JP2010263899A - L2ペプチドを含むキメラ・ヒト・パピローマウイルス16l1タンパク質、それから調製したウイルス様粒子および該粒子の調製方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】異種ペプチド、詳細にはHPV L2ペプチドを含むキメラ・ヒト・パピローマウイルス(HPV)L1ポリペプチドを作製する方法を提供する。
【解決手段】異種ペプチドをコードするDNAを、L1ポリペプチドをコードするDNAに導入し、両ペプチドの配列を含むDNAを宿主細胞に導入し、該DNAを発現させ、ついで該異種ペプチドを含むキメラL1ポリペプチドを回収する工程を含む、キメラ・ヒト・HPV L1ポリペプチドの作製方法。また、該方法に用いるベクター、該ベクターを含む宿主細胞、および該方法に従って作製したキメラHPV L1ポリペプチドを含むワクチン。
【選択図】なし
【解決手段】異種ペプチドをコードするDNAを、L1ポリペプチドをコードするDNAに導入し、両ペプチドの配列を含むDNAを宿主細胞に導入し、該DNAを発現させ、ついで該異種ペプチドを含むキメラL1ポリペプチドを回収する工程を含む、キメラ・ヒト・HPV L1ポリペプチドの作製方法。また、該方法に用いるベクター、該ベクターを含む宿主細胞、および該方法に従って作製したキメラHPV L1ポリペプチドを含むワクチン。
【選択図】なし
Description
本発明は、ヒト・パピローマウイルスのポリペプチド、詳細にはウイルス様粒子(VLP)またはキャプソメアを調製する方法に関する。
パピローマウイルスは、ヒトを含む種々の高等脊椎動物にイボおよび他の障害を誘導する一群の小さなDNAウイルスである。
パピローマウイルス(PV)は、パポーバウイルス科、パピローマウイルス属のメンバーであり、7,900塩基対の典型的サイズを有する二本鎖環状DNAゲノムを含む(非特許文献1)。すべてのPVは同様のゲノム組織を有し、それにはDNA複製および細胞トランスフォーメーションに関与するタンパク質をコードする初期遺伝子領域、およびウイルスキャプシドタンパク質をコードする後期領域が含まれる(図1)。long control region(LCR)として知られている非コード領域には、転写および複製に関する制御エレメントが含まれる。
パピローマウイルスは2のウイルス構造タンパク質、L1およびL2をコードしている。ビリオンには72のキャプソメアとして並んだ360のL1分子が含まれており、その各キャプソメアは5のL1分子からなるペンタマーである(非特許文献2)。L2分子に対するL1分子の比率は、ほぼ30:1と概算されており(非特許文献3)、これは各ビリオンがほぼ12のL2分子を含むことを示唆している。ビリオン当たりのL1分子の数が増えるほど、L1を"多い方の"キャプシドタンパク質といい、L2を"少ない方の"キャプシドタンパク質ということになる。
HPV−16 L1は1.518kbの遺伝子によってコードされ、504のアミノ酸のタンパク質を生じる。L1は55ないし58kDの分子量を有する(非特許文献4)。L1のドメインは細胞結合を仲介するようであり、また、ウイルスに対する抗体およびT細胞免疫応答を仲介する抗原決定基を含むようである。
生殖器ヒト・パピローマウイルス(HPV)の中には、通常は退行するかまたは悪性腫瘍には進行しない生殖器のイボおよび子宮頸部病変を引き起こす低リスクHPV(例えば、HPV6およびHPV11)、ならびに高い等級の子宮頸部病変およびガンと関連する高リスク(または発ガン性)遺伝子型(例えば、HPV16およびHPV18)が存在する。HPVは幾つかの他の肛門性器(anogenital)ガンおよび上部気道消化管ガン(upper aerodigestive tract cancer)における病因因子として関連付けられてもいる(非特許文献5)。臨床的、分子的、実験的および疫学的事実の抵抗しがたい集合は、ある種のHPV型が子宮頸ガンの主要因であることを確立している(非特許文献6)。
HPV16は子宮頸ガン症例の大部分の症例に存在し、ほぼさらなる30%の症例においてはさらなる3の型(HPV18、31および45)が存在する(非特許文献7)。
子宮頸ガンの発病率は合衆国においては低下しているが、それは、各年に約500,000の新たな症例が診断される途上国の女性の最も一般的な悪性腫瘍である。
