PT754231E - Fragmento peptídico da proteína g do vírus respiratório sincicial, agente imunogénico, composição farmacêutica contendo-o e processo de preparação - Google Patents

Fragmento peptídico da proteína g do vírus respiratório sincicial, agente imunogénico, composição farmacêutica contendo-o e processo de preparação Download PDF

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PT754231E
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Thierry Baussant
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Michel Trudel
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Description

DESCRIÇÃO
FRAGMENTO PEPTÍDICO DA PROTEÍNA G DO VÍRUS RESPIRATÓRIO SINCICIAL, AGENTE IMUNOGÉNICO, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA CONTENDO-O E PROCESSO DE PREPARAÇÃO A presente invenção refere-se ao vírus respiratório sincicial (VRS), a uma proteína OmpA adjuvante de imunidade extraída de Klebsiella pneumoniae e a composições contendo polipéptidos imunogénicos provenientes de associados a uma proteína adjuvante deste tipo, assim como ao seu processo de preparação. 0 vírus respiratório sincicial (VRS) é a causa mais frequente de doenças respiratórias no recém-nascido: as broncopneumopatias (bronquiolites). A OMS estima que todos os anos ocorram 50 milhões de casos de VRS, entre os quais 160.000 mortes no mundo inteiro. Existem dois subgrupos do vírus (os subgrupos A e B). O VRS está classificado na família dos Paramyxoviridae, género Pneumovírus, compreendendo um genoma de ARN não segmentado, de polaridade negativa, que codifica 10 proteínas específicas. Não existe actualmente uma vacina disponível contra o VRS. As vacinas com o vírus inactivado revelaram-se ineficazes e, por vezes, agravaram mesmo as infecções dos recém-nascidos. Nos anos 60, as tentativas de vacinação com o VRS inactivado pela formalina conduziram ao fracasso: em vez de conferir uma protecção aquando da reinfecção pelo VRS, a vacina teve como efeito agravar a doença na criança. 1 0 pedido WO 87/04185 propôs a utilização de proteínas estruturais do VRS com vista a uma vacina, como sejam as proteínas do envelope denominadas proteína F (proteína de fusão) ou proteína G, uma glicoproteína de 22 Kd, uma proteína de 9,5 Kd ou a proteína principal da cápside (proteína N). O pedido WO 89/02935 descreve as propriedades de protecção da proteína F completa do VRS, eventualmente modificada sob formas monoméricas ou desacetiladas.
Uma série de fragmentos da proteína F foram clonados com o objectivo de pesquisar as suas propriedades neutralizantes. É possível referir o documento de Norrby et al. (Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1987, 84(18), 6572-76), que descreve determinados fragmentos da proteína G do VRS (péptidos 12 e 15 deste documento) como sendo a região mais imunogénica da proteína G. É igualmente possível referir o documento Lawrence et al. (J.O.) General Microbiology, 1991, 137(8), 1911-21) relativo à classificação das enterobactérias, que descreve a sequência nucleica parcial de 18 locus correspondente à sequência que codifica a proteína da membrana externa (OmpA) de 18 enterobactérias, entre as quais Klebsiella pneumoniae.
No entanto, as vacinas imunitárias testadas até ao momento mostraram-se ineficazes ou induziram uma patologia pulmonar (bronquiolite ou peribronquite).
Actualmente, não existe um tratamento de fundo para as infecções causadas pelo VRS. 2
Nas infecções pelo VRS das vias aéreas superiores, o tratamento assenta essencialmente em medicações sintomáticas idênticas aquelas das outras infecções virais.
Nas infecções pelo VRS das vias aéreas inferiores, o tratamento nos recém-nascidos assenta na manutenção de uma hidratação correcta, na aspiração das secreções e na administração de oxigénio se necessário. Observou-se um efeito positivo com a ribavirina, um nucleótido activo in vitro contra o VRS. A presente invenção descreve um polipéptido útil especialmente na produção de imunogénio, transportado pela sequência peptídica compreendida entre os resíduos de aminoácidos 130 e 230 da sequência da proteína G do vírus respiratório sincicial, ou por uma sequência que apresenta pelo menos 80% de homologia com a referida sequência peptídica. Esta sequência difere ligeiramente para os subgrupos A e B do VRS humano ou para o VRS bovino. A invenção compreende as sequências provenientes do VRS humano, subgrupos A e B, ou bovino. A proteína G é uma glicoproteína do envelope do VRS, com um peso molecular compreendido entre 84 e 90 Kd e pobre em metionina. A requerente mostrou que a sequência compreendida entre os aminoácidos 130 e 230 da proteína G natural é particularmente apropriada para induzir uma protecção eficaz contra a infecção pelo VRS. A invenção compreende as sequências provenientes do VRS humano, subgrupo A ou B, ou bovino. 3
Em particular, a presente invenção descreve polipéptidos que são úteis especialmente como elemento imunogénico incluído na sequência acima e que compreendem a sequência peptídica compreendida entre os resíduos de aminoácidos identificados pelos números 174 e 187 da proteína G do VRS (humano, subgrupos A e B, ou bovino) , ou uma sequência que apresenta pelo menos 80% de homologia com a sequência correspondente.
Outras sequências peptídicas adaptadas à preparação de um imunogénio e compreendidas na referida sequência da proteína G do VRS são constituídas pela sequência compreendida entre os resíduos de aminoácidos identificados pelos números 171 e 187 da proteína G do VRS humano ou bovino, ou por uma sequência que apresenta pelo menos 80% de homologia com a sequência correspondente. Outros péptidos de interesse são transportados pela sequência compreendida entre os nucleótidos identificados pelos números 158 e 190 da proteína G do VRS, ou por uma sequência que apresenta pelo menos 80% de homologia com a sequência correspondente. A invenção descreve igualmente péptidos que são úteis para a preparação de um imunogénio e que apresentam uma sequência correspondente à sequência compreendida entre os resíduos de aminoácidos identificados pelos números 140 e 200 da proteína G do VRS humano ou bovino, ou uma sequência que apresenta pelo menos 80% de homologia com a sequência correspondente. As sequências que se iniciam no aminoácido 140 da referida proteína G do VRS e cuja extremidade C-terminal corresponde, respectivamente, ao aminoácido 198, 196, 194, 192 ou 190, assim como as sequências que apresentam pelo menos 80% de homologia com as sequências transportadas por estes fragmentos são particularmente vantajosas. 4
Entre as variantes das sequências anteriores, é necessário referir os polipéptidos que compreendem uma sequência na qual: a) o aminoácido Cys nas posições 173 e/ou 186 foi substituído por um aminoácido que não forma uma ponte de dissulfureto, em particular a serina e/ou b) os aminoácidos nas posições 176 e 182 são susceptíveis de formar uma ligação covalente diferente de uma ponte de dissulfureto, especialmente o ácido aspártico e a ornitina.
Desta forma, a sequência polipeptídica 130-230 do VRS, subgrupo A, pode ser utilizada completa sob a sua forma nativa. Esta sequência corresponde à sequência designada por SEQ id n.0 1 (ou G2A) .
Da forma similar, é possível utilizar a sequência polipeptídica completa 130-230 do VRS, subgrupo B, sob a sua forma nativa. Esta sequência corresponde à sequência designada por Seq id n.° 2 (G2B). A sequência id n.° 1 será designada por G2A no restante pedido. A sequência id n.° 2 será designada por G2B no restante pedido.
As sequências que apresentam pelo menos 80% de homologia com G2A ou G2B são igualmente apropriadas. A sequência compreendida entre os aminoácidos 130 e 230 pode ser modificada através da substituição dos resíduos de 5 cisteína nas posições 173 e 186 por resíduos de serina, para obter um péptido que conserva boas propriedades imunogénicas, graças à manutenção da volta formada pelos resíduos Cys nas posições 176 e 182. As sequências de aminoácidos e de nucleótidos deste polipéptido, para o subgrupo A, estão representadas na seq id n.° 3 (G2AôCys).
Para o subgrupo B, as sequências de aminoácidos e de nucleótidos estão representadas na seq id n,° 4 (G2BôCys).
As sequências peptídicas serão designadas por G2AôCys e G2BôCys.
No presente pedido, descreve-se também um polipéptido útil para a preparação do imunogénio, que consiste na sequência peptídica compreendida entre os resíduos de aminoácidos identificados pelos números 174 e 187 da proteína G do VRS, ou numa sequência que apresenta pelo menos 80% de homologia com a referida sequência peptídica.
Nesta última sequência, o péptido 174-187, subgrupo A, pode apresentar a sequência:
Seq id n.° 5:
Ser Ile Cys Ser Asn Asn Pro Thr Cys Trp Ala Ile Cys Lys. O péptido 174-187, subgrupo B, pode apresentar a sequência: Seq id n.° 6:
Ser-Ile-Cys-Gly-Asn-Asn-Gln-Leu-Cys-Lys-Ser-Ile-Cys-Lys. O resíduo Cys na posição 186 pode também ser substituído por um resíduo de serina, de forma a obter a seguinte sequência: 6
Seq id n.° 7 para o subgrupo A:
Ser Ile Cys Ser Asn Asn Pro Thr Cys Trp Ala Ile Ser Lys.
Seq id n.° 8 para o subgrupo B:
Ser-Ile-Cys-Gly-Asn-Asn-Gln-Leu-Cys-Lys-Ser-Ile-Ser-Lys.
Na sequência compreendida entre os resíduos 174 e 187 do péptido imunogénico, os resíduos de aminoácidos nas posições 17 6 e 182 podem ser substituídos, respectivamente, por um ácido aspártico e por uma ornitina, de forma a obter uma das sequências seguintes:
Seq id n.° 9 para o subgrupo A:
Ser Ile Asp Ser Asn Asn Pro Thr Orn Trp Ala Ile Cys Lys Seq id n.° 10 para o subgrupo B:
Ser-Ile-Asp-Gly-Asn-Asn-Gln-Leu-Orn-Lys-Ser-Ile-Cys-Lys·
Seq id n.° 11 para o subgrupo A:
Ser Ile Asp Ser Asn Asn Pro Thr Orn Trp Ala Ile Ser Lys.
Seq id n.° 12 para o subgrupo B:
Ser-Ile-Asp-Gly-Asn-Asn-Gln-Leu-Orn-Lys-Ser-Ile-Ser-Lys. A conservação das propriedades imunogénicas é conseguida graças à substituição da ponte de dissulfureto (entre as Cys naturais) por uma ligação amida entre as posições 176 e 182.
Outras sequências de polipéptidos imunogénicos figuram em anexo ao presente pedido, sob as designações SEQ ID N.° 14 a SEQ ID N.0 73. 7 A invenção descreve igualmente um polipéptido utilizável como agente imunogénico, que apresenta uma das sequências anteriores e que compreende, além disso, pelo menos um resíduo de cisteína em posição N-terminal ou C-terminal. A invenção descreve também um polipéptido que consiste na sequência peptídica compreendida entre os resíduos de aminoácidos identificados pelos números 130 e 230 da sequência da proteína G do VRS, subgrupo A e subgrupo B, ou numa sequência que apresenta 80% de homologia com a referida sequência peptídica, e que se encontra sob a forma de uma proteína de fusão com o receptor da albumina sérica humana, denominada BBG2AÔC ou BBG2BÔC, ou de uma outra proteína de ligação. A sequência da proteína BB completa figura em anexo (Seq ID n.0 74). É possível citar igualmente as variantes, por exemplo, glicosiladas ou sulfatadas, dos diferentes péptidos, quer estas funções sejam naturais ou não.
Os polipéptidos podem ser preparados por síntese peptídica ou por meio das técnicas de ADN recombinante, que são conhecidas pelos peritos.
Em particular, as sequências do gene que codifica o epitopo de aproximadamente 100 aminoácidos podem ser preparadas por montagem de genes em fase sólida, e a proteína correspondente pode ser expressa, por exemplo, em E. coli por via intracelular.
