WO2023008881A1 - 발현 시스템 및 이를 포함하는 핵산 기반 약학 조성물 - Google Patents

발현 시스템 및 이를 포함하는 핵산 기반 약학 조성물 Download PDF

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WO2023008881A1
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immunogen
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박형준
김재용
방유진
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주식회사 에스엠엘바이오팜
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    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors

Definitions

  • vaccines are widely used.
  • prepared vaccines are protein vaccines that attenuate or inactivate antigens of viruses or bacteria that cause infectious diseases.
  • Vaccines prepared in the traditional way have effectively protected humans from many infectious diseases, but there are limitations. In particular, it is difficult to develop effective vaccines against various infectious pathogens capable of evading the acquired immune response.
  • the greatest difficulty in developing most new vaccines is the need for rapid development and large-scale distribution of vaccines rather than efficacy. Accordingly, the development of a vaccine using nucleic acids has become a good alternative.
  • An object of the present disclosure is to provide a nucleic acid molecule and a recombinant expression vector capable of efficiently expressing an immunogenic protein or peptide related to an infectious disease, and a nucleic acid-based pharmaceutical composition using the same.
  • the nucleotide encoding the immunogen of the severe fever with thrombocytopenia syndrome virus or a fragment thereof may consist of a nucleotide selected from the group consisting of SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, and SEQ ID NO: 10, or a transcript thereof.
  • FIG. 4 is a graph showing results of serial dilution of immunoglobulins produced from serum of mice immunized with nucleic acid molecules encoding HA according to an exemplary embodiment of the present disclosure and measurement by ELISA.
  • FIG. 5 is a graph showing the results of measuring the dilution factor for inhibiting hemagglutination by HA inhibition (HI) assay using the serum of a mouse immunized with a nucleic acid molecule encoding HA according to an exemplary embodiment of the present disclosure.
  • HI hemagglutination by HA inhibition
  • 11 and 12 are graphs showing the results of ELISA measurement of immunoglobulins produced in the serum of mice immunized with a nucleic acid molecule encoding glycoprotein N of SFTSV, respectively, according to an exemplary embodiment of the present disclosure.
  • FIG. 14 is a graph showing the results of measuring neutralizing antibody titers in the serum of mice immunized with a nucleic acid molecule encoding glycoprotein N of SFTSV according to an exemplary embodiment of the present disclosure.
  • amino acid herein is used in its broadest sense and is intended to include naturally-occurring L-amino acids or residues.
  • Amino acids include D-amino acids as well as chemically-modified amino acids, such as amino acid analogs, naturally-occurring amino acids not commonly incorporated in proteins, such as norleucine, and chemically modified amino acids having properties known in the art to be characteristic of amino acids.
  • amino acid analogs For example, synthetic peptides synthesized by standard solid-phase synthesis techniques are not limited to the amino acids encoded by genes, and thus allow for a wider variety of substitutions for a given amino acid. Amino acids not encoded by the genetic code may be referred to herein as "amino acid analogs".
  • substitutions may include amino acid substitutions known as "conservative".
  • Variants may also contain nonconservative changes.
  • the sequence of the variant polypeptide differs from the original sequence by substitution, deletion, addition or insertion of 5 or fewer amino acids.
  • Variants can also be altered by deletion or addition of amino acids that minimally affect the immunogenicity, secondary structure and hydropathic nature of the peptide.
  • Constant substitution means that there is no significant change in properties such as secondary structure and hydropathic nature of a polypeptide even when one amino acid is substituted with another amino acid.
  • Amino acid variations are based on the relative similarity of amino acid side chain substituents, such as polarity, charge, solubility, hydrophobicity, hydrophilicity and/or amphipathic nature. can be obtained by
  • arginine, lysine and histidine are all positively charged residues; Alanine, glycine and serine have similar sizes; It can be seen that phenylalanine, tryptophan and tyrosine have similar shapes. Therefore, based on these considerations, arginine, lysine and histidine; alanine, glycine and serine; And phenylalanine, tryptophan and tyrosine are biologically functional equivalents.
  • the hydrophobic amino acid index is very important in conferring the interactive biological function of proteins. It is a known fact that amino acids having similar hydrophobicity indexes should be substituted to retain similar biological activities. When a mutation is introduced with reference to the hydrophobicity index, substitution is made between amino acids exhibiting a difference in hydrophobicity index, preferably within ⁇ 2, more preferably within ⁇ 1, and even more preferably within ⁇ 0.5.
  • polynucleotide or “nucleic acid” are used interchangeably herein and refer to polymers of nucleotides of any length and include DNA (eg cDNA) and RNA molecules generically.
  • Nucleotides which are the building blocks of nucleic acid molecules, are deoxyribonucleotides, ribonucleotides, modified nucleotides or bases, and/or their analogues, or which can be incorporated into polymers by DNA or RNA polymerase, or by synthetic reactions. It can be any substrate.
  • Polynucleotides may include modified nucleotides, sugar or base modified analogs, such as methylated nucleotides and their analogs.
  • translation control/regulation sequence or “translation control/regulation element” may be used for nucleic acid sequences that control translation from nucleic acids in the form of transcripts to proteins or peptides.
  • transcriptional control sequences/elements and/or translation control sequences/elements are operatively linked to sequences to be expressed, eg, nucleic acid sequences to be transcribed or translated.
  • the present disclosure is based on the fact that the expression efficiency of an immunogenic target sequence operably linked to an expression control sequence is improved, and thus it can be used as a nucleic acid-based vaccine using such an expression system.
  • 1 is a schematic diagram schematically showing the configuration of a nucleic acid molecule or polynucleotide capable of efficiently expressing a protein or peptide causing an infectious disease, according to an exemplary embodiment of the present disclosure.
  • the nucleic acid molecule is operably linked to an expression control element (ECE) and an open reading frame encoding a virus-derived immunogen.
  • ECE expression control element
  • ORF may include a coding region (CR).
  • the first translational regulatory element may be all or part of a 5'-untranslated region (5'-UTR) having cap dependent translation initiation activity
  • the second translational regulatory element may be all or part of a 3'-UTR corresponding to the first translational regulatory element (U-TLCE).
  • each of the first translational regulatory element (U-TLCE) and/or the second translational regulatory element (D-TLCE) is derived from an animal, such as a mammal, specifically a primate, more specifically a human. It can consist of nucleotides with cap-dependent translation initiation activity.
  • the first translational regulatory element (U-TLCE) and the second translational regulatory element (D-TLCE) are an ORF encoding a peptide capable of functioning as an immunogen in influenza virus and / or SFTSV forming a coding region (CR) or It plays an important role in improving the translation efficiency of its transcripts and stably maintaining mRNAs, which are transcripts, in cells without being destroyed.
  • Influenza viruses are negative-sense RNA viruses, and there are four types: A, B, C, and D. Among them, types A and B are most common in humans. Type A is distinguished by a combination of hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA), which are virus-expressed antigens. Worldwide, between 3 and 5 million patients with seasonal influenza each year develop severe symptoms and cause 290,000 to 650,000 deaths. There is no effective treatment yet, and prevention is best with a vaccine. Inactivated influenza vaccine was approved for the first time in the United States in 1945, and currently influenza vaccine development is being carried out in various ways using protein vaccines and virus-like particles (VLPs).
  • VLPs virus-like particles
  • influenza virus immunogen encoded in the coding region may be influenza virus hemagglutinin (HA) or a fragment thereof.
  • hemagglutinin an immunogen of influenza virus
  • the nucleotide encoding an influenza virus immunogen or a fragment thereof may consist of the nucleotide of SEQ ID NO: 4 or a transcript thereof, but is not limited thereto.
  • Severe fever with thrombocytopenia syndrome is a disease caused by SFTSV, and the first cases were reported in Korea and Japan in 2013. In Korea, the mortality rate among 605 patients from 2013 to 2017 reached an average of 20.9%. Symptoms of infection with the virus include high fever, fatigue, headache, muscle pain, vomiting, and diarrhea.
  • the immunogenic glycoprotein (Gn) of SFTSV is SEQ ID NO: 5 (referred to herein as Gn), SEQ ID NO: 7 (referred to herein as Gn ⁇ TM) and SEQ ID NO: 9 (referred to herein as Gn ⁇ TM). It may consist of a peptide mutated from glycoprotein N of SFTSV having an amino acid sequence selected from the group consisting of (referred to as Gn ⁇ STEM in), but is not limited thereto.
  • the initial codon may have a Kozak sequence. Nucleotides near the stop codon also need to be optimized. If necessary, the third part of the codon sequence of the gene to be expressed in the coding region (CR) or its transcript, mRNA, can be changed to GC to increase the GC% of the target gene without changing amino acids, thereby increasing mRNA stability.
  • the transcriptional regulatory element includes a promoter derived from a mammalian virus, a promoter derived from a genome of a mammalian cell, or a promoter derived from a bacteriophage.
  • the nucleic acid molecule stabilizes the nucleic acid molecule transcribed downstream of the coding region (CR), more specifically downstream of the second translational regulatory element (D-TLCE), while also stabilizing the viral origin present in the coding region (CR).
  • a polyadenylation signal sequence and/or a polyadenosine sequence (PA) capable of further improving translation efficiency of an ORF composed of a gene encoding an antigenic peptide or a transcript sequence thereof may be further inserted.
  • the polyadenylation signal sequence or polyadenosine sequence is a plurality of adenosines, eg, 25 to about 400, 30 to 400, 50 to 250, or 60 to 250 adenosines.
  • it may consist of a sequence in which a signal sequence such as 5'-GATCATCAGT-3' or a linker sequence is inserted between two nucleotides of the transcript.
  • the nucleic acid molecule may include one or more cloning sites, preferably a Multiple Cloning Site (MCS).
  • MCS Multiple Cloning Site
  • the one or more cloning sites may include one or more restriction endonuclease recognition sequences and/or sequences cleaved by restriction enzymes.
  • Restriction enzymes include not only natural restriction enzymes found in bacteria and archaea, but also artificially manufactured restriction enzymes (for example, restriction enzymes based on zinc finger nuclease or DNA binding sites of TAL effectors, or PNA-based PNAznymes). can include
  • the signal sequence is a PhoA signal sequence, an OmpA signal sequence, etc.
  • an ⁇ -amylase signal sequence, a subtilisin signal sequence, etc. can be used there is.
  • the signal sequence is MF- ⁇ signal sequence, SUC2 signal sequence, etc.
  • insulin signal sequence, a-interferon signal sequence, antibody molecule signal sequence, etc. can be used, but the present disclosure is not limited thereto.
  • a strong promoter capable of promoting transcription e.g., tac promoter, lac promoter, lacUV5 promoter, lpp promoter, pL ⁇ promoter, pR ⁇ promoter , rac5 promoter, amp promoter, recA promoter, SP6 promoter, trp promoter and T7 promoter, etc.
  • transcription control elements TCCE
  • translation control sequences TLCE1, TLCE2
  • the mixing ratio thereof is not particularly limited.
  • the nucleic acid molecule or expression construct according to the present disclosure and the adjuvant are 100:1 to 1:100, preferably 10:1 to 1:10, more preferably 5:1 to 1:5, Most preferably, it may be blended in a weight ratio of 3:1 to 1:3.
  • the pharmaceutical composition can be prepared as a sustained-release formulation.
  • sustained-release preparations include semipermeable matrices of solid hydrophobic polymers containing nucleic acid molecules or gene carriers, which matrices are in the form of shaped articles, for example films or micro-capsules.
  • sustained-release matrices are polyesters, hydrogels (eg, poly(2-hydroxyethyl-methacrylate), or poly(vinyl alcohol)), polylactide, L-glutamic acid and gamma-ethyl- copolymers of L-glutamate, non-degradable ethylene-vinyl acetate, degradable lactic acid-glycolic acid copolymers and poly-D-(-)-3-hydroxybutyric acid.
  • polyesters eg, poly(2-hydroxyethyl-methacrylate), or poly(vinyl alcohol)
  • polylactide eg, L-glutamic acid and gamma-ethyl- copolymers of L-glutamate
  • non-degradable ethylene-vinyl acetate non-degradable ethylene-vinyl acetate
  • degradable lactic acid-glycolic acid copolymers poly-D-(-)-3-hydroxybutyric acid.
  • Suitable neutral lipids may include neutral, uncharged or zwitterionic lipids.
  • Neutral phospholipids are 5-heptadecylbenzene-1,3-diol (resorcinol), dipalmitoylphosphatidylcholine (DPPC), distearoylphosphatidylcholine (DSPC), phosphocholine (DOPC), dimyristoylphosphatidylcholine (DMPC), Phosphatidylcholine (PLPC), 1,2-Distearoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholine (DAPC), Phosphatidylethanolamine (PE), Nanphosphatidylcholine (EPC), Dilauroylphosphatidylcholine (DLPC), dimyristoylphosphatidylcholine (DMPC), 1-myristoyl-2-palmitoylphosphatidylcholine (MPPC), 1-palmitoyl-2-myristoylphosphatidylcho
  • the Th 1 /Th 2 ratio is very important in the immune response, and the nucleic acid molecules of the present disclosure enhance and induce the Th 1 immune response, that is, the cell-mediated immune response. Therefore, when a nucleic acid molecule according to the present disclosure is administered to a living body together with a pharmaceutically active substance, for example, an immune enhancing component, the pharmaceutical composition can further enhance a specific immune response induced by the pharmaceutically active substance. .
  • a pharmaceutically active substance for example, an immune enhancing component
  • the pharmaceutical composition according to the present disclosure may include a pharmaceutically acceptable carrier in addition to a nucleic acid molecule and a pharmaceutically active substance.
  • the pharmaceutically acceptable carrier may be, for example, pyrogen-free water; isotonic saline or buffered (aqueous) solutions such as, for example, phosphate, citrate and the like, buffered solutions, for example vegetable oils such as peanut oil, cottonseed oil, sesame oil, olive oil, corn oil and cacao nut oil; For example, polypropylene glycol, glycerol, sorbitol, mannitol and polyethylene glycol; polyols such as alginic acid and the like.
  • An aqueous buffer containing a sodium salt, a calcium salt and optionally a potassium salt may be used to inject the liquid vaccine composition into a living body.
  • the sodium, calcium and potassium salts may be in the form of a halogen such as chlorine, iodine or bromine, or in the form of a hydroxide, carbonate, hydrogen carbonate, or sulfate.
  • the pharmaceutically acceptable carrier may include a solid carrier such as a solid filler, liquid filler or diluent, and an encapsulating compound suitable for administration to a living body may also be used.
  • pharmaceutically acceptable solid carriers include sugars such as lactose, glucose and sucrose; starches such as, for example, corn starch or potato starch; cellulose and derivatives thereof such as, for example, sodium carboxymethylcellulose, ethylcellulose, and cellulose acetate; powdered tragacanth; malt; gelatin; tallow; solid lubricants such as, for example, stearic acid and magnesium stearate; calcium sulfate and so on.
  • a pharmaceutically acceptable carrier may be selected depending on the manner in which the pharmaceutical composition according to the present disclosure is to be administered.
  • a pharmaceutical composition according to the present disclosure may be administered systemically, for example.
  • Routes of administration include, for example, oral, subcutaneous, intravenous, intramuscular, intra-articular, intrasynovial, intrasternal, intrathecal, intrahepatic, intralesional, intracranial, transdermal, intradermal, intrapulmonal, intraperitoneal, intracardial, intraarterial, and sublingual topical ( sublingual topical and/or intranasal routes.
  • the pharmaceutical composition according to the present disclosure may additionally include one or more auxiliary substances.
  • auxiliary substances are compounds that allow maturation of dendritic cells (DCs), such as lipopolysaccharides, TNF-alpha or CD40 ligands, GM-CFS and/or cytokines.
  • DCs dendritic cells
  • GM-CSF lipopolysaccharides
  • TNF-alpha ligands
  • GM-CFS ligands
  • GM-CFS ligands
  • GM-CFS cytokines
  • various interleukins, interferons, GM-CSF, G-CSF, M-CSF, LT-beta, TNF-alpha such as growth factors such as hGH, monokines, lymphokines, cytokines such as interleukins or keokines.
  • a buffers i.e., stabilizers, surfactants, wetting agents, lubricants, emulsifiers, suspending agents, preservatives, antioxidants, opacifiers, lubricants, processing aids, colorants, sweeteners, flavoring agents, flavoring agents, diluents, and other known additives that provide an attractive appearance for the drug (i.e., a nucle
  • emulsifiers such as Tween
  • humectants such as, for example, sodium lauryl sulfate
  • coloring agent such as, for example, sodium lauryl sulfate
  • taste-imparting agents such as, tablet forming agents
  • stabilizers such as, sodium lauryl sulfate
  • antioxidants such as, sodium lauryl sulfate
  • It is a preservative.
  • the content or concentration of nucleic acid molecules in the pharmaceutical composition is not particularly limited.
  • the nucleic acid molecule according to the present disclosure may be used in a pharmaceutical composition at a concentration of 1 to 1000 ug/mL, preferably 10 to 1000 ug/mL, but is not limited thereto.
  • T-lymphocytes typically differentiate into two subpopulations: T-helper 1 (Th 1 ) cells and T-helper 2 (Th 2 ) cells, which are intracellular (Th 1 ) pathogens and extracellular ( Th 2 ) It has an immune system capable of destroying pathogens (eg, antigens).
  • Th 1 T-helper 1
  • Th 2 T-helper 2
  • Th 1 T-helper 1
  • Th 2 T-helper 2
  • Th 1 intracellular pathogens
  • Th 2 extracellular
  • the two Th cell populations differ in the patterns of effector proteins (cytokines) produced by them.
  • Th 1 cells help cellular immune responses mainly by activating macrophages and cytotoxic T-cells in connection with humoral immunity.
  • Th 2 cells are mainly involved in cellular immunity by enhancing B-cells for conversion into plasma cells, and by forming antibodies (eg, antibodies to antigens), to initiate humoral immune responses. promote Therefore, the Th 1 /Th 2 ratio is very important in the immune response. Nucleic acid molecules according to the present disclosure enhance both the Th 1 immune response and the Th 2 immune response.
  • a pharmaceutical composition according to the present disclosure may be administered in any convenient dosage form, such as tablets, powders, capsules, solutions, dispersions, suspensions, syrups, sprays, suppositories, gels, emulsions, patches, and the like.
  • Such compositions may contain ingredients customary in pharmaceutical formulations, such as diluents, carriers, pH adjusting agents, sweetening agents, bulking agents and additional active agents.