伝統的に大部分の予防的なワクチンは、生、弱毒ウイルスまたはホルマリン不活化ウイルスからなる。パピローマウイルスのビリオンは免疫原性が非常に高く、全身的に注射した場合は高い力価(>10,000)の中和抗体を誘導する(非特許文献8−10)。しかしながら、大量のこれらの伝統的なワクチンを作り出すことに含まれる困難および危険性に起因して、ウイルスタンパク質サブユニットまたはウイルス様粒子(VLP)ワクチンを開発することが非常に強調されている。
HPVに対する予防ワクチン用の最良の候補タンパク質は、VLPに自己会合する多い方のキャプシドタンパク質L1である(非特許文献11)。これらのVLPは非常によく特徴付けられており、全ビリオンと区別し得ないように形態上見える(非特許文献12;非特許文献13)。実験動物にVLPを注射すると、中和抗体を誘導し(非特許文献14);接種したVLPワクチンの予備的なヒト試験も、これらはよく耐性であり非常に免疫原性が高く、前者の症例においては刺激された強いBおよびT細胞応答も示された(非特許文献15;非特許文献16)。
発ガン型の粘膜親和性(mucotropic)HPVに対する有効で安価な予防ワクチンは、世界のガンの負担、特にHPV16に対する負担に対して潜在的にインパクトを有し得るであろう。
HPV6型および16型に共通の中和エピトープは、HPV16の少ない方のキャプシドタンパク質、L2の領域(aa)108−120に見出されている(非特許文献17および18)。エピトープに対応する合成ペプチドで鼻腔免疫化したBalb/cマウスは、HPV6、16および18のL1/L2キャプシドと交差反応するIgAおよびIgG抗体を生じる免疫応答を誘起した(非特許文献19)。ウサギ口腔パピローマウイルス(ROPV)またはウサギ乳頭腫パピローマウイルス(CRPV)のいずれかからのL2配列領域94−122由来の2の重複するペプチドのいずれかでウサギを免疫化すると、精製した同族のL2、特に感染細胞中で認識されたL2に反応した血清を生じ、これはイン・ビトロ(in vitro)でウイルスを中和した。CRPVペプチドで免疫化したウサギは、CRPV攻撃に対して免疫性であった(非特許文献20)。
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かくして、本発明者らは、その自身の権利におけるワクチンとして、および他の免疫原性ペプチド配列の提示のためのモデルとして、キメラL1 VLP上のこのL2エピトープの提示をさらに調べることを決心した。
本発明の第1の形態によれば、
HPV L2ペプチドをコードするDNA配列を、L1ポリペプチドをコードするDNA配列に導入し;
L1ポリペプチドおよびL2ペプチドの配列を含むDNA配列を、中で該DNA配列を発現し得る宿主細胞に導入し;
該DNA配列を発現させ;ついで
L2ペプチドを含む得られたキメラL1ポリペプチドを回収する
工程を含む、HPV L2ペプチドを含むキメラ・ヒト・パピローマウイルス(HPV)L1ポリペプチドを作製する方法を提供する。
HPV L2ペプチドをコードするDNA配列を、L1ポリペプチドをコードするDNA配列に導入し;
L1ポリペプチドおよびL2ペプチドの配列を含むDNA配列を、中で該DNA配列を発現し得る宿主細胞に導入し;
該DNA配列を発現させ;ついで
L2ペプチドを含む得られたキメラL1ポリペプチドを回収する
工程を含む、HPV L2ペプチドを含むキメラ・ヒト・パピローマウイルス(HPV)L1ポリペプチドを作製する方法を提供する。
HPV L1ポリペプチドおよび/またはHPV L2ペプチドは、HPV−16のポリペプチドまたはペプチドとし得る。
HPV L2ペプチドは、以下のアミノ酸配列:
LVEETSFIDAGAP(配列番号:1)、またはその修飾体もしくは誘導体である配列を有し得、但し、その修飾配列または誘導配列は、配列番号:1の配列に少なくとも80%相同性を有し、かつ、HPVに対する免疫原性応答を誘起するペプチドをコードする配列である。
LVEETSFIDAGAP(配列番号:1)、またはその修飾体もしくは誘導体である配列を有し得、但し、その修飾配列または誘導配列は、配列番号:1の配列に少なくとも80%相同性を有し、かつ、HPVに対する免疫原性応答を誘起するペプチドをコードする配列である。
L1 DNA配列の1またはそれを超えるヌクレオチドはL2 DNA配列の導入の点において欠失していてもよく、典型的には、L1配列から欠失したヌクレオチドの数は挿入したL2ヌクレオチドの数と対応するであろう。