As sequências nucleotídicas (ARN ou ADN) que codificam as proteínas ou os polipéptidos definidos acima também podem ser referidas. 8 A presente invenção tem como objecto uma proteína isolada, caracterizada por ser a proteína OmpA da membrana externa de Klebsiella pneumoniae de sequência SEQ ID N.° 13.
Um outro objecto da invenção consiste num conjugado imunogénico que compreende um polipéptido tal como definido anteriormente, acoplado à proteína de transporte do tipo OmpA da membrana externa da bactéria do género Klebsiella de acordo com a invenção. A requerente conseguiu mostrar que, enquanto as variantes da sequência 174-187 da proteína G do VRS são fracamente imunogénicas, o seu acoplamento a uma proteína deste tipo induz uma resposta imunitária específica. A intensidade da resposta imunitária foi comparada com aquela obtida com adjuvantes clássicos, como seja o acoplamento à proteína de transporte KLH (keyhole limpet hemocyanin) co-administrado com o adjuvante de Freund ou o acoplamento à proteína de transporte TT (toxóide tetânico).
Obtiveram-se resultados particularmente vantajosos para as composições que contêm um polipéptido imunogénico de VRS, tal como descrito anteriormente, acoplado à proteína p40 de Klebsiella pneumoniae cuja sequência peptídica está identificada na Seq id n.° 13. A sequência nucleotídica (ADN ou ARN) que codifica a proteína de sequência id n.° 13 está compreendida na invenção. 0 polipéptido imunogénico pode ser acoplado à proteína adjuvante de imunidade através de métodos conhecidos pelos peritos, tais como: 9
Glutaraldeído;
Carbodiimida (ex: EDC - 1-(3-dimetilaminopropil)-3- etilcarbodiimida); Ésteres bis-imido (ex: adipimidato de dimetilo); Ésteres de N-hidroxisuccinimidilo (ex: suberato de disuccinimidilo);
No caso dos péptidos que compreendem uma cisteína suplementar em posição N-terminal ou C-terminal: * Ésteres de maleimido-N-hidroxisuccinimida (ex: MBS -éster de maleimido-benzoí1-N-hidroxisuccinimida) ; * Bromoacetato de N-succinimidilo. 0 péptido pode ser conjugado com a proteína de transporte por meio de uma proteína de ligação, por exemplo, o receptor da albumina sérica humana (BB).
De acordo com um outro aspecto, a invenção tem igualmente como objecto um processo para preparar um péptido conjugado que entra numa composição útil para a prevenção ou o tratamento de doenças causadas pelo VRS, caracterizado por: a) precipitação dos lipopolissacáridos de membranas de bactérias do género Klebsiella, em presença de um sal de um catião divalente e de detergentes, para recuperar as proteínas membranares totais no sobrenadante; b) sujeição das proteínas a uma cromatografia de permuta aniónica para separar a fracção que contém a proteína adjuvante de imunidade; c) concentração da fracção que contém a proteína adjuvante de imunidade; 10 d) conjugação da proteína adjuvante de imunidade com um polipéptido imunogénico, tal como definido acima, para formar um conjugado solúvel, em que o referido polipéptido imunogénico compreende a sequência de aa 174-187 da sequência de aa 130-230 da proteína G do VRS humano de tipo A ou B, ou do VRS bovino, polipéptido imunogénico este no qual o aminoácido cys na posição 173 e/ou 186 pode ser uma serina. O sal de catião divalente utilizado na etapa a) é preferencialmente um sal de cálcio ou de magnésio. Após centrifugação, as proteínas do sobrenadante podem ser recuperadas com um bom rendimento por meio de duas precipitações com etanol.
As proteínas membranares, após serem novamente colocadas em suspensão, são separadas numa coluna permutadora de aniões, que pode ser utilizada em condições industriais. Este suporte cromatográfico é muito estável e compatível com os tratamentos de despirogenação drásticos, o que não acontecia com os suportes cromatográficos já descritos. Por outro lado, a eluição da proteína pode ser realizada em condições isocráticas e não por aplicação de um gradiente de NaCl (como anteriormente descrito), o que é particularmente vantajoso em condições industriais.
De acordo com um modo de realização preferido, após a etapa c) , procede-se a uma segunda etapa de cromatográfia, em permutador de catiões, e recuperam-se as fracções contendo a proteína adjuvante, que são concentradas. Esta etapa suplementar permite uma melhor eliminação dos lipopolissacáridos. A proteína adjuvante é, em seguida, conjugada com um polipéptido imunogénico de acordo com a invenção. 11
De acordo com um outro aspecto, a invenção descreve uma composição útil para a prevenção e/ou o tratamento das doenças provocadas pelo VRS, caracterizada por conter um polipéptido caracterizado mais à frente.
Mais particularmente, as composições contêm adicionalmente excipientes farmaceuticamente aceitáveis, adaptados a uma administração por via injectável.
Com efeito, a requerente demonstrou que a injecção destas composições desencadeia uma protecção, não por um efeito neutralizante, mas através de uma resposta imunitária sistémica do organismo.
As respostas humorais e celular (IgM, IgG, IgA e células T) são provocadas pelo produto que induz igualmente uma protecção a longo prazo e uma memória imunológica contra os VRS, subgrupos A e B.
Tendo em vista a administração das composições vacinais por via subcutânea, é desejável dispor de conjugado solúvel, o que é difícil pelos métodos convencionais. A invenção descreve igualmente um processo de preparação de um conjugado entre um péptido imunogénico e uma proteína de membrana de Klebsiella, em particular a proteína p40 de K. pneumoniae, no qual o acoplamento é efectuado na presença de glutaraldeído em concentrações inferiores ou iguais a 0,05%.
Este processo de acoplamento diminui consideravelmente as concentrações de glutaraldeído em comparação com aquelas habitualmente utilizadas (2 vezes 0,01% em lugar de cerca de 1%) ; o glutaraldeído é adicionado em 2 vezes ao longo de um 12 período de cinco dias, ao passo que os protocolos descritos mencionam tempos de 24 horas.
Estas modificações permitiram a obtenção de um conjugado solúvel, sob uma forma que se encontra adaptada a administração subcutânea.
Os protocolos habituais (concentrações de glutaraldeído mais elevadas e tempos curtos) traduzem-se pela formação de um gel denso (devido, muito provavelmente, a reacções de conjugação P40-P40), uma forma imprópria para administração e para a manipulação em geral. 0 péptido conjugado pode ser congelado e utilizado tal qual ou pode ser liofilizado.
Os exemplos seguintes destinam-se a ilustrar a invenção sem, de modo algum, limitar o seu âmbito.
Nestes exemplos, far-se-á referência às seguintes figuras:
Figura 1: Intensidade da resposta imunitária induzida contra G1A sob diferentes formas.
Figura 2: Cinética da resposta imunitária induzida contra G1A apresentada sob diferentes formas.
Figura 3: Cinética da resposta imunitária induzida contra a proteína de transporte sozinha.
Figura 4: Estratégia de clonagem por amplificação génica de p40. 13
Exemplo 1: Síntese e purificação de GiA 0 polipéptido de sequência
Ser-Ile-Cys-Ser-Asn-Asn-Pro-Thr-Cys-Trp-Ala-Ile-Ser-Lys -- s-s -^ designado por GiA, é preparado por síntese em fase sólida utilizando a química Boc.
Montagem A montagem do péptido é efectuada por síntese peptídica em fase sólida sobre poliestireno (divinilbenzeno a 1%), começando com um agente de ligação Boc-Lys(2-cl-Z) -fenilacetamidometilo.
Utilizou-se a estratégica química Boc-Benzilo com o seguinte procedimento de desprotecção-acoplamento: 1. TFA a 55% em DCM d X 5 min) 2 . TFA a 55% em DCM d X 25 min 3. DCM (2 X 1 min) 4 . Álcool isopropílico d X 1 min) 5. DMF (2 X 1 min) 6. DIEA a 10% em DMF (2 X 2 min) 7 . Acoplamento 8. DMF (2 X 1 min) 9. DCM (2 X 1 min)
Em cada etapa, utilizam-se 20 ml de solvente por grama de péptido-resina. 14 0 acoplamento é efectuado durante 30 minutos em DMF, com um éster de hidroxibenzotriazol pré-formado. Em cada etapa do acoplamento, verifica-se se estão presentes funções aminadas livres residuais, por meio do teste com ninidrina. Se necessário, realiza-se um acoplamento duplo.
Para a síntese do péptido GiA, utilizaram-se os seguintes grupos de protecção da cadeia lateral: - 2-clorobenziloxicarbonilo para a lisina, - benzilo para a serina e a treonina, - 4-metilbenzilo para a cisteína, - formilo para o triptofano.
Antes da etapa final de desprotecção/clivagem, o grupo formilo é eliminado por tratamento com uma solução de piperidina a 25% em DMF, durante 30 minutos. A resina peptídica é lavada com DCM e éter e é seca sob pressão reduzida.
Clivagem O péptido é clivado da resina e totalmente desprotegido através de tratamento com fluoreto de hidrogénio líquido. Utilizam-se habitualmente 10 ml de fluoreto de hidrogénio por grama de péptido-resina, a 0°C e durante 45 min, na presença de p-cresol e de etanoditiol como retentores. Após evaporação do fluoreto de hidrogénio, a mistura de reacção bruta é lavada com éter, dissolvida em TFA, precipitada com éter e seca. 15
Ciclização e purificação
Condições gerais de purificação por HPLC:
Fase estacionária Fase móvel: Gradiente linear:
Caudal: Detecção: sílica em C18r 15-25 μιη, 100 Â solvente A: água, TFA a 0,1%
Solvente B: acetonitrilo/A, 60/40% (v/v) 20 a 50% B em 30 min (primeira etapa de purificação) 15 a 40% B em 30 min (segunda etapa de purificação) 40 ml/min UV (210 nm) 0 péptido bruto obtido após clivagem é purificado nas condições descritas acima (gradiente de 20 a 50% de B) . As fracções possuindo uma pureza superior a 70-80% (HPLC) são combinadas e liofilizadas. O péptido é depois purificado numa mistura de acetonitrilo, água e DMSO (1 mg/ml) e deixado sob agitação até que a ciclização esteja completa (4 a 6 dias). A evolução da reacção é controlada por HPLC. A mistura de reacção é finalmente concentrada na coluna de HPLC preparativa, aplicando-se um gradiente de 15 a 40% de B, durante 30 minutos, para purificar o péptido.
Geralmente, após a liofilização, efectua-se uma segunda purificação nas mesmas condições para atingir o grau de pureza exigido. A pureza e a identidade do produto final são controladas por HPLC analítica, análise de aminoácidos e espectrometria de massa FAB. 16
No péptido obtido desta forma, o resíduo de serina na décima terceira posição substitui o resíduo Cys do péptido natural, evitando assim uma heterogeneidade na formação de pontes de dissulfureto que pode ser prejudicial para a imunogenicidade.
Exemplo 2: Preparação do epitopo G2AÔCys
Construção do gene: materiais e métodos
Num microtubo Eppendorf, lavam-se 300 μρ de esferas com tampão de lavagem/ligação (NaCl 1M, Tris-HCl 10 mM, pH 7,5; EDTA 1 mM) antes de adicionar 0,2 pmole do oligonucleótido biotinilado, seguindo-se 15 minutos de incubação à temperatura ambiente para a ligação. As esferas com o oligonucleótido imobilizado são lavadas e depositadas. Adicionam-se 0,2 pmole do oligonucleótido fosforilado em 5' seguinte em 60 μΐ de tampão de hibridação/ligação (Tris-HCl 50 mM, pH 7,6; MgCl2 10 mM, ATP 1 mM, 1,4-ditiotreitol [DTT] 1 mM, polietilenoglicol [PEG] 8000 a 5%) . A mistura de hibridação é incubada a 70°C durante 5 min, deixa-se chegar a 37°C antes de adicionar 3 unidades de ADN-ligase de T4 (BRL) e incuba-se durante 15 min a 37°C. A mistura reaccional é lavada antes da adição de 0,2 pmole do oligonucleótido seguinte. O procedimento de hibridação/ligação é repetido tantas vezes quantas as adições de um novo oligonucleótido complementar fosforilado em 5' . No final, o duplex de ADN imobilizado sobre esferas magnéticas pode ser separado do suporte através de corte com as enzimas de restrição apropriadas.