  • a gene delivery system comprising a nucleic acid molecule of the present disclosure can be included in a pharmaceutical composition.
  • Gene carriers are designed to deliver and express nucleotides encoding the desired immunogen.
  • the transcript of the gene of interest is preferably present in a suitable expression construct.
  • the transcript of the gene of interest encoding the virally derived immunogen is preferably operably linked to a transcriptional regulatory element (TCCE).
  • TCCE transcriptional regulatory element
  • the expression construct may be an expression vector into which the aforementioned nucleic acid molecule is inserted.
  • the vector may include a nucleic acid molecule, and the nucleic acid molecule may be combined with other nucleotides to encode a fusion protein or a fusion peptide.
  • Example 1 Construction of a nucleic acid molecule with an influenza virus hemagglutinin (HA) coding sequence inserted
  • the template DNA was inserted into the pGH vector (downstream of SEQ ID NO: 13 and upstream of SEQ ID NO: 14), cloned, linearized with restriction enzymes, and nucleic acid molecules in RNA platform form through in vitro transcription (IVT). (hereinafter referred to as "pHJ5L-HA”) was prepared.
  • RNA-type nucleic acid molecules were purified with N-methylpseudouridine (m1 ⁇ ) and cellulose.
  • RNA was modified using a commercially available cap1-type capping reagent, and formulated using lipid-based nanoparticles (LNP) used in Moderna's COVID-19 mRNA vaccine.
  • mice Two weeks after the last immunization, the mice were euthanized with carbon dioxide, and then necropsied, and blood was collected from the abdominal vena cava. The collected blood was left at room temperature for more than 2 hours to agglutinate the blood cells, and then centrifuged at 4,000 g for 15 minutes to separate serum. After coating 100 ng of HA protein on a 96-well plate, 50 ⁇ l of blood diluted 1:200 in 1% BSA in PBS as a primary antibody was added.
  • Mouse serum was obtained using the same method as in Experimental Example 1. 25 ⁇ l of PBS was added to the 96-well plate. 25 ⁇ l of mouse serum was added to the first column and serially diluted 2-fold in the next column. Influenza virus (PR8 HA) of the same type as the HA encoded in pHJ5L-HA mRNA was added to all wells at 25 ⁇ l and reacted for 30 minutes. Thereafter, 50 ⁇ l of 1% turkey blood was added and waited until red blood cells were aggregated. Aggregation of erythrocytes is due to the HA antigen of the virus, and non-aggregation of erythrocytes is due to the presence of HA antibodies in the serum. The analysis results are shown in FIG. 5 . As shown in Figure 5, it can be seen that the group to which pHJ5L-HA mRNA was added had a high antibody titer by preventing hemagglutination even at a high dilution rate.
  • the spleen extracted was ground into single cells as much as possible using a 40 ⁇ m strainer.
  • the ground spleen cells were put into a pre-coating ELISpot plate at 50 ⁇ l at a number of 5 ⁇ 10 5 cells/well.
  • For non-stimulation (Group 1) 50 ⁇ l of RPMI1640 complete medium (10% FBS, 1% antibiotics), and for peptide stimulation (Group 2) expressed in pHJ5L-HA mRNA at a concentration of 4 ⁇ g/well in complete medium 50 ⁇ l of 7 types of HA peptides were added. After culturing for 48 hours in a 37° C.
  • Example 2 The procedure of Example 1 was repeated, except that a modified nucleotide (SEQ ID NO: 6) encoding glycoprotein N (SEQ ID NO: 5) of SFTSV was inserted in the coding region in place of the nucleotide encoding influenza HA.
  • a nucleic acid molecule in the form of an RNA platform hereinafter referred to as "pHJ5L-Gn" was prepared.
  • mice Two weeks after the last immunization, the mice were euthanized with carbon dioxide, and then necropsied, and blood was collected from the abdominal vena cava. The collected blood was left at room temperature for more than 2 hours to agglutinate the blood cells, and then centrifuged at 4,000 g for 15 minutes to separate serum. After coating 100 ng of Gn protein on a 96-well plate, the amount of secreted antigen-specific antibody in mouse serum was measured by ELISA in the same manner as in Experimental Example 1. The measurement results are shown in FIGS. 11 and 12 .

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Abstract

번역 개시 활성을 갖는 번역 조절 요소와, 상기 번역 조절 요소와 작동 가능하게 연결되며, 인플루엔자바이러스 또는 중증열성혈소판감소증후군바이러스(SFTSV)의 면역원 또는 이의 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드로 이루어지는 코딩 영역을 포함하는 핵산 분자가 개시된다. 핵산 분자 또는 핵산 분자가 삽입된 발현 시스템은 독감 또는 SFTS를 치료 또는 예방하기 위한 약학 조성물, 예를 들어 mRNA 백신이나 유전자 치료 플랫폼으로 활용될 수 있다.

Description

발현 시스템 및 이를 포함하는 핵산 기반 약학 조성물
본 특허출원은 2021년 7월 29일자로 출원한 대한민국 특허출원 제10-2021-0100099호 및 2021년 12월 13일자로 출원한 대한민국 특허출원 제10-2021-0177977호의 우선권의 이익을 주장한다.
본 개시는 발현 시스템에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 바이러스의 면역원 발현 시스템 및 이를 이용한 핵산 기반 약학 조성물에 관한 것이다.
인간에게 전염되는 다양한 감염 질환은 근대 이전부터 잘 알려져 있으며, 때로 이들 감염 질환은 심각한 범유행(pandemic)으로 진행되었다. 중세 유럽에서 유행하였던 흑사병으로 인하여 유럽 인구의 상당수가 사망하였다. 이러한 감염성 질환의 범유행은 현대에도 계속되고 있다. 20세기 초에는 스페인 독감으로 인하여 1차 세계대전에서 전투로 사망한 인원보다 많은 인원이 사망한 것으로 알려져 있다. 또한, 2019년 중국 우한에서 발생한 COVID-19는 다양한 변이를 일으키면서 현재까지도 세계적인 범유행을 초래하고 있다.
이와 같은 감염성 질환을 예방하기 위한 전략으로 널리 백신이 널리 사용되고 있다. 전통적으로 제조된 백신은 감염성 질환을 야기하는 바이러스 또는 박테리아의 항원을 약독화, 불활성화하는 단백질 백신이다. 전통적인 방식으로 제조되는 백신은 많은 감염성 질환으로부터 효과적으로 인간을 보호하였으나, 한계도 존재한다. 특히, 후천성 면역 반응을 회피할 수 있는 다양한 감염성 병원균에 대해서는 효과적인 백신 개발이 어렵다. 또한, 대부분의 새로운 백신 개발에 있어 큰 어려움은 효과보다는 백신의 신속한 개발과 대규모 배포의 필요성이다. 이에 핵산을 이용한 백신 개발은 좋은 대안이 되었다. 이에 2019년 발생한 COVID-19 범유행 과정에서도 핵산 기반의 mRNA 백신은 신속하게 개발되었고, 각국의 긴급 사용 승인을 받아 전세계적으로 mRNA 백신 접종이 이루어진바 있다. 따라서, COVID-19 이외에도 감염성 질환을 효율적으로 예방할 수 있는 핵산 기반의 백신 플랫폼을 개발할 필요가 있다.
본 개시의 목적은 감염성 질환과 관련 있는 면역원 단백질 또는 펩타이드를 효율적으로 발현시킬 수 있는 핵산 분자 및 재조합 발현 벡터와, 이를 이용한 핵산 기반 약학 조성물을 제공하고자 하는 것이다.
일 측면에서, 본 개시는 트로포닌 T1(troponin T1, TNNT1) 유래의 번역 조절 요소와, 상기 번역 조절 요소와 작동 가능하게 연결되는 코딩 영역을 포함하고, 상기 코딩 영역은 인플루엔자바이러스 또는 중증열성혈소판감소증후군바이러스(SFTSV)의 면역원 또는 이의 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드를 포함하는 핵산 분자를 제공한다.
상기 번역 조절 요소는 상기 코딩 영역의 상류에 위치하는 제 1 번역 조절 요소 및/또는 상기 코딩 영역의 하류에 위치하는 제 2 번역 조절 요소를 포함할 수 있다.
일례로, 상기 제 1 번역 조절 요소는 서열식별번호: 1의 뉴클레오타이드 또는 이의 전사체로 이루어질 수 있으며, 상기 제 2 번역 조절 요소는 서열식별번호: 2의 뉴클레오타이드 또는 이의 전사체로 이루어질 수 있다.
예시적인 측면에서, 상기 인플루엔자바이러스의 면역원은 상기 인플루엔자바이러스의 헤마글루티닌(hemagglutinin) 또는 이의 단편일 수 있다.
상기 인플루엔자바이러스의 면역원은 서열식별번호: 3의 아미노산으로 이루어질 수 있다.
상기 인플루엔자바이러스의 면역원 또는 이의 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드는 서열식별번호: 4의 뉴클레오타이드 또는 이의 전사체로 이루어질 수 있다.
선택적인 측면에서, 상기 중증열성혈소판감소증후군바이러스의 면역원은 상기 중증열성혈소판감소증후군바이러스의 당단백질(glycoprotein N) 또는 이의 단편일 수 있다.
상기 중증열성혈소판감소증후군바이러스의 면역원은 서열식별번호: 5, 서열식별번호: 7 및 서열식별번호: 9로 구성되는 군에서 선택되는 아미노산으로 이루어질 수 있다.
상기 중증열성혈소판감소증후군바이러스의 면역원 또는 이의 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드는 서열식별번호: 6, 서열식별번호: 8 및 서열식별번호: 10으로 구성되는 군에서 선택되는 뉴클레오타이드 또는 이의 전사체로 이루어질 수 있다.
일례로, 상기 핵산 분자는 RNA 형태의 핵산 분자일 수 있다.
상기 핵산 분자는 상기 코딩 영역과 작동 가능하게 연결되는 전사 조절 요소, 및 상기 전사 조절 요소의 하류에 위치하는 폴리아데닐레이션 신호 서열 또는 폴리아데노신 서열 중에서 적어도 하나의 뉴클레오타이드를 더욱 포함할 수 있다.
다른 측면에서, 본 개시는 전술한 핵산 분자를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 개시는 전술한 핵산 분자 또는 상기 핵산 분자가 삽입된 발현 컨스트럭트(construct)를 유효 성분으로 포함하는 독감 또는 중증열성혈소판감소증후군을 치료 또는 예방하기 위한 약학 조성물을 제공한다.
예를 들어, 약학 조성물은 백신 조성물일 수 있다.
선택적으로, 상기 약학 조성물은 면역증강제, 핵산 안정화제 및 지질나노입자 중에서 적어도 하나를 더욱 포함할 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 개시는 약학적으로 허용되는 전술한 핵산 분자 또는 상기 핵산 분자가 삽입된 발현 컨스트럭트를 피대상체(subject)에 투여하는 단계를 포함하는 독감 또는 중증열성혈소판감소증후군을 치료 또는 예방하기 위한 방법을 제공한다.
본 개시의 핵산 분자 및 상기 핵산 분자가 삽입된 발현 시스템을 통하여 인플루엔자바이러스 또는 중증열성혈소판감소증후군바이러스(SFTSV)에서 유래한 단백질 및/또는 펩타이드를 효율적으로 발현시킬 수 있다.
본 개시의 핵산 분자 및/또는 발현 컨스트럭트(construct)는 핵산 기반의 약학적 활성 소재로 활용되어, 인플루엔자바이러스가 야기하는 독감 또는 중증열성혈소판감소증후군(SVTS)를 치료 및/또는 예방하기 위한 약학 조성물로 활용될 수 있다. 핵산 분자 및/또는 발현 컨스트럭트를 생체에 투여하여, 생체 내에서 Th1 면역 반응과 Th2 면역 반응을 효율적으로 유도할 수 있다.
따라서 본 개시에 따른 핵산 분자 및/또는 이를 포함하는 발현 컨스트럭트는 인플루엔자바이러스가 야기하는 독감 또는 SFTS를 효율적으로 예방 또는 치료할 수 있는 핵산 기반 백신과 같은 약품의 유효성분으로 활용될 수 있다.
도 1은 본 개시의 예시적인 실시형태에 따라, 감염성 질환을 야기하는 단백질 또는 펩타이드를 효율적으로 발현시킬 수 있는 핵산 분자의 구성을 개략적으로 나타낸 모식도이다.
도 2 및 도 3은 각각 본 개시의 예시적인 실시예에 따라, 헤마글루티닌(HA)을 암호화한 핵산 분자로 면역시킨 마우스의 혈청에서 생성된 면역글로불린을 ELISA로 측정한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 4는 본 개시의 예시적인 실시예에 따라 HA를 암호화한 핵산 분자로 면역시킨 마우스의 혈청에서 생성된 면역글로불린을 연속적으로 희석하고, ELISA로 측정한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 5는 본 개시의 예시적인 실시예에 따라 HA를 암호화한 핵산 분자로 면역시킨 마우스의 혈청을 이용하여 HA 억제(HI) assay로 혈구 응집을 억제한 희석 배수를 측정한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 6은 본 개시의 예시적인 실시예에 따라, HA를 암호화한 핵산 분자로 면역시킨 마우스의 혈청을 이용하여 Micro-neutralization assay로 바이러스 역가를 측정하여 중화능력을 평가한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 7은 본 개시의 예시적인 실시예에 따라, HA를 암호화한 핵산 분자로 면역시킨 마우스의 비장세포에서 항원 특이적 IFN-감마를 생성하는 세포 개수를 ELISPOT으로 측정한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 8 및 도 9는 각각 본 개시의 예시적인 실시예에 따라, HA를 암호화한 핵산 분자로 면역시킨 마우스의 비장세포에서 항원 특이적 IFN-감마를 생성하는 CD4 T 세포 및 CD8 T 세포의 개수를 FACS를 이용한 유세포 분석 결과를 보여주는 그래프이다.
도 10은 본 개시의 예시적인 실시예에 따라, SFTSV의 당단백질 N을 암호화한 핵산 분자의 발현 여부를 확인하기 위한 western-blotting 결과를 보여주는 사진이다.
도 11 및 도 12는 각각 본 개시의 예시적인 실시예에 따라, SFTSV의 당단백질 N을 암호화한 핵산 분자로 면역시킨 마우스의 혈청에서 생성된 면역글로불린을 ELISA로 측정한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 13은 본 개시의 예시적인 실시예에 따라, SFTSV의 당단백질 N을 암호화한 핵산 분자로 면역시킨 마우스의 비장세포에서 항원 특이적 IFN-감마를 생성하는 세포 개수를 ELISPOT으로 측정한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 14는 본 개시의 예시적인 실시예에 따라, SFTSV의 당단백질 N을 암호화한 핵산 분자로 면역시킨 마우스의 혈청에서 중화항체 역가를 측정한 결과를 보여주는 그래프이다.
용어의 정의
본 명세서에서 용어 "아미노산"은 가장 넓은 의미로 사용되고, 자연-발생 L-아미노산 또는 잔기를 포함하는 것으로 의도된다. 아미노산은 D-아미노산뿐만 아니라 화학적으로-변형된 아미노산, 예컨대 아미노산 유사체, 단백질에 통상적으로 혼입되지 않는 자연-발생 아미노산, 예컨대 노르류신, 및 아미노산의 특징인 것으로 당업계에 공지된 특성을 갖는 화학적으로-합성된 화합물을 포함한다. 예를 들어, 천연 Phe 또는 Pro와 동일한 펩타이드 화합물의 입체형태 제한을 허용하는 페닐알라닌 또는 프롤린의 유사체 또는 모방체가 아미노산의 정의 내에 포함된다. 이러한 유사체 및 모방체는 본 명세서에서 아미노산의 "기능적 균등물"로서 지칭된다.
예를 들어, 표준 고체-상 합성 기술에 의해 합성된 합성 펩타이드는 유전자에 의해 암호화되는(encoded) 아미노산으로 제한되지 않으며, 이에 따라 주어진 아미노산에 대해 보다 광범위하게 다양한 치환을 허용한다. 유전자 코드에 의해 암호화되지 않은 아미노산은 본 명세서에서 "아미노산 유사체"로서 지칭될 수 있다. 예를 들어, 아미노산 유사체는 Glu 및 Asp에 대한 2-아미노 아디프산(Aad); Glu 및 Asp에 대한 2-아미노피멜산(Apm); Met, Leu 및 다른 지방족 아미노산에 대한 2-아미노부티르산(Abu); Met, Leu 및 다른 지방족 아미노산에 대한 2-아미노헵탄산(Ahe); Gly에 대한 2-아미노부티르산(Aib); Val, Leu 및 Ile에 대한 시클로헥실알라닌(Cha); Arg 및 Lys에 대한 호모아르기닌(Har); Lys, Arg 및 His에 대한 2,3-디아미노프로피온산(Dap); Gly, Pro 및 Ala에 대한 N-에틸글리신(EtGly); Gly, Pro 및 Ala에 대한 N-에틸글리신(EtGly); Asn 및 Gln에 대한 N-에틸아스파라긴(EtAsn); Lys에 대한 히드록시리신(Hyl); Lys에 대한 알로히드록시리신(AHyl); Pro, Ser 및 Thr에 대한 3-(및 4-)히드록시프롤린(3Hyp, 4Hyp); Ile, Leu 및 Val에 대한 알로-이소류신(AIle); Arg에 대한 4-아미디노페닐알라닌; Gly, Pro 및 Ala에 대한 N-메틸글리신(MeGly, 사르코신); Ile에 대한 N-메틸이소류신(MeIle); Met 및 다른 지방족 아미노산에 대한 노르발린(Nva); Met 및 다른 지방족 아미노산을 위한 노르류신(Nle); Lys, Arg 및 His에 대한 오르니틴(Orn); Thr, Asn및 Gln에 대한 시트룰린(Cit) 및 메티오닌 술폭시드(MSO); 및 Phe에 대한 N-메틸페닐알라닌(MePhe), 트리메틸페닐알라닌, 할로-(F-, Cl-, Br- 또는 I-)페닐알라닌 또는 트리플루오릴페닐알라닌을 포함한다.
본 명세서에서 용어 "펩타이드"는 자연적으로 존재하는 것으로부터 분리하였거나, 재조합 기술 (recombinant technique)에 의하여 또는 화학적으로 합성된 단백질, 단백질 단편 및 펩타이드를 모두 포함한다. 예를 들어 본 개시의 펩타이드는 적어도 5개, 일례로, 적어도 10개의 아미노산으로 구성되어 있다.
