CN112608908B - 重组新型冠状病毒刺突蛋白受体结合区9型腺相关病毒的构建方法 - Google Patents

重组新型冠状病毒刺突蛋白受体结合区9型腺相关病毒的构建方法 Download PDF

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Abstract

重组新型冠状病毒刺突蛋白受体结合区9型腺相关病毒的构建方法：将2段RBD序列用柔性Linker串联连接，再在前面加上tPA分泌表达信号肽，以BamHI和SalI两个酶切位点，插入pAAV‑MCS表达载体。本发明构建的重组RBD蛋白分泌表达的重组9型腺相关病毒载体及其细胞株，能够用于预防新型冠状病毒2019‑nCoV病毒载体疫苗，满足当前预防新型冠状病毒2019‑nCoV疫苗的急需，在进一步安全实验验证的前提下，可望大面积推广，对人类实现长期有效的免疫保护。

Description

重组新型冠状病毒刺突蛋白受体结合区9型腺相关病毒的构 建方法
技术领域
本发明涉及用于表达新型冠状病毒刺突蛋白受体结合区(RBD)的重组表达病毒载体和重组9型腺相关病毒及其制备方法，进一步涉及含有表达新型冠状病毒刺突蛋白受体结合区的重组腺相关病毒载体的用于预防新型冠状病毒2019-nCoV的疫苗。
背景技术
2019-2020年，新型冠状病毒2019-nCoV在全球爆发，针对该新型冠状病毒的治疗药物和疫苗成为研发的焦点。2019-nCoV是正链RNA病毒，属于冠状病毒家族，之前从未在人体见诸报道。2019-nCoV感染人体后，会导致肺部感染，严重的导致死亡。目前的研究表明，2019-nCoV通过其刺突糖蛋白上的受体结合区(RBD)与人体细胞受体血管紧张素转换酶2(ACE2)结合，从而引发病毒对体细胞的入侵。因此，RBD区成为新冠病毒治疗药物和疫苗开发的重要靶点。在疫苗的实际应用中，保护期是一项重要的指标，腺相关病毒在感染人体后，可在人体持续表达8年以上，将腺相关病毒用于疫苗的开发具有很好的前景。本发明涉及一种分泌型表达重组RBD蛋白的重组9型腺相关病毒的构建及病毒包装纯化，可在感染细胞后，将表达的重组RBD蛋白分泌到细胞培养上清中，可应用于2019-nCoV病毒载体疫苗的开发。
发明内容
本发明目的是构建能够将重组RBD蛋白分泌表达的重组9型腺相关病毒载体及其细胞株，进一步提供一种用于预防新型冠状病毒2019-nCoV病毒载体疫苗。
本发明的目的是这样实现的：一种表达新型冠状病毒刺突蛋白受体结合区的重组腺相关病毒，其特征在于：由pAAV-MCS表达载体中插入tPA分泌信号肽连接的双RBD基因构成。
本发明的目的还可以这样实现：所述的重组腺相关病毒为重组9型腺相关病毒-tPA分泌信号肽连接的双RBD基因。
所述的双RBD基因由柔性Linker连接。
本发明所述的重组腺相关病毒采用如下方法制备而成：将2段RBD序列用柔性Linker串联连接，再在前面加上tPA分泌表达信号肽，以BamH I和Sal I两个酶切位点，插入pAAV-MCS表达载体。
本发明提供一种表达新型冠状病毒刺突蛋白受体结合区的重组腺相关病毒转染的细胞株，其特征在于：含有pAAV-MCS表达载体中插入tPA分泌信号肽连接的双RBD基因。
本发明提供一种用于预防新型冠状病毒2019-nCoV的疫苗，其特征在于：含有权利要求1-4其中之一所述的表达新型冠状病毒刺突蛋白受体结合区的重组腺相关病毒。
本发明一种表达新型冠状病毒刺突蛋白受体结合区的重组腺相关病毒的制备方法，其特征在于：将2段RBD序列用柔性Linker串联连接，再在前面加上tPA分泌表达信号肽，以BamH I和Sal I两个酶切位点，插入pAAV-MCS表达载体；具体步骤为：