Prepara-se o ADN correspondente à sequência G2AôCys e à sequência G2AôCys unida à proteína de ligação à albumina sérica humana (BB) designada por BB-G2AôCys. 17 A sequência nucleotídica é expressa em E. coli para recuperar as proteínas correspondentes.
Vector de expressão: 0 vector pVABBG2AôC é um vector de expressão de tipo intracelular. Ele contém um promotor de origem E. coli, o operão do triptofano (Trp) seguido do gene que codifica o receptor da albumina sérica humana BB (P-Â Nygrén et al., J. Mol. Recognit., 1988, 1, 60) e, finalmente, o gene que codifica G2AÔC do VRS. A expressão do gene heterólogo pode ser induzida em presença do IAA (ácido 3-p-indolacrílico). O produto de fusão BBG2AÔC pode ser purificado por afinidade em coluna de HSA-sepharose, após ter libertado as proteínas citoplasmáticas de E. coli.
Exemplos de purificação de proteínas a partir de uma cultura de 500 ml: A estirpe E. coli RV308 (Maurer et al., J. Mol. Biol., 1980, 139, 147) transfectada com o plasmídeo pVABBG2AôC foi seleccionada em gelose suplementada com ampicilina (100 μρ/ιηΐ) e tetraciclina (8 μρ/ιηΐ) . Inocula-se a estirpe num erlenmeyer contendo 100 ml de meio de cultura TSB (Tryptic Soy Broth, Difco) (30 g/1) , suplementado com levedura (Yeast Extract, Difco) (5 g/1), ampicilina (100 μρ/ιηΐ) , tetraciclina (8 μρ/ιτιΐ) e triptofano (100 μρ/ιηΐ) . Incuba-se a 32°C durante 12 horas sob agitação (190 rpm) . Transfere-se a cultura para um outro erlenmeyer (5 litros) contendo quatro vezes o volume inicial (400 ml TSB + levedura + os mesmos antibióticos à mesma concentração). Quando a densidade óptica do meio (a 550 nm) atinge uma D.O. de aproximadamente 1,5, induz-se a produção das proteínas adicionando ao meio IAA numa concentração final de 25 pg/ml. Pára-se a cultura após 5 18 horas de incubação, sob agitação (190 rpm) a 32°C. Após centrifugação, o resíduo bacteriano é ressuspenso num recipiente contendo cerca de 60 ml de solução de TST (TrisHCl 50 mM, pH 8,0; NaCl 200 mM, Tween 20 a 0,05%, EDTA 0,5 mM) a frio.
Introduz-se no recipiente uma sonda padrão de sonicador (VIBRA-CELL, Somics Mat, EUA) . Faz-se a sonicação à potência 5 durante cerca de dois minutos. O sobrenadante da solução, após centrifugação, é filtrado a 0,45 μιη e passado por uma coluna contendo cerca de 3 ml de gel de HSA-sepharose (STÂHL et ai., J. Immunol. Meth., 1989, 124, 43).
As proteínas purificadas são analisadas por SDS-PAGE no equipamento Phast System (PHARMACIA) ou no equipamento Mini Protean (BIORAD) . Os géis são revelados com azul de Coomassie. A proteína BBG2AÔC, representando mais de 90% de pureza, corresponde perfeitamente ao tamanho esperado (39,3 Kda) em relação aos padrões de peso molecular conhecidos. A imunotransferência desta proteína para a membrana Problott (ABI) permite identificá-la com anticorpos específicos anti-BB e/ou anti-proteína G do VRS (subgrupo A) . O rendimento de proteínas solúveis purificadas a partir do citoplasma de E. coli é de aproximadamente 50 mg/litro de cultura.
Em fermentador de 2 litros, é possível obter 500 a 800 mg de proteínas BBG2AôC por litro de cultura, nas condições óptimas de cultura. 19
Exemplo 3: Isolamento e purificação da proteína P40 natural 0 processo de purificação da proteína P40 a partir da biomassa de Klebsiella pneumonlae, estirpe 1-145, foi aperfeiçoado com um objectivo principal: melhorar um processo que permita a transposição para larga escala e a extrapolação industrial. Este processo recorre sucessivamente à preparação de uma fracção enriquecida em proteínas membranares e a purificação da proteína P40 por cromatografia.
MATERIAIS E MÉTODOS A biomassa de Klebsiella pneumoniae (estirpe 1-145, 40 g de células secas) é ajustada a pH 2,5 com o auxílio de ácido acético puro. Após adição de 1/2 volumes de uma solução contendo cetrimida a 6%, etanol a 60% e CaCl2 1,5M cujo pH é ajustado a 2,5 com ácido acético, a mistura é colocada sob agitação durante 16 horas à temperatura ambiente.
Após centrifugação durante 20 minutos a 15.000 xg a 4°C, as proteínas do sobrenadante são precipitadas com etanol. Efectuam-se duas precipitações sucessivas com centrifugação intermediária (10 min, 10.000 xg, 4°C): de 20% a 50% e depois de 50% a 80%.
Os resíduos obtidos após a segunda precipitação são colocados em suspensão numa solução de zwittergent 3-14 a 1%.
Após agitação durante 4 horas à temperatura ambiente, o pH é ajustado a 6,5 com a ajuda de NaOH IN.
Uma centrifugação da mistura durante 20 min, a 10.000 xg a 4°C, permite obter uma fracção enriquecida em proteínas membranares (fracção MP). 20
As proteínas da fracção MP são dialisadas contra um tampão Tris/HCl 20 mM pH 8,0; zwittergent 3-14 a 0,1%. O dialisado é introduzido numa coluna contendo um suporte de tipo permutador de aniões fortes (coluna de diâmetro = 50 mm x H = 250 mm, gel Biorad Macroprep High Q) , equilibrada com o tampão descrito acima. A proteína P40 é eluída por uma concentração de 50 mM de NaCl no tampão de equilíbrio.
As fracções contendo a proteína P40 são combinadas e dialisadas contra um tampão citrato 20 mM pH 3,0; zwittergent 3-14 a 0,1%. O dialisado é introduzido numa coluna contendo um suporte de tipo permutador de catiões fortes (dimensões da coluna: diâmetro = 25 mm x H = 160 mm, gel Biorad Macroprep High S) equilibrada com o tampão citrato 20 mM pH 3,0; zwittergent 3-14 a 0,1%. A proteína P40 é eluída por uma concentração 0,7 M de NaCl. As fracções contendo a P40 são reunidas e concentradas por ultrafiltração com o auxílio de um sistema de filtração de fluxo tangencial Minitan Millipore, utilizado juntamente com filtros de membrana possuindo um limite de exclusão de 10 kDa.
RESULTADOS
As fracções obtidas após cada etapa cromatográfica são analisadas por SDS-PAGE, para reunir aquelas que contêm a proteína P40.
As quantidades de proteínas são medidas pelo método de Lowry (Tabela I) . A pureza e a homogeneidade da proteína P40 são estimadas por SDS-PAGE, na presença de padrões de massa molecular.
Após a etapa de cromatografia de permuta de catiões, a proteína P40 está isenta do contaminante principal presente 21 na fracção MP (a proteína que apresenta uma massa molecular aparente de 18 kDa) e apresenta um grau de pureza superior a 95%. 0 perfil electroforético da proteína P40 revela várias bandas. Estas bandas são reconhecidas, após imunotransferência, por anticorpos monoclonais P40 obtidos em ratinho. A banda principal superior corresponde à proteína desnaturada (por tratamento a 100°C, durante 15 minutos, na presença de SDS), e a banda secundária inferior corresponde à proteína sob a forma nativa.
De facto, a proteína P40 é uma proteína dita "heat-modifiable", e nós pudemos verificar esta propriedade com o auxílio de uma cinética de aquecimento a 100°C na presença de SDS. Sem aquecimento, a proteína sob a forma nativa apresenta uma estrutura em hélices α que fixa mais SDS e migra, portanto, mais longe em direcção ao ânodo que a forma desnaturada (desnaturação completa após 5 minutos a 100°C), que apresenta uma estrutura em folhas β (K.B. KELLER (1978) J. Bacteriol. 134, 1181-1183). A contaminação pelos lipopolissacáridos (LPS) é estimada através de doseamento por cromatografia em fase gasosa do ácido β-hidroximirístico, o ácido gordo marcador dos LPS de Klebsiella pneumoniae (Tabela I). 22
Tabela 1: Tabela recapitulativa das quantidades de proteína e de LPS das fracções obtidas para as diferentes etapas do processo de purificação da proteína p40 (n.d. = não determinado). PROTEÍNAS RENDIMENTO LPS BIOMASSA 40 g - n.d FRACÇÃO MP 900 mg 2,25¾ n.d. FRACÇÃO ENRIQUECIDA EM P40 400 mg 1¾ 10¾ PROTEÍNA P40 130 mg 0,3¾ < n
Este método é utilizado para chegar ao teor de LPS das amostras provenientes das diferentes etapas de purificação.
Uma vez que a quantidade de ácido β-hidroximirístico presente na fracção P40 após a cromatografia de permuta de catiões é inferior ao limite de quantificação do doseamento, é possível estimar que a quantidade de LPS residual é inferior a 1%.
Exemplo 4: Clonagem da proteína P40 e expressão de BBP40
ESTIRPES BACTERIANAS * E. coli: RV 308: estirpe ATCC 31608 (MAURER R., MEYER B. J., PTASCHNE M., J. MOL. BIOL, 1980, 139, 147-161).
* K. pneumoniae: IP 145: estirpe C.I.B.P.F-VECTORES * pRU 28 (Hultman et al., 1988, 7 : 629-638): vector de clonagem e de sequenciação que possui o gene de resistência à ampicilina e as origens de replicação de E. coli e do fago Fl, assim como uma porção do gene lac-Z de E. coli (β-galactosidase). * pVABB: vector de expressão da fusão do gene.
SOLUÇÕES * Amplificação génica:
Tampão de lise: Taps 25 mM, pH 9,3
MgCl2 2 mM 24
Tampão de amplificação: Taps 25 mM, pH 9,3
MgCl2 2 mM Tween 20 a 0,1% dNTP 200 mM. * Purificação das proteínas: TST (20X): Tris base 0,5 M HC1 0,3 M NaCl 4 M Tween 20 1% EDTA 2 0 mM Tampão de lavagem: Tris HC1 5 0 mM pH 8,5 MgCl2 5 mM Solução de desnaturação: Gua-HCl 7, 8 M Tris-HCl 2 8 mM PH 8,5 Solução de renaturação: Gua-HCl 0,5 M Tris-HCl 25 mM PH 8,5 NaCl 150 mM Tween 20 0, 05% MATERIAIS E MÉTODOS Síntese dos oligonucleótidos
Os iniciadores nucleotídicos foram determinados a partir da porção da sequência da proteína OMPA de Klebsiella pneumoniae que se encontra publicada (LAWRENCE, G.J. et ai., Journal of General Microbiology, 1991, 137, 1911-1921) e da sequência consenso proveniente do alinhamento das sequências de 5 OMPA de enterobactérias (E. coli, S. tryphimurium, S. marcescens, 25 S. dysenteriae, E. aeroginosae) , assim como das sequências de péptidos obtidas por sequenciação manual.
