JP2002516291A - パピローマウイルス・ウイルス様粒子による経口免疫感作 - Google Patents

パピローマウイルス・ウイルス様粒子による経口免疫感作

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、細胞におけるタンパク質の発現を促進する条件下で、発現系を用いて細胞においてパピローマウイルス・カプシド・タンパク質コード配列を発現させる方法に関する。本発明のもう一つの局面において、パピローマウイルス・カプシド・タンパク質から、（一つ又は複数の）ウイルス様粒子（VLP）、（一つ又は複数の）断片、（一つ又は複数の）カプソマー、又は（一つ又は複数の）それらの一部が形成されることが見出された。さらに、（一つ又は複数の）ウイルス様粒子は、天然の感染性パピローマウイルス粒子と類似した抗原性に関する特徴を含むことが見出された。本発明の一つの態様において、バキュロウイルス発現系を用いて、Sf-9昆虫細胞において、ヒト・パピローマウイルスの6型（HPV-6）及び11型（HPV-11）のL1主要カプシド・タンパク質を発現させる方法、並びに6型（HPV-6）、11型（HPV-11）、16型（HPV-16）、及び18型（HPV-18）のウイルス様粒子の作製が提供される。さらにもう一つの態様において、本発明は、パピローマウイルスに対する免疫応答を誘導するために充分な量のパピローマウイルス・ウイルス様粒子を哺乳動物に経口投与することを含む、パピローマウイルスに対する予防接種を哺乳動物に施す方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本願は、現在係属中の1993年3月9日に出願された米国特許出願第08/028,517号
の一部継続出願である、現在係属中の1994年3月7日に出願された米国特許出願第
08/207,309号の一部継続出願である。
【０００２】 米国政府は、国立衛生研究所からの公衆衛生総局支援AI-82509、AI-35159、及
びCA-11198に準じて、本発明におけるある程度の権利を有する。
【０００３】 発明の分野 本発明は、概して、パピローマウイルス（PV）に関する。より具体的には、本
発明は、バキュロウイルス発現系を用いて、ヒト・パピローマウイルスの6型（H
PV-6）及び11型（HPV-11）のカプシド・タンパク質コード配列を発現させる方法
、HPVウイルス様粒子（VLP）の製造、並びにHPV上のエピトープを認識する抗体
の製造、HPVワクチン開発、及びHPV感染の検出のための血清学的試験の開発にお
ける、これらのVLPの使用に関する。
【０００４】 発明の背景 パポーバウイルス科は、溶解性感染及び良性又は悪性の腫瘍の両方を誘導する
、DNAウイルス群を構成する。構造的には、全て、72個のカプソマーをもつエン
ベロープのない正20面体ビリオンであり、二本鎖環状DNAを含有する。この科に
含まれるウイルスは、（1）ヒト及び動物のパピローマウイルス、（2）マウス・
ポリオーマウイルス、（3）サル空胞化ウイルス、並びに（4）ヒト・ウイルスBK
及びJCである。
【０００５】 ヒト・パピローマウイルス（HPV）は、皮膚、性器、口腔、及び気道の上皮に
組織特異的に感染する。HPV感染は、良性病変及び悪性疾患の両方の発生と密接
に関連している（Reichmanら、Papillomaviruses,1990,1191-1200頁;及びMandel
lら、Principles and Practice of Infectious Diseases, 第3版, Churchill Li
vingstone,New York,N.Y.）。例えば、HPVの1型（HPV-1）は、足底イボに存在し
、HPVの6型又は11型（HPV-6又はHPV-11）は、尖形コンジローム（肛門性器イボ
）に存在し、HPVの16型又は18型（HPV-16又はHPV-18）は、頸部扁平上皮の前悪
性病変及び悪性病変に多く見られる（Crumら、「ヒト・パピローマウイルス感染
及び頸部新形成：新たな展望(Human papillomavirus infection and cervical n
eoplasia:New perspectives)」Int.J.Gynecol.Pathol.3:376-388(1984):zur Hau
zen,Genital Papillomavirus Infections,1985,83-90頁;Rigbyら、Viruses and
Cancer,Cambridge University Press,Cambridge,UK及びKoutskyら、「性器ヒト
・パピローマウイルス感染の疫学(Epidemiology of genital human papillomavi
rus infection)」Epidemiol.Rev.10:122-163(1988)を参照のこと）。
【０００６】 しかし、HPVをインビトロで繁殖させることは困難であるため、免疫学的研究
のための抗原作製の代替法が開発された。例えば、ボネズ（Bonnez）ら（「尖形
コンジローム患者及び対照由来の血清により決定されたように、HPV-6b L1 ORF
のPstI-XhoII制限断片は、免疫学的特異性を欠いている（The PstI-XhoII restr
iction fragment of the HPV-6b L1 ORF lacks immunological specificity as
determined by sera from HPV 6 condyloma acuminatum patients and controls
」UCLA Symp.Mol.Cell.Biol.,New Series,124:77-80(1990)）、ジェニソン（Jen
ison）ら（「大腸菌で発現させた融合タンパク質の使用による、ヒト・パピロー
マウイルス6b型の免疫反応性抗原の同定(Identification of immunoreactive an
tigens of human papillomavirus type 6b by using Escherichia coli-express
ed fusion proteins)」J.Virol.62:2115-2123(1988)）、リー（Li）ら（「コン
ジロームにおけるヒト・パピローマウイルス6b型 L1 オープン・リーディング・
フレーム、及びヒト血清中の対応する抗体の同定(Identification of the human
papillomavirus type 6b L1 open reading frame protein in condylomas and
corresponding antibodies in human sera)」J.Virol.61:2684-2690(1987)）、
スティール（Steel）ら（「ヒト・パピローマウイルス1型の破壊されたエピトー
プ及び破壊されていないエピトープに対するヒト血清の体液性アッセイ法(Humor
al assays of human sera to disrupted and nondisrupted epitopes of human
papillomavirus type 1)」Virology 174:388-398(1990)）、及びストライク（St
rike）ら（「ヒト・パピローマウイルス6b型のL1及びL2の全長オープン・リーデ
ィング・フレームを含む7個のDNAセグメントの大腸菌における発現及び「共通抗
原」の位置(Expression in Escherichia coli of seven DNA segments comprisi
ng the complete L1 and L2 open reading frames of human papillomavirus ty
pe 6b and the location of the 'common antigen')」J.Gen.Virol.70:543-555(
1989)）は、原核生物系において組換えカプシド・タンパク質コード配列を発現
させ、生殖管のHPV感染を有する患者から得られた血清のウェスタンブロット解
析においてそれらを用いた。これらの研究の結果から、HPVカプシド・タンパク
質の変性エピトープ、即ち直鎖状のエピトープに対する抗体が、いくつかの感染
個体の血清中に検出されうることが示唆されている。
【０００７】 完全ウイルス粒子も、三次元エピトープに対する抗体を含む、ヒト血清中の抗
体を検出するために用いられている。大部分の天然に存在するHPVにより誘導さ
れる病変がほとんど粒子を産生しないため、これらの研究を実施することは困難
であった。しかし、完全ウイルス粒子は、HPV1型により誘導された足底イボ（Ki
enzlerら、「ヒト・イボにおけるヒト・パピローマウイルス1型（HPV-1）に対す
る体液性免疫及び細胞性免疫(Humoral and cell-mediated immunity to human p
apillomavirus type 1(HPV-1) in human warts)」Br.J.Dermatol.108:65-672(19
83)、Pfisterら、「ヒト・パピローマウイルス1型（HPV-1）感染の血清疫学的研
究(Seroepidemiological studies of human papilloma virus (HPV-1)infection
s)」Int.J.Cancer 21:161-165(1978)、及びSteeleら、「ヒト・パピローマウイ
ルス1型の破壊されたエピトープ及び破壊されていないエピトープに対するヒト
血清の体液性アッセイ法(Humoral assays of human sera to distupted and non
disrupted epitopes of human papillomavirus type 1)」Virology 174:388-398
(1990)」）、及び実験的に誘導されたHPV-11無胸腺マウス異種移植片（Kreider
ら、「感染性ヒト・パピローマウイルス11型のインビボにおける実験的作製(Lab
oratory production in vivo of infectious human papillomavirus type 11)」
J.Virol.61:590-593(1991)及びKreiderら、「尖形コンジローム由来のパピロー
マウイルスによるヒト子宮頸のインビボにおける形態学的形質転換(Morphologic
al transformation in vivo of human uterine cervix with papillomavirus fr
om condylomata acuminata)」Nature 317:639-641(1985)）から、免疫学的アッ
セイ法を実施するために十分な量で入手されうる。より具体的には、クレイダー
（Kreider）らの米国特許第5,071,757号が、無胸腺マウス異種移植片モデル系を
用いて、実験室において感染性HPV-11ビリオンを繁殖させる方法を開示している
。この系は、性器HPV感染の血清学的試験の開発に用いられうる量の感染性ウイ
ルスを作製することができるが、この系は極めて多くの費用及び労力を要する。
さらに、現在までにこの系において繁殖させられた性器HPV型はただ一つであり
、従って有用性が限定されている。さらに、この系を用いて作製された感染性ウ
イルスは、生物学的危険であり、従ってワクチン製剤において用いるのは困難で
あると考えられる。
【０００８】 ゾウ（Zhou）らは、「上皮細胞におけるワクシニア組換えHPV16 L1 ORFタンパ
ク質及びL2 ORFタンパク質の発現は、HPVビリオン様粒子の組み立てにとって充
分である(Expression of vaccinia recombinant HPV 16 L1 and L2 ORF protein
in epithelial cells is sufficient for assembly of HPV virion-like parti
cles)」Virology 185:251-257(1992)において、ワクシニアウイルスHPV-16 L1/L
2二重組換え発現ベクターによる感染後のCV-1細胞核におけるHPV-16ウイルス様
粒子の形成を報告した。しかし、この著者らは、L1のみを発現するベクターを用
いてVLPを作製することはできなかった。さらに、作製されたVLPは、明確な対称
性を欠いており、HPVビリオン（55nm）又は本発明のVLP（バキュロウイルスで作
製されたHPV-11 VLP、直径約50nm）よりも、サイズのばらつきが大きく、直径が
わずか約35〜40nmと小さかった。
【０００９】 ミンソン（Minson）の米国特許第5,045,447号は、所望の特異性を有するモノ
クローナル抗体に関してハイブリドーマ培養上清をスクリーニングする方法を開
示している。ミンソンの方法は、マウスにおいて標的抗原としてこのタンパク質
を用いたヒト・パピローマウイルス16型（HPV-16）のL1タンパク質に対する抗体
の作製により例示される。しかし、ミンソンは、L1タンパク質の発現又はHPVウ
イルス様粒子（VLP）の作製は開示していない。
【００１０】 スクールニック（Schoolnik）らの米国特許第4,777,239号は、パピローマウイ
ルスに対する型特異的抗体を誘発する、パピローマウイルス初期領域オープン・
リーディング・フレームのいくつかに由来する短いペプチド配列を開示している
。しかし、この発明者らは、主要後期オープン・リーディング・フレームである
L1に関する配列は全く開示していない。
【００１１】 ランカスター（Lancaster）らの米国特許第5,057,411号は、彼らがパピローマ
ウイルス型特異的エピトープをコードすると主張する、パピローマウイルスL1カ
プシド・タンパク質オープン・リーディング・フレームの約30ヌクレオチドのポ
リヌクレオチド配列を開示している。しかし、この配列を認識する抗体を産生す
る感染動物は開示されていない。その代わりに、彼らは、ウシ・パピローマウイ
ルス1型（BPV-1）型の配列（10アミノ酸ペプチド又はデカペプチド）を合成し、
ウサギを免疫感作し、BPV-1又はBPV-2のいずれかにより誘導された繊維乳頭腫組
織と反応する抗血清の能力を試験した。ペプチド抗血清は、BPV-1組織とのみ反
応し、BPV-2組織とは反応しなかった。その後、彼らは、ペプチドが型特異的な
抗原決定基を含有し、従って、全てのパピローマウイルスL1コード配列がこの位
置に型特異的エピトープを含有すると結論付けた。これは、彼らの理論的な推測
であり、この仮説を支持するデータは与えられていない。さらに、開示されたア
ミノ酸配列（10アミノ酸）は、一般的には、本明細書に記載の方法により作製さ
れたエピトープのような、より高次の抗原構造、即ち三次元構造を有する三次元
エピトープとはなりえないと考えられている。
【００１２】 パピローマウイルス感染に関連するもう一つの問題は、別の治療様式及び予防
様式の必要性である。最近ではほとんど研究されていないそのような様式の一つ
は、パピローマウイルス・ワクチンであろう。1944年、ビバースタイン（Bibers
tein）は、患者のイボに由来する自原ワクチンにより、尖形コンジローム患者を
治療した（Biberstein「イボの免疫感作療法(Immunization therapy of warts)
」Arch.Dermatol Syphilol.50:12-22(1944)）。その後、パウエル（Powell）ら
は、尖形コンジロームの治療のための自原イボ・ワクチンを調製するための、今
日典型的に用いられている技術を開発した（Powellら、「自原ワクチンによる尖
形コンジロームの治療(Treatment of condylomata acuminata by autogenous va
ccine)」South Med.J.63:202-205(1970)）。自原ワクチンの効力を評価するため
、一回のみのプラセボ対照二重盲検が試みられた（Malisonら、尖形コンジロー
ムのための自家ワクチン療法：プラセボ対照二重盲検(Autogenous vaccine ther
apy for condyloma acuminatum:A double-blind controlled study)」Br.J.Vene
r.Dis.58:62-65(1982)）。著者らは、自原ワクチンが尖形コンジロームの治療に
おいて効果がないことを結論付けたが、この解釈は誤りであったかもしれない。
研究した患者が少数であったため、妥当な負の結論の導出が妨害された。いずれ
にせよ、現在までに記載されている自原ワクチンは、いくつかの欠点を有してい
る。第一に、ワクチンを調製するためには、患者が比較的大きなイボ（2gから5g
）を有している必要がある。第二に、実務者は、新たな患者を治療する度に、実
験用の装置及び専門技術を入手する必要がある。従って、ワクチン調製物は、非
常に高価で、時間がかかり、病巣の量が比較的少ない場合には不可能である。
【００１３】 残念なことに、ウイルス繁殖の伝統的な方法は、パピローマウイルスの研究に
適用されておらず、以前に記載された別の方法では、免疫学的研究のために十分
な量の感染性ビリオンを作製することができない。また、無胸腺マウス系におけ
るHPV-11のインビボ繁殖は、高価で、面倒であり、現在のところHPV-11に限定さ
れているため、あまり実用的ではない。その結果、免疫学的研究及びワクチン作
製において用いるためのHPVカプシドのエピトープを作製する別の方法が必要と
されている。
【００１４】 発明の概要 本発明は、細胞におけるタンパク質の発現を促進する条件下で、パピローマウ
イルス・カプシド・タンパク質コード配列を含有する発現ベクターで細胞をトラ
ンスフェクトすることを含む、細胞においてパピローマウイルス（PV）のカプシ
ド・タンパク質コード配列を発現させる方法に関する。
【００１５】 本発明のもう一つの局面において、パピローマウイルス・カプシド・タンパク
質から形成された、（一つ又は複数の）ウイルス様粒子（VLP）、（一つ又は複
数の）断片、（一つ又は複数の）カプソマー、又は（一つ又は複数の）それらの
一部が提供される。（一つ又は複数の）ウイルス様粒子は、天然の感染性パピロ
ーマウイルス粒子と類似した（一つ又は複数の）抗原性に関する特徴を含むこと
が発見された。
【００１６】 本発明の好ましい態様において、バキュロウイルス発現系を用いて、Sf-9昆虫
細胞において、ヒト・パピローマウイルスの6型（HPV-6）及び11型（HPV-11）の
L1主要カプシド・タンパク質コード配列を発現させる方法が提供される。HPV-6
及びHPV-11のコード配列は、当技術分野における標準的な技術を用いて、バキュ
ロウイルス導入ベクターにクローニングされた。得られたバキュロウイルス導入
ベクターは、回収された組換えバキュロウイルス（Ac6L1又はAc11L1）を形成す
るオートグラファ・カリフォルニカ（autographa californica）核多角体病ウイ
ルス（AcNPV）でSf-9昆虫細胞を共トランスフェクトするために用いられた。そ
