WO2021060824A1 - 중증열성혈소판감소증후증 바이러스에 대한 백신 조성물 - Google Patents

중증열성혈소판감소증후증 바이러스에 대한 백신 조성물 Download PDF

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extracellular domain
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vaccine
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조남혁
강준구
전경석
최훈철
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서울대학교 산학협력단
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Definitions

  • the present invention relates to a vaccine composition against a vaccine composition against severe febrile thrombocytopenia syndrome virus.
  • Severe fever with thrombocytopenia syndrome is an infectious disease caused by infection with the SFTS virus (SFTSV). Since it was first reported in China in 2009, it has been reported in Asian countries such as China, Korea, Japan, and Vietnam. SFTSV has three segmented RNAs as its genome, and each encodes RNA polymerase (RdRp), two outer membrane glycoproteins (Gn, Gc), and nucleocapsid (NP) and non-structural protein (NS).
  • RdRp RNA polymerase
  • Gn, Gc two outer membrane glycoproteins
  • NP nucleocapsid
  • NS non-structural protein
  • SFTS vaccine development is in the early stages of research, and recent reports have confirmed that vaccines or DNA vaccines using recombinant viral vectors can provide protective immunity in infected animal models ( NPJ Vac cines 2019, 4, 5, doi. :10.1038/s41541-018-0096-y; Nat Commun 2019, 10, 3836, doi:10.1038/s41467-019-11815-4). It was confirmed that the vaccine using NS protein induced antibody production, but did not provide protective immunity in the mouse infection model ( Viral Immunol 2015, 28, 113-122, doi:10.1089/vim.2014.0100).
  • the present invention discloses the vaccine efficacy of Gn protein, Gc protein, and NP protein.
  • An object of the present invention is to provide a vaccine composition against SFTS virus using Gn protein, Gc protein, and NP protein.
  • Gn-Fc and Gc-Fc recombinant proteins
  • NP proteins full-length sequence
  • mice immunized with the NP protein survived, each having a significant protective immunity providing effect.
  • the vaccine composition of the present invention comprises an extracellular domain of a Gc protein, an extracellular domain of a Gn protein, a full-length NP protein, or a mixture of two or more thereof as an active ingredient, It relates to a vaccine composition against SFTS virus.
  • the extracellular domain of the Gc protein or the extracellular domain of the Gn protein may be in a form fused to the human antibody Fc region in order to improve half-life in vivo. Hinge sequences with 2 to 15 amino acids can be posted so as not to interfere with the formation of the three-dimensional structure.
  • a signal peptide sequence may be located at the N-terminus in order to facilitate separation and purification as in the following examples. Since these sequences are removed and lost when the protein is secreted outside the cell, it does not exist in the isolated/purified protein.
  • the vaccine refers to the prevention of infection or reinfection of the pathogen by inducing an immune response to the pathogen in a host, reducing the severity of symptoms or eliminating symptoms caused by the pathogen, or by the pathogen or the pathogen. It is meant to include substantial or complete elimination of the disease. Therefore, the vaccine composition of the present invention may be prophylactically administered to a person before infection with the corresponding pathogen, or may be therapeutically administered to a person after infection with the corresponding pathogen.
  • the "immune response” is meant to include a humoral immune response, a cellular immune response, or both.
  • the active ingredient refers to a component capable of inducing an immune response by itself or together with a carrier that cannot induce an immune response by itself. Therefore, the active ingredient does not necessarily have to be immunogenic (the ability to induce an immune response) by itself.
  • the active ingredient is not essential, but it is preferably purified.
  • purified refers to a state in which the cell component of the original organism (ie, the transformed microorganism in the present invention) or the culture medium component (which is a contaminant) in which the target substance exists is substantially reduced or removed.
  • a state in which contaminants are substantially reduced or removed means a purity of at least 50%, preferably at least 90%, and more preferably at least 99%. Purity may be evaluated through methods known in the art such as chromatography, gel electrophoresis, and immunological analysis, and methods known in the art may be used as the purification method is also followed.
  • the vaccine composition of the present invention may be prepared in any suitable, pharmaceutically acceptable formulation.
  • it can be prepared in the form of a ready-to-dosing solution or suspension, a concentrated stock solution suitable for dilution prior to administration, or in a reconstitutable form such as lyophilized, freeze-dried, or frozen preparation.
  • the vaccine composition of the present invention may be formulated including a pharmaceutically acceptable carrier.
  • Pharmaceutically acceptable carriers that can be used for the formulation of vaccine compositions are listed and defined in the Korean Pharmacopoeia or the Pharmacopoeia in other countries, particularly in the United States, Japan, and Europe, and reference can be made to these pharmacopeias.
  • Such carriers will usually contain diluents, excipients, stabilizers, preservatives, and the like.
  • Suitable diluents include non-aqueous solvents such as propylene glycol, polyethylene glycol, olive oil, vegetable oils such as peanut oil, saline (preferably 0.8% saline), water containing a buffer medium (preferably 0.05M phosphate buffer), etc.
  • Aqueous solvents, etc., and suitable excipients include starch, glucose, lactose, sucrose, gelatin, malt, rice, wheat flour, chalk, silica gel, sodium stearate, glycerol monostearate, talc, sodium chloride, anhydrous skim milk.
  • Glycerol, propylene, glycol, water, ethanol, etc., and suitable stabilizers include carbohydrates such as sorbitol, mannitol, starch, sucrose, dextran, glutamate, and glucose, and animal and vegetable products such as milk powder, serum albumin, and casein. Or a protein such as a microbial protein may be mentioned.