Os oligonucleótidos foram sintetizados de acordo com o método químico dos fosforamiditos, no equipamento "Gene Assembler Plus" de Pharmacia.
Amplificação génica do gene de P40 por PCR 0 ADN da proteína OMPA de Klebsiella pneumoniae foi amplificado da forma que se segue.
Uma colónia de Klebsiella pneumoniae é lisada em 10 μΐ de tampão de lise, por aquecimento a 95°C durante 5 minutos. 1 μΐ desta solução serve de fonte de ADN para as reacçoes de amplificação.
Estas são realizadas em 100 μΐ de tampao de amplificaçao (ver anexo), com 5 pmole de cada iniciador e uma unidade da enzima Taq polimerase (Perkin Elmer Cetus). Cada ciclo compreende uma etapa de desnaturação de 30 segundos a 95°C, seguida de uma hibridação do iniciador com o ADN e de uma extensão de um minuto a 72°C. Efectuam-se, assim, 30 ciclos com a ajuda de um termociclador "Gen Amp PCR" 9000 de Perkin Elmer Cetus.
Os PCR seguintes são realizados a partir dos fragmentos de ADN previamente amplificados.
Os fragmentos de ADN amplificados são, em seguida, digeridos, purificados e ligados ao vector pRIT 28. 26
SEQUENCIAÇÃO
Os fragmentos clonados desta forma são sequenciados num sequenciador automático 373 DNA Sequencer de Applied Biosystem. As reacções de sequenciação são realizadas com o auxilio do kit "Dye Terminator" de acordo com as recomendações do fornecedor (Applied Biosystem), quer sobre o ADN de cadeia dupla obtido após amplificação génica ou proveniente de maxiprep, quer sobre o ADN de cadeia simples proveniente de fragmentos de PCR desnaturados (Hultman et al., Nucleic Acids Res. 1989, 17:4937-4946).
EXPRESSÃO DA PROTEÍNA 0 gene inteiro de P40 é clonado no vector de expressão pVABB. Este vector permite juntar uma cauda de afinidade "BB" a P40, sendo B a porção da proteína G do estreptococo que liga a albumina sérica (Nygren P.A. et al., Journal Mol. Recognit. 1988: 1, 69-74) .
As estirpes de E. coli RV308 transformadas com o vector pVABBP40 são cultivadas durante uma noite a 37 °C sob agitação, em 100 ml de TSB suplementado com extracto de levedura, ampicilina (200 μρ/ιηΐ) , tetraciclina (8 μρ/ιηΐ) e triptofano (100 μρ/ιηΐ) . Na manhã seguinte, uma cultura com uma DO = 1, a um comprimento de onda de 580 nm, é preparada em TSB + extracto de levedura + ampi + tetra.
Após 10 minutos de cultura, a expressão da proteína é induzida por adição de IAA (25 μρ/ιηΐ) ao meio. A cultura é centrifugada a 4°C e 2.460 xg, durante 10 minutos. O residuo é recuperado em 20 ml de TST IX pH 7,4, e a solução é centrifugada a 4°C e 23.000 xg durante 30 minutos. 27 0 sobrenadante é filtrado através de Sepharose, o que permite isolar as proteínas ditas solúveis. 0 resíduo é lavado com tampão de lavagem e depois é centrifugado a 23.000 xg e 4°C durante 30 minutos. O resíduo englobando os corpos de inclusão é então recuperado em 900 μΐ de uma solução desnaturante + 100 μΐ de ditiotreitol 10 mM e incubado durante 2 horas a 37°C.
Em seguida, a solução é incubada durante 1 noite à temperatura ambiente, sob agitação, em 100 ml de tampão de renaturação a 2.300 xg durante 1 hora. O sobrenadante é filtrado através de HSA-Sepharose.
Nos dois casos, as proteínas imobilizadas são eluídas com ácido acético 0,5 M, pH 2,8, e recolhidas em fracções de 1 ml.
As fracções recolhidas são, em seguida, analisadas por electroforese em gel SDS-PAGE e por imunotransferência.
RESULTADOS A clonagem do gene foi efectuada em três passos de acordo com a estratégia apresentada na Figura 4.
Num primeiro momento, confirmámos a porção da sequência publicada, com excepção de um T em vez de um A na posição 103.
Em seguida, determinámos a sequência do gene em 3' e, finalmente, a sequência em 5'. 28 0 gene inteiro foi obtido por fusão das duas porções 8/4 e 3/14 e depois foi clonado no vector pRIT28. A sequência corresponde à SEQ ID N.° 13. A proteína é expressa sob a forma BBP40.
Ela é essencialmente obtida a partir dos corpos de inclusão. Para uma cultura de 200 ml, purificam-se cerca de quinze miligrama de proteína. O perfil electroforético mostra que a proteína BBP40, obtida após desnaturação, é de uma grande pureza. 0 peso molecular aparente corresponde ao peso teórico calculado, que é de 63 kDa. A caracterização por imunotransferência mostra que a proteína purificada é bem reconhecida por um soro de coelho anti-P40.
Exemplo 5: Acoplamento da proteína P40 ao péptido GiA A proteína P40 (5 mg/ml, 40 mg) é dialisada contra 300 volumes de tampão fosfato de sódio 0,1 M pH 7, zwittergent 3-14 a 0,1%. O dialisado é ajustado a uma concentração de 2 mg/ml com o auxílio de um tampão carbonato 0,1 M pH 9, zwittergent 3-14 a 0,1%. Adiciona-se dodecilsulfato de sódio (SDS) para obter uma concentração final de 4%. O péptido Gi (10 mg/10 ml de tampão carbonato 0,1 M pH 9; zwittergent 3-14 a 0,1%) é adicionado à solução de P40. O valor do pH é controlado (compreendido entre pH 9 e pH 10). 29
Adicionam-se 220 μΐ de glutaraldeido (a 2,5% em água) e agita-se durante 24 horas a 4°C.
Adicionam-se 5 ml de tampão carbonato 0,1 M pH 9; zwittergent 3-14 a 0,1%, verifica-se o pH (compreendido entre pH 9 e pH 10) e agita-se durante 72 horas a 4°C.
Adicionam-se 220 μΐ de glutaraldeido (a 2,5% em água), verifica-se o pH e agita-se durante 24 horas a 4°C. A reacção é parada por adição de 100 μΐ de lisina 1 Μ. A solução é dialisada durante 24 horas a 4°C. O SDS é eliminado por dupla precipitação com KC1. A solução contendo o conjugado P40 é congelada e utilizada tal qual ou liofilizada.
Exemplo 6: Actividade Materiais e métodos
Os ratinhos C57BL/6 (N=5) são imunizados nos dias D0, D10 e D20 por via subcutânea com 10 pg de Gl, acoplado ou não a uma proteína de transporte, na presença ou não de um adjuvante. O soro é recolhido e testado por ELISA. Os Ig anti-Gl ou anti-proteína de transporte são isolados num suporte BSA-G1 e num suporte "proteína de transporte" (KLH ou TT ou P40) . Os Ig são revelados com o auxilio de um conjugado anti-Ig de coelho/peroxidase. A densidade óptica é lida a 450 nm, e o título de anticorpos anti-Gl é dado pelo inverso da última diluição que origina duas vezes o ruído de fundo. Os 30 resultados representam a média ± desvio-padrão dos títulos dos 5 ratinhos.
RESULTADOS
Indução de uma resposta imunitária contra G1A
Os ratinhos são imunizados com G1A sob diferentes formas, de acordo com um esquema de imunização idêntico. As respostas de anticorpos induzidas pelas diferentes formas de G1A são comparadas 28 dias após o início da experiência. 0 péptido sintético G1A administrado puro não induz uma resposta imunitária, mesmo quando é co-administrado com o adjuvante de Freund. Quando é apresentado pela proteína de transporte KLH, G1A induz uma resposta fraca que é significativamente aumentada pela co-administração do adjuvante de Freund (AF) . Quando é apresentado por P40, G1A induz uma resposta superior aquela obtida no esquema de imunização clássica KLH/G1+AF, tendo P40 propriedades de "self-adjuvant carrier".
Os resultados estão apresentados na Figura 1.
Cinética da resposta imunitária contra G1A
Os ratinhos são imunizados com G1A sob diferentes formas, de acordo com um esquema de imunização idêntico. As respostas de anticorpos induzidas pelas diferentes formas de G1A são comparadas no tempo: 7, 17, 28, 35 e 42 dias após o início da experiência. A resposta anti-GlA é significativamente mais elevada e mais rápida quando os ratinhos são imunizados com P40/G1A em comparaçao com as imunizações mais clássicas TT/G1A e 31 KLH/G1A+AF. Uma única injecção de P40/G1A permite obter, em 7 dias, um titulo de anticorpos anti-GlA de 1.000. Este titulo é obtido com TT/G1A ou KLH/G1A+AF em 28 dias. A resposta máxima (titulo = 1/380.000), obtida após três injecções, em 28 dias, é aproximadamente 30 vezes superior aquela obtida com KLH/G1A+AF e 70 vezes superior à obtida com TT/G1A. O titulo de anticorpos anti-GlA mantém-se sem diminuir até ao dia 42.
Os resultados estão apresentados na Figura 2.
Cinética da resposta imunitária contra a proteína de transporte
Os ratinhos são imunizados com G1A acoplado a uma proteína de transporte, de acordo com um esquema de imunização idêntico. As respostas de anticorpos induzidas pelas diferentes proteínas de transporte são comparadas no tempo: 7, 17, 28, 35 e 42 dias após o início da experiência. A resposta anti-P40 (título próximo de 10.000) é superior à resposta anti-KLH, mas não é significativamente diferente da resposta anti-TT.
Os resultados estão apresentados na Figura 3.
CONCLUSÃO O acoplamento químico do péptido G1A à proteína P40 permitiu induzir uma resposta anti-GlA significativamente mais importante e mais rápida que aquelas provocadas pelos modelos de referência KLH/G1A+AF ou TT/G1A. O acoplamento do péptido G1B deveria induzir respostas similares. 32
Exemplo 7: Avaliação do potencial protector dos péptidos e das proteínas recombinantes da glicoproteína G do vírus respiratório sincicial (VRS), subgrupo A, acoplados à proteína de transporte P40
Os ratinhos BALB/c foram imunizados com as diferentes preparações que se seguem: 1) péptido sintético G1A acoplado a KLH (keyhole limpet hemocyanin) = KLH.G1A. 2) péptido sintético G1A acoplado à proteína de transporte P40 = P40.G1A. 3) controlo P40 isolado. 4) proteína recombinante produzida em E. coli - BBG2AÔC -acoplada à proteína de transporte P40 = P40.BBG2AÔC. 5) péptido sintético G1A acoplado à proteína de transporte toxina tetânica (TT) = TT.G1A. 6) controlo TT isolado. 7) controlo BB isolado. 8) controlo VRS Long (subgrupo A).
Os ratinhos receberam 3 doses intramusculares (200 μρ/^^ηΐοο) com hidróxido de alumínio como adjuvante (utilizado correntemente no homem). Os resultados dos testes de protecção, bem como do perfil imunológico dos soros encontram-se na Tabela 2.
