HU220747B1 - Polinukleotid vakcina papillómavírus ellen - Google Patents

Polinukleotid vakcina papillómavírus ellen Download PDF

Info

Publication number
HU220747B1
HU220747B1 HU9603562A HU9603562A HU220747B1 HU 220747 B1 HU220747 B1 HU 220747B1 HU 9603562 A HU9603562 A HU 9603562A HU 9603562 A HU9603562 A HU 9603562A HU 220747 B1 HU220747 B1 HU 220747B1
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
dna
crpv
protein
papillomavirus
gene
Prior art date
Application number
HU9603562A
Other languages
English (en)
Other versions
HU9603562D0 (en
HUT76446A (en
Inventor
John J. Donnelly
Margaret A. Liu
Douglas Martinez
Donna L. Montgomery
Original Assignee
Merck & Co. Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Merck & Co. Inc. filed Critical Merck & Co. Inc.
Publication of HU9603562D0 publication Critical patent/HU9603562D0/hu
Publication of HUT76446A publication Critical patent/HUT76446A/hu
Publication of HU220747B1 publication Critical patent/HU220747B1/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/20011—Papillomaviridae
    • C12N2710/20022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Description

A találmány tárgyát papillomavírus-specifikus immunválaszt indukálni képes polipeptideket kódoló polinukleotidok képezik. A találmány tárgyát képezik továbbá maguk a találmány szerinti polinukleotidokat tartalmazó vakcinák és gyógyászati készítmények, valamint a találmány szerinti polinukleotidok alkalmazása papillomavírus-specifikus immunválasz kiváltására.
A papillomavírus-fertőzések különböző állatfajokban fordulnak elő, például emberben, juhban, kutyában, macskában, nyálban, majomban, kígyóban és marhában. A papillomavírusok az epitelsejteket fertőzik általában jóindulatú epiteliális vagy fíbroepiteliális tumorokat okozva a fertőzés helyén. A papillomavírusok fajspecifikus fertőző ágensek; például az emberi papillomavírus általában nem fertőz egyéb fajhoz tartozó állatokat.
A papillomavírusokat különböző csoportokba sorolhatjuk be a gazdaszervezetek alapján, melyeket megfertőzhetnek. Az emberi papillomavírusokat („Humán papilloma vírus”, HPV) DNS-szekvenciájuk homológiája alapján 60 további típusra oszthatjuk fel [áttekintés érdekében lásd „Papilloma Viruses and Humán Cancer”, szerk.: H. Pfister, CRC Press, Inc., (1990)]. Úgy tűnik, a papillomavírus-fertőzések típusra jellemző immunválaszt indukálnak, melynek során egy adott típusú papillomavírus okozta fertőzést közömbösítő immunitás nem nyújt immunológiai védelmet egy másik típusú papillomavírus ellen.
Emberben különböző HPV-típusok különböző betegségeket okoznak. Az 1-es, 2-es, 3-as, 4-es, 7-es, 10es és a 26-29-es HPV-típusok jóindulatú szemölcsöket okoznak mind normális, mind immunológiailag veszélyeztetett személyekben. Az 5-ös, 8-as, 9-es, 12-es, 14es, 15-ös, 17-es, 19-25-ös, 36-os és a 46-50-es HPVtípusok lapos elváltozásokat okoznak immunológiailag veszélyeztetett személyekben. A 6-os, 11-es, 34-es, 39es, 41-44-es és az 51-55-ös HPV-típusok a nemi szervek nem rosszindulatú függölyeit okozzák. A 16-os és a 18-as HPV-típusok a nemi szervek epiteliális diszpláziáit okozzák, és összefüggésben vannak a méhnyak, a hüvely, a külső női nemi szervek és a végbélnyílás in situ és invazív karcinómáinak többségével.
Állati rendszereken végzett immunológiai vizsgálatok kimutatták, hogy a papillomavírus-antigének elleni közömbösítő antitestek termelése megakadályozza a homológ vírusokkal történő fertőzést. Az emberi papillomavírus elleni hatékony vakcinák kifejlesztése lelassult amiatt, hogy a papillomavírusokat nem sikerült in vitro tenyészteni. A hatékony HPV-vakcina fejlesztését különösen lassította a HPV direkt tanulmányozására gazdaszervezetként alkalmazható állat hiánya.
A papillomavírus antitestekkel történő közömbösítése úgy tűnik típusspecifikus, és a vírus felszínének konformációs epitópjaitól függ.
A papillomavírusok kicsi (50-60 nm), nem burkolt, ikozaéder alakú DNS-vírusok, amelyek korai és késői géneket kódolnak. A vírusgenomok nyílt leolvasási fázisait („open reading fiamé”, ORF) El-tői E7-ig és L 1-től L2-ig jelölik, ahol az „E” korait és „L” későit jelent. L1 és L2 a vírus kapszidfehérjéit kódolja. Az E5-től E3ig és az E5-től E7-ig terjedő gének a vírus replikációjával és transzformációjával vannak összefüggésben.
Az Ll-fehéqe a nagyobbik kapszidfehérje, a molekulatömege 55-60 kD. Az L2-fehérje a kisebbik kapszidfehéije, a jósolt molekulatömege 55 kD, a látszólagos molekulatömege pedig 75-100 kD poliakrilamidgélelektroforézis segítségével meghatározva. Elektronmikroszkópiás és immunológiai adatok azt támasztják alá, hogy az L2-fehéije az Ll-fehérjén belül foglal helyet. A különböző papillomavírusok L2-fehérjéi nagymértékben konzerváltak, különösen a C-terminális tíz bázikus aminosava. The Ll-ORF nagy értékben konzervált különböző papillomavírusokban.
Az Ll- és az L2-géneket rekombináns fehérjék előállítására használták abból a meggondolásból, hogy azok a papillomavírus-fertőzések kezelésére és megelőzésére is alkalmasak lehetnek. Zhou és munkatársai klónozták a 16-os HPV-típus Ll- és L2-génjeit egy tehénhimlő („vaccinia”)-vírusvektorba, és CV-1 emlőssejteket fertőztek a rekombináns vektorral, hogy vírusszerű részecskéket („virus-like particles”, VLP) kapjanak. Ezeket a kutatásokat úgy interpretálták, hogy a 16os HPV-típusnak mind az L1-, mind az L2-fehérjéje expressziójának az epitelsejtekben való megléte szükséges és elégséges a VLP-k összeszerelődésének lehetővé tételéhez. Külön az Ll-fehérje vagy az L2-fehérje expressziója, vagy a sejtek kétszeres fertőzése egyszeresen rekombináns Ll-et és L2-t tartalmazó tehénhimlővírusvektorral nem eredményezett részecskéket.
Rekombináns marha-papillomavírus bakteriálisán előállított Ll- és L2-fehéijéit is elkészítették. A rekombináns fehéqék elleni közömbösítő szérum alacsony szintű keresztreakciót mutatott a natív vírussal, feltehetőleg a natív és a bakteriálisán előállított fehérjék közötti konformációs különbségeknek köszönhetően.
HPV16-Ll-et vagy HPV16-L2-t kódoló régiókat expresszáló rekombináns bakulovírust alkalmaztak SF9 rovarsejtek fertőzésére és rekombináns Ll- és L2-fehérjék termelésére. A Westem-blot-analízis azt mutatta, hogy a bakulovírus által módosított Ll- és L2-fehérjék reagáltak a HPVI6 ellen készült antitesttel. A HPV16-L1- és HPV16-L2-fehérjék termelését Saccharomyces cerevisiae rekombináns törzseiben szintén megoldották.
Mivel a citotoxikus T-limfociták („cytotoxic T-lymphocyte”, CTL) egérben és emberben is képesek felismerni konzerválódott belső vírusfehérjékből származó epitópokat, és mivel feltehetőleg fontosak a vírusok elleni immunválaszban, erőfeszítések történtek olyan CTL-vakcinák kifejlesztésére, amelyek képesek heterológ védelmet nyújtani különböző vírustörzsek ellen.
Ismert, hogy a CD8 CTL-ek megölik a virálisan fertőzött sejteket, ha a T-sejt-receptoraik MHC-I molekulákhoz kötött virális eredetű peptideket ismernek fel. Ezek a peptidek endogén módon szintetizált virális fehérjékből származnak, tekintet nélkül a fehérje elhelyezkedésére vagy funkciójára a víruson belül. így, konzerválódott vírusfehérjék epitópjait felismerve a CTLek esetleg több törzsre kiterjedő védelmet is biztosíthatnak. A CTL általi felismerésre alkalmas MHC-I-hez asszociálódni képes peptidek olyan fehérjékből szár2
HU 220 747 Bl maznak, amelyek jelen vannak a citoplazmában, vagy keresztülhaladnak az endoplazmás retikulumon. Ezért általában az exogén fehéijék, amelyek az endoszomális útvonalon processzálódnak (ahogy ez az MHC-II molekulák által bemutatott antigének esetében történik) nem hatékonyak a CD8+ CTL-válasza szempontjából.
A CTL-válaszok létrehozására irányuló erőfeszítések során a sejten belüli fehérjeantigének termelése érdekében alkalmaztak replikálódó vektorokat, más esetben pedig a peptidek citoszolba történő bejuttatására koncentráltak. Mindkét megközelítésnek vannak korlátái, amelyek csökkenthetik vakcinaként való felhasználásuk lehetőségét. A retrovírusvektorok segítségével nem lehet bármilyen méretű és szerkezetű fúziós fehérjét expresszáltatni, ha fenn akarjuk tartani a vírusok replikációs képességét, és a későbbi immunizálások során az olyan vektorok, mint például a tehénhimlő hatékonyságát a vektorok ellen kialakuló immunválasz is veszélyeztetheti. A virális vektorok és módosított patogének önmagukban is kockázatot jelenthetnek, ami hátráltatja emberben történő alkalmazásukat. Továbbá a bemutatandó peptidepitópok szelekciója az egyén MHC-antigénjeinek szerkezetétől függ, ezért a peptidvakcinák hatékonysága az MHC-haplotípusok változatossága következtében korlátozott lehet a nem beltenyésztett populációkban.