1)重组表达质粒的构建：将合成的插入基因和pAAV-MCS载体分别用BamH I和SalI双酶切后，回收连接，转化大肠杆菌DH5α感受态，涂布Kana抗体的LB培养基，筛选阳性克隆，鉴定后送出测序；
2)重组表达质粒转染细胞后并验证：a)接种HEK293细胞至24孔板，4-5万细胞/孔；b)接种第二天换液，2h后用Lipofectamine 3000按0.5μg/孔转染重组质粒至细胞中；c)37℃，5％CO2孵育6h；d)换液，继续培养24-48h；e)分别收集24小时后细胞裂解物和细胞培养上清，以及48小时后细胞培养上清，用抗RBD单抗Western Blot检测；
3)重组表达质粒的大量提取：将重组表达质粒、pAAV-RC9、pAAV-Help大量培养后，按质粒大提试剂盒的步骤进行，最后测定质粒浓度，并用Sma I酶切重组表达质粒，以验证该质粒的完整性。
本发明一种用于预防新型冠状病毒2019-nCoV的疫苗的制备方法，其特征在于：制备步骤如下：
第一步，重组9型腺相关病毒-RBD的制备
1)重组表达质粒的构建：将合成的插入基因和pAAV-MCS载体分别用BamH I和SalI双酶切后，回收连接，转化大肠杆菌DH5α感受态，涂布Kana抗体的LB培养基，筛选阳性克隆，鉴定后送出测序；
2)重组表达质粒转染细胞后并验证：a)接种HEK293细胞至24孔板，4-5万细胞/孔；b)接种第二天换液，2h后用Lipofectamine 3000按0.5μg/孔转染重组质粒至细胞中；c)37℃，5％CO2孵育6h；d)换液，继续培养24-48h；e)分别收集24小时后细胞裂解物和细胞培养上清，以及48小时后细胞培养上清，用抗RBD单抗Western Blot检测；
3)重组表达质粒的大量提取：将重组表达质粒、pAAV-RC9、pAAV-Help大量培养后，按质粒大提试剂盒的步骤进行，最后测定质粒浓度，并用Sma I酶切重组表达质粒，以验证该质粒的完整性；
第二步，重组9型腺相关病毒-RBD的包装
1)接种HEK293细胞至10cm培养皿中，密度为40000cell/cm2；
2)培养24h后，对其中一皿细胞计数；
3)按1μg质粒/100万细胞，计算需转染细胞的质粒总量；
4)重组表达质粒、pAAV-RC9、pAAV-Help三种质粒按照质量比1:1:1，确定各质粒的用量；
5)FectoVIR-AAV用量和转染质粒总量按照1μL:1μg的比例，确定FectoVIR-AAV的用量；
6)将确定用量的三种质粒加入0.5mL高糖DMEM培养基中，涡旋3-4s混匀；
7)将确定好用量的FectoVIR-AAV加入6)中，涡旋3-4s混匀；
8)室温孵育30min后，滴入HEK293细胞中；
9)37℃，5％ CO2孵育72h。
第三步，重组9型腺相关病毒-RBD的纯化
1)分别收集第二步9)的细胞培养上清和细胞；
2)将收集的细胞用1mL PBS重悬；
3)将重悬的细胞放入液氮和室温，反复冻融3次，每次融化后剧烈震荡2min，以破碎细胞，释放病毒；
4)将反复冻融的细胞在4℃，12000rpm离心10min，收集裂解物上清；
5)将4)中裂解物上清并入1)中细胞培养上清中，即为收获的重组AAV病毒粗制品；
6)按50U/mL加入Benzonase至5)中，去除未包装残余DNA；
7)37℃孵育30min，每10min翻转以确保Benzonase混合均匀；
8)4℃，12000rpm离心20min，取上清；
9)上清用0.45μm滤器过滤，放入新管；
10)将上述上清放入超速离心管，进行密度梯度离心(碘克沙醇)；
11)称重配平后，301580g，12℃，离心1h 40min；
12)收集病毒液透明部分，脱盐、浓缩；
