ES2268691T3 - Fragmento peptidico de la proteina g del virus respiratorio sincitial, agente inmunogeno, composicion farmaceutica que lo contiene y procedimiento de preparacion. - Google Patents
Fragmento peptidico de la proteina g del virus respiratorio sincitial, agente inmunogeno, composicion farmaceutica que lo contiene y procedimiento de preparacion. Download PDFInfo
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Abstract
LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A UN POLIPEPTIDO UTILIZABLE COMO ELEMENTO DE INMUNOGENO, CARACTERIZADO PORQUE ES LLEVADO POR LA SECUENCIA PEPTIDICA COMPRENDIDA ENTRE LOS RESIDUOS DE AMINOACIDOS 130 Y 230 DE LA SECUENCIA DE LA PROTEINA G DEL VIRUS SINCITAL HUMANO DEL SUBGRUPO A Y DEL SUBGRUPO B, O DEL VIRUS RESPIRATORIO SINCITAL BOVINO, O POR UNA SECUENCIA QUE PRESENTA AL MENOS 80% DE HOMOLOGIA CON DICHA SECUENCIA PEPTIDICA. LA INVENCION SE REFIERE TAMBIEN A UN AGENTE INMUNOGENO O UNA COMPOSICION FARMACEUTICA QUE CONTIENE EL POLIPEPTIDO Y SU PROCEDIMIENTO DE PREPARACION.
Description
Fragmento peptídico de la proteína G del virus
respiratorio sincitial, agente inmunógeno, composición farmacéutica
que lo contiene y procedimiento de preparación.
La presente invención se refiere al virus
respiratorio sincitial (VRS), a una proteína OmpA adyuvante de la
inmunidad extraída de Klebsiella pneumoniae, a composiciones
que contienen polipéptidos inmunógenos que proceden de asociados con
tal proteína adyuvante, así como a su procedimiento de
preparación.
El virus respiratorio sincitial (VRS) es la
causa más frecuente de enfermedades respiratorias en el neonato:
bronconeumopatía (bronquiolitis). La OMS estima cada año 50 millones
de casos que padecen del VRS, de los cuales 160.000 fallecen en todo
el mundo. Existen dos subgrupos de virus (subgrupos A y B).
El VRS se clasifica en la familia de los
Paramyxoviridae, un tipo de neumovirus que comprende un
genoma ARN no segmentado, de polaridad negativa, que codifica 10
proteínas específicas.
En la actualidad, no existe todavía ninguna
vacuna disponible contra el VRS. Las vacunas de virus desactivados
se mostraron ineficaces e, incluso, han agravado las infecciones de
lactantes. En los años 60, fracasaron los ensayos de vacunación con
el VRS desactivado con formalina: en lugar de conferir protección
durante la reinfección debido al VRS, la vacuna tuvo por efecto
agravar la enfermedad en el niño.
La solicitud WO 87/04185 propuso usar proteínas
estructurales del VRS como vacuna, tal como las proteínas de
cubierta denominadas proteínas F (proteína de fusión) o proteína G,
una glicoproteína de 22 Kd, una proteína de 9,5 Kd, o la proteína
mayor de cápsida (proteína N).
La solicitud WO 89/02935 describe las
propiedades de protección de la proteína F entera del VRS,
eventualmente modificada en forma monomérica o desacetilada.
Se clonó una serie de fragmentos de la proteína
F con vistas a buscar sus propiedades neutralizantes.
Se puede citar el documento de Norrby et
al. (Proc.Natl. Acad. Sci. USA, 1987 84 (18),
6572-76) que describe ciertos fragmentos de la
proteína G del VRS (péptidos 12 y 15 de este documento) como región
más inmunógena de la proteína G.
Se puede igualmente citar el documento de
Lawrence et al. (J. of General Microbiology, 1991, 137 (8),
1911-21) que se refiere a la clasificación de las
enterobacterias que describe la secuencia nucleica parcial de 18
locus que corresponden a la secuencia que codifica la proteína de
membrana externa (OmpA) de 18 enterobacterias incluyendo
Klebsiella pneumoniae.
Sin embargo, las vacunas inmunitarias ensayadas
hoy en día se muestran ineficaces o inducen una patología pulmonar
(bronquiolitis o peribronquitis).
En la actualidad no existe tratamiento de fondo
de las infecciones debidas al VRS.
Infecciones debidas al VRS de las vías
respiratorias superiores: el tratamiento se basa esencialmente en
medicaciones sintomáticas idénticas a las de otras infecciones
víricas.
Infecciones debidas al VRS de las vías
respiratorias inferiores: el tratamiento en el lactante se basa en
el mantenimiento de una hidratación correcta, la aspiración de las
secreciones y la administración de oxígeno si es necesario. Se
observó un efecto positivo con la ribavirina, que es un nucleótido
activo in vitro contra el VRS.
La presente invención describe un polipéptido
útil especialmente en la producción de inmunógeno, portado por la
secuencia peptídica comprendida entre los restos de aminoácidos 130
y 230 de la secuencia de la proteína G del virus respiratorio
sincitial, o por una secuencia que presenta al menos 80% de
homología con dicha secuencia peptídica. Esta secuencia difiere
ligeramente para los subgrupos A y B del VRS humano, o para el VRS
bovino. La invención comprende las secuencias que proceden de los
VRS humano, subgrupo A y B, o bovino.
La proteína G es una glicoproteína de cubierta
del VRS, de peso molecular comprendido entre 84 y 90 Kd, pobre en
metionina.
Se demostró que la secuencia comprendida entre
los aminoácidos 130 y 230 de la proteína G natural es
particularmente apropiada para inducir una protección eficaz contra
la infección mediante el VRS. La invención comprende las secuencias
que proceden de los VRS humano, subgrupo A o B, o bovino.
La presente invención describe particularmente
polipéptidos, útiles especialmente como elemento inmunógeno
comprendido en el anterior, y que comprende la secuencia peptídica
comprendida entre los restos de aminoácidos numerados 74 y 187 de la
proteína G del VRS (humano, subgrupos A y B, o bovino) o una
secuencia que presenta al menos 80% de homología con la secuencia
correspondiente.
Otras secuencias peptídicas adaptadas a la
preparación de un inmunógeno comprendidas en dicha secuencia de la
proteína G del VRS están constituidas por la secuencia comprendida
entre los restos de aminoácidos numerados 171 y 187 de la proteína G
del VRS humano o bovino, o una secuencia que presenta al menos 80%
de homología con la secuencia correspondiente. Otros péptidos de
interés son portados por la secuencia comprendida entre los
nucleótidos numerados 158 y 190 de la proteína G del VRS, o una
secuencia que presenta al menos 80% de homología con la secuencia
correspondiente.
La invención describe asimismo péptidos útiles
para la preparación de un inmunógeno, que presentan una secuencia
que corresponde a la secuencia comprendida entre los restos de
aminoácidos numerados 140 y 200 de la proteína G del VRS humano o
bovino, o una secuencia que presenta al menos 80% de homología con
la secuencia correspondiente. Son particularmente ventajosas las
secuencias que empiezan con el aminoácido 140 de dicha proteína G
del VRS y cuyo extremo C-terminal corresponde
respectivamente al aminoácido 198, 196, 194, 192 ó 190, así como
secuencias que presentan al menos 80% de homología con las
secuencias portadas por estos fragmen-
tos.
tos.
Entre las variantes de las secuencias
anteriores, se pueden mencionar los polipéptidos que comprenden una
secuencia en la que:
- a)
- el aminoácido Cys en posiciones 173 y/o 186 se sustituyó por un aminoácido que no forma puente de disulfuro, en particular la serina, y/o
- b)
- los aminoácidos en posiciones 176 y 182 son susceptibles de formar un puente covalente distinto de un puente de disulfuro, especialmente el ácido aspártico y la ornitina.
Así, la secuencia polipeptídica
130-230 del VRS subgrupo A se puede usar
completamente, en su forma nativa. Esta secuencia corresponde a la
secuencia Sec id nº 1 escrita (o G2A).
Además, se puede usar la secuencia polipeptídica
completa 130-230 del VRS subgrupo B, en su forma
nativa. Esta secuencia corresponde a la secuencia Sec id nº 2
escrita (G2B).
La secuencia id nº 1 se denominara G2A a
continuación en la solicitud.
La secuencia id nº 2 se denominara G2B a
continuación en la solicitud.
Son igualmente apropiadas secuencias que
presentan al menos 80% de homología con G2A o G2B.
La secuencia comprendida entre los aminoácidos
130 y 230 se puede modificar mediante la sustitución de los restos
de cisteína en posiciones 173 y 186 por restos de serina para
obtener un péptido que conserva buenas propiedades inmunógenas,
gracias al mantenimiento del bucle formado por los restos de Cys en
posiciones 176 y 182. Las secuencias de aminoácidos y de nucleótidos
de este polipéptido para el subgrupo A se representan en la seq id
nº 3 (G2A\deltaCys).
Para el subgrupo B, las secuencias de
aminoácidos y de nucleótidos se representan en la seq id nº 4
(G2B\deltaCys).
Las secuencias peptídicas se denominan
G2A\deltaCys y G2B\deltaCys.
Se describe asimismo en la presente solicitud un
polipéptido útil para la preparación de un inmunógeno, que consiste
en la secuencia peptídica comprendida entre los restos de
aminoácidos numerados 174 y 187 de la proteína G del VRS, o una
secuencia que presenta al menos 80% de homología con dicha secuencia
peptídica.
En esta última secuencia, el péptido
174-187 del subgrupo A puede presentar la
secuencia:
\vskip1.000000\baselineskip
Sec id nº 5:
- Ser Ile Cys Ser Asn Asn Pro Thr Cys Trp Ala Ile Cys Lys.
El péptido 174-187 del subgrupo
B puede presentar la secuencia:
Sec id nº 6:
- Ser-Ile-Cys-Gly-Asn-Asn-Gln-Leu-Cys-Lys-Ser-Ile-Cys-Lys.
\vskip1.000000\baselineskip
El resto de Cys en posición 186 se puede
igualmente sustituir por un resto de serina, a fin de obtener la
siguiente secuencia:
\vskip1.000000\baselineskip
Sec id nº 7 para el subgrupo A:
- Ser Ile Cys Ser Asn Asn Pro Thr Cys Trp Ala Ile Ser Lys.
Sec id nº 8 para el subgrupo B:
- Ser-Ile-Cys-Gly-Asn-Asn-Gln-Leu-Cys-Lys-Ser-Ile-Ser-Lys.
\vskip1.000000\baselineskip
En la secuencia comprendida entre los restos 174
y 187 del péptido inmunógeno, los restos de aminoácidos en
posiciones 176 y 182 se pueden sustituir, respectivamente, por un
ácido aspártico y una ornitina, a fin de obtener una de las
siguientes secuencias:
\vskip1.000000\baselineskip
Sec id nº 9 para el subgrupo A:
- Ser Ile Asp Ser Asn Asn Pro Thr Orn Trp Ala Ile Cys Lys.