특정 실시형태에서, 화합물의 변이체, 예컨대 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 펩타이드 변이체가 제공된다. 본 명세서에서 "펩타이드 변이체 (peptide variants)"란 하나 또는 그 이상의 아미노산이 펩타이드의 아미노산 서열에 치환 (substitutions), 결실 (deletions), 첨가 (additions) 및/또는 삽입 (insertions)되어 있으면서, 원래의 아미노산으로 구성된 펩타이드와 거의 동일한 생물학적 기능을 발휘하는 것을 말한다. 펩타이드 변이체는 원래의 펩타이드와 70% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상의 동일성 (identity)을 가지고 있어야 한다.
이러한 치환체로서 "보존성"이라고 알려진 아미노산 치환제가 포함될 수 있다. 변이체는 또한 비보존성(nonconservative)의 변화를 포함할 수도 있다. 일례로, 변이체 폴리펩타이드의 서열은 5개 또는 그 이하의 아미노산이 치환, 결실, 부가 또는 삽입됨으로써, 원래의 서열과 달라진다. 변이체들은 또한 펩타이드의 면역원성(immunogenicity), 2차 구조(secondary structure) 및 수치료성(hydropathic nature)에 최소한의 영향을 주는 아미노산들의 결실 또는 부가에 의해 변화될 수 있다.
"보존성" 치환이란 하나의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환되었을 때에도 폴리펩타이드의 2차 구조 및 수치료성(hydropathic nature) 등의 특성에 큰 변화가 없는 것을 의미한다. 아미노산 변이는 아미노산 곁사슬 치환체의 상대적 유사성, 예컨대 극성(polarity), 전하(charge), 수용성(solubility), 소수성(hydrophobicity), 친수성(hydrophilicity) 및/또는 양친화성(amphipathic nature) 등의 유사성을 기초로 하여 얻어질 수 있다.
예를 들어 아미노산은 공통적인 곁사슬 특성에 따라 a) 소수성 (노르류신, 메티오닌, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신) b) 중성 친수성 (시스테인, 세린, 트레오닌, 아스파라진, 글루타민), c) 산성 (아스파르트산, 글루탐산), d) 염기성 (히스티딘, 리신, 아르기닌), e) 쇄 방향에 영향을 미치는 잔기 (글리신, 프롤린), f) 방향족 (트립토판, 티로신, 페닐알라닌)으로 분류될 수 있다. 보존적 치환은 이들 각각의 클래스 중 하나의 구성원을 동일한 클래스의 다른 구성원으로 교환하는 것을 수반할 것이다.
아미노산 곁사슬 치환체의 크기, 모양 및 종류에 대한 분석에 의하여, 아르기닌, 리신과 히스티딘은 모두 양전하를 띤 잔기이고; 알라닌, 글리신과 세린은 유사한 크기를 가지며; 페닐알라닌, 트립토판과 티로신은 유사한 모양을 갖는다는 것을 알 수 있다. 따라서 이러한 고려 사항에 기초하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘; 알라닌, 글리신과 세린; 그리고 페닐알라닌, 트립토판과 티로신은 생물학적으로 기능 균등물이라 할 수 있다.
변이를 도입하는 데 있어서, 아미노산의 소수성 인덱스(hydropathic index)가 고려될 수 있다. 각각의 아미노산은 소수성과 전하에 따라 소수성 인덱스가 부여되어 있다: 이소류신 (+4.5); 발린 (+4.2); 류신 (+3.8); 페닐알라닌 (+2.8); 시스테인/시스타인 (+2.5); 메티오닌 (+1.9); 알라닌 (+1.8); 글리신 (-0.4); 트레오닌(-0.7); 세린 (-0.8); 트립토판 (-0.9); 티로신 (-1.3); 프롤린 (-1.6); 히스티딘 (-3.2); 글루탐산 (-3.5); 글루타민 (-3.5); 아스파르트산 (-3.5); 아스파라긴 (-3.5); 라이신 (-3.9); 및 아르기닌 (-4.5).
단백질의 상호적인 생물학적 기능(interactive biological function)을 부여하는 데 있어서 소수성 아미노산 인덱스는 매우 중요하다. 유사한 소수성 인덱스를 가지는 아미노산으로 치환하여야 유사한 생물학적 활성을 보유할 수 있다는 것은 공지된 사실이다. 소수성 인덱스를 참조하여 변이를 도입시키는 경우, 바람직하게는 ±2 이내, 보다 바람직하게는 ±1 이내, 보다 더 바람직하게는 ±0.5 이내의 소수성 인덱스 차이를 나타내는 아미노산 사이에 치환을 한다.
한편, 유사한 친수성 값(hydrophilicity value)을 가지는 아미노산 사이의 치환이 균등한 생물학적 활성을 갖는 단백질을 초래한다는 것도 잘 알려져 있다. 다음과 같은 친수성 값이 각각의 아미노산 잔기에 부여되어 있다: 아르기닌 (+3.0); 리신 (+3.0); 아스파르트산 (+3.0±1); 글루탐산 (+3.0±1); 세린 (+0.3); 아스파라긴 (+0.2); 글루타민 (+0.2); 글리신 (0); 트레오닌 (-0.4); 프롤린 (-0.5 ± 1); 알라닌 (-0.5); 히스티딘 (-0.5); 시스테인 (-1.0); 메티오닌 (-1.3); 발린 (-1.5); 리신 (-1.8); 이소류신 (-1.8); 티로신 (-2.3); 페닐알라닌 (-2.5); 트립토판 (-3.4). 친수성 값을 참조하여 변이를 도입시키는 경우, 바람직하게는 ± 2 이내, 보다 바람직하게는 ± 1 이내, 보다 더 바람직하게는 ± 0.5 이내의 친수성 값 차이를 나타내는 아미노산 사이에 치환을 한다.
분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다(H.Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다.
일반적으로, 본 명세서상에 언급되어 있는 펩타이드들 (융합 단백질 포함) 및 폴리뉴클레오타이드들은 분리된(isolated) 것이다. "분리된 (isolated)" 펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드란 원래의 환경으로부터 제거된 것이다. 예를 들어, 자연 상태로 존재하는 단백질은 그 상태에서 함께 존재하는 물질들 전부 혹은 일부를 제거함으로써 분리되는 것이다. 이러한 폴리펩타이드는 적어도 90% 이상의 순도를 지녀야 하며, 바람직하게는 95%, 더욱 바람직하게는 99% 이상의 순도를 가져야 한다. 폴리뉴클레오타이드는 벡터 내에서 클로닝 시킴으로써 분리된다.
본 명세서에서 용어 "폴리뉴클레오타이드" 또는 "핵산"은 교환 가능하게 사용되며, 임의 길이의 뉴클레오타이드의 중합체를 지칭하고 DNA(예컨대 cDNA) 및 RNA 분자를 포괄적으로 포함한다. 핵산 분자의 구성 단위인 "뉴클레오타이드"는 데옥시리보뉴클레오타이드, 리보뉴클레오타이드, 변형된 뉴클레오타이드 또는 염기, 및/또는 그 유사체, 또는 DNA 또는 RNA 폴리머라제에 의해, 또는 합성 반응에 의해 중합체 내로 혼입될 수 있는 임의의 기질일 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 변형된 뉴클레오타이드, 당 또는 염기가 변형된 유사체(analogue), 예컨대 메틸화 뉴클레오타이드 및 그 유사체를 포함할 수 있다.
예를 들어, 뉴클레오타이드는 5-변형된 사이티딘 및/또는 5-변형된 우리딘을 포함할 수 있다. 5-변형된 사이티딘은 5-할로사이티딘(예를 들어, 5-요오도사이티딘 또는 5-브로모사이티딘), 5-알키닐사이티딘 및 또는 5-헤테로사이클릴우리딘을 포함한다. 5-변형된 우리딘은 5-할로우리딘(예를 들어, 5-요오도우리딘 또는 5-브로모우리딘), 5-알키닐우리딘 및/또는 5-헤테로사이클릴우리딘을 포함할 수 있다. 선택적으로, 5-변형된 우리딘은 2-디옥시리보오스를 함유하는 뉴클레오사이드이다.
뉴클레오타이드에서의 변이는 단백질에서 변이를 가져오지 않는 것도 있다. 이러한 핵산은 기능적으로 균등한 코돈 또는 동일한 아미노산을 암호화하는 코돈 (예를 들어, 코돈의 축퇴성에 의해, 아르기닌 또는 세린에 대한 코돈은 여섯 개이다), 또는 생물학적으로 균등한 아미노산을 암호화하는 코돈을 포함하는 핵산분자를 포함한다. 또한, 뉴클레오타이드에서의 변이가 단백질 자체에 변화를 가져올 수도 있다. 단백질의 아미노산에 변화를 가져오는 변이인 경우에도 본 개시의 단백질과 거의 동일한 활성을 나타내는 것이 얻어질 수 있다.
본 개시의 핵산 분자 또는 폴리뉴클레오타이드가 가지는 특징, 예를 들어 백신 및/또는 면역증강제로서의 효과를 갖는 범위에서, 본 개시의 펩타이드 및 핵산 분자는 서열목록에 기재된 아미노산 서열 또는 염기 서열에 한정되지 않는다는 것은 통상의 기술자에게 명확하다. 예를 들어, 발현 조절 서열과 작동 가능하게 연결되는 코딩 영역 및/또는 이로부터 발현되는 재조합 단백질/펩타이드에 포함될 수 있는 생물학적 기능 균등물은 전술한 코딩 영역 및/재조합 단백질과 균등한 생물학적 활성을 발휘하는 염기 서열의 변이를 가지는 폴리뉴클레오타이드 및/또는 아미노산 서열의 변이를 가지는 단백질/펩타이드일 수 있다.
상술한 생물학적 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 본 개시에 따른 펩타이드 및/또는 단백질을 암호화하는 핵산 분자는 서열목록에 기재된 서열과 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 개시의 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 61%의 상동성, 보다 바람직하게는 70%의 상동성, 보다 더 바람직하게는 80%의 상동성, 가장 바람직하게는 90%의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다. 서열비교를 위한 얼라인먼트 방법은 당업계에 공지되어 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "벡터"는 숙주 세포에 전달이 가능하며 바람직하게는 하나 이상의 목적 유전자 또는 서열의 발현이 가능하도록 만들어진 구조물을 의미한다. 또한, 특정 벡터는 벡터가 작동 가능하게 연결된 ORF 형태의 유전자의 발현을 지시할 수 있다. 이러한 벡터가 본 명세에서 "재조합 발현 벡터" (또는 간단히, "재조합 벡터")로서 지칭된다.
본 명세서에서 용어 "발현 조절 서열(expression control/regulation sequence)" 또는 "발현 조절 요소(expression control/regulation element)"는 핵산의 전사(transcription) 및/또는 전사체(transcript) 형태의 핵산으로부터 번역(translation)을 조절하는 핵산 서열을 의미할 수 있다. 한편, 용어 "전사 조절 서열(transcription control/regulation sequence)" 또는 "전사 조절 요소(transcription control/regulation element)"는 핵산의 전사를 조절하는 핵산 서열을 의미한다. 전사 조절 서열은 구조 프로모터(constitute promoter) 또는 유도 프로모터(inducible promoter)와 같은 프로모터 또는 인핸서(enhancer) 등이 있다.
또한, 전사체 형태의 핵산으로부터 단백질 또는 펩타이드로의 번역을 조절하는 핵산 서열에 대해서 "번역 조절 서열(translation control/regulation sequence)" 또는 "번역 조절 요소(translation control/regulation element)"라는 용어가 사용될 수 있다. 이들 발현 조절 서열/요소, 전사 조절 서열/요소 및/또는 번역 조절 서열/요소는 발현될 서열, 예를 들어 전사 또는 번역될 핵산 서열에 작동 가능하게 연결(operatively linked)되어 있다.
본 명세서에서 용어 "작동 가능하게 연결된 (operatively linked)"은 핵산의 발현 조절서열(예: 프로모터, 시그널 서열, 리보솜 결합부위, 전사 종결서열 등)과 다른 핵산 서열 사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 번역을 조절하게 된다.
핵산 분자
본 개시는 발현 조절 서열과 작동 가능하게 연결된 면역원성 표적 서열의 발현 효율이 향상되며, 이에 따라 이러한 발현 시스템을 이용하여 핵산 기반의 백신으로 활용될 수 있다는 점에 근거한다. 도 1은 본 개시의 예시적인 실시형태에 따라, 감염성 질환을 야기하는 단백질 또는 펩타이드를 효율적으로 발현시킬 수 있는 핵산 분자 또는 폴리뉴클레오타이드의 구성을 개략적으로 나타낸 모식도이다.
도 1에 나타낸 바와 같이, 핵산 분자는 발현 조절 요소(expression control element, ECE)와, 발현 조절 요소(ECE)와 작동 가능하게 연결되며, 바이러스 유래의 면역원을 암호화하는 열린해독틀(open reading frame, ORF)로 이루어진 코딩 영역(CR)을 포함할 수 있다.
발현 조절 요소(ECE)는 트로포닌 1(troponin T1, TNNT1, slow skeletal muscle) 유래의 번역 조절 요소(translation control element, TLCE)를 포함할 수 있다. 코딩 영역(CR)은 번역 조절 요소(TLCE)와 작동 가능하게 연결되며, 인플루엔자바이러스(Influenza virus) 및/또는 중증열성혈소판감소증후군바이러스(Severe fever with thrombocytopenia syndrome virus, SFTSV) 유래 면역원을 암호화하는(encoding) ORF로 이루어질 수 있다.
일 측면에서, 발현 조절 요소(ECE)는 코딩 영역(CR)과 작동 가능하게 연결되며, 번역 조절 요소(TLCE)의 상류에 위치하는 전사 조절 요소(transcription control element, TCCE)를 더욱 포함할 수 있다. 또한, 핵산 분자는 발현 조절 요소(ECE)의 하류, 예를 들어 전사 조절 요소(TLCE)의 하류에 위치하는 폴리아데닐레이션 신호 서열 또는 폴리아데노신 서열(PA) 중에서 적어도 하나의 뉴클레오타이드를 더욱 포함할 수 있다.
번역 조절 요소(TLCE)는 ORF 형태로 삽입되는 코딩 영역(CR)과 작동 가능하게 연결되는 TNNT1 유래의 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 예를 들어, 번역 조절 요소(TLCE)는 코딩 영역(CR)의 상류에 위치하는 제 1 번역 조절 요소(U-TLCE) 및/또는 코딩 영역(CR)의 하류에 위치하는 제 2 번역 조절 요소(D-TLCE)를 포함할 수 있다.
일례로, 제 1 번역 조절 요소(U-TLCE)는 캡 의존성(cap dependent) 번역 개시 활성을 갖는 5'-비번역영역 (5'-Untranslated Region, 5'-UTR)의 전부 또는 일부일 수 있고, 제 2 번역 조절 요소(D-TLCE)는 제 1 번역 조절 요소(U-TLCE)에 대응되는 3'-UTR의 전부 또는 일부일 수 있다.
대부분의 진핵세포의 mRNA는 5' 말단에 7-methyl-guanosine (cap)을 가지는데, 단백질 합성 개시 복합체(translation initiation complex)가 5' 말단에 위치한 cap을 인식하고 개시 코돈인 AUG까지 진행하여 단백질 합성을 시작한다. 즉, mRNA의 5' 말단에 위치한 cap 구조는 단백질 합성을 개시할 뿐만 아니라, nuclease의 작용으로부터 mRNA의 파괴를 막는다.
시험관내(in vitro)에서 전자의 첫 과정은 pDNA(plasmid DNA)에 제한 효소를 처리하여 선형화시킨 후, 적절한 RNA 중합 효소를 이용하여 제조된 mRNA에 m7G(5')-ppp(5')G (이를 regular cap analog)를 붙여서 capped mRNA를 만들어 사용할 수 있다. 선택적으로 cap analog 없이 시험관내 전사를 수행하고, 상업적으로 이용 가능한 vaccinia virus capping 효소를 사용하여 cap 반응을 수행하는 방법이 있으며, 이러한 cap의 역방향 반응을 막는 'anti-reverse' cap analog (ARCA)를 사용할 수 있다. ARCA를 도입하면, 메틸화가 일어난 guanosine의 3'-O-methylation만이 메틸화가 일어나지 않은 guanosine의 nucleotide에 결합할 수 있다.
예를 들어, 제 1 번역 조절 요소(U-TLCE) 및/또는 제 2 번역 조절 요소(D-TLCE)는 각각 동물, 예를 들어, 포유강, 구체적으로는 영장목, 보다 구체적으로는 인간으로부터 유래한 캡 의존성 번역 개시 활성을 갖는 뉴클레오타이드로 이루어질 수 있다. 예를 들어, 제 1 번역 조절 요소(U-TLCE)는 인간 TNNT1 유래의 5'-UTR의 일부일 수 있는 서열식별번호: 1의 뉴클레오타이드 또는 이의 전사체로 이루어질 수 있고, 제 2 번역 조절 요소(D-TLCE)는 TNNT1 유래의 3'-UTR의 일부일 수 있는 서열식별번호: 2의 뉴클레오타이드 또는 이의 전사체로 이루어질 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
일례로, 제 1 번역 조절 요소(D-TLCE)는 코딩 영역(CR)으로부터 발현되는 펩타이드 및/또는 단백질의 번역 과정에서 번역개시복합체(translation initiation complex)가 결합하는 영역으로서, 코딩 영역(CR)의 번역을 유도하는 cis-acting 뉴클레오타이드일 수 있다.
제 1 번역 조절 요소(U-TLCE)가 캡 의존성 번역 개시 활성을 갖는 뉴클레오타이드의 전부 또는 일부인 경우, 핵산 분자는 ORF 형태로 코딩 영역(CR)에 삽입되는 바이러스 유래의 면역원의 전부 또는 일부를 암호화하는 표적 유전자의 발현 효율을 향상시키기 위하여, 코딩 영역(CR)의 하류에 위치할 수 있는 제 2 번역 조절 요소(D-TLCE)를 포함할 수 있다. 제 1 번역 조절 요소(U-TLCE)와, 제 2 번역 조절 요소(D-TLCE)는 코딩 영역(CR)을 형성하는 인플루엔자 바이러스 및/또는 SFTSV에서 면역원으로 기능할 수 있는 펩타이드를 암호화하는 ORF 또는 이의 전사체(transcript)의 번역 효율을 향상시키고, 전사체인 mRNA가 세포 내에서 파괴되지 않고 안정적으로 유지되는데 중요한 역할을 한다.