  • suitable preservatives include thimerosal, merthiolate, gentamicin, neomycin, nystatin, amphotericin B, tetracycline, penicillin, streptomycin, polymyxin B, and the like.
  • the vaccine composition of the present invention may further include an antigen adjuvant.
  • the antigen adjuvant may be made of one or more substances that enhance the immune response to the antigen. Adjuvants can function as tissue reservoirs that slowly release antigens and/or as lymphoid system activators that nonspecifically enhance the immune response (Hood et al., Immunology, Second Ed., 1984, benjamin/Cummings: Menlo Park , California, p.384).
  • Antigen adjuvants include, for example, complete Freund, incomplete Freund, saponins, gelatinous aluminum adjuvants, surface active substances (e.g., lysolecithin, fluron glycol, polyanions, peptides, oils or hydrocarbon emulsions, etc.), vegetable oils. (Cottonseed oil, peanut oil, corn oil, etc.), vitamin E acetate, and the like.
  • aluminum adjuvants are the most widely used, and these aluminum adjuvants are used as the gel properties of aluminum salts such as aluminum phosphate, potassium aluminum sulfate, and aluminum hydroxide. have. These aluminum adjuvants are generally known to elicit Th2-type immune responses to enhance vaccine effectiveness (Sokolovska A et al., Vaccine. 2007 Jun 6;25(23):4575-85; O'Hagan DT AND) Rappuoli R., Pharm Res. 2004 Sep;21(9):1519-30.) Invivogen's Alhydrogel® used in the examples of the present invention is a gel-like suspension of aluminum hydroxide.
  • Such aluminum adjuvants are known in the art for their preparation (R. Bomford. Immunological Adjuvants and Vaccines. NATO ASI Series 1989;179:35-41; Vogel FR AND Powell MF. Pharm Biotechnol. 1995; 6:141- 228.;Derek T. O'Hagan, Methods in Molecular Medicine. 2000; April 15; 42: 65-90) Directly manufactured and used, or commercially distributed products may be purchased and used. Commercially distributed products include Invivogen's Alhydrogel® 2% product used in the following examples, Sigma's Aluminum hydroxide Gel product, and BRENNTAG's AlhydrogelTM product.
  • the vaccine composition of the present invention can be prepared in arbitrary unit doses.
  • the unit dose refers to the amount of the active ingredient and a pharmaceutically acceptable carrier contained in a single product packaged for administration to a person more than once, and the appropriate amount of such an active ingredient and a carrier is the vaccine composition of the present invention.
  • this amount can be determined nonclinically and clinically within the ordinary skill of a person skilled in the art.
  • the vaccine composition of the present invention may be preferably administered parenterally, for example, rectal, transdermal, intravenous injection, intraarterial injection, intramuscular injection, intradermal injection, subcutaneous injection, intraperitoneal injection, intraventricular injection, and the like. .
  • the vaccine composition of the present invention can be administered in a controlled release system.
  • controlled release systems include liposomes, implantable osmotic pumps, transdermal patches, and the like.
  • the active ingredient is delivered in a liposome manner.
  • the delivery of the active ingredient by the liposome method see Langer, Science 249: 1527-1533 (1990), Treat at al., in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein and Fidler. (des.), Liss, New York, pp. 353-365 (1989)].
  • For other modes of delivery of active ingredients see Langer, supra; Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng.
  • the dosage of the vaccine composition of the present invention may be determined by a medical practitioner in consideration of patient characteristics such as age, weight, sex, symptoms, complications, and the presence or absence of other diseases.
  • time interval and frequency of administration may be determined in consideration of the half-life of the formulation or active ingredient in the blood.
  • the dosage and the time interval or frequency of administration depend on the judgment of the medical practitioner and should be determined by the individual, but the usual appropriate dosage will be determined within the range of about 0.1 to 10 mg per 1 kg of individual body weight per day, and the administration interval is 3 to 10 days, the number of administrations will be determined within the range of 1 to 5 times.
  • Each protein used as an active ingredient in the vaccine composition of the present invention can be prepared by DNA recombination techniques known in the art using a gene encoding it.
  • This method includes (i) preparing an expression vector containing a gene encoding each of the above proteins, (ii) transforming the expression vector into a host cell, (iii) culturing the transformed host cell, and finally (iv ) And separating and purifying each of the proteins from the culture.
  • Genes encoding each of the proteins are disclosed herein, and using these genes to produce each protein by DNA recombination technology, specifically, regulatory sequences such as promoters or terminators, signal peptide sequences, selection markers, etc.
  • the present invention can provide a vaccine composition against SFTS virus, comprising the extracellular domain of the Gc protein, the extracellular domain of the Gn protein, the full-length NP protein, or a mixture thereof as an active ingredient.
  • 1 is a view showing the structure and molecular weight of the active ingredient of the vaccine composition of the present invention, Gc protein, Gn protein, or NP protein.
  • Gc protein is a SDS-PAGE result of Gc protein, Gn protein or NP protein, which are active ingredients of the vaccine composition of the present invention.
  • Fig. 3 shows the results of specific antibody induction by Gn and Gc antigen immunity and virus neutralization test results using immune serum (a. Antibody titers against Gn and Gn proteins. b and c. Neutralization capacity analysis test against SFTS virus. FRNT) : focus reduction neutralization titer)
  • GenBank Using the amino acid information on GenBank, viral Gn protein, Gc protein, and NP protein to be used as vaccine antigens were produced.
  • Amino acid information on GenBank is GenBank ID: ATW63054.1 (Gn protein), GenBank ID: AOO85591.1 (Gc protein), GenBank ID: AJO16084.1 (NP protein).