タンパク質の発現は、原核生物または真核生物の発現システムのいずれかにおいてとし得る。
キメラ・ポリペプチドは、図6、8、10、12および14のいずれか1に記載のアミノ酸配列(配列番号:5、7、9、11および13)、または配列番号:5、7、9、11および13に記載の配列のいずれか1に少なくとも80%相同であって、かつ、HPVに対する免疫原性応答を誘起することができる配列を有し得る。キメラ・ポリペプチドをコードするDNA配列は、図5、7、9、11および13のいずれか1に記載のDNA配列(配列番号:4、6、8、10および12)、またはこれらの配列のいずれか1に少なくとも80%相同性を有し、かつ、HPVに対する免疫原性応答を誘起することができるポリペプチドをコードする配列を有し得る。
キメラL1ポリペプチドは、ウイルス様粒子および/またはキャプソメアに会合し得る。ウイルス様粒子またはキャプソメアは免疫原性であってもよい。
本発明の第2の形態によれば、前記HPV L2ペプチドをコードするDNA配列が挿入されたキメラHPV L1 DNA配列を提供し、ここに該得られたHPV L1配列はHPV L2ペプチドを発現することができる。
L2 DNA配列の導入の点におけるL1 DNA配列の1またはそれを超えるヌクレオチドは欠失していてもよく、典型的には、L1配列から欠失したヌクレオチドの数は挿入されたL2ヌクレオチドの数に対応するであろう。
キメラ核酸配列は、図5、7、9、11および13のいずれか1に記載の配列、またはその修飾体もしくは誘導体であるDNA配列とし得、但し、その修飾DNA配列または誘導DNA配列は、配列番号:4、6、8、10および12のいずれか1の配列に少なくとも80%相同性を有し、かつ、HPVに対する免疫原性応答を誘起することができるキメラL1ペプチドをコードする。
本発明の第3の形態によれば、前記した核酸配列を含むベクターを提供する。
本発明の第4の形態によれば、前記したベクターを含む宿主細胞を提供する。
本発明のいまださらなる形態によれば、前記HPV L2ペプチド(配列番号:1)を含むキメラHPV L1ポリペプチドを提供する。
該キメラ・ポリペプチドは、キメラHPV L1ウイルス様粒子またはキャプソメアとし得る。
本発明のさらなる形態によれば、図6、8、10、12および14のいずれか1に記載のアミノ酸配列(配列番号:5、7、9、11および13)、またはその修飾体または誘導体である配列を有し、その修飾体または誘導体は、配列番号:5、7、9、11および13に記載の配列のいずれか1に少なくとも80%相同であって、かつ、HPVに対する免疫原性応答を誘起することができる配列であるHPVポリペプチドを提供する。
本発明のもう1の形態によれば、
異種ペプチドをコードするDNA配列を、L1ポリペプチドをコードするDNA配列に導入し;
L1ポリペプチドおよび異種ペプチドの配列を含むDNA配列を、該DNA配列を発現し得る宿主細胞に導入し;
該DNA配列を発現させ;ついで
異種ペプチドを含む得られたキメラL1ポリペプチドを回収する
工程を含む、異種ペプチドを含むキメラ・ヒト・パピローマウイルス(HPV)L1ポリペプチドを作製する方法を提供する。
異種ペプチドをコードするDNA配列を、L1ポリペプチドをコードするDNA配列に導入し;
L1ポリペプチドおよび異種ペプチドの配列を含むDNA配列を、該DNA配列を発現し得る宿主細胞に導入し;
該DNA配列を発現させ;ついで
異種ペプチドを含む得られたキメラL1ポリペプチドを回収する
工程を含む、異種ペプチドを含むキメラ・ヒト・パピローマウイルス(HPV)L1ポリペプチドを作製する方法を提供する。
異種ペプチド配列は、いずれか他のHPV配列とすることができ、あるいはB−細胞またはT−細胞特異的ないずれかの抗原エピトープ由来のものとし得る。
異種DNA配列の導入の点におけるL1 DNA配列の1またはそれを超えるヌクレオチドは欠失していてもよく、典型的には、L1配列から欠失したヌクレオチドの数は挿入された異種ヌクレオチドの数に対応するであろう。
本発明のいまださらなる形態によれば、前記したものと実質的に同じである、キメラHPV L1ポリペプチドまたは該ポリペプチドをコードするDNA配列を含むワクチンを提供する。該ワクチンは、HPV感染症、詳細にはHPV6、16および18の感染症の予防的または治療的処理用とし得る。
