CN115040644A - 新冠肺炎重组狂犬病病毒载体疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种包含改造的SARS‑CoV‑2的刺突蛋白(S’)的疫苗组合物，用于预防新型冠状病毒的感染，尤其是针对哺乳动物的新型冠状病毒的感染。

Description

新冠肺炎重组狂犬病病毒载体疫苗

技术领域

本发明涉及针对哺乳动物新型冠状病毒的预防性疫苗的组合物和方法，进一步涉及针对哺乳动物新型冠状病毒和狂犬病病毒的预防性疫苗的组合物和方法。

背景技术

新型冠状病毒性疾病(COVID-19)是由新型冠状病毒(SARS-CoV-2)引起的传播能力极强的人兽共患病(Chan,J.F.W.,et al.,A familial cluster of pneumoniaassociated with the 2019novel coronavirus indicating person-to-persontransmission:a study of a family cluster.Lancet,2020.395(10223):p.514-523；Zhu,N.,et al.,A Novel Coronavirus from Patients with Pneumonia in China,2019.New England Journal Of Medicine,2020.382(8):p.727-733.)。COVID-19在全球仍然持续流行，不断危害人类生命健康。SARS-CoV-2的动物感染谱较为广泛，能感染蝙蝠、狮子、老虎、恒河猴、食蟹猴、水貂、雪貂、猫等多种强流动性动物。目前，欧洲和北美大量养殖场水貂发生新冠病毒感染，已出现水貂将新冠病毒传播给人类的个案，近2千万只水貂被扑杀，给欧美水貂产业带来毁灭性打击，对我国的水貂产业也构成严重威胁。值得注意的是，SARS-CoV-2高度易感的水貂和猫在全球范围内广泛存在，流动性极强，这将极大地增加了人间COVID-19的传播风险。到目前为止仍缺少有效预防COVID-19的方法，其中间宿主和传播途径也有待进一步证实，从而加大了防控COVID-19的难度。疫苗是阻断、消除人间COVID-19最有效最有潜力的途径。

寻找抗原性更优的SARS-CoV-2病毒的抗原依然是目前研究的热点。进一步制备用于动物的COVID-19的疫苗是阻断、消除COVID-19在动物之间以及人畜之间传播的最有效的手段。

RABV属于弹状病毒科(Rhaboviridae)狂犬病病毒属(Lyssaavirus)的狂犬病病毒，其基因组RNA(vRNA)严格保守有序地编码5种结构蛋白：核蛋白(N)，磷蛋白(P)，基质蛋白(M)，糖蛋白(G)和大聚合酶蛋白(L)。RABV具有基因组结构简单、反向遗传技术成熟、能稳定容纳并高水平表达外源基因、能同时有效诱导载体和外源蛋白相关的免疫反应等特点，可作为优良的病毒载体[Bukreyev,A.,et al.,Nonsegmented negative-strand virusesas vaccine vectors.ournal Of Virology,2006.80(21):p.10293-10306.]。本研究团队前期在RABV重组野生Evelyn-Rokitnicki-Abelseth(rERA)株反向遗传操作载体平台上，构建出G333位点突变成谷氨酸(E)的分子修饰狂犬病病毒ERA疫苗株(rERAG333E).[Shuai,L.,et al.,Genetically modified rabies virus ERA strain is safe and induceslong-lasting protective immune response in dogs after oralvaccination.Antiviral Res,2015.121:p.9-15.]；以候选疫苗株rERAG333E为活病毒载体，构建出一系列表达埃博拉病毒、尼帕脑炎病毒G蛋白的重组RABV，均具有良好的安全性和免疫原性。[Shuai,L.,et al.,Genetically modified rabies virus-vectored Ebolavirus disease vaccines are safe and induce efficacious immune responses inmice and dogs.Antiviral Res,2017.146:p.36-44；Shuai,L.,et al.,Immune responsesin mice and pigs after oral vaccination with rabies virus vectored Nipahdisease vaccines.Vet Microbiol,2020.241:p.108549.]。因此，RABV rERAG333E株是良好的病毒载体用于疫苗的创制。

从上述内容可以看出，寻找抗原性更优的SARS-CoV-2蛋白提供针对COVID-19的疫苗，尤其是针对哺乳动物的COVID-19的疫苗是迫切需要的，因此本发明人在多年工作的积累下开发了这样的新的疫苗来预防新型冠状病毒的感染，尤其是针对哺乳动物的新的疫苗来预防新型冠状病毒的感染。本发明提供了这种预防性疫苗。

发明内容

SARS-CoV-2的刺突蛋白(S)含有S1和S2两个亚基，其中S1具有SARS-CoV-2与宿主细胞结合的RBD区，发挥病毒吸附宿主细胞的功能，S2亚基发挥病毒-宿主细胞吸附后膜融合的功能。S蛋白是刺激机体发挥免疫原性的重要靶标蛋白，是COVID-19疫苗创制的基础。

本发明提供了包含改造的SARS-CoV-2的刺突蛋白(S’)的疫苗组合物，该改造的SARS-CoV-2的刺突蛋白(S’)包含组织型纤溶酶原激活因子信号肽。

在一个实施方案中，本发明提供了包含改造的SARS-CoV-2的刺突蛋白(S’)或其免疫原性衍生物的疫苗组合物，其中改造的SARS-CoV-2的刺突蛋白(S’)包括S蛋白基因信号肽替换为组织型纤溶酶原激活因子信号肽。

在一个实施方案中，该疫苗组合物包含改造的SARS-CoV-2的刺突蛋白(S’)，该改造的SARS-CoV-2的刺突蛋白(S’)选自命名为S’-TP-1(SEQ ID NO：1)、S’-TP-2(SEQ ID NO：2)的刺突蛋白。

在一个实施方案中，该改造的SARS-CoV-2的刺突蛋白(S’)或其免疫原性衍生物包含来自SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的核苷酸序列。

在一个实施方案中，该改造的SARS-CoV-2的刺突蛋白(S’)及或其免疫原性衍生物与SARS-CoV-2的刺突蛋白(S)相比优选Furin裂解位点突变缺失，进一步优选6个氨基酸位点脯氨酸突变(F817P、A892P、A899P、A942P、K986P、V987P)可表达出完整、空间结构更稳定、免疫原性更高的SARS-CoV-2S’蛋白。

在一个实施方案中，该改造的SARS-CoV-2的刺突蛋白(S’)或其免疫原性衍生物由病毒载体编码。

在一个实施方案中，该改造的SARS-CoV-2的刺突蛋白(S’)或其免疫原性衍生物由病毒载体编码，所属病毒载体选自腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体、痘病毒载体、疱疹病毒载体、新城疫病毒载体、流感病毒载体、狂犬病病毒载体。

在一个实施方案中，该疫苗组合物优选包含将狂犬病毒疫苗株(rERAG333E)的非致病性骨架与新型改造的SARS-CoV-2的刺突蛋白(S’)结合的重组嵌合型狂犬病毒。

在一个实施方案中，重组嵌合型狂犬病毒病毒被命名为重组RABV rERAG_333E-coS’(SEQ ID NO：3)，在coS的基础上构建了表达coS蛋白基因信号肽替换成tPA、Furin裂解位点突变缺失和6个脯氨酸突变的SARS-CoV-2S蛋白基因突变体tPASopti6(S6P)的重组RABVrERAG_333E-S6P(SEQ ID NO：4)。在一个实施方案中，疫苗是口服疫苗、活疫苗、经修饰的活疫苗、灭活疫苗、减毒疫苗、或亚单位疫苗。在另一个实施方案中，疫苗组合物包含含有改造的SARS-CoV-2的刺突蛋白(S’)的狂犬病病毒载体RABV rERAG333E。

在一个具体实施方案中，疫苗是口服疫苗，在另一个具体实施方案中，疫苗是灭活疫苗。在另一个具体的实施方案中，疫苗是亚单位疫苗或灭活的全病毒疫苗。

在一个方面，根据本发明的疫苗组合物还包含佐剂。在一个实施方案中，佐剂选自：水包油佐剂、聚合物和水佐剂、油包水佐剂、氢氧化铝佐剂、维生素E佐剂及其组合。在一个具体实施方案中，佐剂包含油乳剂，该油乳剂包含聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物、角鲨烷、聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯和缓冲盐溶液(SP-油)。在一个实施方案中，该组合物还包含药学上可接受的载体。

在另一个实施方案中，该疫苗组合物还可以包含至少一种额外的抗原。在某些实施方案中，至少一种额外的抗原保护性地抵御可以引起哺乳动物疾病的微生物。

在另一个实施方案中，提供了嵌合核酸分子，其包含编码非致病性狂犬病病毒载体RABV rERAG333E的核酸分子和编码改造的SARS-CoV-2的刺突蛋白(S’)的氨基酸(SEQ IDNO：5)，即改造的SARS-CoV-2的刺突蛋白(S’)的核酸分子在coS的基础上构建了表达coS蛋白基因信号肽替换成tPA，进一步改造的SARS-CoV-2的刺突蛋白(S’)的核酸分子在coS的基础上构建了表达coS蛋白基因信号肽替换成tPA，Furin裂解位点突变缺失和6个脯氨酸突变的SARS-CoV-2S蛋白基因突变体tPASopti6(S6P)(SEQ ID NO：6)

本发明还提供了保护哺乳动物免受新型冠状病毒SARS-CoV-2和狂犬病病毒(RABV)感染的方法。该方法包括向哺乳施用免疫有效量的本发明公开的疫苗组合物、嵌合核酸分子、或病毒载体。在多种实施方案中，该方法包括通过选自经口服、胃肠道外、经鼻、皮内和经皮的一种或多于一种途径向哺乳动物施用疫苗组合物、嵌合核酸分子或病毒载体。在另一个实施方案中，疫苗组合物、嵌合核酸分子或病毒载体以单剂量施用。在另一个实施案中，组合物与至少一种额外的抗原联合施用，该额外的抗原保护性地抵御可以引起哺乳动物疾病的微生物，其实施例如上所述。

附图说明

图1：重组RABV rERAG_333E/coS和rERAG_333E/S6P株的构建及鉴定。(A)重组RABVrERAG_333E/coS和rERAG_333E/S6P株的构建示意图。coS蛋白基因为哺乳动物密码子偏噬性密码子优化的SARS-CoV-2S蛋白基因；S6P蛋白基因为包含组织型纤溶酶原激活因子(Tissueplasminogen activator,tPA)信号肽基因、6个突变位点及furin裂解位点删除突变的SARS-CoV-2S蛋白基因突变体；coS和S6P蛋白基因分别插入至rERAG_333E株全长cDNA的P、M基因间的Pme I位点处。(B)重组RABVs的间接免疫荧光(IFA)鉴定。(C)重组RABVs的SARS-CoV-2S蛋白在感染BSR细胞中的western blot鉴定。(D)重组RABVs在BSR细胞上的生长动力学分析。病毒滴度经过四次平行试验确定，并以lg FFU/mL表示。通过T检验进行重组RABVs和亲本株之间不同时间点病毒滴度的差异性分析，“*”为0.01<P<0.05，。

图2：重组RABV rERAG_333E/coS和rERAG_333E/S6P株的小鼠体内致病力分析。分别将重组RABVs和rERAG_333E的活病毒按5×10⁷PFU/100μL/只的剂量经肌肉(A)、口服(B)途径接种感染6周龄BALB/c小鼠，6只/组，连续监测21天，记录体重变化情况。另设PBS接种组小鼠作为平行对照。

图3：重组RABV rERAG_333E/coS和rERAG_333E/S6P株在小鼠上的免疫原性分析。将重组病毒rERAG_333E/coS、rERAG_333E/S6P和亲本株rERAG_333E分别按5×10⁷PFU/100μL/只的剂量活病毒口服免疫接种(orally)或经β-丙内酯灭活混以入10％的Montanide^TM GEL 02佐剂后按等同于5×10⁷PFU/100μL/只剂量的灭活疫苗肌肉免疫接种(i.m.)6只6周龄BALB/c小鼠；免疫后21天按相同剂量、途径加强免疫。各组小鼠定期采血，免疫前、初次免疫后第21天的组内6只小鼠血清混合、加强免疫后第14天的每只小鼠血清分别用于SARS-CoV-2S蛋白特异性IgG抗体(A)、SARS-CoV-2中和抗体(B)和RABV中和抗体(C)检测。通过T检验进行重组RABVs和亲本株之间抗体水平的差异性分析，“*”为0.01<P<0.05，“**”为0.001<P<0.01，“***”为0.0001<P<0.001,“****”为0.00001<P<0.0001。

图4：重组RABV rERAG_333E/coS和rERAG_333E/S6P株在小鼠上的攻毒保护效力分析。小鼠在经口服(A、C)或灭活肌肉途径(B、D)加强免疫后14天经鼻内途径按10^3.6PFU/50μL/只的剂量接种SARS-CoV-2HRB26M毒株。每组6只小鼠分别在攻毒后3天和5天时处死3只，取鼻甲(Tubinate)和肺(Lung)组织，通过qPCR及细胞蚀斑计数试验检测样品中的病毒载量(A、B)及活病毒数(C、D)。