  • Gn and Gc proteins used only the extracellular domain (SEQ ID NO: 1 and 2, respectively) excluding the signal peptide, transmembrane domain, and cytoplasmic domain, and the full-length sequence (SEQ ID NO: 3) was used for the NP protein.
  • the signal peptide gene (SEQ ID NO: 6) of the human Ig kappa light chain is fused to the N-terminal as shown in FIG.
  • the recombinant gene in which the IgG1 CH2-CH3 region Fc domain gene (SEQ ID NO: 7) was fused to the C-terminal via a hinge region (SEQ ID NO: 8) was cloned into a pCEP4 mammalian expression vector.
  • the gene encoding the NP protein (SEQ ID NO: 9) to which 6 His (used for purification) was linked to each of the N-terminal and C-terminal was cloned into the pET28a vector.
  • the cloned genes were introduced into HEK293T cells (Gn, Gc) and E.coli BL21 (NP), respectively, to induce protein expression, and were purified using Protein A/G column and Ni-NTA column, respectively. The size and purity of the purified protein were confirmed through SDS-PAGE (FIG. 2).
  • Gn-Fc (SEQ ID NO: 10, the N-terminal DVAQAA amino acid sequence is a sequence inserted for cloning)
  • Gc-Fc (SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 10, the N-terminal DVAQAA amino acid sequence is cloned Is a sequence inserted for)
  • NP SEQ ID NO: 12
  • mice The PBS-immunized mice (control group) gradually lost weight, and all died until the 6th day of infection.
  • the mice immunized with Fc control gradually lost weight from the second day of infection, and all died until the 5th day of infection.
  • Mice immunized with Gc-Fc started to lose weight from the 4th day of infection, and all died on the 8th day of infection.
  • Mice immunized with Gn-Fc started to lose weight from the 3rd day of infection, and half died until the 8th day of infection, but the remaining mice recovered their weight and survived.
  • Mice immunized with NP started to lose weight from the 3rd day of infection, and 40% died by the 8th day, and the remaining 60% of the mice gradually recovered their weight and survived.
  • mice The PBS-immunized mice (control group) gradually lost weight, and all died until the 6th day of infection.
  • Mice immunized with Gn+NP started to lose weight from the 4th day of infection, 14.3% died on the 5th day of infection, and 28.6% died until the 6th day of infection, but the rest of the mice recovered their weight and survived.
  • Mice immunized with Gc+NP began to lose weight on the 5th day of infection, and 14.3% died on the 6th day of infection, but the remaining mice recovered and survived.
  • Mice immunized with Gn+Gc+NP started to lose weight on the 4th day, and 42.9% died on the 7th day of infection, but the rest of the mice recovered their weight and survived.

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Abstract

본 발명은 SFTS 바이러스의 Gn 또는 Gc 단백질의 세포외 도메인(extracellular domain)이 사람 항체 Fc 부위에 융합된 재조합 단백질, NP 단백질(전장 서열의 단백질) 또는 이들의 혼합물이 제1형 인터페론 수용체 KO 생쥐에서 보호면역을 제공하는 실험 결과에 기초하여 Gn 또는 Gc 단백질이나 NP 단백질 또는 이들의 혼합물을 이용한 SFTS 바이러스에 대한 백신 조성물을 개시한다.

Description

중증열성혈소판감소증후증 바이러스에 대한 백신 조성물
본 발명은 중증열성혈소판감소증후증 바이러스에 대한 백신 조성물에 대한 백신 조성물에 대한 것이다.
중증열성혈소판감소증후증(Severe fever with thrombocytopenia syndrome, SFTS)은 SFTS virus(SFTSV) 감염에 의해 발생하는 감염질환이다. 2009년 중국에서 처음 보고된 이후로 중국, 한국, 일본, 베트남 등 아시아 국가들에서 발생이 보고되고 있다. SFTSV는 3개의 분절 RNA를 유전체로 보유하고 있으며, 각각 RNA 중합효소 (RdRp), 2개의 외막 당단백질(Gn, Gc), 그리고 뉴클레오캡시드(NP) 및 비구조단백질(NS)를 암호화하고 있다. 이 바이러스에 감염되면, 고열, 위장관 합병증, 백혈구 감소증, 혈소판 감소증을 동반하며, 치사율은 5~20%로 알려져 있다(Lancet Infect Dis 2018, 18, 1127-1137, doi:10.1016/S1473-3099(18)30293-7). 아직까지 치료제가 없으며, 백신 개발이 진행되고 있다.