일례로, 제 1 번역 조절 요소(U-TLCE)는 코딩 영역(CR)의 상류에 위치할 수 있고, 제 2 번역 조절 요소(D-TLCE)은 코딩 영역 (CR)의 하류에 위치할 수 있다. 다시 말하면, 코딩 영역(CR)은 제 1 번역 조절 요소(U-TLCE)와 제 2 번역 조절 요소(D-TLCE) 사이에 위치할 수 있으며, 인플루엔자바이러스 또는 SFTSV 유래의 펩타이드, 예를 들어 감염성 면역원을 암호화하는 표적 서열(target sequence)을 형성한다.
인플루엔자바이러스는 음성 가닥 RNA(negative-sense RNA) 바이러스로 A, B, C, D 네 가지 종류가 있다. 그 중에서 사람에게 주로 병을 일으키는 것은 A와 B 타입이다. A 타입은 바이러스 표현 항원인 hemagglutinin(HA)와 neuraminidase (NA)의 조합으로 구분이 된다. 세계적으로 매년 계절성 인플루엔자 환자 중 3 ~ 5백만명은 심각한 증상을 보이며 29만~65만명은 사망에 이른다. 효과적인 치료제는 아직 없으며 백신을 이용하여 예방하는 것이 최선이다. 불활성화 인플루엔자 백신은 1945년 미국에서 처음으로 승인되었으며 현재는 단백질 백신과 virus-like particle(VLP) 등을 이용한 다양한 방법으로 인플루엔자 백신 개발이 이루어지고 있다.
예시적인 측면에서, 코딩 영역(CR)에 암호화되는 인플루엔자바이러스의 면역원은 인플루엔자바이러스의 헤마글루티닌(Hemagglutin, HA) 또는 이의 단편일 수 있다. 예를 들어, 인플루엔자바이러스의 면역원인 헤마글루티닌은 서열식별번호: 3의 아미노산으로 이루어질 수 있다. 일례로, 인플루엔자바이러스의 면역원 또는 이의 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드는 서열식별번호: 4의 뉴클레오타이드 또는 이의 전사체로 이루어질 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
중증열성혈소판감소증후군(Severe fever with thrombocytopenia syndrome, SFTS)은 SFTSV에 의한 질환으로, 2013년에는 한국과 일본에서도 첫 환자가 보고되었다. 한국의 경우 2013년부터 2017년까지 605건의 환자 중 사망률은 평균 20.9%에 이르고 있다. 바이러스에 감염되었을 때의 증상은 주로 고열, 피로감, 두통, 근육통, 구토, 설사 등이며 중증의 경우 혈소판이 감소하고 신장, 간, 심장을 포함한 여러 장기의 복합적인 기능저하와 심하면 사망에 이른다.
SFTS는 대부분 중증열성혈소판감소증후군바이러스(SFTSV)를 가지는 진드기에 의한 감염에 의해 야기되며, 야외 활동이 많고 진드기가 주로 서식하는 풀에 접촉할 일이 많은 농업이나 임업 종사자에서 많이 발생한다. 한국의 경우 수확철인 7월에서 10월 사이에 많은 감염이 보고되고 있다. 진드기에 의해 감염되긴 하지만 다른 동물 숙주인 양, 돼지, 개, 고양이 등에도 전염될 수 있는데, 감염된 환자의 경우 혈중 바이러스 농도가 매우 높기 때문에 혈액을 통해 사람과 사람 간의 전파도 가능한 것으로 알려져 있다. 특히 진드기가 북아메리카로 넘어감에 따라 극동아시아를 넘어서 전세계적으로 발병할 수 있는 위험이 생겼다. 이에 2018년에는 국제보건기구 (WHO) 에서는 주의가 필요한 병원체 목록에 SFTSV를 포함시켰다.
SFTSV는 Bunyaviridae family에 속하며 3개의 분절을 포함한 음성가닥(negative-strand) RNA 바이러스이다. 유전체(genome)는 L 분절, M 분절 및 S 분절로 나뉜다. L 분절은 6368개의 뉴클레오타이드로 이루어져 있는데, RNA-의존 RNA 중합효소 유전자가 위치한다. M 분절은 3378개의 뉴클레오타이드로 이루어지며, 외피(envelope)에 존재하는 당단백질 Glycoprotein N(Gn) 및 Glycoprotein C(Gc) 유전자가 위치한다. S 분절은 1744개의 뉴클레오타이드로 이루어지며, 핵단백질(nucleoprotein)과 비-구조단백질(non-structural protein)을 암호화한다.
현재까지 SFTSV의 치료제와 백신은 상업적으로 개발되지 못하고 있다. 개발이 지연되고 있는 이유는 SFTS가 비교적 최근에 규명된 신종 감염 질환으로, 환자가 동북아시아에 집중되고 환자의 수가 많이 않았기 때문에 세계적인 관심이 크지 않았기 때문이다. 또한 적절한 동물 모델이 없었던 것도 SFTS의 치료제와 백신이 개발되지 못한 이유 중의 하나이다.
일례로, 코딩 영역(CR)에 암호화되는 중증열성혈소판감소증후군바이러스(SFTSV)의 면역원은 SFTSV의 당단백질 N(Gn) 또는 이의 단편일 수 있다.
예를 들어, SFTSV의 면역원인 당단백질(Gn)은 서열식별번호: 5 (본 명세서에서 Gn로 지칭), 서열식별번호: 7(본 명세서에서 GnΔTM로 지칭) 및 서열식별번호: 9(본 명세서에서 GnΔSTEM으로 지칭)로 구성되는 군에서 선택되는 아미노산 서열을 가지는, SFTSV의 당단백질 N으로부터 변이된 펩타이드로 이루어질 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 일례로, 일례로, SFSTV의 면역원 또는 이의 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드는 서열식별번호: 6, 서열식별번호: 8 및 서열식별번호: 10으로 구성되는 군에서 선택되는 뉴클레오타이드 또는 이의 전사체로 이루어질 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
예를 들어, 핵산 분자가 RNA 형태인 경우, 코딩 영역(CR)은 인플루엔자바이러스의 면역원(예를 들어, HA) 또는 SFTSV의 면역원(예를 들어, 당단백질) 또는 이들의 단편을 암호화하는 ORF를 가지는 전사체로 이루어질 수 있다.
코딩 영역(CR)을 구성하는 ORF의 길이는 제한이 없으며, ORF의 길이에 따른 발현 효율은 본 개시에 따른 핵산 분자, 이를 이용한 재조합 발현 벡터 및 치료 또는 예방을 위한 핵산 백신 등의 개발에서 큰 고려 대상이 아니다. Codon usage는 보통 다양한 종에서 단백질/펩타이드 발현에 영향을 미칠 수 있으나, 인간의 codon usage bias는 보통 단백질/펩타이드 발현에 큰 영향을 미치지 않는다고 알려져 있으므로, 인간을 대상으로 하는 핵산 백신이나 유전자 치료제를 개발할 때 고려 대상이 아니다.
필요한 경우, 개시 코돈(initial codon)은 Kozak 서열을 가질 수 있다. 종결 코돈 근처의 뉴클레오타이드도 최적화할 필요가 있다. 필요한 경우, 코딩 영역(CR)에서 발현하고자 하는 유전자 또는 이의 전사체인 mRNA의 코돈 서열 중 세 번째 부분을 GC로 바꾸어 아미노산의 변화 없이 표적 유전자의 GC%를 증가시켜 mRNA의 안정성을 높일 수 있다.
선택적인 실시형태에서, 핵산 분자는 ORF 형태로 연결되는 코딩 영역(CR)의 발현 효율을 증가시킬 수 있는 뉴클레오타이드가 더욱 삽입될 수 있다. 일례로, 핵산 분자는 번역 조절 요소, 예를 들어 제 1 번역 조절 요소(U-TLCE)에 인접하여 핵산 분자의 전사를 촉진하는 전사 조절 요소(TCCE)를 가질 수 있다. 예를 들어, 전사 조절 요소(TCCE)는 제 1 번역 조절 요소(U-TLCE)의 상류에 위치할 수 있다. 이러한 전사 조절 요소(TCCE)은 특별히 제한되는 것은 아니다.
예시적인 측면에서, 전사 조절 요소(TCCE)는 코딩 영역(CR)에 ORF 형태로 암호화된 인플루엔자 바이러스 유래의 HA 또는 SFTSV 유래의 Gn의 전사를 촉진하는 프로모터일 수 있다. 전사 조절 요소(TCCE)는 동물세포, 보다 구체적으로는 포유동물 세포에서 작동하여 코딩 영역(CR)에 암호화된 바이러스 유래 면역원의 전사를 조절할 수 있다.
일례로, 전사 조절 요소(TCCE)는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터, 포유동물 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터, 또는 박테리오파지에서 유래한 프로모터를 포함한다. 예를 들어, 전사 조절 요소(TCCE)는 CMV(cytomegalo virus) 프로모터, 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, HSV의 tk 프로모터, T7 박테리오파지 프로모터, T3 박테리오파지 프로모터, SM6 프로모터, RSV 프로모터, EF1 알파프로모터, 메탈로티오닌 프로모터, 베타-액틴 프로모터, 인간 IL-2 유전자의 프로모터, 인간 IFN 유전자의 프로모터, 인간 IL-4 유전자의 프로모터, 인간 림포톡신 유전자의 프로모터, 인간 GM-CSF 유전자의 프로모터, 암세포 특이적 프로모터(예컨대, TERT 프로모터, PSA 프로모터, PSMA 프로모터, CEA 프로모터, E2F 프로모터 및 AFP 프로모터) 및 조직 특이적 프로모터(예컨대, 알부민 프로모터)를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
예시적인 측면에서, T7 박테리오파지 프로모터, T3 박테리오파지 프로모터, SP6 박테리오파지 프로모터 등 선형화된 DNA 주형으로부터 mRNA를 전사할 수 있는 임의의 전사 조절 요소(TCCE)가 제 1 번역 조절 요소(U-TLCE)의 인근, 구체적으로 제 1 번역 조절 요소(U-TLCE)의 상류에 위치할 수 있다.
그 외에도 핵산 분자는 전술한 번역 조절 요소(TLCE), 코딩 영역(CR) 및 전사 조절 요소(TCCE) 이외에도, 코딩 영역(CR)에 삽입되는, 바이러스 유래의 면역원성 펩타이드를 암호화하는 유전자 또는 이의 전사체 서열로 이루어진 ORF의 발현을 유도할 수 있는 뉴클레오타이드가 삽입될 수 있다. 하나의 예시적인 실시형태에서, 핵산 분자는 전사 조절 요소(TCCE) 또는 제 1 번역 조절 요소(U-TLCE)와, 코딩 영역(CR)의 개시 코돈 사이에 삽입되는 Kozak 서열을 포함할 수 있다.
선택적으로, 핵산 분자는 코딩 영역(CR)의 하류, 보다 구체적으로는 제 2 번역 조절 요소(D-TLCE)의 하류에 전사된 핵산 분자를 안정화시키면서, 코딩 영역(CR)에 존재하는 바이러스 유래의 항원 펩타이드를 암호화하는 유전자 또는 이의 전사체 서열로 이루어지는 ORF의 번역 효율을 더욱 향상시킬 수 있는 폴리아데닐레이션 신호 서열 및/또는 폴리아데노신 서열(PA)이 더욱 삽입될 수 있다.
예를 들어, 본 개시의 핵산 분자가 RNA 형태의 전사체 서열로 이루어지는 경우, 폴리아데노신 서열(PA)은 대략 25개 내지 대략 400개, 예를 들어, 30개 내지 400개, 50 내지 250개, 또는 60 내지 250개의 아데노신으로 이루어지는 뉴클레오타이드일 수 있다.
다른 예시적인 측면에서, 본 개시의 핵산 분자가 DNA 형태로 이루어지는 경우, 폴리아데닐레이션 신호 서열(PA)이 코딩 영역(CR)의 하류에 위치할 수 있다. 일례로, 폴리아데닐레이션 신호 서열(PA)은 SV40, 인간 성장호르몬 (human growth factor, hGH), 소 성장 호르몬 (Bovine Growth hormone, BGH) 또는 토끼 베타-글로빈 (rabbit beta-globin, rbGlob) 등에서 유래한 것을 사용할 수 있지만, 본 개시가 이에 한정되지 않는다.
선택적으로, 폴리아데닐레이션 신호 서열 또는 폴리아데노신 서열(PA)은 다수의 아데노신, 예를 들어, 25개 내지 대략 400개, 30개 내지 400개, 50개 내지 250개, 또는 60개 내지 250개의 아데노신 또는 이의 전사체로 이루어진 2개의 뉴클레오타이드 사이에 5'- GATCATCAGT - 3'과 같은 신호 서열 또는 링커 서열이 삽입된 서열로 이루어질 수도 있다.
핵산 분자에 코딩 영역 (CR)을 삽입하기 위하여 핵산 분자는 하나 이상의 클로닝 사이트, 바람직하게는 멀티플 클로닝 사이트 (Multiple Cloning Site; MCS)를 포함할 수 있다. 하나 이상의 클로닝 사이트는 하나 이상의 제한효소 (restriction endonuclease) 인식 서열 (recognition site) 및/또는 제한효소에 의해 절단되는 서열을 포함할 수 있다. 제한효소는 박테리아나 고세균 등에서 발견되는 자연적인 제한효소는 물론이고, 인위적으로 제조된 제한효소 (예를 들어, Zinc finger nuclease이나 TAL effector의 DNA 결합 부위에 근거한 제한효소 또는 PNA-기반의 PNAznymes 등)를 포함할 수 있다.
예를 들어, 자연적으로 일어나는 제한효소는 1) Type Ⅰ 제한효소 (인식 부위와 떨어지는 부위를 절단하고, ATP, S-adenosyl-L-methionine 및 마그네슘 이온을 필요로 함), 2) Type Ⅱ 제한효소 (인식부위 내부 또는 인식부위에서 약간 떨어진 특정 부위를 절단하며, 대부분 마그네슘 이온을 필요로 함), 3) Type Ⅲ 제한효소 (인식 부위에서 약간 떨어진 부위를 절단하며, ATP는 필요하지만, ATP의 가수분해는 필요 없음), 4) Type Ⅳ 제한효소 (메틸화, 하이드록시메틸화 또는 글루코실-하이드록시메틸화 등 변형된 부위를 표적으로 함), 5) Type Ⅴ 제한효소 (CRISPRs의 cas9-gRNA complex) 등으로 구분될 수 있다.
예를 들어, 멀티플 클로닝 사이트에 아래의 제한효소에 의해 인식되는 부위 및/또는 제한효소 절단 부위를 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. AngⅠ, AatⅠ, AbaⅠ, BamHⅠ, BbvⅠ, BcgⅠ, BplⅠ, BsmAⅠ, Alw26Ⅰ, BsrⅠ, ClaⅠ, EarⅠ, Eco57Ⅰ, EcoRⅠ, EcoRⅡ, EcoRⅤ, FokⅠ, HaeⅢ, HindⅢ, HpaⅢ, HphⅠ, KpnⅠ, MboⅠ, MluⅠ, NaeⅠ, NdeⅡ, NgoMⅣ, NlaⅢ, NotⅠ, PacⅠ, PstⅠ, SacⅠ, SacⅡ, SalⅠ, SapⅠ, SfaNⅠ, SmaⅠ, TaqⅠ, XbaⅠ, XhoⅠ, PvuⅠ 및 이들의 조합. 하나의 예시적인 측면에서, 클로닝 사이트는 서열식별번호: 16 내지 서열식별번호: 21 중에서 적어도 하나의 제한효소 인식 부위 및/또는 제한효소 절단 부위를 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
핵산 분자는 DNA 또는 RNA일 수 있다. 예시적인 실시형태에 따르면, 본 개시에 따른 핵산 분자는 RNA 형태를 가질 수 있다. 코딩 영역(CR)이 인플루엔자바이러스 또는 SFTSV의 면역원을 암호화하는 ORF의 전사체 서열로 이루어지는 등 핵산 분자가 RNA 형태로 이루어지는 경우, DNA 형태의 핵산 분자에 비하여 유리하다.
DNA 형태의 핵산 분자와 달리, RNA 형태의 핵산 분자는 mRNA로의 전사를 위해서 숙주 세포의 핵 안으로 진입할 필요가 없다. RNA 형태의 핵산 분자는 핵 내에서 숙주의 염색체 내로 끼어들어갈 가능성이 없으며, 숙주 세포에서 선별 생산하기 위해 사용하는 선별 마커인 항생제 저항 유전자가 RNA 핵산 분자의 제작에 불필요하고, RNA는 DNA에 비하여 반감기가 짧기 때문에 장기 유전자 변형(persistence genetic transformation)을 유도하지 않는다.
RNA 형태의 핵산 분자는 상대적으로 DNA 형태의 핵산 분자에 비하여 적은 양을 사용하더라도 원하는 생체내 면역 반응을 유도할 수 있다. 또한, RNA 형태의 핵산 분자를 제작할 때, 모든 제작 공정을 인공적으로 제어할 수 있기 때문에, 생물학적 오염에 대한 위험 없이 소규모 GMP(good manufacturing practice) 생산 시설에서 안전하게 생산할 수 있다. RNA 핵산 분자를 생산할 때 감염원을 직접 다룰 필요가 없으며, 대신 발현하고자 하는 감염원의 중화항체 유도 관련 부분(중화 epitope)의 핵산 서열만을 인공적으로 합성하고, 시험관내 전사(in vitro transcription, IVT)만으로 대량의 RNA 핵산 분자를 생산할 수 있다. 최근에는 IVT 반응과 관련된 시약, 특히 DNA-의존성 RNA 중합효소가 개선되어 소량의 DNA 주형 (template)을 이용하여 대량의 RNA를 1~2주 안에 신속하게 생산할 수 있다.
RNA 형태의 핵산 분자는 naked DNA 핵산 분자에 비하여 더욱 강한 면역 반응을 유도할 수 있고, RNA 핵산 분자 자체가 세포 내에서 복잡한 항원 복합체(complex antigen)을 생산하고 이것이 항원 제시 세포의 MHC(major histocompatiblity complex; 주조직적합성복합체) class Ⅱ에 접근하여 이상적인 면역증강제로 기능할 수 있다. 또한, 면역 반응을 유도하고자 하는 다수의 항원을 동시에 제작하여 혼합한 후 면역할 수 있으며, 발현하고자 하는 항원의 유전자 길이에 특별한 제약이 없어 RNA 핵산 분자 제작의 응용성 및 간편성이 증가할 수 있다.