の後、細胞におけるタンパク質の発現を促進する条件下で、Sf-9昆虫細胞にAc6L
1又はAc11L1を感染させた。L1タンパク質はウイルス様粒子（VLP）を形成するこ
とが見出された。VLPは、Ac11L1組換えバキュロウイルスに感染したSf-9細胞か
ら得られたネガティブ染色されたショ糖バンド画分の電子顕微鏡検により同定さ
れた。ウサギ抗血清により決定されたように、VLPは、天然のHPV-11ビリオンと
類似した免疫学的特徴及び形態学的特徴を有することが、さらに発見された。
【００１７】 本発明に従い作製された（一つ又は複数の）ウイルス様粒子は、診断アッセイ
法において用いることができ、HPV細胞受容体の同定及び特徴決定において役割
を果たすことができ、ワクチン開発（治療用及び予防用の両方）のため用いるこ
とができる。HPV-11及びHPV-6の作製のための本明細書に記載の本発明の方法は
、他の動物及び／又はヒトのパピローマウイルスから同様の免疫学的試薬を作製
するために用いられうることが理解される。さらに、本発明に従い作製されたVL
Pは、パピローマウイルスの免疫学的研究を実施し、パピローマウイルスに対す
るワクチンを開発するための多量の試薬を提供すると考えられる。
【００１８】 本発明はまた、パピローマウイルスに対する免疫応答を誘導するために充分な
量のパピローマウイルス・ウイルス様粒子を哺乳動物に経口投与することにより
、パピローマウイルス感染に対する予防接種を哺乳動物に施す方法を提供する。
【００１９】 詳細な説明 本発明は、細胞におけるタンパク質の発現を促進する条件下で、バキュロウイ
ルス発現系を用いて、細胞においてパピローマウイルス・カプシド・タンパク質
コード配列を発現させる方法に関する。本発明のもう一つの局面において、パピ
ローマウイルス・カプシド・タンパク質から、（一つ又は複数の）ウイルス様粒
子（VLP）、（一つ又は複数の）断片、（一つ又は複数の）カプソマー、又は（
一つ又は複数の）それらの一部が形成されることが発見された。さらに、（一つ
又は複数の）ウイルス様粒子は、天然の感染性パピローマウイルス粒子と類似し
た抗原性に関する特徴を含むことが発見された。
【００２０】 本明細書において用いられるように、「（一つ又は複数の）ウイルス様粒子（
VLP）」とは、パピローマウイルスのカプシド・タンパク質コード配列から作製
され、感染性パピローマウイルス粒子と類似した（一つ又は複数の）抗原性に関
する特徴を含む、（一つ又は複数の）ウイルス様粒子、（一つ又は複数の）断片
、（一つ又は複数の）カプソマー、又は（一つ又は複数の）それらの一部をさす
。本明細書において用いられるように、「（一つ又は複数の）抗原性に関する特
徴」とは、（1）VLP又は感染性ウイルスのいずれかによる免疫感作により動物及
び／もしくはヒトにおいて作製された抗血清により決定される、野生型粒子（同
一のHPV型の天然型感染性ウイルス粒子）と交差反応する（一つ又は複数の）ウ
イルス様粒子の能力、並びに／又は（2）同種ウイルスに感染していることが既
知のヒト由来のヒト血清中の抗体を認識又は検出する能力、をさす。
【００２１】 本明細書において用いられるように、「L1タンパク質コード配列」又は「L1カ
プシド・タンパク質コード配列」又は「L1コード配列」とは、パピローマウイル
スにおけるL1タンパク質をコードするオープン・リーディング・フレームをさす
。発現されたとき、L1タンパク質コード配列は、天然パピローマウイルス・ビリ
オンと類似した免疫学的特徴及び形態学的特徴を有する、タンパク質又はタンパ
ク質複合体又は凝集物を産生する。本発明において用いられるL1コード配列は、
パピローマウイルス・ゲノムDNAから単離及び精製されるか、又は標準的な遺伝
子組換え技術を用いて合成されうる。
【００２２】 本明細書において用いられるように、「トランスフェクトする」という用語は
、ウイルス、プラスミド、又はベクターを細胞に導入するための任意の手段をさ
す。そのような手段の例には、感染、リン酸カルシウム沈殿、及びエレクトロポ
レーションが含まれる。
【００２３】 本発明の好ましい態様において、バキュロウイルス発現系を用いて、Sf-9昆虫
細胞において、ヒト・パピローマウイルス11型（HPV-11）及びヒト・パピローマ
ウイルス6型（HPV-6）のL1カプシド・タンパク質のコード配列を発現させる方法
が提供される。これらのHPV型のカプシド・タンパク質コード配列は、例示の目
的のためにのみ用いられ、意図される本発明の範囲を逸脱することなく、任意の
動物又はヒトのパピローマウイルス型のL1カプシド・タンパク質コード配列が用
いられうることが理解される。そのようなHPV型には、これらに限定されないが
、HPVの16型、18型、31型、33型、35型（参照として本明細書に組み込まれるGis
smanら、Cancer Cells 5:275(1987)）、及び参照として本明細書に組み込まれる
ボースネル（Boursnell）らのPCT公開第WO92/16636号に開示されているHPV型が
含まれる。
【００２４】 本発明の方法において用いられる好ましい発現系は、バキュロウイルス発現系
であるが、L1タンパク質コード配列を発現することができる（一つ又は複数の）
系であれば、任意のその他の（一つ又は複数の）発現系が本発明において使用さ
れうることが理解される。そのような系の例には、これらに限定されないが、ア
デノウイルス、SV40、大腸菌、CHO細胞、ワクシニアウイルス、昆虫ウイルス、
酵母、バクテリオファージウイルス、又は修飾されたウイルス、DNAプラスミド
、ベクターなどを含む、任意の（一つ又は複数の）原核生物系及び／又は真核生
物系が含まれる。
【００２５】 L1コード配列の発現のための宿主細胞は、用いられる発現系による。適当な宿
主細胞の例には、これらに限定されないが、細菌（原核生物）、酵母のような微
生物、哺乳動物細胞（真核生物）、及び昆虫細胞が含まれる。バキュロウイルス
発現系を用いる場合には、Sf-9又はSf-21のような昆虫細胞が好ましい。
【００２６】 本発明のもう一つの局面において、L1タンパク質が、パピローマウイルス・カ
プシド・タンパク質から形成される、（一つ又は複数の）ウイルス様粒子、（一
つ又は複数の）断片、（一つ又は複数の）カプソマー、又は（一つ又は複数の）
それらの一部を産生することが発見された。（一つ又は複数の）ウイルス様粒子
は、天然の感染性パピローマウイルス粒子と類似した（一つ又は複数の）抗原性
に関する特徴を含むことが見出された。より具体的には、これらのVLPは、性器H
PV感染患者から得られた血清中に存在する抗体により特異的に認識される抗原決
定基を含有する。例えば、ウェスタンブロット・アッセイ法及びイムノドットブ
ロット・アッセイ法における免疫反応性により推測される、VLP含有昆虫細胞抽
出物の、変性カプシド・エピトープ又は非変性カプシド・エピトープのいずれか
に対する抗血清との反応から、天然HPV-11感染性ビリオンに存在する三次元エピ
トープが、本発明のバキュロウイルスで作製されたHPV-11 VLP上にも存在するこ
とが示唆された。剖検により立証された尖形コンジロームを有する個体から得ら
れたヒト血清を用いたイムノドットブロット・アッセイ法は、参照として本明細
書に組み込まれるBonnezら、「尖形コンジロームを有するヒトにおける特異的抗
体を検出するためのヒト・パピローマウイルス11型ビリオンの使用(Use of huma
n papillomavirus type 11 virions in an ELISA to detect specific antibodi
es in humans with condylomata acuminata)」J.Gen.Virol.72:1343-1347(1991)
により記載されたHPV-11完全ウイルス粒子に基づくELISA試験で以前に得られた
結果と密接に相関していた。
【００２７】 天然HPV-11ビリオンとの形態学的類似性及び免疫学的類似性から、バキュロウ
イルス系において作製された組換えVLPが、性器HPV感染のみならず、任意のパピ
ローマウイルスの血清疫学及び病原の研究において、そしてワクチン開発にとっ
て有用であろうことが示唆される。L1は、内因性の自己組み立て能を有している
。従って、その他のパピローマウイルス・タンパク質は、バキュロウイルス系に
おけるVLP形成にとって必要でない。このことは、全ての型のパピローマウイル
スに関するVLPが、本明細書に記載の方法に従い作製されうるという主張を支持
する。
【００２８】 本発明のVLPは、HPVによる感染に対する防御、即ちワクチンが所望の対象にお
いて抗体を生成させるため、又は既に存在するHPV感染に対する免疫応答を強化
するために用いられうる。本発明のVLPは、診断において有用な抗血清を得るた
めに動物種に注射されうる。ポリクローナル抗血清に加え、コーラー（Kohler）
及びミルスタイン（Milstein）の方法、又はその変法を用いて、抗体産生クロー
ン、即ちハイブリドーマを得るため、注射された動物由来の脾細胞又はその他の
抗体産生細胞を不死化することによりモノクローナル抗体が入手されうる。
【００２９】 得られた抗体は、頸部剖検又はパパニコラウ染色塗抹標本におけるHPV感染の
診断、及びヒト又はその他の対象における疾患レベルの調査に用いられうる。特
に、本発明の抗体を用いた診断は、疾患の進展のモニタリングを可能にする。抗
体は、ウイルスを検出するため、及び感染又は癌を調節するための抗ウイルス剤
又はその他の治療剤による療法の進行をモニターするための血清の分析に用いら
れうる。抗体は、種による変動を考慮して、受動療法としても用いられうる。
【００３０】 本発明のVLPは、HPV感染を保有することが疑われる患者の血清中のHPVに対し
て生成した抗体の存在を検出するため、又は抗HPVワクチンで治療されている患
者の血清の力価を測定するためのイムノアッセイ法において用いられうる。
【００３１】 本発明のVLPは、中和抗体の形成を誘導するため（参照として本明細書に組み
込まれるBonnezら、「ヌードマウスにおけるヒト・パピローマウイルス11型（HP
V-11）感染の抗体媒介中和：ポリメラーゼ連鎖反応によるHPV-11 mRNAの検出(An
tibody-mediated neutlization of human papillomavirus type 11(HPV-11)infe
ction in the nude mouse:Detection of HPV-11 mRNAs by the polymerase chai
n reaction)」J.Inf.Dis.,165:376-380(1992)、Rose,R.C.ら、「ヒト・パピロー
マウイルス（HPV）11型組換えウイルス様粒子は、中和抗体の形成を誘導し、ヒ
ト血清中のHPV特異的抗体を検出する(Human Papillomavirus(HPV) Type 11 Reco
mbinant Virus-Like Particle Induce the Formation of Neutralizing Antibod
ies and Detect HPV-Specfic Antibodies in Human Sera)」J.Gen.Virol.75:207
5-2079(1994)）、HPVに対する防御的免疫を与えるため、又は患者が既に感染し
ている場合には患者自身の免疫応答を高めるため、宿主に直接的に投与されうる
。全ての適用に関して、VLPは免疫原性の形態で投与される。場合により、VLPは
、免疫原性を与える担体材料、好ましくは免疫原性に関して中性の担体と結合し
ていてもよい。必要とされる使用に応じて、本発明のVLPは、型特異的又は広域
性のワクチン及び診断薬として作用する能力を有する。
【００３２】 ワクチンとして投与されるVLPは、防御を受ける対象へのそのような投与のた
めの従来の方法及び／又は将来的な方法に従い製剤化され、従来のアジュバント
と混合されうる。発現したペプチドは、多価であってもよいサブユニット・ワク
チン製剤における免疫原として用いられうる。多価ワクチン製剤は、それぞれが
異なるHPVに由来する異なるL1タンパク質をコードするVLPを含みうる。産物は、
異種タンパク質を発現する任意のベクター／宿主系からワクチン製剤の目的のた
め精製されうる。精製されたVLPは、適当な濃度に調整され、適当なワクチン・
アジュバントと共に製剤化され、使用のためパッケージングされうる。適当なア
ジュバントには、これらに限定されないが、無機ゲル、例えば水酸化アルミニウ
ム、リゾレシチン、プルロニック・ポリオール（pluronic polyols）のような界
面活性物質、ポリアニオン、ペプチド、油乳濁液、及びBCG（Bacille Calmette-
Guerin）及びコリネバクテリウム・パーバム（Corynebacterium parvum）のよう
な潜在的に有用であるヒト・アジュバントが含まれる。免疫原は、リポソームに
取り込まれていてもよく、又は多糖及び／もしくはワクチン製剤において用いる
ためのその他の重合体と結合していてもよい。前記のワクチン製剤の導入には多
くの方法が用いられ、これらに限定されないが、経口、皮内、筋肉内、腹腔内、
静脈内、皮下、及び鼻腔内の経路が含まれる。診断試薬として直接的に用いられ
る場合には、従来の方法を用いて精製され、そのような使用に応じてパッケージ
される。診断目的のための抗体を作製するために用いられる場合には、適当な抗
血清を調製するため便利な被検動物が用いられうる。適当な宿主には、マウス、
ラット、ウサギ、モルモット、又はヒツジのようなはるかに大きい哺乳動物が含
まれる。抗体は、治療される宿主と適合性である限り、治療的に用いられうる。
適切な種特徴を有するモノクローナル抗体が、この適用にとって好ましい。
【００３３】 好ましい態様において、本発明は、パピローマウイルスに対する免疫応答を誘
導するために充分な量のパピローマウイルス・ウイルス様粒子を哺乳動物に経口
投与することにより、パピローマウイルスに対する予防接種を哺乳動物に施す方
法を提供する。高度の防御を得るため、方法は、一回又は複数回のパピローマウ
イルス・ウイルス様粒子のワクチン追加接種を哺乳動物に経口投与することも含
みうる。本発明の好ましい態様において、経口免疫により誘導された免疫応答は
、哺乳動物をパピローマウイルス感染から防御すると考えられる。
【００３４】 好ましいパピローマウイルスは、ヒト・パピローマウイルス、特にヒト・パピ
ローマウイルスの6型及び11型である。
【００３５】 本発明は、パピローマウイルス・ウイルス様粒子と薬学的に許容される担体と
を有する経口ワクチンも提供する。経口ワクチンは、香料、着色料、及び嗜好性
を高めるためのその他の食品添加剤も含みうる。さらに、経口ワクチンは、ワク
チンの貯蔵寿命を延長させるための安定剤及び保存剤も含有しうる。
【００３６】 組換えVLPを用いた予防的予防接種は、肛門性器HPV感染の予防のための戦略と
して出現した（参照として本明細書に組み込まれるKirnbauer,R.,「血清学及び
ワクチン開発のためのパピローマウイルス様粒子(Papollomavirus-Like Particl
es For Serology and Vaccine Development)」Intervirology 39(1-2):54-61(19
96)、Rose.,R.C.ら、「ヒト・パピローマウイルス感染(Human Papillomavirus I
nfections)」343-368頁 G.J.Galasso,R.J.Whitley and T.C.Merigan(編)「抗ウ
イルス剤及びヒト・ウイルス性疾患(Antiviral Agents and Human Viral Diseas
es)」第4版 Lippincott-Raven Puslishers,Philadelphia(1997)、Schiller,J.T.
ら、「パピローマウイルス様粒子及びHPVワクチン開発(Papillomavirus-Like Pa
rticles and hpv Vaccine Development)」Seminars in Cancer Biology 7(6):37
3-382(1996)）。VLPは、非経口投与された場合、高度に免疫原性であり（参照と
して本明細書に組み込まれるKirnbauer,R.F.ら、「パピローマウイルスL1主要カ
プシド・タンパク質は、高度に免疫原性であるウイルス様粒子へと自己組み立て
する(Papillomavirus L1 Major Capsid Protein Self-Assembles into Virus-Li
ke Particles That Are Highly Immunogenic)」Proceedings of the National A
cademy of Sciences of the United States of Americaa 89(24):12180-12184(1
992)、Rose,R.C.ら、「ヒト・パピローマウイルス（HPV）11型組換えウイルス様
粒子は、中和抗体の形成を誘導し、ヒト血清中のHPV特異的抗体を検出する(Huma
n Papillomavirus(HPV) Type 11 Recombinant Virus-Like Particle Induce the
Formation of Neutralizing Antibodies and Detect HPV-Specfic Antibodies
in Human Sera)」J.Gen.Virol.75:2075-2079(1994)）、防御的な免疫応答を誘発
することが示されている（参照として本明細書に組み込まれるBreitburd,F.ら、
「ワタオウサギ・パピローマウイルス（CRPV）由来のウイルス様粒子による免疫
感作は、実験的CRPV感染を抑制することができる(Immunization With Virus-Lik
e Particles From Cottontail Rabbit Papillomavirus(CRPV) Can Protect Agai
nst Experimental CRPV Infection)」J.Virology 69(6):3959-3963(1995)、Chri
stensen,N.D.ら、「組立てられたバキュロウイルス発現ヒト・パピローマウイル
ス11型L1カプシド・タンパク質ウイルス様粒子は、中和モノクローナル抗体によ
り認識され、高力価の中和抗体を誘導する(Assembled Baculovirus-Expressed H
uman Papillomavirus Type 11 L1 Capsid Protein Virus-Like Particles Are R
ecognized By Neutralizing Monoclonal Antibodies and Induce High Titres o
f Neutralizing Antibodies)」J.Gen.Virol.75:2271-2276(1994)、Kirnbauer,R.