A polinukleotidkonstrukciók, azaz fehérjéket kódoló DNS-plazmidok izomba történő beoltásáról kimutatták, hogy az izomsejtben a fehérjék in situ keletkezését eredményezi. Vírusfehérjéket kódoló cDNS-plazmidok alkalmazásával egymást követő fertőzések ellen is homológ védelmet biztosító antitestválaszok kelthetők. Az, hogy az antitestek előállítására polinukleotidvakcinákat („polinucleotide vaccine”, PNV) alkalmazunk, az antitestválasz megnövekedett időtartamát eredményezheti, valamint egy olyan antigén előállítását, amelyen a poszttranszlációs módosítások tökéletesek, és konformációja megegyezik a natív fehéijéével. (Miközben a rekombináns fehérjéével nem.) A PNV-immunizálást követően in vivő termelt virális fehéijék felvehetik natív konformációjukat, ami a vírust közömbösítő antitest termelését eredményezi. Annak, hogy ily módon keltjük a CTL-választ, megvan az a jótékony hatása, hogy keresztrezisztenciát biztosít anélkül, hogy működőképes potenciálisan patogén vektort vagy legyengített vírust alkalmaznánk.
Benvenisty és munkatársai leközölték, hogy CaCl2dal kicsapott DNS-t, melyet intraperitoneálisan, intravénásán vagy intramuszkulárisan juttattak be egérbe, expresszáltatni lehetett. Újabban arról adtak hírt, hogy egérbe intramuszkulárisan (im.) beinjektált DNS expressziós vektorok azt eredményezték, hogy az izomsejtek felvették a DNS-t, és expresszálták a DNS kódolta fehéijét. [J. A. Wolff és munkatársai (1990); G. Acsadi és munkatársai (1991)]. Kimutatták, hogy az injektált plazmidok extrakromoszómálisan maradnak fenn, és nem replikálódnak. Ezt követően patkány, hal és főemlősök vázizmába valamint patkány szívizmába történt im. injekció után létrejövő tartós expressziót is leközöltek. A nukleinsavak immunogén ágensekként való alkalmazására szolgáló eljárás a W090/11092-es számú (1990. október 4) nemzetközi közzétételi iratban van leírva, ahol „csupasz” polinukleotidokat alkalmaztak gerincesek beoltására.
Az eljárás nem csupán az intramuszkuláris injekciót foglalja magában. Például marha-növekedésihormont („bovine growth hormoné”, BGH) kódoló DNS-sel burkolt arany mikrolövedékek bejuttatása egér bőrébe BGH elleni antitestek termelődését eredményezte egérben. „Jet injektort” alkalmaztak élő állatok bőr-, izom-, zsír- és emlőszövetének transzfektálására. A különböző, nukleinsavak bejuttatására szolgáló eljárásokat Donelly, Ulmer és Liu tekintette át [The Immunologist, 2, 20, (1994)].
A találmány tárgyát képezik eljárások nukleinsavak élő szövetekbe juttatására fehérjék expressziójának beindítása céljából. A találmány tárgyát képezik eljárások, amelyek révén a virális fehérjék az antigénprocesszáló reakcióútra jutnak, ezáltal vírusspecifikus CTL-ek és antitestek keletkeznek. A találmány szerinti megoldás tehát papillomavírus vonatkozásában kielégíti az olyan specifikus terápiás szerek iránti igényt, amelyek képesek víruspatogének ellen a kívánt profilaktikus immunválaszt kiváltani. A találmány tárgyát képezik tehát az emberi papillomavírus vírusfehéijéit kódoló DNS-konstrukciók, amelyek képesek specifikus CTL-ek és antitestek indukálására.
A DNS-védőoltás újabb vírustámadás elleni védelmi hatékonyságát úgy demonstráltuk, hogy nem replikálódó plazmid-DNS-sel immunizáltunk, amely a fent említett vírusfehérjékből egyet vagy többet kódolt. Ez azért előnyös, mivel így fertőző szer nem szerepel a kísérletben, nincs szükség a vírusrészecskék összeszerelődésére, és a determinánsok szelekciója megengedett. Továbbá, mivel néhány géntermék szekvenciája konzerválódott a különböző típusú papillomavírusokban, a védelem lehetségessé válik egy újabb, más típusú (a törzzsel, amelyből a klónozott gén származik homológ vagy heterológ) papillomavírus támadása során is.
A papillomavírus géntermékeit kódoló DNS-konstrukciók, amelyeket állati szövetekbe közvetlenül bejuttatva expresszáltatni lehet, olyan új profilaktikus és terápiás gyógyászati készítmények, amelyek képesek immunválaszt biztosítani papillomavírus-fertózések ellen.
Az alábbiakban ismertetjük a leíráshoz tartozó ábrákat.
Az 1. ábra a vírust közömbösítő antitestválaszt mutatja, melyet nyálban CRPV-L1-DNS vagy Ll- és L2DNS (y tengely) keverékének injektálásával indukáltak, valamint a megfelelő ELISA-titereket ugyanazon indukciónál.
2. ábra. Nyulak antitestválaszai, az állatokba előzőleg Ll-DNS-t injektáltak. Az ábrán az önkényesen kiválasztott mennyiséggel, 1 mg-mal történt egyszeri immunizálás után nyúlban kapott Ll-VLP elleni ELISA-titerek láthatók. Azok a nyulak, amelyeket kontroll-DNSsel injektáltunk nem termeltek kimutatható mennyiségű antitestet Ll-VLP ellen.
3. ábra. Ll-VLP abszorpciójának hatása az LlDNS-sel való immunizálással kapott antiszérumra.
HU 220 747 Bl
A.: Natív vagy denaturált VLP-khez kötött normálszérum és immunszérum tesztelése vírusközömbösítő hatás szempontjából. Az ábrán a függölyök (condylomák) átlagos területe látható 3 fertőzési helyen, 7 héttel a fertőzés után mérve. B.: Ll-DNS-sel injektált nyúlból származó immunszérum, amelyet egy rekombináns élesztő (Saccharomyces cerevisiae)-tÖTZsben expresszáltatott natív (körök) vagy denaturált (négyzetek) Ll-VLP-vel abszorbeáltunk egymás után három alkalommal. Minden egyes abszorpció után megvizsgáltuk a szérum aliquot részeinek bakulovírus-eredetű LlVLP elleni antitestaktivitását ELISA-val. Az abszorbeált anyag ELISA-titerét a nem abszorbeált szérum eredeti ELISA-titerének százalékában tüntettük fel.
4. ábra. ELISA-válaszok az anti-CRPV-E2 (A) és az anti-CRPV-E7 (B) antitestek mérése során. Az ábrán a korrigált reakciósebességet (a 4. dózis beadása utáni sebességből kivonjuk a sebességet az immunizálás előtt ugyanannál a hígításnál) tüntettük fel mOD/perc-ben (1 mOD megegyezik 10~3-on abszorbanciaegységgel) minden egyes nyúl esetében.
Az alábbiakban részletesebben is ismertetjük a találmány gyakorlati megvalósítási módjait.
A papillomavírus géntermékeit kódoló DNS-konstrukciók, amelyeket állati szövetekbe való közvetlen bejuttatással expresszáltathatunk olyan új profilaktikus és terápiás gyógyászati készítmények, amelyek papillomavírus-fertőzések ellen immunológiai védelmet biztosítanak.
A találmány tárgyát képezik polinukleotidok, amelyek gerinces állatokba - mint például az amerikai üregi nyúl vagy az ember - közvetlenül bejuttatva az állati szövetekben a kódolt peptidek expresszióját indukálják. Amennyiben a peptid az állatban a fertőzések kivételével nem fordul elő, mint például a papillomavírus (PV) fehérjéi, az állat immunrendszere aktiválódik, hogy védelmet biztosító választ adhasson. Mivel ezeket az exogén fehéijéket a gazdaállat saját sejtjei termelik, ezért a fő hisztokompatibilitási komplex (MHC) processzálja és mutatja be őket. Ez a felismerési folyamat analóg azzal, amely a szervezet tényleges fertőzése során történik. Az eredmény, amint azt itt bemutatjuk olyan immunválaszok elindítása, amelyek védelmet biztosíthatnak vírusfertőzéssel szemben.
A leírásban használt értelemben a polinukleotid olyan nukleinsavat jelent, amely esszenciális szabályozóelemeket tartalmaz, például olyanokat, amelyek egy gerinces élő sejtjébe történő bejuttatás során képesek úgy irányítani a sejt működését, hogy a polinukleotidot tartalmazó gének által kódolt transzlációs termékek keletkezzenek. A találmánynak sok megvalósítási módja van, amelyek a leírás alapján szakember számára nyilvánvalóak. Például különböző transzkripciós promoterek, terminátorok, hordozóvektorok vagy specifikus génszekvenciák használhatók.
A találmány tárgyát képezik nukleinsavak, amelyeket állati szövetekbe bejuttatva a papillomavírus géntermékeinek in vivő expresszióját indukálják. így például a találmány szerinti DNS-konstrukciókat nyúlizomba injektálva azok a kódolt géntermékek expresszióját indítják meg, melynek során a vírust közömbösítő antitestek keletkeznek. Amerikai üregi nyúl papillomavírussal való újabb fertőzése során - a kontrollként használt nyulak mindegyikén elváltozásokat okozó dózisokat alkalmazva - a polinukleotidvakcinával beoltott állatok sokkal kisebb elváltozásokat mutatnak. A találmány tárgyát képezi tehát egy vakcina, amely alkalmas papillomavírus-fertőzések megelőzésére emberekben.
A papillomavírus fehérjéit kódoló DNS-konstrukciók védelemre alkalmas immunválaszt indítanak el állatokban. Amint azt az alábbiakban részletesebben leírjuk, állatokban az immunválaszhoz tartozik a vírust közömbösítő antitest, valamint nyúlban a homológ típusú papillomavírus-fertőzés elleni védelem.