具体实施方式

虽然下面详细讨论了本发明各种实施方案的进行和使用，但应该理解，本发明提供了许多可以在各种特定情况下使用的可适用的发明概念。这里讨论的具体实施方案仅说明进行和使用本发明的具体方式，并不限制本发明的范围。

S蛋白单体情况下，RBD区存在关闭沉降和上升开放两种状态。RBD的关闭沉降状态覆盖了S2亚基部分氨基酸，削弱S蛋白的免疫原性；RBD上升开放状态则是解离S2亚基，可充分发挥其免疫原性。相较野生型S蛋白，K986P、V987P这两个联合突变可使具有高免疫原性和可移动特性的RBD处于稳定的上升开放状态，提高表达S蛋白的免疫原性(Henderson R,Edwards R J,Mansouri K,Janowska K,Stalls V,Gobeil S M C,Kopp M,Li D,Parks R,Hsu A L,Borgnia M J,Haynes B F,Acharya P.2020.Controlling the SARS-CoV-2spikeglycoprotein conformation.Nature structural&molecular biology,27,925-933.5)；F817P、A892P、A899P、A942P突变则可使S蛋白的表达量增高约10倍，并具有耐热、室温贮藏和3次冻融循环的能力(Hsieh C L,Goldsmith J A,Schaub J M,DiVenere A M,Kuo H C,Javanmardi K,Le K C,Wrapp D,Lee A G,Liu Y,Chou C W,Byrne P O,Hjorth C K,Johnson N V,Ludes-Meyers J,Nguyen A W,Park J,Wang N,Amengor D,Lavinder J J,Ippolito G C,Maynard J A,Finkelstein I J,McLellan J S.2020.Structure-baseddesign of prefusion-stabilized SARS-CoV-2spikes.Science,369,1501-150)；SARS-CoV-2S蛋白基因的Furin裂解位点突变缺失可保留了S’蛋白的预融合构像，不裂解成S1和S2亚基，提高了S’蛋白的抗原性。

本发明通过例举性的实施RABV口服疫苗株rERAG_333E载体平台，通过反向遗传技术构建了分别表达哺乳动物密码子偏噬性密码子优化的SARS-CoV-2S蛋白基因(coS’)和表达含组织型纤溶酶原激活因子(Tissue plasminogen activator,tPA)信号肽基因的coS’蛋白基因突变体tPASopti6(S6P)的重组RABV rERAG_333E-coS’和rERAG_333E-S6P。重组RABVrERAG_333E-coS’和rERAG_333E-S6P均具有与亲本株rERAG_333E相似的细胞培养生长特性和良好的生物安全性；相较rERAG_333E-coS’，rERAG_333E-S6P口服免疫和作为灭活疫苗肌肉免疫BABL/c小鼠不仅保持了rERAG_333E株良好的RABV免疫原性，还可诱导更高水平的SARS-CoV-2抗S蛋白特异性IgG抗体和中和抗体反应，并且可实现SARS-CoV-2小鼠适应株在小鼠上呼吸道和肺部的攻毒完全保护，表明重组RABV rERAG_333E-S6P株能够用于新冠肺炎与狂犬病动物用口服二联疫苗和人用灭活二联疫苗。

以狂犬病毒为载体，可同时对狂犬病毒进行免疫，对狂犬病毒的易感宿主人、动物均可实现免疫功能。

为了便于理解本发明，下面定义了许多术语。本发明定义的术语具有本发明相关领域中普通技术人员通常理解的含义。

如本发明所用术语“包含”、“包括”、“含有”旨在表示组合物和方法包括所列举的要素，但不排除其他要素。

术语“抗原”是指可以在动物中刺激抗体或T细胞应答或两者的产生的化合物、组合物或免疫原性物质，其包括口服、注射或吸收到动物体内的组合物。可以对整个分子或分子的一部分(例如表位或半抗原)产生免疫应答。

如本发明所定义的，“免疫原性组合物或免疫组合物”是指包含至少一种抗原的物质的组合物，该抗原在宿主中引发对感兴趣的组合物或疫苗的细胞的免疫应答和/或抗体介导的免疫应答。

本发明所用的“佐剂”是指由一种或多于一种增强对抗原的免疫应答的物质组成的组合物。佐剂如何起作用的机制尚不完全清楚。一些佐剂被认为通过缓慢释放抗原来增强免疫应答，而其他佐剂本身具有强免疫原性并被认为起到协同作用。

本发明所用的术语“哺乳动物”是指包括人、及对狂犬病毒和新冠病毒病毒的哺乳动物，例如人、蝙蝠、狮子、老虎、恒河猴、食蟹猴、水貂、雪貂、猫、狗等。

如本文所用术语“药学上可接受的载体”是指用于包含可以口服或注射到宿主中且没有副作用的疫苗抗原的流体载体。本领域已知的合适的药学上可接受的载体包括但不限于无菌水、盐水、葡萄糖、右旋糖或缓冲溶液等。载体可包括助剂包括但不限于稀释剂、稳定剂(糖和氨基酸)、防腐剂、润湿剂、乳化剂、pH缓冲剂、黏度增强添加剂、着色剂等。

如本文所用术语“疫苗组合物”包括在药学上可接受的载体中的至少一种抗原或免疫原，其可用于在宿主中诱导免疫应答。疫苗组合物可以按剂量施用并通过医学或兽医领域技术人员熟知的技术施用，同时考虑例如接受体动物的年龄、性别、体重、物种和状况、以及给药途径等因素。给药途径可以是经皮(通过皮内、经皮、皮下、肌内途径而穿过皮肤或通过口腔、鼻腔、肛门、阴道而穿过黏膜)或通过肠胃外途径(静脉内或腹膜内)。疫苗组合物可以单独施用，或者可以与其他治疗或疗法共同施用或按顺序施用。给药形式可包括混悬剂、糖浆剂或酏剂，以及用于肠胃外、皮下、皮内、肌内或静脉内给药(例如注射给药)的制剂，例如无菌混悬剂或乳剂。疫苗组合物可以以喷雾形式给药或混合于食物和/或水中或与合适的载体、稀释剂、或赋形剂如无菌水、生理盐水、葡萄糖等混合递送。该组合物可含有辅助物质，如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂、佐剂、凝胶化或黏度增强添加剂、防腐剂、调味剂、着色剂等，这取决于给药途径和所需制剂。

为了公开的完整性，包括了以下实施例以说明制备本发明组合物和复合物的方法以及呈现组合物的某些特征。这些实施例决不旨在限制本公开的范围或教导。

实施例1：材料与方法

1.1细胞、重组质粒、病毒株、主要试剂及仪器

BSR细胞、rERAG_333E株全长cDNA质粒pCI-rERAG_333E及辅助核蛋白pCI-ERAN、磷蛋白pCI-ERAP和聚合酶大蛋白pCI-ERAL均由本实验室保存。弱毒疫苗株rERAG_333E株由本实验室拯救并保存。SARS-CoV-2鼠适应株HRB26M株由本实验室分离、适应并保存。Phanta高保真DNA聚合酶、One Step Cloning Kit购自Vazyme；限制性内切酶Pme I购自NEB公司；质粒提取试剂盒购自QIAGEN公司；胎牛血清、DMEM培养基购自Gibco公司；磷酸钙转染试剂盒、RNA提取试剂TRIzol及鼠源反转录酶(M-MLV)试剂盒均购自Invitrogen；小鼠抗SARS-CoV-2S蛋白多克隆抗体、犬抗RABV多克隆抗体由本实验室制备和保存；FITC标记的兔抗犬IgG和TRITC标记的山羊抗鼠IgG抗体、hoechst 33342染料购自Abcam；共聚焦激光扫描显微镜为ZEISS公司产品。

1.2质粒构建

根据合成基因Sopti和tPASopti6P序列信息，利用引物将coS和S6P基因分别引入rERAG_333E株全长cDNA的P、M基因间的Pme I位点处(表1)。采用PCR方法，以pBlue-Sopti为模板，用引物EcoSF和EcoSR扩增coS蛋白基因；以pBlue-tPASopti6P为模板，用引物ES6PF和EcoSR扩增S6P、S6PG蛋白基因。rERAG_333E株全长cDNA质粒pCI-rERAG_333E经过限制性内切酶Pme I处理线性化得到全长线性片段pCI-rERAG_333E。利用One Step Cloning Kit将片段coS、S6P分别经过一步克隆至pCI-rERAG_333E的Pme I位点处，获得重组全长cDNA质粒pCI-rERAG_333E/coS、pCI-rERAG_333E/S6P(图1A)。

表1表达SARS-CoV-2 coS和S6P基因重组rERAG_333E全基因组质粒所用引物

1.3重组RABVs的拯救

采用磷酸钙转染法将5μg pCI-rERAG_333E/coS、pCI-rERAG_333E/S6P分别与一套RABV拯救辅助质粒系统(2.5μg pCI-ERAN，1.25μg pCI-ERAP和1.25μg pCI-ERAL)共转染至6孔板中汇合度约80％的BSR细胞中，4天后收集细胞孔内上清液，并通过在BSR细胞上继续盲传3代以提高病毒滴度。将待鉴定的F3代重组病毒保存至-70℃，并命名为rERAG_333E/coS和rERAG_333E/S6P。

1.4重组RABVs的间接免疫荧光(IFA)检测

将rERAG_333E和F3代重组RABVs按多重感染复数(MOI)约0.1感染BSR细胞。接种细胞37℃培养48h后3％多聚甲醛固定20min，以抗RABV犬血清和抗SARS-CoV-2S蛋白小鼠血清为一抗，以绿色荧光素(FITC)标记的兔抗犬IgG和TRITC标记的山羊抗鼠IgG为二抗，进行荧光染色。以hoechst 33342对细胞进行染核处理。使用激光共聚焦显微镜对染色的细胞单层进行观察并拍照。

1.5重组RABVs的RT-PCR鉴定

采用TRIzol法提取F3代重组RABVs基因组RNA。根据RABV疫苗株ERA全基因序列(EF206707.1)，设计一对引物NXF(5'-GATCCTCAGGGATACTCTTG-3')和NXR(5'-AGCCACAAGTCATCGTCATC-3')，进行RT-PCR扩增，对扩增的PCR产物进行测序分析。

1.6重组RABVs的SARS-CoV-2S蛋白在感染细胞中的表达鉴定

将rERAG_333E/coS和rERAG_333E/S6P和亲本株rERAG_333E分别以多重感染复数(MOI)为0.5的剂量感染于汇合度约80％的BSR细胞，感染48h后收集细胞，经细胞裂解液裂解后进行SDS-PAGE电泳并将蛋白转印至NC膜，5％脱脂乳封闭过夜。利用鼠抗SARS-CoV-2S蛋白小鼠血清为一抗，Alexa Fluor 680标记的驴抗小鼠IgG为二抗，进行western blot鉴定。同时设置空白细胞作为平行试验对照。

1.7重组RABVs的体外生长动力学曲线的测定

将rERAG_333E/coS和rERAG_333E/S6P和亲本株rERAG_333E分别以多重感染复数(MOI)为0.01的剂量感染于汇合度约80％的BSR细胞，37℃孵育1小时后，用PBS(pH7.4)洗涤细胞两次，然后加入维持液，置于37℃含5％CO₂的培养箱。分别于接毒24h、48h、72h、96h、120h、144h后收获含病毒的上清液，均在BSR细胞上进行滴定，以此绘制病毒在不同细胞上的生长动力学曲线。

1.8实验动物及动物实验

6周龄雌性BALB/c小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司(Vital River)。小鼠实验严格按照“实验动物护理和使用指南”中的建议开展，并经中国农业科学院哈尔滨兽医研究所(HVRI，CAAS)动物护理和伦理委员会(IACEC)机构批准。所有小鼠的SARS-CoV-2接种实验均在国家动物疫病防控高级别生物安全实验室四级实验室(BSL-4)中进行。

1.9重组RABVs在BALB/c小鼠上的的致病力分析

为了评估重组RABVs作为新冠肺炎候选口服疫苗和灭活注射用疫苗的安全性，分别将重组RABVs和rERAG_333E的活病毒按5×10⁷PFU/100μL/只的剂量分别肌肉、口服接种6周龄BALB/c小鼠，6只/组；同时，用PBS按100μL/只的剂量分别肌肉、口服接种6只小鼠，作为对照进行平行试验。记录感染后每天各组小鼠的体重及临床发病情况，持续21天。

1.10重组RABVs在BALB/c小鼠上的免疫原性评价

为了评估重组病毒rERAG_333E/coS、rERAG_333E/S6P和亲本株rERAG_333E分别按5×10⁷PFU/100μL/只的剂量活病毒口服免疫接种6只6周龄BALB/c小鼠小鼠；同时，将重组RABVs和rERAG_333E经β-丙内酯灭活后加入10％的Montanide^TM GEL02(SEPPIC)佐剂，混匀后分别按等同于5×10⁷PFU/100μL/只剂量的灭活疫苗i.m.免疫接种6只小鼠；免疫后21天按相同剂量、途径加强免疫。各组小鼠于免疫前、初次免疫后第21天和加强免疫后第14天经眶下静脉丛采血，分离血清，在56℃水浴灭活30min，免疫前、初次免疫后第21天的组内6只小鼠血清混合、加强免疫后第14天的每只小鼠血清分别用于SARS-CoV-2S蛋白特异性IgG抗体、中和抗体和RABV中和抗体检测。