13)纯化后的重组9型腺相关病毒-RBD和对照病毒分别用AAVpro Titration KitVer.2检测病毒滴度，按说明书进行Q-PCR检测；纯化后的重组9型腺相关病毒-RBD经试剂盒检测，病毒液滴度为2.05×1013v.g/mL。
第四步，重组9型腺相关病毒-RBD感染细胞后的表达验证和用于疫苗的细胞株筛选按照下述步骤对重组9型腺相关病毒-RBD感染细胞后的表达效果进行验证并筛选其中表达强的重组9型腺相关病毒-RBD感染细胞株及其上清液制备出疫苗。
1)接种HeLa细胞至24孔板，4-5万细胞/孔；
2)接种第二天，将纯化的重组9型腺相关病毒-RBD稀释至5×106v.g/mL，按每孔10μL加入24孔板细胞中；
3)37℃，5％ CO2孵育48h；
4)分别收集细胞培养上清和细胞裂解物，用抗RBD单抗Western Blot检测，结果显示：插入片段在合成后，连入pAAV-MCS，重组质粒经检验，序列正确。
通过Western Blot检测，2号克隆和4号克隆的重组质粒在转染24小时后，细胞裂解物和细胞培养上清中都检测到重组RBD的表达，同时在转染48小时后的细胞培养上清中也检测到重组RBD的表达，且此时细胞培养上清中重组RBD表达更强。
在用重组9型腺相关病毒-RBD感染HeLa细胞后，经Western Blot检验，由2号克隆包装的重组病毒感染组，48h后在细胞裂解物和细胞培养上清中均检测到重组RBD的表达，且在细胞培养上清中，表达量远远高于细胞裂解物；2号克隆质粒表达和包装成重组病毒的表达均显示，重组RBD蛋白序列、结构正确，在柔性Linker的连接下，前后2段无影响；tPA信号肽正常工作，重组RBD蛋白大部分以分泌表达的形式进入细胞培养上清。
本发明通过将2段RBD序列用柔性Linker串联，并在前端构建tPA信号肽后，构建到腺相关病毒表达载体pAAV-MCS，测序正确。将该重组质粒转染HEK293细胞后，用RBD的特异抗体，在细胞内和培养上清中均检测到了重组RBD蛋白的表达，大小正确。在HEK293细胞中包装腺相关病毒，将该重组质粒、pAAV-RC9(提供9型腺相关病毒rep和cap基因)和pAAV-Help(提供腺相关病毒包装所需的腺病毒基因)共转，72小时候后收集培养上清和细胞裂解物，纯化后检测病毒滴度，以MOI为1感染HeLa细胞，48小时后用RBD特异抗体分别检测细胞裂解物和培养上清，在培养上清中检测到了重组RBD的高表达，大小正确。可用于下一步感染动物后，检测血清中的免疫效价。
有益效果：该重组腺相关病毒的构建，和初步开发的新型冠状病毒2019-nCoV的腺相关病毒载体疫苗，可满足当前预防新型冠状病毒2019-nCoV疫苗的急需，防止病毒对全球人类的大面积感染，具有较高的应用价值。在进一步安全实验验证的前提下，可望大面积推广，对人类实现长期有效的免疫保护。
附图说明
图1插入区图解示意图
图2重组质粒转染细胞后的表达验证
图3重组9型腺相关病毒-RBD感染细胞后的表达验证
具体实施方式
参见图1：
本发明所述的插入基因：两个新型冠状病毒刺突蛋白受体结合区RBD区用柔性Linker连接，再在前面加上tPA分泌表达信号肽，以BamH I和Sal I两个酶切位点，插入pAAV-MCS表达载体。基因序列定义：tPA分泌信号肽连接的双RBD基因。重组后终产品：重组9型腺相关病毒-tPA分泌信号肽连接的双RBD基因。
参见图2：
1.1号克隆，转染24小时，细胞裂解物；
2.2号克隆，转染24小时，细胞裂解物；
3.3号克隆，转染24小时，细胞裂解物；
4.4号克隆，转染24小时，细胞裂解物；
5.阴性对照，转染24小时，细胞裂解物；
6.EGFP对照，2转染24小时，细胞裂解物；
7.1号克隆，转染48小时，细胞培养上清；