Sec id nº 10 para el subgrupo B
- Ser-Ile-Asp-Gly-Asn-Asn-Gln-Leu-Orn-Lys-Ser-Ile-Cys-Lys.
Sec id nº 11 para el subgrupo A:
- Ser Ile Asp Ser Asn Asn Pro Thr Orn Trp Ala Ile Ser Lys.
Sec id nº 12 para el subgrupo B:
- Ser-Ile-Asp-Gly-Asn-Asn-Gln-Leu-Orn-Lys-Ser-Ile-Ser-Lys.
\vskip1.000000\baselineskip
El mantenimiento de las propiedades inmunógenas
se obtiene gracias a la sustitución del puente de disulfuro (entre
las Cys naturales) por un puente de amida entre las posiciones 176 y
182.
Otras secuencias de polipéptido inmunógeno
figuran en adjunto de la presente solicitud bajo las denominaciones
de SEC ID nº 14 hasta SEC ID nº 73.
La invención describe asimismo un polipéptido
que se puede utilizar como agente inmunógeno que presenta una de las
secuencias anteriores, y que comprende además al menos un resto de
cisteína en posición N-terminal o
C-terminal.
La invención describe asimismo un polipéptido
que consiste en la secuencia peptídica comprendida entre los restos
de aminoácidos numerados 130 y 230 de la secuencia de la proteína G
del VRS, subgrupo A y subgrupo B, o en una secuencia que presenta
80% de homología con dicha secuencia peptídica, y que está en forma
de una proteína de fusión con el receptor de la seroalbúmina humana,
denominada BBG2A\deltaC o BBG2B\deltaC, u otra proteína de
unión. La secuencia de la proteína BB completa figura en el anexo
(Seq ID nº 74).
Se pueden igualmente citar las variantes, por
ejemplo glicosiladas o sulfatadas, de los distintos péptidos, ya sea
que estas funciones sean naturales o no.
Los polipéptidos se pueden preparar por síntesis
peptídica o mediante las técnicas de ADN recombinante, conocidas por
el experto en la técnica.
En particular, las secuencias génicas que
codifican el epítopo de aproximadamente 100 aminoácidos se pueden
preparar por ensamblaje de genes en fase sólida, y la proteína
correspondiente se puede expresar, por ejemplo, en E. coli
por vía intracelular.
Se pueden igualmente citar las secuencias
nucleotídicas (ARN o ADN) que codifican las proteínas o los
polipéptidos definidos aquí arriba.
La presente invención tiene por objeto una
proteína aislada caracterizada porque es la proteína OmpA de la
membrana externa de Klebsiella pneumoniae de secuencia SEC ID
nº 13.
Otro objeto de la invención es un conjugado
inmunógeno que comprende un polipéptido tal como se define
anteriormente acoplado a una proteína portadora, en particular a una
proteína adyuvante inmunitaria.
Preferentemente, el polipéptido según la
invención está acoplado a una proteína portadora de tipo OmpA de la
membrana externa de la bacteria del género Klebsiella.
Se ha podido demostrar que aunque las variantes
de la secuencia 174-187 de la proteína G del VRS son
débilmente inmunógenas, su acoplamiento con tal proteína induce una
respuesta inmunitaria específica.
La intensidad de la respuesta inmunitaria se
comparó con la respuesta obtenida con adyuvantes clásicos, tal como
el acoplamiento al portador KLH (Hemocianina de Lapa Californiana)
coadministrado con el adyuvante de Freund, o el acoplamiento a la
proteína portadora TT (toxoide tetánico).
Se obtienen resultados particularmente
ventajosos para composiciones que contienen un polipéptido
inmunógeno de VRS tal como se describe anteriormente, acoplado a la
proteína p40 de Klebsiella pneumoniae de secuencia peptídica
Sec id nº 13.
La secuencia nucleotídica (ADN o ARN) que
codifica la proteína de secuencia id nº 13 está comprendida en la
invención.
El polipéptido inmunógeno se puede acoplar a la
proteína adyuvante de inmunidad mediante métodos conocidos por el
experto en la técnica, tales como:
- -
- Glutaraldehído.
- -
- Carbodiimida (por ej.: EDC: 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida).
- -
- Ésteres de bisimido (por ej.: adipimidato de dimetilo).
- -
- Ésteres de N-hidroxisuccinimidilo (por ej.: suberato de disuccinimidilo).
- -
- Para los péptidos que comprenden una cisteína suplementaria en posición N terminal o C terminal:
- \bullet Ésteres de maleimido-N-hidroxisuccinimida (por ej.: MBS: éster de maleimido benzoil-N-hidroxi-suc-{}\hskip0.3cm cinimida).
- \bullet Bromoacetato de N-succinimidilo.
El polipéptido se puede conjugar a la proteína
portadora mediante una proteína enlazante, por ejemplo el receptor
de la seroalbúmina humana (BB).
Según otro aspecto, la invención tiene
igualmente por objeto un procedimiento de preparación de un péptido
conjugado que entra en una composición útil para la prevención o el
tratamiento de las afecciones con el VRS, caracterizado porque:
- a)
- se precipitan los lipopolisacáridos de membranas de bacterias del género Klebsiella, en presencia de una sal de un catión divalente y de detergentes, para recuperar las proteínas membránicas totales en el sobrenadante,
- b)
- las proteínas se someten a una cromatografía por intercambio de aniones para separar la fracción que contiene la proteína adyuvante de inmunidad,
- c)
- se concentra la fracción que contiene la proteína adyuvante de inmunidad,
- d)
- se conjuga la proteína adyuvante de inmunidad con un polipéptido inmunógeno, tal como se define aquí arriba, para formar un conjugado soluble, comprendiendo dicho polipéptido inmunógeno la secuencia aa 174-187 de la secuencia aa 130-230 de la proteína G del VRS humano de tipo A o B, o del VRS bovino, y en el que el polipéptido inmunógeno, el aminoácido Cys en posición 173 y/o 186 puede ser una serina.
La sal de catión divalente usada en la etapa a)
es, preferentemente, una sal de calcio o de magnesio. Después de la
centrifugación, las proteínas del sobrenadante se pueden recuperar
con un buen rendimiento mediante dos precipitaciones con etanol.
Las proteínas membránicas, tras la resuspensión,
se separan en una columna de intercambio de aniones, que se puede
utilizar en condiciones industriales. Este soporte cromatográfico es
muy estable y compatible con los tratamientos de despirogenación
drásticos, lo que no era el caso de los soportes cromatográficos ya
descritos. Por otra parte, la elución de la proteína se puede
realizar en condiciones isocráticas y no mediante aplicación de un
gradiente de NaCl (como se describe anteriormente), lo que es
particularmente ventajoso en condiciones industriales.
Según una forma de realización preferida,
después de la etapa c), se procede a una segunda etapa de
cromatografía, en intercambiador de cationes, y se recuperan y se
concentran las fracciones que contienen la proteína adyuvante. Esta
etapa suplementaria permite una mejor eliminación de los
lipopolisacáridos. Después, la proteína adyuvante se conjuga con un
polipéptido inmunógeno según la invención.
Según otro aspecto, la invención describe una
composición útil para la prevención y/o el tratamiento de las
afecciones provocadas por el VRS, caracterizada porque contiene un
polipéptido caracterizado aquí anteriormente.
Más particularmente, las composiciones contienen
además excipientes farmacéuticamente aceptables adaptados para la
administración por vía inyectable.
En efecto, se demostró que la inyección de tales
composiciones conlleva a una protección, no mediante un efecto
neutralizante, sino mediante una respuesta inmunitaria sistémica del
organismo.
Las respuestas humorales y celulares (IgM, IgG,
IgA y células T) están provocadas mediante el producto que induce
igualmente una protección a largo plazo y una memoria inmunológica
contra los VRS, subgrupos a y b.
En vista a la administración de las
composiciones vacunales por vías subcutáneas, es deseable disponer
de un conjugado soluble, lo que resulta difícil mediante los métodos
convencionales.
La invención describe asimismo un procedimiento
de preparación de un conjugado entre un péptido inmunógeno y una
proteína de membrana de Klebsiella, en particular la proteína
p40 de K. pneumoniae, en el que el acoplamiento se efectúa en
presencia de glutaraldehído con concentraciones menores o iguales
que 0,05%.
Este procedimiento de acoplamiento disminuye
considerablemente las concentraciones de glutaraldehído en
comparación con las concentraciones usadas habitualmente (2 veces
0,01% en lugar de 1% aproximadamente); el glutaraldehído se añade en
2 veces en un periodo de cinco días, mientras que los protocolos
descritos mencionan tiempos de 24 horas.
Estas modificaciones han permitido obtener un
conjugado soluble, en forma adaptada para la administración
subcutánea.
Los protocolos usuales (concentraciones de
glutaraldehído más elevadas, y tiempos cortos) se traducen por la
formación de un gel denso (muy probablemente debido a reacciones de
conjugación p40-p40), forma impropia para la
administración y la manipulación en general.
El péptido conjugado se puede congelar y usar
tal cual, o liofilizado.
Los ejemplos se proporcionan a continuación a
título ilustrativo de la invención sin limitarla de ningún modo.
En estos ejemplos se referirá a las siguientes
figuras:
\vskip1.000000\baselineskip
- Figura 1: intensidad de la respuesta
inmunitaria inducida contra G1A en distintas formas,
- Figura 2: cinética de la respuesta inmunitaria
inducida contra G1A presentada en distintas formas,
- Figura 3: cinética de la respuesta inmunitaria
inducida contra el portador solo,
- Figura 4: estrategia de clonación mediante
amplificación génica de p40.
\vskip1.000000\baselineskip
El polipéptido de secuencia
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
denominado G_{1}A, se prepara
mediante síntesis en fase sólida usando la química de
Boc.
\newpage
El ensamblaje del péptido se efectúa mediante
síntesis peptídica en fase sólida sobre poliestireno (divinilbenceno
al 1%), comenzando con un agente enlazante
Boc-Lys(2-cl-Z)-fenilacetamidometilo.
Se usó la estrategia química de
Boc-bencilo con el procedimiento de
desprotección-acoplamiento siguiente:
| 1. 55% de TFA en DCM | (1 x 5 min.) |
| 2. 55% de TFA en DCM | (1 x 25 min.) |
| 3. DCM | (2 x 1 min.) |
| 4. Alcohol isopropílico | (1 x 1min.) |
| 5. DMF | (2 x 1 min.) |
| 6. 10% de DIEA en DMF | (2 x 2 min.) |
| 7. Acoplamiento | |
| 8. DMF | (2 x 1 min.) |
| 9. DCM | (2 x 1 min.) |
En cada etapa, se usan 20 ml de disolvente por
gramo de resina peptídica.
El acoplamiento se efectúa en DMF con un éster
de hidroxibenzotriazol preformado durante 30 min. Se verifica en
cada etapa del acoplamiento si están presentes las funciones de
amina libre residuales mediante el ensayo con ninhidrina. Si es
necesario, se efectúa un doble acoplamiento.