好ましくは、ワクチンは、HPVに対するおよび好適な宿主中の導入されたペプチドに対する免疫原性応答を誘導することができるであろう。
ワクチンは、さらに、医薬上の賦形剤および/または補助剤を含み得る。
キメラ構築物の設計
HPVの少ない方のキャプシドタンパク質、L2の領域(aa)108−120のHPV6および16に対する共通の中和エピトープであるペプチド:
LVEETSFIDAGAP(配列番号:1)
をコードするプライマーを合成した。
HPVの少ない方のキャプシドタンパク質、L2の領域(aa)108−120のHPV6および16に対する共通の中和エピトープであるペプチド:
LVEETSFIDAGAP(配列番号:1)
をコードするプライマーを合成した。
Chenら(2000)によって発表されたHPV16 L1のモノマー構造(図2)によれば、種々の表面ループおよび領域がペンタマーおよび高次構造が形成された場合に曝露される。
V5抗体(L1に対して作り出された中和抗体)のエピトープマッピングに基づき、L1 VLPのV5抗体結合領域を維持するように、L2ペプチドを挿入するための種々の領域/ループを選択した。
L1分子の多い方の抗原領域(V5結合領域)は、アミノ酸残基A266(表面残基V271の下方に位置するF50と共に)およびS282でマッピングされている(Rodenら, 1996、Whiteら, 1999)。これらの残基に基づいて、本発明者らは、分子のBループを変化させないことを決定した。これは抗原領域を変化させ、おそらく活性を有するL1エピトープを破壊するであろうからである。
したがって、以下のL1領域を、L2ペプチドを挿入するために選択した:
A: E−Fループ(配列番号:4および5)
C: D−Eループ(配列番号:6および7)
E: L1のh4へリックスとJ領域との間の領域(配列番号:8および9)
F: h4へリックス(配列番号:10および11)
H: 内部C−Dループ(配列番号:12および13)
A: E−Fループ(配列番号:4および5)
C: D−Eループ(配列番号:6および7)
E: L1のh4へリックスとJ領域との間の領域(配列番号:8および9)
F: h4へリックス(配列番号:10および11)
H: 内部C−Dループ(配列番号:12および13)
キメラ構築物の合成
キメラ構築物は、L2ペプチドをコードする3'末端を用いて設計したプライマーを用いるPCRによって調製した。pSKプラスミドベクターにクローン化したHPV 16SA−optL1遺伝子(配列番号:3および4)をテンプレートとして用いた。以下のDNA配列:
キメラ構築物は、L2ペプチドをコードする3'末端を用いて設計したプライマーを用いるPCRによって調製した。pSKプラスミドベクターにクローン化したHPV 16SA−optL1遺伝子(配列番号:3および4)をテンプレートとして用いた。以下のDNA配列:
5'−TTAGTGGAAGAAACTAGTTTTATTGATGC
TGGTGCACCA−3'(配列番号:14)
TGGTGCACCA−3'(配列番号:14)
を用いてL2ペプチドをコードした。
表1に示す領域を置換することによって、L2ペプチドを遺伝子に挿入した。存在するヌクレオチドを置換するこの方法は、いずれの置換もせずにL2ヌクレオチドをL1配列に単に挿入するよりも、三次構造の乱れが最小限に維持され、かつ、余分なペプチド"ループ"に起因する近くの配列の立体効果の可能性またはそれに結合する抗体との干渉の可能性が最小限化される点で有利である。
挿入したL2エピトープの位置は、キメラ構築物について各々図15〜19に図示する。
配列決定したpSK構築物からのキメラ遺伝子を、pFastbac1ベクター(SalI/XbaIサイト)にクローン化した。pFastbac1クローンからのDNAを用いてDH10bac細胞をトランスフェクトし、bacmidクローンを調製した。
Bac−to−Bac(登録商標)バキュロウイルス発現システム(Life Technologies社)を用いて、昆虫細胞中でキメラ構築物を発現した。
bacmid DNAを、セルフェクチンを用いてsf21(スポドプテラ・フルギペルダ(Spodoptera frugiperda)昆虫細胞にトランスフェクトした。基本的なBac−to−Bac(登録商標)プロトコールに従って、組換えウイルスを増幅し、キメラVLPを発現させるためのsf21昆虫細胞に感染させた。