RNA 형태일 수 있는 핵산 분자를 활용하고자 하는 경우, 제 1 번역 조절 요소(U-TLCE)의 상류에 IVT를 가능하게 하는 적절한 전사 조절 요소(TCCE)가 위치할 수 있다. RNA 형태의 핵산 분자는 IVT 과정을 통해서 합성될 수 있기 때문에, 일반적인 생백신이나 사백신 제조에 사용되는 살아 있는 바이러스나 병원성 미생물을 직접 다룰 필요가 없으며, 재조합 단백질/펩타이드를 생산하기 위하여 반드시 사용해야 하는 효모, 대장균, 곤충 세포와 같은 숙주 세포의 배양 등이 불필요하다.
벡터에 삽입된 DNA 형태의 핵산 분자를 IVT 과정을 통해 mRNA 형태로 전사할 때, 제한효소 등으로 말단이 전달되어 선형화된 DNA를 주형으로 이용하여 RNA 중합효소(RNA polymerase)에 의해 RNA 형태의 핵산 분자를 시험관에서 합성할 수 있다. 선형화된 DNA로부터 RNA로의 전사를 위해서 예를 들어 박테리오파지 등에서 유래한 프로모터 서열과 같은 전사 조절 요소(TCCE)가 번역 조절 요소(TLCE)의 상류에 위치할 수 있다.
재조합 발현 벡터, 발현 컨스트럭트 및 핵산 분자 주입
도 1에 도시된 핵산 분자는 재조합 발현 벡터 내에 삽입될 수 있다. 재조합 발현 벡터는 번역 개시 활성을 가지는 번역 조절 요소(TLCE)와, 코딩 영역(CR)을 포함하고, 전사 조절 요소(TCCE) 및 또는 폴리아데닐레이션 신호 서열(PA)을 포함할 수 있다. 즉, 재조합 발현 벡터는 도 1을 참조하면서 설명한 핵산 분자를 포함할 수 있는데, 이 핵산 분자는 다른 핵산과 결합하여 융합 단백질 또는 융합 펩타이드를 암호화할 수도 있다. 이 경우, 핵산 분자는 유전자 전달체인 발현 컨스트럭트(expression construct)의 형태로 생체 내에 주입될 수 있다.
유전자 전달체로 사용될 수 있는 벡터는 다양한 형태로 제작될 수 있으며, 바이러스 벡터(viral vectors), DNA 또는 RNA 발현 벡터(expression vectors), 플라스미드(plasmid), 코스미드(cosmid) 또는 파지벡터(phage vectors), CCA(cationic condensing agents)와 연결된 DNA 또는 RNA 발현 벡터, 예를 들어, 플라스미드를 내포하는 리포좀(liposomes) 또는 니오좀으로 포장된 포장된 DNA 또는 RNA 발현 벡터, 프로듀서 세포(producer cells)와 같은 특정 진핵세포(eukaryotic cells) 등이 포함된다.
예시적으로, 본 개시의 핵산 분자는 포유동물 세포 내로 들어가서 발현되도록 구성될 수 있다. 이러한 구성은 감염성 질환의 치료 및/또는 예방 목적에 사용하는 데에 특히 유용할 수 있다. 핵산 분자를 숙주 세포 내에서 발현시키는 데에는 많은 방법이 있으며 적절한 어느 방법도 사용 가능하다. 예를 들어, 본 개시에 따른 핵산 분자는 발현 컨스트럭트 또는 유전자 전달 시스템을 구성하는 임의의 벡터에 삽입될 수 있다.
벡터의 한 유형은 벡터의 한 유형은 추가의 DNA 절편이 그 내부에 라이게이션될 수 있는 원형 이중 가닥 DNA 루프를 지칭하는 “플라스미드”이다. 또 다른 유형의 벡터는 파지 벡터이다. 또 다른 유형의 벡터는 추가의 DNA 절편이 바이러스 게놈 내로 라이게이션될 수 있는 바이러스 벡터이다. 한 특정 벡터는 그것이 도입된 숙주 세포 내에서 자율 복제가 가능하다 (예를 들어, 박테리아 복제 기점을 갖는 박테리아 벡터 및 에피솜 포유동물 벡터). 다른 벡터 (예를 들어, 비-에피솜 포유동물 벡터)는 숙주 세포 내로 도입 시에 숙주 세포의 게놈 내로 통합될 수 있고, 이에 의해 숙주의 게놈과 함께 복제된다. 또 일반적으로, 재조합 DNA 기술에 유용한 발현 벡터는 종종 플라스미드의 형태로 존재한다.
일례로, 핵산 분자는 바이러스 유전자 전달 시스템을 이용하여 숙주 세포로 삽입될 수 있다. 핵산 분자가 삽입될 수 있는 바이러스 벡터는 아데노바이러스(adenovirus), 아데노-연관 바이러스(adeno-associated virus, AAV), 레트로바이러스(retrovirus), 백시니아 (vaccinia) 또는 다른 폭스 바이러스 (e.q., avian pox virus), 렌티바이러스, 헤르페스 심플렉스 바이러스 유래의 벡터를 포함할 수 있다. 예를 들어, 바이러스 벡터는 인간면역결핍바이러스(HIV), 원숭이면역결핍바이러스(SIV)와 같은 렌티바이러스 유래의 벡터; 설치류 레트로바이러스(murine reteroviruses), 기본 백혈병 바이러스 (gibbon ape leukemia virus), AAVs (adeno-associated viruses) 및 아데노바이러스 (adenoviruses) 등에서 유래된 레트로 바이러스 벡터가 포함되나, 이에 한정되지 않는다. 그 외에도, 설치류 백혈병 바이러스(murine leukemia virus, MuLV), 기본 백혈병 바이러스(gibbon ape leukemia virus, GaLV), 에코트로픽 레트로바이러스 (ecotropic retroviruses) 등에서 유래된 레트로 바이러스 벡터들이 널리 사용되고 있다. 본 개시에 따른 벡터 시스템은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있다.
필요한 경우, 전술한 핵산 분자를 적절한 벡터에 삽입한 뒤에 시험관내 전사(in vitro transcription, IVT)를 통하여 RNA 형태의 핵산 분자로 변형될 수 있다.
핵산 분자, 예컨대 DNA를 이러한 벡터에 삽입시키는 기술에 관해서는 이미 잘 알려져 있다. 레트로 바이러스 벡터에는 형질도입 된 세포들의 확인 또는 선택을 쉽게 해 주는 선택 마커(selectable marker)에 대한 유전자 및/또는 특정한 표적 세포에 대한 수용체 역할을 하는 리간드(ligand)를 암호화하는 유전자와 같은 표적 부위(targeting moiety)를 부가적으로 삽입시킬 수 있다. 표적(targeting)은 또한 항체를 이용한 공지의 방법에 의해서도 이루어질 수 있다.
입수 가능하고 본 개시가 속하는 기술분야에 공지된 다수의 벡터를 본 개시의 목적에 사용할 수 있다. 적절한 벡터의 선택은 주로 벡터에 삽입되는 핵산 분자의 크기 및 벡터로 형질전환 되는 특정한 숙주 세포에 따라 달라질 것이다. 각각의 벡터는 그의 기능(이종 폴리뉴클레오타이드의 증폭 또는 발현, 또는 둘 다) 및 벡터가 존재하는 특정한 숙주 세포와의 상용성에 따라 다양한 성분을 함유한다. 벡터 성분은 일반적으로 복제 기점(특히 벡터가 원핵세포에 삽입되는 경우), 선별 마커 유전자, 프로모터, 리보솜 결합 부위(RBS), 신호 서열, 이종 핵산 삽입물 및/또는 전사 종결 서열을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
예를 들어, 본 개시에 따른 발현 벡터는 코딩 영역(CR) 내에 암호화된, 인플루엔자바이러스 또는 SFTSV 항원의 발현에 영향을 미칠 수 있는 발현 조절 요소, 예를 들어, 개시 코돈, 종결 코돈, 폴리아데닐레이션 신호 서열, 인핸서, 막 표적화 또는 분비를 위한 신호서열 등을 포함할 수 있다. 인핸서 서열은 프로모터에서 다양한 부위에 위치하여 인핸서 서열이 없을 때의 프로모터에 의한 전사 활성과 비교하여, 전사 활성을 증가시키는 핵산 염기서열이다.
숙주가 에스케리키아 (Escherichia) 속 균인 경우에는 신호 서열은 PhoA 신호서열, OmpA 신호서열 등이, 숙주가 바실러스 (Bacillus)속 균인 경우에는 α-아밀라아제 신호서열, 서브틸리신 신호서열 등을 이용할 수 있다. 숙주가 효모인 경우에는 신호 서열은 MF-α 신호서열, SUC2 신호서열 등이, 숙주가 동물세포인 경우에는 인슐린 신호서열, a-인터페론 신호서열, 항체 분자 신호서열 등을 이용할 수 있으나, 본 개시가 이에 제한되지 않는다.
어떤 벡터(예를 들어, 박테리아 복제 기점을 갖는 박테리아 벡터 및 에피솜 포유동물 벡터)는 그것이 도입된 숙주 세포 내에서 자율 복제가 가능하다. 다른 벡터(예를 들어, 비-에피솜 포유동물 벡터)는 숙주 세포 내로 도입 시에 숙주 세포의 게놈 내로 통합될 수 있고, 이에 의해 숙주의 게놈과 함께 복제된다.
본 개시에 따른 벡터 시스템은 본 개시가 속하는 기술분야에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있다. 또한, 본 개시의 벡터는 전형적으로 클로닝(cloning)을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 또한, 본 개시의 벡터는 원핵세포 또는 진핵세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 예를 들어, 본 개시에 이용될 수 있는 벡터는 본 개시가 속하는 기술분야에서 종종 사용되는 플라스미드(예: pSC101, ColE1, pBR322, pUC8/9, pHC79, pUC19, pET 등), 파지 (예: λgt4λB, λ-Charon, λΔz1, λGEM.TM.-11 및 M13 등) 또는 바이러스 (예: SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있다.
구성적 또는 유도성 프로모터는 통상의 기술자에 의해 확인될 수 있는 특정한 상황의 필요에 따라 본 개시에 사용될 수 있다. 다양한 가능한 숙주 세포에 의해 인식되는 다수의 프로모터가 널리 공지되어 있다. 선택된 프로모터는 제한 효소 소화를 통해 공급원 핵산 분자로부터 프로모터를 제거하고 단리된 프로모터 서열을 선택 벡터 내로 삽입함으로써, 면역원성 펩타이드 또는 단백질을 암호화하는 유전자 또는 전사체의 ORF로 이루어진 코딩 영역(CR)을 가지는 핵산 분자에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 천연 프로모터 서열 및 다수의 이종 프로모터를 둘 다 사용하여 코딩 영역(CR)을 구성하는 유전자 또는 전사체의 증폭 및/또는 발현을 지시할 수 있다. 이종 프로모터는 일반적으로 천연 프로모터와 비교하여 발현된 관심유전자의 보다 큰 전사 및 보다 높은 수율을 얻을 수 있기 때문에 바람직할 수 있다.
예를 들어, 본 개시의 벡터가 발현 벡터이고, 원핵세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터(예컨대, tac 프로모터, lac 프로모터, lacUV5 프로모터, lpp 프로모터, pLλ 프로모터, pRλ프로모터, rac5 프로모터, amp 프로모터, recA 프로모터, SP6 프로모터, trp 프로모터 및 T7 프로모터 등)와 같은 전사 조절 요소(TCCE), 번역을 개시하기 위한 번역 조절 서열(TLCE1, TLCE2), 및 전사/번역 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 숙주 세포로서 E. coli가 이용되는 경우, E. coli 트립토판 생합성 경로의 프로모터 및 오퍼레이터 부위 (Yanofsky, C., J.Bacteriol., 158:1018-1024(1984)) 그리고 파아지 λ의 좌향 프로모터가 발현 조절 부위로 이용될 수 있다.
한편, 본 개시의 벡터가 발현 벡터이고, 진핵세포를 숙주로 하는 경우에는, 포유동물 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터(예: 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터(예: 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터 및 HSV의 tk 프로모터) 또는 박테리오파지에서 유래한 프로모터(예: T7 프로모터, T3 프로모터, SM6 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐레이션 신호 서열을 일반적으로 갖는다.
또한, 본 개시의 재조합 벡터가 복제 가능한 발현 벡터인 경우, 복제가 개시되는 특정 핵산 서열인 복제원점 (replication origin)을 포함할 수 있다. 또한, 재조합 벡터는 선별 마커(selection marker)를 포함할 수 있다. 선별 마커는 벡터로 형질전환 된 세포를 선별하기 위한 것으로, 약물 내성, 영양 요구성, 세포 독성제에 대한 내성 또는 표면 단백질의 발현과 같은 선택가능 표현형을 부여하는 마커들이 사용될 수 있다. 본 개시의 벡터는 선별 표지로서, 해당 기술분야에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함하며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자가 있다. 선별제(selective agent)로 처리된 환경에서 선별 마커를 발현하는 세포만 생존하므로 형질전환 된 세포를 선별할 수 있다. 선별 마커의 대표적인 예로써, 영양 요구 마커 (auxotrophic marker)인 ura4, leu1, his3 등을 들 수 있으나 상기 예에 의해 본 개시에서 사용될 수 있는 선별 마커의 종류가 제한되는 것은 아니다.
발현 벡터에 서브클론 된 서열을 증폭시키는 여러 가지 시험관내 증폭 기법들(in vitro amplification techniques)이 알려져 있다. 이러한 기법에는 PCR (polymerase chain reaction), LCR (ligase chain reaction), Qβ-복제효소 증폭 (replicase amplification) 및 다른 RNA 중합효소를 이용한 기법들이 있다.
본 개시의 벡터는 그로부터 발현되는 재조합 단백질 또는 펩타이드의 정제를 용이하게 하기 위하여, 다른 서열과 융합될 수도 있다. 융합되는 서열은 예컨대, 글루타티온 S-트랜스퍼라제 (Pharmacia, USA), 말토스 결합 단백질 (NEB, USA), FLAG (IBI, USA) 및 6 x His (hexahistidine; Quiagen, USA) 등이 있고, 가장 바람직하게는 6 x His이다. 상기 정제를 위한 추가적인 서열 때문에, 숙주에서 발현된 단백질은 친화성 크로마토그래피를 통하여 신속하고, 용이하게 정제된다. 필요한 경우에 이들 재조합 단백질의 세포외 분비를 촉진할 수 있도록 Fc 절편을 암호화하는 서열이 융합될 수도 있다.
본 개시의 예시적인 실시형태에 따르면, 상기 융합 서열이 포함되어 있는 벡터에 의해 발현된 융합 단백질은 친화성 크로마토그래피에 의해 정제된다. 예컨대, 글루타티온-S-트랜스퍼라제가 융합된 경우에는 이 효소의 기질인 글루타티온을 이용할 수 있고, 6 x His이 이용된 경우에는 Ni-NTA His-결합 레진 컬럼 (Novagen, USA)을 이용하여 소망하는 재조합 단백질을 신속하고 용이하게 얻을 수 있다.
전술한 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주 세포는 본 개시가 속하는 기술분야에 공지된 어떠한 숙주 세포도 이용할 수 있으며, 예컨대, E. coli JM109, E. coli BL21(DE3), E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있다. 또한, 본 개시의 벡터를 진핵 세포에 형질전환 시키는 경우에는 숙주 세포로서, 이스트(Saccharomyce cerevisiae), 곤충 세포(예컨대 SF9 세포) 및 사람 세포(예컨대, CHO 세포주 (Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주) 등이 이용될 수 있다.
본 개시의 벡터는 세포를 세포내외(in vivo, ex vivo) 또는 시험관 내(in vitro)에서 유전적으로 변형시키는데 이용될 수 있다. 세포를 유전적으로 변형시키는 방법으로는 세포를 바이러스 벡터로 감염 또는 형질도입 시키는 방법, 인산칼슘 침전법(calcium phosphate precipitation), 수용체 세포 (recipient cells)를 DNA를 포함하는 세균 프로토플라스트(bacterial protoplasts)와 융합시키는 방법, 수용체 세포에 DNA를 포함하고 있는 리포좀(liposome) 또는 미세소구(microspheres)를 처리하는 방법, 엔도사이토시스(DEAE dextran, receptor-mediated endocytosis), 일렉트로포레이션(electroporation), 마이크로 인젝션(micro-injection) 등을 포함한 여러 가지 방법이 알려져 있다.
예를 들어 숙주 세포가 원핵세포인 경우, CaCl2 방법, 하나한 방법 및/또는 전기 천공 방법 등에 의해 실시될 수 있다. 또한, 숙주 세포가 진핵세포인 경우에는, 미세 주입법, 칼슘 포스페이트 침전법, 전기 천공법, 리포좀-매개 형질감염법, DEAE-덱스트란 처리법, 및/또는 유전자 밤바드먼트 등에 의해 벡터를 숙주 세포 내로 주입할 수 있다. 숙주 세포 내로 주입된 벡터는 숙주 세포 내에서 발현될 수 있으며, 이러한 경우에는 다량의 재조합 단백질 또는 재조합 펩타이드를 얻게 된다. 예를 들어, 상기 발현 벡터가 lac 프로모터를 포함하는 경우에는 숙주 세포에 IPTG를 처리하여 유전자 발현을 유도할 수 있다.
약학 조성물
다른 측면에 따르면, 본 개시는 전술한 핵산 분자 및/또는 유전자 전달체로서 전술한 핵산 분자가 삽입된 발현 시스템인 발현 컨스트럭트(construct)를 유효 성분으로 함유하는 독감 또는 SFTS를 예방 또는 치료하기 위한 약학 조성물, 예를 들어 백신 조성물에 관한 것이다. 즉, 전술한 핵산 분자 또는 이를 포함하는 발현 컨스트럭트는 면역원으로 기능하여, 독감 또는 SFTS를 예방 또는 치료하기 위한 약학 조성물의 유효 성분일 수 있다.
따라서, 본 개시의 다른 측면에 따르면, 전술한 핵산 분자의 약학적 유효량을 포함하고, 필요에 따라 약학적으로 허용되는 담체(carrier)를 포함하는 독감 또는 SFTS를 예방 또는 치료하기 위한 약학 조성물이 개시된다. 이 경우 전술한 핵산 분자는 피-대상체에 직접적으로 투여된다. 본 명세서에서 "약학적 유효량"이란, 본 개시에 따른 핵산 분자의 효능 또는 활성을 달성하는데 충분한 양을 의미한다.