Para la síntesis del péptido G_{1}A se usaron
los grupos de protección de la cadena lateral siguientes:
- -
- 2-clorobenciloxicarbonilo para la lisina,
- -
- Bencilo para serina y treonina,
- -
- 4-Metilbencilo para cisteína,
- -
- Formilo para triptófano.
Antes de la etapa final de
desprotección/ruptura, el grupo formilo se elimina mediante un
tratamiento de 30 min. con una disolución de piperidina al 25% en
DMF. La resina peptídica se lava con DCM y éter, y se seca a presión
reducida.
El péptido se separa de la resina y se
desprotege completamente mediante un tratamiento con fluoruro de
hidrógeno líquido. Se usan clásicamente 10 ml de fluoruro de
hidrógeno por gramo de resina peptídico a 0ºC durante 45 min., en
presencia de p-cresol y etanoditiol como trampa.
Después de la evaporación del fluoruro de hidrógeno, la mezcla de
reacción en bruto se lava con éter, se disuelve en TFA, se precipita
con éter y se seca.
Condiciones generales de purificación mediante
HPLC:
- Fase estacionaria:
- sílice C_{18}, 15-25 \mum, 100 \ring{A}
- Fase móvil:
- disolvente A: agua 0,1% de TFA
- \quad
- disolvente B: acetonitrilo/A, 60/40% (v/v)
- Gradiente lineal:
- 20 a 50% de B en 30 min. (primera etapa de purificación)
- \quad
- 15 a 40% de B en 30 min. (segunda etapa de purificación)
- Caudal:
- 40 ml/min.
- Detección:
- UV (210 nm)
El péptido bruto obtenido después de la
separación se purifica en condiciones descritas aquí arriba
(gradiente de 20 a 50% de B). Las fracciones que tienen una pureza
mayor que 70-80% (HPLC) se reúnen y se liofilizan.
Después, el péptido se purifica en una mezcla de acetonitrilo, agua
y DMSO (1 mg/ml), y se agita hasta que la ciclación esté completa (4
a 6 días). La evolución de la reacción se monitoriza mediante HPLC.
Finalmente, la mezcla de reacción se concentra en la columna de HPLC
preparativa, y se aplica durante 30 min. un gradiente de 15 a 40% de
B a fin de purificar el péptido.
Generalmente, después de la liofilización, se
efectúa una segunda purificación en las mismas condiciones, para
alcanzar el grado de pureza requerido.
La pureza y la identidad del producto final se
controlan mediante HPLC analítica, análisis de los aminoácidos y
análisis de masas con FAB.
En el péptido así obtenido, el resto de serina
en posición trece sustituye el resto de Cys del péptido natural,
evitando así una heterogeneidad en la formación de los puentes de
disulfuro, que pueden perjudicar a la inmunogenecidad.
En un microtubo de Eppendorf, se enjuagan 300
\mug de perlas con un tampón de lavado/unión (1 M de NaCl, 10 mM
de Tris-HCl, pH 7,5, 1 mM de EDTA) antes de añadir
0,2 pmoles del oligonucleótido biotinilado, durante 15 minutos de
incubación a temperatura ambiente para la unión. Se enjuagan y se
sedimentan las perlas con el oligonucleótido inmovilizado. Se añaden
0,2 pmoles del oligonucleótido fosforilado en 5' siguiente en 60
\mul de tampón de hibridación/ligación (50 mM de
Tris-HCl, pH 7,6, 10 mM de MgCl_{2}, 1 mM de ATP,
1 mM de 1,4-ditiotreitol [DTT], 5% de
polietilenglicol [PEG] 8000). La mezcla de hibridación se incuba a
70ºC durante 5 minutos, y se deja volver a 37ºC antes de añadir 3
unidades de T4 ADN ligasa (BRL), seguido de 15 minutos de incubación
a 37ºC. La mezcla de reacción se enjuaga antes de añadir 0,2 pmoles
del oligonucleótido siguiente. El procedimiento de
hibridación/ligación se repite tantas veces como se añada un nuevo
oligonucleótido complementario fosforilado en 5'. Al final, el
dúplex de ADN inmovilizado sobre las perlas magnéticas se puede
separar del soporte cortando con las enzimas de restricción
apropiadas.
Se prepara el ADN que corresponde a la secuencia
G2A\deltaCys y a la secuencia G2A\deltaCys unida a la proteína
de unión a la seroalbúmina humana (BB) denominada
BB-G2A\deltaCys.
La secuencia nucleotídica se expresa en E.
coli para recuperar las proteínas correspondientes.
pVABBG2A\deltaC es un vector de expresión de
tipo intracelular, contiene un promotor de origen E. coli, la
operación triptofano (Trp) seguido del gen que codifica el receptor
de la seroalbúmina humana BB (P-\ring{A} Nygrén
et al., J. Mol. Recognit., 1988, 1, 60), y finalmente
el gen que codifica G2A\deltaC del VRS. La expresión del gen
heterólogo se puede inducir en presencia de IAA (ácido
3-\beta-indolacrílico). El
producto de fusión BBG2A\deltaC se puede purificar por afinidad
sobre columna de HSA-sefarosa, tras haber liberado
las proteínas citoplásmicas de E. coli.
La cepa de E. coli RV308 (Maurer et
al., J. Mol. Biol., 1980, 139, 147), transfectada por el
plásmido
pVABBG2A\deltaC, se seleccionó sobre agar que contiene ampicilina (100 \mug/ml) y tetraciclina (8 \mug/ml). Se inocula la cepa en un Erlenmeyer que contiene 100 ml de medio de cultivo TSB (Tryptic Soy broth (caldo de soja tríptico), Difco) (30 g/l), suplementado con levadura (extracto de levadura, Difco) (5 g/l), ampicilina (100 \mug/ml), tetraciclina (8 \mug/ml), y triptófano (100 \mug/ml). Se incuba a 32ºC durante 12 horas con agitación (190 rpm). Se transfiere el cultivo en otro Erlenmeyer (5 litros) que contiene cuatro veces el volumen inicial (400 ml de TSB + levadura + los mismos antibióticos a la misma concentración). Cuando la densidad óptica del medio (a 550 nm) alcanza aproximadamente una D.O. de 1,5, se induce la producción de las proteínas añadiendo al medio IAA hasta una concentración final de 25 \mug/ml. Se detiene el cultivo tras 5 horas de incubación, con agitación (190 rpm) a 32ºC. Tras centrifugar, el pelete bacteriano se resuspende en un recipiente que contiene aproximadamente 60 ml de disolución de TST (50 mM de TrisHCl, pH 8,0, 200 mM de NaCl, 0,05% de Tween 20, 0,5 mM de EDTA) fría.
pVABBG2A\deltaC, se seleccionó sobre agar que contiene ampicilina (100 \mug/ml) y tetraciclina (8 \mug/ml). Se inocula la cepa en un Erlenmeyer que contiene 100 ml de medio de cultivo TSB (Tryptic Soy broth (caldo de soja tríptico), Difco) (30 g/l), suplementado con levadura (extracto de levadura, Difco) (5 g/l), ampicilina (100 \mug/ml), tetraciclina (8 \mug/ml), y triptófano (100 \mug/ml). Se incuba a 32ºC durante 12 horas con agitación (190 rpm). Se transfiere el cultivo en otro Erlenmeyer (5 litros) que contiene cuatro veces el volumen inicial (400 ml de TSB + levadura + los mismos antibióticos a la misma concentración). Cuando la densidad óptica del medio (a 550 nm) alcanza aproximadamente una D.O. de 1,5, se induce la producción de las proteínas añadiendo al medio IAA hasta una concentración final de 25 \mug/ml. Se detiene el cultivo tras 5 horas de incubación, con agitación (190 rpm) a 32ºC. Tras centrifugar, el pelete bacteriano se resuspende en un recipiente que contiene aproximadamente 60 ml de disolución de TST (50 mM de TrisHCl, pH 8,0, 200 mM de NaCl, 0,05% de Tween 20, 0,5 mM de EDTA) fría.
Se introduce en el recipiente una sonda estándar
de baño de ultrasonidos (VIBRA-CELL, Somics Mat,
USA). Se realiza el baño de ultrasonidos en la potencia 5 durante
dos minutos aproximadamente. Después de la centrifugación, el
sobrenadante de disolución se filtra a 0,45 \mum, y se transfiere
a una columna que contiene aproximadamente 3 ml de gel de
HSA-sefarosa (STAHL et al., J. Immunol.
Meth., 1989, 124, 43).
Las proteínas purificadas se analizan mediante
SDS-PAGE en el aparato de Phast System (PHARMACIA) o
en Mini Protean BIORAD. Los geles se revelan mediante azul de
Coomassie. La proteína BBG2A\deltaC, que representa más del 90% de
pureza, corresponde al tamaño esperado (39,3 kDa) con relación a los
patrones de pesos moleculares conocidos.
La inmunotransferencia de esta proteína a una
membrana Problott (ABI) permite que se identifique
anti-BB y/o antiproteína G del VRS (subgrupo A) con
anticuerpos específicos. El rendimiento de proteínas solubles
purificadas a partir del citoplasma de E. coli es de
aproximadamente 50 mg/litro de cultivo.
En un fermentador de 2 litros, se pueden obtener
de 500 hasta 800 mg de proteínas BBG2A\deltaC por litro de
cultivo, en condiciones optimas de cultivo.
El procedimiento de purificación de la proteína
p40 a partir de la biomasa de Klebsiella pneumoniae, cepa
I-145, se desarrolló con un objetivo principal:
desarrollar un procedimiento que permite la transposición a gran
escala y la extrapolación industrial. Este procedimiento exige
sucesivamente la preparación de una fracción enriquecida en
proteínas membránicas y la purificación de la proteína p40 mediante
cromatografía.
La biomasa de Klebsiella pneumoniae (cepa
I-145, 40 g de células secas) se ajusta hasta pH 2,5
con la ayuda de ácido acético puro.
Después de la adición de 1/2 volumen de una
disolución que contiene 6% de cetrimida, 60% de etanol, 1,5 M de
CaCl_{2} cuyo pH se ajusta hasta 2,5 con la ayuda del ácido
acético, la mezcla se agitó durante 16 horas a temperatura
ambiente.
Después de centrifugar durante 20 minutos a
15.000 g a 4ºC, las proteínas del sobrenadante se precipitan con
etanol. Se realizan dos precipitaciones sucesivas con una
centrifugación intermedia (10 minutos, 10.000 g, 4ºC): de 20 a 50%,
y después de 50 a 80%.
Los peletes obtenidos después de la segunda
precipitación se resuspenden en una disolución de zwittergent
3-14, 1%.
Después de agitar durante 4 horas a temperatura
ambiente, el pH se ajusta hasta 6,5 con la ayuda de NaOH 1N.
Una centrifugación de la mezcla durante 20
minutos a 10.000 g a 4ºC permite obtener una fracción enriquecida en
proteínas membránicas (fracción de MP).