1.10重组RABVs在BALB/c小鼠上的攻毒保护效力评价

上述各组免疫小鼠在加强免疫后第14天时经鼻内途径按10^3.6PFU/50μL/只的剂量接种SARS-CoV-2HRB26M毒株。每组6只小鼠分别在攻毒后3天和5天时随机被处死3只，通过qPCR及细胞蚀斑计数试验检测鼻甲和肺内的病毒载量及活病毒数。

实施例2：实验结果

2.1重组RABV的拯救与鉴定

在RABV疫苗株rERAG_333E反向遗传操作系统基础上，利用PCR法将哺乳动物密码子偏噬性密码子优化的SARS-CoV-2S蛋白基因(coS)和SARS-CoV-2S蛋白基因高效表达且空间结构稳定的突变体tPASopti6(S6P)分别克隆至pCI-rERAG_333E的Pme I位点。经测序鉴定后成功构建pCI-rERAG_333E/coS和pCI-rERAG_333E/S6P，并用于拯救rERAG_333E/coS和rERAG_333E/S6P毒株(图1A)。

为鉴定重组RABV rERAG_333E/coS和rERAG_333E/S6P的SARS-CoV-2S蛋白基因在细胞内的表达，将rERA-N/mCherry感染BSR细胞，采用IFA的方法染色，然后通过共聚焦激光扫描显微镜观察。结果显示，两株重组RABVs均呈现SARS-CoV-2S蛋白和RABV G蛋白的共表达，rERAG_333E仅呈现针对RABV G蛋白抗体的阳性结果(图1B)。结果表明，重组RABVs的SARS-CoV-2S蛋白均有效表达，并且具有RABV相应的生物学活性。

为了进一步鉴定重组RABVs的SARS-CoV-2S蛋白的正确表达，分别将重组RABVs和rERAG_333E感染的BSR细胞和空白对照BSR细胞制备裂解液，进行Western blot分析。结果显示，以SARS-CoV-2S蛋白小鼠血清为一抗进行WB检测，rERAG_333E/coS、rERAG_333E/S6P接种的细胞样品出现特异性条带与相应外源蛋白预期大小相符；而rERAG_333E感染的BSR细胞和空白对照BSR细胞样品无特异条带(图1C)。结果表明，coS、S6P蛋白能在重组RABVs感染细胞中正确表达，并具有良好的反应原性。

为了比较重组RABVs和rERAG_333E在BSR细胞上的生长动力学特点，将重组RABVs和rERAG_333E分别按MOI为0.01的剂量感染BSR细胞后定时取样滴定病毒滴度。结果显示，在病毒感染BSR后48～120h间重组RABVs的滴度均显著低于亲本株的滴度；在感染后96h重组RABVs和rERAG_333E滴度均达到的峰值，其中重组RABVs最高生长滴度为10^7.68～10^7.77FFU/mL，rERAG_333E最高生长滴度为10^8.15FFU/mL(图1D)。结果表明，SARS-CoV-2S蛋白基因的插入不影响重组RABVs的体外生长性状，但降低了重组RABVs的体外增殖效率。

2.2SARS-CoV-2S蛋白基因的插入不影响RABV载体对小鼠的致病力

为了评估重组RABVs作为新冠肺炎候选口服疫苗和灭活注射用疫苗的安全性，分别将重组RABVs和rERAG_333E的活病毒按5×10⁷PFU/100μL/只的剂量分别肌肉、口服接种6周龄BALB/c小鼠。结果显示，重组RABVs和rERAG_333Ei.m.接种(图2A)或口服接种(图2B)后的全部成年小鼠均未发生任何疾病或死亡情况，各组间成年小鼠的体重均平稳增长且无显著差异。结果表明，coS和S6P基因的插入未增加rERAG_333E的致病力与亲本株相似，重组RABVs肌肉和口服接种对小鼠均无致病力。

2.3rERAG_333E/S6P口服或灭活免疫小鼠均能诱导SARS-CoV-2和RABV中和抗体反应

为了评估重组RABVs作为新冠肺炎候选口服疫苗和灭活注射用疫苗的免疫原性，分别将重组RABVs和rERAG_333E的活病毒按5×10⁷PFU/100μL/只的剂量口服免疫6周龄BALB/c小鼠，或β-丙内酯灭活、混以10％的Montanide^TM GEL 02佐剂后分别按等同于5×10⁷PFU/100μL/只剂量的灭活疫苗肌肉免疫6周龄BALB/c小鼠。

活病毒口服免疫结果显示，rERAG_333E/S6P免疫组小鼠在初次免疫后21天均产生低水平抗S蛋白特异性IgG抗体(图3A)和中和抗体(图3B)，而rERAG_333E/coS和rERAG_333E免疫组均未检测到；rERAG_333E/S6P免疫组小鼠加强免疫后14天均产生增强的抗S蛋白特异性IgG抗体和中和抗体反应，中和抗体滴度均介于32至256，显著高于rERAG_333E/coS和rERAG_333E免疫组；重组RABVs和rERAG_333E免疫组小鼠初免后21天均产生RABV中和抗体，加强免疫后均显著增高中和抗体水平，平均滴度为5.09～6.23IU/mL，且重组RABVs与亲本株之间及重组RABVs之间均无显著性差异(图3C)。以上结果表明，rERAG_333E/S6PG在小鼠上具有良好的SARS-CoV-2和RABV口服免疫原性。

病毒灭活肌肉免疫结果显示，重组RABVs免疫组小鼠在初次免疫后21天均产生抗S蛋白特异性IgG抗体(图3A)和中和抗体(图3B)，而亲本株rERAG_333E免疫组未检测到；rERAG_333E/S6P免疫组小鼠加强免疫后14天均产生高水平的抗S蛋白特异性IgG抗体和中和抗体反应，中和抗体滴度均介于256至2048，显著高于rERAG_333E/coS和rERAG_333E免疫组；重组RABVs和亲本株免疫组小鼠初免后21天均产生RABV中和抗体，加强免疫后均显著增高中和抗体水平，平均滴度为12.31～14.45IU/mL，且重组RABVs与亲本株和重组RABVs之间均无显著性差异(图3C)。以上结果表明，rERAG_333E/S6P灭活免疫小鼠具有良好的SARS-CoV-2和RABV免疫原性。

2.4rERAG_333E/S6P口服或灭活免疫小鼠能提供完全的SARS-CoV-2攻毒保护效力

上述各组免疫小鼠在加强免疫后第14天时经鼻内途径按10^3.6PFU/50μL/只的剂量接种SARS-CoV-2HRB26M毒株。活病毒口服免疫攻毒结果显示，rERAG_333E/S6P免疫组所有小鼠(3/3)在攻毒后第3天和第5天鼻甲和肺均未检测到病毒载量(图4A)和活病毒(图4C)；rERAG_333E/coS免疫组第3天和第5天鼻甲检测到病毒载量均值为8.41、6.32log(copies/g)的病毒载量，肺检测到病毒载量均值为8.30、3.84log(copies/g)的病毒载量，均显著高于rERAG_333E/S6P各组织、时间点的病毒载量(图4A)，同时在第3天部分鼻甲(2/3)和肺(1/3)检测到活病毒，均值为2.98、2.59log(PFU/g)(图4C)；亲本株rERAG_333E免疫组所有小鼠(3/3)在攻毒后第3天和第5天鼻甲检测到病毒载量均值为8.93、7.71log(copies/g)的病毒载量，肺检测到病毒载量均值为10.07、8.15log(copies/g)的病毒载量，均显著高于rERAG_333E/S6P各组织、时间点的病毒载量(图4A)，并且所有小鼠(3/3)在攻毒后第3天和第5天鼻甲检测到均值为4.58、3.69log(PFU/g)的活病毒量，肺检测到均值为6.22、3.91log(PFU/g)的病毒载量，均显著高于rERAG_333E/S6P免疫小鼠各组织、时间点的病毒载量(图4C)。结果表明，rERAG_333E/S6P在小鼠上具有完全的口服免疫SARS-CoV-2攻毒保护效力，有潜力作为动物新冠肺炎口服疫苗。

病毒灭活肌肉免疫攻毒结果显示，rERAG_333E/S6P免疫组所有小鼠(3/3和3/3)在攻毒后第3天和第5天鼻甲和肺均未检测到病毒载量(图4B)和活病毒(图4D)；rERAG_333E/coS免疫组第3天和第5天鼻甲检测到病毒载量均值为7.11、4.09log(copies/g)的病毒载量，肺均未检测到病毒载量(图4B)，同时在第3天部分鼻甲(2/3)检测到活病毒，均值为2.39(PFU/g)(图4D)；亲本株rERAG_333E免疫组所有小鼠(3/3)在攻毒后第3天和第5天鼻甲检测到病毒载量均值为9.06、8.02log(copies/g)的病毒载量，肺检测到病毒载量均值为9.16、7.16log(copies/g)的病毒载量，均显著高于重组RABVs免疫小鼠各组织、时间点的病毒载量(图4B)，并且所有小鼠(3/3)在攻毒后第3天和第5天鼻甲检测到均值为4.41、3.39log(PFU/g)的活病毒量，肺检测到均值为5.97、3.75log(PFU/g)的病毒载量，均显著高于重组RABVs免疫小鼠各组织、时间点的病毒载量(图4C)。结果表明，rERAG_333E/S6P灭活免疫小鼠具有完全的攻毒保护效力。

序列表

<110> 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所(中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心)