SFTS 백신 개발은 초기 연구단계에 있으며, 최근 보고를 통해 재조합 바이러스 벡터를 이용한 백신이나 DNA 백신이 감염동물 모델에서 보호면역을 제공할 수 있다는 사실들이 확인되었다(NPJ Vaccines 2019, 4, 5, doi:10.1038/s41541-018-0096-y; Nat Commun 2019, 10, 3836, doi:10.1038/s41467-019-11815-4). NS 단백질을 이용한 백신은 항체 생성이 유도됨을 확인하였으나, 생쥐감염모델에서 보호면역을 제공하지 못하였다(Viral Immunol 2015, 28, 113-122, doi:10.1089/vim.2014.0100). NP와 NS 유전자를 암호화하는 DNA를 마이크로니들을 이용하여 면역하였을 때, 이 항원들에 특이적인 T 세포 반응이 유도된다는 사실도 보고되었으나, 동물감염 모델에서 보호면역을 제공하는지는 밝혀지지 않았다(Colloids Surf B Biointerfaces 2017, 159, 54-61, doi:10.1016/j.colsurfb.2017.07.059). 최근에 와서 Gn과 Gc 단백질을 발현하는 재조합 바이러스(live attenuated recombinant vesicular stomatitis virus, rVSV)를 1회 면역하였을 때, 중화항체 생성를 유도할 수 있으며, SFTSV가 치사량으로 감염된 제1형 인터페론 수용체 knock-out (KO) 생쥐에서 완벽한 보호면역을 유도한다는 논문이 보고되었다(NPJ Vaccines 2019, 4, 5, doi:10.1038/s41541-018-0096-y). 또한 SFTSV의 5개 유전자를 각각 발현하는 DNA를 같이 면역하였을 때, Gn 및 Gc를 암호화하는 DNA 두가지를 동시에 면역하였을 때, 그리고 NP, NS, RdRp를 암호화하는 세가지 DNA를 함께 면역하였을 때, SFTSV에 감수성이 있는 나이든 족제비(4년 이상)에서 치사감염에 대한 보호면역이 제공된다는 사실도 보고되었다(Nat Commun 2019, 10, 3836, doi:10.1038/s41467-019-11815-4). 그러나 아직까지 각각의 구조 단백질 (Gn, Gc, NP)을 개별 면역하였을 때, 어느 정도의 보호면역이 제공되는 지 보고된 바는 없으며, 이 단백질들을 이용한 아단위 단백질 백신의 효능에 관한 연구는 발표되지 않고 있다.
본 발명은 Gn 단백질, Gc 단백질, NP 단백질의 백신 효능을 개시한다.
본 발명의 목적은 Gn 단백질, Gc 단백질, NP 단백질을 이용한 SFTS 바이러스에 대한 백신 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적이나 구체적인 목적은 이하에서 제시될 것이다.
본 발명자들은 아래의 실시예에서 확인되는 바와 같이, Gn 또는 Gc 단백질의 세포외 도메인(extracellular domain)이 사람 항체 Fc 부위에 융합된 재조합 단백질(Gn-Fc 및 Gc-Fc)과 NP 단백질(전장 서열의 단백질)을 개별로 제1형 인터페론 수용체 KO 생쥐에 면역하고 보호면역을 제공할 수 있는지를 비교검증 하였다. 그 결과 Gc-Fc 단백질은 면역한 생쥐는 모두 사망하였으나, 대조군(Fc만 면역한 그룹)에 비하여 생존 시간이 통계학적으로 유의하게 증가하였으며, Gn-Fc 단백질을 면역한 생쥐는 50%가 생존하였고, NP 단백질을 면역한 생쥐는 60%가 생존하여 각각 유의한 보호 면역 제공 효과가 있음을 확인하였다. 또한 Gn-Fc 및 Gc-Fc와 NP를 혼합하여 제1형 인터페론 수용체 KO 생쥐에 면역하여 보호면역이 상승하는지를 살펴 봤을 때, Gc-Fc와 NP의 혼합 면역의 경우 80%가 생존하였고, Gn-Fc와 NP의 혼합 면역의 경우는 70%가 생존하였으며, Gn-Fc와 Gc-Fc 그리고 NP의 혼합 면역의 경우는 60% 생존하여 전체적으로 혼합 면역의 경우가 개별 면역의 경우보다 생존율이 향상됨을 확인하였다.
본 발명은 이러한 실험 결과에 기초하여 제공되는 것으로, 본 발명의 백신 조성물은 Gc 단백질의 세포외 도메인, Gn 단백질의 세포외 도메인, 전장의 NP 단백질 또는 이들의 둘 이상의 혼합물을 활성성분으로 포함하는, SFTS 바이러스에 대한 백신 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서, 특히 Gc 단백질의 세포외 도메인이나 Gn 단백질의 세포외 도메인은 생체 내 반감기를 향상시키기 위하여 사람 항체 Fc 부위에 융합된 형태일 수 있으며, Fc와 융합될 경우 각 융합되는 단백질이 서로 간에 3차원 구조 형성을 방해하지 않도록 2~15 아미노산을 가진 힌지(hinge) 서열이 게재될 수 있다. 또 이러한 단백질을 유전자 재조합 방식으로 숙주세포를 이용하여 생산하기 위해서는, 아래 실시예에서처럼 분리·정제를 용이하게 하기 위하여 신호 펩타이드(signal peptid) 서열이 N-말단에 위치할 수도 있다. 이러한 서열은 세포외로 해당 단백질이 분비될 때 제거되어 없어지기 때문에, 분리·정제된 단백질에서는 존재하지 않는다.
본 명세서에서, "백신"은 숙주인 사람에게서 해당 병원체에 대한 면역 반응을 유도함으로써 해당 병원체의 감염 또는 재감염의 예방, 해당 병원체에 의한 증상의 중증도 감소 또는 증상의 제거, 또는 해당 병원체나 그 병원체 의한 질환의 실질적 또는 완전한 제거를 포함하는 의미이다. 따라서 본 발명의 백신 조성물은 해당 병원체의 감염 전에 예방적으로 사람에게 투여되거나 해당 병원체의 감염 후에 치료적으로 사람에게 투여될 수 있다. 여기서 상기 "면역 반응"은 체액성 면역 반응, 세포성 면역 반응 또는 이들을 모두 포함하는 의미이다.