A találmány egyik megvalósítási módja szerint a vakcinatermék különálló DNS-plazmidokat tartalmaz, amelyek egyenként vagy együtt a papillomavírus L1-, L2-, E2-, E4-fehérjéit kódolják.
Más vakcinákkal szembeni várható előnyök közül az egyik az, hogy a CTL-válaszok révén kiterjedtebb védelmet biztosítanak, az antitestek szélesebb skálája keletkezik és megnövekszik a védelem élettartama.
A találmány egyik megvalósítási módja szerint a klinikai izolátumokból nyert 6a, 6b, 11-es, 16-os vagy 18as HPV-típusokból származó Ll- vagy L2-, vagy L1+L2 fehéijeszekvenciákat kódoló régiókat klónozzuk egy expressziós vektorba. A vektor tartalmaz egy, az RNS-polimeráz transzkripciójához szükséges promotert, és egy transzkripciós terminációs helyet a HPV-kódoló szekvencia végén. A promoter egyebek mellett lehet például a CMV-promoter. Transzkripciós terminációs hely többek között lehet például a BGH. Ezenfelül, hogy megkönnyítsük a gyógyászati készítmény előállítását az expressziós vektor előnyösen tartalmaz egy E. coliban expresszálódó antibiotikumrezisztencia-markert is. Neomicinrezisztencia-gének, vagy bármely más gyógyászatilag elfogadható antibiotikumrezisztencia-markert alkalmazhatunk. Továbbá a gyógyászati készítmény prokarióta szervezetekben nagy mennyiségben történő előállítása végett a vektor előnyösen nagy kópiaszámú, és replikációs origót tartalmaz. Számos kereskedelmileg hozzáférhető prokarióta klónozóvektor rendelkezik ezekkel az előnyökkel. Kívánatos eltávolítani a nem esszenciális DN S-szekvenciákat.
A találmány tárgyát képezik tehát olyan expressziós vektorok, amelyek papillomavírus-fehérjét kódolnak mint immunogént. A találmány szerinti megoldás egyes megvalósítási módjai lehetőséget biztosítanak arra, hogy keresztrezisztenciát indukáljunk anélkül, hogy szükség lenne önmagukban replikálódó ágensekre. Ezenfelül a DNS-sel való immunizálás számos egyéb előnyt biztosít. Először is a védőoltásnak ez a megközelítése feltehetőleg éppúgy alkalmazható tumorok, mint fertőző ágensek ellen, mivel a CD8+ CTL-válasz mindkét patofiziológiai folyamatban fontos az immunrendszer beavatkozása során. Ezért a transzformációs folyamat egy lényeges fehéijéje elleni immunválasz beindítása hatékony eszköze lehet a rák elleni védelemnek vagy az immunoterápiának. Másodsorban az a jelenség, hogy virális fehérjéket kódoló DNS injektálása következté4
HU 220 747 Bl ben expresszált fehérjék ellen antitestek keletkeznek valószínűsíti, hogy ez a technológia jól alkalmazható és hatékony eszköze lesz az antitestek keletkezését beindító vakcinák előállításának.
A DNS-konstrukciók előállításának és tisztításának egyszerűsége - szemben a hagyományos fehérjetisztítással - megkönnyíti a kombinációs vakcinák létrehozását. így többszörös konstrukciókat, például egy vagy többféle típusú HPV-L1- és -L2-fehéijét kódoló konstrukciókat állíthatunk elő, keverhetünk össze és adhatunk be együttesen. Végül, mivel a fehérjeexpresszió a DNS injektálása után fenntartható egy ideig, a B- és Tsejtes memória tartóssága megnövelhető, ami hosszan tartó sejtes és humorális immunitást idéz elő.
A jelenleg ajánlott HPV-vakcinák korlátái nyilvánvalóvá teszik az igényt a fertőzés és a betegség rosszabbodása megelőzésének hatékonyabb módszereire. Egy konzerválódott fehérje elleni megnövelt CTL-válasz előidézése hosszan tartó, keresztrezisztenciát biztosító immunitást nyújthat.
Nyúlban kimutattunk PNV-konstrukciók előidézte febérjeexpressziót azáltal, hogy detektáltuk a gazdaszervezet CRPV-antigének ellen irányuló immunválaszát. Ezen állatkísérletek eredményei azt mutatják, hogy a közvetlen DNS-injektálás emberek HPV-fertőzése és az előidézett betegség elleni védelem eszköze lehet.
Dózisok sorozatát hasonlítottuk össze immunogenicitás szempontjából, hogy optimalizálhassuk az alkalmazandó koncentrációkat. Azt várhatjuk, hogy emberben a 10, 50,100 és 200 pg-os adagok lesznek hatékonyak.
Emberek esetében a hatékonyságot önkénteseken mutatjuk meg, akik HPV-DNS-vakcinát kapnak. A vakcina összetételét, dózisát és beadásának rendjét a korábbi vizsgálatok alapján határozzuk meg. A klinikai hatékonyságot a fertőzési arány, a betegségre jellemző pontérték és annak időtartama jellemzi. Ezeket a klinikai eredményeket összehasonlítjuk a gazdaszervezet immunválaszának és a vírusok észlelésének laboratóriumi kiértékelésével annak érdekében, hogy meghatározhassunk helyettesítő markereket, amelyek korrelálnak a védelem mértékével.
A DNS-konstrukciók előállításának és tisztításának molekuláris biológiája lehetővé teszi a találmány szerinti DNS-alapú gyógyászati készítmények előállítását. Miközben a molekuláris biológia standard technikái elegendőek a találmány szerinti termékek előállításához, a leírásban feltárt specifikus konstrukciók új gyógyászati készítmények, amelyek keresztrezisztenciát biztosíthatnak.
A befogadó gazdába bejuttatandó DNS expresszálható mennyisége a DNS-konstrukcióban alkalmazott transzkripciós és transzlációs promoterek erősségén múlik, valamint az expresszált géntermék immunogenicitásán. Általában egy immunológiailag és profilaktikusan hatékony dózis körülbelül 1 pg és 1 mg között van, előnyösen 10 pg és 300 pg között, és ezt adjuk be közvetlenül az izomszövetbe. Szubkután injekció, intradermális bevitel, bőrön keresztüli impresszió vagy a beadás más módjai, mint például az intraperitoneális, intravénás vagy inhalálás révén történő bevitel szintén lehetségesek. Megerősítő oltások adása is ajánlott.
A polinukleotid lehet csupasz, azaz olyan ami nem kapcsolódik fehérjéhez, adjuvánshoz vagy más szerhez, ami a befogadó immunrendszerét befolyásolná. Ebben az esetben kívánatos, hogy a polinukleotid fiziológiásán befogadható oldatban legyen, például steril sós vagy steril puffereit sós oldat, de ez lehet más oldat is. Alternatív megoldásként a polinukleotidot hozzáköthetjük liposzómákhoz, például lecitinliposzómákhoz vagy más, a technika állása szerint ismert liposzómákhoz, például DNS-liposzómakeverékekhez, vagy hozzáköthetjük a DNS-t valamely, a technika állása szerinti adjuvánshoz - például fehérjéhez vagy más hordozóhoz -, hogy megerősítsük az immunválaszokat. Olyan szerek, amelyek elősegítik a sejtek DNS-felvételét, többek között például kalciumionok, virális fehérjék és más transzfekciót elősegítő szerek esetleg szintén előnyösen alkalmazhatók. Ezekre a szerekre általában úgy hivatkozunk mint transzfekciót elősegítő szerekre, valamint mint gyógyászatilag elfogadható hordozókra.
Több előnye is van annak, hogy egy génnel, és nem annak termékével immunizálunk. Az egyik előny az, hogy a natív vagy majdnem natív antigén viszonylag egyszerűen bemutatható az immunrendszer számára. A polinukleotidimmunizálás másik előnye az immunogén azon képessége, hogy végigmenjen az MHC-I reakcióúton és citotoxikus T-sejtes immunválaszt váltson ki. Mivel a polinukleotidimmunizálás humorális és sejtes immunválaszt is kelthet, egy újabb előnye az lehet, hogy viszonylag egyszerűen nagyszámú virális gént és vírustípust vizsgálhatunk vakcinaként való alkalmazhatóságuk szempontjából. A polinukleotidok injektálásával végzett immunizálás azt is lehetővé teszi, hogy többkomponensű vakcinákat hozzunk létre az egyes komponensek összekeverésével.
A leírásban használt értelemben a „gén” kifejezés egy nukleinsavszegmensre vonatkozik, amely egy külön polipeptidet kódol. A „gyógyászati készítmény” és a „vakcina” kifejezést azonos értelemben használjuk, és olyan készítményeket jelölnek, amelyek alkalmasak immunválasz kiváltására. A leírásban használt értelemben a „konstrukció” és a „plazmid” kifejezés felcserélhető. A „vektor” kifejezés egy olyan DNS-t jelöl, amelybe géneket klónozhatunk, hogy felhasználhatók legyenek a találmány szerinti eljárás alkalmazása során.
Ezek alapján a találmány szerinti megoldás egyik megvalósítási módja egy eljárás PV-gének alkalmazására immunválaszok indukálásában in vivő, gerincesekben, például emlősökben (az embert is beleértve). Az eljárás magában foglalja:
a) legalább egy PV-gén izolálását,
b) a gén szabályozószekvenciákhoz való kapcsolását úgy, hogy a gént működőképesen kontrollszekvenciákhoz kötjük, amelyek az élő szövetbe való bejutáskor a transzkripció iniciációját és a gén azt követő transzlációját irányítani képesek,
c) a gén bejuttatását egy élő szövetbe és
d) esetleg egy újabb génnel való megerősítő immunizálást.
HU 220 747 Bl