<120> 新冠肺炎重组狂犬病病毒载体疫苗

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 3852

<212> DNA

<213> S’-TP-1(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 1

atggacgcca tgaagcgcgg cctgtgctgc gtgctgctgc tgtgcggcgc cgtgttcgtg 60

tccgcccgcc agtgcgtgaa cctgaccacc cgcacccagc tgccccccgc ctacaccaac 120

tccttcaccc gcggcgtgta ctaccccgac aaggtgttcc gctcctccgt gctgcactcc 180

acccaggacc tgttcctgcc cttcttctcc aacgtgacct ggttccacgc catccacgtg 240

tccggcacca acggcaccaa gcgcttcgac aaccccgtgc tgcccttcaa cgacggcgtg 300

tacttcgcct ccaccgagaa gtccaacatc atccgcggct ggatcttcgg caccaccctg 360

gactccaaga cccagtccct gctgatcgtg aacaacgcca ccaacgtggt gatcaaggtg 420

tgcgagttcc agttctgcaa cgaccccttc ctgggcgtgt actaccacaa gaacaacaag 480

tcctggatgg agtccgagtt ccgcgtgtac tcctccgcca acaactgcac cttcgagtac 540

gtgtcccagc ccttcctgat ggacctggag ggcaagcagg gcaacttcaa gaacctgcgc 600

gagttcgtgt tcaagaacat cgacggctac ttcaagatct actccaagca cacccccatc 660

aacctggtgc gcgacctgcc ccagggcttc tccgccctgg agcccctggt ggacctgccc 720

atcggcatca acatcacccg cttccagacc ctgctggccc tgcaccgctc ctacctgacc 780

cccggcgact cctcctccgg ctggaccgcc ggcgccgccg cctactacgt gggctacctg 840

cagccccgca ccttcctgct gaagtacaac gagaacggca ccatcaccga cgccgtggac 900

tgcgccctgg accccctgtc cgagaccaag tgcaccctga agtccttcac cgtggagaag 960

ggcatctacc agacctccaa cttccgcgtg cagcccaccg agtccatcgt gcgcttcccc 1020

aacatcacca acctgtgccc cttcggcgag gtgttcaacg ccacccgctt cgcctccgtg 1080

tacgcctgga accgcaagcg catctccaac tgcgtggccg actactccgt gctgtacaac 1140

tccgcctcct tctccacctt caagtgctac ggcgtgtccc ccaccaagct gaacgacctg 1200

tgcttcacca acgtgtacgc cgactccttc gtgatccgcg gcgacgaggt gcgccagatc 1260

gcccccggcc agaccggcaa gatcgccgac tacaactaca agctgcccga cgacttcacc 1320

ggctgcgtga tcgcctggaa ctccaacaac ctggactcca aggtgggcgg caactacaac 1380

tacctgtacc gcctgttccg caagtccaac ctgaagccct tcgagcgcga catctccacc 1440

gagatctacc aggccggctc caccccctgc aacggcgtgg agggcttcaa ctgctacttc 1500

cccctgcagt cctacggctt ccagcccacc aacggcgtgg gctaccagcc ctaccgcgtg 1560

gtggtgctgt ccttcgagct gctgcacgcc cccgccaccg tgtgcggccc caagaagtcc 1620

accaacctgg tgaagaacaa gtgcgtgaac ttcaacttca acggcctgac cggcaccggc 1680

gtgctgaccg agtccaacaa gaagttcctg cccttccagc agttcggccg cgacatcgcc 1740

gacaccaccg acgccgtgcg cgacccccag accctggaga tcctggacat caccccctgc 1800

tccttcggcg gcgtgtccgt gatcaccccc ggcaccaaca cctccaacca ggtggccgtg 1860

ctgtaccagg acgtgaactg caccgaggtg cccgtggcca tccacgccga ccagctgacc 1920

cccacctggc gcgtgtactc caccggctcc aacgtgttcc agacccgcgc cggctgcctg 1980

atcggcgccg agcacgtgaa caactcctac gagtgcgaca tccccatcgg cgccggcatc 2040

tgcgcctcct accagaccca gaccaactcc ccccgccgcg cccgctccgt ggcctcccag 2100

tccatcatcg cctacaccat gtccctgggc gccgagaact ccgtggccta ctccaacaac 2160

tccatcgcca tccccaccaa cttcaccatc tccgtgacca ccgagatcct gcccgtgtcc 2220

atgaccaaga cctccgtgga ctgcaccatg tacatctgcg gcgactccac cgagtgctcc 2280

aacctgctgc tgcagtacgg ctccttctgc acccagctga accgcgccct gaccggcatc 2340

gccgtggagc aggacaagaa cacccaggag gtgttcgccc aggtgaagca gatctacaag 2400

acccccccca tcaaggactt cggcggcttc aacttctccc agatcctgcc cgacccctcc 2460

aagccctcca agcgctcctt catcgaggac ctgctgttca acaaggtgac cctggccgac 2520

gccggcttca tcaagcagta cggcgactgc ctgggcgaca tcgccgcccg cgacctgatc 2580

tgcgcccaga agttcaacgg cctgaccgtg ctgccccccc tgctgaccga cgagatgatc 2640

gcccagtaca cctccgccct gctggccggc accatcacct ccggctggac cttcggcgcc 2700

ggcgccgccc tgcagatccc cttcgccatg cagatggcct accgcttcaa cggcatcggc 2760

gtgacccaga acgtgctgta cgagaaccag aagctgatcg ccaaccagtt caactccgcc 2820

atcggcaaga tccaggactc cctgtcctcc accgcctccg ccctgggcaa gctgcaggac 2880

gtggtgaacc agaacgccca ggccctgaac accctggtga agcagctgtc ctccaacttc 2940

ggcgccatct cctccgtgct gaacgacatc ctgtcccgcc tggacaaggt ggaggccgag 3000

gtgcagatcg accgcctgat caccggccgc ctgcagtccc tgcagaccta cgtgacccag 3060

cagctgatcc gcgccgccga gatccgcgcc tccgccaacc tggccgccac caagatgtcc 3120

gagtgcgtgc tgggccagtc caagcgcgtg gacttctgcg gcaagggcta ccacctgatg 3180

tccttccccc agtccgcccc ccacggcgtg gtgttcctgc acgtgaccta cgtgcccgcc 3240

caggagaaga acttcaccac cgcccccgcc atctgccacg acggcaaggc ccacttcccc 3300

cgcgagggcg tgttcgtgtc caacggcacc cactggttcg tgacccagcg caacttctac 3360

gagccccaga tcatcaccac cgacaacacc ttcgtgtccg gcaactgcga cgtggtgatc 3420

ggcatcgtga acaacaccgt gtacgacccc ctgcagcccg agctggactc cttcaaggag 3480

gagctggaca agtacttcaa gaaccacacc tcccccgacg tggacctggg cgacatctcc 3540

ggcatcaacg cctccgtggt gaacatccag aaggagatcg accgcctgaa cgaggtggcc 3600

aagaacctga acgagtccct gatcgacctg caggagctgg gcaagtacga gcagtacatc 3660

aagtggccct ggtacatctg gctgggcttc atcgccggcc tgatcgccat cgtgatggtg 3720

accatcatgc tgtgctgcat gacctcctgc tgctcctgcc tgaagggctg ctgctcctgc 3780

ggctcctgct gcaagttcga cgaggacgac tccgagcccg tgctgaaggg cgtgaagctg 3840

cactacacct aa 3852

<210> 2

<211> 1283

<212> PRT

<213> SARS-CoV-2 S蛋白基因突变体tPASopti6(2 Ambystoma laterale xAmbystoma jeffersonianum)

<400> 2

Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly

1 5 10 15

Ala Val Phe Val Ser Ala Arg Gln Cys Val Asn Leu Thr Thr Arg Thr

20 25 30

Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser Phe Thr Arg Gly Val Tyr Tyr

35 40 45

Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser Ser Val Leu His Ser Thr Gln Asp Leu

50 55 60

Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn Val Thr Trp Phe His Ala Ile His Val

65 70 75 80

Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe Asp Asn Pro Val Leu Pro Phe

85 90 95

Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala Ser Thr Glu Lys Ser Asn Ile Ile Arg

100 105 110

Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr Leu Asp Ser Lys Thr Gln Ser Leu Leu

115 120 125

Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val Ile Lys Val Cys Glu Phe Gln

130 135 140

Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val Tyr Tyr His Lys Asn Asn Lys

145 150 155 160

Ser Trp Met Glu Ser Glu Phe Arg Val Tyr Ser Ser Ala Asn Asn Cys

165 170 175

Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe Leu Met Asp Leu Glu Gly Lys

180 185 190

Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu Arg Glu Phe Val Phe Lys Asn Ile Asp

195 200 205

Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser Lys His Thr Pro Ile Asn Leu Val Arg

210 215 220

Asp Leu Pro Gln Gly Phe Ser Ala Leu Glu Pro Leu Val Asp Leu Pro

225 230 235 240

Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg Phe Gln Thr Leu Leu Ala Leu His Arg

245 250 255

Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser Ser Gly Trp Thr Ala Gly Ala

260 265 270

Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu Gln Pro Arg Thr Phe Leu Leu Lys

275 280 285

Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp Ala Val Asp Cys Ala Leu Asp

290 295 300

Pro Leu Ser Glu Thr Lys Cys Thr Leu Lys Ser Phe Thr Val Glu Lys

305 310 315 320

Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile

325 330 335

Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe

340 345 350

Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile

355 360 365

Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe

370 375 380

Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu

385 390 395 400

Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu

405 410 415

Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn

420 425 430

Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser

435 440 445

Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg

450 455 460

Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr

465 470 475 480

Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe

485 490 495

Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly

500 505 510

Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu

515 520 525

His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val

530 535 540

Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn Gly Leu Thr Gly Thr Gly

545 550 555 560

Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe Leu Pro Phe Gln Gln Phe Gly

565 570 575

Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp Ala Val Arg Asp Pro Gln Thr Leu

580 585 590

Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys Ser Phe Gly Gly Val Ser Val Ile

595 600 605

Thr Pro Gly Thr Asn Thr Ser Asn Gln Val Ala Val Leu Tyr Gln Asp

610 615 620

Val Asn Cys Thr Glu Val Pro Val Ala Ile His Ala Asp Gln Leu Thr

625 630 635 640

Pro Thr Trp Arg Val Tyr Ser Thr Gly Ser Asn Val Phe Gln Thr Arg

645 650 655

Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu His Val Asn Asn Ser Tyr Glu Cys

660 665 670

Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile Cys Ala Ser Tyr Gln Thr Gln Thr

675 680 685

Asn Ser Pro Gly Ser Ala Ser Ser Val Ala Ser Gln Ser Ile Ile Ala

690 695 700

Tyr Thr Met Ser Leu Gly Ala Glu Asn Ser Val Ala Tyr Ser Asn Asn

705 710 715 720

Ser Ile Ala Ile Pro Thr Asn Phe Thr Ile Ser Val Thr Thr Glu Ile

725 730 735

Leu Pro Val Ser Met Thr Lys Thr Ser Val Asp Cys Thr Met Tyr Ile

740 745 750

Cys Gly Asp Ser Thr Glu Cys Ser Asn Leu Leu Leu Gln Tyr Gly Ser

755 760 765

Phe Cys Thr Gln Leu Asn Arg Ala Leu Thr Gly Ile Ala Val Glu Gln

770 775 780

Asp Lys Asn Thr Gln Glu Val Phe Ala Gln Val Lys Gln Ile Tyr Lys

785 790 795 800

Thr Pro Pro Ile Lys Asp Phe Gly Gly Phe Asn Phe Ser Gln Ile Leu

805 810 815

Pro Asp Pro Ser Lys Pro Ser Lys Arg Ser Phe Ile Glu Asp Leu Leu

820 825 830

Phe Asn Lys Val Thr Leu Ala Asp Ala Gly Phe Ile Lys Gln Tyr Gly

835 840 845

Asp Cys Leu Gly Asp Ile Ala Ala Arg Asp Leu Ile Cys Ala Gln Lys

850 855 860

Phe Asn Gly Leu Thr Val Leu Pro Pro Leu Leu Thr Asp Glu Met Ile

865 870 875 880

Ala Gln Tyr Thr Ser Ala Leu Leu Ala Gly Thr Ile Thr Ser Gly Trp

885 890 895

Thr Phe Gly Ala Gly Ala Ala Leu Gln Ile Pro Phe Ala Met Gln Met

900 905 910

Ala Tyr Arg Phe Asn Gly Ile Gly Val Thr Gln Asn Val Leu Tyr Glu

915 920 925

Asn Gln Lys Leu Ile Ala Asn Gln Phe Asn Ser Ala Ile Gly Lys Ile

930 935 940

Gln Asp Ser Leu Ser Ser Thr Ala Ser Ala Leu Gly Lys Leu Gln Asp

945 950 955 960

Val Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu Asn Thr Leu Val Lys Gln Leu

965 970 975

Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile Ser Ser Val Leu Asn Asp Ile Leu Ser

980 985 990

Arg Leu Asp Lys Val Glu Ala Glu Val Gln Ile Asp Arg Leu Ile Thr

995 1000 1005

Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln Thr Tyr Val Thr Gln Gln Leu Ile Arg

1010 1015 1020

Ala Ala Glu Ile Arg Ala Ser Ala Asn Leu Ala Ala Thr Lys Met Ser

1025 1030 1035 1040

Glu Cys Val Leu Gly Gln Ser Lys Arg Val Asp Phe Cys Gly Lys Gly

1045 1050 1055

Tyr His Leu Met Ser Phe Pro Gln Ser Ala Pro His Gly Val Val Phe

1060 1065 1070

Leu His Val Thr Tyr Val Pro Ala Gln Glu Lys Asn Phe Thr Thr Ala

1075 1080 1085

Pro Ala Ile Cys His Asp Gly Lys Ala His Phe Pro Arg Glu Gly Val

1090 1095 1100

Phe Val Ser Asn Gly Thr His Trp Phe Val Thr Gln Arg Asn Phe Tyr

1105 1110 1115 1120

Glu Pro Gln Ile Ile Thr Thr Asp Asn Thr Phe Val Ser Gly Asn Cys

1125 1130 1135

Asp Val Val Ile Gly Ile Val Asn Asn Thr Val Tyr Asp Pro Leu Gln

1140 1145 1150

Pro Glu Leu Asp Ser Phe Lys Glu Glu Leu Asp Lys Tyr Phe Lys Asn

1155 1160 1165

His Thr Ser Pro Asp Val Asp Leu Gly Asp Ile Ser Gly Ile Asn Ala

1170 1175 1180

Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp Arg Leu Asn Glu Val Ala

1185 1190 1195 1200

Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu Gln Glu Leu Gly Lys Tyr

1205 1210 1215

Glu Gln Tyr Ile Lys Trp Pro Trp Tyr Ile Trp Leu Gly Phe Ile Ala

1220 1225 1230

Gly Leu Ile Ala Ile Val Met Val Thr Ile Met Leu Cys Cys Met Thr

1235 1240 1245

Ser Cys Cys Ser Cys Leu Lys Gly Cys Cys Ser Cys Gly Ser Cys Cys

1250 1255 1260

Lys Phe Asp Glu Asp Asp Ser Glu Pro Val Leu Lys Gly Val Lys Leu

1265 1270 1275 1280

His Tyr Thr

<210> 3

<211> 1283

<212> PRT

<213> 改造的SARS-CoV-2的刺突蛋白(2 Ambystoma laterale x Ambystomajeffersonianum)

<400> 3

Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly

1 5 10 15

Ala Val Phe Val Ser Ala Arg Gln Cys Val Asn Leu Thr Thr Arg Thr

20 25 30

Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser Phe Thr Arg Gly Val Tyr Tyr

35 40 45

Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser Ser Val Leu His Ser Thr Gln Asp Leu

50 55 60

Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn Val Thr Trp Phe His Ala Ile His Val

65 70 75 80

Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe Asp Asn Pro Val Leu Pro Phe

85 90 95

Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala Ser Thr Glu Lys Ser Asn Ile Ile Arg

100 105 110

Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr Leu Asp Ser Lys Thr Gln Ser Leu Leu

115 120 125

Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val Ile Lys Val Cys Glu Phe Gln

130 135 140

Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val Tyr Tyr His Lys Asn Asn Lys

145 150 155 160

Ser Trp Met Glu Ser Glu Phe Arg Val Tyr Ser Ser Ala Asn Asn Cys

165 170 175

Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe Leu Met Asp Leu Glu Gly Lys