8.2号克隆，转染48小时，细胞培养上清；
9.阴性对照，转染24小时，细胞培养上清；
10.1号克隆，转染24小时，细胞培养上清；
11.2号克隆，转染24小时，细胞培养上清；
12.3号克隆，转染24小时，细胞培养上清；
13.4号克隆，转染24小时，细胞培养上清；
14.阴性对照，转染24小时，细胞培养上清；
15.EGFP对照，转染24小时，细胞培养上清；
16.3号克隆，转染48小时，细胞培养上清；
17.4号克隆，转染48小时，细胞培养上清；
18.EGFP对照，转染48小时，细胞培养上清。
参见图3：
1,2：1号病毒，感染48小时，细胞裂解物；
3,4：2号病毒，感染48小时，细胞裂解物；
5,6：3号病毒，感染48小时，细胞裂解物；
7,8：4号病毒，感染48小时，细胞裂解物；
9：AAV9-EGFP对照病毒，感染48小时，细胞裂解物；
10：1号病毒，感染48小时，细胞培养上清；
11,12：2号病毒，感染48小时，细胞培养上清；
13,14：3号病毒，感染48小时，细胞培养上清；
15,16：4号病毒，感染48小时，细胞培养上清；
17,18：AAV9-EGFP对照病毒，感染48小时，细胞培养上清。
本发明下述符号含义中英文对照：
pAAV-RC9：AAV系统质粒，血清型9型；
pAAV-MCS：过表达AAV质粒；
pAAV-Help：AAV系统质粒。
下面详述本发明重组新型冠状病毒刺突蛋白受体结合区9型腺相关病毒的构建方法。
1.材料与方法：
1.1研究对象：新型冠状病毒刺突蛋白RBD，重组9型腺相关病毒。
1.2插入基因由苏州泓迅生物科技有限公司合成。
HEK293细胞、HeLa细胞：购买于ATCC。
pAAV-MCS、pAAV-RC9、pAAV-Help：购买于生物风公司。
1.3试剂：
培养基：DMEM(GIBCO，#11995500BT)+10％胎牛血清(GIBCO，#10099)+1％双抗(GIBCO，#15240)
抗RBD单抗(Sino Biological公司，#HD14SE0224)
转染试剂Lipofectamine 3000(Thermo Fisher公司，#L3000001)
三质粒转染试剂FectoVIR-AAV(Polyplus公司，#120-010)
质粒大提试剂盒(QIAGEN，#12391)
AAV滴度检测试剂盒AAVpro Titration Kit(for Real Time PCR)Ver.2(TaKaRa，#6233)Benzonase(Sigma，#E1014-25KU)
碘克沙醇(Sigma，#D1556)
1.4实验流程：
1.4.1重组表达质粒的构建
将合成的插入基因(见图1)和pAAV-MCS载体分别用BamH I和Sal I双酶切后，回收连接，转化大肠杆菌DH5α感受态，涂布Kana抗体的LB培养基，筛选阳性克隆，鉴定后送出测序。
1.4.2重组表达质粒转染细胞后的验证
1)接种HEK293细胞至24孔板，4-5万细胞/孔；
2)接种第二天换液，2h后用Lipofectamine 3000按0.5μg/孔转染重组质粒至细胞中；
3)37℃，5％ CO2孵育6h；
4)换液，继续培养24-48h；
5)分别收集24小时后细胞裂解物和细胞培养上清，以及48小时后细胞培养上清，用抗RBD单抗Western Blot检测。
1.4.3重组表达质粒的大量提取
将重组表达质粒、pAAV-RC9、pAAV-Help大量培养后，按质粒大提试剂盒的步骤进行，最后测定质粒浓度，并用Sma I酶切重组表达质粒，以验证该质粒的完整性。
1.4.4重组9型腺相关病毒-RBD的包装
1)接种HEK293细胞至10cm培养皿中，密度为40000cell/cm2；