또 본 명세서에서, "활성성분"은 단독으로 면역 반응을 유도하거나 또는 그 자체로는 면역 반응을 유도할 수 없는 담체와 함께 면역 반응을 유도할 수 있는 성분을 의미한다. 따라서 활성성분은 스스로가 반드시 면역원성(면역 반응을 유도할 수 있는 능력)을 가질 필요는 없다. 본 발명에서 상기 활성성분은 필수적이지는 않지만 정제된 것이 바람직하다. 여기서 "정제된"은 그 대상 물질이 존재하는 원래의 유기체(즉 본 발명에서는 형질전환된 미생물)의 세포 성분 또는 그 배양액 성분 등(오염물임)이 실질적으로 감소되었거나 제거된 상태를 의미한다. 오염물이 실질적으로 감소되었거나 제거된 상태는 순도가 50% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 더 바람직하게는 99% 이상을 의미한다. 순도는 크로마토그래피, 겔 전기영동, 면역학적 분석 등 당업계에 공지된 방법을 통하여 평가될 수 있으며, 정제 방법도 후수하는 바와 같이 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있다.
본 발명의 백신 조성물은 임의의 적절한, 약학적으로 허용되는 제제로 제조될 수 있다. 예컨대 즉석 투여 용액 또는 현탁액 형태이거나, 투여 전 희석에 적절한 농축된 원액이거나, 또는 재구성 가능한 형태 예컨대 동결건조, 냉동-건조, 또는 냉동 제제 형태로 제조될 수 있다.
본 발명의 백신 조성물은 약학적으로 허용되는 담체를 포함하여 제제화될 수 있다. 백신 조성물의 제제화를 위하여 사용될 수 있는 약학적으로 허용되는 담체는 대한민국 약전이나 제외국의 약전 특히 미국, 일본, 유럽의 약전에 열거·규정되어 있으며, 이들 약전을 참조할 수 있다.
이러한 담체는 통상 희석제, 부형제, 안정화제, 방부제 등을 포함할 것이다. 적절한 희석제로서는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브유, 땅콩유와 같은 식물성유 등의 비수성 용매나 염수(바람직하게는 0.8%의 염수), 완충 매질을 포함한 물(바람직하게는 0.05M의 인산염 완충액) 등의 수성 용매 등을 들 수 있고, 적절한 부형제로서는 전분, 글루코스, 락토스, 수크로스, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 백악, 실리카 겔, 나트륨 스테아레이트, 글리세롤 모노스테아레이트, 활석, 나트륨 클로라이드, 무수 탈지유, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 물, 에탄올 등을 들 수 있으며, 적절한 안정화제로서는 소르비톨, 만니톨, 전분, 수크로스, 덱스트란, 글루타메이트, 글루코스 등의 탄수화물이나 분유, 혈청 알부민, 카제인 등의 동물성, 식물성 또는 미생물성 단백질 등의 단백질을 들 수 있다. 적절한 방부제로서는 티메로살, 메르티올레이트, 젠타마이신, 네오마이신, 니스타틴, 암포테리신 B, 테트라사이클린, 페니실린, 스트렙토마이신, 폴리믹신 B 등을 들 수 있다.
본 발명의 백신 조성물은 항원 보조제(adjuvant)를 추가로 포함할 수 있다. 항원 보조제는 항원에 대한 면역 반응을 증강시키는 하나 이상의 물질로 이루어진 것일 수 있다. 보조제는 항원을 서서히 방출시키는 조직 저장소로서 및/또는 면역 반응을 비특이적으로 증강시키는 임파성 시스템 활성자로서 기능할 수 있다(Hood et al., Immunology, Second Ed., 1984, benjamin/Cummings: Menlo Park, California, p.384). 항원 보조제는 예컨대 완전 프로인트(Freund), 불완전 프로인트, 사포닌, 겔 성상의 알루미늄 보조제, 표면 활성 물질(예: 리소레시틴, 플루론 글리콜, 다중 음이온, 펩티드, 오일 또는 탄화수소 에멀젼 등), 식물성 오일(면실유, 땅콩유, 옥수수유 등), 비타민 E 아세테이트 등일 수 있다.
현재 인체에 적용 가능한 항원 보조제 중에서 가장 널리 사용되고 있는 것은 알루미늄 보조제이며, 이러한 알루미늄 보조제는 인산알루미늄(Aluminum phosphate), Potassium aluminum sulfate, 수산화 알루미늄(Aluminum hydroxide) 등 알루미늄 염(Aluminium salts)의 겔 성상으로 사용되고 있다. 이러한 알루미늄 보조제는 일반적으로 Th2-type의 면역반응을 이끌어내어 백신 효과를 증강시키는 것으로 알려져 있다(Sokolovska A et al., Vaccine. 2007 Jun 6;25(23):4575-85; O'Hagan DT AND Rappuoli R., Pharm Res. 2004 Sep;21(9):1519-30.) 본 발명의 실시예에서 사용한 Invivogen사의 Alhydrogel®은 수산화 알루미늄(Aluminium hydroxide)의 겔 형태 현탁액(colloidal)이다. 이러한 알루미늄 보조제는 그 제조 방법이 당업계에 공지되어 있어(R. Bomford. Immunological Adjuvants and Vaccines. NATO ASI Series 1989;179:35-41; Vogel FR AND Powell MF. Pharm Biotechnol. 1995;6:141-228.;Derek T. O'Hagan, Methods in Molecular Medicine. 2000; April 15; 42: 65-90) 직접 제조하여 사용하거나, 상업적으로 유통되는 제품을 구입하여 사용할 수도 있다. 상업적으로 유통되는 제품으로서는 아래의 실시예에서 사용된 Invivogen사의 Alhydrogel® 2% 제품을 비롯하여 Sigma사의 Aluminum hydroxide Gel 제품, BRENNTAG사의 Alhydrogel™ 제품 등을 들 수 있다.