180 185 190

Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu Arg Glu Phe Val Phe Lys Asn Ile Asp

195 200 205

Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser Lys His Thr Pro Ile Asn Leu Val Arg

210 215 220

Asp Leu Pro Gln Gly Phe Ser Ala Leu Glu Pro Leu Val Asp Leu Pro

225 230 235 240

Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg Phe Gln Thr Leu Leu Ala Leu His Arg

245 250 255

Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser Ser Gly Trp Thr Ala Gly Ala

260 265 270

Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu Gln Pro Arg Thr Phe Leu Leu Lys

275 280 285

Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp Ala Val Asp Cys Ala Leu Asp

290 295 300

Pro Leu Ser Glu Thr Lys Cys Thr Leu Lys Ser Phe Thr Val Glu Lys

305 310 315 320

Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile

325 330 335

Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe

340 345 350

Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile

355 360 365

Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe

370 375 380

Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu

385 390 395 400

Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu

405 410 415

Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn

420 425 430

Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser

435 440 445

Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg

450 455 460

Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr

465 470 475 480

Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe

485 490 495

Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly

500 505 510

Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu

515 520 525

His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val

530 535 540

Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn Gly Leu Thr Gly Thr Gly

545 550 555 560

Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe Leu Pro Phe Gln Gln Phe Gly

565 570 575

Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp Ala Val Arg Asp Pro Gln Thr Leu

580 585 590

Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys Ser Phe Gly Gly Val Ser Val Ile

595 600 605

Thr Pro Gly Thr Asn Thr Ser Asn Gln Val Ala Val Leu Tyr Gln Asp

610 615 620

Val Asn Cys Thr Glu Val Pro Val Ala Ile His Ala Asp Gln Leu Thr

625 630 635 640

Pro Thr Trp Arg Val Tyr Ser Thr Gly Ser Asn Val Phe Gln Thr Arg

645 650 655

Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu His Val Asn Asn Ser Tyr Glu Cys

660 665 670

Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile Cys Ala Ser Tyr Gln Thr Gln Thr

675 680 685

Asn Ser Pro Arg Arg Ala Arg Ser Val Ala Ser Gln Ser Ile Ile Ala

690 695 700

Tyr Thr Met Ser Leu Gly Ala Glu Asn Ser Val Ala Tyr Ser Asn Asn

705 710 715 720

Ser Ile Ala Ile Pro Thr Asn Phe Thr Ile Ser Val Thr Thr Glu Ile

725 730 735

Leu Pro Val Ser Met Thr Lys Thr Ser Val Asp Cys Thr Met Tyr Ile

740 745 750

Cys Gly Asp Ser Thr Glu Cys Ser Asn Leu Leu Leu Gln Tyr Gly Ser

755 760 765

Phe Cys Thr Gln Leu Asn Arg Ala Leu Thr Gly Ile Ala Val Glu Gln

770 775 780

Asp Lys Asn Thr Gln Glu Val Phe Ala Gln Val Lys Gln Ile Tyr Lys

785 790 795 800

Thr Pro Pro Ile Lys Asp Phe Gly Gly Phe Asn Phe Ser Gln Ile Leu

805 810 815

Pro Asp Pro Ser Lys Pro Ser Lys Arg Ser Phe Ile Glu Asp Leu Leu

820 825 830

Phe Asn Lys Val Thr Leu Ala Asp Ala Gly Phe Ile Lys Gln Tyr Gly

835 840 845

Asp Cys Leu Gly Asp Ile Ala Ala Arg Asp Leu Ile Cys Ala Gln Lys

850 855 860

Phe Asn Gly Leu Thr Val Leu Pro Pro Leu Leu Thr Asp Glu Met Ile

865 870 875 880

Ala Gln Tyr Thr Ser Ala Leu Leu Ala Gly Thr Ile Thr Ser Gly Trp

885 890 895

Thr Phe Gly Ala Gly Ala Ala Leu Gln Ile Pro Phe Ala Met Gln Met

900 905 910

Ala Tyr Arg Phe Asn Gly Ile Gly Val Thr Gln Asn Val Leu Tyr Glu

915 920 925

Asn Gln Lys Leu Ile Ala Asn Gln Phe Asn Ser Ala Ile Gly Lys Ile

930 935 940

Gln Asp Ser Leu Ser Ser Thr Ala Ser Ala Leu Gly Lys Leu Gln Asp

945 950 955 960

Val Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu Asn Thr Leu Val Lys Gln Leu

965 970 975

Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile Ser Ser Val Leu Asn Asp Ile Leu Ser

980 985 990

Arg Leu Asp Lys Val Glu Ala Glu Val Gln Ile Asp Arg Leu Ile Thr

995 1000 1005

Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln Thr Tyr Val Thr Gln Gln Leu Ile Arg

1010 1015 1020

Ala Ala Glu Ile Arg Ala Ser Ala Asn Leu Ala Ala Thr Lys Met Ser

1025 1030 1035 1040

Glu Cys Val Leu Gly Gln Ser Lys Arg Val Asp Phe Cys Gly Lys Gly

1045 1050 1055

Tyr His Leu Met Ser Phe Pro Gln Ser Ala Pro His Gly Val Val Phe

1060 1065 1070

Leu His Val Thr Tyr Val Pro Ala Gln Glu Lys Asn Phe Thr Thr Ala

1075 1080 1085

Pro Ala Ile Cys His Asp Gly Lys Ala His Phe Pro Arg Glu Gly Val

1090 1095 1100

Phe Val Ser Asn Gly Thr His Trp Phe Val Thr Gln Arg Asn Phe Tyr

1105 1110 1115 1120

Glu Pro Gln Ile Ile Thr Thr Asp Asn Thr Phe Val Ser Gly Asn Cys

1125 1130 1135

Asp Val Val Ile Gly Ile Val Asn Asn Thr Val Tyr Asp Pro Leu Gln

1140 1145 1150

Pro Glu Leu Asp Ser Phe Lys Glu Glu Leu Asp Lys Tyr Phe Lys Asn

1155 1160 1165

His Thr Ser Pro Asp Val Asp Leu Gly Asp Ile Ser Gly Ile Asn Ala

1170 1175 1180

Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp Arg Leu Asn Glu Val Ala

1185 1190 1195 1200

Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu Gln Glu Leu Gly Lys Tyr

1205 1210 1215

Glu Gln Tyr Ile Lys Trp Pro Trp Tyr Ile Trp Leu Gly Phe Ile Ala

1220 1225 1230

Gly Leu Ile Ala Ile Val Met Val Thr Ile Met Leu Cys Cys Met Thr

1235 1240 1245

Ser Cys Cys Ser Cys Leu Lys Gly Cys Cys Ser Cys Gly Ser Cys Cys

1250 1255 1260

Lys Phe Asp Glu Asp Asp Ser Glu Pro Val Leu Lys Gly Val Lys Leu

1265 1270 1275 1280

His Tyr Thr

<210> 4

<211> 15971

<212> DNA

<213> 重组RABV rERAG333E-S6P(2 Ambystoma laterale x Ambystomajeffersonianum)