본 개시의 다른 측면에 따르면, 본 개시는 상술한 본 개시의 핵산 분자가 삽입된 발현 컨스트럭트를 포함하고, 필요에 따라 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 독감 또는 SFTS를 예방 또는 치료하기 위한 약학 조성물 개시된다. 또 다른 측면에서, 본 개시는 약학적 유효량의 전술한 핵산 분자 또는 발현 컨스트럭트를 피대상체에 투여하는 단계를 포함하여, 독감 또는 SFTS를 예방 또는 치료하기 위한 방법에 관한 것이다.
본 개시에 따른 핵산 분자 또는 발현 컨스트럭트의 약학적 유효량을 포함하는 약학 조성물은 담체, 희석제 및/또는 부형제를 포함한다. 하나의 예시적인 측면에서, 유효 성분인 핵산 분자 또는 발현 컨스트럭트는 생리학상 허용되는 담체, 즉 생약 투여 형태로 사용되는 투여량 및 농도에서 수용자에게 비독성인 담체와 함께, 주위 온도, 적절한 pH에서, 원하는 정도의 순도로 혼합됨으로써 제제화될 수 있다. 제제의 pH는 주로 화합물의 특정한 용도 및 농도에 따라 달라지지만, 바람직하게는 약 3 내지 약 8의 범위이다. 또 다른 실시양태에서, 화합물은 멸균된다. 화합물은 예를 들어 고체 또는 무정형 조성물, 동결건조 제제 또는 수용액으로서 저장될 수 있다.
하나의 예시적인 실시형태에서, 전술한 핵산 분자 또는 발현 컨스트럭트는 양이온성 폴리머, 양이온성 펩타이드 또는 양이온성 폴리펩타이드와 같은 핵산 안정화제를 이용하여 약학 조성물 중에 안정화될 수 있다. 핵산 안정화제로 사용될 수 있는 양이온성 (폴리)펩타이드는 폴리라이신 또는 폴리아르기닌과 같은 다중 양이온성 폴리머, 양이온성 지질 또는 리포펙턴트 (lipofectant)일 수 있다. 보다 구체적으로, 안정화제는 히스톤, 뉴클레오린, 프로타민, 올리고펙타민, 스페르민 또는 스페르미딘 및 양이온성 다당류, 특히 키토산, TDM, MDP, 뮤라밀 디펩타이드, 플루로닉 및/또는 이들의 유도체일 수 있다. 히스톤 및 프로타민은 DNA를 천연적으로 컴팩트하게 하는 양이온성 단백질이다.
일례로, 핵산 분자 또는 발현 컨스트럭트와 함께 복합체를 형성할 수 있는 히스톤은 히스톤 H1, H2a, H3 및 H4를 포함하며, 프로타민은 프로타민 P1 또는 P2, 특히 프로타민의 양이온성 부분 서열이 바람직하다. 필요한 경우, 본 개시에 따른 핵산 분자와 함께 복합체를 형성할 수 있는 다른 화합물은 추가적으로 사용되는 면역증강제(adjuvant)일 수 있다. 추가적인 면역증강제는 약학적으로 활성인 물질 및 핵산 분자의 면역원성을 향상시킬 수 있다.
하나의 예시적인 측면에서, 면역증강제는 프로타민, 뉴클레오린, 스페르민, 스페르미딘 및 양이온성 다당류와, 안정화 양이온성 펩타이드 또는 폴리펩타이드, 특히 키토산, TDM, MDP, 뮤라밀 디펩타이드, 플루로닉, 백반 (alum) 용액, 알루미늄 히드록시드, ADJUMER (폴리포스파젠); 알루미늄 포스페이트 겔; 조류 (algae)의 글루칸; 알가뮬린 (algammulin); 알루미늄 히드록시드 겔 (백반(alum)); 높은 단백질-흡착성 알루미늄 히드록시드 겔; 낮은 점성의 알루미늄 히드록시드 겔; AF 또는 SPT (스쿠알란(5%)의 에멀젼, Tween-80(0.2%), PLURONIC-L121(1.25%), 포스페이트-완충 식염수, pH 7.4); AVRIDINE (프로판디아민); BAY R1005 ((N-(2-데옥시-2-L-류실아미노-b-D-글루코피라노실)-N-옥타데실도데카노일-아미드 히드로아세테이트); CALCITRIOL (1α,25-디히드록시-비타민 D3); 칼슘 포스페이트 겔; CAPTM (칼슘 포스페이트 나노입자); 콜레라홀로톡신, 콜레라-독소-A1-단백질-A-D-절편 융합 단백질, 콜레라 독소의 서브 유닛 B; CRL 1005 (블록 코폴리머 P1205); 사이토카인-포함 리포솜; DDA (디메틸디옥타데실암모늄 브로마이드); DHEA (디히드로에피안드로스테론); DMPC (디미리스토일 포스파티딜콜린); DMPG (디미리스토일 포스파티딜글리세롤); DOC/백반 (alum) 복합체 (데옥시콜린산 소듐염); Freund 완전 애주번트; Freund 불완전 애주번트; 감마 이눌린; Gerbu 애주번트(N-아세틸글루코사미닐-(P1-4)-N-아세틸뮤라밀-L-알라닐-D-글루타민(GMDP), 디메틸디옥타데실암모늄 클로라이드(DDA), 징크-L-프롤린염 복합체 (ZnPro-8)의 혼합물; GM-CSF); GMDP (N-아세틸글루코사미닐-(b1-4)-N-아세틸뮤라밀-L-알라닐-D-이소글루타민); 마퀴모드(1-(2-메틸프로필)-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-4-아민); (N-아세틸글루코사미닐-N-아세틸뮤라밀-L-Ala-D-이소Glu-L-Ala-글리세롤디팔미테이트); DRV(탈수-재수화 (re-hydration)비히클 (vesicle)로부터 제조된 면역리포솜); 인터페론-감마; 인터류킨-1베타; 인터류킨-2; 인터류킨-7; 인터류킨-12; ISCOMS("면역증강 복합체 (Immunostimulating Complexes)"); ISCOPREP 7.0.3.; 리포솜; LOXORIBINE (7-알릴-8-옥소구아노신(구아닌)); LT 경구 애주번트 (E.coli 라이어블(labile) 엔테로톡신-프로톡신); 조성물의 마이크로스피어 및 마이크로입자; MF59; (스쿠알렌-물의 에멀젼); MONTANIDE ISA 51 (정제된 불완전 Freund 애주번트); MONTANIDE ISA 720 (대사작용이 가능한 오일 애주번트); MPL (3-Q-데사실(desacyl)-4'-모노포스포릴 지질 A); MTP-PE 및 MTP-PE 리포솜 ((N-아세틸-L-알라닐-D-이소글루타미닐-L-알라닌-2-(1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-(히드록시포스포릴옥시))-에틸아미드, 모노소듐염); MURAMETIDE (Nac-Mur-L-Ala-D-Gln-OCH3); MURA PALMITINE 및 D-MURAPALMITINE (Nac-Mur-L-Thr-D-이소GIn-sn-글리세롤디팔미토일); NAGO (뉴라미니다아제-갈락토오스 옥시다아제); 조성물의 나노스피어 또는 나노 입자; NISV (비이온성 계면활성제 비히클(vesicle)); PLEURAN (베타-글루칸); PLGA, PGA 및 PLA (젖산과 글리콜산의 호모폴리머 및 코폴리머; 마이크로스피어/나노스피어); PLURONIC L121; PMMA (폴리메틸 메타크릴레이트); PODDS (프로테노이드 마이크로스피어); 폴리에틸렌 카바메이트 유도체; 폴리-rA: 폴리-rU (폴리아데닐산-폴리우리딜산 복합체); 폴리소르베이트 80 (Tween 80); 단백질 코크리트 (cochleate)(Avanti Polar Lipids, Inc., Alabaster, AL); STIMULON (QS-21); Quil-A (Quil-A 사포닌); S-28463 (4-아미노-otec-디메틸-2-에톡시메틸-1H-이미다조[4,5-c]-퀴놀린-1-에탄올); SAF-1 ("신텍스 애주번트(adjuvant) 제제"); 센다이(Sendai) 프로테오리포솜 및 센다이 (Sendai)-함유 지질 매트릭스; Span-85 (소르비탄 트리올레이트); Specol (Marcol 52, Span 85 및 Tween 85의 에멀젼); 스쿠알렌 또는 Robane (2,6,10,15,19,23-헥사메틸테트라코산 및 2,6,10,15,19,23-헥사메틸-2,6,10,14,18,22-테트라코사헥산); 스테아릴티로신 (옥타데실티로신 히드로클로라이드); Theramid (N-아세틸글루코사미닐-N-아세틸뮤라밀-L-Ala-D-이소Glu-L-Ala-디팔미톡시프로필아미드); 트레오닐-MDP (Termurtide 또는 [thr-1]-MDP; N-아세틸뮤라밀-L-트레오닐-D-이소글루타민); Ty 입자 (Ty-VLP 또는 바이러스-유사 입자); Walter-Reed 리포솜 (수산화 알루미늄에 흡착된 지질 A를 포함하는 리포솜), 및 이와 유사한 것 등을 포함한다.
일례로, 약학 조성물에 포함되는 면역증강제는 alum(Th2 면역 반응을 유도하여 체액성 면역 반응 강화); MF59, AS03, AS04 (TLR-4 agonist인 MPL과 alum 혼합, GSK), AddaVax (스쿠알렌 기반; InvivoGen)과 같은 oil-in-water 에멀션형 면역증강제(항원성 면역 반응 강화하고, Th1 면역 반응을 균형 있게 유도); Toll-like receptors (TLRs), RIG-I-like receptors (RLRs), NOD-like receptors (NLRs)와 같은 pattern recognition receptors (PRRs) 등의 agonist인 LPS (지방다당류), Poly:C, imidazoquinolines (imiquinod나 R848), CpG oligonucleotides 등을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 개시에 따른 핵산 분자 또는 발현 컨스트럭트와, 면역증강제를 혼합하는 경우에 이들의 배합 비율은 특별히 한정되지 않는다. 일례로, 본 개시에 따른 핵산 분자 또는 발현 컨스트럭트와, 면역증강제는 100:1 내지 1:100, 바람직하게는 10:1 내지 1:10, 더욱 바람직하게는 5:1 내지 1:5, 가장 바람직하게는 3:1 내지 1:3의 중량 비율로 배합될 수 있다.
필요한 경우, 약학 조성물은 지속-방출 제제를 제조할 수 있다. 지속-방출 제제의 적합한 예는 핵산 분자 또는 유전자 전달체를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스를 포함하고, 이 매트릭스는 성형품, 예를 들어 필름 또는 마이크로-캡슐의 형태이다. 지속-방출 매트릭스의 예는 폴리에스테르, 하이드로겔(예를 들어, 폴리(2-하이드록시에틸-메타크릴레이트), 또는 폴리(비닐알코올)), 폴리락티드, L-글루탐산 및 감마-에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비-분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체 및 폴리-D-(-)-3-하이드록시부티르산을 포함한다.
선택적인 측면에서, 약학 조성물은 유효 성분으로 사용되는 핵산 분자를 보호하고, 생체 주입 활성을 향상시킬 수 있는 지질나노입자(lipid nano particle, LNP)를 포함할 수 있다. 지질나노입자는 서로 물리적으로 회합된 다수의 지질 분자를 포함하는데, 마이크로스피어(단일층 및 다중층 소포, 예컨대 리포좀을 포함), 에멀션에 분산된 상, 미셸, 또는 현탁액의 내부 상을 포함한다. 지질나노입자는 전달을 위해 본 개시의 핵산 분자 또는 핵산 분자로부터 발현된 펩타이드(단백질)을 캡슐화하기 위해 사용될 수 있다.
양이온성 지질을 함유한 제제는 핵산 분자와 같은 다가 음이온을 전달하는 데 유용하다. 포함될 수 있는 다른 지질은 중성 지질(즉, 하전되지 않은 또는 양성이온성 지질), 음이온성 지질, 트랜스펙션을 증강시키는 헬퍼 지질, 및 나노입자가 생체 내에서 존재할 수 있는 시간의 길이를 증가시키는 스텔스 지질 (stealth lipid)이다. 적합한 양이온성 지질, 중성 지질, 음이온성 지질, 헬퍼 지질, 및 스텔스 지질의 예는, 본 명세서에 참조로 병합된 WO 2016/010840 A1에 개시되어 있다.
예를 들어, 캡슐화를 위한 지질은 양이온성 지질, 생분해성 지질일 수 있다. 일례로, 이러한 지질은 (9Z,12Z)-3((4,4-비스(옥틸옥시)부타노일)옥시)-2-((((3-(다이에틸아미노)프로폭시)카르보닐)옥시)메틸)프로필옥타데카9,12-다이에노에이트, ((5-((다이메틸아미노)메틸)-1,3-페닐렌)비스(옥시))비스(옥탄-8,1-다이일)비스(데카노에이트), 2-((4-(((3-(다이메틸아미노)프로폭시)카르보닐)옥시)헥사데카노일)옥시)프로판-1,3-다이일(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-비스(옥타데카-9,12-다이에노에이트), 3-(((3-(다이메틸아미노)프로폭시)카르보닐)옥시)-13-(옥타노일옥시)트라이데실 3-옥틸운데카노에이트, 헵타트라이아콘타-6,9,28,31-테트라엔-19-일 4-(다이메틸아미노)부타노에이트(Dlin-MC3-DMA (MC3)으로도 알려져 있음)를 들 수 있다.
적합한 중성 지질은 중성, 비전하 또는 양성이온성 지질을 포함할 수 있다. 중성 인지질은 5-헵타데실벤젠-1,3-다이올(레조르시놀), 다이팔미토일포스파티딜콜린(DPPC), 다이스테아로일포스파티딜콜린(DSPC), 포스포콜린(DOPC), 다이미리스토일포스파티딜콜린(DMPC), 포스파티딜콜린(PLPC), 1,2-다이스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DAPC), 포스파티딜에탄올아민(PE), 난포스파티딜콜린(EPC), 다이라우로일포스파티딜콜린(DLPC), 다이미리스토일포스파티딜콜린(DMPC), 1-미리스토일-2-팔미토일 포스파티딜콜린(MPPC), 1-팔미토일-2-미리스토일포스파티딜콜린(PMPC), 1-팔미토일-2-스테아로일포스파티딜콜린(PSPC), 1,2-다이아라키도일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DBPC), 1-스테아로일-2-팔미토일 포스파티딜콜린(SPPC), 1,2다이에이코세노일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DEPC), 팔미토일올레오일포스파티딜콜린(POPC), 리소포스파티딜콜린, 다이올레오일 포스파티딜에탄올아민 (DOPE) 등을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
헬퍼 지질은 트랜스펙션을 증강시키고/거나, 막 융합생성성(fusogenicity)을 증강시킬 수 있다. 헬퍼 지질은 스테로이드, 스테롤, 및 알킬 레조르시놀을 포함한다. 구체적으로, 헬퍼 지질은 콜레스테롤, 5-헵타데실 레조르시놀, 및 콜레스테롤 헤미석시네이트를 포함할 수 있다.
스텔스 지질은 입자 응집을 감소시키고 입자 크기를 제어함으로써 제제화 과정을 보조하거나, LNP의 약동학적 특성을 조절할 수 있다. 일례로, 스텔스 지질은 PEG(폴리에틸렌글리콜 또는 폴리에틸렌 옥사이드), 폴리(옥사졸린), 폴리(비닐 알코올), 폴리(글리세롤), 폴리(N-비닐 피롤리돈), 폴리아미노산, 및 폴리 N-(2-하이드록시프로필)메타크릴아미드와 같은 친수성 헤드를 가지는 중합체를 포함할 수 있다. 구체적으로, 스텔스 지질은 PEG-다이라우로일글리세롤, PEG-다이미리스토일글리세롤(PEG-DMG), PEG-다이팔미토일글리세롤, PEG-다이스테아로일글리세롤(PEG-DSPE), PEG-다이라우릴글리카미드, PEG-다이미리스틸글리카미드, PEG-다이팔미토일글리카미드, PEG-다이스테아로일글리카미드, PEG-콜레스테롤(1-[8'-(콜레스트-5-엔3[베타]-옥시)카르복사미도-3',6'-다이옥사옥타닐]카바모일-[오메가]-메틸-폴리(에틸렌글리콜), PEG-DMB(3,4다이테트라데콕실벤질-[오메가]-메틸-폴리(에틸렌글리콜)에테르) 등을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 개시의 핵산 분자는 비-항원 특이적인 면역 반응을 유발할 수 있다. 면역 반응과 관련해서 T-림포사이트는 T-헬퍼 1(Th1) 세포 및 T-헬퍼 2(Th2) 세포로 분화되며, 면역 체계는 세포내 (Th1) 및 세포외 (Th2) 병원균 (예를 들면 항원)을 파괴할 수 있다. Th1 세포는 대식세포 및 세포독성 T-세포의 활성에 의해 세포성 면역 반응을 돕는다. 한편, Th2 세포는, 원형질 세포로의 전환을 위한 B-세포의 증강 및 항체 (예를 들면 항원에 대항하는)의 형성에 의해 체액성 면역 반응을 촉진한다. Th1/Th2 비율은 면역 반응에서 매우 중요한데, 본 개시의 핵산 분자는 Th1 면역 반응, 즉 세포 매개성 변역 반응을 강화, 유도한다. 따라서 본 개시에 따른 핵산 분자가 약학적으로 활성인 물질, 예를 들어 면역 증강 성분과 함께 생체에 투여되면, 약학 조성물은 약학적으로 활성인 물질에 의해 유발된 특정한 면역 반응을 더욱 강화시킬 수 있다.
하나의 예시적인 측면에서, 약학 조성물은 전술한 핵산 분자 이외에 약학적으로 활성인 물질을 더욱 포함할 수 있다. 일 측면에서, 약학적으로 활성인 물질은 면역원과 같은 면역 증강 성분이다. 일례로, 약학적으로 활성인 물질은 암, 전염병, 자가면역 질환 또는 알레르기에 대한 치료 및/또는 예방 효과를 가지는 화합물일 수 있다. 예를 들어, 약학적으로 활성인 물질은 펩타이드, 단백질, 핵산, 치료적으로 활성 있는 저분자량의 유기 또는 무기 화합물, 당, 항원 또는 항체, 당업계에서 공지된 치료제, 항원 세포, 항원 세포의 절편, 세포 조각, 화학적 또는 광선 조사에 의하여 변형된 (예를 들어 약독화되거나 비활성화된) 병원균 (바이러스 또는 박테리아 등)을 포함한다.