Las proteínas de la fracción de MP se dializan
contra un tampón de Tris/HCl 20 mM pH 8,0; zwittergent
3-14, 0,1%. El dializado se coloca en una columna
que contiene un soporte de tipo intercambiador de aniones fuertes
(columna de diámetro = 50 mm x H = 250 mm, gel Biorad Macroprep High
Q), equilibrada en el tampón descrito aquí arriba. La proteína P40
se eluye mediante una concentración de 50 mM de NaCl en el tampón de
equilibrio.
Las fracciones que contienen P40 se reúnen y se
dializan contra un tampón de citrato 20 mM pH 3,0; zwittergent
3-14, 0,1%. El dializado se coloca en una columna
que contiene un soporte de tipo intercambiador de cationes fuertes
(dimensiones de la columna: diámetro = 25 mm x H = 160 mm, gel
Biorad Macroprep High S), equilibrada en el tampón de citrato 20 mM
pH 3,0, zwittergent 3-14, 0,1%. La proteína P40 se
eluye mediante una concentración de 0,7 M de NaCl. Las fracciones
que contienen P40 se reúnen y se concentran mediante ultrafiltración
con la ayuda de un sistema de filtración de flujo tangencial Minitan
Millipore usado con hojas de membrana que poseen un nivel de corte
de 10 kDa.
Las fracciones obtenidas después de cada etapa
cromatográfica se analizan mediante SDS-PAGE a fin
de reunir las que contienen la proteína p40.
Las cantidades de proteínas se miden mediante el
método de Lowry (tabla I). La pureza y la homogeneidad de la
proteína p40 se estiman mediante SDS-PAGE, en
presencia de patrones de pesos moleculares.
Después de la etapa de cromatografía de
intercambio de cationes, la proteína p40 está desprovista del
contaminante principal presente en la fracción de MP (presentando la
proteína un peso molecular aparente de 18 kDa), y presenta un grado
de pureza mayor que 95%.
El perfil electroforético de p40 revela varias
bandas. Estas bandas se reconocen, después de la
inmunotransferencia, mediante anticuerpos monoclonales p40 obtenidos
del ratón. La banda principal superior corresponde a la proteína
desnaturalizada (mediante un tratamiento a 100ºC, durante 15 minutos
en presencia de SDS), y la banda secundaria inferior a la proteína
en su forma nativa.
\newpage
En efecto, P40 es una proteína denominada
"termomodificable", y se pudo verificar está propiedad con la
ayuda de una cinética de calentamiento a 100ºC en presencia de SDS.
Sin calentamiento, la proteína en su forma nativa presenta una
estructura de hélice \alpha que fija más SDS y migra por lo tanto
más lejos hacía el ánodo que la forma desnaturalizada
(desnaturalización completa después de 5 minutos a 100ºC), que
presenta una estructura de hojas \beta (K.B KELLER (1978) J.
Bacteriol. 134, 1181-1183).
La contaminación mediante los lipopolisacáridos
(LPS) se estima mediante verificación por cromatografía en fase
gaseosa del ácido \beta-hidroximirístico, ácido
graso marcador de los LPS de Klebsiella pneumoniae (tabla
1).
\vskip1.000000\baselineskip
| Proteínas | Rendimiento | LPS | |
| Biomasa | 40 g | - | n.d. |
| Fracción de MP | 900 mg | 2,25% | n.d. |
| Fracción enriquecida en P40 | 400 mg | 1% | 10% |
| Proteína P40 | 130 mg | 0,3% | < 1% |
\vskip1.000000\baselineskip
Este método se usa para aproximar el contenido
de LPS de las muestras que proceden de las distintas etapas de
purificación.
Siendo la cantidad de ácido
\beta-hidroximirístico presente en la fracción de
p40 después de la cromatografía de intercambio de cationes menor que
el nivel de cuantificación de la determinación, se puede estimar que
la cantidad de LPS residual es menor que 1%.
- \text{*}
- E. coli: RV 308: cepa ATCC 31608 (MAURER R., MEYER B.J., PTASCHNE M., J. MOL BIOL, 1980, 139, 147-161).
- \text{*}
- K. pneumoniae: IP 145: cepa C.I.B.P.F.
- \text{*}
- pRIT 28 (Hultman et al., 1988, 7: 629-638): vector de clonación y de secuenciación que posee el gen de resistencia a la ampicilina, los orígenes de replicación de E. coli y del fago F1, así como una porción del gen lac-z de E. coli (\beta-galactosidasa).
- \text{*}
- pVABB: vector de expresión de fusión de gen.
\vskip1.000000\baselineskip
* Amplificación génica:
| Tampón de lisis: | 25 mM de Taps, pH 9,3 |
| 2 mM de MgCl_{2} | |
| Tampón de amplificación: | 25 mM de Taps, pH 9,3 |
| 2 mM de MgCl_{2} | |
| 0,1% de tween 20 | |
| 200 mM de dNTP |
* Purificación de las proteínas:
| TST (20X): | Tris base | 0,5 M |
| HCl | 0,3 M | |
| NaCl | 4 M | |
| Tween 20 | 1% | |
| EDTA | 20 mM | |
| Tampón de lavado: | Tris HCl | 50 mM \hskip0.5cm pH 8,5 |
| MgCl_{2} | 5 mM | |
| Disolución de desnaturalización: | Gua-HCl | 7,8 M |
| Tris-HCl | 28 mM \hskip0.5cm pH 8,5 | |
| Disolución de renaturalización: | Gua-HCl | 0,5 M |
| Tris-HCl | 25 mM \hskip0.5cm pH 8,5 | |
| NaCl | 150 mM | |
| Tween 20 | 0,05%. |
\vskip1.000000\baselineskip
Los cebadores nucleotídicos se determinaron a
partir de la secuencia publicada de la OMPA de Klebsiella
pneumoniae (LAWRENCE, G.J., et al., Journal of General
Microbiology, 1991, 137, 1911-1921) de la secuencia
de consenso que procede del alineamiento de las secuencias de 5 OMPA
de enterobacterias (E. coli, S. tryphimurium, S. marcescens, S.
dysenteriae, E. aeroginosae), así como de las secuencias de
péptidos obtenidos mediante secuenciación manual.
Los oligonucleótidos se sintetizaron según el
método químico de fosforamidito en el aparato "Gene Assembler
Plus" de Pharmacia.
El ADN de la OMPA de Klebsiella
pneumoniae se amplificó de la siguiente manera.
Se lisó una colonia de Klebsiella
pneumoniae en 10 \mul de tampón de lisis mediante
calentamiento a 95ºC durante 5 minutos.
1 \mul de esta disolución sirve de fuente de
ADN para las reacciones de amplificación.
Éstas se realizan en 100 \mul de tampón de
amplificación (véase en anejo), con 5 pmoles de cada cebador y una
unidad de enzima Taq polimerasa (Perkin Elmer Cetus). Cada ciclo
comprende una etapa de desnaturalización de 30 segundos a 95ºC,
seguida de una hibridación del cebador al ADN y de una extensión de
un minuto a 72ºC. Se efectúan de esta manera 30 ciclos con la ayuda
de un termocilador "Gen Amp PCR" 9000 Perkin Elmer Cetus.
Los PCR a continuación se preparan a partir de
los fragmentos de ADN amplificados previamente.
Después, los fragmentos de ADN amplificados se
digieren, se purifican y se ligan al vector pRIT 28.
Los fragmentos así clonados se secuencian en un
secuenciador automático 373 DNA, secuenciador de Applied Biosystem.
Las reacciones de secuenciación se realizan con la ayuda del kit
"dye Terminator" según las recomendaciones del proveedor
(Applied Biosystem), en ADN bicatenario obtenido después de la
amplificación génica o a partir de maxiprep, o bien en ADN
monocatenario que procede de fragmentos de PCR desnaturalizados
(Hultman et al., Nucleic acids res.; 1989, 17:
4937-4946).
El gen entero de P40 se clona en el vector de
expresión pVABB. Este vector permite adjuntar una cola de afinidad
"BB" a P40; siendo B la parte de la proteína G del estreptococo
que se liga a seroalbúmina (Nygren P. A et al.; Journal mol.
Recognit. 1988; 1, 69-74).
Las cepas de E. coli RV308 transformadas
mediante el vector pVABBP40 se cultivaron una noche a 37ºC con
agitación, en 100 ml de TSB complementado con extracto de levadura,
ampicilina (200 \mug/ml), tetraciclina (8 \mug/ml) y triptófano
(100 \mug/ml). Al día siguiente, se prepara un cultivo con DO = 1
para una longitud de onda de 580 nm en TSB + extractos de levadura +
ampi + tetra.
Después de 10 minutos de cultivo, se induce la
expresión de la proteína mediante adición de IAA (25 \mug/ml) al
medio. El cultivo se centrifuga a 4ºC a 2.460 g durante 10
minutos.
El pelete se recoge mediante 20 ml de TST 1 x pH
7,4, y entonces la disolución se centrifuga a 4ºC a 23.000 g durante
30 minutos.
El sobrenadante se hace pasar sobre sefarosa, lo
que permite aislar las proteínas denominadas solubles. El pelete se
lava mediante un tampón de lavado, y después se centrifuga a 23.000
g a 4ºC durante 30 minutos. El pelete que contiene los cuerpos de
inclusión se recoge entonces mediante 900 \mul de una disolución
desnaturalizante + 100 \mul de ditiotreitol 10 mM, y se incuba
durante 2 horas a 37ºC.
Después, la disolución se incuba 1 noche a
temperatura ambiente, con agitación, en 100 ml de tampón de
renaturalización a 2.300 g durante 1 hora.
El sobrenadante se hace pasar sobre HSA
sefarosa.
En ambos casos, las proteínas inmovilizadas se
eluyen mediante 0,5 M de ácido acético pH 2,8 y se recogen en
fracciones de 1 ml.
Después, las fracciones recogidas se analizan
sobre gel de electroforesis en SDS-PAGE y mediante
inmunotransferencia.
La clonación del gen se efectuó en tres etapas
según la estrategia presentada en la figura 4.
En una primera etapa, se confirmó la parte
publicada de la secuencia con excepción de una T en lugar de una A
en posición 103.
Después, se determinó la secuencia en 3' del
gen, y finalmente la secuencia en 5'.
El gen entero se obtuvo mediante fusión de las
dos partes 8/4 y 3/14, y después se clonó en el vector pRIT 28. La
secuencia corresponde a SEC ID nº 13.
La proteína se expresa en forma de BBP40.
Se obtiene esencialmente a partir de los cuerpos
de inclusión. Para un cultivo de 200 ml, se purifican una quincena
de miligramos de proteína.
El perfil electroforético muestra que BBP40,
obtenido después de la desnaturalización, tiene una gran pureza. El
peso molecular aparente corresponde al peso teórico calculado, que
es de 63 kDa.
La caracterización mediante inmunotransferencia
muestra que la proteína purificada está efectivamente reconocida por
el suero de conejo anti-P40.