ら、「予防及び治療のための免疫感作におけるウシ・パピローマウイルス4型の
ウイルス様粒子(Virus-Like Particles of Bovine Papillomavirus Type 4 in P
rophylactic and Therapeutic Immunization)」Virology 219(1):37-44(1996)、
Rose,R.C.ら、「ヒト・パピローマウイルス（HPV）11型組換えウイルス様粒子は
、中和抗体の形成を誘導し、ヒト血清中のHPV特異的抗体を検出する(Human Papi
llomavirus(HPV) Type 11 Recombinant Virus-Like Particle Induce the Forma
tion of Neutralizing Antibodies and Detect HPV-Specfic Antibodies in Hum
an Sera)」J.Gen.Virol.75:2075-2079(1994)、Suzich,J.A.ら、「パピローマウ
イルスL1タンパク質による全身免疫感作は、ウイルス性粘膜乳頭腫の発生を完全
に予防する(Systemic Immunization With Papillomavirus L1 Protein Complete
ly Prevents the Development of Viral Mucosal Papillomas)」Proc.Natl.Acad
.Sci.USA 92:11553-11557(1995)、White,W.I.ら、「真正ヒト・パピローマウイ
ルス16型のインビトロ感染及び型限定抗体媒介中和(In Vitro Infection and Ty
pe-Restricted Antibody-Mediated Neutralizaion of Authentic Human Papillo
mavirus Type 16)」J.Virology 72:959-964(1998)）。本結果は、同様の応答が
経口VLP免疫感作により誘導されうることを証明している。経口誘導された抗体
の抗原特異性は、天然のVLP構造に依存し、HPV遺伝子型により制限されることが
見出された。エピトープ遮断ELISAからの結果より、免疫後血清抗体が、HPV-11
ウイルス中和抗体によるVLP結合を効率的に阻害することが示された。マウス免
疫後血清における抗原構造依存的な抗体特異性の検出は、胃内の酸性pH及び小腸
内の多量のプロテアーゼにも関わらず、HPV-11 VLPが天然の構造及び抗原性を維
持していることを示した。このことから、肛門性器HPV疾患の予防のための経口
免疫原としてVLPが有用であることが証明された。
【００３７】 経口免疫感作は、他の予防接種経路と比べて、いくつかの利点を示す。例えば
、経口ワクチンは、より容易に投与され、従ってワクチン受容者に受け入れられ
やすい。又、経口ワクチンは、注射用に製剤化されたワクチンよりも純度が低く
てもよく、従って製造コストが低い。興味深いことに、いくつかの場合において
、経口投与された抗原が、いくつかの病原体による感染に対する防御にとって重
要であるかもしれない粘膜免疫応答を誘発することが示されている（参照として
本明細書に組み込まれるBall,J.M.ら、「組換えノーウォークウイルス様粒子に
よる経口免疫感作は、マウスにおいて全身及び粘膜の免疫応答を誘導する(Oral
Immunization With Recombinant Norwalk Virus-Like Particles Induces a Sys
temic and Mucosal Immune Response in Mice)」J.Virology 72(2):1345-1353(1
998)、Oneal,C.M.ら、「投与されたロタウイルス様粒子は防御的免疫を粘膜的に
誘導する(Rotavirus Virus-Like Particles Administerd Mucosally Induce Pro
tective Immunity)」J.Virology 71(11):8707-8717(1997)）。他の研究者により
報告された以前の研究に基づき（参照として本明細書に組み込まれるKirnbauer,
R.ら、「予防及び治療のための免疫感作におけるウシ・パピローマウイルス4型
のウイルス様粒子(Virus-Like Particles of Bovine Papillomavirus Type 4 in
Prophylactic and Therapeutic Immunization)」Virology 219(1):37-44(1996)
、Suzich,J.A.ら、「パピローマウイルスL1タンパク質による全身免疫感作は、
ウイルス性粘膜乳頭腫の発生を完全に予防する(Systemic Immunization With Pa
pillomavirus L1 Protein Completely Prevents the Development of Viral Muc
osal Papillomas)」Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:11553-11557(1995)）、経口VLP
投与後の粘膜応答を調査することは本発明の目的ではなかった。しかし、そのよ
うな応答は、ワクチンの効力を増強する可能性があり、この可能性については現
在調査中である。
【００３８】 腸の抗原は、パイアー斑（PP）上皮中のM細胞を介して、消化管関連リンパ系
組織（GALT）に接近すると考えられ（参照として本明細書に組み込まれるNeutra
,M.R.,「上皮関門を介した抗原サンプリング及び粘膜免疫応答の誘導(Antigen S
ampling Across Epithelial Barriers and Induction of Mucosal Immune Respo
nses)」Annual Review of Immunology 14:275-300(1996)）、PPへのM細胞媒介取
り込みは多数の微生物に関して証明されている（参照として本明細書に組み込ま
れるAmerongen,H.M.ら、「腸内M細胞によるHIV-1の経上皮輸送：AIDSの伝搬のメ
カニズム(Transepithelial Transport of HIV-1 By Intestinal M Cells:a Mech
anism For Transmission of AIDS)」Journal of Acquired Immune Deficiency S
yndromes 4(8):760-765(1991)、Buller,C.R.ら、「ロタウイルス及び腸内アデノ
ウイルスによる回腸ドームM細胞の自然感染(Natural Infection of Porcine Ile
al Dome M Cells With Rotavirus and Enteric Adenovirus)」Vet.Pathol.25(6)
:516-517(1988)、Inman,L.R.ら、「ウサギにおける大腸菌性下痢におけるパイア
ー斑の膜（M）細胞への大腸菌（RDEC-1株）の特異的接着(Specific Adherence o
f Escherichia Coli (Strain RDEC-1) to Membranous(M) Cells of the Perer's
Patch in Escherichia Coli Diarrhea in the Rabbit)」Journal of Clinical
Investigation 71(1):1-8(1983)、Keren,D.F.ら、「シゲラ抗原に対する腸内免
疫応答(The Enteric Immune Response to Shigella Antigens)」Current Topics
in Microbiology & Immunology 146:213-223(1989)、Sicinski,P.ら、「1型ポ
リオウイルスは腸内M細胞を通ってヒト宿主に侵入する(Poliovirus Type 1 Ente
rs the Human Host Through Intestinal M Cells)」Gastroenterology 98(1):56
-58(1990)、Wolf,J.L.ら、「腸内M細胞：レオウイルスの宿主への侵入経路(Inte
stinal M Cells:a Pathway for Entry of Reovirus Into the Host)」Science 2
12(4493):471-472(1981)）。M細胞は、PPの基底領域に豊富に存在する（参照と
して本明細書に組み込まれるMowat,A.M.ら、「腸管免疫の解剖学的基礎(The Ana
tomical Basis of Intestinal Immunity)」Immunol.Rev.156:145-166(1997)）、
専門的な抗原提示細胞に無傷のVLPを直接的に輸送することができる（参照とし
て本明細書に組み込まれるBall,J.M.ら、「組換えノーウォークウイルス様粒子
による経口免疫感作は、マウスにおいて全身及び粘膜の免疫応答を誘導する(Ora
l Immunization With Recombinant Norwalk Virus-Like Particles Induces a S
ystemic and Mucosal Immune Response in Mice)」J.Virology 72(2):1345-1353
(1998)）。以前の研究により、いくつかの抗原型が経口輸送後に全身性応答を誘
発することができること、及びこの現象に細胞結合活性が関与していることが示
された（参照として本明細書に組み込まれるdeAizpurua,H,J.ら、「経口免疫感
作 経口摂取により免疫応答を惹起するタンパク質のクラスの同定(Oral Vaccin
ation.Identification of Classes of Proteins That Provoke an Immune Respo
nse Upon Oral Feeding)」J.Exp.Med.167(2):440-451(1988)）。腸管粘膜上の糖
脂質又は糖タンパク質に結合する能力が、そのような抗原を循環系に輸送するよ
う粘膜細胞を刺激し、それにより、全身性応答が誘発されるのかもしれない（参
照として本明細書に組み込まれるdeAizpurua,H,J.ら、「経口免疫感作 経口摂
取により免疫応答を惹起するタンパク質のクラスの同定(Oral Vaccination.Iden
tification of Classes of Proteins That Provoke an Immune Response Upon O
ral Feeding)」J.Exp.Med.167(2):440-451(1988)）。パピローマウイルスVLPは
、多様な真核細胞型に結合し（参照として本明細書に組み込まれるMuller,M.ら
、「異なる組織及び種に由来する細胞によるパピローマウイルス・カプシドの結
合及び取り込み(Papillomavirus Capsid Binding and Uptake by Cells From Di
fferent Tissues and Species)」J.Virology 69(2):948-954(1995)、Volpers,C.
ら、「真核細胞によるヒト・パピローマウイルス33型ウイルス様粒子の結合及び
取り込み(Binding and Internalization of Human Papillomavirus Type 33 Vir
us-Like Particles by Eukaryotic Cells)」J.Virology 69(6):3258-3264(1995)
）、この能力は本発明において記載されたような応答の誘導に関与しているかも
しれない。パピローマウイルスによる自然感染は受容体により媒介されると考え
られるが、経口予防接種後の免疫応答の誘導において特異的受容体が役割を果た
している可能性は低い。なぜなら、パピローマウイルスが腸粘膜上皮組織に感染
することは知られておらず、マウスは天然にはHPV感染に対して感受性でないた
めである。
【００３９】 エピトープ遮断ELISAにおいて得られた結果は、経口誘導された抗体が、HPV-1
1ビリオン中和抗体によるVLP結合を効率よくブロッキングすることを示している
。天然のビリオンは製造コストが高く（参照として本明細書に組み込まれるBonn
ez,W.ら、「重症複合免疫不全（SCID）マウスを用いたヒト異種移植片における
ヒト・パピローマウイルス11型の繁殖及びヌードマウス・モデルとの比較(Propa
gation of Human Papillomavirus Type 11 in Human Xenografts Using the Sev
ere Combined Immunodeficiency(SCID) Mouse and Comparison to the Nude Mou
se Model)」Virology 197(1):455-458(1993)、Kreider,J.W.ら、「感染性ヒト・
パピローマウイルス11型のインビボにおける実験的作製(Laboratory Production
in vivo of Infectious Human Papillomavirus Type 11)」J.Virology 61:590-
593(1987)）、大部分の臨床的に関連のあるウイルス遺伝子型に関して利用可能
でない。従って、エピトープ遮断ELISAは、ワクチン効力を予測するためのビリ
オン感染性アッセイ法の有用な別法である。それは、最近記載されたその他の代
理アッセイ法よりも信頼性が高いかもしれない。例えば、血球凝集阻害アッセイ
法（HAI）（参照として本明細書に組み込まれるRoden,R.B.ら、「血球凝集阻害
による性器ヒト・パピローマウイルスの血清学的関係性の調査(Assessment of t
he Serological Relatedness of Genital Human Papillomaviruses by Hemagglu
tination Inhibiion)」J.Virology 70(5):3298-3301(1996)）は、抗体が感染性H
PVビリオンを中和するメカニズムが、VLP媒介凝集に関与するメカニズムとは異
なる可能性を示唆している。対照的に、エピトープ遮断ELISAの結果から、ウサ
ギHPV-11 N-pAbにH11.H3中和抗原特異性が存在することが示され、従って、経口
免疫感作後に誘導された抗体に同一の特異性が存在することが間接的に示された
。
【００４０】 世界中で毎年およそ450,000の侵襲的子宮頸癌の新たな症例が診断されている
（参照として本明細書に組み込まれるMunos,N.,「ウイルス及びH.ピロリにより
誘導された癌と関係した疾患負荷(Disease-Burden Related to Cancer Induced
by Viruses and H.pylori)」World Health Organization(WHO) Vaccine Researc
h and Development:Report of the Technical Review Group Meeting 9-10 June
,1997(1997)）。従って、多数の感受性のある個体の免疫感作のため、効率的な
ワクチン輸送法が必要であると考えられる。従って、経口免疫感作戦法は、頸癌
及びその他のHPV関連疾患の罹患率を減少させるために設計された集団免疫感作
プログラムの実行を確実に促進すると考えられる。
【００４１】 以下の実施例は、本発明をさらに例示するために提供される。
【００４２】 実施例I 方法 1．HPV-11ウイルスDNA及びpVL11L1バキュロウイルス導入ベクターの構築 参照として本明細書に組み込まれるRoseら、「組換えバキュロウイルスによる
HPV-6b及びHPV-11のL2オープン・リーディング・フレームの全長産物の発現、並
びにHPV-11完全ウイルス粒子との抗原性の比較(Expression of the full-length
products of the HPV-6b and HPV-11 L2 open reading frames by recombinant
baculovirus and Antigenic comparisons with HPV-11 whole virus particles
)」J.Gen.Virol.71:2725-2729(1990)の記載のようにして、実験的に誘導された
無胸腺マウス異種移植片から精製されたウイルス粒子から、HPV-11ゲノムDNAを
得た。それぞれ5'末端及び3'末端にBglII及びEcoRIの制限酵素部位を導入するた
めに設計されたプライマーを用いて、精製されたゲノムDNAをPCR増幅することに
より、L1コード配列をクローニングした。フォワードプライマー及びリバースプ
ライマーの配列は、それぞれ、5'-CGC AGA TCT atg TGG CGG CCT AGC-3'（配列
番号：1）及び5'-CAT ATG AAT TCC CAC AAC ACA CTG ACA CAC-3'（配列番号：2
）であった。プライマーを用いた突然変異導入により、制限部位（下線）を、推
定L1開始コドン（小文字）の近傍、及び推定L1終止コドンからおよそ30ヌクレオ
チド下流に導入した。増幅を、500ngの各プライマー及び2ユニットのTaq DNAポ
リメラーゼ（Amplitaq、Perkin-Elmer Cetus Corp.、Norwalk、CT）を用いて、
本質的に、参照として本明細書に組み込まれるBonnezら、「ヌードマウスにおけ
るヒト・パピローマウイルス11型（HPV-11）感染の抗体媒介中和：ポリメラーゼ
連鎖反応によるHPV-11 mRNAの検出(Antibody-mediated neutlization of human
papillomavirus type 11(HPV-11)infection in the nude mouse:Detection of H
PV-11 mRNAs by the polymerase chain reaction)」J.Inf.Dis.,165:376-380(19
92)の記載のようにして実施した。増幅後、PCR産物を、BglII及びEcoRIで消化し
た。完全なHPV-11 L1オープン・リーディング・フレーム（ORF）を含有していた
1539塩基対（bp）消化産物を、参照として本明細書に組み込まれるRoseら、「組
換えバキュロウイルスによるHPV-6b及びHPV-11のL2オープン・リーディング・フ
レームの全長産物の発現、並びにHPV-11完全ウイルス粒子との抗原性の比較(Exp
ression of the full-length products of the HPV-6b and HPV-11 L2 open rea
ding frames by recombinant baculovirus and Antigenic comparisons with HP
V-11 whole virus particles)」J.Gen.Virol.71:2725-2729(1990)の記載のよう
にして、アガロースゲル電気泳動により精製し、バキュロウイルス導入ベクター
pVL-1392（M.D.Summers、Texas A & M University、College Station、TX）の対
応する部位にクローニングした。参照として本明細書に組み込まれるSummersら
、A Manual of Method for Baculovirus Vectors and Insect Cell Culture Pro
cedures,1987,Texas A & M University,College Station,Texasの記載に従い、