일례로, 약학적으로 활성인 물질의 하나인 항원은 펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질, 세포, 세포 추출물, 다당류, 복합 다당류, 지질, 글리코리피드 및 탄수화물일 수 있다. 예를 들어, 종양 세포의 표면 항원 및 표면 항원, 특히, 바이러스 병원균, 박테리아 병원균, 곰팡이 병원균 또는 원생 동물 병원균의, 분비된 형태가 바람직하다. 물론 항원은, 예를 들어 본 개시에 따른 핵산 분자 내부에 존재할 수 있고, 또한, 적당한 담체(carrier)에 결합된 햅텐(haptene)으로 존재할 수 있다. 다른 항원 성분, 비활성화되거나 약독화된 병원균이 또한 사용될 수 있다.
본 개시에 따른 약학 조성물은 핵산 분자, 약학적으로 활성인 물질 이외에 약학적으로 허용되는 담체(carrier)를 포함할 수 있다. 하나의 예시적인 측면에서, 조성물이 액체 형태인 경우, 약학적으로 허용되는 담체는 예를 들어, 발열원이 없는 물(pyrogen-free water); 예를 들어 포스페이트, 시트레이트 등등, 완충 용액과 같은 등장액(isotonic saline) 또는 완충 (수)용액, 예를 들어, 땅콩유, 면실유, 참기름, 올리브유, 옥수수유 및 카카오 열매의 오일과 같은 식물성 기름; 예를 들어, 폴리프로필렌 글리콜, 글리세롤, 소르비톨, 만니톨 및 폴리에틸렌 글리콜; 알기닌산 등과 같은 폴리올을 포함할 수 있다. 액체의 백신 조성물을 생체에 주입하기 위하여 나트륨염, 칼슘염 및 선택적으로 칼륨염을 포함하는 수성 버퍼가 사용될 수 있다. 나트륨염, 칼슘염 및 칼륨염은 염소, 요오드 또는 브롬과 같은 할로겐의 형태, 또는 수산화물, 탄산염, 탄산수소염, 또는 황산염 등의 형태로 존재할 수 있다.
또한, 약학 조성물이 고체 형태인 경우, 약학적으로 허용되는 담체는 고체 필러, 액체 필러 또는 희석제와 같은 고체 담체를 포함할 수 있으며, 생체에 투여하기 적당한 캡슐화 (encapsulating) 화합물이 또한 사용될 수 있다. 예를 들어, 약학적으로 허용되는 고체 담체는, 락토오스, 글루코오스 및 수크로오스와 같은 당; 예를 들어, 옥수수 전분 또는 감자 전분과 같은 전분; 예를 들어, 소듐 카르복시메틸셀룰로오스, 에틸셀룰로오스, 셀룰로오스 아세테이트와 같은 셀룰로오스 및 이의 유도체; 분말화된 트래거캔스; 엿기름 (malt); 젤라틴; 수지 (tallow); 예를 들어, 스테아르산, 마그네슘 스테아레이트와 같은 고체 활택제; 칼슘 설페이트 등등.
약학적으로 허용되는 담체는 본 개시에 따른 약학 조성물이 투여되는 방식에 따라 선택될 수 있다. 본 개시에 따른 약학 조성물은, 예를 들어, 전신으로 (systemically) 투여될 수 있다. 투여 경로는, 예를 들어, 경구 (oral), 피하내, 정맥내, 근육내, 관절내 (intra-articular), 활액내 (intrasynovial), 흉골내, 경막내 (intrathecal), 간내 (intrahepatic), 병변내 (intralesional), 두개내 (intracranial), 경피 (transdermal), 진피내 (intradermal), 폐내 (intrapulmonal), 복강내 (intraperitoneal), 심장내 (intracardial), 동맥내 (intraarterial), 및 설하 국소 (sublingual topical) 및/또는 비강내 (intranasal) 경로를 포함한다.
사용되어야 하는 약학 조성물의 적당한 양은 동물 모델을 이용한 통상의 실험에 의해 결정될 수 있다. 그러한 모델은, 어떠한 제한을 내포함이 없이, 토끼, 양, 마우스, 쥐, 개 및 인간이 아닌 영장류 모델을 포함한다. 바람직한 주사용 단위 투여 형태는 멸균 수용액, 생리 식염수, 또는 이의 혼합물을 포함한다. 그러한 용액의 pH는 약 7.4로 조정되어야 한다.
주사용으로 적당한 담체는 히드로젤, 조절된 방출용 장치, 지연된 방출용 (delayed release) 장치, 폴리젖산 (polylactic acid) 및 콜라겐 매트릭스를 포함한다. 국소 용도로 적당한 약학적으로 허용되는 담체는 로션, 크림, 젤 및 이와 유사한 것에 사용되는데 적당한 것을 포함한다. 만약 화합물이 경구로 (perorally) 투여된다면, 태블릿, 캡슐 및 이와 유사한 것은 바람직한 단위 투여 형태이다. 구강 투여를 위하여 사용될 수 있는, 단위 투여 형태의 제조를 위한 약학적으로 허용되는 담체는 당업계에 잘 알려져 있다.
필요한 경우, 약학적으로 활성인 물질 및/또는 핵산 분자에 의하여 유도되는 면역원성을 더욱 증가시키기 위하여, 본 개시에 따른 약학 조성물은 하나 이상의 보조 물질을 추가적으로 포함할 수 있다. 이러한 보조 물질의 비제한적인 예는 수지상 세포(DC)의 성숙을 허용하는 화합물, 예를 들어 리포다당질, TNF-알파 또는 CD40 리간드, GM-CFS 및/또는 사이토카인이다. 구체적으로, 다양한 인터루킨류, 인터페론류, GM-CSF, G-CSF, M-CSF, LT-베타, TNF-알파, hGH와 같은 성장 인자와 같은, 면역 반응을 촉진하는, 모노킨, 림포킨, 인터류킨 또는 케오카인과 같은 사이토카인이다.
본 개시에 따른 약학 조성물에 추가적으로 하나 이상의 완충제, 안정화제, 계면활성제, 습윤제, 윤활제, 유화제, 현탁화제, 보존제, 항산화제, 불투명화제, 활택제, 가공 보조제, 착색제, 감미제, 향료, 향미제, 희석제, 및 약물 (즉, 본 개시의 유효 성분인 핵산 분자, 유전자 전달체 또는 이의 백신 조성물)의 멋진 외양을 제공하거나 제약 제품(즉, 의약)의 제조에 도움이 되는 다른 공지된 첨가제를 포함할 수 있다. 일례로, Tween과 같은 같은 유화제; 예를 들어, 소듐 라우릴 설페이트와 같은 습윤제; 착색제; 맛을 부여하는 제제 (taste-imparting agent), 태블릿을 형성하는 제제; 안정화제; 항산화제; 보존제이다.
본 개시에 따라 약학 조성물 중의 핵산 분자의 함량이나 농도는 특별히 제한되지 않는다. 특히, RNA 플랫폼 형태의 핵산 분자를 사용하는 경우, 생체 내에서 신속하게 분해되기 때문에 안전성 및 안정성을 확보할 수 있다. 하나의 예시적인 실시형태에서, 본 개시에 따른 핵산 분자는 약학 조성물 중에 1 내지 1000 ug/mL, 바람직하게는 10 내지 1000 ug/mL의 농도로 사용될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
적절한 면역 반응에 중요한 요인은 다른 T-세포 아집단(sub-population)의 증강이다. T-림프구는 전형적으로 2개의 아집단, 즉 T-헬퍼 1(Th1) 세포 및 T-헬퍼 2(Th2) 세포로 분화되며, 상기 아집단은 세포내 (Th1) 병원균 및 세포외 (Th2) 병원균 (예를 들면, 항원)을 파괴할 수 있는 면역계를 가지고 있다. 상기 2개의 Th 세포 집단은, 그들에 의해 생산된 이펙터 단백질(사이토카인)의 패턴에 있어서 차이가 있다. 일반적으로, Th1 세포는 주로 체액성 면역과 관련하여 대식세포 및 세포독성이 있는 T-세포의 활성에 의한 세포 면역 반응을 돕는다. 한편, Th2 세포는 주로 세포성 면역과 관련하여 원형질 세포로의 전환을 위한 B-세포의 증강에 의해, 그리고 항체(예를 들면, 항원에 대한 항체)의 형성에 의해, 체액성 면역 반응을 촉진시킨다. 따라서 Th1/Th2 비율은 면역 반응에서 상당히 중요하다. 본 개시에 따른 핵산 분자는 Th1 면역 반응 및 Th2 면역 반응을 모두 강화한다.
일례로, 본 개시에 따른 약학 조성물은 종양-특이성(tumor-specific) 또는 병원균-특이성 면역 반응을 유발하여, 종양 및 전염성 질병을 예방하기 위하여 사용될 수 있다. 선택적으로, 약학 조성물은 알레르기성 장애 또는 질병, 자가면역성 질병의 예방을 위해 사용될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 개시에 따른 약학 조성물은 임의의 편리한 투여 형태, 예를 들어 정제, 분말, 캡슐, 용액, 분산액, 현탁액, 시럽, 분무제, 좌제, 겔, 에멀젼, 패치 등으로 투여될 수 있다. 이러한 조성물은 제약 제제에 통상적인 성분, 예를 들어 희석제, 담체, pH 조정제, 감미제, 벌킹제 및 추가의 활성제를 함유할 수 있다.
본 개시의 약학 조성물은 본 개시가 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
한편, 본 명세서에서 제제는 또한 치료할 특정한 적응증에 필요한 경우에는 하나 초과의 활성 화합물, 바람직하게는 서로 유해한 영향을 미치지 않는 보완적 활성을 갖는 화합물을 함유할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 조성물은 그의 기능을 증진시키는 작용제, 예컨대 예를 들어 세포독성제, 사이토카인, 화학요법제, 또는 성장-억제제, 또는 성장-증진제를 포함할 수 있다. 이러한 분자는 의도된 목적에 유효한 양으로 조합되어 적합하게 존재한다.
선택적인 측면에서, 본 개시의 핵산 분자를 포함하는 유전자 전달체가 약학 조성물에 포함될 수 있다. 유전자 전달체는 목적하는 면역원을 암호화하는 뉴클레오타이드를 운반 및 발현시키기 위하여 제작된 것이다. 유전자 전달체를 제조하기 위해, 관심 유전자의 전사체는 적합한 발현 컨스트럭트(expression construct) 내에 존재하는 것이 바람직하다. 발현 컨스트럭트에서, 바이러스 유래 면역원을 암호화하는 관심 유전자의 전사체는 전사 조절 요소(TCCE)에 작동 가능하게 연결되는 것이 바람직하다.
예를 들어, 발현 컨스트럭트는 전술한 핵산 분자가 삽입된 발현 벡터일 수 있다. 이때, 벡터는 핵산 분자를 포함할 수 있으며, 핵산 분자는 다른 뉴클레오타이드와 결합하여, 융합 단백질 또는 융합 펩타이드를 암호화할 수도 있다.
한편, 상술한 유전자 전달체를 세포내로 도입하는 방법은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 실시될 수 있다. 본 개시에서, 유전자 전달체가 바이러스 벡터에 기초하여 제작된 경우에는, 당업계에 공지된 바이러스 감염 방법에 따라 실시된다. 또한, 본 개시에서 유전자 전달 시스템이 naked 재조합 DNA 분자 또는 플라스미드인 경우에는, 미세 주입법, 칼슘 포스페이트 침전법, 전기 천공법, 리포좀-매개 형질감염법, DEAE-덱스트란 처리법), 및 유전자 밤바드먼트 방법에 의해 유전자를 세포내로 이입시킬 수 있다.
실시예 1: 인플루엔자바이러스 hemagglutinin(HA) 암호화 서열이 삽입된 핵산 분자 제작
인플루엔자바이러스의 Hemagglutinin(HA) 암호화하는 뉴클레오타이드가 삽입된 핵산 분자를 제작하였다. MCS를 갖는 핵산 분자로부터 인플루엔ㅌ자바이러스의 HA를 암호화하는 코딩 영역을 갖는 주형 DNA 서열은 다음과 같이 설계하였다.
5'- KpnⅠ 인식 서열(GGTACC) - T7 프로모터 (서열식별번호: 11) - 인간 troponin T1(TNNT1) 유래의 번역 조절 요소(서열식별번호: 1) - PacⅠ 인식 서열(TTAATTAA) - Kozak 서열(GCCACC) - 인플루엔자바이러스 HA(서열식별번호: 3) 암호화 서열(HA, 서열식별번호: 4) - ClaⅠ 인식 서열(ATCGAT) - 인간 troponin T1(TNNT1) 유래의 번역 조절 요소(서열식별번호: 2) - EcoRⅠ 인식 서열(GAATTC) - 폴리아데닐레이션 시그널 (서열식별번호: 12) - SapⅠ 인식 서열(GAAGAGC) - NotⅠ 인식 서열(GCGGCCGC) - 3'.
주형 DNA를 pGH 벡터(서열식별번호: 13의 하류 및 서열식별번호: 14의 상류)에 삽입, 클로닝(cloning)하고 제한효소로 linearization시켜, in vitro transcription (IVT)를 통해 RNA 플랫폼 형태의 핵산 분자 (이하, "pHJ5L-HA"라 함)를 제작하였다.
실험예 1: in vivo 마우스 면역 및 항원 특이적 면역글로불린 및 사이토카인 생성 측정
Wild type Balb/c 마우스에 saline(Group 1)과, 실시예 1에서 제작된 pHJ5L-HA 핵산 분자(Group 2)를 투여하였다. RNA 형태의 핵산 분자는 N-methylpseudouridine(m1Ψ)과 cellulose로 정제하였다. RNA는 시중에 판매 중인 cap1 방식의 capping reagent를 사용하여 변형시켰고, Moderna 사의 COVID-19 mRNA 백신에 사용된 지질나노입자(lipid-based nanoparticles, LNP)를 사용하여 formulation하였다.
Formulation된 pHJ5L-HA를 2주 간격으로 2회 마우스에 근육 주사 한 뒤, 마지막 면역 후 2주일 후에 마우스의 혈액 채취 및 장기를 적출하여 핵산 분자에 의한 면역 유도 정부를 확인하였다. 본 실험예에서 마우스 면역 그룹은 하기 표 1과 같고, 각 그룹 당 5마리의 마우스를 면역하였다.
마우스 면역 그룹 및 투여량
Group N Substrate Dose Route
Group 1 5 Saline 60 ㎕/mouse 근육 주사
Group 2 5 pHJ5L-HA + LNP 60 ㎕/mouse 근육 주사
마지막 면역으로부터 2주 후 마우스를 이산화탄소로 안락사 후 부검하여 복대정맥에서 혈액을 채취하였다. 채취한 혈액은 상온에 2시간 이상 방치하여, 혈구를 응집시킨 후 4,000g 에서 15분 동안 원심분리 하여 혈청을 따로 분리하였다. 96-well plate에 HA 단백질을 100 ng 코팅한 후 1차 항체로서 1% BSA in PBS에 1:200으로 혈액을 희석하여 50 ㎕씩 넣었다. 상온에서 2시간 동안 반응시킨 후 0.5% PBST 200 ㎕로 3번 씻어낸 후 2차 항체로 goat anti-mouse IgG H+I HRP conjugated를 1% BSA in PBS에 1:3000으로 희석하여 100 ㎕씩 넣었다. 상온에서 1시간 반응 후 씻어준 뒤 TMB 용액을 100 ㎕씩 넣어주어 발색을 확인하였다. 발색이 충분히 진행되었으면 2N 황산을 50 ㎕씩 넣어 반응을 멈추고, 흡광도를 측정할 수 있는 spectrophotometer를 이용해 450 nm의 파장으로 흡광도를 측정하였다.
본 실시예에 따라 마우스 혈청 내에서 분비된 항원 특이적 항체의 양을 ELISA로 측정한 결과를 도 2, 도 3 및 도 4에 나타낸다. 생리 식염수를 주사한 음성 대조군(G1)과 달리, 실시예 1에서 제작한 mRNA 핵산 분자로 면역한 그룹(G2)에서 HA 단백질에 특이적인 항체가 많이 생성된 것을 확인하였다. 특히, Th2 면역 반응에 관여하는 IgG1과 Th1 면역 반응에 관여하는 IgG2a가 모두 많이 생성되었고 혈청을 12,800배 희석하여 측정하여도 높은 흡광도를 나타내, 많은 항체를 형성한 것을 확인할 수 있었다.
실험예 2: Hemagglutin Inhibition (HI) assay를 통한 중화 능력 평가
실험예 1과 같은 방법을 사용하여 마우스의 혈청을 얻었다. 96-well 플레이트에 25 ㎕의 PBS를 넣었다. 첫 번째 column에 25 ㎕의 마우스 혈청을 넣고 옆의 column으로 순차적으로 2배씩 희석하였다. pHJ5L-HA mRNA에 암호화된 HA와 같은 종류의 인플루엔자 바이러스(PR8 HA)를 25 ㎕씩 모든 well에 넣어준 후 30분 동안 반응시켰다. 이후, 1%의 칠면조 혈액을 50 ㎕씩 넣고, 적혈구가 응집될 때까지 기다렸다. 적혈구가 응집된 것은 바이러스의 HA 항원 때문이며, 적혈구가 응집되지 않은 것은 혈청에 HA 항체가 있기 때문이다. 분석 결과를 도 5에 나타낸다. 도 5에 나타낸 바와 같이, pHJ5L-HA mRNA를 넣어준 그룹에선 높은 희석 배율에도 적혈구 응집을 막아내 높은 항체 역가(titer)를 가지고 있음을 알 수 있다.