P40 (5 mg/ml, 40 mg) se dializa contra 300
volúmenes de tampón de fosfato de sodio 0,1 M pH 7; Zwittergent
3-14, 0,1%.
El dializado se ajusta hasta una concentración
de 2 mg/ml con la ayuda de un tampón de carbonato 0,1 M pH 9;
Zwittergent 3-14, 0,1%. Se añade dodecilsulfato de
sodio (SDS) para alcanzar una concentración final de 4%.
Se añade el péptido G_{1} (10 mg/10 ml de
tampón de carbonato 0,1 M pH 9; zwittergent 3-14,
0,1%) a la disolución de p40. Se comprueba el valor del pH
(comprendido entre pH 9 y pH 10).
Se añaden 220 \mul de glutaraldehído (2,5% en
agua), se agita durante 24 horas a 4ºC.
Se añaden 5 ml de tampón de carbonato 0,1 M pH9;
zwittergent 3-14, 0,1%; se verifica el pH
(comprendido entre pH 9 y pH 10); se agita durante 72 horas a
4ºC.
Se añaden 220 \mul de glutaraldehído (2,5% en
agua), se verifica el pH, y se agita durante 24 horas a +4ºC.
La reacción se detiene mediante adición de 100
\mul de lisina 1M. La disolución se dializa durante 24 horas a
4ºC.
El SDS se elimina mediante doble precipitación
con KCl.
La disolución que contiene el conjugado de p40
se congela y se usa tal cual, o liofilizada.
Se inmunizaron ratones C57BL/6 (N=5) a D0, D10,
D20, por vía subcutánea con 10 \mug de G1, acoplado o no a un
portador, en presencia o no de un adyuvante. El suero se recoge y se
ensaya mediante ELISA. Las Ig anti-G1 o
anti-portador se aíslan en un soporte
BSA-G1 y un soporte "portador" (KLH o TT o
P40). Las Ig se revelan con la ayuda de un conjugado
anti-Ig de conejo peroxidasa. La densidad óptica se
lee a 450 nm, y el título de anticuerpos anti-G1 se
da mediante el recíproco de la última dilución dando dos veces el
ruido de fondo. Los resultados representan la media \pm desviación
estándar de los títulos de 5 ratones.
Los ratones se inmunizan mediante G1A en
distintas formas según un esquema de inmunización idéntico. Las
respuestas de anticuerpos inducidas mediante las distintas formas de
G1A se comparan 28 días después del comienzo del experimento.
El péptido sintético G1A administrado puro no
induce ninguna respuesta inmunitaria incluso si se coadministra con
el adyuvante de Freund. Presentado con el portador KLH, G1A induce
una respuesta débil que aumenta significativamente mediante la
coadministración del adyuvante de Freund (AF). Presentado con p40,
G1A induce una respuesta mayor que la obtenida en el esquema de
inmunización convencional de p40 KLH/G1+AF, frente a propiedades de
"portador autoadyuvante".
Los resultados se presentan en la figura 1.
Los ratones se inmunizan con G1A en distintas
formas según un esquema de inmunización idéntico. Las respuestas de
los anticuerpos inducidas mediante las distintas formas de G1A se
comparan en los tiempos: 7, 17, 28, 35, 42 días después del comienzo
del experimento.
La respuesta anti-G1A es
significativamente más alta y más rápida cuando los ratones se
inmunizan con p40/G1A que las inmunizaciones más convencionales
TT/G1A y KLH/G1A+AF. Una sola inyección de p40/G1A permite obtener,
en 7 días, un título de anticuerpos anti-G1A de
1000. Este título se obtiene con TT/G1A o KLH/G1A+AF en 28 días. La
respuesta máxima (título = 1/380.000), obtenida después de tres
inyecciones, en 28 días, es de aproximadamente 30 veces mayor que la
obtenida con KLH/G1A+AF, y 70 veces mayor que la obtenida con
TT/G1A. El título de anticuerpos anti-G1A se
mantiene sin cambios sin debilitamiento hasta el día 42.
Los resultados se presentan en la figura 2.
Los ratones se inmunizan con G1A acoplado a un
portador según un esquema de inmunización idéntico. Las respuestas
de anticuerpos inducidas por los distintos portadores se comparan en
los tiempos 7, 17, 28, 35, 42 días después del comienzo del
experimento.
La respuesta anti-p40 (título
próximo a 10.000) es mayor que la respuesta
anti-KLH, pero no significativamente distinta de la
respuesta anti-TT.
Los resultados se presentan en la figura 3.
El acoplamiento químico del péptido G1A a la
proteína p40 permitió inducir una respuesta anti-G1A
significativamente más importante y más rápida que la provocada por
los modelos de referencia KLH/G1A+AF o TT/G1A. El acoplamiento del
péptido G1B debería inducir respuestas similares.
Los ratones BALB/c se inmunizaron con las
distintas preparaciones siguientes:
- 1)
- péptido de síntesis G1A acoplado a KLH (Hemocianina de Lapa Californiana) = KLH.G1A.
- 2)
- péptido de síntesis G1A acoplado a la proteína portadora p40 = p40.G1A.
- 3)
- testigo p40 solo.
- 4)
- proteína recombinante producida en E. coli: BBG2A\deltaC acoplada a la proteína portadora p40 = p40.BBG2A\deltaC.
- 5)
- péptido de síntesis G1A acoplado a la proteína portadora de la toxina tetánica (TT) = TT.G1A.
- 6)
- testigo TT solo.
- 7)
- testigo BB solo.
- 8)
- testigo VRS largo (subgrupo A).
Los ratones recibieron 3 dosis intramusculares
(200 \mug/ratón) con hidróxido de aluminio como adyuvante (usado
corrientemente en el ser humano). Los resultados de los ensayos de
protección así como el perfil inmunológico de los sueros se
encuentran en la tabla 2.
Las preparaciones siguientes confieren una
protección completa tras la exposición con el VRS largo (cepa A):
p40.G1A, p40.BBG2A\deltaC, con relación a TT.G1A que confiere
también una muy buena protección comparable al péptido KLH.G1A. En
un ensayo de ELISA, todos reconocen el antígeno de VRS con un título
más elevado para p40.G1A=1/12.800.
En cuanto al ensayo de neutralización, ninguna
de las preparaciones posee actividad neutralizante in
vitro.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
Los ratones BALB/c se inmunizaron con las
distintas preparaciones siguientes:
- 1.
- péptido de síntesis G1A acoplado a KLH (Hemocianina de Lapa Californiana) = KLH-G1A
- 2.
- péptido de síntesis G1B acoplado a KLH (Hemocianina de Lapa Californiana) = KLH-G1B. El péptido G1B corresponde a la secuencia G (174-187)\deltaCys del subgrupo B cuya secuencia es:
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- 3.
- testigo KLH
- 4.
- testigo VRS largo (subgrupo A)
- 5.
- testigo VRS 8/60 (subgrupo B)
Los ratones recibieron 3 dosis intramusculares
(200 \mug/ratón) con el adyuvante de Freund. Los resultados de los
ensayos de protección así como del perfil inmunológico de los sueros
se encuentran en la tabla 3.
La preparación KLH-G1A permite
una protección completa frente al VRS subgrupo A, pero no frente al
VRS subgrupo B. Por el contrario, la preparación
KLH-G1B permite una protección completa frente al
VRS subgrupo B, pero no frente al VRS subgrupo A. El ensayo de ELISA
refleja la misma situación.
Evaluación del potencial de protección del
péptido G1v\DeltaC derivado de la proteína G de la cepa bovina del
virus respiratorio sincitial (VRS) Lerch et al. 1990, J.
Virol. 64:5559, acoplado a la proteína portadora KLH.
que presenta un puente de disulfuro
en posición
176-182.
El péptido preparado mediante síntesis en fase
sólida usando la química de Boc se acopla a KLH usando
glutaraldehído (Schaaper et al. Mol. Inmunol. (1989) 26:
81-85).
Se inmunizaron dos terneras por vía
intramuscular con 500 \mug de G1v\DeltaC-KLH con
el adyuvante incompleto de Freund 3 veces, a intervalos de 3
semanas. Una ternera se inmunizó con KLH sin péptido G1V\DeltaC;
con un adyuvante incompleto de Freund.
Los animales se expusieron con la cepa Snook,
durante 21 días tras la última inoculación, por vía intranasal e
intratraqueal, cada uno con 1 ml de virus que dan un título a
2x105/ml.
El virus titulado en células de riñón de ternera
según el método de las placas se determinó en lavados nasofaríngeos
respectivamente 3 y 2 días después de la exposición, y 7 días en los
pulmones de los animales sacrificados.
Ternera 3432 (KLH + FIA):
Ternera 3440 (péptido - KLH
+
FIA):
Terneras a las cuales se administraron 500
\mug de G1v\DeltaC - KLH en adyuvante incompleto de Freund, en
tres ocasiones a intervalos de 3 semanas.