2)培养24h后，对其中一皿细胞计数；
3)按1μg质粒/100万细胞，计算需转染细胞的质粒总量；
4)重组表达质粒、pAAV-RC9、pAAV-Help三种质粒按照质量比1:1:1，确定各质粒的用量；
5)FectoVIR-AAV用量和转染质粒总量按照1μL:1μg的比例，确定FectoVIR-AAV的用量；
6)将确定用量的三种质粒加入0.5mL高糖DMEM培养基中，涡旋3-4s混匀；
7)将确定好用量的FectoVIR-AAV加入6)中，涡旋3-4s混匀；
8)室温孵育30min后，滴入HEK293细胞中；
9)37℃，5％ CO2孵育72h。
1.4.5重组9型腺相关病毒-RBD的初步纯化
1)分别收集1.4.4中9)步的细胞培养上清和细胞；
2)将收集的细胞用1mL PBS重悬；
3)将重悬的细胞放入液氮和室温，反复冻融3次，每次融化后剧烈震荡2min，以破碎细胞，释放病毒；
4)将反复冻融的细胞在4℃，12000rpm离心10min，收集裂解物上清；
5)将4)中裂解物上清并入1)中细胞培养上清中，即为收获的重组AAV病毒粗制品；
6)按50U/mL加入Benzonase至5)中，去除未包装残余DNA；
7)37℃孵育30min，每10min翻转以确保Benzonase混合均匀；
8)4℃，12000rpm离心20min，取上清；
9)上清用0.45μm滤器过滤，放入新管；
10)将上述上清放入超速离心管，进行密度梯度离心(碘克沙醇)；
11)称重配平后，301580g，12℃，离心1h 40min；
12)收集病毒液(透明部分)，脱盐、浓缩。
1.4.6重组9型腺相关病毒-RBD滴度测定
纯化后的重组9型腺相关病毒-RBD和对照病毒分别用AAVpro Titration KitVer.2检测病毒滴度，按说明书进行Q-PCR检测。
1.4.7重组9型腺相关病毒-RBD感染细胞后的表达验证
1)接种HeLa细胞至24孔板，4-5万细胞/孔；
2)接种第二天，将纯化的重组9型腺相关病毒-RBD稀释至5×106v.g/mL，按每孔10μL加入24孔板细胞中；
3)37℃，5％ CO2孵育48h；
4)分别收集细胞培养上清和细胞裂解物，用抗RBD单抗Western Blot检测。
2.结果与讨论
2.1插入片段在合成后，连入pAAV-MCS，重组质粒经检验，序列正确。
2.2通过Western Blot检测，重组质粒(2号克隆和4号克隆)在转染24小时后，细胞裂解物和细胞培养上清中都检测到重组RBD的表达，同时在转染48小时后的细胞培养上清中也检测到重组RBD的表达，且此时细胞培养上清中重组RBD表达更强，大小与预期一致(见图2)。
2.3纯化后的重组9型腺相关病毒-RBD经试剂盒检测，得到滴度大约为2.05×1013v.g/mL的病毒液2mL。
2.4在用重组9型腺相关病毒-RBD感染HeLa细胞后，经Western Blot检验，由2号克隆包装的重组病毒感染组，48h后在细胞裂解物和细胞培养上清中均检测到重组RBD的表达，且在细胞培养上清中，表达量远远高于细胞裂解物(见图3)。4号克隆组在细胞培养上清中虽然检测到了重组RBD的表达，但是表达量较低，不能排除是未去除干净的4号克隆质粒所引起的表达，而非重组病毒。
2.5 2号克隆质粒表达和包装成重组病毒的表达均显示，重组RBD蛋白序列、结构正确，在柔性Linker的连接下，前后2段无影响；tPA信号肽正常工作，重组RBD蛋白大部分以分泌表达的形式进入细胞培养上清。以上结果证明，可开发出一种高效病毒疫苗用于预防新型冠状病毒2019-nCoV。