실험예 3: Microneutralization assay를 통한 중화 능력 측정
실험예 1과 같은 방법을 사용하여 마우스의 혈청을 얻었다. 96-well 플레이트에 MDCK 세포를 3x104 cells/well이 되게 깔았다. 혈청은 12 ㎕씩 준비하여 56℃에서 30분 동안 불활성화하였다. 불활성화 한 혈청을 배지로 10배 희석하여 80 ㎕씩 비어있는 96-well 플레이트의 첫 줄에 넣었다. 다른 well에는 40 ㎕씩 배지를 넣고 첫 줄의 혈청을 40 ㎕씩 넘기며 2배씩 희석하였다. 각 well에 100 TCID50/40 ㎕ 농도의 바이러스를 40 ㎕씩 넣어주고 37℃ 인큐베이터에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응한 바이러스와 혈청은 50 ㎕씩 배지를 제거한 96-well 플레이트의 MDCK 세포 위에 넣고, 37℃ 인큐베이터에서 2시간 동안 감염시켰다. 2시간 후 완전배지 50 ㎕를 각 well에 넣어주고 37℃ 인큐베이터에 넣었다. 시간대별로 세포를 관찰하여 세포 병변이 발생하면 상층액을 모두 제거하고, 4% 포름알데히드 용액을 넣고 3시간 이상 고정하였다. 그 후 2% 크리스탈 바이올렛 용액을 각 well에 넣어 30분 이상 염색하고, 씻어내어 바이러스 역가를 측정하였다. 측정 결과를 도 6에 나타낸다. pHJ5L-HA mRNA로 면역한 군에서는 효과적으로 바이러스를 중화한 것을 확인하였다.
실험예 4: 항원 특이적 IFN-감마 생성 측정
(1) ELISPOT 분석
실험예 1의 면역 스케줄에 따라 면역한 마우스를 희생할 때 적출한 비장을 40 ㎛ strainer를 이용하여 최대한 단일 세포가 될 수 있게 갈아주었다. 갈아준 비장 세포를 pre-coating ELISpot plate에 5x105 cells/well의 개수로 50 ㎕씩 넣어 주었다. Non-stimulation(Group 1)의 경우 RPMI1640 완전배지(10% FBS, 1% antibiotics)를 50 ㎕, pHJ5L-HA mRNA에서 발현된 peptide stimulation(Group 2)의 경우 완전배지에 4 ㎍/well의 농도로 7 종류의 HA 펩타이드를 넣어 50 ㎕씩 넣어주었다. 37℃인큐베이터에서 48시간 배양 후 제조사에서 제공한 프로토콜에 따라 실험을 진행하였다. 측정 결과를 도 7에 나타낸다. 음성 대조군(G1)과 비교해서, pHJ5L-HA mRNA로 면역한 군(G2)에서 spot의 개수가 증가하여, IFN-감마를 분비하는 세포가 크게 증가한 것을 확인하였다.
(2) FACS를 이용한 유세포 분석
위에서 갈아준 비장 세포를 round-bottom 96-well plate에 1x106 cells/well의 개수로 넣어준 뒤 마찬가지로 7종류의 HA 펩타이드를 4 ㎍/well의 농도로 넣어주어 stimulation 한 후 24시간 동안 37℃ 인큐베이터에서 배양하였다. 그 후 T 세포 특이적인 항체와 IFN-감마 특이적인 항체를 이용하여 염색한 후 유세포 분석기를 통하여 IFN-감마를 생성하는 T 세포를 구분하였다. 분석 결과를 도 8과 도 9에 나타낸다. 음성 대조군(G1)과 비교해서, mRNA로 면역한 군(G2)에서 IFN-감마를 분비하는 T 세포의 개수가 크게 증가하였다.
실시예 2: SFTSV의 N glycoprotein(Gn) 서열이 삽입된 핵산 분자 제작
코딩 영역에 인플루엔자 HA를 암호화하는 뉴클레오타이드를 대신하여 SFTSV의 glycoprotein N(서열식별번호: 5)을 암호화하는 변형된 뉴클레오타이드(서열식별번호: 6)을 삽입한 것을 제외하고, 실시예 1의 절차를 반복하여 RNA 플랫폼 형태의 핵산 분자(이하, "pHJ5L-Gn"이라 함)를 제작하였다.
실시예 3: SFTSV의 N glycoprotein(Gn) 결손 서열이 삽입된 핵산 분자 제작
코딩 영역에 인플루엔자 HA를 암호화하는 뉴클레오타이드를 대신하여 SFTSV의 glycoprotein N 결손 단백질(서열식별번호: 7)을 암호화하는 변형된 뉴클레오타이드(서열식별번호: 8)을 삽입한 것을 제외하고, 실시예 1의 절차를 반복하여 RNA 플랫폼 형태의 핵산 분자(이하, "pHJ5L-GNΔTM"이라 함)를 제작하였다.
실시예 4: SFTSV의 N glycoprotein Gn) 결손 서열이 삽입된 핵산 분자 제작
코딩 영역에 인플루엔자 HA를 암호화하는 뉴클레오타이드를 대신하여 SFTSV의 glycoprotein N 결손 단백질(서열식별번호: 9)을 암호화하는 변형된 뉴클레오타이드(서열식별번호: 10)을 삽입한 것을 제외하고, 실시예 1의 절차를 반복하여 RNA 플랫폼 형태의 핵산 분자(이하, "pHJ5L-GNΔSTEM"이라 함)를 제작하였다.
실험예 5: 핵산 분자의 발현 확인
실시예 2 내지 실시예 4에서 제조한 mRNA로부터 표적 펩타이드의 발현 여부를 확인하였다. VERO cell을 10% FBS DMEM complete medium으로 6-well cell culture plate에 6x105 접종하여 37℃, O/N incubation하였다. Lipofectamine2000®로 핵산 분자 10 ㎍을 transfection하고, 37℃에서 30시간 incubation하였다. Incubation 후 세포 내 단백질을 정량하여 30 ㎍씩 SDS PAGE를 수행하였다. Western blot으로 Gn, GnΔTM, GnΔSTEM 단백질 발현 여부를 다음과 같이 각각 확인하였다. 1차 항체로 SFTS Virus HB29 Antibody (NBP2-41153) 5% skim milk in PBST에 1:1000 희석하여 4℃, O/N incubation 하였고, 2차 항체로 anti-rabbit IgG HRP 항체를 5% skim milk in PBST에 1:5000희석하여 상온에서 1시간 incubation하였다. 도 10에 나타낸 바와 같이, pHJ5-Gn 핵산 분자에서 약 60 kDa의 단백질이 발현되었고, pHJ5L-GnΔTM 핵산 분자에서 약 50 kDa의 단백질이 발현되었으며, pHJ5L-GnΔSTEM 핵산 분자에서 약 40 kDa의 단백질이 발현되었다.
실험예 6: in vivo 마우스 면역 및 항원 특이적 면역글로불린 생성 측정
Wild type C57BL/6 마우스에 saline(Group 1)과 실시예 2에서 제작된 pHJ5L-Gn 핵산 분자(Group 2)를 투여하였다. 그 외에는 실험예 1과 동일한 면역 스케줄 및 투여량으로 마우스에 근육 주사한 뒤, 마지막 면역 후 2주일 후에 마우스의 혈액 채취 및 장기 적출을 통해 mRNA에 의한 면역 유도 여부를 확인하였다. 본 실험예에서 사용된 마우스 그룹은 실험예 1의 표 1과 동일하고, 각 그룹 당 5마리의 마우스를 면역했다.
마지막 면역으로부터 2주 후 마우스를 이산화탄소로 안락사 후 부검하여 복대정맥에서 혈액을 채취하였다. 채취한 혈액은 상온에 2시간 이상 두어 혈구를 응집시킨 후 4,000g 에서 15분 동안 원심분리 하여 혈청을 따로 분리하였다. 96-well plate에 Gn 단백질을 100 ng 코팅한 뒤, 실험예 1과 동일한 방법으로 마우스 혈청 내에서 분비된 항원 특이적 항체의 양을 ELISA로 측정하였다. 측정 결과를 도 11 및 도 12에 나타낸다. 생리 식염수를 주사한 음성 대조군(G1)과 달리 pHJ5L-Gn mRNA로 면역한 군(G2)에서 Gn 단백질에 특이적인 항체가 많이 생성된 것을 확인하였다. 특히, Th2 면역 반응에 관여하는 IgG1과 Th1 면역 반응에 관여하는 IgG2c가 모두 많이 생성된 것을 확인할 수 있었다.
실험예 7: 항원 특이적 IFN-감마 생성 측정
실험예 6의 면역 스케줄에 따라 면역한 마우스를 희생할 때 적출한 비장을 40 ㎛ strainer를 이용하여 최대한 단일 세포가 될 수 있게 갈아주었다. 이후, pHJ5L-Gn mRNA에서 발현된 peptide stimulation(Group 2)의 경우 완전배지에 200 ng/well의 농도로 Gn 단백질을 넣어 50 ㎕씩 넣어주었다. 37℃ 인큐베이터에서 48시간 배양 후 제조사에서 제공한 프로토콜에 따라 실험을 진행하였다. 측정 결과를 도 13에 나타낸다. 음성 대조군(G1)과 비교해서, pHJ5L-Gn mRNA로 면역한 군(G2)에서 spot의 개수가 증가하여, IFN-감마를 분비하는 세포가 크게 증가한 것을 확인하였다.
실험예 7: 중화항체 역가 측정
Vero 세포를 24-well 플레이트에 1.5x105 cells/well 농도로 접종하고 37℃ 인큐베이터에서 키워준다. 쥐에서 얻은 혈청 60 ㎕를 배지 540 ㎕에 넣어 1/10로 희석해주고 56℃에서 30분 동안 불활성화 시켰다. 불활성화 시킨 혈청을 미리 300 ㎕의 배지가 들어있는 곳에 300 ㎕를 넣어 1/2로 희석하는 방식으로 최초 10배 희석한 혈청을 320배까지 희석하였다. 희석한 혈청의 200 ㎕와 80 ffu/well 농도의 SFTS 바이러스 용액을 200 ㎕ 혼합하였다. 미리 접종시킨 세포의 완전배지를 제거하고 PBS로 세척한 뒤, 혈청과 바이러스가 섞인 용액을 100 ㎕씩 각 well에 넣고, 37℃ 인큐베이터에서 1시간 반응시켰다. 이 때 20분 간격으로 흔들어준다. 1시간 후 바이러스 용액을 제거한 후 1.5 %의 카르보실메틸셀룰로스 용액을 1 mL씩 각 well에 넣어주고, 37℃ 인큐베이터에서 2일 동안 방치하였다. 2일 후 상층액을 제거하고, 4% 포름알데히드 용액을 넣고 10분간 상온에 두어 바이러스를 불활성화 시켰다. 10분 후 상층액을 제거하고 PBS로 세척하였다. PBS에 1:500으로 희석하고 0.5%의 Triton X-100 500 ㎕의 anti-SFTSV NP 단클론항체를 각 well에 넣어주고 상온에서 흔들며 90분 동안 반응시켰다. 상층액을 제거한 후 PBS로 세척하였다. 2차 항체로 0.5% Triton X-100이 포함된 HRP-conjugated antibody를 PBS에 1:2000으로 희석하여 각 well에 500 ㎕씩 넣은 후 상온에서 흔들며 90분 동안 반응시켰다. 다시 상층액을 제거한 후 PBS로 세척하였다. 그 후 500 ㎕의 DAB substrate를 각 well에 넣어주어 foci가 갈색이 될 때까지 반응 후 수돗물로 씻어주어 반응을 멈춘다. 이 때 염색된 점의 개수가 혈청 없이 바이러스만 넣은 well의 개수의 절반이 되는 희석배수를 FRNT50이라고 한다. 희석배수가 높을수록 중화항체가 많은 것을 의미한다. 측정 결과를 도 14에 나타낸다. mRNA로 면역한 그룹의 혈청에선 높은 중화항체가 존재하는 것을 확인할 수 있다.
상기에서는 본 개시의 예시적인 실시형태 및 실시예에 기초하여 본 개시를 설명하였으나, 본 개시가 상기 실시형태 및 실시예에 기재된 기술사상으로 한정되는 것은 아니다. 오히려 본 개시가 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 전술한 실시형태 및 실시예를 토대로 다양한 변형과 변경을 용이하게 추고할 수 있다. 하지만, 이러한 변형과 변경은 모두 본 개시의 권리범위에 속한다는 점은, 첨부하는 청구범위에서 분명하다.

Claims (26)

  1. 트로포닌 T1(troponin T1, TNNT1) 유래의 번역 조절 요소와,
    상기 번역 조절 요소와 작동 가능하게 연결되는 코딩 영역을 포함하고,
    상기 코딩 영역은 인플루엔자바이러스 또는 중증열성혈소판감소증후군바이러스(SFTSV)의 면역원 또는 이의 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드를 포함하는 핵산 분자.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 번역 조절 요소는 상기 코딩 영역의 상류에 위치하는 제 1 번역 조절 요소 및 상기 코딩 영역의 하류에 위치하는 제 2 번역 조절 요소를 포함하는 핵산 분자.
  3. 제 2항에 있어서, 상기 제 1 번역 조절 요소는 서열식별번호: 1의 뉴클레오타이드 또는 이의 전사체로 이루어지는 핵산 분자.
  4. 제 2항에 있어서, 상기 제 2 번역 조절 요소는 서열식별번호: 2의 뉴클레오타이드 또는 전사체로 이루어지는 핵산 분자.
  5. 제 1항에 있어서, 상기 인플루엔자바이러스의 면역원은 상기 인플루엔자바이러스의 헤마글루티닌(hemagglutinin) 또는 이의 단편인 핵산 분자.
  6. 제 1항에 있어서, 상기 인플루엔자바이러스의 면역원은 서열식별번호: 3의 아미노산으로 이루어지는 핵산 분자.
  7. 제 1항에 있어서, 상기 인플루엔자바이러스의 면역원 또는 이의 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드는 서열식별번호: 4의 뉴클레오타이드 또는 이의 전사체로 이루어지는 핵산 분자.
  8. 제 1항에 있어서, 상기 중증열성혈소판감소증후군바이러스의 면역원은 상기 중증열성혈소판감소증후군바이러스의 당단백질(glycoprotein N) 또는 이의 단편인 핵산 분자.
  9. 제 1항에 있어서, 상기 중증열성혈소판감소증후군바이러스의 면역원은 서열식별번호: 5, 서열식별번호: 7 및 서열식별번호: 9로 구성되는 군에서 선택되는 아미노산으로 이루어지는 핵산 분자.
  10. 제 1항에 있어서, 상기 중증열성혈소판감소증후군바이러스의 면역원 또는 이의 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드는 서열식별번호: 6, 서열식별번호: 8 및 서열식별번호: 10으로 구성되는 군에서 선택되는 뉴클레오타이드 또는 이의 전사체로 이루어지는 핵산 분자.
  11. 제 1항에 있어서, 상기 핵산 분자는 RNA 형태의 핵산 분자인 핵산 분자.
  12. 제 1항에 있어서, 상기 핵산 분자는 상기 코딩 영역과 작동 가능하게 연결되는 전사 조절 요소, 및 상기 전사 조절 요소의 하류에 위치하는 폴리아데닐레이션 신호 서열 또는 폴리아데노신 서열 중에서 적어도 하나의 뉴클레오타이드를 더욱 포함하는 핵산 분자.
  13. 핵산 분자를 포함하는 재조합 발현 벡터로서,
    상기 핵산 분자는, 트로포닌T1 (troponin T1, TNNT1) 유래의 번역 조절 요소와,
    상기 번역 조절 요소와 작동 가능하게 연결되는 코딩 영역을 포함하고,
    상기 코딩 영역은 인플루엔자바이러스 또는 중증열성혈소판감소증후군바이러스(SFTSV)에서 유래한 면역원 또는 이의 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 발현 벡터.
  14. 제 13항에 있어서, 상기 번역 조절 요소는 상기 코딩 영역의 상류에 위치하는 제 1 번역 조절 요소와, 상기 코딩 영역의 하류에 위치하는 제 2 번역 조절 요소를 포함하는 재조합 발현 벡터.
  15. 제 13항에 있어서, 상기 제 1 번역 조절 요소는 서열식별번호: 1의 뉴클레오타이드 또는 전사체로 이루어지는 재조합 발현 벡터.
  16. 제 13항에 있어서, 상기 제 2 번역 조절 요소는 서열식별번호: 2의 뉴클레오타이드 또는 전사체로 이루어지는 재조합 발현 벡터.
  17. 제 13항에 있어서, 상기 인플루엔자바이러스의 면역원은 상기 인플루엔자바이러스의 헤마글루티닌(hemagglutinin) 또는 이의 단편인 재조합 발현 벡터.
  18. 제 13항에 있어서, 상기 인플루엔자바이러스의 면역원은 서열식별번호: 3의 아미노산으로 이루어지는 재조합 발현 벡터.
  19. 제 13항에 있어서, 상기 인플루엔자바이러스의 면역원 또는 이의 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드는 서열식별번호: 4의 뉴클레오타이드 또는 이의 전사체로 이루어지는 재조합 발현 벡터.
  20. 제 13항에 있어서, 상기 중증열성혈소판감소증후군바이러스의 면역원은 상기 중증열성혈소판감소증후군바이러스의 당단백질(glycoprotein N) 또는 이의 단편인 재조합 발현 벡터.
  21. 제 13항에 있어서, 상기 중증열성혈소판감소증후군바이러스의 면역원은 서열식별번호: 5, 서열식별번호: 7 및 서열식별번호: 9로 구성되는 군에서 선택되는 아미노산으로 이루어지는 재조합 발현 벡터.
  22. 제 13항에 있어서, 상기 중증열성혈소판감소증후군바이러스의 면역원 또는 이의 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드는 서열식별번호: 6, 서열식별번호: 8 및 서열식별번호: 10으로 구성되는 군에서 선택되는 뉴클레오타이드 또는 이의 전사체로 이루어지는 재조합 발현 벡터.
  23. 제 13항에 있어서, 상기 핵산 분자는 RNA 형태의 핵산 분자인 재조합 발현 벡터.
  24. 제 13항에 있어서, 상기 핵산 분자는 상기 코딩 영역과 작동 가능하게 연결되는 전사 조절 요소 및 상기 전사 조절 요소의 하류에 위치하는 폴리아데닐레이션 신호 서열 또는 폴리아데노신 서열 중에서 적어도 하나의 뉴클레오타이드를 더욱 포함하는 재조합 발현 벡터.
  25. 제 1항에 기재된 핵산 분자 또는 제 1항에 기재된 핵산 분자가 삽입된 발현 컨스트럭트(construct)를 유효 성분으로 포함하는 독감 또는 중증열성혈소판감소증후군을 치료 또는 예방하기 위한 약학 조성물.
  26. 제 25항에 있어서, 상기 약학 조성물은 면역증강제, 핵산 안정화제 및 지질나노입자 중에서 적어도 하나를 더욱 포함하는 약학 조성물.
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