As preparações seguintes conferem uma protecção completa no seguimento de provocação com o vírus VRS Long (subgrupo A) : P40.G1A e P40.BBG2AÔC, em relação a TT.G1A que confere também uma protecção muito boa e comparável ao péptido KLH.G1A. No 33 teste ELISA, todas reconhecem o antigénio VRS, sendo o título mais elevado para Quanto ao teste possui actividade P4 0.G1A=1/12.800. de neutralização, nenhuma das preparações neutralizante in vitro. 34 Péptidos e proteínas recombinantes Protecção Título Elisa versus VRS Long Neutralização log 2/25 μΐ DICT50 log 10/g pulmões provocação com VRS Long (l,5xl05/ratinho) (Subgrupo A) 5 - 6 dias 7 - 8 dias KLH.G1A (100 a 151 μ?) 2.45 2.45 <2,010,4 <1,7 p < 0,001 <1,7 <1,7 2,45 2,15 <2,010,4 <1,7 p < 0,001 <1,7 <1,7 4.000 < 3,0 P40.G1A (200 μ9) <1,7 < 1,7 < 1,7 í 0 <1,7 p < 0,001 <1,7 <1,7 < 1,7 < 1,7 1 0 <1,7 p < 0,001 <1,7 12.800 < 3,0 Controlos P40 (200 μ?) 4,7 4.45 4,5 1 0,1 4.45 p < 0,001 4.45 4,7 4.45 4,5 1 0,1 4.45 p < 0,001 4.45 300 < 3,0 P40.BBG2A5C (200 μ?) <1,7 < 1,7 < 1,7 1 0 <1,7 p < 0,001 <1,7 <1,7 <1,7 <1,7 <1,7 10 <1,7 p < 0,001 <1,7 <1,7 1.700 < 3,0
Tabela 2: Protecção conferida e perfil imunológico dos soros após provocação com VRS Long (A), no seguimento da imunização de ratinhos BALB/c com diferentes proteínas recombinantes (3-4 semanas após 3 doses i.m. com hidróxido de alumínio). 3 6 Péptidos e proteínas recombinantes Protecção Título Elisa versus VRS Long Neutralização log 2/25 μΐ DICT5õ log 10/g pulmões provocação com VRS Long (1,5xl05/ratinho) (Subgrupo A) 5 - 6 dias 7 - 8 dias TT.G1A (200 μρ) <1,7 <1,7 <1,910,3 <1,7 p < 0,001 <1,7 2,45 <1,7 <1,7 <1,910,3 <1,7 p < 0,001 <1,7 2,45 7.200 < 3,0 Controlos TT (200 μρ) 4.45 4.2 4,210,3 4.2 p = 0,022 4.45 3,7 4.7 4.2 4,210,4 4.2 p = 0,053 4,45 3.7 250 < 3,0 Controlos BB (200 μρ) 2.95 4,2 3,710,5 3.95 p = 0,853 3.7 3.7 2,95 4.2 3,810,5 4.2 p = 0,760 3.7 3.7 150 < 3,0
Tabela 2 (continuação): Protecção conferida e perfil imunológico dos soros após provocação cora VRS Long (A), no seguimento da imunização de ratinhos BALB/c com diferentes proteínas recombinantes (3-4 semanas após 3 doses i.m. com hidróxido de alumínio).
Protecção Péptidos e proteínas recombinantes DICT50 log 10/g pulmões provocação com VRS Long (l,5xl05/ratinho) (Subgrupo A) Título Elisa versus VRS Long Neutralização log 2/25 μΐ 5 - 6 dias 1 - 8 dias
Controlos VRS Long <1,7 <1,7 <1,7 + 0 <1,7 p = 0,001 <1,7 <1,7 <1,7 <1,7 <1,7 + 0 <1,7 p = 0,001 <1,7 < 1,7 76.800 6,6 Controlos, não imunizados, provocados 3.95 3.95 3,7 3,7 + 0,2 3.45 3.95 3.45 3.95 4,2 3.7 3,8 + 0,3 3,45 3.95 3.7 150 < 3,0 Controlos, não imunizados, não provocados Ausência de vírus Ausência de vírus 150 < 3,0
Tabela 2 (continuação): Protecção conferida e perfil imunológico dos soros após provocação com VRS Long (A), no seguimento da imunização de ratinhos BALB/c com diferentes proteínas recombinantes (3-4 semanas após 3 doses i.m. com hidróxido de alumínio).
Exemplo 8: Avaliação do potencial protector de péptidos da glicoproteina G do virus respiratório sincicial (VRS), subgrupo A e subgrupo B, acoplados a KLH. Protecção em relação a uma provocação efectuada com os dois subgrupos do VRS .
Os ratinhos BALB/c foram imunizados com as diferentes preparações que se seguem: 1) péptido sintético G1A acoplado a KLH (keyhole limpet
hemocyanin) = KLH.G1A 2) péptido sintético G1A acoplado a KLH (keyhole limpet hemocyanin) = KLH.G1B. 0 péptido G1B corresponde à sequência G (174-187)ôCys do subgrupo B, cuja sequência é:
Ser-Ile-Cys-Gly-Asn-Asn-Gln-Leu-Cys-Lys-Ser-Ile-Ser-Lys -- s-s -^
3) controlo KLH 4) controlo VRS Long (subgrupo A) 5) controlo VRS 8/60 (subgrupo B)
Os ratinhos receberam 3 doses intramusculares (200 μρ/^^ηϊιο) com adjuvante de Freund. Os resultados dos testes de protecção, bem como do perfil imunológico dos soros encontram-se na Tabela 3. A preparação KLH-G1A permite uma protecção completa em relação ao VRS, subgrupo A, mas não em relação ao VRS, subgrupo B. Pelo contrário, a preparação KLH-G1B permite uma protecção completa em relação ao VRS, subgrupo B, mas não em relação ao VRS, subgrupo A. O teste ELISA reflecte a mesma situação. 38 PROTECÇÃO DICTio log 10/g pulmões Título ELISA Péptidos acoplados a KLH Provocação VRS Long (subgrupo A) 1,5 x 105/r (50/μ1) Provocação VRS Long (subgrupo B) 0,6 x 105/r (50/μ1) Versus VRS Long (A) Versus VRS 8/60 (B) G1A < 1,8 í 0,3 n = 11 p < 0,001 3,3 í 0,5 n = 10 p = 0,237 29.866 266 G1B 3,8 i 0,8 n = 7 p = 0,517 <2,110,5 n = 8 p < 0,001 < 100 7.200 Controlo KLH 3,7 i 0,3 n = 11 p = 0,01 3,410,3 n = 10 p = 0,6 < 200 133 Controlo VRS (A) <1,7 + 0 n = 11 p < 0,001 <1,7 + 0 n = 11 p < 0,001 > 68.266 51.200 Controlo VRS (B) <1,7 + 0 n = 10 p < 0,001 < 1,71 0 n = 10 p < 0,001 > 76.800 68.266
Tabela 3 : Protecção conferida e perfil imunológico dos soros após provocação com o RS Long (subgrupo A) ou com o RS 8/60 (subgrupo B), no seguimento da imunização de ratinhos BALB/c com os péptidos G1A e G1B.
Exemplo 9: Aplicação veterinária
Avaliação do potencial protector do péptido GlvAC derivado da proteína G da estirpe bovina do vírus respiratório sincicial (VRS) - Lerch et al., 1990, J. Virol. 64:5559 - acoplado à proteína de transporte KLH. 174 187
Ser Thr Cys Glu Gly Asn Leu Ala Cys Leu Ser Leu Ser His que possui uma ponte de dissulfureto na posição 176-182. O péptido preparado por síntese em fase sólida, utilizando a química Boc, é acoplado à proteína KLH usando o glutaraldeído (Schaaper et al., Mol. Immunol. (1989) 26:81-85).
Dois vitelos foram imunizados por via intramuscular com 500 pg de GlvAC-KLH, juntamente com adjuvante incompleto de Freund, por 3 vezes com um intervalo de 3 semanas. Um vitelo foi imunizado com KLH sem péptido GlvAC, juntamente com adjuvante incompleto de Freund.
Os animais são provocados com a estirpe Snook 21 dias após a última inoculação, por via intranasal e intratraqueal, cada um deles com 1 ml de vírus titulando a 2xl05/ml O vírus titulado em células de rim de vitelo, de acordo com o método das placas fágicas, é determinado nas lavagens nasofaríngeas, respectivamente, 3 e 2 dias após a provocação, e 7 dias nos pulmões dos animais sacrificados. 40 RESPOSTA EM ANTICORPOS CIRCULANTES:
Vitelo 3432 (KLH + FIA):
Data Tratamento Título loglO ELISA Péptido + KLH Péptido KLH BRSV (Snook) 23/11 D0 vacinação <1,0 <1,0 <1,0 <1,5 14/12 D21 vacinação <1,0 <1,0 3, 0 <1,5 04/01 D42 vacinação <1,0 < 1,0 4,7 < 1,5 01/02 D70 VRS IN/IT <1,0 <1,0 5,7 <1,5 08/02 D77 sacrifício 1,5 <1,0 4,8 <1,5
Vitelo 3440 (Péptido - KLH + FIA):
Data Tratamento Título loglO ELISA Péptido + KLH Péptido KLH BRSV (Snook) 23/11 D0 vacinação <1,0 <1,0 <1,0 <1,5 14/12 D21 vacinação 1,6 <1,0 <1,0 <1,5 04/01 D42 vacinação 3, 8 2, 6 1,7 1,9 01/02 D70 VRS IN/IT 2,7 2, 8 2, 6 3,7 08/02 D77 sacrifício 4,1 2, 6 1,7 3,1 KLH em com 3
Vitelos aos quais foi administrado 500 μg GlvAC -adjuvante incompleto de Freund por três ocasiões, semanas de intervalo. 41
RESPOSTA À PROVOCAÇÃO DO VÍRUS
Secreção Dia 7 nasofaringeal Vírus do pulmão g. 0 Vitelo Vacinação N. ° Título Tít. LBA Pulmão pneumoniae dias max. (ufp/ml) homog. 3432 KLH + FIA 3 5,1 x 103 1, 4 x 102 3/3 12 3440 Péptido -KLH + FIA 2 5,5 x 102 <0,7 0/3 < 1 RESPOSTA EM ANTICORPOS CIRCULANTES:
Vitelo Vacinação Título loglO ELISA (BRSV Snook) Dia 0 Dia 24 Dia 42 Dia 68 Dia 75 4138 KLH + FIA < 1,5 < 1,5 < 1,5 < 1,5 2,4 4140 *Péptido- < 1,5 < 1,5 3, 0 2,5 = 2, 9 KLH + FIA * Vitelo ao qual foi administrado 500 μg de BP 4006 - KLH em adjuvante incompleto de Freund por três ocasiões, com 3 semanas de intervalo.