(1) INFORMACIONES GENERALES:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: PIERRE FABRE MEDICAMENT
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- DIRECCIÓN: 17, AVENUE JEAN MOULIN
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: CASTRES
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: FRANCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: 81106
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: ELEMENTO INMUNOGÉNICO, AGENTE INMUNÓGENO, COMPOSICIÓN FARMACÉUTICA Y PROCEDIMIENTO DE PREPARACIÓN
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 75
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- FORMATO LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE SOPORTE: DISQUETE
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: FR 94 04009
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE SOLICITUD: 06 DE ABRIL DE 1994
\vskip1.000000\baselineskip
Información para la SEC ID nº 1: G2A
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| TIPO DE SECUENCIA: aminoácidos y nucleótidos | |
| LONGITUD DE LA SECUENCIA: 101 aminoácidos, 303 nucleótidos | |
| NÚMERO DE HEBRAS: simple | |
| CONFIGURACIÓN: lineal | |
| TIPO DE MOLÉCULA: proteína |
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\vskip1.000000\baselineskip
Información para la SEC ID nº 2: G2B
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| TIPO DE SECUENCIA: aminoácidos y nucleótidos | |
| LONGITUD DE LA SECUENCIA: 101 aminoácidos, 303 nucleótidos | |
| NÚMERO DE HEBRAS: simple | |
| CONFIGURACIÓN: lineal | |
| TIPO DE MOLÉCULA: proteína |
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\vskip1.000000\baselineskip
Información para la SEC ID nº 3:
G2A\deltaCys
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| TIPO DE SECUENCIA: aminoácidos y nucleótidos | |
| LONGITUD DE LA SECUENCIA: 101 aminoácidos, 303 nucleótidos | |
| NÚMERO DE HEBRAS: simple | |
| CONFIGURACIÓN: lineal | |
| TIPO DE MOLÉCULA: proteína |
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\vskip1.000000\baselineskip
Información para la SEC ID nº 4:
G2B\deltaCys
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| TIPO DE SECUENCIA: aminoácidos y nucleótidos | |
| LONGITUD DE LA SECUENCIA: 101 aminoácidos, 303 nucleótidos | |
| NÚMERO DE HEBRAS: simple | |
| CONFIGURACIÓN: lineal | |
| TIPO DE MOLÉCULA: proteína |
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Información para la SEC ID nº 5: G1ACys
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| TIPO DE SECUENCIA: aminoácidos y nucleótidos | |
| LONGITUD DE LA SECUENCIA: 14 aminoácidos, 42 nucleótidos | |
| NÚMERO DE HEBRAS: simple | |
| CONFIGURACIÓN: lineal | |
| TIPO DE MOLÉCULA: péptido |
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Información para la SEC ID nº 6: G1BCys
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| TIPO DE SECUENCIA: aminoácidos y nucleótidos | |
| LONGITUD DE LA SECUENCIA: 14 aminoácidos, 42 nucleótidos | |
| NÚMERO DE HEBRAS: simple | |
| CONFIGURACIÓN: lineal | |
| TIPO DE MOLÉCULA: péptido |
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Información para la SEC ID nº 7: G1A
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| TIPO DE SECUENCIA: aminoácidos y nucleótidos | |
| LONGITUD DE LA SECUENCIA: 14 aminoácidos, 42 nucleótidos | |
| NÚMERO DE HEBRAS: simple | |
| CONFIGURACIÓN: lineal | |
| TIPO DE MOLÉCULA: péptido |
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Información para la SEC ID nº 8: G1B
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| TIPO DE SECUENCIA: aminoácidos y nucleótidos | |
| LONGITUD DE LA SECUENCIA: 14 aminoácidos, 42 nucleótidos | |
| NÚMERO DE HEBRAS: simple | |
| CONFIGURACIÓN: lineal | |
| TIPO DE MOLÉCULA: péptido |
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\vskip1.000000\baselineskip
Información para la SEC ID nº 9: GL'A
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| TIPO DE SECUENCIA: aminoácidos | |
| LONGITUD DE LA SECUENCIA: 14 aminoácidos | |
| NÚMERO DE HEBRAS: simple | |
| CONFIGURACIÓN: lineal | |
| TIPO DE MOLÉCULA: péptido |
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Información para la SEC ID nº 10: G1'B
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| TIPO DE SECUENCIA: aminoácidos | |
| LONGITUD DE LA SECUENCIA: 14 aminoácidos | |
| NÚMERO DE HEBRAS: simple | |
| CONFIGURACIÓN: lineal | |
| TIPO DE MOLÉCULA: péptido |
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Información para la SEC ID nº 11:
G1'A\deltaC
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| TIPO DE SECUENCIA: aminoácidos | |
| LONGITUD DE LA SECUENCIA: 14 aminoácidos | |
| NÚMERO DE HEBRAS: simple | |
| CONFIGURACIÓN: lineal | |
| TIPO DE MOLÉCULA: péptido |
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\vskip1.000000\baselineskip
Información para la SEC ID nº 12:
G1'B\deltaC
\vskip1.000000\baselineskip
| TIPO DE SECUENCIA: aminoácidos | |
| LONGITUD DE LA SECUENCIA: 14 aminoácidos | |
| NÚMERO DE HEBRAS: simple | |
| CONFIGURACIÓN: lineal | |
| TIPO DE MOLÉCULA: péptido |
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\vskip1.000000\baselineskip
Información para la SEC ID nº 13: P40
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| TIPO DE SECUENCIA: aminoácidos y nucleótidos | |
| LONGITUD DE LA SECUENCIA: 335 aminoácidos, 1005 nucleótidos | |
| NÚMERO DE HEBRAS: simple | |
| CONFIGURACIÓN: lineal | |
| TIPO DE MOLÉCULA: proteína |
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\vskip1.000000\baselineskip
Información para la SEC ID nº 14:
G2A\deltaCF
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| TIPO DE SECUENCIA: aminoácidos y nucleótidos | |
| LONGITUD DE LA SECUENCIA: 101 aminoácidos, 303 nucleótidos | |
| NÚMERO DE HEBRAS: simple | |
| CONFIGURACIÓN: lineal | |
| TIPO DE MOLÉCULA: proteína |
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Información para la SEC ID nº: 15 G4A
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| TIPO DE SECUENCIA: aminoácidos y nucleótidos | |
| LONGITUD DE LA SECUENCIA: 17 aminoácidos, 42 nucleótidos | |
| NÚMERO DE HEBRAS: simple | |
| CONFIGURACIÓN: lineal | |
| TIPO DE MOLÉCULA: péptido |
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Información para la SEC ID nº: 16
GAA\deltaC
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| TIPO DE SECUENCIA: aminoácidos y nucleótidos | |
| LONGITUD DE LA SECUENCIA: 17 aminoácidos, 42 nucleótidos | |
| NÚMERO DE HEBRAS: simple | |
| CONFIGURACIÓN: lineal | |
| TIPO DE MOLÉCULA: péptido |
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Información para la SEC ID nº: 17 G4B
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| TIPO DE SECUENCIA: aminoácidos y nucleótidos | |
| LONGITUD DE LA SECUENCIA: 17 aminoácidos, 42 nucleótidos | |
| NÚMERO DE HEBRAS: simple | |
| CONFIGURACIÓN: lineal | |
| TIPO DE MOLÉCULA: péptido |
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Información para la SEC ID nº: 18
GAB\deltaC
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| LONGITUD DE LA SECUENCIA: 17 aminoácidos, 42 nucleótidos | |
| NÚMERO DE HEBRAS: simple | |
| CONFIGURACIÓN: lineal | |
| TIPO DE MOLÉCULA: péptido |
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Información para la SEC ID nº: 19 G4'A
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| LONGITUD DE LA SECUENCIA: 17 aminoácidos | |
| NÚMERO DE HEBRAS: simple | |
| CONFIGURACIÓN: lineal | |
| TIPO DE MOLÉCULA: péptido |
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Información para la SEC ID nº: 20
G4'A\deltaC
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| LONGITUD DE LA SECUENCIA: 17 aminoácidos | |
| NÚMERO DE HEBRAS: simple | |
| CONFIGURACIÓN: lineal | |
| TIPO DE MOLÉCULA: péptido |
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Información para la SEC ID nº: 21 G4'B
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| TIPO DE SECUENCIA: aminoácidos | |
| LONGITUD DE LA SECUENCIA: 17 aminoácidos | |
| NÚMERO DE HEBRAS: simple | |
| CONFIGURACIÓN: lineal | |
| TIPO DE MOLÉCULA: péptido |
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\vskip1.000000\baselineskip
Información para la SEC ID nº: 22
G4'B\deltaC
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| TIPO DE SECUENCIA: aminoácidos | |
| LONGITUD DE LA SECUENCIA: 17 aminoácidos | |
| NÚMERO DE HEBRAS: simple | |
| CONFIGURACIÓN: lineal | |
| TIPO DE MOLÉCULA: péptido |
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\vskip1.000000\baselineskip
Información para la SEC ID nº: 23 G200A
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| TIPO DE SECUENCIA: aminoácidos y nucleótidos | |
| LONGITUD DE LA SECUENCIA: 61 aminoácidos, 183 nucleótidos | |
| NÚMERO DE HEBRAS: simple | |
| CONFIGURACIÓN: lineal | |
| TIPO DE MOLÉCULA: péptido |
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Información para la SEC ID nº: 24 G198A
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| TIPO DE SECUENCIA: aminoácidos y nucleótidos | |
| LONGITUD DE LA SECUENCIA: 59 aminoácidos, 177 nucleótidos | |
| NÚMERO DE HEBRAS: simple | |
| CONFIGURACIÓN: lineal | |
| TIPO DE MOLÉCULA: proteína |
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\vskip1.000000\baselineskip
Información para la SEC ID nº: 25 G196A
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| TIPO DE SECUENCIA: aminoácidos y nucleótidos | |
| LONGITUD DE LA SECUENCIA: 57 aminoácidos, 171 nucleótidos | |
| NÚMERO DE HEBRAS: simple | |
| CONFIGURACIÓN: lineal | |
| TIPO DE MOLÉCULA: proteína |
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\vskip1.000000\baselineskip
Información para la SEC ID nº: 26 G194A
\vskip1.000000\baselineskip
| TIPO DE SECUENCIA: aminoácidos y nucleótidos | |
| LONGITUD DE LA SECUENCIA: 55 aminoácidos, 165 nucleótidos | |
| NÚMERO DE HEBRAS: simple | |
| CONFIGURACIÓN: lineal | |
| TIPO DE MOLÉCULA: proteína |
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\vskip1.000000\baselineskip
Información para la SEC ID nº: 27 G192A
\vskip1.000000\baselineskip
| TIPO DE SECUENCIA: aminoácidos y nucleótidos | |
| LONGITUD DE LA SECUENCIA: 52 aminoácidos, 156 nucleótidos | |
| NÚMERO DE HEBRAS: simple | |
| CONFIGURACIÓN: lineal | |
| TIPO DE MOLÉCULA: proteína |