得られた構築物pVL11L1を、オートグラファ・カリフォルニカ核多角体病ウイル
ス（AcNPV）ゲノムDNAと共にSf-9細胞を共トランスフェクトするために用いた。
参照として本明細書に組み込まれるSummersら、A Manual of Method for Baculo
virus Vectors and Insect Cell Culture Procedures,1987,Texas A & M Univer
sity,College Station,Texasの方法に従い、視覚的な検査及び閉塞陰性（occlus
ion-negative/occ）プラークの選択により組換えバキュロウイルスを回収し、さ
らに2回のプラーク精製を行った。単離されたウイルス・ストックからのタンパ
ク質発現を、ウェスタンブロットにより決定した。
【００４３】 2．Sf-9細胞における組換えL1発現のSDS-PAGE及びウェスタンブロット検出 感染したSf-9培養細胞を150cm2組織培養フラスコ内で増殖させ、分析用SDS-PA
GE及びウェスタンブロット・アッセイ法のため調製した。パスツール・ピペット
での再懸濁により非組換えL1感染細胞又は組換えL1感染細胞をフラスコから収集
し、同数の野生型L1感染細胞又は組換えL1感染細胞を500×gで10分間4℃で遠心
分離した。上清を除去し、細胞ペレットを氷上に移し、直ちに1mlの溶解緩衝液
（30mMトリス（pH7.6）、10mM MgCl2、1mM CaCl2、1mMフェニルメチルスルホニ
ルフロリド（PMSF）、ロイペプチン（10μg/ml）、1％ NP-40）に再懸濁させ、
断続的に攪拌しながら室温で15分間放置した。4℃で2分間500×gで遠心分離した
後、上清に含まれるNP40可溶性画分を除去し、参照として本明細書に組み込まれ
るLaemmliら、「バクテリオファージT4の頭部の組み立てにおける構造タンパク
質の切断(Cleavage of structural proteins during the assembly of the head
of the bacteriophage T4)」Nature 227:680-685(1970)の記載のようにして、2
×レムリ試料緩衝液で1：1に希釈し、3分間95℃に加熱した。NP40不溶性ペレッ
ト（核材料を含有）を冷PBS（1mM PMSF、10g/mlロイペプチン）で1回洗浄し、加
熱及び1×レムリ試料緩衝液中での攪拌により可溶化した。試料を10％SDSポリア
クリルアミドゲル中で電気泳動させ、参照として本明細書に組み込まれるRoseら
、「組換えバキュロウイルスによるHPV-6b及びHPV-11のL2オープン・リーディン
グ・フレームの全長産物の発現、並びにHPV-11完全ウイルス粒子との抗原性の比
較(Expression of the full-length products of the HPV-6b and HPV-11 L2 op
en reading frames by recombinant baculovirus and Antigenic comparisons w
ith HPV-11 whole virus particles)」J.Gen.Virol.71:2725-2729(1990)の記載
のようにして、クーマシーブルー染色（図1、パネルA）又はイモビロン（Immobi
lon）-Pメンブレン（Millipore Corp.、New Bedford、MA）へのブロッティング
（図1、パネルB）を行った。
【００４４】 3．非組換えL1及び組換えL1のストック溶液の調製 これらのアッセイ法は、AcNPV又はAc11L1に感染した昆虫細胞の抽出物から調
製された清澄化（高速）上清ストック溶液の希釈物を用いて実施された。1細胞
当たりおよそ10プラーク形成単位という感染多重度でAcNPV又はAc11L1のいずれ
かを感染させたSf-9細胞の懸濁培養物（100ml）を、27℃で72時間インキュベー
トした。次に、培養物を、1,000×gで10分間4℃で遠心分離し、細胞ペレットを2
0mlのホモジナイゼーション緩衝液（1M NaClを含む溶解緩衝液）に再懸濁させ、
氷上でダウンス（Dounce）ホモジナイザーで50ストロークでホモジナイズした。
ホモジネートを、冷却した30mlスクリューキャップ・コレックス（Corex）チュ
ーブに移し、3,000×gで10分間4℃で遠心分離した。次に、低速上清画分を、清
潔なチューブに移し、100,000×gで30分間4℃で遠心分離した。参照として本明
細書に組み込まれるStoscheckら、「タンパク質の定量(Quantification of prot
eins)」（1990,Methods in Enzymology,第182巻,54頁,Academic Press,Inc.,New
York）の方法に従い、280nmにおける分光測光的吸収により、高速上清画分の全
タンパク質濃度を測定し、新鮮なホモジナイゼーション緩衝液で当量に調整した
（30mg/mlにほぼ等しいタンパク質濃度）。グリセロールを10％（v/v）で添加し
、ストック溶液を分割し、-20℃で保存した。
【００４５】 4．ウェスタンブロット・アッセイ法及びイムノドットブロット・アッセイ法 ウサギ抗血清及びヒト血清における直鎖状エピトープ及び三次元エピトープに
対する抗体の特異性を決定するため、ウェスタンブロット・アッセイ法及びイム
ノドットブロット・アッセイ法を用いた。ウェスタンブロット・アッセイ法（図
3、パネルA、及び図4）は、参照として本明細書に組み込まれるLaemmli,「バク
テリオファージT4の頭部の組み立てにおける構造タンパク質の切断(Cleavage of
structural proteins during the assembly of the head of the bacteriophag
e T4)」Nature 227:680-685(1970)に記載のようなタンパク質変性試薬を含有し
、95℃で3分間加熱された1×レムリ試料緩衝液で1：100に希釈された2μl（約60
μg全タンパク質）の組換えL1ストック溶液を用いて実施された。変性試料を、
単一の100mm幅の試料ウェルに担荷し、10％SDSポリアクリルアミドゲル中で電気
泳動させ、イモビロン-Pメンブレンにブロットした。2％BSA溶液（Kirkegaard a
nd Perry Labs,Inc.、Gaithersburg、MD）により37℃で2時間ブロッキングした
後、メンブレンを、それぞれ約2.5μgの全タンパク質を含有する24.4mm幅のスト
リップへと切り離した。その後、ストリップを抗血清で検索した（図3、パネルA
、及び図4）。
【００４６】 イムノドットブロット・アッセイ法に関しては、非組換えL1又は組換えL1のス
トック溶液を冷PBS（1mM CaCl2）で1：1,000に希釈し、その一部100μl（約3.0
μgの全タンパク質を含有）を、イモビロン-Pメンブレンにドットした。組換えL
1の天然コンフォメーションを保存するため、イムノドットブロット試料調製物
からはタンパク質変性試薬を除去した。用いられたブロッキング、一次及び二次
抗体希釈溶液、洗浄、及び基質は、参照として本明細書に組み込まれるStrikeら
、「ヒト・パピローマウイルス6b型のL1及びL2の全長オープン・リーディング・
フレームを含む7個のDNAセグメントの大腸菌における発現及び（共通抗原）の位
置(Expression in Escherichia coli of seven DNA segments comprising the c
omplete L1 and L2 open reading frames of human papillomavirus type 6b an
d the location of the (common antigen))」J.Gen.Virol.70:543-555(1989)の
記載と同様であった。一次抗体のインキュベーションは、4℃で一晩実施され、
二次抗体のインキュベーションは室温で90分間実施された。イムノドットブロッ
トに関しては、基質溶液を除く全ての溶液が1mMのCaCl2を含有していた。一次抗
体の希釈率は、ウサギ抗血清については1：2,000、ヒト血清については1：1,000
であった。特異的に結合した抗体は、基質としてBCIP/NBT（Kirkegaard and Per
ry Laboratories,Inc.）を用いて、それぞれ1：2,000及び1：5,000の希釈率で用
いられたアフィニティ精製された抗ウサギ（Kirkegaard and Perry Labs,Inc.,G
aithersburg,MD）又は抗ヒト（TAGO Immunodiagnostics,Burlingame,CA）IgG-ア
ルカリホスファターゼ結合体により検出した。イムノドットブロット反応は、非
組換えL1と組換えL1のドット強度の視覚的な比較により調査した。組換えL1ドッ
トの色強度が、同一ストリップ上に存在する非組換え対照ドットの色強度よりも
大きい場合に、反応を陽性と見なした。
【００４７】 5.抗血清 用いられた変性L1抗血清は、参照として本明細書に組み込まれるStrikeら、「
ヒト・パピローマウイルス6b型のL1及びL2の全長オープン・リーディング・フレ
ームを含む7個のDNAセグメントの大腸菌における発現及び（共通抗原）の位置(E
xpression in Escherichia coli of seven DNA segments comprising the compl
ete L1 and L2 open reading frames of human papillomavirus type 6b and th
e location of the (common antigen))」J.Gen.Virol.70:543-555(1989)により
、抗pEX480として以前に記載されたものである。この抗血清は、参照として本明
細書に組み込まれるStanleyら、「高効率細菌発現ベクターの新規ファミリーの
構築：ヒト肝臓タンパク質をコードするcDNAクローンの同定(Construction of a
new family oh high efficiency bacterial expression vectors:Identificati
on of cDNA clones coding for human liver proteins)」EMBO.J.3:1429-1434(1
984)及びStrikeら、「ヒト・パピローマウイルス6b型のL1及びL2の全長オープン
・リーディング・フレームを含む7個のDNAセグメントの大腸菌における発現及び
（共通抗原）の位置(Expression in Escherichia coli of seven DNA segments
comprising the complete L1 and L2 open reading frames of human papilloma
virus type 6b and the location of the (common antigen))」J.Gen.Virol.70:
543-555(1989)により記載されたような、ベータガラクトシダーゼのカルボキシ
末端に融合したHPV-6b L1オープン・リーディング・フレームの中央領域に由来
する160アミノ酸配列を含有する、ゲル精製された細菌発現融合タンパク質によ
るウサギの免疫感作により得られた。この配列は、参照として本明細書に組み込
まれるStrikeら、「ヒト・パピローマウイルス6b型のL1及びL2の全長オープン・
リーディング・フレームを含む7個のDNAセグメントの大腸菌における発現及び（
共通抗原）の位置(Expression in Escherichia coli of seven DNA segments co
mprising the complete L1 and L2 open reading frames of human papillomavi
rus type 6b and the location of the (common antigen))」J.Gen.Virol.70:54
3-555(1989)に記載されたような、パピローマウイルスL1共通抗原を含有する。
用いられたウサギ完全ウイルス粒子抗血清は、参照として本明細書に組み込まれ
るBonnezら、「ヌードマウスにおけるヒト・パピローマウイルス11型（HPV-11）
感染の抗体媒介中和：ポリメラーゼ連鎖反応によるHPV-11 mRNAの検出(Antibody
-mediated neutlization of human papillomavirus type 11(HPV-11)infection
in the nude mouse:Detection of HPV-11 mRNAs by the polymerase chain reac
tion)」J.Inf.Dis.,165:376-380(1992)に記載されたようなものであり、Bonnez
ら、「ヌードマウスにおけるヒト・パピローマウイルス11型（HPV-11）感染の抗
体媒介中和：ポリメラーゼ連鎖反応によるHPV-11 mRNAの検出(Antibody-mediate
d neutlization of human papillomavirus type 11(HPV-11)infection in the n
ude mouse:Detection of HPV-11 mRNAs by the polymerase chain reaction)」J
.Inf.Dis.,165:376-380(1992)及びKreiderら、「感染性ヒト・パピローマウイル
ス11型のインビボにおける実験的作製(Laboratory production in vivo of infe
ctious human papillomavirus type 11)」J.Virol.61:590-593(1989)に従い、無
胸腺マウス包皮異種移植片から得られた精製された非変性HPV-11ビリオンでウサ
ギを免疫感作することにより作製された。患者の血清は、剖検により立証された
尖形コンジロームを有する個体から得られた。参照として本明細書に組み込まれ
るBonnezら、「尖形コンジロームを有するヒトにおける特異的抗体を検出するた
めのELISAにおけるヒト・パピローマウイルス11型ビリオンの使用(Use of human
papillomavirus type 11 virions in an ELISA to detect specific antibodie
s in humans with condylomata acuminata)」J.Gen.Virol.72:1343-1347(1991)
に記載されたような、HPV-11完全ウイルス粒子に基づくELISAにより陽性である
ことが以前に見出された血清標本を、VLPに対する抗体を検出する能力を最大に
するために用いた。対照血清は、生涯性的接触の経験がないことを明言する修道
女から得られた。これらの血清は、参照として本明細書に組み込まれるBonnezら
、「尖形コンジロームを有するヒトにおける特異的抗体を検出するためのELISA
におけるヒト・パピローマウイルス11型ビリオンの使用(Use of human papillom
avirus type 11 virions in an ELISA to detect specific antibodies in huma
ns with condylomata acuminata)」J.Gen.Virol.72:1343-1347(1991)に記載され
たような、HPV-11完全ウイルス粒子に基づくELISAにより決定したところ、HPV-1
1抗体陰性であった。
【００４８】 6．HPV-11 L1ウイルス様粒子の作製及び精製 組換えVLPは、一連の低速及び高速の遠心分離工程により、Ac11L1感染Sf-9細
胞懸濁培養物の無細胞培養上清から直接的に精製された。感染Sf-9細胞は、低速
（1,000×g）で200mlの懸濁培養物からペレット化され、無細胞上清が高速（100
,000×g）で90分4℃で再遠心分離された。高速ペレットを緩衝液A（50mMトリス
（pH8.0）、1M NaCl、10mM MgCl2、10mM CaCl2、2mMフェニルメチルスルホニル
フロリド（PMSF）、10μg/mlロイペプチン）に再懸濁させ、5.2gの固体CsClを添
加し、新鮮な緩衝液Aで最終容量を計13mlに調整した（0.4g/ml最終濃度）。遠心
分離（100,000×g、22時間、10℃）後、得られた単一のバンドを除去し、12mlの
新鮮な緩衝液A（CsClを含まない）で希釈し、精製されたVLPをペレット化するた
め再遠心分離（100,000×g、90分、4℃）した。ショ糖密度勾配遠心分離により
精製されたVLPを、2％中性緩衝リンタングステン酸による染色の後、電子顕微鏡
により同定した（図2、6、及び7）。
【００４９】 実施例II Sf-9細胞における組換えHPV-11 L1タンパク質の発現及び免疫学的検出 組換えウイルスAc11L1を感染させた昆虫細胞由来の全Sf-9細胞タンパク質のSD
S-PAGE分析により、Ac11L1感染細胞においてクーマシブルー染色により観察され
る新規な55kDタンパク質が証明された（図1A、レーン3）。図1（A及びB）を参照
すると、図1Aは、野生型AcNPV及び組換えAc11L1に感染したSf-9細胞溶解物のク
ーマシブルー染色されたSDSポリアクリルアミドゲルを示し、図1Bは、HPV L1共
通エピトープに特異的なウサギ・ポリクローナル抗血清で検索された野生型AcNP
V及び組換えAc11L1に感染したSf-9細胞溶解物のウェスタンブロットを示す。非
組換えL1感染Sf-9細胞溶解物（レーン1、2）及び組換えL1感染Sf-9細胞溶解物（
レーン3、4）を、不溶性画分（レーン1、3）と可溶性画分（レーン2、4）とに分
画し、10％ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動させた。分子参照（Mr）マーカ
ーは、左に示されており、右側の矢印は、組換えL1のおよその位置（約55kD Mr
）を示す。このタンパク質は、野生型AcNPV溶解物中には存在せず、参照として
本明細書に組み込まれるStrikeら、「ヒト・パピローマウイルス6b型のL1及びL2
の全長オープン・リーディング・フレームを含む7個のDNAセグメントの大腸菌に
おける発現及び（共通抗原）の位置(Expression in Escherichia coli of seven
DNA segments comprising the complete L1 and L2 open reading frames of h
uman papillomavirus type 6b and the location of the (common antigen))」J
.Gen.Virol.70:543-555(1989)に記載されたような、直鎖状HPV L1共通抗原に対
して調製されたウサギ抗血清と免疫反応性のタンパク質と共に移動する（図1B、
レーン3及び4）。低Mr L1免疫反応性バンドも検出され、これは全長L1産物の分
解に由来するのかもしれない（図1B、レーン3及び4）。この系において作製され
たL1の主要部分はNP40不溶性画分には出現したが、NP40可溶性画分にはおよそ25
〜30％が存在した（図1B、レーン4）。最大L1蓄積は、感染の72時間後に起こっ
た。
【００５０】 実施例III VLPの電子顕微鏡可視化 ショ糖でバンド化されたVLPのネガティブ染色調製物の電子顕微鏡写真（図2、
6、及び7）は、異なるVLPを示した。図2は、ショ糖密度勾配の50〜60％界面に存
在していたHPV-11カプシド様粒子を示している。図6は、バキュロウイルス系に