その後に、基本的なHPV16 L1 VLP精製プロトコールを行った。感染した昆虫細胞を3,000rpmで沈殿させ、0.5MのNaClを含むリン酸緩衝化生理食塩水(PBS)中に再懸濁した。その懸濁液を5秒間隔で4回、超音波処理した。ついで、これを、40%スクロース・クッション上にオーバーレイし、100,000×gにて3時間ペレット化した。このペレットをCsCl緩衝液(0.4g/mlのCsClを含むPBS)に再懸濁し、18および26ゲージ注射針を通して吸引して再懸濁して超音波の前に粘度を低下させた(5秒間隔で4回)。その懸濁液を10℃、100,000×gにて24時間遠心した。
CsClグラジエント中に明瞭なバンドは観察されなかった。したがって、500μl画分を収集し、コンフォメーション特異的V5およびD9(線状エピトープ)モノクローナル抗体を用いるELISAによって解析した。V5および/またはD9抗体と反応することが判明した画分を保存し、PBSに対して4℃にて一晩透析した。
結果
ウェスタンブロットは、ウサギにおいてペプチドに対して作らせたポリクローナルL2抗体(The Jake Gittlen Cancer Research Institute, The Milton S. Hershey Medical Centre, Hersey Pennsylvania, USAのNeil Christensen博士から得た)がキメラL1粒子(55kD)に結合することを示し、これはL2エピトープがキメラ構築物によって発現されていることを示している。
ウェスタンブロットは、ウサギにおいてペプチドに対して作らせたポリクローナルL2抗体(The Jake Gittlen Cancer Research Institute, The Milton S. Hershey Medical Centre, Hersey Pennsylvania, USAのNeil Christensen博士から得た)がキメラL1粒子(55kD)に結合することを示し、これはL2エピトープがキメラ構築物によって発現されていることを示している。
精製したVLPの抗体特徴付けを、Neil Christensen博士によって提供された一連の抗体を用いたELISAによって行った(Christensenら, 1996, 2001)。表2はかかるデータを要約している。
抗体およびそれらの結合領域の簡単な説明を以下の表3に示す。
キメラ粒子の電子顕微鏡観察
電子顕微鏡観察の結果は、キメラ構築物から形成された粒子が野生型HPV L1遺伝子によって生成されたものと同一でないことを示した。形成された粒子は主として部分的に分解されているかまたは部分的にバラバラになった状態であり、一般的に互いに凝集しているように見える。
電子顕微鏡観察の結果は、キメラ構築物から形成された粒子が野生型HPV L1遺伝子によって生成されたものと同一でないことを示した。形成された粒子は主として部分的に分解されているかまたは部分的にバラバラになった状態であり、一般的に互いに凝集しているように見える。
キメラ抗原を用いた動物実験
6セットの5匹のBalb/cマウスを動物実験に用いて、キメラVLPの接種が免疫応答を誘起するかを判定した。5のキメラ構築物から生成したキメラVLPおよび非キメラHPV16 L1(SA−opt)から生成したキメラVLPを100μgの濃度で2の皮下部位に注射した。0、2および4週目に動物に接種した。血液試料および膣洗液を種々の期間に採取した。
6セットの5匹のBalb/cマウスを動物実験に用いて、キメラVLPの接種が免疫応答を誘起するかを判定した。5のキメラ構築物から生成したキメラVLPおよび非キメラHPV16 L1(SA−opt)から生成したキメラVLPを100μgの濃度で2の皮下部位に注射した。0、2および4週目に動物に接種した。血液試料および膣洗液を種々の期間に採取した。
各群からのマウス血清を保存し、組換えバキュロウイルスによって昆虫細胞中に生成したVLPを用いるELISAによって解析した。各群のマウスのエンドポイント力価測定を行って、応答の程度を決定し、応答のより良好な反映を得た(図20ないし26)。
結果は、高い免疫応答が達成されたことを示している。
結果は、高い免疫応答が達成されたことを示している。
参考資料
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SEQ ID NO: 1