본 발명의 백신 조성물은 임의적 단위 용량으로 제조될 수 있다. 단위 용량은 사람에 1회 이상 투여되기 위한 용도로 포장된 낱개의 제품에 포함된 활성성분과 약학적으로 허용되는 담체의 양을 말하는 것으로, 이러한 활성성분과 담체의 적절한 양은 본 발명의 백신 조성물이 1회 이상 접종될 때 백신으로서 기능할 수 있는 양으로 이러한 양은 당업자의 통상의 능력 범위 내에서 비임상적 및 임상적으로 결정될 수 있다.
본 발명의 백신 조성물은 바람직하게는 비경구적으로 예컨대 직장, 경피, 정맥 내 주사, 동맥 내 주사, 근육 내 주사, 피 내 주사, 피하 주사, 복막 내 주사, 심실 내 주사 등을 통해 투여될 수 있다.
본 발명의 백신 조성물은 조절 방출 시스템으로 투여될 수 있다. 예컨대 그러한 조절 방출 시스템으로서는 리포좀, 이식 삼투성 펌프, 경피 패치 등의 방식 등을 들 수 있다. 바람직하게는 리포좀 방식으로 활성성분을 전달하는 경우이다. 리포좀 방식에 의해 활성성분을 전달하는 것과 관련해서는 문헌[Langer, Science 249: 1527-1533 (1990)], 문헌[Treat at al., in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein and Fidler (des.), Liss, New York, pp. 353-365 (1989)] 등을 참조할 수 있다. 여타의 활성성분의 전달 방식과 관련해서는 문헌 [Langer, supra; Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201 (1987)], 문헌[Buchwald et al., Surgery 88: 507 (1980)], 문헌[Saudek et al., N. Engl. J. Med. 321:574 (1989)], 문헌 [Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Florida (1974)], 문헌[Controlled Drug Bioavailability. Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York (1984)], 문헌[Ranger and Peppas, J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61 (1983)], 문헌[During et al., Ann. Neurol. 25:351 (1989)], 문헌[Howard et al., J. Neurosurg. 71:105 (1989)] 등을 참조할 수 있다. 이들 문헌은 본 명세서의 일부로서 간주된다.
본 발명의 백신 조성물의 투여량은 의료인에 의해 나이, 체중, 성별, 증상, 합병증, 다른 질환의 이환 유무 등의 환자 특성을 고려하여 결정될 수 있다.
또한 투여의 시간적 간격과 횟수는 사용되는 제형이나 활성성분의 혈중 반감기 등을 고려하여 결정될 수 있다.
이처럼 투여량과 투여의 시간적 간격이나 횟수는 의료인의 판단에 따라 좌우되고 개인에 따라 결정되어야 하지만, 통상의 적절한 투여량은 1일 기준 개인 체중 1kg당 약 0.1 내지 10mg 범위 내에서 결정될 것이고 투여 간격은 3 내지 10일, 투여 횟수는 1 내지 5회 범위 내에서 결정될 것이다.
본 발명의 백신 조성물에서 활성성분으로 사용되는 각 단백질은 이를 암호화하는 유전자를 이용하여 당업계에 공지된 DNA 재조합 기술로 제조할 수 있다. 이러한 방법은 (i) 상기 각 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 발현벡터를 제조하고 (ii) 이 발현벡터를 숙주세포에 형질전환시키고 (iii) 형질전환된 숙주세포를 배양하고, 마지막으로 (iv) 그 배양물로부터 상기 각 단백질을 분리·정제하는 단계를 포함하여 구성된다. 상기 각 단백질을 암호화하는 유전자는 본 명세서에 개시되어 있으며, 이러한 유전자를 이용하여 DNA 재조합 기술로 해당 각 단백질을 생산하는 것, 구체적으로 프로모터나 터미네이터 등의 조절서열이나 신호 펩타이드 서열, 선별마커 등을 포함하는 발현벡터 구성이나 재조합 DNA 기술, 형질전환 방법, 배지의 구성, 형질전환 후 배양 방법 등에 대해서 당업계에 상당한 양의 문헌이 축적되어 있으며, 각 해당 사항에 대해서는 이들 문헌을 참조할 수 있다. 구체적으로 문헌(Nucl. Acid Res. 14:5399-5467, 1986), 문헌(Tet. Lett. 27:5575-5578, 1986), 문헌(Nucl. Acid Res. 4:2557, 1977), 문헌(Lett., 28:2449, 1978), 문헌(Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (2001)), 문헌(F M Ausubel et al, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley amp; Sons, Inc. (1994)), 문헌(Marston, F (1987) DNA Cloning Techniques), 문헌(Cohen, S.N. et al., Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9:2110-2114(1973)), 문헌(Hanahan, D., J. Mol. Biol., 166:557-580(1983)), 문헌(Dower, W.J. et al., Nucleic. Acids Res., 16:6127-6145(1988)) (Capecchi, M.R., Cell, 22:479(1980)), 문헌(Graham, F.L. et al., Virology, 52:456(1973)), 문헌(Neumann, E. et al., EMBO J., 1:841(1982)), 문헌(Wong, T.K. et al., Gene, 10:87(1980)), 문헌(Gopal, Mol. Cell Biol., 5:1188-1190(1985)), 문헌(Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87:9568-9572(1990)) 문헌(Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1982)) 문헌(Hitzeman et al., J. Biol. Chem., 255, 12073-12080 (1980)), 문헌(Luchansky et al Mol. Microbiol. 2, 637-646 (1988)), 문헌(Sambrook 등, Molecular Cloning A Laboratory Mannual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, US(1989)), 문헌(Ausubel 등, Current Protocols in Molecular Biology, Jon Willey & Sons, US(1993)), 문헌(Sambrook, J. ＆ Russel, D. 저, Molecular Cloning, A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001년 1월 15일 발행의 제1권 및 제2권) 등을 참조할 수 있다.