おけるHPV-6b L1コード配列の発現から生じ、全く同様に精製されたHPVの6b型（
HPV-6b）カプシド様粒子を示している。図7は、この方法が、HPV-16 L1コード配
列の発現による、HPVの16型（HPV-16）VLPの作製にも適していることを証明して
いる。図12及び16は、VLPが、塩化セシウム密度勾配遠心分離によっても同様に
精製されうることを証明している。図2におけるVLPの直接測定により決定された
粒子直径は、およそ52nmであった。この測定値は、参照として本明細書に組み込
まれるKlugら、「パピローマウイルス−ポリオーマI型のウイルスの構造：ヒト
・イボ・ウイルス(Structure of viruses of the papilloma-polyoma type I:Hu
man wart virus)」J.Mol.Biol.11:403-423(1965)に記載されたような、単離され
たパピローマウイルス・ビリオンの直径と一致している。
【００５１】 実施例IV HPV-11 VLP含有昆虫細胞抽出物のウサギ抗血清との免疫反応性 天然型又は変性型のL1タンパク質エピトープと反応したウサギ抗血清を用いて
、組換えL1タンパク質の免疫原特性を研究した。共通パピローマウイルス抗原に
対するウサギ抗血清pEX480は、ウェスタンブロット・アッセイ法において変性組
換えL1とよく反応したが、抗原が非変性条件下でブロッティング・メンブレン上
に置かれるイムノアッセイ法の型であるイムノドットブロットでは同一の抗原調
製物と反応しなかった（図3、ストリップAを比較せよ）。抗pEX480により示され
た反応性パターンとは対照的に、HPV-11完全ウイルス粒子に対して作製されたウ
サギ・ポリクローナル抗血清は、ウェスタンブロットでは組換えL1と反応しなか
ったが、イムノドットブロット・アッセイ法においては組換えL1と強く反応した
（図3、ストリップCを比較せよ）。天然非組換え対照調製物に対する免疫後血清
に反応性が欠如していることにより証明されたように、この反応性は特異的であ
った（図3、パネルB、ストリップC）。2つの型のイムノアッセイ法に存在するL1
の相対量の比較を可能にするため、これらのイムノアッセイ法にはウサギ抗血清
pEX215が含まれていた。両フォーマットにおけるpEX215抗血清の組換えL1との免
疫反応性のレベルは、ほぼ同等であり（図3、ストリップB）、存在するL1の量が
ほぼ等しいことが示された。さらに、この抗血清が両フォーマットにおいてL1と
反応することができることが観察されたため、pEX215抗血清により認識される（
一つ又は複数の）直鎖状免疫反応性L1アミノ末端エピトープは、より高次のL1コ
ンフォメーションの採用により妨害されないことが示唆される。
【００５２】 実施例V VLP含有昆虫細胞抽出物のヒト血清との免疫反応性 直鎖状エピトープ及び三次元エピトープに対する抗体のヒト血清中の有病率を
決定するため、剖検により立証された尖形コンジロームを有する個体から得られ
た血清を、VLPを抗原として用いたウェスタンブロット・アッセイ法及びイムノ
ドットブロット・アッセイ法において評価した。患者の血清又は対照血清はいず
れも、ウェスタンブロットにより変性組換えL1と免疫反応性であった（図4、ス
トリップD〜O（患者）及びP〜X（対照））。反対に、患者の血清12個（ストリッ
プHを除き、ストリップD〜Oは陽性と見なされた）のうちの11個及び対照血清9個
（図5、ストリップP〜X）のうちの0個が、イムノドットブロットにより組換えL1
と免疫反応性であり、高度の統計学的有意差が存在した（p＝7×10-5；フィッシ
ャーの直接法）。この結果は、参照として本明細書に組み込まれるBonnezら、「
尖形コンジロームを有するヒトにおける特異的抗体を検出するためのELISAにお
けるヒト・パピローマウイルス11型ビリオンの使用(Use of human papillomavir
us type 11 virions in an ELISA to detect specific antibodies in humans w
ith condylomata acuminata)」J.Gen.Virol.72:1343-1347(1991)に記載されたよ
うな、HPV-11完全ウイルス粒子に基づくELISAにおいて同一の血清を用いて以前
に得られた結果とよく相関している。
【００５３】 実施例VI ELISAアッセイ法 CsCl精製VLPを分光測光器（A280）により定量し、冷PBSで8ng／mlの濃度に希
釈した。PBS又は希釈VLP溶液（800ng全タンパク質）のいずれかの一部（100μl
）を、ウェルに担荷し、プレートを4℃で一晩放置した。プレートを1％BSAによ
り室温で2時間ブロッキングした後、二連で1：100の希釈率の抗血清を添加した
。一次抗血清を室温で90分間反応させた。プレートを4回洗浄し、二次抗体（ヤ
ギ抗ヒトIgGアルカリホスファターゼ結合体）を添加し（TAGO、1：5,000）、プ
レートを室温で90分間放置した。各ウェルに基質を添加し、405nmの吸光度を読
み取った。各レプリケートのVLP吸光度からPBS吸光度を差し引き、平均吸光度値
をとることにより、特異的吸光度を計算した。
【００５４】 VLPを用いて得られた結果（図8）は、抗原としてHPV-11完全ウイルス粒子を用
いた、同一血清（RRP患者由来）のELISA試験において以前に報告された結果と等
価であった（50％）。以前の完全ウイルス粒子に基づくELISAからの結果との良
好な相関を、図9に与える（r2＝0.75）。
【００５５】 実施例VII ウェスタンブロット及びイムノドットブロット 参照として本明細書に組み込まれるRoseら、J.Virol.,67:1936-1944(1993)に
より以前に記載されたようにして、Sf-9懸濁培養物（100ml）にAcNPV（非非組換
え対照）、Ac11L1、又はAc16L1の組換えバキュロウイルスを感染させ、27℃で72
時間インキュベートした。図11を参照すると、試料は、参照として本明細書に組
み込まれるRoseら、J.Virol.,67:1936-1944(1993)及びRoseら、J.Gen.Virol.71:
2725-2729(1990)に以前に記載されたようにして、調製され、電気泳動され、イ
ムノブロットされた。電子顕微鏡により確認したところ、VLPは、両方の試料調
製物中に存在した（データは示していない）。全試料タンパク質濃度は、使用前
に分光測光器（A280）により平衡化された。
【００５６】 図10(a)を参照すると、参照として本明細書に組み込まれるBonnezら、J.Inf.D
is.165:376-380(1992)により以前に記載されたようにして、試料（20μg全タン
パク質／1レーン）を、10％SDS-ポリアクリルアミドゲル中で電気泳動させ、一
晩ウェスタンブロットした。ニトロセルロース・ブロットを、参照として本明細
書に組み込まれるChristensenら、Virus Research 21:169-179(1991)により記載
されたような1：1,000の希釈率で用いられたウサギ抗血清R5-409で検索した。図
10（a）（左パネル）に示されたように、組換えHPV-11 L1タンパク質（レーン2
）及び組換えHPV-16 L1タンパク質（レーン3）は、抗パピローマウイルスL1共
通エピトープ抗血清R5-409により、ほぼ同量で検出された。組換えHPV-16 L1タ
ンパク質により示されるわずかに遅い移動速度と一致して、HPV-16 L1タンパク
質の推定アミノ酸配列は、HPV-11 L1タンパク質の予測配列よりも5アミノ酸長い
。
【００５７】 図10(b)を参照すると、試料を希釈し（PBSによる2段階希釈）、最初は25μgと
いう全タンパク質濃度（下）で、最後は25ngという全タンパク質濃度（上）で、
非変性条件下でニトロセルロースに供した。ウサギ抗血清R-366を1：1,000の希
釈率で用いた。右パネル（即ち、イムノドットブロット）において、完全ウイル
ス粒子抗血清は、天然組換えHPV-11 L1 VLP調製物を1,000倍の希釈域にわたり検
出した。しかし、これと同一の過剰免疫ウサギ抗血清は、ウェスタンブロットに
よる分析に用いられた濃度より高い抗原濃度（25μg）ですら、天然組換えHPV-1
6 L1 VLP調製物とは免疫反応性でなかった。
【００５８】 過剰免疫ウサギ天然HPV-11ビリオン中和抗血清は、天然HPV-16 L1タンパク質
と交差反応せず、この抗血清により認識されるHPV-11カプシドの（一つ又は複数
の）三次元エピトープが、HPV-16 L1 VLP調製物中に存在する三次元エピトープ
とは免疫学的に異なることが示唆された。
【００５９】 実施例VIII ウェスタンイムノブロット・アッセイ法 Ac11L1感染Sf-9細胞懸濁培養物（200ml）の上清培地中にVLPが検出され、直接
的に精製された。低速（1000×g）で細胞をペレット化し、次に無細胞上清を高
速（100,000×g）で遠心分離した。参照として本明細書に組み込まれるRose,R.C
.ら、「ヒト・パピローマウイルス（HPV）11型組換えウイルス様粒子は、中和抗
体の形成を誘導し、ヒト血清中のHPV特異的抗体を検出する(Human Papillomavir
us(HPV) Type 11 Recombinant Virus-Like Particle Induce the Formation of
Neutralizing Antibodies and Detect HPV-Specfic Antibodies in Human Sera)
」J.Gen.Virol.75:2075-2079(1994)に以前に記載されたようにして、低速遠心分
離（1,000×g）により細胞を除去し、培養上清からVLPを調製した。図11Aは、ク
ーマシーブルーで染色された10％SDS-ポリアクリルアミドゲルである。図11Bは
、1：1,000の希釈率で用いられた、参照として本明細書に組み込まれるStrikeら
、J.Gen.Virol.70:543-555(1989)に記載されたようなHPV共通抗原に特異的なウ
サギ抗血清で検索された、同様に担荷されたゲルのウェスタンイムノブロットで
ある。非組換えL1又は組換えL1に感染したSf-9細胞の培養上清から得られた高速
ペレットの検査より、組換えL1感染上清画分にVLPが存在することが示された。
参照として本明細書に組み込まれるBonnezら、J.Inf.Dis.165:376-380(1992)に
以前に記載されたようにして、再懸濁された組換えL1高速ペレットを平衡密度勾
配遠心分離により精製した。この方法により得られた単一のバンドを、無菌の18
ゲージ針を用いて除去し、容量が12mlになるよう新鮮な緩衝液A（50mMトリス（p
H8.0）、1M NaCl、10mM MgCl2、10mM CaCl2、2mMフェニルメチルスルホニルフロ
リド（PMSF）、10μg/mlロイペプチン）で希釈し、100,000×gで90分間4℃で再
遠心分離した。0.5mlの新鮮な緩衝液A（50％グリセロール）でペレットを再懸濁
させた後、2％リンタングステン酸によりネガティブ染色された試料の一部の電
子顕微鏡分析により、完全なHPV VLPの存在が確認された（図12）。
【００６０】 以前に記載されたように、組換えVLPはHPV-11完全ウイルス粒子に対する抗体
と免疫反応性であった（参照として本明細書に組み込まれるRoseら、J.Virol.,6
7:1936-1944(1993)を参照のこと）。本研究において、本出願人らは、精製され
たVLPでウサギを免疫感作し、完全ビリオンとの免疫反応性について免疫後血清
を試験した。完全フロイント・アジュバント中の精製されたVLP（およそ20μgタ
ンパク質）の1：1乳濁液により、ニュージーランド白ウサギを2つの部位で筋肉
内免疫感作した（1部位当たり0.25ml）。不完全フロイント・アジュバント中に
調製されたVLP乳濁液による追加感作を30日後に与え、14日後に免疫血清を収集
した。参照として本明細書に組み込まれるRoseら、J.Virol.,67:1936-1944(1993
)に以前に記載されたようにして、ドットブロット・イムノアッセイ法において
、血清を、天然HPV-11ビリオン又は組換えVLPのいずれかと反応させた。図13に
示されたように、抗VLP抗体と完全ビリオンとの免疫学的な交差反応性から、VLP
が免疫原性であり、感染性HPV-11ビリオンの抗原プロフィールを忠実に再現する
らしいことが証明された。図13を参照すると、精製された非変性試料調製物は、
本明細書に組み込まれるRoseら、J.Virol.,67:1936-1944(1993)に記載されたよ
うにして、ニトロセルロースに供した。
【００６１】 実施例IX 中和活性 感染HPV-11Hersheyウイルス懸濁液（John Kreider、Department of Pathology
and Microbiology and Immunology、The Milton S.Hershey Medical Center、H
ershey、PA.により最初に提供された）の調製は、参照として本明細書に組み込
まれるBonnezら、J.Inf.Dis.165:376-380(1992)に記載されている。4つの平行実
験において、450μlの感染性ウイルス懸濁液（バッチ4/90）を、免疫前抗HPV-11
血清（1群）、免疫後抗HPV-11血清（2群）、免疫前抗VLP血清（3群）、又は免疫
後抗VLP血清（4群）のいずれか50μl（1：10最終希釈率）と共に37℃で1時間イ
ンキュベートした。1群及び2群は、参照として本明細書に組み込まれるBonnezら
、J.Inf.Dis.165:376-380(1992)により以前に記載された中和対照であり、3群及
び4群が被検群であった。通常の環状切除のため切除されたヒト包皮の調製も、
参照として本明細書に組み込まれるBonnezら、J.Gen.Virol.72:1343-1347(1991)
により記載されている。包皮を1×1mm平方に切断し、用いられた各包皮からの少
数の断片を急速凍結し、保存した。残りの断片は、4つの群に等分し、インキュ
ベーション時間の最後に、各群を4つのウイルス懸濁液−血清混合物のうちの一
つに添加した。混合物を37℃で1時間インキュベートした。各実験群について、
一つの包皮断片を、3匹の同腹子であるBALB/cバックグラウンドの4〜6週齢無胸
腺nu/nuマウス（Taconic Farms、Germantown、NY）の各腎臓の副腎の下に置いた
。実験は、異なる日に異なる包皮を用いて繰り返された。従って、各実験群につ
いて、計12個の移植片が移植された。移植から12週間後、動物を屠殺し、その時
点で移植片を取り出し、処理した（参照として本明細書に組み込まれるBonnezら
、J.Inf.Dis.165:376-380(1992)を参照のこと）。図14を参照すると、移植片を
本明細書に記載の分析のため調製し、（1）免疫前ウサギHPV-11完全ウイルス粒
子血清及び（2）免疫前ウサギHPV-11完全ウイルス粒子血清、又は（3）免疫前ウ
サギHPV-11 L1ウイルス様粒子血清及び（4）免疫後ウサギHPV-11 L1ウイルス様
粒子血清のいずれかで前処理されたウイルス溶解物を感染させた。黒丸は第一レ
プリケート実験に相当し、白丸は第二レプリケート実験に相当する。水平線は、
中央値GMDを示す。移植片サイズ比較のため、回収された移植片の長さ、幅、及
び高さの積の立方根をとることにより、幾何平均直径（GMD）を計算した。
【００６２】 安楽死の時点で、中和対照の免疫前及び免疫後の抗HPV-11処理群のそれぞれか
ら一つの移植片が失われた。従って、これらの各群における分析に利用可能な移
植片の数は11であった（図14）。免疫前及び免疫後の対照群における移植片の中
央値［範囲］GMD（mm）は、それぞれ2.9［1.0、4.9］及び1.3［1.0、2.6］であ
った。1.6mmの差は、統計的に有意であった（P＝0.004、マン−ホイトニーU検定
）。免疫前及び免疫後の抗VLP抗体処理群においては、12個の移植された移植片
が全て分析に利用可能であった（図4）。移植片の中央値［範囲］GMD（mm）は、
それぞれ2.3［1.3、4.2］及び1.0［1.0、1.8］であった。1.3mmのサイズの差は
、統計学的に有意であった（P＜10-4）。第一実験と第二実験の移植片サイズの
差は、免疫前群においては統計学的に有意でなかったが（P＝0.62）、免疫後群
においては、有意であった（P＝0.007）。従って、本出願人らは、各レプリケー
ト実験内の免疫前抗VLP抗体処理群と免疫後抗VLP抗体処理群との間の移植片サイ
ズの差を比較した。いずれも統計的に有意であった（第一レプリケートについて
はP＝0.002、第二レプリケートについてはP＝0.04）。
【００６３】 実施例X ウイルスDNAの起源 HPV-11ゲノムDNAの起源（参照として本明細書に組み込まれるBonnezら、J.Gen
.Virol.72:343-1347(1991)）及びAc11L1組換えバキュロウイルスの構築（参照と
して本明細書に組み込まれるRoseら、J.Virol.,67:1936-1944(1993)）は、記載
されている。HPV-16ゲノムDNAは、CIN III病巣から回収され、Ac16L1バキュロウ
イルスの構築には標準的なクローニング法が用いられた（Chesters and McCance
、未公開のデータ）。HPV-18 L1配列は、HPV-18原型（H.zur Hausenより提供）
からポリメラーゼ連鎖反応により増幅され、Ac11L1の構築に用いられたのと同一
の方法によりAc18L1バキュロウイルスを構築するために用いられた（参照として
本明細書に組み込まれるRoseら、J.Virol.,67:1936-1944(1993)）。
【００６４】 実施例XI 組換えVLPの精製 組換えVLPは、参照として本明細書に組み込まれるRose,R.C.ら、「ヒト・パピ
ローマウイルス（HPV）11型組換えウイルス様粒子は、中和抗体の形成を誘導し
、ヒト血清中のHPV特異的抗体を検出する(Human Papillomavirus(HPV) Type 11
Recombinant Virus-Like Particle Induce the Formation of Neutralizing Ant
ibodies and Detect HPV-Specfic Antibodies in Human Sera)」J.Gen.Virol.75
:2075-2079(1994)により記載されたようにして精製された。精製されたHPV-11、
HPV-16、又はHPV-18のVLPを含有する単一のバンドを、シリンジによりCsCl密度
勾配から取り出し、緩衝液A（50mMトリス（pH8.0）、1M NaCl、10mM MgCl2、10m
M CaCl2、2mMフェニルメチルスルホニルフロリド（PMSF）、10μg/mlロイペプチ
ン）で12mlに希釈し、4℃で90分間100,000×gで沈降させた。ペレットを200μl
の50％グリセロール含有緩衝液Aに再懸濁させ、分光測光法（280nm）により定量
し、-20℃で保存した。組換えL1タンパク質を、以前に記載されたようなSDS-PAG
E及びウェスタンブロット・イムノアッセイ法により分析した（参照として本明
細書に組み込まれるRoseら、J.Virol.,67:1936-1944(1993)）。5μgの精製され
たHPV-11、HPV-16、又はHPV-18のVLPを含有する試料を電気泳動させ、ブロット
し、以前に記載されたような抗パピローマウイルスL1（抗PVL1）共通抗原ウサギ
抗血清で検索した（参照として本明細書に組み込まれるStrikeら、J.Gen.Virol.