<400> 4

tgttaagcgt ctgatgagtc cgtgaggacg aaactatagg aaaggaattc ctatagtcac 60

gcttaacaac cagatcaaag aaaaaacaga cattgtcaat tgcaaagcaa aaatgtaaca 120

cccctacaat ggatgccgac aagattgtat tcaaagtcaa taatcaggtg gtctctttga 180

agcctgagat tatcgtggat caatatgagt acaagtaccc tgccatcaaa gatttgaaaa 240

agccctgtat aaccctagga aaggctcccg atttaaataa agcatacaag tcagttttgt 300

caggcatgag cgccgccaaa cttgatcctg acgatgtatg ttcctatttg gcagcggcaa 360

tgcagttttt tgaggggaca tgtccggaag actggaccag ctatggaatc gtgattgcac 420

gaaaaggaga taagatcacc ccaggttctc tggtggagat aaaacgtact gatgtagaag 480

ggaattgggc tctgacagga ggcatggaac tgacaagaga ccccactgtc cctgagcatg 540

cgtccttagt cggtcttctc ttgagtctgt ataggttgag caaaatatcc gggcaaaaca 600

ctggtaacta taagacaaac attgcagaca ggatagagca gatttttgag acagcccctt 660

ttgttaaaat cgtagaacac catactctaa tgacaactca caaaatgtgt gctaattgga 720

gtactatacc aaacttcaga tttttggccg gaacctatga catgtttttc tcccggattg 780

agcatctata ttcagcaatc agagtgggca cagttgtcac tgcttatgaa gactgttcag 840

gactggtatc atttactggg ttcataaaac aaatcaatct caccgctaga gaggcaatac 900

tatatttctt ccacaagaac tttgaggaag agataagaag aatgtttgag ccagggcagg 960

agacagctgt tcctcactct tatttcatcc acttccgttc actaggcttg agtgggaaat 1020

ctccttattc atcaaatgct gttggtcacg tgttcaatct cattcacttt gtaggatgct 1080

atatgggtca agtcagatcc ctaaatgcaa cggttattgc tgcatgtgct cctcatgaaa 1140

tgtctgttct agggggctat ctgggagagg aattcttcgg gaaagggaca tttgaaagaa 1200

gattcttcag agatgagaaa gaacttcaag aatacgaggc ggctgaactg acaaagactg 1260

acgtagcact ggcagatgat ggaactgtca actctgacga cgaggactac ttctcaggtg 1320

aaaccagaag tccggaggct gtttatactc gaatcatgat gaatggaggt cgactaaaga 1380

gatctcacat acggagatat gtctcagtca gttccaatca tcaagcccgt ccaaactcat 1440

tcgccgagtt tctaaacaag acatattcga gtgactcata agaagttgaa taacaaaatg 1500

ccggaaatct acggattgtg tatatccatc atgaaaaaaa ctaacacccc tcctttcgaa 1560

ccatcccaaa catgagcaag atctttgtca atcctagtgc tattagagcc ggtctggccg 1620

atcttgagat ggctgaagaa actgttgatc tgatcaatag aaatatcgaa gacaatcagg 1680

ctcatctcca aggggaaccc atagaagtgg acaatctccc tgaggatatg gggcgacttc 1740

acctggatga tggaaaatcg cccaaccctg gtgagatggc caaggtggga gaaggcaagt 1800

atcgagagga ctttcagatg gatgaaggag aggatcctag cttcctgttc cagtcatacc 1860

tggaaaatgt tggagtccaa atagtcagac aaatgaggtc aggagagaga tttctcaaga 1920

tatggtcaca gaccgtagaa gagattatat cctatgtcgc ggtcaacttt cccaaccctc 1980

caggaaagtc ttcagaggat aaatcaaccc agactactgg ccgagagctc aagaaggaga 2040

caacacccac tccttctcag agagaaagcc aatcatcgaa agccaggatg gcggctcaaa 2100

ctgcgtctgg ccctccagcc cttgaatggt cggccgccaa tgaagaggat gatctatcag 2160

tggaggctga gatcgctcac cagattgcag aaagtttctc caaaaaatat aagtttccgt 2220

ctcgatcctc agggatactc ttgtataatt ttgagcaatt gaaaatgaac cttgatgata 2280

tagttaaaga ggcaaaaaat gtaccaggtg tgacccgttt agcccatgac gggtccaaac 2340

tccccctaag atgtgtactg ggatgggtcg ctttggccaa ctctaagaaa ttccagttgt 2400

tagtcgaatc cgacaagctg agtaaaatca tgcaagatga cttgaatcgc tatacatctt 2460

gctaaccgaa cctctccact cagtccctct agagtttaaa catgaaaaaa acaggcaaca 2520

ccactgccgc caccatggac gccatgaagc gcggcctgtg ctgcgtgctg ctgctgtgcg 2580

gcgccgtgtt cgtgtccgcc cgccagtgcg tgaacctgac cacccgcacc cagctgcccc 2640

ccgcctacac caactccttc acccgcggcg tgtactaccc cgacaaggtg ttccgctcct 2700

ccgtgctgca ctccacccag gacctgttcc tgcccttctt ctccaacgtg acctggttcc 2760

acgccatcca cgtgtccggc accaacggca ccaagcgctt cgacaacccc gtgctgccct 2820

tcaacgacgg cgtgtacttc gcctccaccg agaagtccaa catcatccgc ggctggatct 2880

tcggcaccac cctggactcc aagacccagt ccctgctgat cgtgaacaac gccaccaacg 2940

tggtgatcaa ggtgtgcgag ttccagttct gcaacgaccc cttcctgggc gtgtactacc 3000

acaagaacaa caagtcctgg atggagtccg agttccgcgt gtactcctcc gccaacaact 3060

gcaccttcga gtacgtgtcc cagcccttcc tgatggacct ggagggcaag cagggcaact 3120

tcaagaacct gcgcgagttc gtgttcaaga acatcgacgg ctacttcaag atctactcca 3180

agcacacccc catcaacctg gtgcgcgacc tgccccaggg cttctccgcc ctggagcccc 3240

tggtggacct gcccatcggc atcaacatca cccgcttcca gaccctgctg gccctgcacc 3300

gctcctacct gacccccggc gactcctcct ccggctggac cgccggcgcc gccgcctact 3360

acgtgggcta cctgcagccc cgcaccttcc tgctgaagta caacgagaac ggcaccatca 3420

ccgacgccgt ggactgcgcc ctggaccccc tgtccgagac caagtgcacc ctgaagtcct 3480

tcaccgtgga gaagggcatc taccagacct ccaacttccg cgtgcagccc accgagtcca 3540

tcgtgcgctt ccccaacatc accaacctgt gccccttcgg cgaggtgttc aacgccaccc 3600

gcttcgcctc cgtgtacgcc tggaaccgca agcgcatctc caactgcgtg gccgactact 3660

ccgtgctgta caactccgcc tccttctcca ccttcaagtg ctacggcgtg tcccccacca 3720

agctgaacga cctgtgcttc accaacgtgt acgccgactc cttcgtgatc cgcggcgacg 3780

aggtgcgcca gatcgccccc ggccagaccg gcaagatcgc cgactacaac tacaagctgc 3840

ccgacgactt caccggctgc gtgatcgcct ggaactccaa caacctggac tccaaggtgg 3900

gcggcaacta caactacctg taccgcctgt tccgcaagtc caacctgaag cccttcgagc 3960

gcgacatctc caccgagatc taccaggccg gctccacccc ctgcaacggc gtggagggct 4020

tcaactgcta cttccccctg cagtcctacg gcttccagcc caccaacggc gtgggctacc 4080

agccctaccg cgtggtggtg ctgtccttcg agctgctgca cgcccccgcc accgtgtgcg 4140

gccccaagaa gtccaccaac ctggtgaaga acaagtgcgt gaacttcaac ttcaacggcc 4200

tgaccggcac cggcgtgctg accgagtcca acaagaagtt cctgcccttc cagcagttcg 4260

gccgcgacat cgccgacacc accgacgccg tgcgcgaccc ccagaccctg gagatcctgg 4320

acatcacccc ctgctccttc ggcggcgtgt ccgtgatcac ccccggcacc aacacctcca 4380

accaggtggc cgtgctgtac caggacgtga actgcaccga ggtgcccgtg gccatccacg 4440

ccgaccagct gacccccacc tggcgcgtgt actccaccgg ctccaacgtg ttccagaccc 4500

gcgccggctg cctgatcggc gccgagcacg tgaacaactc ctacgagtgc gacatcccca 4560

tcggcgccgg catctgcgcc tcctaccaga cccagaccaa ctcccccggc tccgcctcct 4620

ccgtggcctc ccagtccatc atcgcctaca ccatgtccct gggcgccgag aactccgtgg 4680

cctactccaa caactccatc gccatcccca ccaacttcac catctccgtg accaccgaga 4740

tcctgcccgt gtccatgacc aagacctccg tggactgcac catgtacatc tgcggcgact 4800

ccaccgagtg ctccaacctg ctgctgcagt acggctcctt ctgcacccag ctgaaccgcg 4860

ccctgaccgg catcgccgtg gagcaggaca agaacaccca ggaggtgttc gcccaggtga 4920

agcagatcta caagaccccc cccatcaagg acttcggcgg cttcaacttc tcccagatcc 4980

tgcccgaccc ctccaagccc tccaagcgct ccttcatcga ggacctgctg ttcaacaagg 5040

tgaccctggc cgacgccggc ttcatcaagc agtacggcga ctgcctgggc gacatcgccg 5100

cccgcgacct gatctgcgcc cagaagttca acggcctgac cgtgctgccc cccctgctga 5160

ccgacgagat gatcgcccag tacacctccg ccctgctggc cggcaccatc acctccggct 5220

ggaccttcgg cgccggcgcc gccctgcaga tccccttcgc catgcagatg gcctaccgct 5280

tcaacggcat cggcgtgacc cagaacgtgc tgtacgagaa ccagaagctg atcgccaacc 5340

agttcaactc cgccatcggc aagatccagg actccctgtc ctccaccgcc tccgccctgg 5400

gcaagctgca ggacgtggtg aaccagaacg cccaggccct gaacaccctg gtgaagcagc 5460

tgtcctccaa cttcggcgcc atctcctccg tgctgaacga catcctgtcc cgcctggaca 5520

aggtggaggc cgaggtgcag atcgaccgcc tgatcaccgg ccgcctgcag tccctgcaga 5580

cctacgtgac ccagcagctg atccgcgccg ccgagatccg cgcctccgcc aacctggccg 5640

ccaccaagat gtccgagtgc gtgctgggcc agtccaagcg cgtggacttc tgcggcaagg 5700

gctaccacct gatgtccttc ccccagtccg ccccccacgg cgtggtgttc ctgcacgtga 5760

cctacgtgcc cgcccaggag aagaacttca ccaccgcccc cgccatctgc cacgacggca 5820

aggcccactt cccccgcgag ggcgtgttcg tgtccaacgg cacccactgg ttcgtgaccc 5880

agcgcaactt ctacgagccc cagatcatca ccaccgacaa caccttcgtg tccggcaact 5940

gcgacgtggt gatcggcatc gtgaacaaca ccgtgtacga ccccctgcag cccgagctgg 6000

actccttcaa ggaggagctg gacaagtact tcaagaacca cacctccccc gacgtggacc 6060

tgggcgacat ctccggcatc aacgcctccg tggtgaacat ccagaaggag atcgaccgcc 6120

tgaacgaggt ggccaagaac ctgaacgagt ccctgatcga cctgcaggag ctgggcaagt 6180

acgagcagta catcaagtgg ccctggtaca tctggctggg cttcatcgcc ggcctgatcg 6240

ccatcgtgat ggtgaccatc atgctgtgct gcatgacctc ctgctgctcc tgcctgaagg 6300

gctgctgctc ctgcggctcc tgctgcaagt tcgacgagga cgactccgag cccgtgctga 6360

agggcgtgaa gctgcactac acctaagttt aaactccgag atgtcctaaa gtcaacatga 6420

aaaaaacagg caacaccact gataaaatga actttctacg taagatagtg aaaaattgca 6480

gggacgagga cactcaaaaa ccctctcccg tgtcagcccc tctggatgac gatgacttgt 6540

ggcttccacc ccctgaatac gtcccgctga aagaacttac aagcaagaag aacatgagga 6600

acttttgtat caacggaggg gttaaagtgt gtagcccgaa tggttactcg ttcaggatcc 6660

tgcggcacat tctgaaatca ttcgacgaga tatattctgg gaatcatagg atgatcgggt 6720

tagtcaaagt agttattgga ctggctttgt caggatctcc agtccctgag ggcatgaact 6780

gggtatacaa attgaggaga acctttatct tccagtgggc tgattccagg ggccctcttg 6840

aaggggagga gttggaatac tctcaggaga tcacttggga tgatgatact gagttcgtcg 6900

gattgcaaat aagagtgatt gcaaaacagt gtcatatcca gggcagaatc tggtgtatca 6960

acatgaaccc gagagcatgt caactatggt ctgacatgtc tcttcagaca caaaggtccg 7020

aagaggacaa agattcctct ctgcttctag aataatcaga ttatatcccg caaatttatc 7080

acttgtttac ctctggagga gagaacatat gggctcaact ccaacccttg ggagcaatat 7140

aacaaaaaaa catgttatgg tgccattaaa ccgctgcatt tcatcaaagt caagttgatt 7200

acctttacat tttgatcctc ttggatgtga aaaaaactat taacatccct caaaagactc 7260

aaggaaagat ggttcctcag gctctcctgt ttgtacccct tctggttttt ccattgtgtt 7320

ttgggaaatt ccctatttac acgataccag acaagcttgg tccctggagc ccgattgaca 7380

tacatcacct cagatgccca aacaatttgg tagtggagga cgaaggatgc accaacctgt 7440

cagggttctc ctacatggaa cttaaagttg gatacatctt agccataaaa atgaacgggt 7500

tcacttgcac aggcgttgtg acggaggctg aaacctacac taacttcgtt ggttatgtca 7560

caaccacgtt caaaagaaag catttccgcc caacaccaga tgcatgtaga gccgcgtaca 7620

actggaagat ggccggtgac cccagatatg aagagtctct acacaatccg taccctgact 7680

accgctggct tcgaactgta aaaaccacca aggagtctct cgttatcata tctccaagtg 7740

tggcagattt ggacccatat gacagatccc ttcactcgag ggtcttccct agcgggaagt 7800

gctcaggagt agcggtgtct tctacctact gctccactaa ccacgattac accatttgga 7860

tgcccgagaa tccgagacta gggatgtctt gtgacatttt taccaatagt agagggaaga 7920

gagcatccaa agggagtgag acttgcggct ttgtagatga aagaggccta tataagtctt 7980

taaaaggagc atgcaaactc aagttatgtg gagttctagg acttagactt atggatggaa 8040

catgggtcgc gatgcaaaca tcaaatgaaa ccaaatggtg ccctcccgat cagttggtga 8100

acctgcacga ctttcgctca gacgaaattg agcaccttgt tgtagaggag ttggtcagga 8160

agagagagga gtgtctggat gtactagagt ccatcatgac aaccaagtca gtgagtttca 8220

gacgtctcag tcatttaaga aaacttgtcc ctgggtttgg aaaagcatat accatattca 8280

acaagacctt gatggaagcc gatgctcact acaagtcagt cgaaacttgg aatgagatcc 8340

tcccttcaaa agggtgttta agagttgggg ggaggtgtca tcctcatgtg aacggggtgt 8400

ttttcaatgg tataatatta ggacctgacg gcaatgtctt aatcccagag atgcaatcat 8460

ccctcctcca gcaacatatg gagttgttgg aatcctcggt tatccccctt gtgcaccccc 8520

tggcagaccc gtctaccgtt ttcaaggacg gtgacgaggc tgaggatttt gttgaagttc 8580

accttcccga tgtgcacaat caggtctcag gagttgactt gggtctcccg aactggggga 8640

agtatgtatt actgagtgca ggggccctga ctgccttgat gttgataatt ttcctgatga 8700

catgttgtag aagagtcaat cgatcagaac ctacgcaaca caatctcaga gggacaggga 8760

gggaggtgtc agtcactccc caaagcggga agatcatatc ttcatgggaa tcacacaaga 8820

gtgggggtga gaccagactg tgaggactgg ccgtcctttc aacgatccaa gtcctgaaga 8880

tcacctcccc ttggggggtt ctttttgaaa aaaaacctgg gttcaatagt cctccttgaa 8940

ctccatgcaa ctgggtagat tcaagagtca tgagattttc attaatcctc tcagttgatc 9000

aagcaagatc atgtagattc tcataatagg ggagatcttc tagcagtttc agtgactaac 9060

ggtactttca ttctccagga actgacacca acagttgtag acaaaccacg gggtgtctcg 9120

ggtgactctg tgcttgggca cagacaaagg tcatggtgtg ttccatgata gcggactcag 9180

gatgagttaa ttgagagagg cagtcttcct cccgtgaagg acataagcag tagctcacaa 9240

tcatctcgcg tctcagcaaa gtgtgcataa ttataaagtg ctgggtcatc taagcttttc 9300

agtcgagaaa aaaacattag atcagaagaa caactggcaa cacttctcaa cctgagacct 9360

acttcaagat gctcgatcct ggagaggtct atgatgaccc tattgaccca atcgagttag 9420

aggctgaacc cagaggaacc cccactgtcc ccaacatctt gaggaactct gactacaatc 9480

tcaactctcc tttgatagaa gatcctgcta gactaatgtt agaatggtta aaaacaggga 9540

atagacctta tcggatgact ctaacagaca attgctccag gtctttcaga gttttgaaag 9600

attatttcaa gaaggtagat ttgggttctc tcaaggtggg cggaatggct gcacagtcaa 9660

tgatttctct ctggttatat ggtgcccact ctgaatccaa caggagccgg agatgtataa 9720

cagacttggc ccatttctat tccaagtcgt cccccataga gaagctgttg aatctcacgc 9780

taggaaatag agggctgaga atccccccag agggagtgtt aagttgcctt gagagggttg 9840

attatgataa tgcatttgga aggtatcttg ccaacacgta ttcctcttac ttgttcttcc 9900

atgtaatcac cttatacatg aacgccctag actgggatga agaaaagacc atcctagcat 9960

tatggaaaga tttaacctca gtggacatcg ggaaggactt ggtaaagttc aaagaccaaa 10020

tatggggact gctgatcgta acaaaggact ttgtttactc ccaaagttcc aattgtcttt 10080

ttgacagaaa ctacacactt atgctaaaag atcttttctt gtctcgcttc aactccttaa 10140

tggtcttgct ctctccccca gagccccgat actcagatga cttgatatct caactatgcc 10200

agctgtacat tgctggggat caagtcttgt ctatgtgtgg aaactccggc tatgaagtca 10260

tcaaactatt ggagccatat gtcgtgaata gtttagtcca gagagcagaa aagtttaggc 10320

ctctcattca ttccttggga gactttcctg tatttataaa agacaaggta agtcaacttg 10380

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tacatgactt ggtttttgtg tatggctgtt acaggcattg ggggcaccca tatatagatt 10500