본 발명은 전술한 바와 같이, Gc 단백질의 세포외 도메인, Gn 단백질의 세포외 도메인, 전장의 NP 단백질 또는 이들의 혼합물을 활성성분으로 하는, SFTS 바이러스에 대한 백신 조성물을 제공할 수 있다.
도 1은 본 발명의 백신 조성물의 활성성분인 Gc 단백질, Gn 단백질 또는 NP 단백질의 구조와 분자량을 나타낸 도면이다.
도 2는 본 발명의 백신 조성물의 활성성분인 Gc 단백질, Gn 단백질 또는 NP 단백질의 SDS-PAGE 결과이다.
도 3은 Gn 및 Gc 항원 면역에 의한 특이 항체 유도 및 면역 혈청을 이용한 바이러스 중화능 검사 결과이다(a. Gn 및 Gn 단백질에 대한 항체 역가. b and c. SFTS 바이러스에 대한 중화능 분석 시험. FRNT: focus reduction neutralization titer)
도 4는 Gc 단백질, Gn 단백질 또는 NP 단백질을 제1형 인터페론 수용체 KO 생쥐에 면역하고 생존율과 체중 변화를 측정한 결과이다.
도 5는 Gc 단백질, Gn 단백질 및/또는 NP 단백질의 혼합물을 제1형 인터페론 수용체 KO 생쥐에 면역하고 생존율과 체중 변화를 측정한 결과이다.
이하 본 발명을 실시예를 참조하여 설명한다. 그러나 본 발명의 범위가 이러한 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 백신 항원으로 사용될 바이러스 단백질의 생산
<실시예 1-1> 백신 항원으로 사용될 바이러스 단백질의 아미노산 서열
GenBank 상의 아미노산 정보를 이용하여 백신 항원으로 사용될 바이러스 Gn 단백질, Gc 단백질 및 NP 단백질의 생산하였다. GenBank 상의 아미노산 정보는 GenBank ID: ATW63054.1(Gn 단백질), GenBank ID: AOO85591.1(Gc 단백질), GenBank ID: AJO16084.1(NP 단백질)이다.
Gn과 Gc 단백질은 signal peptide와 transmembrane domain 및 cytoplasmic domain을 제외한 extracellular domain 만(각각 서열번호 1 및 2)을 사용하였으며, NP 단백질은 전장 서열(서열번호 3)을 사용하였다.
<실시예 1-2> 바이러스 단백질 유전자 클로닝 및 발현
Gn 및 Gc 단백질(extracellular domain)을 암호화하는 유전자(각각 서열번호 4 및 5)를 합성한 후 도 1과 같이 사람 Ig kappa light chain의 signal peptide 유전자(서열번호 6)가 N-terminal에 융합되고 human IgG1 CH2-CH3 부위 Fc domain 유전자(서열번호 7)가 힌지 서열(hinge region)(서열번호 8)을 매개로 C-terminal에 융합된 재조합 유전자를 pCEP4 mammalian expression vector에 클로닝 하였다. N-terminal과 C-terminal 각각에 6 His(정제를 위하여 사용함)가 연결된 NP 단백질을 암호화하는 유전자(서열번호 9)는 pET28a vector에 클로닝 하였다. 클로닝된 유전자는 각각 HEK293T 세포(Gn, Gc)와 E.coli BL21 (NP)에 도입하여 단백질 발현을 유도하였으며, Protein A/G column과 Ni-NTA column을 이용하여 각각 정제하였다. 정제된 단백질의 크기와 순도는 SDS-PAGE를 통해 확인하였다(도 2).
<실시예 2> SFTS 바이러스 단백질의 면역과 항체 분석
Gn-Fc(서열번호 10, 서열번호 10에서 N-terminal의 DVAQAA 아미노산 서열은 클로닝을 위하여 삽입된 서열임), Gc-Fc(서열번호 11, 서열번호 10에서 N-terminal의 DVAQAA 아미노산 서열은 클로닝을 위하여 삽입된 서열임), NP(서열번호 12), 사람 Fc를 각각 제1형 인터페론 수용체 KO 생쥐(n=4)에 2주 간격으로 3회 면역하고 (20ug/mouse +Alum, Gn-Fc, Gc-Fc, Fc; 10ug/mouse + Alum, NP), 3차 면역 2주 후 혈액을 채취하여 Gn, Gc, 및 NP에 대한 항체 역가를 ELISA 방법으로 측정하였다(도 3의 a). 각 항원에 대하여 높은 수준의 항체들이 생성됨을 확인 하였으며(anti-Gn 또는 anti-Gc IgG 평균 titer = 1:4,096, anti-NP IgG 평균 titer = 1:24,576; n = 4/group), 특히 NP 항원에 대한 항체 역가가 높게 유도되는 것이 관찰되었다. 바이러스 당단백질들(Gn과 Gc)에 대해 생성된 항체들의 바이러스 중화능을 확인하기 위하여 SFTS 바이러스를 면역혈청과 반응시키고, Vero 세포에 감염시켜 focus reduction assay를 실시였다 (도 3의 b 및 c). 거의 유사한 수준의 항체가 생성되었음에도 불구하고, Gn-Fc를 면역하여 얻은 혈청이 Gc-Fc를 면역하여 얻은 혈청보다 좀 더 높은 중화 항체가를 형성하였으며, 두 가지 면역 혈청 모두 Fc만을 면역하여 얻은 혈청보다 유의하게 높은 수준의 바이러스 중화능을 보유 하고 있음이 확인되었다 (중화항체 역가: Gn-Fc: 929 ± 1134, Gc-Fc: 209 ± 140, Fc: 42 ± 29; n = 4/group, mean titer ± S.D.).