70:543-555(1989)及びRoseら、J.Virol.,67:1936-1944(1993)）。HPV-11、HPV-1
6、及びHPV-18のL1オープン・リーディング・フレーム（ORF）の予測コード容量
は、それぞれ501アミノ酸（参照として本明細書に組み込まれるDartmannら、Vir
ology 151:14-130(1986)）、505アミノ酸（参照として本明細書に組み込まれるS
eedorfら、Virology 145:181-185(1985)）、及び507アミノ酸（参照として本明
細書に組み込まれるColeら、J.Mol Biol.193:599-608(1987)）であり、予想サイ
ズ（約55kD Mr）のL1免疫反応性バンドが、ウェスタンブロット・イムノアッセ
イ法により試験された3つの各試料調製物中に出現した（図15）。低分子量L1免
疫反応性タンパク質も、CsCl精製VLP調製物のウェスタンブロット・イムノアッ
セイ法により検出され（図15）、その後の分析においてこれらのタンパク質の相
対量が変動したため（データは示していない）、それらは全長L1タンパク質の分
解産物である可能性が高い。しかし、各試料中の約55kD MrのL1免疫反応性バン
ドは、移動度も相対量も変動しなかった（データは示していない）。精製された
試料（2％リンタングステン酸でネガティブ染色）の電子顕微鏡により、HPV-11
（図16A）、HPV-16（図16B）、及びHPV-18（図16C）のVLP調製物中のVLP形成が
確認された。
【００６５】 実施例XII ウサギVLP免疫血清の調製及びELISAの条件 HPV-11、HPV-16、及びHPV-18のL1 VLPウサギ免疫血清は、以前に記載された方
法を用いて（参照として本明細書に組み込まれるBonnezら、J.Inf.Dis.165:376-
380(1992)、Roseら、J.Virol.,67:1936-1944(1993)）、2匹のニュージーランド
白ウサギに2つの部位で各VLP調製物を筋肉内免疫感作することにより調製された
（即ち、6匹のウサギが免疫感作された）。ウサギ抗PVL1共通抗原（参照として
本明細書に組み込まれるStrikeら、J.Gen.Virol.70:543-555(1989)）、HPV-11完
全ビリオン（参照として本明細書に組み込まれるBonnezら、J.Inf.Dis.165:376-
380(1992)）、並びにHPV-11、HPV-16、及びHPV-18のVLP抗血清が、3つの組換えV
LP調製物に対するELISAにより試験された（図17）。このELISAのため、精製され
たVLPをPBS中10mg/mlの濃度に希釈し、約1μgの抗原を含有する一部又はPBSのみ
を、96穴ELISAプレートの別の列に分配した。アッセイ法の条件は、試験の前に
ブロッキング溶液（2％v/v）で希釈された非組換え（AcNPV）バキュロウイルス
感染Sf-9細胞溶解物を一次抗血清に予備吸着させたことを除けば、以前に記載さ
れたのと全く同様であった（参照として本明細書に組み込まれるRose,R.C.ら、
「ヒト・パピローマウイルス（HPV）11型組換えウイルス様粒子は、中和抗体の
形成を誘導し、ヒト血清中のHPV特異的抗体を検出する(Human Papillomavirus(H
PV) Type 11 Recombinant Virus-Like Particle Induce the Formation of Neut
ralizing Antibodies and Detect HPV-Specfic Antibodies in Human Sera)」J.
Gen.Virol.75:2075-2079(1994)）。全ての抗血清が、多数回、1：1,000から1：1
28,000の範囲の希釈率で二連で試験された。図17に示されたウサギ抗VLP抗血清
の全ての吸光度値は、これらの抗血清の最適希釈率である1：16,000で得られた
。抗VPL1共通抗原及びHPV-11完全ビリオンウサギ抗血清についての吸光度値は、
より低い希釈率で得られた（1：1,000）。特異的吸光度値は、各レプリケートに
ついて実験値（抗原含有ウェル）から対照値（PVSウェル）を差し引くことによ
り決定され、平均（504nm）吸光度値が決定された。
【００６６】 実施例XIII VLP ELISA 患者の血清中の特異的抗体を検出する能力について調査するため、VLPをELISA
イムノアッセイ法において試験し、その結果をHPV-11完全ビリオンELISAイムノ
アッセイ法において同一血清を用いて以前に得られた結果と比較した（参照とし
て本明細書に組み込まれるBonnezら、J.Med.Virol.39:340-344(1993)）。以前の
完全ビリオンELISA（参照として本明細書に組み込まれるBonnezら、J.Med.Virol
.39:340-344(1993)）において用いられた量と等価な量を与えるため、リン酸緩
衝生理食塩水（PBS）で抗原を希釈し、抗原溶液又は抗原を含まないPBSのいずれ
かを96穴プレートの別の列に分配した。4℃で16時間コーティングした後、これ
らの溶液を吸引し、ウェルを室温で2時間希釈剤／ブロッキング溶液（Kirkegaar
d and Perry Laboratories,Inc.、Gaithersburg、MD）でブロッキングした。HPV
-11完全ウイルス粒子ELISA（参照として本明細書に組み込まれるBonnezら、J.Me
d.Virol.39:340-344(1993)）により以前に試験された計59個のヒト血清（43患者
、16対照）を、希釈剤／ブロッキング溶液で1：100に希釈し、その一部100μlを
PBS単独又は抗原溶液のいずれかで処理されたウェルに添加した（血清試料1つ当
たり2個のレプリケート）。プレートを室温で90分間インキュベートし、次に4回
洗浄した（洗浄溶液、Kirkegaard and Perry Laboratories,Inc.、Gaithersburg
、MD）。抗ヒトIgGアルカリホスファターゼ結合体（100μl、1：5000に希釈、TA
GO、Burlingame、CA）を、各ウェルに添加し、プレートを室温で90分間インキュ
ベートした。プレートを4回洗浄し、アルカリホスファターゼ基質（ジエタノー
ルアミン緩衝液中のp-ニトロフェニルホスフェート）で発色させた。各血清試料
についての405nmにおける特異的吸光度を、各レプリケートについて抗原含有ウ
ェルから得られた値からPBS処理ウェルから得られた値を差し引くことにより計
算し、平均レプリケート差を計算した。本明細書中の別の箇所で論じた完全ビリ
オンELISAにおいて、処理の経過中のカプシド抗体レベルの変化について、42人
の患者の血清（及び20人の対照血清）を分析した（参照として本明細書に組み込
まれるBonnezら、J.Med.Virol.39:340-344(1993)）。本ELISA実験において試験
された全ての血清が、以前の実験のために収集された。以前の実験において分析
された患者の血清の一つは、イムノアッセイ法の結果ではなく処理の結果に関す
る理由のため除外された。しかし、この血清の吸光度値は利用可能であったため
、その血清は本アッセイ法に含まれ、本ELISA実験において分析された患者の血
清の数は43に増加した。分析された対照血清の数は、アッセイ法に適したロジス
ティックな考慮のため、20から16に減少した。
【００６７】 OD値で表された16個の対照血清の中央値［範囲］血清反応性は、43人の患者の
血清についての0.024［-0.063、0.512］と比較して、0.005［-0.029、0.025］で
あり、統計学的に有意な差（P＝0.01、マン−ホイトニーU検定）が存在した。対
照群における最も高いOD値をカットオフ値として用いると、アッセイ法の感度は
49％であった（P＝2×10-4；フィッシャーの直接法）。従って、HPV-11 VLP ELI
SAは尖形コンジロームの患者と対照とを区別することができた。さらに、全ての
血清を含めた場合、又はHPV-11 VLP ELISAにより陽性であった21個の血清のみを
考慮した場合、HPV-11 VLP ELISAによる試料血清反応性とHPV-11ビリオンELISA
による試料血清反応性との間には極めて良好な相関（ピアソンの積率r＝0.87；P
＜10-6）が存在した（r＝0.87；P＜10-6）。
【００６８】 実施例XIV 経口投与されたVLPは、全身性の免疫グロブリンG（IgG）抗体及びIgA抗体の応
答を誘導する 以前に記載されたようにして構築された組換えバキュロウイルスAc11L1及びAc
11L2を昆虫細胞に共形質転換することにより、HPV-11 VLPを作製した（参照とし
て本明細書に組み込まれるRose,R.C.ら、「昆虫細胞におけるヒト・パピローマ
ウイルス11型L1タンパク質の発現：ウイルス様粒子のインビボ及びインビトロに
おける組み立て(Expression Of Human Papillomavirus Type 11 L1 Protein In
Insect Cells:In Vivo And In Vitro Assembly of Virus-Like Particles)」J.V
irology 67(4):1936-1944(1993)、Rose,R.C.ら、「組換えバキュロウイルスによ
るHPV-6b及びHPV-11のL2オープン・リーディング・フレームの全長産物の発現、
並びにHPV-11完全ウイルス粒子との抗原性の比較(Expression of the full-leng
th products of the HPV-6b and HPV-11 L2 open reading frames by recombina
nt baculovirus and Antigenic comparisons with HPV-11 whole virus particl
es)」J.Gen.Virol.71:2725-2729(1990)）。精製されたVLPを3つの用量レベル（
リン酸緩衝生理食塩水中100μg、50μg、又は10μg）で製剤化し、5匹の雌BALB/
cマウス（8〜10週齢）の3つの群に6週間にわたり3回胃内に投与した。一次免疫
感作から14日後及び41日後にも追加接種を経口投与した。第4のマウス群には、
接種を与えなかった。眼窩後穿刺により2週間毎に血清を収集した。収集後に各
マウス群内で免疫前血清及び免疫後血清をプールし、以前に記載されたようにし
て酵素結合イムノソルベントアッセイ法（ELISA）で試験した（参照として本明
細書に組み込まれるLi,M.ら、「大腸菌におけるヒト・パピローマウイルス11型L
1カプシド・タンパク質の発現：DNA結合及びカプシド組み立てに関与するタンパ
ク質ドメインの特徴決定(Expression of The Human Papillomavirus Type 11 L1
Capsid Protein In Escherichia Coli:Characterization of Protein Domains
Involved in DNA-Binging And Capsid Assembly)」J.Virology,71:2988-2995(19
97)、White,W.I.ら、「真正ヒト・パピローマウイルス16型のインビトロ感染及
び型限定抗体媒介中和(In Vitro Infection and Type-Restricted Antibody-Med
iated Neutralizaion of Authentic Human Papillomavirus Type 16)」J.Virolo
gy 72:959-964(1998)）。以前に記載されたようにして特異的吸光度値（405nm）
を決定した（参照として本明細書に組み込まれるLi,M.ら、「大腸菌におけるヒ
ト・パピローマウイルス11型L1カプシド・タンパク質の発現：DNA結合及びカプ
シド組み立てに関与するタンパク質ドメインの特徴決定(Expression of The Hum
an Papillomavirus Type 11 L1 Capsid Protein In Escherichia Coli:Characte
rization of Protein Domains Involved in DNA-Binging And Capsid Assembly)
」J.Virology,71:2988-2995(1997)、White,W.I.ら、「真正ヒト・パピローマウ
イルス16型のインビトロ感染及び型限定抗体媒介中和(In Vitro Infection and
Type-Restricted Antibody-Mediated Neutralizaion of Authentic Human Papil
lomavirus Type 16)」J.Virology 72:959-964(1998)）。中間抗原用量群及び高
抗原用量群における応答は、第2の追加接種後2週間以内にほぼ同等となった（図
18A）。
【００６９】 以前に記載されたようにして（参照として本明細書に組み込まれるGray,J.J.
ら、「ノーウォークウイルスを投与された成人有志者におけるバキュロウイルス
で発現したノーウォークウイルス・カプシド抗原を用いた間接的な酵素結合イム
ノソルベント・アッセイ法による免疫グロブリンM（IgM）、IgA、及びIgGノーウ
ォークウイルス特異的抗体の検出(Detection Of Immunoglobulin M(IgM),IgA,an
d IgG Norwalk Virus-Specific Antibodies By Indirect Enzyme-Linked Immuno
sorbent Assay With Baculovirus-Expressed Norwalk Virus Capsid Antigen In
Adult Volunteers Challenged With Norwalk Virus)」Journal of Clinical Mi
crobiology 32(12):3059-3063(1994)）、ヤギ抗マウスIgG（Kirkegaard and Per
ry Laboratories,Inc.、Gaithersburg、MD）による前処理により血清IgG抗体を
除去した後、免疫感作された動物由来の免疫後血清中にも血清IgA抗体応答が検
出された（図18B）。IgG抗体及びIgA抗体の応答の動態はほぼ同等であったが（
図18A、B）、IgG応答の相対的な大きさはIgA応答よりもはるかに大きかった（図
18）。
【００７０】 IgGサブクラス分析により、特定のサブクラスの明らかな優勢はないことが示
されたが、IgG2a及びIgG2bの出現はIgG1の出現よりも早かった（表1）。
【００７１】
【表１】 VLP血清IgGサブクラス分析
【００７２】 IgG2aは、ウイルス感染に対するマウス免疫応答の顕著な成分であることが示
されている（参照として本明細書に組み込まれるCoutelier,J.P.ら、「マウスIg
G抗体サブクラスのウイルスにより誘導されたモデュレーション(Virally Induce
d Modulation of Murine IgG Antibody Subclasses)」J.Exp.Med.168(6):2373-2
378）。
【００７３】 実施例XV 経口誘導された血清VLP抗体の抗原特異性 経口誘導された抗体を、天然HPV-11 VLP及び変性HPV-11 VLP（参照として本明
細書に組み込まれるRose,R.C.ら、「昆虫細胞におけるヒト・パピローマウイル
ス11型L1タンパク質の発現：ウイルス様粒子のインビボ及びインビトロにおける
組み立て(Expression Of Human Papillomavirus Type 11 L1 Protein In Insect
Cells:In Vivo And In Vitro Assembly of Virus-Like Particles)」J.Virolog
y 67(4):1936-1944(1993)）並びに以前に記載されたような（参照として本明細
書に組み込まれるRose,R.C.ら、「組換えウイルス様粒子を用いたヒト・パピロ
ーマウイルスの11型、16型、及び18型の血清学的な区別(Serological Different
iation of Human Papillomavirus Types 11,16 and 18 Using Recombinant Viru
s-Like Particles)」J.Gen.Virol.75:2445-2449(1994)）異種天然VLPに対するEL
ISAにおいて評価した。抗原の変性は、炭酸緩衝液（pH9.5；0.01mg/ml最終濃度
）でVLPを希釈した後に、沸騰水浴中でインキュベート（10分間）することによ
り達成された（参照として本明細書に組み込まれるDillner,L.ら、「ヒト・パピ
ローマウイルス16型、ウシ・パピローマウイルス、イヌ・パピローマウイルス、
及びトリ・パピローマウイルスに共通の抗原性エピトープ及び免疫原性エピトー
プ(Antigenic and Immunogenic Epitopes Shared By Human Papillomavirus Typ
es 16 and Bovine,Canine,and Avian Papillomaviruses)」J.Virology 65(12):6
862-6871(1991)）。天然VLP抗原は、リン酸緩衝生理食塩液（PBS、pH7.1）で同
最終濃度に希釈され、評価まで氷上に維持された。図19に示されているように、
経口誘導された血清IgG VLP抗体及びIgA VLP抗体の特異性は、天然抗原コンフォ
メーションに完全に依存していた。以前に報告された結果と一致して（参照とし
て本明細書に組み込まれるRose,R.C.ら、「組換えウイルス様粒子を用いたヒト
・パピローマウイルスの11型、16型、及び18型の血清学的な区別(Serological D
ifferentiation of Human Papillomavirus Types 11,16 and 18 Using Recombin
ant Virus-Like Particles)」J.Gen.Virol.75:2445-2449(1994)）、経口誘導さ
れたHPV-11 VLP抗体は、免疫感作に用いられたのと同一の型のVLPとは高度に免
疫反応性であったが、異種HPV遺伝子型のVLPを用いたELISAでは免疫反応性でな
かった（図19）。
【００７４】 実施例XVI エピトープ遮断ELISA VLPエピトープ遮断ELISAは、抗体媒介ウイルス中和活性を検出するための代理
アッセイ法として開発された。このアッセイ法においては、未知の抗体調製物が
、同種感染性ビリオンを中和することが既知の抗体による同種VLP結合を阻止す
る能力について評価され、中和ドメインの遮断が、未知の抗体における中和活性
の証拠として解釈される。エピトープ遮断アッセイ法には、別の宿主種において
作製された未知抗体及びウイルス中和抗体が必要である。ウサギHPV-11ビリオン
中和ポリクローナル抗体（N-pAb）（参照として本明細書に組み込まれるRose,R.