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gagtcttcaa cgtttccaaa cccctaactg accccttgtt ctatccaccg tctgatccca 15360

aaatcctgag gcacttcaac atatgttgca gtactatgat gtatctatct actgctttag 15420

gtgacgtccc tagcttcgca agacttcacg acctgtataa cagacctata acttattact 15480

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aagggagggc g 15971

<210> 5

<211> 15971

<212> DNA

<213> 重组RABV rERAG333E-coS’(2 Ambystoma laterale x Ambystomajeffersonianum)

<400> 5

tgttaagcgt ctgatgagtc cgtgaggacg aaactatagg aaaggaattc ctatagtcac 60

gcttaacaac cagatcaaag aaaaaacaga cattgtcaat tgcaaagcaa aaatgtaaca 120

cccctacaat ggatgccgac aagattgtat tcaaagtcaa taatcaggtg gtctctttga 180

agcctgagat tatcgtggat caatatgagt acaagtaccc tgccatcaaa gatttgaaaa 240

agccctgtat aaccctagga aaggctcccg atttaaataa agcatacaag tcagttttgt 300

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agccctaccg cgtggtggtg ctgtccttcg agctgctgca cgcccccgcc accgtgtgcg 4140

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ccaccgagtg ctccaacctg ctgctgcagt acggctcctt ctgcacccag ctgaaccgcg 4860

ccctgaccgg catcgccgtg gagcaggaca agaacaccca ggaggtgttc gcccaggtga 4920

agcagatcta caagaccccc cccatcaagg acttcggcgg cttcaacttc tcccagatcc 4980

tgcccgaccc ctccaagccc tccaagcgct ccttcatcga ggacctgctg ttcaacaagg 5040

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gcaagctgca ggacgtggtg aaccagaacg cccaggccct gaacaccctg gtgaagcagc 5460

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aggcccactt cccccgcgag ggcgtgttcg tgtccaacgg cacccactgg ttcgtgaccc 5880

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gcgacgtggt gatcggcatc gtgaacaaca ccgtgtacga ccccctgcag cccgagctgg 6000

actccttcaa ggaggagctg gacaagtact tcaagaacca cacctccccc gacgtggacc 6060

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ccatcgtgat ggtgaccatc atgctgtgct gcatgacctc ctgctgctcc tgcctgaagg 6300

gctgctgctc ctgcggctcc tgctgcaagt tcgacgagga cgactccgag cccgtgctga 6360

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acatgaaccc gagagcatgt caactatggt ctgacatgtc tcttcagaca caaaggtccg 7020

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agagagagga gtgtctggat gtactagagt ccatcatgac aaccaagtca gtgagtttca 8220