HPV L2 peptide
SEQ ID NO: 2
Nucleotide sequence of native HPV16 L1 gene
SEQ ID NO: 3
Amino acid sequence of native HPV 16 L1
SEQ ID NO: 4
Nucleotide Sequence of chimera construct A
SEQ ID NO: 5
Amino acid sequence of chimera construct A
SEQ ID NO: 6
Nucleotide Sequence of chimera construct C
SEQ ID NO: 7
Amino acid sequence of chimera construct C
SEQ ID NO: 8
Nucleotide Sequence of chimera construct E
SEQ ID NO: 9
Amino acid sequence of chimera construct E
SEQ ID NO: 10
Nucleotide Sequence of chimera construct F
SEQ ID NO: 11
Amino acid sequence of chimera construct F
SEQ ID NO: 12
Nucleotide Sequence of chimera construct H
SEQ ID NO: 13
Amino acid sequence of chimera construct H
SEQ ID NO: 14
Nucleotide sequence of L2 inserted to L1 sequence
HPV L2 peptide
SEQ ID NO: 2
Nucleotide sequence of native HPV16 L1 gene
SEQ ID NO: 3
Amino acid sequence of native HPV 16 L1
SEQ ID NO: 4
Nucleotide Sequence of chimera construct A
SEQ ID NO: 5
Amino acid sequence of chimera construct A
SEQ ID NO: 6
Nucleotide Sequence of chimera construct C
SEQ ID NO: 7
Amino acid sequence of chimera construct C
SEQ ID NO: 8
Nucleotide Sequence of chimera construct E
SEQ ID NO: 9
Amino acid sequence of chimera construct E
SEQ ID NO: 10
Nucleotide Sequence of chimera construct F
SEQ ID NO: 11
Amino acid sequence of chimera construct F
SEQ ID NO: 12
Nucleotide Sequence of chimera construct H
SEQ ID NO: 13
Amino acid sequence of chimera construct H
SEQ ID NO: 14
Nucleotide sequence of L2 inserted to L1 sequence
Claims (33)
- 免疫原性HPV L2ペプチドをコードするポリヌクレオチドを、
(i)E−Fループ;
(ii)D−Eループ;
(iii)h4ヘリックスおよびJ領域の間の領域;
(iv)h4ヘリックス;および
(v)内部C−Dループ
から選択されるL1ポリペプチドの表面領域
でL1ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに導入し;
L1ポリペプチドおよびL2ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを、中で該ポリヌクレオチドを発現することができる宿主細胞に導入し;
該ポリヌクレオチドを発現させ;ついで
L2ペプチドを含む得られたキメラL1ポリペプチドを回収する