C.ら、「ヒト・パピローマウイルス（HPV）11型組換えウイルス様粒子は、中和
抗体の形成を誘導し、ヒト血清中のHPV特異的抗体を検出する(Human Papillomav
irus(HPV) Type 11 Recombinant Virus-Like Particle Induce the Formation o
f Neutralizing Antibodies and Detect HPV-Specfic Antibodies in Human Ser
a)」J.Gen.Virol.75:2075-2079(1994)）が、以前に特徴決定されたHPV-11ビリオ
ン中和モノクローナル抗体（N-mAb）H11.H3（参照として本明細書に組み込まれ
るChristensen,N.D.ら、「感染性ヒト・パピローマウイルス11型のモノクローナ
ル抗体により媒介される中和(Monoclonal Antibody-Mediated Neutralization o
f Infectious Human Papillomavirus Type 11)」J.Virology 64(11):5678-5681(
1990)）により認識されるエピトープを遮断する能力を試験した。ウサギHPV-11
N-pAbの3段階希釈物を、250ngのHPV-11 VLPを含有する二連のウェルで試験した
。この後、予備力価測定されたH11.H3を、抗原飽和レベル未満（即ち1：180,000
）に希釈し、ウサギN-pAb/VLP複合体を含有するウェルに添加した。最後に、抗
ウサギ又は抗マウスIgG-アルカリホスファターゼ酵素結合体（Kirkegaard and P
erry Laboratories、Gaithersburg、MD）を平行列に添加することにより、結合N
-pAb対結合N-mAbの相対量を決定した。予想通り、ウサギN-pAbの低希釈物は、H1
1.H3のVLP結合を効率的に遮断し（図20A）、ウサギHPV-11 N-pAbがH11.H3により
決定される中和抗原特異性を含有することが示唆された。アッセイ法の妥当性を
さらに確認するため、HPV-16ビリオン中和モノクローナル抗体及びポリクローナ
ル抗体（参照として本明細書に組み込まれるChristensen,N.D.ら、「モノクロー
ナル抗体により決定されるHPV-16及びHPV-18のL1ウイルス様粒子表面の三次元エ
ピトープ及び直鎖状エピトープ(Surface Conformational and Linear Epitopes
on HPV-16 and HPV-18 L1 Virus-Like Particles as Defined By Monoclonal An
tibodies)」Virology 223(1):174-184(1996)、White,W.I.ら、「真正ヒト・パピ
ローマウイルス16型のインビトロ感染及び型限定抗体媒介中和(In Vitro Infect
ion and Type-Restricted Antibody-Mediated Neutralizaion of Authentic Hum
an Papillomavirus Type 16)」J.Virology 72:959-964(1998)）を同様に評価し
、ほぼ同等の結果を得た。本研究において作製されたマウス抗体の段階希釈物を
、予備力価測定されたウサギHPV-11 N-pAbの準飽和希釈物（1：9,000）に対して
評価した。その結果、低希釈率で、経口誘導されたHPV-11 VLP抗体が、ウサギN-
pAb VLP結合を効率的に遮断することが示され（図20B）、潜在的に防御的な体液
性応答が経口VLP免疫感作後に誘導されうることが示唆された。
【００７５】 結果 免疫学的観察より、組換えL1が天然コンフォメーションを採用していることが
示唆される。変性L1共通抗原に対して作製されたウサギ抗血清は、変性組換えL1
とのみ（即ち、ウェスタンブロットにより）免疫反応性であり、非変性完全ウイ
ルス粒子に対して作製されたウサギ抗血清は、非変性組換えL1とのみ（即ち、イ
ムノドットブロットにより）反応した。さらに、（参照として本明細書に組み込
まれるBonnezら、「尖形コンジロームを有するヒトにおける特異的抗体を検出す
るためのELISAにおけるヒト・パピローマウイルス11型ビリオンの使用(Use of h
uman papillomavirus type 11 virions in an ELISA to detect specific antib
odies in humans with condylomata acuminata)」J.Gen.Virol.72:1343-1347(19
91)によるELISAにおいてHPV-11ビリオンと反応性であった尖形コンジローム患者
由来のヒト血清も、非変性HPV-11組換えL1と反応した（図4、8、及び9）。従っ
て、本発明のVLPの三次元エピトープは、自然感染においてヒト免疫系により認
識される天然HPV-11ビリオンに存在するエピトープと類似していると考えられる
。パピローマウイルス血清学のいくつかの研究より、三次元エピトープに対する
抗体の特異性は、パピローマウイルス感染の優れた指標であることが証明されて
いる（参照として本明細書に組み込まれるBonnezら、「尖形コンジロームを有す
るヒトにおける特異的抗体を検出するためのELISAにおけるヒト・パピローマウ
イルス11型ビリオンの使用(Use of human papillomavirus type 11 virions in
an ELISA to detect specific antibodies in humans with condylomata acumin
ata)」J.Gen.Virol.72:1343-1347(1991)、Bonnezら、「治療応答による尖形コン
ジローム患者におけるヒト・パピローマウイルス11型（HPV-11）に対する抗体応
答の展開(Evolution of the antibody response to human papillomavirus type
11 (HPV-11) in patients with codyloma acuminatum according to treatment
response)」J.Med.Virol.39:340-44(1993)、Bonnezら、「ヌードマウスにおけ
るヒト・パピローマウイルス11型（HPV-11）感染の抗体媒介中和：ポリメラーゼ
連鎖反応によるHPV-11 mRNAの検出(Antibody-mediated neutlization of human
papillomavirus type 11(HPV-11)infection in the nude mouse:Detection of H
PV-11 mRNAs by the polymerase chain reaction)」1992,J.Inf.Dis.,165:376-3
80(1992)、Christensenら、「感染性ヒト・パピローマウイルス11型ビリオンを
中和するヒト血清抗体の検出(Detection of human serum antibodies that neut
ralize infectious human papillomavirus type 11 virions)」J.Gen.Virol.73:
1261-1267(1992)、Kienzlerら、「ヒト・イボにおけるヒト・パピローマウイル
ス1型（HPV-1）に対する体液性免疫及び細胞性免疫(Humoral and cell-mediated
immunity to human papillomavirus type 1(HPV-1) in human warts)」Br.J.De
rmatol.108:65-672(1983)、及びSteeleら、「ヒト・パピローマウイルス1型の破
壊されたエピトープ及び破壊されていないエピトープに対するヒト血清の体液性
アッセイ法(Humoral assays of human sera to distupted and nondisrupted ep
itopes of human papillomavirus type 1)」Virology 174:388-398(1990)）。こ
れらの特異性は、ウイルスの病原においても重要な役割を果たす。例えば、完全
HPV-11粒子に対するウサギ抗血清は、HPV-11感染性を中和する（参照として本明
細書に組み込まれるBonnezら、「ヌードマウスにおけるヒト・パピローマウイル
ス11型（HPV-11）感染の抗体媒介中和：ポリメラーゼ連鎖反応によるHPV-11 mRN
Aの検出(Antibody-mediated neutlization of human papillomavirus type 11(H
PV-11)infection in the nude mouse:Detection of HPV-11 mRNAs by the polym
erase chain reaction)」J.Inf.Dis.,165:376-380(1992)、及びChristensenら、
「感染性パピローマウイルスの抗体により媒介されるインビボの中和(Antibody-
Mediated Neutralization in vivo of Infectious papillomavirus)」J.Virol.
,64:3151-3156(1990)）。さらに、参照として本明細書に組み込まれるChristens
enら、「感染性ヒト・パピローマウイルス11型ビリオンを中和するヒト血清抗体
の検出(Detection of human serum antibodies that neutralize infectious hu
man papillomavirus type 11 virions)」J.Gen.Virol.73:1261-1267(1992)は、
ヒト血清を用いて、抗完全HPV-11ビリオン抗体と血清中和活性との間の相関を報
告した。本発明の組換えL1 VLPによるそのような抗体の検出は、診断的及び機能
的な重要性を有しているかもしれない。
【００７６】 組換えバキュロウイルスの構築を考慮する場合、本出願人らが構築した初期組
換えバキュロウイルスのいくつかは、正確なL1コード配列を有しているが、検出
可能なレベルのL1タンパク質を産生しなかった。このため、本出願人らは、HPV-
11の3'非翻訳領域及びいくつかのその他のHPV L1コード配列を調査した。ペンタ
ヌクレオチドmRNA分解シグナル配列AUUUA（参照として本明細書に組み込まれるS
haw G.and Kamen R.,「GM-CFS mRNAの3'非翻訳領域由来の保存されたAU配列は選
択的なmRNA分解を媒介する(A conserved AU sequence from the 3' untranslate
d region of GM-CFS mRNA mediates selective mRNA degradation)」Cell 46:65
9-67(1986)、Cole MD.and Mango SE.,「c-myc mRNA安定性のシス作用性決定基(c
is-acting determinants of c-myc mRNA stability)」Enzyme 44:167-80(1990)
、Shyu ABら、「c-fosメッセージ中の2つの異なる不安定化要素が、急速なmRNA
崩壊における第一段階として脱アデニル化を誘発する(Two distinct destabiliz
ing elements in the c-fos message trigger deadenylation as a first step
in rapid mRNA decay)」Genes & Development 5:221-31(1991)、Savant-Bhonsal
e S.and Cleveland DW.,「>20Sの分解複合体の翻訳依存的組み立てにより媒介さ
れるAUUUAモチーフを含有するmRNAの不安定性の証拠(Evidence for instability
of mRNAs containing AUUUA motifs mediated through translation-dependent
assembly of a >20S degradation complex)」Genes & Development 6:1927-37(
1992)）が、HPV-11 L1コード配列の終止コドンの30ヌクレオチド内に存在し、さ
らに、調査された他のHPV型も同様にL1終止コドンの近傍にAUUUA配列を有するこ
とが決定された。この配列を除去するか、又は変異を導入した場合、L1タンパク
質の発現レベルは増加する可能性がある。従って、クローニングのための制限酵
素部位が組み込まれているのみならず、L1終止コドンから30ヌクレオチド下流の
AUUUAペンタヌクレオチド配列が変異しているHPV-11ゲノムDNA由来のL1コード配
列を増幅するためのPCRプライマーを設計した。このクローンを増幅することに
より、極めて高レベルのL1タンパク質が作製された。BEVS系を用いた報告は、細
胞培養物1リットル当たり300〜500mgの範囲の組換えタンパク質産生レベルを与
えている。本発明においては、おそらく3'非翻訳領域内のL1分解シグナル配列の
除去により、組換えL1タンパク質産物のレベルがはるかに大きく、約600〜800mg
／リットルであった。
【００７７】 これらの結果は、同様の実験条件下で、HPV-11 VLPで免疫感作されたウサギ由
来の免疫後血清が、HPV-11完全ビリオンで免疫感作されたウサギから得られた血
清と同等の効率でヒト組織のHPV-11感染を遮断しうることを示している。各免疫
前血清では観察されなかった遮断は、初期ウイルス遺伝子発現の欠如と関連して
いた。従って、その効果は古典的なウイルス中和、即ちウイルスの侵入又は脱殻
の阻止と一致していた（参照として本明細書に組み込まれるDimmock,1993,Neutr
alization of Animal Viruses,Berlin:Springer-Verlag）。
【００７８】 ウイルス遺伝子発現の分析によりHPV-11中和を確認するため、参照として本明
細書に組み込まれるBonnezら、J.Inf.Dis.165:376-380(1992)に以前に記載され
たようにして、全ての移植片をHPV-11E1＾E4スプライシングされたmRNA転写物の
存在について分析した（データは示していない）。E1＾E4 mRNAは、免疫前VLP血
清で前処理された群の移植片の10/12（83％）及び免疫後VLP血清で前処理された
群の移植片の0/12（0％）に検出された（p＜10-4）。同様に、免疫前又は免疫後
の抗完全ビリオン血清で前処理された対照群においては、E1＾E4 mRNAは、8/11
（73％）及び0/11（0％）の移植片で検出された（p＝10-3）。これらの結果は、
免疫後VLP血清によるウイルス接種物の処理が、免疫中和と一致する効果である
、移植片増殖及びウイルス遺伝子発現の著しい阻害と関連していることを示して
いる。従って、組換えVLPは、感染性ウイルスによる免疫感作により得られる応
答と大きさが類似した中和応答を誘導することができる。
【００７９】 参照として本明細書に組み込まれるZhouら、Virology 185:251-257(1991)によ
り記載されたHPV16 L1-L2 VLPは、HPVビリオン（50-55）又はバキュロウイルス
で作製されたHPV11 VLP（50-55mm、参照として本明細書に組み込まれるRose,R.C
.ら、「ヒト・パピローマウイルス（HPV）11型組換えウイルス様粒子は、中和抗
体の形成を誘導し、ヒト血清中のHPV特異的抗体を検出する(Human Papillomavir
us(HPV) Type 11 Recombinant Virus-Like Particle Induce the Formation of
Neutralizing Antibodies and Detect HPV-Specfic Antibodies in Human Sera)
」J.Gen.Virol.75:2075-2079(1994)）よりもサイズが変動しやすく、小さい（直
径35〜40mm）。これらの形態学的特徴は、本発明において記載されたVLPとは極
めて異なっている。さらに、本発明の方法を用いれば、生物物理学的特徴及び抗
原性に関する特性が天然HPVビリオンのそれを密接に反映している粒子を形成す
るためには、HPV L1タンパク質のみで充分である。
【００８０】 同様の方法を用いて、キルンバウアー（Kirnbauer）らは、抗BPV-1 VLP抗体に
よるインビトロのマウスC127細胞のBPV-1媒介形質転換の阻害を報告した（参照
として本明細書に組み込まれるKirnbauerら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:12180
-12184(1992)）。その系において得られた結果は、本出願人らが性器HPV及びそ
の通常の標識組織を用いた中和を証明した、本発明において報告された結果を支
持している。参照として本明細書に組み込まれるGhimら、Int.J.Cancer 49:285-
289(1993)により以前に記載されたように、BPV-1/C127細胞アッセイ法からの結
果と、無胸腺マウス・ウシ胎児皮膚移植片系との一致が報告されているが、BPV-
1/C127マウス繊維芽細胞系は生産性でなく、従って中和はインビトロの形質転換
されたフォーカスの欠如からのみ推理されうる。さらに、BPV-1は、自然にはマ
ウスに感染せず、C127細胞に侵入するメカニズムは自然感染過程に関与するメカ
ニズムとは異なっている可能性がある。対照的に、本研究において用いられた無
胸腺マウスモデルは、参照として本明細書に組み込まれるKreiderら、Nature 31
7:639-641(1985)により以前に記載された天然標識組織の性器HPVによる感染に依
存しており、感染した移植片はインビボで維持され、感染移植片の形態学的及び
組織学的形質転換は、感染性ビリオンの産生を伴う（参照として本明細書に組み
込まれるKreiderら、J.Virol.61:590-593(1987)を参照のこと）。参照として本
明細書に組み込まれるBonnezら、J.Inf.Dis.165:376-380(1992)、Christensenら
、J.Virol.,64:3151-3156(1990)、Christensenら、Virus Research 21:169-179
、Christensenら、J.Virol.,64:5678-5684(1990)、及びChristensenら、J.Gen.V
irol.73:1261-1267(1992)により以前に記載されたような抗体により媒介される
移植片増殖阻害、及びウイルス遺伝子発現阻害の免疫細胞化学的証拠及び分子生
物学的証拠も、参照として本明細書に組み込まれるBonnezら、J.Gen.Virol.72:1
343-1347(1991)及びBonnezら、J.Inf.Dis.165:376-380(1992)により以前に記載
されたように、よく証明されている。従って、無胸腺マウス系においてなされた
観察は、自然感染において起こる事象をより正確に反映しているかもしれない。
【００８１】 HPV11に対する中和抗体は、参照として本明細書に組み込まれるChristensenら
、J.Gen.Virol.73:1261-1267(1992)により以前に記載されたように、尖形コンジ
ロームを有するヒトにおいて同定されたが、その生物学的意義は不明である。中
和がインビボのパピローマウイルス感染に対する防御的免疫学的エフェクター・
メカニズムであることが判明すれば、組換えVLPによる免疫感作は、感染のリス