RESPOSTA À PROVOCAÇÃO DO VÍRUS
Secreção Dia 7 nasofaringeal Vírus do pulmão % Vitelo Vacinação N. ° Título Tít. LBA Pulmão pneumoniae dias max. (ufp/ml) homog. 4138 KLH + FIA 5 4 x 101 6,5 x 102 2/3 27 4140 Péptido -KLH + FIA 4 2 x 103 7,0 x 101 3/3 2 42
LISTA DE SEQUÊNCIAS
(1) INFORMAÇÕES GERAIS (i) DEPOSITANTE:
(A) NOME: PIERRE FABRE MEDICAMENT
(B) RUA: 17, AVENUE JEAN MOULIN
(C) CIDADE: CASTRES
(E) PAÍS: FRANÇA (F) CÓDIGO POSTAL: 81106 (ii) TÍTULO DA INVENÇÃO: ELEMENTO DE IMUNOGÉNIO, AGENTE IMUNOGÉNICO, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA E PROCESSO DE PREPARAÇÃO. (iii) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 75
(iv) FORMA DECIFRÁVEL POR COMPUTADOR (A) TIPO DE MEIO: Disquete (B) COMPUTADOR: PC IBM-compatível
(C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (vi) DADOS DO PEDIDO ANTERIOR: (A) NÚMERO DO PEDIDO: FR 94 04009 (B) DATA DE DEPÓSITO: 6 ABRIL 1994
INFORMAÇÕES PARA A SEQ ID NO: 1 G2A TIPO DE SEQUÊNCIA: aminoácidos e nucleótidos COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIA: 101 aminoácidos, 303 nucleótidos NÚMERO DE CADEIAS: simples CONFIGURAÇÃO: linear TIPO DE MOLÉCULA: proteína 1 130 $ί - Ihr 1¾¾ Ihr 1¾¾ Asn "&r Thr Thr Thr GSri Thr Oa Pro Ser Pêo Thr Thr Lys S‘- WGRjmMCMhjmio; AXtMCKCCftswccKasii^jwAãKaxjiccMA. iSi|!|||s:;: C*Ln teq (Sn Am Lys Pro Pto Am tys Bj» Am Ám. Asp Hb His Eb» Glu \M lhe Am Ehgs OG COT CSG JWC ASA CHS CTO AAC AAA 023 AfiC JWC OKI TSC OST TEC GRA GÍG TTC ABC ΤΣΟ 1:71 173 176 182 186 \&ã Pca Q® Ser He q® Ser M Asa Bso Thr Cy* fcp Aia. Π» q® Ar$ £Le Pro Am
GE3 033 1QC WC AIC Έ30 AGC RAC ABC 003 AQC 7GC TOS QQS MÇ TQC ABA CG? ASO <H? AAC 2$f2 1¾¾ lys Fro CHy t#s 1¾¾¾ Ha1 Usr lhe 1*® Eh* Ihr Sys I$s to Uw £be 1¾¾ Thr Ihr lys AAA. £#Ã CTO <HC ASA ASA ASC SOS «X AAA 033 AEX MA ASA 033 XE WC ARA KELXC NA 213 230 1¾¾ Asp His lys Pso Gbi Tht Thr l&« Pso Lys du i&l $%o lhe Ha* iys f*o - C AAA 0ΚΓ CAX AAA 335 0fí AQC JK33 ARA 033 AAA ®A ORí 033 AOC AGC ARA <333 * 3*
INFORMAÇÕES PARA A SEQ ID NO: 2 G2B TIPO DE SEQUÊNCIA: aminoácidos e nucleótidos COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIA: 101 aminoácidos, 303 nucleótidos NÚMERO DE CADEIAS: simples CONFIGURAÇÃO: linear TIPO DE MOLÉCULA: proteína 130 H - The Ala Or. Thr 02y Asg ne •ow tor Ser Thr Sn Ώίγ íssn to Ser Uor 3'-: :ACÚ: QQQ ilH· ?£C VA or CGT XX xr AX ASC ACC CAQ ΑΧ n*J* Γ» 1U jWí ¢03 A03 AX Ser Hw •gjèfl-WWr . íys Mli Pro ΪΪΟ tè® lyB Pso a^e> Asptyr HiS íhe GElu wdt Shs Asn Ihs Α3Τ íést «X 033 OX /yTV Aftà 033 MA GBT Gftr TJC ac 310 0»A GIG 170 ABC 170 171 173 17$ 183 18$ fc' '11»' CVS âar fie Cys Gly Asa Asa Gin leu 1$E Ser £le Q® Lys Thr m Pro Ser SEG LÂJw Ί33 AX XO wz OX aar CRG QO TGC ιΓνΤ’ίι xo Í£C ARA ACC A3C CD3 AGC .aHíí Ιψβ Pto lys Liys Pro The He Pep Th- Am fro Ito Tto Lys Ibr thr: Am .MÉ ARA iiOQS ASA, AA3 JfeftíV 003 AX tac AMl 033 «c :3WÍ C05 AX AOC AOC AT Λδ^* ,»sF7r^wo 213 230 5¾¾ Arçj Αεσ to lys 3Hr Pro Alã lys WK Pr*> lys lys Glu He He lhe Am - C sÉA G3T ÇHT C05 f»Tt m: 033 003 jyiA xo 033 AAG AA3 XC .XO AX AAC :És3' 1· 2 INFORMAÇÕES PARA A SEQ ID NO: 3 G2AÔCys TIPO DE SEQUÊNCIA: aminoácidos e nucleótidos COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIA: 101 aminoácidos, 303 nucleótidos NÚMERO DE CADEIAS: simples CONFIGURAÇÃO: linear TIPO DE MOLÉCULA: proteína 130 N - Xtx V&l tjjfS Har íft* Pm Hur fp Thr !ϋ <&n Gin ffes Ser ti® |§§f Ur Lys-i: S1- AOS iili «T ff.ft.ft •«WIF*: AX «r «T β 0x3 «ri 0x3 cm «r AM ar AX |lc AAA li ϋ> Αϊφ Gin Am lyu PSQ m Agn Êto Astí Asn Αφ. Rie His am au vai 3m Am Hm gs CGT ac* MC ÇLli cm AM cm MC rWU GO T3C csr TSC CftA CT5 TtC wc nc ΐϋ m 383 L8S Pro §§§ Ser He Q® Aan Am Pro "Sb: Cy® isp 111 He Lys Arg ne Prts Am cm as: A3C τα: mc JWC PfC 035 KC TOC TG3 333 «3C «r MA mr íOC cm asf* 192 1¾¾ 1¾¾ $EO Giy Lj® ’&Τ Thr lys Ηϋ *a» Lys Jto Ihr 3¾ Hw- Ittar 35AA. 033 AftA ACC AG3 ÁX AAA Viiij· ÃCC AM cm «r TEC MA #r ATM 20 330 U/» Asp Ms fto Gin Thr w í^s £*» Ghi v&i Pio ‘Xhr Utr Lys Pro * c MA GKT Ο0Γ CEO cm «X AOC AftA 033 jAAÍl 6SA GKj rrE ACC :P£S2 MA cm - 3 INFORMAÇÕES PARA A SEQ ID NO: 4 G2BÔCys TIPO DE SEQUÊNCIA: aminoácidos e nucleótidos COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIA: 101 aminoácidos, 303 nucleótidos NÚMERO DE CADEIAS: simples CONFIGURAÇÃO: linear TIPO DE MOLÉCULA: proteína 3 I lllll Ν - Ihr Ala dn Τ5ν Lj® SLy Axg He thr thc Ssr Ur CELn Ur Am 1¾¾ fso Ser The Lys m:a&ocm:*»&<icQKm:MCM£i^faz<ttpaz!Wjm.cazi^$ccfm
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Ser Arg Ser Lys M sat P*o í#$ jty& fts> iys Aqp Asp Tyr t&$ Sbe CEIm ΤΑΛ lhe Ahi ftw MC 0»AT WWVWC» 005 ΑΑΑ^ΰΟΪΑΑΑCttOKTTICae*»«&«»TK! «CISC 171. 173 176 132 186 vai Peo Ser Ser He cys SLy Asn Asrt dn Lm Cys Lys Ser He ser H/s Use He Pro Ser aso ca: mc «e mc « as: mc wc cm ac to a» w i«c ιβ: a» jcc joc cas Mc
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Am iys Ρεσ E#s 1¾¾ lys Pro Ur He lys Pro Use Asm t$s Pte> *»r Ur Lys Ihr Ufir As* AAA 033 AAA AM MA CHS ADC ΑΛ (TO PCC AWC jm C33 AOC MC muOC AG3 PAC 2U 230 lys Asg Asp Pco lys Thr Pto Ala íys í“®t Pco tys 1¾¾ <3Lu He He. ihr Ass · C jVA CST OBX 033 AT OH OH AAA SIS TO AM AM (m AOO PCC ASO » 3* INFORMAÇÕES PARA A SEQ ID NO: 5 GlACys TIPO DE SEQUÊNCIA: aminoácidos e nucleótidos COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIA: 14 aminoácidos, 42 nucleótidos NÚMERO DE CADEIAS: simples CONFIGURAÇÃO: linear TIPO DE MOLÉCULA: péptido 174 176 183 188 U» n - Ser He cys Ser Am Asa Pro Ur cys t*p ALa He Cys lys - C 5' - AGI Α3Γ ICC ACC AAC A8C C05 fCC 7CC 7H3 CEH A3C ICC AAA * 3* INFORMAÇÕES PARA A SEQ ID NO: 6 GIBCys TIPO DE SEQUÊNCIA: aminoácidos e nucleótidos COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIA: 14 aminoácidos, 42 nucleótidos NÚMERO DE CADEIAS: simples CONFIGURAÇÃO: linear TIPO DE MOLÉCULA: péptido 4 174 ** 1S2 m as? N ' ser lie Cys <Sy Aan <Sn Lai Q® tjys Sar He (¾^ i%ss - e 5*- «3Ç /HK U3C OGC JWC MC C?C C3Ç U3C AM ACC! «pç 7ÇÇ MA * y
INFORMAÇÕES PARA A SEQ ID NO: 7 G1A TIPO DE SEQUÊNCIA: aminoácidos e nucleótidos COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIA: 14 aminoácidos, 42 nucleótidos NÚMERO DE CADEIAS: simples CONFIGURAÇÃO: linear TIPO DE MOLÉCULA: péptido lllllllm Wàvfí iiit lllllllllllllll® 1111 ass Jilllllllli: íí * Ser He cys Ser Aso Am Eso Ihr Q* *Etp Ma. lie Ser Lys - C * Α3Γ MC ICC AGC MC ME CH3 ACC 7DE 7S33 033 AIC A3C AM ~ 3'
INFORMAÇÕES PARA A SEQ ID NO: 8 GlB TIPO DE SEQUÊNCIA: aminoácidos e nucleótidos COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIA: 14 aminoácidos, 42 nucleótidos NÚMERO DE CADEIAS: simples CONFIGURAÇÃO: linear TIPO DE MOLÉCULA: péptido 174 17$ iSS IS? :||i!.ãer He Oj® '|§||||:Am Lallfc# i|§l^|||ilssii: - c S'-Aacj^TJCQCCAflCMcasc35TKMAia:jiacid:«wi-3» INFORMAÇÕES PARA A SEQ ID NO: 9 G1' A TIPO DE SEQUÊNCIA: aminoácidos 5 COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIA: 14 aminoácidos NÚMERO DE CADEIAS: simples CONFIGURAÇÃO: linear TIPO DE MOLÉCULA: péptido 174 ; 176 132 28S 187 ϋ - Ser Ué Âsp Sár Ssa Jten Pa» Thr ££» Τφ Μϊ He Cys lys * Ç
INFORMAÇÕES PARA A SEQ ID NO: 10 G1'B TIPO DE SEQUÊNCIA: aminoácidos COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIA: 14 aminoácidos NÚMERO DE CADEIAS: simples CONFIGURAÇÃO: linear TIPO DE MOLÉCULA: péptido 174: ; 176 182 186 287
N » ÉÇT ílé Mp G2y Mn M Sín IM to Ser He cys - C
INFORMAÇÕES PARA A SEQ ID NO: 11 G1'AÔC TIPO DE SEQUÊNCIA: aminoácidos COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIA: 14 aminoácidos NÚMERO DE CADEIAS: simples CONFIGURAÇÃO: linear TIPO DE MOLÉCULA: péptido 6 11 \ ΙΙΙΙΙΙ:1Ρ: 1S6 187 11
INFORMAÇÕES PARA A SEQ ID NO: 12 G1'BÔC TIPO DE SEQUÊNCIA: aminoácidos COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIA: 14 aminoácidos NÚMERO DE CADEIAS: simples CONFIGURAÇÃO: linear TIPO DE MOLÉCULA: péptido 174 17€ m 18$ 18?