工程を含む、免疫原性HPV L2ペプチドを含むキメラ・ヒト・パピローマウイルス(HPV)L1ポリペプチドを作製する方法。 - 該HPV L1ポリペプチドおよび/または該HPV L2ペプチドが、HPV−16のポリペプチドまたはペプチドである請求項1記載の方法。
- 該HPV L2ペプチドが、以下のアミノ酸配列:
LVEETSFIDAGAP(配列番号:1)または配列番号:1に対して少なくとも80%の同一性を有し、かつ、HPVに対する免疫原性応答を誘起することができるペプチドをコードする配列を有する請求項1または2記載の方法。 - 該L1ポリヌクレオチドの1またはそれを超えるヌクレオチドが、L2ポリヌクレオチドの導入の点において欠失している、請求項1ないし3のいずれか1項に記載の方法。
- 該L1ポリヌクレオチドから欠失したヌクレオチドの数が、挿入したL2ヌクレオチドの数に対応する請求項4記載の方法。
- 該ポリペプチドの発現が、原核生物または真核生物の発現系のいずれかにおいてである請求項1ないし5のいずれか1項に記載の方法。
- 該キメラ・ポリペプチドが、図6、8、10、12および14のいずれか1に記載のアミノ酸配列(配列番号:5、7、9、11および13)またはその修飾体を有し、但し、該修飾体は挿入したL2ペプチドの修飾体であって配列番号:1の配列に少なくとも80%同一であり、かつ、該キメラ・ポリペプチドはHPVに対する免疫原性応答を誘起することができる請求項1ないし6のいずれか1項に記載の方法。
- 該キメラ・ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、図5、7、9、11および13のいずれか1に記載のヌクレオチド配列(配列番号:4、6、8、10および12)またはその修飾体を有し、但し、該修飾体は挿入したL2ポリヌクレオチドの修飾体であって配列番号:1の配列に少なくとも80%の同一性を有するペプチドをコードし、かつ、該ポリヌクレオチドはHPVに対する免疫原性応答を誘起することができるキメラ・ポリペプチドをコードする請求項1ないし6のいずれか1項に記載の方法。
- 該キメラL1ポリペプチドが、ウイルス様粒子および/またはキャプソメアに会合することができる請求項1ないし8のいずれか1項に記載の方法。
- 該ウイルス様粒子またはキャプソメアが免疫原性である請求項9記載の方法。
- 中に配列番号:1または少なくとも80%の同一性を有する配列の免疫原性HPV L2ペプチドをコードするポリヌクレオチドが、
(i)E−Fループ;
(ii)D−Eループ;
(iii)h4ヘリックスおよびJ領域の間の領域;
(iv)h4ヘリックス;および
(v)内部C−Dループ
から選択されるL1ポリペプチドの表面領域で挿入されており、かつ、該HPV L2ペプチドを発現することができる、キメラ・ヒト・パピローマウイルス(HPV)L1ポリヌクレオチド。 - 該L1ポリヌクレオチドの1またはそれを超えるヌクレオチドが、L2ポリヌクレオチドの導入の点で欠失している請求項11記載のHPV L1ポリヌクレオチド。
- L1ポリヌクレオチドから欠失したヌクレオチドの数が、L2ペプチドをコードするポリヌクレオチドの挿入したヌクレオチドの数に対応する請求項12記載のHPV L1ポリヌクレオチド。
- 図5、7、9、11および13のいずれか1に記載のDNA配列(配列番号:4、6、8、10および12)、またはその修飾体であるDNA配列を有し、但し、その修飾DNA配列は配列番号:4、6、8、10および12のいずれか1の挿入領域の修飾体であって配列番号:1の配列に少なくとも80%の同一性を有し、ここに該HPVポリヌクレオチドは、
(i)E−Fループ;
(ii)D−Eループ;
(iii)h4ヘリックスおよびJ領域の間の領域;
(iv)h4ヘリックス;および
(v)内部C−Dループ
から選択されるL1ポリペプチドの表面領域で免疫原性HPV L2ペプチドを提示するキメラL1ペプチドをコードし、該キメラL1ペプチドはHPVに対する免疫原性応答を誘起することができるヒト・パピローマウイルス(HPV)ポリヌクレオチド。 - 請求項11ないし14のいずれか1項に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
- 請求項15記載のベクターを含む宿主細胞。
- (i)E−Fループ;
(ii)D−Eループ;
(iii)h4ヘリックスおよびJ領域の間の領域;
(iv)h4ヘリックス;および
(v)内部C−Dループ
から選択されるL1ポリペプチドの表面領域に