A találmány egy másik megvalósítási módja egy, a PV heterológ típusai ellen védelmet biztosító eljárás lehet. Ezt úgy hajtjuk végre, hogy egy konzerválódott PV epitópot kódoló, immunológiailag hatékony mennyiségű nukleinsavat adunk be.
A találmány szerinti megoldás egy másik megvalósítási módja, amikor a polinukleotidvakcina egy másik PV-fehéijét kódol, mint például az Ll-et, L2-t, az Éltől az E7-ig valamelyiket, vagy ezek kombinációit.
A találmány egy másik megvalósítási módja az, amikor a DNS-konstrukció a 6a, 6b, 11-es, 16-os vagy 18-as HPV-típus fehérjéit kódolja, ahol a DNS-konstrukciót expresszáltatni lehet in vivő állati szövetbe való bejuttatás során, valamint immunválaszt lehet indukálni a HPV-génbe kódolt expresszált termékek ellen. Olyan kombinációk, amelyek más (nem HPV-eredetű) antigéneket kódoló polinukletidkonstrukciókat tartalmaznak, szintén a találmány tárgyát képezik. HPV-gént kódoló DNS-konstrukciókra példák a következők: V1J-L1, V1J-L2, V1J-E1, V1J-E2, V1J-E3, V1J-E4, V1J-E5, V1J-E6, V1J-E7, VlJ-EliAE4, V1J-E1AE4Ll, V1J-L2-C.
A találmány egyes megvalósítási módjaiban a DNS-konstrukció a CRPV-Ll-fehérjét kódolja. Ebben az esetben a DNS-konstrukciót expresszáltatni lehet állati szövetbe való bejuttatással in vivő, és immunválasz indukálható a kódolt CRPV-génben kódolt expresszált terméke ellen. Olyan kombinációk, amelyek más (nem CRPV-eredetű) antigéneket kódoló polinukletidkonstrukciókat tartalmaznak, szintén a találmány tárgyát képezik.
CRPV-gént kódoló DNS-konstrukciókra példák a következők: V1J-L1, V1J-L2, V1J-E1, V1J-E2, V1JE3, V1J-E4, V1J-E5, V1J-E6, V1J-E7, VlJ-EliAE4, V1J-E1AE4-L1, V1J-L2-C.
DNS-t tartalmazó, gyógyászatban alkalmazható készítményeket ismert eljárásokkal formulázhatunk, mint például egy gyógyászatilag elfogadható hordozó hozzáadása. Ilyen hordozókra példák, valamint formulázási eljárások találhatók a „Remington’s Pharmaceutical Sciences”-ben. Ahhoz, hogy egy gyógyászatilag elfogadható készítményt állítsunk elő, amely hatékonyan beadható, az ilyen készítményeknek hatékony mennyiségben kell tartalmazniuk a HPV-DNS-t.
A találmány szerinti terápiás vagy diagnosztikai készítményeket az egyéneknek olyan mennyiségekben adjuk be, ami elegendő a PV-fertőzések kezelésére vagy diagnózisára. A hatékony mennyiség számos faktortól függ, mint például az egyén erőnléte, súlya, neme és kora. Egy újabb faktor a beadás módja. Általában a készítményeket körülbelül 1 pg-tól 1 mg-ig teijedő mennyiségű dózisokban adjuk be.
A gyógyászati készítményeket számos módon bejuttathatjuk az egyénbe, például szubkután, topikálisan, orálisan és intramuszkulárisan.
A találmány szerinti vakcinák közül az egyik a HPV-DNS, amelyik olyan, HPV-ből származó rekombináns fehérjéket kódol, amelyek közömbösítő antitestek keletkezését emberi szervezetben indukálni képes antigéndeterminánsokat tartalmaznak. Az ilyen vakcinák elég biztonságosak ahhoz, hogy klinikai fertőzés veszélye nélkül beadhassuk őket, nincs toxikus mellékhatásuk, hatékonyan beadhatók, stabilak és kompatibilisek vakcinahordozókkal. A vakcinákat számos módon beadhatjuk, például orálisan, parenterálisan, szubkután vagy intramuszkulárisan. A beadott dózis változhat az egyén erőnléte, súlya, neme és kora, a beadás módja és a vakcina PV-típusa függvényében. A vakcinát alkalmazhatjuk kapszulák, szuszpenzió, elixír vagy folyékony oldat formájában. A vakcinát egy immunológiailag elfogadható hordozóval formulázhatjuk.
A vakcinákat profilaktikusan vagy terápiásán hatékony mennyiségben adjuk be, azaz elegendő mennyiségben az immunológiai védelmet biztosító válasz kialakulásához. A hatékony mennyiség a PV típusától függetlenül változhat. A vakcinát egyszeres vagy többszörös adagokban adhatjuk be.
A találmány szerinti eljárások lehetővé teszik egyértékű vagy többértékű vakcinák formulázását a PV-fertőzés megelőzése céljából. Az eljárásokat alkalmazva akár egyértékű, akár többértékű PV-vakcinákat készíthetünk, például egy egyértékű 16-os HPV típusú vakcinát készíthetünk, a HPV-16-Ll-fehérjét vagy L2-fehérjét, vagy L1+L2 fehérjéket kódoló DNS formulázásával, alternatív módon egy többértékű HPV-vakcinát formulázhatunk úgy, hogy összekeverjük a HPV-Ll-fehérjét vagy L2-fehérjét, vagy L1+L2 fehérjéket kódoló DNS-t különböző HPV-típusokból.
A DNS-t használhatjuk antitestek termelésére. A leírásban használt értelemben az „antitest” kifejezés magában foglalja mind a poliklonális, mind a monoklonális antitesteket valamint a ffagmenseiket, mint például az Fv, Fab és az F(ab)2 fragmenseket, amelyek képesek antigénhez vagy hapténhez kötődni.
A PV-DNS-t és a találmány szerinti antitesteket alkalmazhatjuk arra is, hogy szerológiailag tipizáljuk a HPV- vagy CRPV-fertőzést, valamint HPV szkrínelésre. A HPV és a CRPV-DNS és az antitestek alkalmasak kitek formulázására, melyekkel a HPV-t és a CRPV-t detektálni és szerológiailag tipizálni lehet. Egy ilyen kit magában foglalna egy rekeszekre osztott hordozóeszközt, amely fixen tud tartani legalább egy tartóedényt. A hordozóeszköz (csomag) tartalmazna továbbá reagenseket, olyanokat mint például a HPV-DNS, vagy többféle HPV-típus azonosítására alkalmas HPV elleni antitestek. A hordozóeszközben (csomagban) kapnának helyet esetleg a detektálásra alkalmas jelölt antigének, enzimszubsztrátok vagy hasonlók.
Az alábbi példák segítségével konkrétabban is ismertetjük a találmány szerinti megoldást, oltalmi igényünket nem korlátozzuk azonban az ismertetettekre.
7. példa
Vakcina termelésére alkalmas vektorok
A) VI
A VI expressziós vektor a pCMVl-AKI-DHFR vektorból [Y. Whang és munkatársai, J. Virol. 61, 1976, (1987)] készült. Az AKI- és a DHFR-géneket EcoRIgyel kivágva eltávolítottuk, majd a vektort önmagával ligáltuk. Ez a vektor nem tartalmazza a CMV-promoter
HU 220 747 BI
A intronját, így azt egy PCR fragmens formájában adtuk hozzá, amelynek belső SacI helyét előzőleg deletáltuk [Az 1855-ös bázispámál, a következő hivatkozásban lévő számozást alkalmazva: B. S. Chapman és munkatársai, Nuc. Acids Rés. 19, 3979, (1991)]. 5 A PCR-reakciókhoz használt templát a pCMVintA-Lux volt, amelyet a pCMV6al20-ból [lásd B. S. Chapman és munkatársai, mint fent] származó HindlII és Nhel fragmens - ez tartalmazza a hCMV-IEl enhanszer/promotert és az A intront - a pBL3 HindlII és Xbal restrik- 10 ciós hasítási helyei közé történő ligálásával készítettünk. így a pCMVIntBL-hez jutottunk. Az 1881 bázispárból álló luciferáz-génfragmenst (HindlII - Smal szakasz Klenowval feltöltve), amely az RSV-Lux-ból származott [J. R. de Wet és munkatársai, Mól. Cell Bioi. 7, 725, (1987)] a p CMVIntBL Sáli helyére klónoztuk, amelyet Klenowval töltöttünk fel és foszfatázzal kezeltünk.
Az A intront szegélyező láncindítók a következők voltak:
5’ láncindító:
5’-CTATATAAGCAGAGCTCGTTTAG-3’ (a szekvencialistában az 1-es azonosítószámon megadott szekvencia)
3’ láncindító:
5’-GTAGCAAAGATCTAAGGACGGTGACTGCAG-3’ (a szekvencialistában a 2-es azonosítószámon megadott szekvencia).
A láncindítók, amiket a SacI hasítóhely eltávolításához használtunk a következők voltak:
szensz láncindító (a szekvencialistában 3-as azonosítószámon megadott szekvencia), ’-GTATGTGTCTGAAAATG AGCGTGGAGATTGGGCTCGCAC-3 ’ és az antiszensz láncindító (a szekvencialistában 4-es azonosítószámon megadott szekvencia) ’-CTGCGAGCCCAATCTCCACGCTCATTTTCAGACACATAC-3 ’
A PCR fragmenst SacI és BglII enzimekkel hasítottuk, majd az előzőleg ugyanezekkel az enzimekkel hasított vektorba inszertáltuk.
Β) A VIJ expressziós vektor (a szekvencialistában 5-ös azonosítószámon megadott szekvencia)
A célunk a VIJ megalkotásával az volt, hogy eltávolítsuk a promotert és a transzkripciós terminációs elemeket a VI vektorunkból annak érdekében, hogy egy jobban definiált környezetbe helyezzük azokat, egy kompaktabb vektort készítsünk és javítsuk a plazmidtisztítás során a termelést.
A V1J a VI és a pUC19 (egy kereskedelmi forgalomban kapható plazmid) felhasználásával készült. A Vl-et Sspl-gyel és EcoRI-gyel emésztettük meg, így két DNS-fragmenst kaptunk. A kisebbik fragmens tartalmazta a CMVintA promotert, és a marha-növekedésihormon („Bovine Growth Hormoné”, BGH) transzkripciós terminációs elemeit, amelyek a heterológ gének expressziójának ellenőrzéséért felelősek. Ezt a fragmenst agaróz elektroforézis-gélből tisztítottuk. A fragmenst tompa végűvé tettük („blunt end”) T4 DNS-polimeráz enzim felhasználásával, hogy megkönnyítsük a ligálását egy másik tompa végű DNS-ffagmenshez.