U * Sar n« Cfty Am Asa leu dm lys Ser He ste * C INFORMAÇÕES PARA A SEQ ID NO: 13 P40 TIPO DE SEQUÊNCIA: aminoácidos e nucleótidos COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIA: 335 aminoácidos, 1005 nucleótidos NÚMERO DE CADEIAS: simples CONFIGURAÇÃO: linear TIPO DE MOLÉCULA: proteína llllllis ΪΪ «Ma lhe tlpltyr Ma <XLy í&y 1¾¾ teu <ayl|||íl^t .............ase 'cmlliilil^' mc aec i|i w' sx atar ot w& ao PIBINIí 17 SB I§ dln Tyr Kis Asp "Shr GXy Re Tyr <3iy Asi Gly fte GU* ftsn Asn Asrs. Gly llps w oc s^lliilÉm m: «ff- m osr m: tm m wc m &éf |l|s............................ ...................... .................................................................................... tte· Mg Am íHns Un GLy Ala SLy Ma Re Q.y <3t.y Ty^r Qii Asi ||i joc me m: <pll||l|§||ísr mz φ tm m: osr asr 11 53
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INFORMAÇÕES PARA A SEQ ID NO: 14 G2AÔCF TIPO DE SEQUÊNCIA: aminoácidos e nucleótidos COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIA: 101 aminoácidos, 303 nucleótidos NÚMERO DE CADEIAS: simples CONFIGURAÇÃO: linear TIPO DE MOLÉCULA: proteína
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INFORMAÇÕES PARA A SEQ ID NO: 15 G4A TIPO DE SEQUÊNCIA: aminoácidos e nucleótidos COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIA: 17 aminoácidos, 42 nucleótidos NÚMERO DE CADEIAS: simples CONFIGURAÇÃO: linear TIPO DE MOLÉCULA: péptido 9 1.71 1TJ X?S JS2 186 187 5'“Ο^αΤί^Α^Ϊ^3θ:^Α^^0α3ΜΓΤΟ1Τ3330α3ΑΪΤΤ^ΑΑΑ~3’
INFORMAÇÕES PARA A SEQ ID NO: 16 G4AÕC TIPO DE SEQUÊNCIA: aminoácidos e nucleótidos COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIA: 17 aminoácidos, 42 nucleótidos NÚMERO DE CADEIAS: simples CONFIGURAÇÃO: linear TIPO DE MOLÉCULA: péptido 171 m 176 182 188 X87 N * v&i S*so Ser ser Ile Cys Ser Asn Am Pto Ihr Q® Τϊρ Ala 11« Ser Lys * C S’- GKJ 033 ^ Α1Γ TGC ΑΧ: AA7 ASC Cm AT JSR.SSS Q33 ÍOC JSQC ASA ~ 3*
INFORMAÇÕES PARA A SEQ ID NO: 17 G4B TIPO DE SEQUÊNCIA: aminoácidos e nucleótidos COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIA: 17 aminoácidos, 42 nucleótidos NÚMERO DE CADEIAS: simples CONFIGURAÇÃO: linear TIPO DE MOLÉCULA: péptido 171 173 17S 1B2 186 187 n - V&l ito cys Ser He Cys dy Asn Asa da Dsu q?» tys Ser He Cys Lys « c “Crer ar icr «r aec ia? ar aac j^ctg ixr - 3*
INFORMAÇÕES PARA A SEQ ID NO: 18 G4BÔC TIPO DE SEQUÊNCIA: aminoácidos e nucleótidos COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIA: 17 aminoácidos, 42 nucleótidos 10 NÚMERO DE CADEIAS: simples CONFIGURAÇÃO: linear TIPO DE MOLÉCULA: péptido 171 171 17S 1M2 igg 3*7 tf - Vai Pro Ser âstr He Çfcs ®y Asi Asn£ki U*4 Gys £ys He Ser 1¾¾ - ç s* arjecíGC ssectgc ar jwc abc cso og rar phh «gc mc agc aaa - y
INFORMAÇÕES PARA A SEQ ID NO: 19 G4'A TIPO DE SEQUÊNCIA: aminoácidos COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIA: 17 aminoácidos NÚMERO DE CADEIAS: simples CONFIGURAÇÃO: linear TIPO DE MOLÉCULA: péptido ....... m 176 182 136 137
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INFORMAÇÕES PARA A SEQ ID NO: 20 G4'AÔC TIPO DE SEQUÊNCIA: aminoácidos COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIA: 17 aminoácidos NÚMERO DE CADEIAS: simples CONFIGURAÇÃO: linear TIPO DE MOLÉCULA: péptido 171 173 173 382 136 187
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INFORMAÇÕES PARA A SEQ ID NO: 21 G4'B TIPO DE SEQUÊNCIA: aminoácidos COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIA: 17 aminoácidos NÚMERO DE CADEIAS: simples CONFIGURAÇÃO: linear TIPO DE MOLÉCULA: péptido m m m w, ím mi íl ~ vai Αφ iSfear 11© Asp tíky Àsrs. fea Gto im to Ser :Oe to. « €
INFORMAÇÕES PARA A SEQ ID NO: 22 G4'BÔC TIPO DE SEQUÊNCIA: aminoácidos COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIA: 17 aminoácidos NÚMERO DE CADEIAS: simples CONFIGURAÇÃO: linear TIPO DE MOLÉCULA: péptido iTL m 182 Wl jí « vai pm Seat Ssr xi© Asp Qy as» As» <&*% um to lyss mt tm Se* * c
INFORMAÇÕES PARA A SEQ ID NO: 23 G200A TIPO DE SEQUÊNCIA: aminoácidos e nucleótidos COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIA: 61 aminoácidos, 183 nucleótidos NÚMERO DE CADEIAS: simples CONFIGURAÇÃO: linear TIPO DE MOLÉCULA: proteína 12 1111!!! .ff R;||p!§§r <2ki ;i&» Ser *Bsç |Mll§piÉl§ll§^ A$a. Asçf shIIÍÍiÍÍÉ ctg ;cm íos 3?ί^||ί|||::ο»^^ |i^|li|^|||ii^ M£ M&;i§§|i;§ías aá| is|llllllllli; iT3111111 i?s 3^1;llÍ:IÍts Am sn* Kíllilllilu f|âi;|§|ii§|| cys |§§l;tie cys; »c !(3κγ tdc cAltllÉa ΙΝΒΙΙβΒΙΙΙ? ^ ®tMc ^ illlllll! mi li!!!!!!!!! ||ei|||||||||||||||i slilliiliiiT· eko utr ·ε^β i||ii||i!|ib <j|s '|§|駧|ιβ^ i|li|m *3γ <33 i|§il||i|§|r ilfii® ã§|1É3S osi 1S6 200
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INFORMAÇÕES PARA A SEQ ID NO: 24 G198A TIPO DE SEQUÊNCIA: aminoácidos e nucleótidos COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIA: 59 aminoácidos, 177 nucleótidos NÚMERO DE CADEIAS: simples CONFIGURAÇÃO: linear TIPO DE MOLÉCULA: proteína 140 N - Gin. to Gki Pro Sesr ly& Pro to to -lys-CSíi· Asg-(Sn Am fix> í*o Am
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INFORMAÇÕES PARA A SEQ ID NO: 25 G196A TIPO DE SEQUÊNCIA: aminoácidos e nucleótidos COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIA: 57 aminoácidos, 171 nucleótidos NÚMERO DE CADEIAS: simples 13 CONFIGURAÇÃO: linear TIPO DE MOLÉCULA: proteína im
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INFORMAÇÕES PARA A SEQ ID NO: 26 G194A TIPO DE SEQUÊNCIA: aminoácidos e nucleótidos COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIA: 55 aminoácidos, 165 nucleótidos NÚMERO DE CADEIAS: simples CONFIGURAÇÃO: linear TIPO DE MOLÉCULA: proteína m g? - Ihi* GlíJ Bco .^!|||!ii!ii: Har X#s 0Í||plÍÍIl|m |||; a» ^i||sfí| ss - di^iiiliilils í^!|||1ííí:í||| acc ma ct§||||i|||i||c |§|: oos ItllMl ise......iiiiiiiiiiiiiiiiiii........... ................................II...........Ilfcl 1¾¾. f*ro Am .Am Asp Ene His 1%¾ Glu Ene Am i%» ^ Fm Cys Ser He Cys AAA 033 AK TIC Off m CM GIG TIC A1C TIC GD CCS 10C AX7 NEC IO: 177 1B2 1M 3J4
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INFORMAÇÕES PARA A SEQ ID NO: 27 G192A 14 TIPO DE SEQUÊNCIA: aminoácidos e nucleótidos COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIA: 52 aminoácidos, 156 nucleótidos NÚMERO DE CADEIAS: simples CONFIGURAÇÃO: linear TIPO DE MOLÉCULA: proteína 140 ΝΓ ~ ΐΠπ Thr Gin Fw? Srar 1¾¾ Ppo Tíe Tter Lys Gin Atg Gin Asn lys Red pjbo Asn III oú. λχ ase asifll aaa a^|wc m|||ma. ο*§:§ϊγ ao cm akí 156 173 176 hys a» Aan Asn Asp Eha Hís K» <&a vai 8* Asn. lhe v&i Red cys Ser Π* cys ^Ha m mc ak: ckIÍÍc os* tUfc salHe JíÍíIifss* . siiliiii: tocllii:: ifb............................... |ie.............Jlllllll'' '^llllilllll::.............Ili''' as» llllllililllll:
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INFORMAÇÕES PARA A SEQ ID NO: 28 G6A TIPO DE SEQUÊNCIA: aminoácidos e nucleótidos COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIA: 51 aminoácidos, 153 nucleótidos NÚMERO DE CADEIAS: simples CONFIGURAÇÃO: linear TIPO DE MOLÉCULA: proteína
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INFORMAÇÕES PARA A SEQ ID NO: 29 G7A TIPO DE SEQUÊNCIA: aminoácidos e nucleótidos COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIA: 33 aminoácidos, 99 nucleótidos NÚMERO DE CADEIAS: simples CONFIGURAÇÃO: linear TIPO DE MOLÉCULA: proteina 158 2TS H - 1#$< ASO Am Asp a» Kis ilfai: Glu &( :.%3tÍ ae \tol Pk> cys Ser S*- MA cro MC JSJT CKT TTC CSX T3BC β; -líisí- HC AAC PC GTM ΟΠ 1Π2 MC 175 182 188 15» Q® Ser Am Am a*> Ur: Cíj® Tsp Alai He cys íys lie Ppo * c ICC #GC JWw CD3 «X B3C uas <133 aoo wc SsTJGC C3B - X \
INFORMAÇÕES PARA A SEQ ID NO: 30 G200AÔC TIPO DE SEQUÊNCIA: aminoácidos e nucleótidos COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIA: 61 aminoácidos, 183 nucleótidos NÚMERO DE CADEIAS: simples CONFIGURAÇÃO: linear TIPO DE MOLÉCULA: proteina 140 .» * .GUv.sro Sesr l*® J5ao Uw ttr 3#$ .ftgg Gin. ftsn 1¾¾ fro Pm tm 5*- «G ACC CHS <03 AftA OB AO: JCC ^ CHS CST OC ÍM? m OO CCS A« asa xn xm
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INFORMAÇÕES PARA A SEQ ID NO: 31 G198AÔC TIPO DE SEQUÊNCIA: aminoácidos e nucleótidos COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIA: 59 aminoácidos, 177 nucleótidos NÚMERO DE CADEIAS: simples CONFIGURAÇÃO: linear TIPO DE MOLÉCULA: proteína 140
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INFORMAÇÕES PARA A SEQ ID NO: 32 G196AÔC TIPO DE SEQUÊNCIA: aminoácidos e nucleótidos COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIA: 57 aminoácidos, 171 nucleótidos NÚMERO DE CADEIAS: simples CONFIGURAÇÃO: linear TIPO DE MOLÉCULA: proteína 140 N “ Gin Utr GLn £*o Sse 141« Pro Osr Hir 15,5 SLn Argr Cto Asn rs> s^^JccTOaxtAXAMacGAarArAAAeKsasrcKSAfCAMGEcoaíMc 17 156 *73 176 fto ásb Asp Et» Hís EItè Cíhi i&i && fcst* She Vai Pro Ser Ser Ils (¾¾ m <X0 ^ «C CRT tac CRT Tj|jiH Α^§§£ JWC Νφέ! iT7 182 ;!!!!!! iéi!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!l|
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G194AÔC INFORMAÇÕES PARA A SEQ ID NO: 33 TIPO DE SEQUENCIA: aminoácidos e nucleótidos COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIA: 55 aminoácidos, 165 nucleótidos NÚMERO DE CADEIAS: simples CONFIGURAÇÃO: linear TIPO DE MOLÉCULA: proteína 140 *í * GOn 75te: Ors Pm Ser 14« Fm Uir thr Lys CSn Arg <&n Asn Lys Fm Fm fim S'- OG aít OG (Tft A3C ABA ar act αχ Aftk 05G CST CSC :WV ABA cm ar APC 158 173 176 Pit> Asn w ttc Hi§ fte aiu wd Ete Asn 3*; Pm Ser Ip lie #A ar íjv* bac 33C OvT TJC OA GXO TVC SSAT* ÍTPIfcí·: 7IC ao αεο ΛΧ AX A3T 177 m 186 194 Ser Asn ífân Ito Tbr cys· Tfcp Ala He Scr He 8W? Ast3 1*3 í#s Fm - € ABC AíC 033 Acr 1SC 703 CEO AJO AGC ABA cor AíC ar ABC. AAA cm * 3