本发明基于以下设计思路：1)为了获得RBD的高表达，将2个RBD串联表达，实验结果证明正确；2)为了2个RBD串联表达的同时，不影响RBD的结构，在2个RBD中间加上柔性Linker，以确保结构正确；3)为了在成为疫苗后，保护期足够长，我们选择AAV病毒载体，因其已证实在人体内可正常表达8年以上；4)为了能够做到疫苗喷雾式鼻腔免疫，我们优选用AAV9病毒，因其只要感染进入细胞，就能高表达；5)因AAV9在人体大多器官都能高表达，我们选择在表达的抗原前加上tPA分泌信号肽，让抗原能够分泌出细胞，实现体液免疫。现实是能够到免疫细胞的病毒毕竟是少数，所以指望细胞免疫不现实。并且tPA信号肽在抗原分泌出细胞后，能被切除，所以不影响抗原免疫效率。
本发明是一种新的新冠病毒刺突蛋白受体结合区(RBD)重组表达的形式。将2个RBD区用Linker串联，并加上tPA信号肽，之后连入腺相关病毒表达载体，并包装为重组9型腺相关病毒(AAV9-RBD)。经实验验证(特异抗体的Western Blot检测)，重组腺相关表达载体在真核细胞中正确表达，且可以分泌到细胞培养上清中；AAV9-RBD在感染HeLa细胞后，在细胞培养上清检测到了重组蛋白的高表达，同时细胞裂解物中表达量较低，重组蛋白基本都分泌到培养上清中。基于AAV9-RBD的表达情况，可制备出一种用于新冠病毒的疫苗，满足全球新型冠状病毒的预防感染的急需。

Claims (6)

1.重组新型冠状病毒刺突蛋白受体结合区9型腺相关病毒，其特征在于：由pAAV-MCS表达载体中插入tPA分泌信号肽连接的双RBD基因构成，所述的双RBD基因由柔性Linker连接。
2.根据权利要求1所述的重组新型冠状病毒刺突蛋白受体结合区9型腺相关病毒，其特征在于：采用如下方法制备而成：将2段RBD序列用柔性Linker串联连接，再在前面加上tPA分泌表达信号肽，以BamH I和Sal I两个酶切位点，插入pAAV-MCS表达载体。
3.权利要求1或2所述的重组新型冠状病毒刺突蛋白受体结合区9型腺相关病毒转染的细胞株，其特征在于：含有pAAV-MCS表达载体中插入tPA分泌信号肽连接的双RBD基因。
4.一种用于预防新型冠状病毒2019-nCoV的疫苗，其特征在于：含有权利要求1-2其中之一所述的重组新型冠状病毒刺突蛋白受体结合区9型腺相关病毒。
5.一种重组新型冠状病毒刺突蛋白受体结合区9型腺相关病毒的制备方法，其特征在于：将2段RBD序列用柔性Linker串联连接，再在前面加上tPA分泌表达信号肽，以BamH I和Sal I两个酶切位点，插入pAAV-MCS表达载体；具体步骤为：
1)重组表达质粒的构建：将合成的插入基因和pAAV-MCS载体分别用BamH I和Sal I双酶切后，回收连接，转化大肠杆菌DH5α感受态，涂布Kana抗体的LB培养基，筛选阳性克隆，鉴定后送出测序；所述合成的插入基因为tPA分泌信号肽连接的双RBD基因，所述的双RBD基因由柔性Linker连接；
2)重组表达质粒转染细胞后并验证：a)接种HEK293细胞至24孔板，4-5万细胞/孔；b)接种第二天换液，2h后用Lipofectamine 3000按0.5μg/孔转染重组质粒至细胞中；c)37℃，5％CO2孵育6h；d)换液，继续培养24-48h；e)分别收集24小时后细胞裂解物和细胞培养上清，以及48小时后细胞培养上清，用抗RBD单抗Western Blot检测；
3)重组表达质粒的大量提取：将重组表达质粒、pAAV-RC9、pAAV-Help大量培养后，按质粒大提试剂盒的步骤进行，最后测定质粒浓度，并用Sma I酶切重组表达质粒，以验证该质粒的完整性。
6.一种用于预防新型冠状病毒2019-nCoV的疫苗的制备方法，其特征在于：制备步骤如下：
第一步，重组9型腺相关病毒-RBD的制备