A pUC19-et választottuk ki, hogy az expressziós vektor „gerincét” alkossa. A pUC 19-ről tudjuk, hogy tisztításával nagy mennyiségű plazmidot nyerhetünk, szekvenciálisán és funkcionálisan jól jellemzett, mérete igen kicsi. Haell restrikciós enzimmel részlegesen emésztve eltávolítottuk a teljes lac operont a vektorból, amelyre nem volt szükségünk és káros hatása lehetett volna a plazmidtermelésre és a heterológ génexpresszióra. A plazmid maradékát agaróz elektroforézisgélből tisztítottuk, T4 DNS-polimerázzal végeit tompává tettük, boíjúbél-alkalikusfoszfatázzal („calf intestinal alkaline phosphatase”) kezeltük, és CMVintA és BGH elemekhez ligáltuk a fentiek szerint. A plazmidokban, amiket kaptunk, a promoterelemek két lehetséges orientációban helyezkedtek el a pUC-gerinchez képest. Ezen plazmidok egyike lényegesen jobb termeléssel keletkezett E. coliban, ezt VIJ-nek jelöltük. Ennek a vektornak a szerkezetét a kapcsolórégiók szekvenciaanalízisével igazoltuk, és a továbbiakban kísérletileg is megállapítottuk, hogy a heterológ géneket hasonlóan vagy jobban expresszáltathatjuk a segítségével, mint a VI plazmiddal.
C) A VIJneo expressziós vektor (a szekvencialistában 6-os azonosítószámon megadott szekvencia)
El kellett hogy távolítsuk az ampr-gént, amely a VIJ-t hordozó baktérium antibiotikummal való szelekciójára szolgál, mivel az ampicillin nem feltétlenül használható az emberi klinikai termékek előállítása során alkalmazott nagyléptékű fermentációnál. Az amprgént a V1J pUC-gerincéből Sspl és EamllO5I restrikciós enzimekkel való emésztéssel távolítottuk el. A plazmid maradékát agaróz-gélelektroforézissel tisztítottuk, végeit tompává tettük T4-polimerázzal, majd borjúbél-alkalikusfoszfatázzal kezeltük. A kereskedelmi forgalomban kapható kanr-gént, mely a 903-as transzpozonból származik és a pUC4K plazmid tartalmazza PstI restrikciós enzimmel vágtuk ki, agarózgélelektroforézissel tisztítottuk, majd végeit tompává tettük T4-polimerázzal. Ezt a fragmenst ligáltuk aztán a VIJ gerinchez, és a kanr-gén orientációjától függően VlJneo#l-nek és VlJneo#3-nak neveztük el őket. Mindkét plazmid szerkezetéről meggyőződtünk restrikciós enzimmel való emésztéssel és a kapcsolórégiók szekvenciaanalízisével is, és kimutattuk, hogy a V1J plazmidhoz hasonló mennyiségben keletkeznek. A heterológ gének expressziója a VIJneo vektorok esetében szintén összemérhető volt a VIJ vektorral. Expressziós konstrukcióként önkényesen kiválasztottuk a VlJneo#3-at - mostantól VIJneo-nak nevezzük amely ugyanolyan orientációban tartalmazza a kanrgént, mint a VIJ az ampr-gént.
HU 220 747 Β1
D) A VIJns expressziós vektor A VIJneo plazmidba az integrációs vizsgálatok érdekében egy Sfil helyet építettünk be. Egy, a kereskedelmi forgalomban kapható 13 bázispár hosszúságú Sfil linkért (New England BioLabs) építettünk be a vek- 5 tor BGH-szekvenciájába a KpnI helyre. A VIJneo-t KpnI-gyel linearizáltuk, gélből tisztítottuk, végeit tompává tettük T4-polimerázzal, és a tompa végű Sfil linkerhez ligáltuk. Restrikciós térképezéssel választottuk ki a kiónokat, és a linkerszakasz szekvenálásával igazol- 10 tűk, hogy megfelelőek. Az új vektort Vl Jns-nek neveztük el. A heterológ gének expressziója a VIJns-ben (Sfil) összemérhető volt ugyanazon gének expressziójával a VIJneo-ban (KpnI).
2. példa
Amerikai üregi nyúl papillomavírus-fehérjéket kódoló DNS-konstrukciók előállítása
Minden klónozott gén esetében a CRPV-DNS forrása a CRPV-pLAII volt. Ez a teljes CRPV genom a Sáli helyre, a pBR322-be klónozva [Nasseri, M., Meyers, C. és Wettstein, F. O.: „Genetic analysis of CRPV pathogenesis: The L1 open reading iramé is dispensable fór cellular transformation bút is required fór papilloma formation”, Virology, 170, 321-325, (1989)].
1. VIJns-Ll: Az L 1-et kódoló szekvenciát PCR-rel hoztuk létre, a CRPV-pLAII DNS-t alkalmazva templátként. A PCR-láncindítókat úgy terveztük meg, hogy tartalmazzanak BamHI hasítóhelyet, miután a PCR fragmenseket gélből kitisztítottuk.
A láncindítók, amelyeket az L1 kódolórégió előállításához használtunk a következők voltak:
szensz láncindító:
BamHI
5’-GGTACAGGATCCACCATGGCAGTGTGGCTGTCTACGCAG-3’ (a szekvencialistában 7-es azonosítószámon megadott szekvencia) antiszensz láncindító:
BamHI
5’-CCACATGGATCCTTAAGTACGTCTCTTGCGTTTAGATG-3’ (a szekvencialistában 8-as azonosítószámon megadott szekvencia)
A PCR fragmenst gélből tisztítottuk, BamHI-gyel kivágtuk, és BglII-vei hasított VIJns-hez ligáltuk.
2. VlJns-L2: Az L2 kódolórégiót PCR-rel állítottuk elő. A CRPV-pLAII vektorban az L2-gént a CRPV pBR322-be történő inszertálására használt Sáli hely megtöri. Ezért úgy hoztuk létre a PCR-templátot, hogy a CRPV-pLAII-t Sall-gyel hasítottuk, és a CRPV-DNS-t cirkuláris formába ligáltuk a Sáli helyen. Ezt a ligáit CRPV-DNS-t alkalmaztuk templátként a PCR-nél. A PCR-láncindítókat úgy terveztük, hogy BamHI helyet tartalmazzanak, amelyeknél a gélből tisztított PCR fragmenst majd elhasíthatjuk.
Az L2 kódolórégió előállításához használt láncindítók a következők voltak:
szensz láncindító:
BamHI
5’-GGTACAGGATCCACCATGGTTGCACGGTCACGAAAACGC-3’ (a szekvencialistában 9-es azonosítószámon megadott szekvencia) antiszensz láncindító:
BamHI
5’-CCACATGGATCCTTATTCTGCGTAGACAGCCACACT-3’ (a szekvencialistában 10-es azonosítószámon megadott szekvencia)
3. VlJns-E2: Az E2 kódolórégiót PCR-rel állítottuk elő, a CRPV-pLAII-DNS-t alkalmazva templátként. A PCR-láncindítókat úgy terveztük meg, hogy BglII helyet tartalmazzanak, hogy ott a gélből tisztított PCR fragmens hasítható legyen.
Az E2 kódolórégió előállításához használt láncindítók a következők:
szensz láncindító:
BglII
5’-GGTACAAGATCTACCATGGAGGCTCTCAGCCAGCGCTTA-3’ (a szekvencialistában 11-es azonosítószámon megadott szekvencia)
HU 220 747 Bl antiszensz láncindító:
BglII
5’-CCACATAGATCTCTAAAGCCCATAAAAATTCCCTAAAAAC-3’ (a szekvencialistában 12-es azonosítószámon megadott szekvencia)
4, VlJns-E4: Az E4 kódolórégiót PCR-rel állítot- Az E4 kódolórégió előállításához használt láncindítuk elő, a CRPV-pLAII-DNS-t alkalmazva templát- tók a következők: ként. A PCR-láncindítókat úgy terveztük meg, hogy
BglII helyet tartalmazzanak, hogy ott a gélből tisztított
PCR fragmens hasítható legyen. 10 szensz láncindító:
BglII
5’-GGTACAAGATCTACCATGAGCCATGGACATTGCAGGATAC-3’ (a szekvencialistában 13-as azonosítószámon megadott szekvencia) antiszensz láncindító:
BglII
5’-CCACATAGATCTTTATAAGCTCGCGAAGCCGTCTATTCC-3’ (a szekvencialistában 14-es azonosítószámon megadott szekvencia)
5. VlJns-E7: Az E7 kódolórégiót PCR-rel állítottuk elő, a CRPV-pLAII-t alkalmazva templátként az egyik esetben, és Kreider-féle CRPV-törzsből származó tisztított DNS-t a másik esetben. Ugyanazokat a PCR-primereket használtuk mindkét templát esetében.
A PCR-láncindítókat úgy terveztük meg, hogy BglII helyet tartalmazzanak, hogy ott a gélből tisztított PCR fragmens hasítható legyen.
Az E7 kódolórégió előállításához használt láncindítók a következők voltak:
szensz láncindító:
BglII ’-GGTACAAGATCTACCATGATAGGCAGAACTCCTAAGCTTA-3 ’ antiszensz láncindító:
BglII
5’-CCACATAGATCTTCAGTTACAACACTCCGGGCACAC-3’
6. pGEX-2T-E2: Az E2 kódolórégiót PCR-rel állítottuk elő, amint azt a VlJns-E2 esetében leírtuk. A fragmenst pGEX-2T-be klónoztuk, a BamHI helyre, hogy a glutation S-transzferázzal (GST) fázisban levő fúziót hozzunk létre. Ezt a konstrukciót használtuk a fehérje előállítására E. coliban.
7. pGEX-2T-E4: Az E4 kódolórégiót PCR-rel állítottuk elő, amint azt a VlJns-E4 esetében leírtuk. A fragmenst pGEX-2T-be klónoztuk, a BamHI helyre, hogy a glutation S-transzferázzal (GST) fázisban levő fúziót hozzunk létre. Ezt a konstrukciót használtuk a fehérje előállítására E. coliban.
8. pGEX-2T-E7: Az E7 kódolórégiót PCR-rel állítottuk elő, amint azt a VlJns-E7 esetében leírtuk. A fragmenst pGEX-2T-be klónoztuk, a BamHI helyre, hogy a glutation S-transzferázzal (GST) fázisban levő fúziót hozzunk létre. Ezt a konstrukciót használtuk a fehérje előállítására E. coliban.
3. példa
Plazmidtisztítás E. coliból.
A V1J konstrukciókat hordozó sejteket éjszaka a telítési fázisig szaporítottuk. A sejteket begyűjtöttük, és az alkalikus SDS-eljárás [Sambrook, J., Fritsch, E. F., and Maniatis, T., „Molecular Cloning: A Laboratory
Manual” Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor. N. Y., ed.2 (1989)] egy módosított változatával feltártuk. A módosítás abban állt, hogy a sejtfeltáráshoz és a DNS líziséhez háromszoros térfogatokat használtunk. A DNS-t „double banding” eljárással tisztítottuk CsCl-EtBr gradiensen. Az EtBr-ot 1-butanolos extrakcióval távolítottuk el. A kapott DNS-t fenol/kloroform eleggyel extraháltuk, majd etanollal kicsaptuk. A DNS-t újra felszuszpendáltuk TE-pufferben (10 mM Tris, 1 mM EDTA), pH 8-on a transzfekciók, és 0,9% NaCl jelenlétében az egérbe való injektálás miatt. Minden DNS-preparátum koncentrációját meghatároztuk 260 nm-en és 280 nm-en leolvasva az OD-t. Az OD260/OD2g0 arány >1,8 volt.