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Información para la SEC ID nº: 28 Q6A
\vskip1.000000\baselineskip
| TIPO DE SECUENCIA: aminoácidos y nucleótidos | |
| LONGITUD DE LA SECUENCIA: 51 aminoácidos, 153 nucleótidos | |
| NÚMERO DE HEBRAS: simple | |
| CONFIGURACIÓN: lineal | |
| TIPO DE MOLÉCULA: proteína |
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Información para la SEC ID nº: 29 G7A
\vskip1.000000\baselineskip
| TIPO DE SECUENCIA: aminoácidos y nucleótidos | |
| LONGITUD DE LA SECUENCIA: 33 aminoácidos, 99 nucleótidos | |
| NÚMERO DE HEBRAS: simple | |
| CONFIGURACIÓN: lineal | |
| TIPO DE MOLÉCULA: proteína |
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Información para la SEC ID nº: 30
G200A\deltaC
\vskip1.000000\baselineskip
| TIPO DE SECUENCIA: aminoácidos y nucleótidos | |
| LONGITUD DE LA SECUENCIA: 61 aminoácidos, 183 nucleótidos | |
| NÚMERO DE HEBRAS: simple | |
| CONFIGURACIÓN: lineal | |
| TIPO DE MOLÉCULA: proteína |
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Información para la SEC ID nº: 31
G198A\deltaC
\vskip1.000000\baselineskip
| TIPO DE SECUENCIA: aminoácidos y nucleótidos | |
| LONGITUD DE LA SECUENCIA: 59 aminoácidos, 177 nucleótidos | |
| NÚMERO DE HEBRAS: simple | |
| CONFIGURACIÓN: lineal | |
| TIPO DE MOLÉCULA: proteína |
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Información para la SEC ID nº: 32
G196A\deltaC
\vskip1.000000\baselineskip
| TIPO DE SECUENCIA: aminoácidos y nucleótidos | |
| LONGITUD DE LA SECUENCIA: 57 aminoácidos, 171 nucleótidos | |
| NÚMERO DE HEBRAS: simple | |
| CONFIGURACIÓN: lineal | |
| TIPO DE MOLÉCULA: proteína |
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Información para la SEC ID nº: 33
G194A\deltaC
\vskip1.000000\baselineskip
| TIPO DE SECUENCIA: aminoácidos y nucleótidos | |
| LONGITUD DE LA SECUENCIA: 55 aminoácidos, 165 nucleótidos | |
| NÚMERO DE HEBRAS: simple | |
| CONFIGURACIÓN: lineal | |
| TIPO DE MOLÉCULA: proteína |
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\vskip1.000000\baselineskip
Información para la SEC ID nº: 34
G192A\deltaC
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| TIPO DE SECUENCIA: aminoácidos y nucleótidos | |
| LONGITUD DE LA SECUENCIA: 52 aminoácidos, 156 nucleótidos | |
| NÚMERO DE HEBRAS: simple | |
| CONFIGURACIÓN: lineal | |
| TIPO DE MOLÉCULA: proteína |
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\vskip1.000000\baselineskip
Información para la SEC ID nº: 35
G6A\deltaC
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| TIPO DE SECUENCIA: aminoácidos y nucleótidos | |
| LONGITUD DE LA SECUENCIA: 50 aminoácidos, 150 nucleótidos | |
| NÚMERO DE HEBRAS: simple | |
| CONFIGURACIÓN: lineal | |
| TIPO DE MOLÉCULA: proteína |
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\vskip1.000000\baselineskip
Información para la SEC ID nº: 36
G7A\deltaC
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| TIPO DE SECUENCIA: aminoácidos y nucleótidos | |
| LONGITUD DE LA SECUENCIA: 33 aminoácidos, 99 nucleótidos | |
| NÚMERO DE HEBRAS: simple | |
| CONFIGURACIÓN: lineal | |
| TIPO DE MOLÉCULA: proteína |
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\vskip1.000000\baselineskip
Información para la SEC ID nº: 37 G200B
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| TIPO DE SECUENCIA: aminoácidos y nucleótidos | |
| LONGITUD DE LA SECUENCIA: 61 aminoácidos, 183 nucleótidos | |
| NÚMERO DE HEBRAS: simple | |
| CONFIGURACIÓN: lineal | |
| TIPO DE MOLÉCULA: proteína |
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\vskip1.000000\baselineskip
Información para la SEC ID nº: 38 G198B
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| TIPO DE SECUENCIA: aminoácidos y nucleótidos | |
| LONGITUD DE LA SECUENCIA: 59 aminoácidos, 177 nucleótidos | |
| NÚMERO DE HEBRAS: simple | |
| CONFIGURACIÓN: lineal | |
| TIPO DE MOLÉCULA: proteína |
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\vskip1.000000\baselineskip
Información para la SEC ID nº: 39 G196B
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| TIPO DE SECUENCIA: aminoácidos y nucleótidos | |
| LONGITUD DE LA SECUENCIA: 57 aminoácidos, 171 nucleótidos | |
| NÚMERO DE HEBRAS: simple | |
| CONFIGURACIÓN: lineal | |
| TIPO DE MOLÉCULA: proteína |
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\vskip1.000000\baselineskip
Información para la SEC ID nº: 40 G194B
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| TIPO DE SECUENCIA: aminoácidos y nucleótidos | |
| LONGITUD DE LA SECUENCIA: 55 aminoácidos, 165 nucleótidos | |
| NÚMERO DE HEBRAS: simple | |
| CONFIGURACIÓN: lineal | |
| TIPO DE MOLÉCULA: proteína |
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\vskip1.000000\baselineskip
Información para la SEC ID nº: 41 G192B
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| TIPO DE SECUENCIA: aminoácidos y nucleótidos | |
| LONGITUD DE LA SECUENCIA: 53 aminoácidos, 159 nucleótidos | |
| NÚMERO DE HEBRAS: simple | |
| CONFIGURACIÓN: lineal | |
| TIPO DE MOLÉCULA: proteína |
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Información para la SEC ID nº: 42 G6B
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| TIPO DE SECUENCIA: aminoácidos y nucleótidos | |
| LONGITUD DE LA SECUENCIA: 51 aminoácidos, 153 nucleótidos | |
| NÚMERO DE HEBRAS: simple | |
| CONFIGURACIÓN: lineal | |
| TIPO DE MOLÉCULA: proteína |
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\vskip1.000000\baselineskip
Información para la SEC ID nº: 43 G7B
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| TIPO DE SECUENCIA: aminoácidos y nucleótidos | |
| LONGITUD DE LA SECUENCIA: 33 aminoácidos, 99 nucleótidos | |
| NÚMERO DE HEBRAS: simple | |
| CONFIGURACIÓN: lineal | |
| TIPO DE MOLÉCULA: proteína |
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Información para la SEC ID nº: 44
G200B\deltac
\vskip1.000000\baselineskip
| TIPO DE SECUENCIA: aminoácidos y nucleótidos | |
| LONGITUD DE LA SECUENCIA: 61 aminoácidos, 183 nucleótidos | |
| NÚMERO DE HEBRAS: simple | |
| CONFIGURACIÓN: lineal | |
| TIPO DE MOLÉCULA: proteína |
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Información para la SEC ID nº: 45
GL98B\deltaC
\vskip1.000000\baselineskip
| TIPO DE SECUENCIA: aminoácidos y nucleótidos | |
| LONGITUD DE LA SECUENCIA: 59 aminoácidos, 177 nucleótidos | |
| NÚMERO DE HEBRAS: simple | |
| CONFIGURACIÓN: lineal | |
| TIPO DE MOLÉCULA: proteína |
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Información para la SEC ID nº: 46
GL96B\deltaC
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| TIPO DE SECUENCIA: aminoácidos y nucleótidos | |
| LONGITUD DE LA SECUENCIA: 57 aminoácidos, 171 nucleótidos | |
| NÚMERO DE HEBRAS: simple | |
| CONFIGURACIÓN: lineal | |
| TIPO DE MOLÉCULA: proteína |
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Información para la SEC ID nº: 47
GL94B\deltaC
\vskip1.000000\baselineskip
| TIPO DE SECUENCIA: aminoácidos y nucleótidos | |
| LONGITUD DE LA SECUENCIA: 55 aminoácidos, 165 nucleótidos | |
| NÚMERO DE HEBRAS: simple | |
| CONFIGURACIÓN: lineal | |
| TIPO DE MOLÉCULA: proteína |
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Información para la SEC ID nº: 48
G192B\deltaC
\vskip1.000000\baselineskip
| TIPO DE SECUENCIA: aminoácidos y nucleótidos | |
| LONGITUD DE LA SECUENCIA: 53 aminoácidos, 159 nucleótidos | |
| NÚMERO DE HEBRAS: simple | |
| CONFIGURACIÓN: lineal | |
| TIPO DE MOLÉCULA: proteína |
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Información para la SEC ID nº: 49
G6B\deltaC
\vskip1.000000\baselineskip
| TIPO DE SECUENCIA: aminoácidos y nucleótidos | |
| LONGITUD DE LA SECUENCIA: 51 aminoácidos, 153 nucleótidos | |
| NÚMERO DE HEBRAS: simple | |
| CONFIGURACIÓN: lineal | |
| TIPO DE MOLÉCULA: proteína |
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Información para la SEC ID nº: 50
G7B\deltaC
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| TIPO DE SECUENCIA: aminoácidos y nucleótidos | |
| LONGITUD DE LA SECUENCIA: 33 aminoácidos, 99 nucleótidos | |
| NÚMERO DE HEBRAS: simple | |
| CONFIGURACIÓN: lineal | |
| TIPO DE MOLÉCULA: proteína |
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\vskip1.000000\baselineskip
Información para la SEC ID nº: 51 G2V
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| TIPO DE SECUENCIA: aminoácidos y nucleótidos | |
| LONGITUD DE LA SECUENCIA: 101 aminoácidos, 303 nucleótidos | |
| NÚMERO DE HEBRAS: simple | |
| CONFIGURACIÓN: lineal | |
| TIPO DE MOLÉCULA: proteína |
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Información para la SEC ID nº: 52
G2V\deltaC
\vskip1.000000\baselineskip
| TIPO DE SECUENCIA: aminoácidos y nucleótidos | |
| LONGITUD DE LA SECUENCIA: 101 aminoácidos, 303 nucleótidos | |
| NÚMERO DE HEBRAS: simple | |
| CONFIGURACIÓN: lineal | |
| TIPO DE MOLÉCULA: proteína |
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Información para la SEC ID nº: 53 G200V
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| TIPO DE SECUENCIA: aminoácidos y nucleótidos | |
| LONGITUD DE LA SECUENCIA: 61 aminoácidos, 183 nucleótidos | |
| NÚMERO DE HEBRAS: simple | |
| CONFIGURACIÓN: lineal | |
| TIPO DE MOLÉCULA: proteína |
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Información para la SEC ID nº: 54 G198V
\vskip1.000000\baselineskip
| TIPO DE SECUENCIA: aminoácidos y nucleótidos | |
| LONGITUD DE LA SECUENCIA: 59 aminoácidos, 177 nucleótidos | |
| NÚMERO DE HEBRAS: simple | |
| CONFIGURACIÓN: lineal | |
| TIPO DE MOLÉCULA: proteína |
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Información para la SEC ID nº: 55 G196V
\vskip1.000000\baselineskip
| TIPO DE SECUENCIA: aminoácidos y nucleótidos | |
| LONGITUD DE LA SECUENCIA: 57 aminoácidos, 171 nucleótidos | |
| NÚMERO DE HEBRAS: simple | |
| CONFIGURACIÓN: lineal | |
| TIPO DE MOLÉCULA: proteína |
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Información para la SEC ID nº: 56 G194V
\vskip1.000000\baselineskip
| TIPO DE SECUENCIA: aminoácidos y nucleótidos | |
| LONGITUD DE LA SECUENCIA: 55 aminoácidos, 165 nucleótidos | |
| NÚMERO DE HEBRAS: simple | |
| CONFIGURACIÓN: lineal | |
| TIPO DE MOLÉCULA: proteína |
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Información para la SEC ID nº: 57 G192V