gacgtctcag tcatttaaga aaacttgtcc ctgggtttgg aaaagcatat accatattca 8280

acaagacctt gatggaagcc gatgctcact acaagtcagt cgaaacttgg aatgagatcc 8340

tcccttcaaa agggtgttta agagttgggg ggaggtgtca tcctcatgtg aacggggtgt 8400

ttttcaatgg tataatatta ggacctgacg gcaatgtctt aatcccagag atgcaatcat 8460

ccctcctcca gcaacatatg gagttgttgg aatcctcggt tatccccctt gtgcaccccc 8520

tggcagaccc gtctaccgtt ttcaaggacg gtgacgaggc tgaggatttt gttgaagttc 8580

accttcccga tgtgcacaat caggtctcag gagttgactt gggtctcccg aactggggga 8640

agtatgtatt actgagtgca ggggccctga ctgccttgat gttgataatt ttcctgatga 8700

catgttgtag aagagtcaat cgatcagaac ctacgcaaca caatctcaga gggacaggga 8760

gggaggtgtc agtcactccc caaagcggga agatcatatc ttcatgggaa tcacacaaga 8820

gtgggggtga gaccagactg tgaggactgg ccgtcctttc aacgatccaa gtcctgaaga 8880

tcacctcccc ttggggggtt ctttttgaaa aaaaacctgg gttcaatagt cctccttgaa 8940

ctccatgcaa ctgggtagat tcaagagtca tgagattttc attaatcctc tcagttgatc 9000

aagcaagatc atgtagattc tcataatagg ggagatcttc tagcagtttc agtgactaac 9060

ggtactttca ttctccagga actgacacca acagttgtag acaaaccacg gggtgtctcg 9120

ggtgactctg tgcttgggca cagacaaagg tcatggtgtg ttccatgata gcggactcag 9180

gatgagttaa ttgagagagg cagtcttcct cccgtgaagg acataagcag tagctcacaa 9240

tcatctcgcg tctcagcaaa gtgtgcataa ttataaagtg ctgggtcatc taagcttttc 9300

agtcgagaaa aaaacattag atcagaagaa caactggcaa cacttctcaa cctgagacct 9360

acttcaagat gctcgatcct ggagaggtct atgatgaccc tattgaccca atcgagttag 9420

aggctgaacc cagaggaacc cccactgtcc ccaacatctt gaggaactct gactacaatc 9480

tcaactctcc tttgatagaa gatcctgcta gactaatgtt agaatggtta aaaacaggga 9540

atagacctta tcggatgact ctaacagaca attgctccag gtctttcaga gttttgaaag 9600

attatttcaa gaaggtagat ttgggttctc tcaaggtggg cggaatggct gcacagtcaa 9660

tgatttctct ctggttatat ggtgcccact ctgaatccaa caggagccgg agatgtataa 9720

cagacttggc ccatttctat tccaagtcgt cccccataga gaagctgttg aatctcacgc 9780

taggaaatag agggctgaga atccccccag agggagtgtt aagttgcctt gagagggttg 9840

attatgataa tgcatttgga aggtatcttg ccaacacgta ttcctcttac ttgttcttcc 9900

atgtaatcac cttatacatg aacgccctag actgggatga agaaaagacc atcctagcat 9960

tatggaaaga tttaacctca gtggacatcg ggaaggactt ggtaaagttc aaagaccaaa 10020

tatggggact gctgatcgta acaaaggact ttgtttactc ccaaagttcc aattgtcttt 10080

ttgacagaaa ctacacactt atgctaaaag atcttttctt gtctcgcttc aactccttaa 10140

tggtcttgct ctctccccca gagccccgat actcagatga cttgatatct caactatgcc 10200

agctgtacat tgctggggat caagtcttgt ctatgtgtgg aaactccggc tatgaagtca 10260

tcaaactatt ggagccatat gtcgtgaata gtttagtcca gagagcagaa aagtttaggc 10320

ctctcattca ttccttggga gactttcctg tatttataaa agacaaggta agtcaacttg 10380

aagagacgtt cggtccctgt gcaagaaggt tctttagggc tctggatcaa ttcgccaaca 10440

tacatgactt ggtttttgtg tatggctgtt acaggcattg ggggcaccca tatatagatt 10500

atcgaaaggg tctgtcaaaa ctatatgatc aggttcacat taaaaaagtg atagataagt 10560

cctaccagga gtgcttagca agcgacctag ccaggaggat ccttagatgg ggttttgata 10620

agtactccaa gtggtatctg gattcaagat tcctagcccg agaccacccc ttgactcctt 10680

atatcaaaac ccaaacatgg ccacccaaac atattgtaga cttggtgggg gatacatggc 10740

acaagctccc gatcacgcag atctttgaga ttcctgaatc aatggatccg tcagaaatat 10800

tggatgacaa atcacattct ttcaccagaa cgagactagc ttcttggctg tcagaaaacc 10860

gaggggggcc tgttcctagc gaaaaagtta ttatcacggc cctgtctaag ccgcctgtca 10920

atccccgaga gtttctgagg tctatagacc tcggaggatt gccagatgaa gacttgataa 10980

ttggcctcaa gccaaaggaa cgggaattga agattgaagg tcgattcttt gctctaatgt 11040

catggaatct aagattgtat tttgtcatca ctgaaaaact cttggccaac tacatcttgc 11100

cactttttga cgcgctgact atgacagaca acctgaacaa ggtgtttaaa aagctgatcg 11160

acagggtcac cgggcaaggg cttttggact attcaagggt cacatatgca tttcacctgg 11220

actatgaaaa gtggaacaac catcaaagat tagagtcaac agaggatgta ttttctgtcc 11280

tagatcaagt gtttggattg aagagagtgt tttctagaac acacgagttt tttcaaaagg 11340

cctggatcta ttattcagac agatcagacc tcatcgggtt acgggaggat caaatatact 11400

gcttagatgc gtccaacggc ccaacctgtt ggaatggcca ggatggcggg ctagaaggct 11460

tacggcagaa gggctggagt ctagtcagct tattgatgat agatagagaa tctcaaatca 11520

ggaacacaag aaccaaaata ctagctcaag gagacaacca ggttttatgt ccgacatata 11580

tgttgtcgcc agggctatct caagaggggc tcctctatga attggagaga atatcaagga 11640

atgcactttc gatatacaga gccgtcgagg aaggggcatc taagctaggg ctgatcatca 11700

agaaagaaga gaccatgtgt agttatgact tcctcatcta tggaaaaacc cctttgttta 11760

gaggtaacat attggtgcct gagtccaaaa gatgggccag agtctcttgc gtctctaatg 11820

accaaatagt caacctcgcc aatataatgt cgacagtgtc caccaatgcg ctaacagtgg 11880

cacaacactc tcaatctttg atcaaaccga tgagggattt tctgctcatg tcagtacagg 11940

cagtctttca ctacctgcta tttagcccaa tcttaaaggg aagagtttac aagattctga 12000

gcgctgaagg ggagagcttt ctcctagcca tgtcaaggat aatctatcta gatccttctt 12060

tgggaggggt atctggaatg tccctcggaa gattccatat acgacagttc tcagaccctg 12120

tctctgaagg gttatccttc tggagagaga tctggttaag ctcccacgag tcctggattc 12180

acgcgttgtg tcaagaggct ggaaacccag atcttggaga gagaacactc gagagcttca 12240

ctcgccttct agaagatcct accaccttaa atatcagagg aggggccagt cctaccattc 12300

tactcaagga tgcaatcaga aaggctttat atgacgaggt ggacaaggtg gagaattcag 12360

agtttcgaga ggcaatcctg ttgtccaaga cccatagaga taattttata ctcttcttaa 12420

catctgttga gcctctgttt cctcgatttc tcagtgagct attcagttcg tcttttttgg 12480

gaatccccga gtcaatcatt ggattgatac aaaactcccg aacgataaga aggcagttta 12540

aaaagagtct ctcaaaaact ttagaagagt ccttctacaa ctcagagatc cacgggatta 12600

gtcggatgac ccagacacct cagagggttg ggggggtgtg gccttgctct tcagagaggg 12660

cagatctact tagggagatc tcttggggaa gaaaagtggt aggcacgaca gttcctcacc 12720

cttctgagat gttggggtta cttcccaagt cctctatttc ttgcacttgt ggagcaacag 12780

gaggaggcaa tcctagagtt tctgtatcag tactyccgtc ctttgatcag tcattttttt 12840

cacgaggccc cctaaagggg tacttgggct cgtccacctc tatgtcgacc cagctattcc 12900

atgcatggga aaaagtcact aatgttcatg tggtgaagag agctctatcg ttaaaagaat 12960

ctataaactg gttcattact agagattcca acttggctca agctctaatt aggaacatta 13020

tgtctctgac aggccctgat ttccctctag aggaggcccc tgtcttcaaa aggacggggt 13080

cagccttgca taggttcaag tctgccagat acagcgaagg agggtattct tctgtctgcc 13140

cgaacctcct ctctcatatt tctgttagta cagacaccat gtctgatttg acccaagacg 13200

ggaagaacta cgatttcatg ttccagccat tgatgcttta tgcacagaca tggacatcag 13260

agctggtaca gagagacaca aggctaagag actctacgtt tcattggcac ctccgatgca 13320

acaggtgtgt gagacccatt gacgacgtga ccctggagac ctctcagatc ttcgagtttc 13380

cggatgtgtc gaaaagaata tccagaatgg tttctggggc tgtgcctcac ttccagaggc 13440

ttcccgatat ccgtctgaga ccaggagatt ttgaatctct aagcggtaga gaaaagtctc 13500

accatatcgg atcagctcag gggctcttat actcaatctt agtggcaatt cacgactcag 13560

gatacaatga tggaaccatc ttccctgtca acatatacgg caaggtttcc cctagagact 13620

atttgagagg gctcgcaagg ggagtattga taggatcctc gatttgcttc ttgacaagaa 13680

tgacaaatat caatattaat agacctcttg aattgatctc aggggtaatc tcatatattc 13740

tcctgaggct agataaccat ccctccttgt acataatgct cagagaaccg tctcttagag 13800

gagagatatt ttctatccct cagaaaatcc ccgccgctta tccaaccact atgaaagaag 13860

gcaacagatc aatcttgtgt tatctccaac atgtgctacg ctatgagcga gagataatca 13920

cggcgtctcc agagaatgac tggctatgga tcttttcaga ctttagaagt gccaaaatga 13980

cgtacctaac cctcattact taccagtctc atcttctact ccagagggtt gagagaaacc 14040

tatctaagag tatgagagat aacctgcgac aattgagttc cttgatgagg caggtgctgg 14100

gcgggcacgg agaagatacc ttagagtcag acgacaacat tcaacgactg ctaaaagact 14160

ctttacgaag gacaagatgg gtggatcaag aggtgcgcca tgcagctaga accatgactg 14220

gagattacag ccccaacaag aaggtgtccc gtaaggtagg atgttcagaa tgggtctgct 14280

ctgctcaaca ggttgcagtc tctacctcag caaacccggc ccctgtctcg gagcttgaca 14340

taagggccct ctctaagagg ttccagaacc ctttgatctc gggcttgaga gtggttcagt 14400

gggcaaccgg tgctcattat aagcttaagc ctattctaga tgatctcaat gttttcccat 14460

ctctctgcct tgtagttggg gacgggtcag gggggatatc aagggcagtc ctcaacatgt 14520

ttccagatgc caagcttgtg ttcaacagtc ttttagaggt gaatgacctg atggcttccg 14580

gaacacatcc actgcctcct tcagcaatca tgaggggagg aaatgatatc gtctccagag 14640

tgatagattt tgactcaatc tgggaaaaac cgtccgactt gagaaacttg gcaacctgga 14700

aatacttcca gtcagtccaa aagcaggtca acatgtccta tgacctcatt atttgcgatg 14760

cagaagttac tgacattgca tctatcaacc ggataaccct gttaatgtcc gattttgcat 14820

tgtctataga tggaccactc tatttggtct tcaaaactta tgggactatg ctagtaaatc 14880

caaactacaa ggctattcaa cacctgtcaa gagcgttccc ctcggtcaca gggtttatca 14940

cccaagtaac ttcgtctttt tcatctgagc tctacctccg attctccaaa cgagggaagt 15000

ttttcagaga tgctgagtac ttgacctctt ccacccttcg agaaatgagc cttgtgttat 15060

tcaattgtag cagccccaag agtgagatgc agagagctcg ttccttgaac tatcaggatc 15120

ttgtcagagg atttcctgaa gaaatcatat caaatcctta caatgagatg atcataactc 15180

tgattgacag tgatgtagaa tcttttctag tccacaagat ggttgatgat cttgagttac 15240

agaggggaac tctgtctaaa gtggctatca ttatagccat catgatagtt ttctccaaca 15300

gagtcttcaa cgtttccaaa cccctaactg accccttgtt ctatccaccg tctgatccca 15360

aaatcctgag gcacttcaac atatgttgca gtactatgat gtatctatct actgctttag 15420

gtgacgtccc tagcttcgca agacttcacg acctgtataa cagacctata acttattact 15480

tcagaaagca agtcattcga gggaacgttt atctatcttg gagttggtcc aacgacacct 15540

cagtgttcaa aagggtagcc tgtaattcta gcctgagtct gtcatctcac tggatcaggt 15600

tgatttacaa gatagtgaag actaccagac tcgttggcag catcaaggat ctatccagag 15660

aagtggaaag acaccttcat aggtacaaca ggtggatcac cctagaggat atcagatcta 15720

gatcatccct actagactac agttgcctgt gaaccggata ctcctggaag cctgcccatg 15780

ctaagactct tgtgtgatgt atcttgaaaa aaacaagatc ctaaatctga acctttggtt 15840

gtttgattgt ttttctcatt tttgttgttt atttgttaag cgtgggtcgg catggcatct 15900

ccacctcctc gcggtccgac ctgggcatcc gaaggaggac gcacgtccac tcggatggct 15960

aagggagggc g 15971

<210> 6

<211> 3852

<212> DNA

<213> SARS-CoV-2的刺突蛋白衍生物(2 Ambystoma laterale x Ambystomajeffersonianum)

<400> 6

atggacgcca tgaagcgcgg cctgtgctgc gtgctgctgc tgtgcggcgc cgtgttcgtg 60

tccgcccgcc agtgcgtgaa cctgaccacc cgcacccagc tgccccccgc ctacaccaac 120

tccttcaccc gcggcgtgta ctaccccgac aaggtgttcc gctcctccgt gctgcactcc 180

acccaggacc tgttcctgcc cttcttctcc aacgtgacct ggttccacgc catccacgtg 240

tccggcacca acggcaccaa gcgcttcgac aaccccgtgc tgcccttcaa cgacggcgtg 300

tacttcgcct ccaccgagaa gtccaacatc atccgcggct ggatcttcgg caccaccctg 360

gactccaaga cccagtccct gctgatcgtg aacaacgcca ccaacgtggt gatcaaggtg 420

tgcgagttcc agttctgcaa cgaccccttc ctgggcgtgt actaccacaa gaacaacaag 480

tcctggatgg agtccgagtt ccgcgtgtac tcctccgcca acaactgcac cttcgagtac 540

gtgtcccagc ccttcctgat ggacctggag ggcaagcagg gcaacttcaa gaacctgcgc 600

gagttcgtgt tcaagaacat cgacggctac ttcaagatct actccaagca cacccccatc 660

aacctggtgc gcgacctgcc ccagggcttc tccgccctgg agcccctggt ggacctgccc 720

atcggcatca acatcacccg cttccagacc ctgctggccc tgcaccgctc ctacctgacc 780

cccggcgact cctcctccgg ctggaccgcc ggcgccgccg cctactacgt gggctacctg 840

cagccccgca ccttcctgct gaagtacaac gagaacggca ccatcaccga cgccgtggac 900

tgcgccctgg accccctgtc cgagaccaag tgcaccctga agtccttcac cgtggagaag 960

ggcatctacc agacctccaa cttccgcgtg cagcccaccg agtccatcgt gcgcttcccc 1020

aacatcacca acctgtgccc cttcggcgag gtgttcaacg ccacccgctt cgcctccgtg 1080

tacgcctgga accgcaagcg catctccaac tgcgtggccg actactccgt gctgtacaac 1140

tccgcctcct tctccacctt caagtgctac ggcgtgtccc ccaccaagct gaacgacctg 1200

tgcttcacca acgtgtacgc cgactccttc gtgatccgcg gcgacgaggt gcgccagatc 1260

gcccccggcc agaccggcaa gatcgccgac tacaactaca agctgcccga cgacttcacc 1320

ggctgcgtga tcgcctggaa ctccaacaac ctggactcca aggtgggcgg caactacaac 1380

tacctgtacc gcctgttccg caagtccaac ctgaagccct tcgagcgcga catctccacc 1440

gagatctacc aggccggctc caccccctgc aacggcgtgg agggcttcaa ctgctacttc 1500

cccctgcagt cctacggctt ccagcccacc aacggcgtgg gctaccagcc ctaccgcgtg 1560

gtggtgctgt ccttcgagct gctgcacgcc cccgccaccg tgtgcggccc caagaagtcc 1620

accaacctgg tgaagaacaa gtgcgtgaac ttcaacttca acggcctgac cggcaccggc 1680

gtgctgaccg agtccaacaa gaagttcctg cccttccagc agttcggccg cgacatcgcc 1740

gacaccaccg acgccgtgcg cgacccccag accctggaga tcctggacat caccccctgc 1800

tccttcggcg gcgtgtccgt gatcaccccc ggcaccaaca cctccaacca ggtggccgtg 1860

ctgtaccagg acgtgaactg caccgaggtg cccgtggcca tccacgccga ccagctgacc 1920

cccacctggc gcgtgtactc caccggctcc aacgtgttcc agacccgcgc cggctgcctg 1980

atcggcgccg agcacgtgaa caactcctac gagtgcgaca tccccatcgg cgccggcatc 2040

tgcgcctcct accagaccca gaccaactcc cccggctccg cctcctccgt ggcctcccag 2100

tccatcatcg cctacaccat gtccctgggc gccgagaact ccgtggccta ctccaacaac 2160

tccatcgcca tccccaccaa cttcaccatc tccgtgacca ccgagatcct gcccgtgtcc 2220

atgaccaaga cctccgtgga ctgcaccatg tacatctgcg gcgactccac cgagtgctcc 2280

aacctgctgc tgcagtacgg ctccttctgc acccagctga accgcgccct gaccggcatc 2340

gccgtggagc aggacaagaa cacccaggag gtgttcgccc aggtgaagca gatctacaag 2400

acccccccca tcaaggactt cggcggcttc aacttctccc agatcctgcc cgacccctcc 2460

aagccctcca agcgctcctt catcgaggac ctgctgttca acaaggtgac cctggccgac 2520

gccggcttca tcaagcagta cggcgactgc ctgggcgaca tcgccgcccg cgacctgatc 2580

tgcgcccaga agttcaacgg cctgaccgtg ctgccccccc tgctgaccga cgagatgatc 2640

gcccagtaca cctccgccct gctggccggc accatcacct ccggctggac cttcggcgcc 2700

ggcgccgccc tgcagatccc cttcgccatg cagatggcct accgcttcaa cggcatcggc 2760

gtgacccaga acgtgctgta cgagaaccag aagctgatcg ccaaccagtt caactccgcc 2820

atcggcaaga tccaggactc cctgtcctcc accgcctccg ccctgggcaa gctgcaggac 2880

gtggtgaacc agaacgccca ggccctgaac accctggtga agcagctgtc ctccaacttc 2940

ggcgccatct cctccgtgct gaacgacatc ctgtcccgcc tggacaaggt ggaggccgag 3000

gtgcagatcg accgcctgat caccggccgc ctgcagtccc tgcagaccta cgtgacccag 3060

cagctgatcc gcgccgccga gatccgcgcc tccgccaacc tggccgccac caagatgtcc 3120

gagtgcgtgc tgggccagtc caagcgcgtg gacttctgcg gcaagggcta ccacctgatg 3180

tccttccccc agtccgcccc ccacggcgtg gtgttcctgc acgtgaccta cgtgcccgcc 3240

caggagaaga acttcaccac cgcccccgcc atctgccacg acggcaaggc ccacttcccc 3300

cgcgagggcg tgttcgtgtc caacggcacc cactggttcg tgacccagcg caacttctac 3360

gagccccaga tcatcaccac cgacaacacc ttcgtgtccg gcaactgcga cgtggtgatc 3420

ggcatcgtga acaacaccgt gtacgacccc ctgcagcccg agctggactc cttcaaggag 3480

gagctggaca agtacttcaa gaaccacacc tcccccgacg tggacctggg cgacatctcc 3540

ggcatcaacg cctccgtggt gaacatccag aaggagatcg accgcctgaa cgaggtggcc 3600

aagaacctga acgagtccct gatcgacctg caggagctgg gcaagtacga gcagtacatc 3660

aagtggccct ggtacatctg gctgggcttc atcgccggcc tgatcgccat cgtgatggtg 3720

accatcatgc tgtgctgcat gacctcctgc tgctcctgcc tgaagggctg ctgctcctgc 3780

ggctcctgct gcaagttcga cgaggacgac tccgagcccg tgctgaaggg cgtgaagctg 3840

cactacacct aa 3852

Claims (10)

1.一种包含改造的SARS-CoV-2的刺突蛋白(S’)的疫苗组合物，该改造的SARS-CoV-2的刺突蛋白(S’)包含组织型纤溶酶原激活因子信号肽。

2.如权利要求1所述的疫苗组合物，其中改造的SARS-CoV-2的刺突蛋白(S’)包括S蛋白基因信号肽替换为组织型纤溶酶原激活因子信号肽。

3.如权利要求1或2所述的疫苗组合物，该改造的SARS-CoV-2的刺突蛋白(S’)或其免疫原性衍生物包含来自SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的核苷酸序列。

4.如权利要求1-3任一项所述的疫苗组合物，该改造的SARS-CoV-2的刺突蛋白(S’)或其免疫原性衍生物由病毒载体编码。

5.如权利要求4所述的疫苗组合物，所述病毒载体选自腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体、痘病毒载体、疱疹病毒载体、新城疫病毒载体、流感病毒载体、狂犬病病毒载体。

6.一种疫苗组合物，包含将狂犬病毒疫苗株(rERAG333E)的非致病性骨架与新型改造的SARS-CoV-2的刺突蛋白(S’)结合的重组嵌合型狂犬病毒。

7.如权利要求6所述的疫苗组合物，其包含编码非致病性狂犬病病毒载体RABVrERAG333E的核酸分子SEQ ID NO：3和编码改造的SARS-CoV-2的刺突蛋白(S’)的核酸分子SEQ ID NO：4。

8.如权利要求6所述的疫苗组合物，其包含编码非致病性狂犬病病毒载体RABVrERAG333E的核酸分子SEQ ID NO：3和编码改造的SARS-CoV-2的刺突蛋白(S’)的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示。

9.如权利要求1-8任一项所述的疫苗组合物，疫苗是口服疫苗、活疫苗、经修饰的活疫苗、灭活疫苗、减毒疫苗、或亚单位疫苗。

10.如权利要求1-9任一项所述的疫苗组合物，该疫苗组合物还可以包含至少一种额外的抗原，至少一种额外的抗原保护性地抵御可以引起哺乳动物疾病的微生物。

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