4. példa
CRPV-specifikus antitestek termelése in vivő:
Öt nyúltól vettünk vért csoportonként, majd oltottunk be 1,2 ml sóoldattal amely 1-1 mg VlJnsLl-t, VlJnsL2-t, VlJnsLl-t VlJnsL2-vel keverve (összesen 2 mg), vagy csupán VI Jns-t (kontrollvektor, nem kódol fehéijét) tartalmazott. Az oltóanyagot egyenletesen osztottuk el hat intramuszkuláris helyen, amelyek a hátsó lábakon, a mellső lábakon és a hát alsó részén voltak. Három héttel a kezdeti DNS-injekció után a nyulaktól
HU 220 747 Bl újra vért vettünk, és ugyanabból a DNS-ből ugyanazon a módon egy második injekciót is kaptak. Négy héttel a második injekció után az állatoktól újra vért vettünk.
A szérumokat vírusközömbösítő antitestekre teszteltük úgy, hogy az immunszérumot tízszeres hígításban adtuk hozzá 1:3 arányban hígított CRPV-vírus-törzsállományhoz (Kreider-törzs). A hígításokat Dulbecco szerint módosított Eagle-féle tápoldatban (DMEM) készítettük el, amelyet 1% marha-szérumalbuminnal (BSA) egészítettünk ki. A CRPV-vírus-törzsállományt (amelyet Dr. J. Kreidertől szereztünk be, Hershey, PA) bőrdarabokból preparáltuk, amelyek CRPV-vel fertőzött vad amerikai üregi nyulakból származtak, és tímuszhiányos egerek renális tokjai alá ültettük be őket. A kapott függölyöket homogenizáltuk majd centrifugáltuk, és így kaptuk a vírustörzsállományt. Az immunszérum és a vírus keverékét legalább 60 percig jégen tartottuk, majd mindegyik keverék 50 μΐ-ét 3 új-zélandi fehér nyúl hátbőrének egy 1 cm2-es borotvált, megkarcolt bőrfelületére cseppentettük. Az állatokon 7 héttel később megvizsgáltuk a szemölcsöket, és anteroposzterior és laterális irányban is megmértük az ellipszoidális szemölcsök átmérőjét. A végponttitereket a szemölcsök gyakoriságának figyelembevételével állapítottuk meg, Reed-Muench interpolálással, különböző hígításoknál. Az Ll-DNS-sel, vagy Ll- és L2-DNS-sel egyszerre beoltott nyulak közömbösítő antitesttitereit az
1. ábra y tengelyén tüntettük fel.
Az Ll-DNS-sel beoltott nyulakból származó szérumot ELISA-val is megvizsgáltuk antitestre nézve. Polisztirol ELISA-lemezeket egy éjszakán át 4 °C-on burkoltuk 1 pg/mélyedés részlegesen tisztított, rekombináns, élesztőben termelt CRPV-Ll-fehérjével. A rekombináns Ll-et Saccharomyces cerevisiaeben készítettük el, és Kirbauer módszerével tisztítottuk [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 12180-4, (1992)] kisebb módosításokkal. A hígított szérumot hozzáadása után 1 órán keresztül rázattuk egy „orbitális” rázógépben szobahőmérsékleten. A lemezeket ezután lemostuk, és tormaperoxidáz-jelölt kecske anti-nyúl IgG-t (Fc-specifikusat) adtunk hozzá. A lemezeket 1 órás rázatás után lemostuk, majd hozzáadtuk a szubsztrátot. A lemezeket 450 nm-nél olvastuk le egy kinetikus ELISA-leolvasóval (Molecular Devices Corp.), majd a kapott értékeket korrigáltuk a háttér kivonásával. A háttér kivonása az immunizálás előtti szérum reakciósebességének a kivonását jelentette az immunizálás utáni szérum reakciósebességéből ugyanannál a hígításnál. A titereket úgy állapítottuk meg, hogy a korrigált reakciósebességek kapott görbéit interpoláltuk a hígítás ellenében 10 mOD/perc sebességértékekre. Az Ll-DNS-sel vagy L2- és Ll-DNS-sel egyszerre beoltott nyulak ELISAtiterei az 1. ábra x tengelyén láthatóak. Az 1. ábra azt mutatja, hogy a 13 szérumból, amelyik pozitív volt közömbösítő aktivitásra nézve, (log(titer) >1, azaz a hígítatlan szérummal nézve pozitív) 12 pozitív volt ELISAval vizsgálva antitestre (ELISA-titer >100). A négy szérumból, amelyek negatívak voltak közömbösítő antitestre nézve mind a négyre az ELISA-titer <350 volt. Az összes olyan nyúlból kapott szérum, amelyek csupán
L2-DNS-t vagy V1J kontrollvektort kaptak, az ELISAtitere kisebb volt mint 100. Egészében nézve ezek az adatok azt mutatják, hogy az Ll-DNS-sel való beoltás után CRPV-re specifikus, és azt közömbösíteni képes antitesteket kaptunk. Az ELISA-titerek nyúlban a beoltást követően legalább 32 hétig megmaradtak (2. ábra).
5. példa
Védelem nyulakban virulens CRPV-vel való fertőzéssel szemben
Csoportonként öt nyulat oltottunk be intramuszkulárisan 1-1 mg VlJnsLl-gyel, VlJnsL2-vel, VlJnsLlvel VlJnsL2-vel keverve (összesen 2 mg), vagy csupán VIJns-sel (kontrollvektor, nem kódol fehérjét) tartalmazott, amint azt fent leírtuk. Három héttel az első DNSinjekció után a nyulak egy második, ugyanolyan DNSinjekciót is kaptak. Négy héttel a második injekció után a nyulakat megfertőztük CRPV-vel. CRPV-vel úgy fertőztük meg az állatokat, hogy 50 μΐ kétféleképpen hígított vírustörzsállománnyal (1:2, illetve 1:12 arányban hígítva DMEM-mel, és 1% BSA-t adva hozzá) a nyulak hátbőrét három helyen 1-1 cm2-es leborotvált, megkarcolt bőrfelületen bekentük. A fertőzés időpontjában szérumot vettünk az állatokból, amelyeket előzőleg beoltottunk Ll-DNS-sel vagy Ll- és L2-DNS-sel egyszerre, és a szérumok a fent leírtak szerint, ELISA-val mérve Ll elleni antitestet, és vírust közömbösítő antitestet tartalmaztak. Az állatokon képződött szemölcsöket a fertőzés után 3, 6, illetve 10 héttel vizsgáltuk meg. Azokon a nyulakon, amelyek nem kaptak Ll-DNS-t 54 CRPV-vel fertőzött hely közül 51-en szemölcsök fejlődtek, míg az Ll-DNS-t kapott állatok közül 60 helyből csak 2-n alakultak ki szemölcsök. A két szemölcs egyike, amelyeket Ll-DNS-sel immunizált nyúlon figyeltünk meg, visszahúzódott 3 héttel a megjelenése után. Az 1. táblázat (5. ábra) mutatja a szemölcsök eloszlását a nyulakon a CRPV-fertőzés után. A profilaktikus immunizálás Ll-DNS-sel megvédte tehát a nyulakat attól, hogy virulens CRPV-vel való fertőzés nyomán szemölcsök fejlődjenek ki rajtuk.
6. példa
Ll-DNS-sel indukált antitestek konformációs specificitása
Annak érdekében, hogy demonstráljuk, hogy a védelmet okozó közömbösítő antitestek a VLP-ken konformációs epitópokat ismernek fel, abszorpciós kísérleteket végeztünk. Az immunszérum abszorpciója LlVLP-hez eltávolította az összes közömbösítő antitestet és ELISA-aktivitást. (3A., 3B. ábra). Ha a megkarcolt bőrre immunizálás előtti nyúlszérummal kevert CRPV-t juttattunk minden fertőzött helyen függölyök alakultak ki, míg ha a CRPV-t immunszérummal kevertük össze és hasonlóképpen fertőztünk vele, a közömbösítő antitestaktivitásnak köszönhetően nem voltak láthatók függölyök. Amikor a CRPV-t olyan immunszérummal kevertük össze, amelyet előzőleg Ll-VLP-vel abszorbeáltunk, azt várva, hogy ezzel eltávolítottuk a közömbösítő antitesteket, mind a három hely pozitív volt függölyökre nézve. Ezzel szemben, ha az immunszérumot
HU 220 747 Β1 denaturált, nem részecske formájában jelen levő Llfehéijével abszorbeáltuk, (amelyet 8 M-os karbamidban redukció és alkilezés segítségével denaturáltunk), a szérum továbbra is képes volt CRPV-t közömbösíteni (3A. ábra), és megtartotta ELISA-aktivitását (3B. ábra), így tehát az Ll-DNS-sel való immunizálás során keletkezett vírusközömbösítő antitestek csupán natív konformációjú Ll-VLP-kkel távolíthatók el, denaturált Irigyel nem. Úgy tűnik az ELISA-mérés elsődlegesen konformációra specifikus antitestek reakcióját méri intakt Ll-VLP-vel, miközben az ELISA-aktivitás csökkenése az abszorpció során megfelelt a közömbösítő antitestek eltávolításának (3B. ábra).
7. példa
E4- és E7-DNS-sel előidézett antitestválaszok
Csoportonként négy új-zélandi fehér nyulat oltottunk be intramuszkulárisan immunizálásonként 1 mg V1JE2-, vagy VlJ-E7-DNS-sel. Négy immunizálást hajtottunk végre a 0., 4., 8., és a 16., héten, és vért vettünk a 20. héten. A kódolt fehéijék expressziójának helyettes markereiként az antitesteket alkalmaztuk. A szérumantitesteket ELISA-lemezek segítségével vizsgáltuk meg (NUNC Maxisorp), amelyeket 1 pg/mélyedés GSTE2 vagy GST-E7 fúziós fehérjével burkoltunk, mely fehérjéket CRPV-E2-t kódoló pGEX expressziós vektorral transzformált és IPTG-vel indukált E. co/íból tisztítottunk. Az ELISA-mérést a 3. példában leírtak szerint hajtottuk végre. A nettó reakciósebességet (a 4. immunizálás utániból kivonva az immunizálás előttit) mOD/perc egységekben a 4. ábra mutatja. A 10 mOD/perc egységnél nagyobb sebességeket pozitívnak tekintjük; a nagy antitesttiterrel rendelkező példányoknak a legkisebb hígításoknál lehet alacsony a nettó reakciósebességük a detektálórendszer túltelítődése következtében. így tehát a kódolt E2- és E7-fehéijék expresszálódtak és a befogadó állat immunrendszere felismerte őket.