\vskip1.000000\baselineskip
| TIPO DE SECUENCIA: aminoácidos y nucleótidos | |
| LONGITUD DE LA SECUENCIA: 52 aminoácidos, 156 nucleótidos | |
| NÚMERO DE HEBRAS: simple | |
| CONFIGURACIÓN: lineal | |
| TIPO DE MOLÉCULA: proteína |
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Información para la SEC ID nº: 58 G6V
\vskip1.000000\baselineskip
| TIPO DE SECUENCIA: aminoácidos y nucleótidos | |
| LONGITUD DE LA SECUENCIA: 51 aminoácidos, 153 nucleótidos | |
| NÚMERO DE HEBRAS: simple | |
| CONFIGURACIÓN: lineal | |
| TIPO DE MOLÉCULA: proteína |
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Información para la SEC ID nº: 59 G7V
\vskip1.000000\baselineskip
| TIPO DE SECUENCIA: aminoácidos y nucleótidos | |
| LONGITUD DE LA SECUENCIA: 33 aminoácidos, 99 nucleótidos | |
| NÚMERO DE HEBRAS: simple | |
| CONFIGURACIÓN: lineal | |
| TIPO DE MOLÉCULA: proteína |
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Información para la SEC ID nº: 60
G200V\deltaC
\vskip1.000000\baselineskip
| TIPO DE SECUENCIA: aminoácidos y nucleótidos | |
| LONGITUD DE LA SECUENCIA: 61 aminoácidos, 183 nucleótidos | |
| NÚMERO DE HEBRAS: simple | |
| CONFIGURACIÓN: lineal | |
| TIPO DE MOLÉCULA: proteína |
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Información para la SEC ID nº: 61
G198V\deltaC
\vskip1.000000\baselineskip
| TIPO DE SECUENCIA: aminoácidos y nucleótidos | |
| LONGITUD DE LA SECUENCIA: 59 aminoácidos, 177 nucleótidos | |
| NÚMERO DE HEBRAS: simple | |
| CONFIGURACIÓN: lineal | |
| TIPO DE MOLÉCULA: proteína |
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Información para la SEC ID nº: 62
G196V\deltaC
\vskip1.000000\baselineskip
| TIPO DE SECUENCIA: aminoácidos y nucleótidos | |
| LONGITUD DE LA SECUENCIA: 57 aminoácidos, 171 nucleótidos | |
| NÚMERO DE HEBRAS: simple | |
| CONFIGURACIÓN: lineal | |
| TIPO DE MOLÉCULA: proteína |
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Información para la SEC ID nº: 63
G194V\deltaC
\vskip1.000000\baselineskip
| TIPO DE SECUENCIA: aminoácidos y nucleótidos | |
| LONGITUD DE LA SECUENCIA: 55 aminoácidos, 165 nucleótidos | |
| NÚMERO DE HEBRAS: simple | |
| CONFIGURACIÓN: lineal | |
| TIPO DE MOLÉCULA: proteína |
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Información para la SEC ID nº: 64
G192V\deltaC
\vskip1.000000\baselineskip
| TIPO DE SECUENCIA: aminoácidos y nucleótidos | |
| LONGITUD DE LA SECUENCIA: 52 aminoácidos, 156 nucleótidos | |
| NÚMERO DE HEBRAS: simple | |
| CONFIGURACIÓN: lineal | |
| TIPO DE MOLÉCULA: proteína |
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Información para la SEC ID nº: 65
G6V\deltaC
\vskip1.000000\baselineskip
| TIPO DE SECUENCIA: aminoácidos y nucleótidos | |
| LONGITUD DE LA SECUENCIA: 51 aminoácidos, 153 nucleótidos | |
| NÚMERO DE HEBRAS: simple | |
| CONFIGURACIÓN: lineal | |
| TIPO DE MOLÉCULA: proteína |
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Información para la SEC ID nº: 66
G7V\deltaC
\vskip1.000000\baselineskip
| TIPO DE SECUENCIA: aminoácidos y nucleótidos | |
| LONGITUD DE LA SECUENCIA: 33 aminoácidos, 99 nucleótidos | |
| NÚMERO DE HEBRAS: simple | |
| CONFIGURACIÓN: lineal | |
| TIPO DE MOLÉCULA: proteína |
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Información para la SEC ID nº: 67 G4V
\vskip1.000000\baselineskip
| TIPO DE SECUENCIA: aminoácidos y nucleótidos | |
| LONGITUD DE LA SECUENCIA: 17 aminoácidos, 51 nucleótidos | |
| NÚMERO DE HEBRAS: simple | |
| CONFIGURACIÓN: lineal | |
| TIPO DE MOLÉCULA: péptido |
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Información para la SEC ID nº: 68
G4V\deltaC
\vskip1.000000\baselineskip
| TIPO DE SECUENCIA: aminoácidos y nucleótidos | |
| LONGITUD DE LA SECUENCIA: 17 aminoácidos, 51 nucleótidos | |
| NÚMERO DE HEBRAS: simple | |
| CONFIGURACIÓN: lineal | |
| TIPO DE MOLÉCULA: péptido |
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Información para la SEC ID nº: 69 G4'V
\vskip1.000000\baselineskip
| TIPO DE SECUENCIA: aminoácidos | |
| LONGITUD DE LA SECUENCIA: 17 aminoácidos | |
| NÚMERO DE HEBRAS: simple | |
| CONFIGURACIÓN: lineal | |
| TIPO DE MOLÉCULA: péptido |
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Información para la SEC ID nº: 70
G4'V\deltaC
\vskip1.000000\baselineskip
| TIPO DE SECUENCIA: aminoácidos | |
| LONGITUD DE LA SECUENCIA: 17 aminoácidos | |
| NÚMERO DE HEBRAS: simple | |
| CONFIGURACIÓN: lineal | |
| TIPO DE MOLÉCULA: péptido |
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Información para la SEC ID nº: 71 G1V
\vskip1.000000\baselineskip
| TIPO DE SECUENCIA: aminoácidos y nucleótidos | |
| LONGITUD DE LA SECUENCIA: 14 aminoácidos, 42 nucleótidos | |
| NÚMERO DE HEBRAS: simple | |
| CONFIGURACIÓN: lineal | |
| TIPO DE MOLÉCULA: péptido |
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Información para la SEC ID nº: 72
G1V\deltaC
\vskip1.000000\baselineskip
| TIPO DE SECUENCIA: aminoácidos y nucleótidos | |
| LONGITUD DE LA SECUENCIA: 14 aminoácidos | |
| NÚMERO DE HEBRAS: simple | |
| CONFIGURACIÓN: lineal | |
| TIPO DE MOLÉCULA: péptido |
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Información para la SEC ID nº: 73
G1'V\deltaC
\vskip1.000000\baselineskip
| TIPO DE SECUENCIA: aminoácidos | |
| LONGITUD DE LA SECUENCIA: 14 aminoácidos | |
| NÚMERO DE HEBRAS: simple | |
| CONFIGURACIÓN: lineal | |
| TIPO DE MOLÉCULA: péptido |
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Información para la SEC ID nº: 74 BB
\vskip1.000000\baselineskip
| TIPO DE SECUENCIA: aminoácidos y nucleótidos | |
| LONGITUD DE LA SECUENCIA: 219 aminoácidos, 657 nucleótidos | |
| NÚMERO DE HEBRAS: simple | |
| CONFIGURACIÓN: lineal | |
| TIPO DE MOLÉCULA: proteína |
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Información para la SEC ID nº: 75 \deltaBE =
fragmento de EB
\vskip1.000000\baselineskip
| TIPO DE SECUENCIA: aminoácidos y nucleótidos | |
| LONGITUD DE LA SECUENCIA: 108 aminoácidos, 324 nucleótidos | |
| NÚMERO DE HEBRAS: simple | |
| CONFIGURACIÓN: lineal | |
| TIPO DE MOLÉCULA: proteína |
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (17)
1. Proteína aislada caracterizada porque
dicha proteína es la proteína OmpA de la membrana externa de la
bacteria Klebsiella pneumoniae de secuencia SEC ID nº 13.
2. Proteína según la reivindicación 1,
caracterizada porque se obtiene mediante recombinación.
3. Proteína según la reivindicación 1,
caracterizada porque se obtiene mediante purificación a
partir de un cultivo de Klebsiella pneumoniae.
4. Proteína según una de las reivindicaciones 1
a 3, caracterizada porque dicha proteína es una proteína
portadora.
5. Conjugado caracterizado porque
comprende una proteína según una de las reivindicaciones 1 a 4 y un
péptido inmunógeno, estando dicho péptido inmunógeno
caracterizado porque comprende la secuencia peptídica
incluida entre los restos de aminoácidos 174 y 187, y porque está
portado por la secuencia peptídica SEC ID nº 1, nº 2 y nº 51
incluida entre los restos de aminoácidos 130 y 230 de la secuencia
de la proteína G del virus respiratorio sincitial humano, subgrupos
A y B, o del virus respiratorio sincitial bovino, y en cuyo péptido
inmunógeno el aminoácido Cys en posición 173 y/o 186 de dicha
proteína G puede ser una serina.
6. Conjugado según la reivindicación 5,
caracterizado porque se obtiene mediante acoplamiento
químico.
7. Conjugado según la reivindicación 5 ó 6,
caracterizado porque es soluble.
8. Conjugado según la reivindicación 7,
caracterizado porque el conjugado se obtiene mediante el
procedimiento que comprende las siguientes etapas:
- a)
- se precipitan los lipopolisacáridos de membranas de bacterias del género Klebsiella en presencia de una sal de un catión divalente y de detergentes, para recuperar las proteínas membránicas totales en el sobrenadante,
- b)
- las proteínas se someten a una cromatografía por intercambio de aniones para separar la fracción que contiene la proteína adyuvante de inmunidad,
- c)
- se concentra la fracción que contiene la proteína adyuvante de inmunidad,
- d)
- se conjuga la proteína adyuvante de inmunidad con un polipéptido inmunógeno, para formar un conjugado soluble,
estando dicho péptido inmunógeno
caracterizado porque comprende la secuencia peptídica
incluida entre los restos de aminoácidos 174 y 187, y porque está
portado por la secuencia peptídica SEC ID nº 1, Nº 2 o Nº 51
incluida entre los restos de aminoácidos 130 y 230 de la secuencia
de la proteína G del virus respiratorio sincitial humano, subgrupos
A y B, o del virus respiratorio sincitial bovino, y en cuyo péptido
inmunógeno el aminoácido Cys en posición 173 y/o 186 de dicha
proteína G puede ser una serina.
9. Conjugado según una de las reivindicaciones 5
a 8, caracterizado porque dicho péptido inmunógeno está
conjugado a la proteína portadora por medio de la proteína BB que se
une a seroalbúmina humana.
10. Conjugado según la reivindicación 9,
caracterizado porque la proteína BB comprende la proteína de
secuencia SEC ID nº 74 o de secuencia SEC ID nº 73.
11. Conjugado según la reivindicación 9 ó 10,
caracterizado porque se obtiene mediante recombinación
génica.
12. Ácido nucléico aislado, caracterizado
porque su secuencia codifica la proteína de secuencia SEC ID nº
13.
13. Composición de vacuna, caracterizada
porque comprende un conjugado según una de las reivindicaciones 5 a
11.
14. Composición según la reivindicación 13, que
se puede administrar mediante inyección o subcutáneamente.
15. Composición según la reivindicación 13 ó 14,
que comprende además excipientes farmacéuticamente aceptables.
16. Uso de una proteína según la reivindicación
1, para la preparación de composición destinada a la prevención o el
tratamiento de afecciones debidas al virus respiratorio sincitial
(VRS).
17. Anticuerpos dirigidos contra la proteína de
secuencia SEC ID nº 13.
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|---|---|---|---|
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| FR9404009A FR2718452B1 (fr) | 1994-04-06 | 1994-04-06 | Elément d'immunogène, agent immunogène, composition pharmaceutique et procédé de préparation. |
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|---|---|---|---|
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