1)重组表达质粒的构建：将合成的插入基因和pAAV-MCS载体分别用BamH I和Sal I双酶切后，回收连接，转化大肠杆菌DH5α感受态，涂布Kana抗体的LB培养基，筛选阳性克隆，鉴定后送出测序；所述合成的插入基因为tPA分泌信号肽连接的双RBD基因，所述的双RBD基因由柔性Linker连接；
2)重组表达质粒转染细胞后并验证：a)接种HEK293细胞至24孔板，4-5万细胞/孔；b)接种第二天换液，2h后用Lipofectamine 3000按0.5μg/孔转染重组质粒至细胞中；c)37℃，5％CO2孵育6h；d)换液，继续培养24-48h；e)分别收集24小时后细胞裂解物和细胞培养上清，以及48小时后细胞培养上清，用抗RBD单抗Western Blot检测；
3)重组表达质粒的大量提取：将重组表达质粒、pAAV-RC9、pAAV-Help大量培养后，按质粒大提试剂盒的步骤进行，最后测定质粒浓度，并用Sma I酶切重组表达质粒，以验证该质粒的完整性；
第二步，重组9型腺相关病毒-RBD的包装
1)接种HEK293细胞至10cm培养皿中，密度为40000cell/cm2；
2)培养24h后，对其中一皿细胞计数；
3)按1μg质粒/100万细胞，计算需转染细胞的质粒总量；
4)重组表达质粒、pAAV-RC9、pAAV-Help三种质粒按照质量比1:1:1，确定各质粒的用量；
5)FectoVIR-AAV用量和转染质粒总量按照1uL:1ug的比例，确定FectoVIR-AAV的用量；
6)将确定用量的三种质粒加入0.5mL高糖DMEM培养基中，涡旋3-4s混匀；
7)将确定好用量的FectoVIR-AAV加入6)中，涡旋3-4s混匀；
8)室温孵育30min后，滴入HEK293细胞中；
9)37℃，5％CO2孵育72h；
第三步，重组9型腺相关病毒-RBD的纯化
1)分别收集第二步9)的细胞培养上清和细胞；
2)将收集的细胞用1mL PBS重悬；
3)将重悬的细胞放入液氮和室温，反复冻融3次，每次融化后剧烈震荡2min，以破碎细胞，释放病毒；
4)将反复冻融的细胞在4℃，12000rpm离心10min，收集裂解物上清；
5)将4)中裂解物上清并入1)中细胞培养上清中，即为收获的重组AAV病毒粗制品；
6)按50U/mL加入Benzonase至5)中，去除未包装残余DNA；
7)37℃孵育30min，每10min翻转以确保Benzonase混合均匀；
8)4℃，12000rpm离心20min，取上清；
9)上清用0.45μm滤器过滤，放入新管；
10)将上述上清放入超速离心管，进行碘克沙醇密度梯度离心；
11)称重配平后，301580g，12℃，离心1h 40min；
12)收集病毒液透明部分，脱盐、浓缩；
13)纯化后的重组9型腺相关病毒-RBD和对照病毒分别用AAVpro Titration KitVer.2检测病毒滴度，按说明书进行Q-PCR检测；纯化后的重组9型腺相关病毒-RBD经试剂盒检测，病毒液滴度为2.05×1013v.g/mL；
第四步，重组9型腺相关病毒-RBD感染细胞后的表达验证和用于疫苗的细胞株筛选按照下述步骤对重组9型腺相关病毒-RBD感染细胞后的表达效果进行验证并筛选其中表达强的重组9型腺相关病毒-RBD感染细胞株及其上清液制备出疫苗；
1)接种HeLa细胞至24孔板，4-5万细胞/孔；
2)接种第二天，将纯化的重组9型腺相关病毒-RBD稀释至5×106v.g/mL，按每孔10μL加入24孔板细胞中；
3)37℃，5％CO2孵育48h；
4)分别收集细胞培养上清和细胞裂解物，用抗RBD单抗Western Blot检测。
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