Claims (2)

1. Fiziológiásán elfogadható oldatban található, és a következő összetevőket a) a HPV6a, HPV6b, HPV11, HPV16 és HPV18 humán papillomavírusok génjei közül legalább egyet tartalmazó és Ll- vagy L1+L2 proteint expresszáló polinukleotidot,
b) RNS polimeráz transzkripciót lehetővé tevő promotert - előnyösen CMV-promotert,
c) transzkripciós terminátort - előnyösen egy marha-növekedésihormon gén transzkripciós terminátorátés
d) markergént - előnyösen neomicinrezisztenciagént tartalmazó polinukleotidvektor alkalmazása állati szövetekben in vivő humán papillomavírus-specifikus immunválasz indukálására alkalmas gyógyászati készítmény előállítására.
2. Az 1. igénypont szerinti alkalmazás, amely szerint a VIJneo- vagy VI Jns-vektort alkalmazzuk.
HU9603562A 1994-06-30 1995-06-01 Polinukleotid vakcina papillómavírus ellen HU220747B1 (hu)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US26842494A 1994-06-30 1994-06-30
PCT/US1995/006915 WO1996000583A1 (en) 1994-06-30 1995-06-01 Polynucleotide vaccine for papillomavirus

Publications (3)

Publication Number Publication Date
HU9603562D0 HU9603562D0 (en) 1997-02-28
HUT76446A HUT76446A (en) 1997-09-29
HU220747B1 true HU220747B1 (hu) 2002-05-28