<실시예 3> SFTS 바이러스 단백질 면역에 의한 보호 면역 효과
Gn-Fc, Gc-Fc, NP, Fc를 각각 제1형 인터페론 수용체 KO 생쥐(n=4~6)에 2주 간격으로 3회 면역하고 (20ug/mouse +Alum, Gn-Fc, Gc-Fc, Fc; 10ug/mouse + Alum, NP), 3차 면역 2주 후 103 foci-forming unit (FFU)의 SFTS 바이러스를 피하로 감염시켰다. 그리고 매일 몸무게 변화와 사망률을 관찰하였다(도 4).
PBS를 면역한 생쥐들(대조군)은 몸무게가 서서히 줄고, 감염 6일째까지 모두 사망하였다. Fc를 면역한 생쥐들(대조군)은 감염 이틀째부터 몸무게가 서서히 줄고, 감염 5일째까지 모두 사망하였다. Gc-Fc를 면역한 생쥐들은 감염 4일째부터 몸무게가 줄기 시작하였고, 감염 8일째 모두 사망하였다. Gn-Fc를 면역한 생쥐들은 감염 3일째부터 몸무게가 줄기 시작하였고, 감염 8일째까지 절반이 사망하였으나 나머지 생쥐들은 이후 몸무게가 회복되고 생존하였다. NP를 면역한 생쥐들은 감염 3일째부터 몸무게가 줄기 시작하였으며, 8일째까지 40%가 사망하였으며, 나머지 60% 생쥐들은 이후 서서히 몸무게를 회복하고 생존하였다. 통계학적 분석을 하였을 때 (Log-rank (Mantel-Cox) Test), 백신에 의한 생존 연장 효과 (Gc-Fc 군: p = 0.0046), 또는 사망률 감소 효과 (Gn-Fc 군: p = 0.0054, NP 군: p = 0.0023)는 대조군에 비하여 통계학적으로 유의한 향상을 보이는 것이 확인되었다.
<실시예 4> SFTS 바이러스 단백질 혼합 면역에 의한 보호 면역 효과
Gn-Fc와 NP의 혼합물(Gn+NP, 혼합비: 10ug + 10ug), Gc-Fc와 NP의 혼합물(Gc+NP, 혼합비: 10ug + 10ug), Gn-Fc와 Gc-Fc 그리고 NP의 혼합물(Gn+Gc+NP, 혼합비: 10ug + 10ug + 10ug), PBS(Control)를 각각 제1형 인터페론 수용체 KO 생쥐(n=7)에 2주 간격으로 3회 면역하고(20 or 30ug/mouse, +Alum), 3차 면역 2주 후 103 foci-forming unit (FFU)의 SFTS 바이러스를 피하로 감염시켰다. 그리고 매일 몸무게 변화와 사망률을 관찰하였다(도 5).
PBS를 면역한 생쥐들(대조군)은 몸무게가 서서히 줄고, 감염 6일째까지 모두 사망하였다. Gn+NP를 면역한 생쥐들은 감염 4일째부터 몸무게가 줄기 시작하였고, 감염 5일째 14.3%가 사망하고 감염 6일째까지 28.6% 사망하였으나 나머지 생쥐들은 이후 몸무게가 회복하고 생존하였다. Gc+NP를 면역한 생쥐들은 감염 5일째부터 몸무게가 줄기 시작하였고, 감염 6일째 14.3%가 사망하였으나 나머지 생쥐들은 이후 몸무게가 회복하고 생존하였다. Gn+Gc+NP를 면역한 생쥐들은 4일째부터 몸무게가 줄기 시작하였고, 감염 7일째 42.9%가 사망하였으나 나머지 생쥐들은 이후 몸무게가 회복하고 생존하였다.
통계학적 분석을 하였을 때 (Log-rank (Mantel-Cox) Test), 백신에 의한 생존 연장 효과 (Gc-Fc 군: p = 0.0046), 또는 사망률 감소 효과 (Gn-Fc 군: p = 0.0054, NP 군: p = 0.0023)는 대조군에 비하여 통계학적으로 유의한 향상을 보이는 것이 확인되었다.

Claims (8)

  1. Gc 단백질의 세포외 도메인(서열번호 1), Gn 단백질의 세포외 도메인(서열번호 2), 전장의 NP 단백질(서열번호 3) 또는 이들의 혼합물을 활성성분으로 포함하는 SFTS 바이러스에 대한 백신 조성물.
  2. 제1항에서,
    Gc 단백질의 세포외 도메인과 Gn 단백질의 세포외 도메인 각각은 사람 항체의 Fc 부위에 융합된 형태인 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 혼합물은 (i) Gc 단백질의 세포외 도메인과 전장의 NP 단백질의 혼합물, (ii) Gn 단백질의 세포외 도메인과 전장의 NP 단백질의 혼합물 또는 (iii) Gc 단백질의 세포외 도메인, Gn 단백질의 세포외 도메인 및 전장의 NP 단백질의 혼합물인 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
  4. 제3항에서,
    Gc 단백질의 세포외 도메인과 Gn 단백질의 세포외 도메인 각각은 사람 항체의 Fc 부위에 융합된 형태인 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 약학적으로 허용되는 담체는 희석제, 부형제, 안정화제 및 방부제로 구성된 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 활성성분 보조제를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 보조제는 겔 상의 알루미늄염인 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
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