クのある個体に防御的な免疫を供給するかもしれない。本出願人らの結果は、HP
V11 VLP抗体の中和活性の大きさが、HPV11感染性ビリオンに特異的な抗体と類似
していることを示唆している。従って、VLPは、好適なワクチン候補であると考
えられる。しかし、異なるHPV型間のカプシド三次元決定基の交差反応性の程度
は、未だ不明であり、参照として本明細書に組み込まれるGissmannら、Virology
76:569-580(1977)、Grossら、Oncogenic Viruses,Pergamon Press,New York(19
83)、Hagenseeら、J.Virol.67:315-322(1993)、Howleyら、「パピローマウイル
ス科及びそれらの複製(Papillomavirinae and their replication)」第58章,162
5-1650頁,B.N.Fields and D.M.Knipe(編),Virology,第2版,第2巻,Raven Press,N
ew York(1990)、Kirnbauerら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:12180-12184(1992)
、Kreiderら、J.Virol.61:590-593(1987)、Kreiderら、Nature 317:639-641(198
5)、及びOrthら、J.Virol.,24:108-120(1977)により以前に記載されたように低
いかもしれない。性器HPV疾患の予防のための免疫原として使用するための組換
えVLPの可能性の完全な特徴決定には、他の性器HPV型に由来するVLPに関するさ
らなる研究が必要と考えられる。異種性器HPV VLPに対する抗体が、HPV感染を中
和することができる否かを決定することが、特に重要であると考えられる。
【００８２】 図17を参照すると、HPV11完全ウイルス粒子（B）及びHPV11 VLP抗血清（C、D
）は、HPV11 VLPと強く反応したが、これらの血清はいずれも、HPV16又はHPV18
のVLP調製物とは反応しなかった。同様に、HPV16（E、F）及びHPV18（G、H）のL
1 VLPウサギ抗血清は、同型VLPとのみ反応した。各ウサギVLP抗血清の免疫反応
性が、同型VLPによる予備吸着により消失したが、異型VLPによる予備吸着によっ
ては消失しなかった予備吸着実験において、これらの反応の特異性が確認された
。ウサギ免疫前血清はいずれも、VLP調製物と反応しなかった。ウェスタンイム
ノブロット（図15）により組換えL1タンパク質とよく反応した抗PVL1共通抗原抗
血清は、ELISAにおける天然VLP調製物とはわずかにしか反応しなかった（図17A
）。この観察より、この抗血清により通常認識されるエピトープがELISAアッセ
イ法の条件下ではマスキングされており、このアッセイ法において試験されたL1
タンパク質は主に非変性型であったことが示唆される。
【００８３】 本発明により、HPV-11、HPV-16、及びHPV-18のL1 VLPエピトープが、抗原性に
関して異なっていることが示された。L2カプシド・タンパク質はこれらのVLP調
製物中に存在しなかったが、観察されたHPV型間の抗原性の違いは、ビリオンに
も当てはまる可能性が高い。L2は、HPV粒子の全タンパク質含量のおよそ10％を
占めるが（参照として本明細書に組み込まれるDoorbarら、J.Virol.61:2793-279
9(1987)）、粒子中のその正確な位置は、決定されておらず（参照として本明細
書に組み込まれるBakerら、Biophysical J.60:1445-1456(1991)）、最近の研究
は、それがDNA脱殻にとって必要であるかもしれないこと（参照として本明細書
に組み込まれるZhouら、J.Gen.Virol.74:763-768(1993)）、及びHPV-16 L2アミ
ノ酸配列の比較的保存されたアミノ末端部分に存在するドメインが、非特異的な
DNA結合を媒介すること（参照として本明細書に組み込まれるZhouら、J.Virol.6
8:619-625(1994)）を示唆している。L2アミノ酸配列の残りの部分は、パピロー
マウイルス間で極めて不均一であるが（参照として本明細書に組み込まれるDano
sら、J.Invest.Dermatology 83:7-11(1990)）、L2特異的抗体が完全ビリオンと
反応するか否かは明らかでない（参照として本明細書に組み込まれるKomlyら、J
.Virol.60:813-816(1986)及びHagenseeら、J.Virol.67:315-322(1993)）。従っ
て、L2タンパク質が本発明の結果を実質的に変化させることはないと予想される
。
【００８４】 以前の研究は、異なるHPV型が血清学的技術を用いて相互に区別されうること
を示している。例えば、足底イボ・ビリオンと反応性の抗体は、尋常性ゆうぜい
、扁平イボ、肛門性器イボ、又は咽頭イボの患者由来の血清よりも、足底イボ患
者由来の血清にはるかに多く見られる（参照として本明細書に組み込まれるPfis
ter & zur Hausen,Int.J.Cancer 21及びViacら、J.Med.Virol.32:18-21(1990)）
。Anisimovaら、1990も、免疫学的電子顕微鏡検（immunoelectron microscopy）
により直接的に、HPV-1及びHPV-2が抗原性に関して異なっていることを示した。
しかし、他のHPV型は抗原性に関して関連しているとも考えられる。例えば、証
明されたHPV-6感染患者由来の血清中のHPV-11ビリオンを特異的に認識する抗体
の検出が、以前に報告されている（参照として本明細書に組み込まれるBonnezら
、J.Gen.Virol.72:1343-1347(1991)及びBonnezら、Virol.188:384-387(1992)）
。ほとんどのHPV型からHPVビリオンを入手することが不可能であるため、VLPは
、現在のところ、HPV間の抗原性に関する関連性を探究するために利用可能な最
良の道具である。HPV型間の抗原性の違いは、L1コード配列内の遺伝学的多様性
を反映している可能性が高い。チャン（Chan）らは、パピローマウイルスL1アミ
ノ酸配列の限定された領域内の遺伝学的相違に基づくパピローマウイルス系統発
生樹を構築した（参照として本明細書に組み込まれるChanら、J.Virol.,66:5714
-5725(1992)）。彼らの研究により、HPV-6カプシドとHPV-11カプシドとの潜在的
な交差反応性と一致して、HPV-6とHPV-11の進化上の関係が比較的近いことが示
されている。他方、L1配列の相違が大きいHPV-16及びHPV-18は、相互に、又はHP
V-11とほとんど抗原交差反応性を有しないと予想されている。これらの予測は、
本発明の結果と一致している。
【００８５】 HPVカプシドの抗原性の可変性の生物学的関連性は不明であるが、カプシド・
タンパク質の多様性はパピローマウイルスの組織特異性の原因である可能性があ
る。多様なパピローマウイルス由来の組換えVLPの利用可能性は、推定される宿
主特異的細胞受容体及び組織特異的細胞受容体の同定において有用であることが
判明するかもしれない。さらに、VLPは、HPVの抗原性に関する特徴の解明、及び
これらのウイルスに対する免疫応答の研究の実施において重要な役割を果たすは
ずである。
【００８６】 理解を明確にするため、例示及び実施例を用いて詳細に本発明を説明したが、
添付の特許請求の範囲内に含まれる何らかの変形及び変更が成されることは明ら
かであると思われる。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】 図1Aは、野生型AcNPV感染SF-9細胞溶解物及び組換えAc11L1感
染SF-9細胞溶解物のクーマシーブルー染色されたSDSポリアクリルアミドゲルを
示す。
【図１Ｂ】 図1Bは、HPV L1共通エピトープに特異的なウサギポリクローナ
ル抗血清により検索された、野生型AcNPV感染SF-9細胞溶解物及び組換えAc11L1
感染SF-9細胞溶解物のウェスタンブロットを示す。
【図２】 図2は、Ac11L1感染Sf-9細胞からショ糖密度遠心分離により回収
されたHPV-11ウイルス様粒子の電子顕微鏡写真を示す。示されたVLPは、天然に
存在するパピローマウイルスの形態学的特徴に関する公開された観察と一致して
、直径およそ52nm（拡大標準により計測）であり、正20面体対称性を有する。
【図３】 図3は、ウサギ抗血清の組換えL1との免疫反応性のウェスタンブ
ロット及びイムノドットブロットの比較を示す。パネルAにおいて、組換えL1昆
虫細胞溶解物は、変性条件下でウェスタンブロットされた。パネルBにおいては
、非組換え（＋）又は組換えL1（L1）の昆虫細胞溶解物を、非変性条件下でブロ
ッティング・メンブレンに供した。ストリップAは、HPV L1共通エピトープに特
異的なウサギ・ポリクローナル抗血清で検索され、ストリップBは、HPV L1のア
ミノ末端アミノ酸配列に特異的なウサギ・ポリクローナル抗血清で検索され、ス
トリップCは、ウサギ完全ウイルス粒子抗血清で検索された。
【図４】 図4は、組換えL1昆虫細胞溶解物を用いたウェスタンブロット・
アッセイ法を示す。ストリップA〜Xは、用いられた異なる一次抗体に対応する（
ストリップA及びBは、それぞれ免疫前及び免疫後のウサギ抗完全ウイルス粒子抗
血清と反応させ、ストリップCは、免疫後のウサギ抗変性L1共通エピトープ抗血
清と反応させ、ストリップD〜Oは、尖形コンジローム患者の血清と反応させ、ス
トリップP〜Xは、対照血清と反応させた）。
【図５】 図5は、昆虫細胞溶解物を用いたイムノドットブロット・アッセ
イ法を示す。ストリップの上の文字は、図4に記載されたのと同一である、用い
られた異なる一次抗体に対応する。
【図６】 図6は、HPV-6 L1組換えバキュロウイルス（Ac6L1）の構築及び発
現により作製されたHPV6型VLPの電子顕微鏡写真である。
【図７】 図7は、HPV-16 L1組換えバキュロウイルス（Ac16L1）の構築及び
発現により作製されたHPV16型VLPの電子顕微鏡写真である。
【図８】 図8は、尖形コンジローム患者のHPV-11 L1 VLPに対する血清反応
性を示す。
【図９】 図9は、HPV-11ビリオンに対する血清反応性とVLPに対する血清反
応性との相関を示す。
【図１０（ａ）】 図10（a）は、HPV-11 L1タンパク質（レーン2）及びHPV
-16 L1タンパク質（レーン3）のウェスタンブロット（左パネル）を示す。分子
参照マーカーは左にあり、矢印はHPV-11組換えL1タンパク質及びHPV-16組換えL1
タンパク質のおよその位置を示す。
【図１０（ｂ）】 図10（b）は、イムノブロット（右パネル）であり、レ
ーン1：AcNPV（野生型バキュロウイルス感染試料）；レーン2：Ac11L1（組換えA
c1L1感染試料）；レーン3：Ac16L1（組換えAc16L1感染試料）である。
【図１１】 図11は、Ac1L1感染Sf-9細胞培養上清中の組換えHPV-11 L1のSD
S Page及びウェスタンイムノブロット検出を示す。図11Aは、SDSポリアクリルア
ミドゲル（クーマシーブルー染色）を示す。図11Bは、PVL1共通抗原血清を用い
たウェスタンブロットであり、レーン1：非組換えAcNPV感染細胞培養上清由来の
高速ペレット；レーン2：Ac11L1感染Sf-9細胞培養上清由来の高速ペレットであ
り、分子量マーカー（Mr）は、左に示されており、右側の矢印は55kD Mr組換えL
1の位置を示す）
【図１２】 図12は、粗VLP調製物及びCsCl精製されたVLP調製物の電子顕微
鏡分析を示す（A−Ac11L1感染Sf-9無細胞培養上清からペレット化されたVLP；B
−CsCl精製されたVLP；線＝50nm）。
【図１３】 図13は、精製された組換えVLP及びHPV-11完全ビリオンのイム
ノドットブロット分析を示す（レーン1：免疫前血清；レーン2：免疫後血清；A
−精製されたHPV-11完全ビリオンで免疫感作されたウサギR-366；B−精製された
HPV-11 VLPで免疫感作されたウサギR-399；抗原：VLP（HPV-11 L1ウイルス様粒
子）；WVP（HPV-11完全ウイルス粒子））。
【図１４】 図14は、異種移植片の幾何平均直径（GMD）のドットプロット
（dotplot）分析を示す。
【図１５】 図15は、HPV-11、HPV-16、及びHPV-18の精製されたVLP調製物
のウェスタンブロット・イムノアッセイ法を示す（レーンA、HPV-11 L1 VLP：レ
ーンB、HPV-16 L1 VLP：レーンC、HPV-18 L1 VLP）。
【図１６】 図16（A〜C）は、HPVの11型、16型、及び18型由来の塩化セシ
ウム精製されたVLPの電子顕微鏡写真を示す。VLPは、明細書に記載のようにして
精製され、2％リンタングステン酸でネガティブ染色された。A）HPV-11 L1 VLP
；B）HPV-16 L1 VLP；C）HPV-18 L1 VLP；線は100nmに相当する。
【図１７】 図17は、VLPウサギ免疫後抗血清の同種VLP調製物及び異種VLP
調製物との免疫反応性を示す。抗原：HPV-11 L1 VLP、白カラム；HPV-16 L1 VLP
、点付きカラム；HPV-18 L1 VLP、黒カラム。抗血清：A）抗PVL1共通抗原ウサギ
抗血清、B）HPV-11完全ビリオン・ウサギ抗血清；C、D）HPV-11 L1 VLPで免疫感
作された2匹のウサギ由来；E、F）HPV-16 L1 VLPで免疫感作された2匹のウサギ
由来；G、H）HPV-18 L1 VLPで免疫感作された2匹のウサギ由来。
【図１８（Ａ〜Ｂ）】 図18（A〜B）は、HPV-11組換えVLPによる経口免疫
感作後の血清IgG及びIgA抗体応答の動態を示している。免疫前及び免疫後の血清
を、HPV-11 VLP ELISAにおいて評価した。経口免疫感作されたマウスは、100μg
（三角）、50μg（四角）、又は10μg（菱形）のHPV-11 VLPを受容した。第四の
マウス群は、接種を受容しなかった（丸）。追加接種は、示された時点で同様に
投与された（矢印）。図18Aにおいては、抗マウスIgG二次抗体酵素結合体を用い
て、結合した抗体が検出された。図18Bにおいては、抗原特異的IgG抗体を除去す
るためヤギ抗マウスIgGを血清に予備吸着させ（参照として本明細書に組み込ま
れるGray,J.J.ら、「ノーウォークウイルスを投与された成人有志者におけるバ
キュロウイルスで発現したノーウォークウイルス・カプシド抗原を用いた間接的
な酵素結合イムノソルベント・アッセイ法による免疫グロブリンM（IgM）、IgA
、及びIgGノーウォークウイルス特異的抗体の検出(Detection Of Immunoglobuli
n M(IgM),IgA,and IgG Norwalk Virus-Specific Antibodies By Indirect Enzym
e-Linked Immunosorbent Assay With Baculovirus-Expressed Norwalk Virus Ca
psid Antigen In Adult Volunteers Challenged With Norwalk Virus)」Journal
of Clinical Microbiology 32(12):3059-3063(1994)）、その後抗マウスIgA二
次抗体酵素結合体を用いて結合したIgA抗体が検出された。
【図１９】 図19は、経口誘導された全身性VLP抗体の抗原特異性を示して
いる。マウス血清VLP抗体は、HPV-11天然VLP（白カラム）、HPV-11変性VLP（黒
カラム）、及びHPV-16天然VLP（灰色カラム）に対するELISAで評価された。
【図２０（Ａ〜Ｂ）】 図20（A〜B）は、VLP結合阻害（VBI）ELISAを示し
ている。モノクローナル及びポリクローナルのHPV-11ウイルス中和抗体及び経口
誘導されたマウスHPV-11 VLPポリクローナル抗体を、HPV-11 VLP ELISAにおいて
評価した。図20Aにおいて、HPV-11 VLP（250ng／ウェル）を、示されたようなウ
サギN-pAb（Rose,R.C.ら、「ヒト・パピローマウイルス（HPV）11型組換えウイ
ルス様粒子は、中和抗体の形成を誘導し、ヒト血清中のHPV特異的抗体を検出す
る(Human Papillomavirus(HPV) Type 11 Recombinant Virus-Like Particle Ind
uce the Formation of Neutralizing Antibodies and Detect HPV-Specfic Anti
bodies in Human Sera)」J.Gen.Virol.75:2075-2079(1994)）の3段階希釈物と反
応させ、次に一定の希釈率（1：180,000）のH11.H3 N-mAbと反応させた。図20B
においては、HPV-11 VLP（250ng／ウェル）を、示されたようなマウス免疫後VLP
抗体の3段階希釈物と反応させ、次に一定の希釈率（1：9,000）のウサギN-pAbと
反応させた。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，Ｇ Ｈ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ， ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，Ｍ Ｗ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ， ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 ウィリアムソン アンナ−リーズ 南アフリカ共和国 ウエスターン ケープ ケープ タウン 7405 パイン ランズ ウィトブルート 34 (72)発明者 ライビッキ エドワード ピー． 南アフリカ共和国 ウエスターン ケープ ケープ タウン 7405 パイン ランズ ウィトブルート 34 Ｆターム(参考） 4C085 AA03 AA08 BA76 CC05 CC08 CC32 DD42 EE01 GG08

Claims (7)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 パピローマウイルスに対する免疫応答を誘導するために充分
    な量のパピローマウイルス・ウイルス様粒子を哺乳動物に経口投与することを含
    む、パピローマウイルスに対する予防接種を哺乳動物に施す方法。
  2. 【請求項２】 一回又は複数回のパピローマウイルス・ウイルス様粒子のワ
    クチン追加接種を哺乳動物に経口投与することをさらに含む、請求項１記載の方
    法。
  3. 【請求項３】 免疫応答がパピローマウイルスによる感染から哺乳動物を防
    御する免疫応答である、請求項１記載の方法。
  4. 【請求項４】 パピローマウイルスがヒト・パピローマウイルスである、請
    求項１記載の方法。
  5. 【請求項５】 ヒト・パピローマウイルスがヒト・パピローマウイルス６型
    である、請求項４記載の方法。
  6. 【請求項６】 ヒト・パピローマウイルスがヒト・パピローマウイルス１１
    型である、請求項４記載の方法。
  7. 【請求項７】 パピローマウイルス・ウイルス様粒子が薬学的に許容される
    担体と共に投与される、請求項４記載の方法。
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