Family

ID=23022939

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU9603562A HU220747B1 (hu) 1994-06-30 1995-06-01 Polinukleotid vakcina papillómavírus ellen

Country Status (20)

Country Link
US (1) US5866553A (hu)
EP (1) EP0768893B1 (hu)
JP (1) JPH10501987A (hu)
CN (1) CN1156966A (hu)
AT (1) ATE233101T1 (hu)
AU (1) AU701973B2 (hu)
CA (1) CA2193365C (hu)
CZ (1) CZ375296A3 (hu)
DE (1) DE69529748T2 (hu)
ES (1) ES2191052T3 (hu)
FI (1) FI965224A0 (hu)
HU (1) HU220747B1 (hu)
IL (1) IL113817A (hu)
MX (1) MX9700229A (hu)
NO (1) NO965590L (hu)
NZ (1) NZ288045A (hu)
PL (1) PL180639B1 (hu)
SK (1) SK164196A3 (hu)
WO (1) WO1996000583A1 (hu)
ZA (1) ZA954641B (hu)

Families Citing this family (44)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6995008B1 (en) * 1994-03-07 2006-02-07 Merck & Co., Inc. Coordinate in vivo gene expression
US5736524A (en) * 1994-11-14 1998-04-07 Merck & Co.,. Inc. Polynucleotide tuberculosis vaccine
FR2751879B1 (fr) * 1996-07-30 1998-10-30 Transgene Sa Composition pharmaceutique contre les tumeurs et infections a papillomavirus
US7118754B1 (en) 1996-07-30 2006-10-10 Transgene S.A. Pharmaceutical composition for treating papillomavirus tumors and infection
DE19631357A1 (de) * 1996-08-02 1998-02-05 Deutsches Krebsforsch Vektor zur Aktivierung des Immunsystems gegen mit Papillomviren bzw. Sequenzen davon assoziierten Zellen
US20060002949A1 (en) * 1996-11-14 2006-01-05 Army Govt. Of The Usa, As Rep. By Secretary Of The Office Of The Command Judge Advocate, Hq Usamrmc. Transcutaneous immunization without heterologous adjuvant
US5980898A (en) * 1996-11-14 1999-11-09 The United States Of America As Represented By The U.S. Army Medical Research & Material Command Adjuvant for transcutaneous immunization
US6797276B1 (en) * 1996-11-14 2004-09-28 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army Use of penetration enhancers and barrier disruption agents to enhance the transcutaneous immune response
US20060002959A1 (en) * 1996-11-14 2006-01-05 Government Of The United States Skin-sctive adjuvants for transcutaneous immuization
AU722326B2 (en) * 1997-02-14 2000-07-27 Merck & Co., Inc. Polynucleotide vaccine formulations
US6183746B1 (en) 1997-10-09 2001-02-06 Zycos Inc. Immunogenic peptides from the HPV E7 protein
US6013258A (en) * 1997-10-09 2000-01-11 Zycos Inc. Immunogenic peptides from the HPV E7 protein
US20040258703A1 (en) * 1997-11-14 2004-12-23 The Government Of The Us, As Represented By The Secretary Of The Army Skin-active adjuvants for transcutaneous immunization
US7182947B2 (en) 1998-02-20 2007-02-27 Medigene Ag Papillomavirus truncated L1 protein and fusion protein constructs
US20020039584A1 (en) 1998-02-20 2002-04-04 Medigene Ag Papilloma virus capsomere vaccine formulations and methods of use
CA2229955C (en) 1998-02-20 2003-12-09 Medigene Gmbh Papilloma virus capsomere vaccine formulations and methods of use
US7494658B2 (en) 1998-02-20 2009-02-24 Medigene Ag Papilloma virus truncated L1 protein and fusion protein constructs
US6926897B1 (en) 1998-03-24 2005-08-09 Medigene Aktiengesellschaft Medicament for the avoidance or treatment of papillomavirus-specific tumour
AU3489499A (en) * 1998-04-14 1999-11-01 Merck & Co., Inc. Needleless administration of polynucleotide formulations
ATE369428T1 (de) * 1998-09-04 2007-08-15 Sanofi Pasteur Ltd Behandlung von gebärmutterhalskrebs
US20020054914A1 (en) * 1999-02-03 2002-05-09 Tulin Morcol Compositions and methods for therapuetic agents complexed with calcium phosphate and encased by casein
US20040258763A1 (en) * 1999-02-03 2004-12-23 Bell Steve J.D. Methods of manufacture and use of calcium phosphate particles containing allergens
EP1150918B1 (en) 1999-02-03 2004-09-15 Biosante Pharmaceuticals, Inc. Method of manufacturing therapeutic calcium phosphate particles
ATE549032T1 (de) * 1999-03-26 2012-03-15 Vical Inc Adjuvanzverbindungen zur verbesserung von immunreaktionen auf polynukleotid-basierten impfstoffen
EP1165132B1 (en) * 1999-04-08 2011-10-19 Intercell USA, Inc. Dry formulation for transcutaneous immunization
PT1212358E (pt) * 1999-08-25 2005-04-29 Merck & Co Inc Genes sinteticos de papilomavirus humano
US7001995B1 (en) 1999-08-25 2006-02-21 Merck & Co., Inc. Synthetic human papillomavirus genes
KR100366608B1 (ko) * 2000-02-15 2003-01-09 마스터진(주) 형질전환 식물체로부터 생산된 재조합 인간 파필로마바이러스 백신
US20020044948A1 (en) * 2000-03-15 2002-04-18 Samir Khleif Methods and compositions for co-stimulation of immunological responses to peptide antigens
SE0002498D0 (sv) * 2000-07-03 2000-07-03 Stefan Schwartz Papillomavirus vaccine
KR20020005332A (ko) * 2000-07-10 2002-01-17 정상훈 탈모증 치료용 키트
CA2437899C (en) * 2001-02-13 2012-05-15 Gregory M. Glenn Vaccine for transcutaneous immunization against etec-caused traveler's diarrhea
EP1409012B1 (en) * 2001-06-22 2009-02-11 The Wistar Institute Of Anatomy And Biology Methods of inducing a cytotoxic immune response and recombinant simian adenovirus compositions useful therein
DE10137102A1 (de) * 2001-07-30 2003-02-27 Deutsches Krebsforsch Polyvalente Vakzine gegen durch Papillomaviren verursachte Erkrankungen, Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung
US20030185892A1 (en) * 2001-08-17 2003-10-02 Bell Steve J. D. Intraocular delivery compositions and methods
US20030228327A1 (en) * 2001-11-05 2003-12-11 Lasher Alfred W. DNA-based plasmid formulations and vaccines and prophylactics containing the same
DK1585812T3 (en) 2002-12-13 2017-04-10 Alphavax Inc MULTI-ANTI-ANTI-ANTI-VIRUS REPLICATE PARTICLES AND PROCEDURES
WO2005084637A2 (en) * 2004-02-13 2005-09-15 Nod Pharmaceuticals, Inc. Particles comprising a core of calcium phosphate nanoparticles, a biomolecule and a bile acid, methods of manufacturing, therapeutic use thereof
CA2586035A1 (en) 2004-11-01 2006-05-11 Biosante Pharmaceuticals, Inc. Therapeutic calcium phosphate particles in use for aesthetic or cosmetic medicine, and methods of manufacture and use
CN101193653B (zh) * 2005-02-01 2013-03-27 美国政府健康及人类服务部 用于诱导广泛交叉中和抗体的乳头瘤病毒l2 n末端肽
BRPI0811016B1 (pt) * 2007-04-29 2021-09-21 Xiamen Innovax Biotech Co., Ltd. Proteína li truncada do papiloma vírus humano tipo 16
WO2008134935A1 (fr) 2007-04-29 2008-11-13 Beijing Wantai Biological Pharmacy Enterprise Co., Ltd. Protéines 18 l1 de type papillomavirus humain tronqué
WO2008145021A1 (en) * 2007-05-29 2008-12-04 Xiamen University A truncated l1 protein of human papillomavirus 6
CN105209063A (zh) * 2013-03-15 2015-12-30 宾夕法尼亚大学理事会 具有抗原和作为佐剂的白细胞介素-23的疫苗

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4497796A (en) * 1980-03-26 1985-02-05 The Regents Of The University Of California Gene transfer in intact mammals
WO1986005816A1 (en) * 1985-04-04 1986-10-09 Georgetown University Type-specific papillomavirus dna sequences and peptides
US4777239A (en) * 1986-07-10 1988-10-11 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Diagnostic peptides of human papilloma virus
DE69032284T2 (de) * 1989-03-21 1998-10-08 Vical, Inc., San Diego, Calif. Expression von exogenen polynukleotidsequenzen in wirbeltieren
EP1471147A3 (en) * 1991-07-19 2007-03-21 The University Of Queensland Method of making a recombinant molecule for the expression of HPV-16 L1 protein
US5376542A (en) * 1992-04-27 1994-12-27 Georgetown University Method for producing immortalized cell lines using human papilluma virus genes
ES2201055T3 (es) * 1992-08-07 2004-03-16 Wyeth Vacunas de adenovirus recombinante.
US5437951A (en) * 1992-09-03 1995-08-01 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Self-assembling recombinant papillomavirus capsid proteins
US5593972A (en) * 1993-01-26 1997-01-14 The Wistar Institute Genetic immunization

Also Published As

Publication number Publication date
ES2191052T3 (es) 2003-09-01
NZ288045A (en) 1998-08-26
PL180639B1 (pl) 2001-03-30
HU9603562D0 (en) 1997-02-28
US5866553A (en) 1999-02-02
MX9700229A (es) 1997-04-30
IL113817A (en) 2001-03-19
DE69529748T2 (de) 2003-10-16
WO1996000583A1 (en) 1996-01-11
FI965224A (fi) 1996-12-27
EP0768893A1 (en) 1997-04-23
ZA954641B (en) 1996-01-26
DE69529748D1 (de) 2003-04-03
IL113817A0 (en) 1995-08-31
SK164196A3 (en) 1997-08-06
CN1156966A (zh) 1997-08-13
EP0768893B1 (en) 2003-02-26
AU701973B2 (en) 1999-02-11
NO965590L (no) 1997-02-28
ATE233101T1 (de) 2003-03-15
CZ375296A3 (en) 1997-08-13
AU2694595A (en) 1996-01-25
JPH10501987A (ja) 1998-02-24
HUT76446A (en) 1997-09-29
CA2193365A1 (en) 1996-01-11
PL317874A1 (en) 1997-04-28
NO965590D0 (no) 1996-12-27
CA2193365C (en) 2007-04-03
FI965224A0 (fi) 1996-12-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HU220747B1 (hu) Polinukleotid vakcina papillómavírus ellen
US6235523B1 (en) Vectors for DNA immunization against cervical cancer
KR20210092762A (ko) 아프리카 돼지 열병 바이러스에 대한 면역원성 조성물
WO1998023635A1 (en) Novel promiscuous t helper cell epitopes
US5874089A (en) Protecting against canine oral papillomavirus (copy)
Hu et al. Intracutaneous DNA vaccination with the E8 gene of cottontail rabbit papillomavirus induces protective immunity against virus challenge in rabbits
JPH10503649A (ja) ポリヌクレオチド・ヘルペスウイルス・ワクチン
US20050118139A1 (en) Vaccine using papilloma virus e proteins delivered by viral vector
Hu et al. Protective cell-mediated immunity by DNA vaccination against papillomavirus L1 capsid protein in the cottontail rabbit papillomavirus model
EP1546191A2 (en) Dna vaccine encoding at least two nonstructural early proteins of papillomavirus
RU2173170C2 (ru) Полинуклеотидная вакцина для вируса папилломы
Deng et al. The preparation of human papillomavirus type 58 vaccine and exploring its biological activity and immunogenicity in vitro
Kwak Development of prophylactic human papillomavirus vaccines
Embers Immunogenicity and Cellular Protein Associations of the Papillomavirus Minor Capsid Protein
AU4889102A (en) Papillomavirus vaccine

Legal Events

Date Code Title Description
HMM4 Cancellation of final prot. due to non-payment of fee