アミノ酸配列:
LVEETSFIDAGAP(配列番号:1)
を有するペプチドを含むキメラ・ヒト・パピローマウイルス(HPV)L1ポリペプチド。 - キメラHPV L1ウイルス様粒子またはキャプソメアである請求項17記載のポリペプチド。
- 図6、8、10、12および14のいずれか1に記載のアミノ酸配列(配列番号:5、7、9、11および13)、またはその修飾体である配列を有し、但し、その修飾体は配列番号:5、7、9、11および13に記載の配列のいずれか1内の配列番号:1の修飾体であって配列番号:1の配列に少なくとも80%の同一性を有し、ここにHPVポリペプチドは、
(i)E−Fループ;
(ii)D−Eループ;
(iii)h4ヘリックスおよびJ領域の間の領域;
(iv)h4ヘリックス;および
(v)内部C−Dループ
から選択されるL1ポリペプチドの表面領域で
免疫原性HPV L2ペプチドを提示するキメラL1ペプチドであり、該キメラL1ペプチドはHPVに対する免疫原性応答を誘起することができるヒト・パピローマウイルス(HPV)ポリペプチド。 - 異種ペプチドをコードするポリヌクレオチドを、ヌクレオチド位置241−279、391−429、520−558、1240−1278および1291−1329(配列番号:12、6、4、10および8)のいずれか1のL1ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに導入し;
該L1ポリペプチドおよび異種ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを、該ポリヌクレオチドを発現することができる宿主細胞に導入し;
該ポリヌクレオチドを発現させ;ついで
異種ペプチドを含む得られたキメラL1ポリペプチドを回収する
工程を含む、異種ペプチドを含むキメラ・ヒト・パピローマウイルス(HPV)L1ポリペプチドを作製する方法。 - 該異種ペプチドが、いずれか他のHPVペプチドであるか、またはB−細胞もしくはT−細胞特異的ないずれかの免疫原性エピトープに由来する請求項20記載の方法。
- 該L1ポリヌクレオチドの1またはそれを超えるヌクレオチドが、該異種ポリヌクレオチドの導入の点で欠失している請求項20または21記載の方法。
- 該L1ポリヌクレオチドから欠失したヌクレオチドの数が、挿入した異種ヌクレオチドの数に対応する請求項22記載の方法。
- 免疫原性応答を誘導するための、請求項17ないし19のいずれか1に記載のキメラ・ヒト・パピローマウイルス(HPV)L1ポリペプチドまたは請求項11ないし14のいずれか1項に記載の免疫原性応答を誘導するためのポリヌクレオチド。
- HPV6、16または18の処置に使用するための請求項24記載のポリペプチドまたはポリヌクレオチド。
- 好適な宿主中のHPVおよび/または導入したペプチドに対する免疫原性応答を誘導することができる請求項24または25に記載のポリペプチドまたはポリヌクレオチド。
- さらに、医薬上の賦形剤および/または補助剤を含む請求項24ないし26のいずれか1項に記載のポリペプチドまたはポリヌクレオチド。
- HPV感染症を予防的または治療的に処理する方法において使用するための薬物を製造する方法における、請求項17ないし19のいずれか1項に記載のポリペプチドまたは請求項11ないし14のいずれか1項に記載のポリヌクレオチドの使用。
- HPV感染症がHPV6、16または18である請求項28記載の使用。
- 該薬物がHPVおよび/または好適な宿主中の誘導したペプチドに対する免疫原性応答を誘導することができる請求項28または29に記載の使用。
- 該薬物がさらに医薬上の賦形剤および/または補助剤を含む請求項28ないし30のいずれか1項に記載の使用。
- 免疫原性応答を誘導するための請求項17ないし19のいずれか1項に記載のキメラ・ヒト・パピローマウイルス(HPV)L1ポリペプチドまたは請求項11ないし14のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド。
- 請求項17ないし19のいずれか1項に記載のキメラ・ヒト・パピローマウイルス(HPV)L1ポリペプチドまたは請求項11ないし14のいずれか1項に記載のポリヌクレオチドを含む免疫原性調製物。
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