INFORMAÇÕES PARA A SEQ ID NO: 34 G192AÔC TIPO DE SEQUÊNCIA: aminoácidos e nucleótidos COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIA: 52 aminoácidos, 156 nucleótidos NÚMERO DE CADEIAS: simples CONFIGURAÇÃO: linear TIPO DE MOLÉCULA: proteína 18 140 14 . Õa thr C&o Psd Ser I$s Fm "Se- Ttar £^s Gin Ssg Gtft Asm Fm Psro As» a& ta;<m ^mm &m&cm>tmmsm m 171 176
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INFORMAÇÕES PARA A SEQ ID NO: 35 G6AÔC TIPO DE SEQUÊNCIA: aminoácidos e nucleótidos COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIA: 50 aminoácidos, 150 nucleótidos NÚMERO DE CADEIAS: simples CONFIGURAÇÃO: linear TIPO DE MOLÉCULA: proteína 140 N * Glti *2« <an Pm ser Ijj® fti» He liar J#s íSd Argr Qia Asn £$« Sxo Sm As»
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INFORMAÇÕES PARA A SEQ ID NO: 36 G7AÔC TIPO DE SEQUÊNCIA: aminoácidos e nucleótidos COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIA: 33 aminoácidos, 99 nucleótidos NÚMERO DE CADEIAS: simples CONFIGURAÇÃO: linear 19 TIPO DE MOLÉCULA: proteína sss m í) * S*« fiw» Am Am Aep && Λ Ita Am 5$*? fw» Ser $m S^mCOSAACAACiWTOWT^aa^tXAíCTíCG^iíXESAXAGeMt:
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INFORMAÇÕES PARA A SEQ ID NO: 37 G200B TIPO DE SEQUÊNCIA: aminoácidos e nucleótidos COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIA: 61 aminoácidos, 183 nucleótidos NÚMERO DE CADEIAS: simples CONFIGURAÇÃO: linear TIPO DE MOLÉCULA: proteína
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INFORMAÇÕES PARA A SEQ ID NO: 38 G198B TIPO DE SEQUÊNCIA: aminoácidos e nucleótidos COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIA: 59 aminoácidos, 177 nucleótidos NÚMERO DE CADEIAS: simples 20 CONFIGURAÇÃO: linear TIPO DE MOLÉCULA: proteína
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INFORMAÇÕES PARA A SEQ ID NO: 39 G196B TIPO DE SEQUÊNCIA: aminoácidos e nucleótidos COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIA: 57 aminoácidos, 171 nucleótidos NÚMERO DE CADEIAS: simples CONFIGURAÇÃO: linear TIPO DE MOLÉCULA: proteína 140 N * ser ihr Gta thr Am Jwe Ser Usr i$s ser Rxg Ser 1¾¾ Aso. peo Pm Lys lys Pm <&'- AX AX CfiC* AX A8C AÍ& CX ÃE£ .SX AAA J3X Xf A&C AAA MC 033 £££* AAA AAA CHS 160 173 376 l^s Asp Kep T/r His ífee sSu vai Re aso aio \al Pm cys ser He cys Gly A33 aso Sto Α^^(^τκ:α£ϊϊε:<^<^τχΑΑ2ϊΐ£θΏατ7Χ^2^ιχαχΑχ;^αρα 162 1S6 3J6
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INFORMAÇÕES PARA A SEQ ID NO: 40 G194B TIPO DE SEQUÊNCIA: aminoácidos e nucleótidos COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIA: 55 aminoácidos, 165 nucleótidos NÚMERO DE CADEIAS: simples 21 CONFIGURAÇÃO: linear TIPO DE MOLÉCULA: proteína .......................................... *í - Sar Tbr Qrs. Uír Asn í#s Pro Ser Thr Lys Ssr Asg Ser Asa 1¾¾) Çfco lyç Pm
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INFORMAÇÕES PARA A SEQ ID NO: 41 G192B TIPO DE SEQUÊNCIA: aminoácidos e nucleótidos COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIA: 53 aminoácidos, 159 nucleótidos NÚMERO DE CADEIAS: simples CONFIGURAÇÃO: linear TIPO DE MOLÉCULA: proteína 14& $t “ SSK1" thr dn S*r Asr* lys Sc» Sex (£htr tys Ser A*sg- Ser 1¾¾ Am pm Pw? íyg Pm
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INFORMAÇÕES PARA A SEQ ID NO: 42 G6B TIPO DE SEQUÊNCIA: aminoácidos e nucleótidos COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIA: 51 aminoácidos, 153 nucleótidos NÚMERO DE CADEIAS: simples CONFIGURAÇÃO: linear 22 TIPO DE MOLÉCULA: proteína
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INFORMAÇÕES PARA A SEQ ID NO: 4 9 G6BÔC TIPO DE SEQUÊNCIA: aminoácidos e nucleótidos COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIA: 51 aminoácidos, 153 nucleótidos NÚMERO DE CADEIAS: simples CONFIGURAÇÃO: linear TIPO DE MOLÉCULA: proteína ............ Jf
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INFORMAÇÕES PARA A SEQ ID NO: 51 G2V TIPO DE SEQUÊNCIA: aminoácidos e nucleótidos COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIA: 101 aminoácidos, 303 nucleótidos NÚMERO DE CADEIAS: simples CONFIGURAÇÃO: linear TIPO DE MOLÉCULA: proteína
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INFORMAÇÕES PARA A SEQ ID NO: 71 G1V TIPO DE SEQUÊNCIA: aminoácidos e nucleótidos COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIA: 14 aminoácidos, 42 nucleótidos NÚMERO DE CADEIAS: simples CONFIGURAÇÃO: linear TIPO DE MOLÉCULA: péptido %m : m xm l&f
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INFORMAÇÕES PARA A SEQ ID NO: 74 BB TIPO DE SEQUÊNCIA: aminoácidos e nucleótidos COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIA: 219 aminoácidos, 657 nucleótidos NÚMERO DE CADEIAS: simples CONFIGURAÇÃO: linear TIPO DE MOLÉCULA: proteína
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INFORMAÇÕES PARA A SEQ ID NO: 75 δΒΒ = fragmento de BB TIPO DE SEQUÊNCIA: aminoácidos e nucleótidos COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIA: 108 aminoácidos, 324 nucleótidos NÚMERO DE CADEIAS: simples CONFIGURAÇÃO: linear TIPO DE MOLÉCULA: proteína 1111 iiiii && * H -1¾¾ iyr Q.y V&l Ser Aíp lyr Hia 1¾¾ Am teu 11« Mn Asn AÍ* 1¾¾ 17
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Claims (17)

  1. REIVINDICAÇÕES 1. Proteína isolada caracterizada pela referida proteína ser a proteína OmpA da membrana externa da bactéria Klebsiella pneumoniae de sequência SEQ ID N.° 13.
  2. 2. Proteína de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por ser obtida por via recombinante.
  3. 3. Proteína de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por ser obtida por purificação a partir de uma cultura de Klebsiella pneumoniae.
  4. 4. Proteína de acordo com uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pela referida proteína ser uma proteína de transporte.
  5. 5. Conjugado caracterizado por compreender uma proteína de acordo com uma das reivindicações 1 a 4 e um péptido imunogénico, em que o referido péptido imunogénico é caracterizado por compreender a sequência peptídica compreendida entre os resíduos de aminoácidos 174 e 187 e por ser transportado pela sequência peptídica SEQ ID N.° 1, N.° 2 ou N.° 51 compreendida entre os resíduos de aminoácidos 130 e 230 da sequência da proteína G do vírus respiratório sincicial humano do subgrupo A e B, ou do vírus respiratório sincicial bovino, péptido imunogénico este em que o aminoácido Cys na posição 173 e/ou 186 da referida proteína G pode ser uma serina.
  6. 6. Conjugado de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por ser obtido por acoplamento químico. 1
  7. 7. Conjugado de acordo com a reivindicação 5 ou 6, caracterizado por ser solúvel.
  8. 8. Conjugado de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo conjugado ser obtido pelo processo que compreende as seguintes etapas: a) precipitação dos lipopolissacáridos de membranas de bactérias do género Klebsiella, em presença de um sal de um catião divalente e de detergentes, para recuperar as proteínas membranares totais no sobrenadante; b) sujeição das proteínas a uma cromatografia de permuta aniónica para separar a fracção que contém a proteína adjuvante de imunidade; c) concentração da fracção que contém a proteína adjuvante de imunidade; d) conjugação da proteína adjuvante de imunidade com um polipéptido imunogénico para formar um conjugado solúvel, em que o referido péptido imunogénico é caracterizado por compreender a sequência peptídica compreendida entre os resíduos de aminoácidos 174 e 187 e por ser transportado pela sequência peptídica SEQ ID N.° 1, N.° 2 ou N.° 51 compreendida entre os resíduos de aminoácidos 130 e 230 da sequência da proteína G do vírus respiratório sincicial humano do subgrupo A e B, ou do vírus respiratório sincicial bovino, péptido imunogénico este em que o aminoácido Cys na posição 173 e/ou 186 da referida proteína G pode ser uma serina. 2
  9. 9. Conjugado de acordo com uma das reivindicações 5 a 8, caracterizado pelo referido péptido imunogénico ser conjugado com a proteina de transporte por meio da proteina BB de ligação à albumina sérica humana.
  10. 10. Conjugado de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pela proteina BB compreender a proteina de sequência SEQ ID N.° 74 ou de sequência SEQ ID N.° 73.
  11. 11. Conjugado de acordo com a reivindicação 9 ou 10, caracterizado por ser obtido por recombinação genética.
  12. 12. Ácido nucleico isolado caracterizado pela sua sequência codificar a proteina de sequência SEQ ID N.° 13.
  13. 13. Composição vacinai caracterizada por compreender um conjugado de acordo com uma das reivindicações 5 a 11.
  14. 14. Composição de acordo com a reivindicação 13, que pode ser administrada por via injectável ou por via subcutânea.
  15. 15. Composição de acordo com a reivindicação 13 ou 14, compreendendo adicionalmente excipientes farmaceuticamente aceitáveis.
  16. 16. Utilização de uma proteina de acordo com a reivindicação 1, para a preparação de uma composição destinada à prevenção ou ao tratamento de condições causadas pelo virus respiratório sincicial (VRS).
  17. 17. Anticorpos dirigidos contra a proteina de sequência SEQ ID N.0 13. 3 19-09-2006 4
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