CN106075418A - 一种fliC蛋白和GAPDH蛋白微胶囊疫苗 - Google Patents

一种fliC蛋白和GAPDH蛋白微胶囊疫苗 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种fliC蛋白和GAPDH蛋白微胶囊疫苗，其中抗原是fliC蛋白和GAPDH蛋白；其中fliC蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:1；GAPDH蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:2。本发明所制备的微胶囊疫苗使用方便，粒径合适，具有良好的缓释性和抗原保护性，且能有效刺激鱼体肠道免疫系统产生免疫应答，使鱼体获得对迟钝爱德华氏菌的特异性免疫保护力，可用于鱼类迟钝爱德华氏菌病的防治。

Description

一种fliC蛋白和GAPDH蛋白微胶囊疫苗
技术领域
本发明属于水产养殖疫苗制备技术领域，具体涉及一种fliC蛋白和GAPDH蛋白微胶囊疫苗。
背景技术
迟钝爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)是一种水产动物重要的致病菌，属于肠杆菌科，爱德华氏菌属，该菌由Hoshina首次在鳗鲡红病中报道，是目前水产养殖中有极大危害的病原菌。该菌可以感染包括淡水与海水养殖的多种鱼类，并能在短期内引起大量死亡，给我国水产养殖业带来了巨大经济损失。
疫苗的使用可提高养殖鱼类特异性免疫水平，使鱼体产生抵抗特定病原微生物感染的免疫力，不污染环境，无药物残留等问题，是今后鱼类疾病防控的主流发展方向。因此，筛选免疫原性好的抗原，并用其制备疫苗就具有现实的应用意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种fliC蛋白和GAPDH蛋白微胶囊疫苗，可以有效的预防迟钝爱德华氏菌引起的疾病，从而弥补现有技术的不足。
本发明提供的微胶囊疫苗，其中抗原是fliC蛋白和GAPDH蛋白；其中fliC蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:1；GAPDH蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:2；
上述的fliC蛋白和GAPDH蛋白用脂多糖进行了偶联；
本发明的微胶囊疫苗；是将fliC蛋白和GAPDH蛋白与黄芪多糖混合，再与海藻酸钠混合，用蒸馏水配制成乳浊液，其中海藻酸钠终浓度为2％，将乳浊液搅拌均匀后，喷入浓度为3％CaCl2的溶液中，形成海藻酸钙微胶囊，喷雾完毕后继续搅拌20min；离心收集海藻酸钙微胶囊，然后将微胶囊分散到0.2％的壳聚糖溶液中，充分搅拌后，离心收集微胶囊，蒸馏水洗涤后，再将收集的微胶囊分散在甘露醇溶液中，混匀后冷冻，经冷冻干燥后制成微胶囊疫苗。
本发明的微胶囊疫苗可用作牙鲆或大菱鲆的饲料添加剂来使用。
本发明提供的fliC蛋白疫苗具有强的免疫原性，其的免疫效果好。且口服免疫对个体较小的鱼体应激小，人力成本低，便于规模化推广应用。该疫苗无异味，适口性好，鱼体易采食。
附图说明
图1：本发明的fliC蛋白与NCBI中的fliC基因的序列比较图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。
实施例1：fliC蛋白、GAPDH蛋白的获得及序列分析
1)迟钝爱德华氏菌的分离
2015年山东某牙鲆养殖场养殖的牙鲆出现了明显的迟钝爱德华氏菌感染的病症，但患病鱼之前已经进行过迟钝爱德华氏菌疫苗的免疫处理。取濒死病鱼，无菌条件下获得肝脏组织，划线于普通营养琼脂平板上，30℃培养后挑取优势菌落进行纯化培养，直至获得纯培养菌。
将分离获得各菌株纯培养物，在普通营养琼脂平板上进行扩大培养，然后用无菌生理盐水洗脱菌落，获得菌悬液用于注射感染。最终筛选的菌株显示出对健康牙鲆具有较高的毒力，可引起90％牙鲆死亡，且死亡牙鲆出现与患病牙鲆相同的症状。因此，证实筛选的迟钝爱德华氏菌ET株为牙鲆腹水症的病原。且在感染患病的牙鲆体内可再次分离到该菌株。
对比实验表明，用目前市场上出售的迟钝爱德华氏菌疫苗对牙鲆幼苗进行免疫后，再用本发明筛选的ET株进行攻毒实验；结果表明目前市场上出售的疫苗的免疫效果远低于用本发明ET株制成的灭活疫苗的效果。推测是由于ET株的某个致病基因发生变异导致目前疫苗的免疫效果不好。
2)迟钝爱德华氏菌ET菌株GAPDH、鞭毛蛋白fliC的扩增及序列分析
根据Genbank迟钝爱德华氏GAPDH、fliC的基因序列，分别设计其特异性引物：
fliC正向引物：CGGGATCCATGGCACAAGTAATCAACACC、
fliC反向引物：CCGCTCGAGACGCAGCAGAGACAGGACGTTC；
GAPDH正向引物：CGGGATCCATGACTATCAAAGTAGGTATTAACG、
GAPDH反向引物：CCGCTCGAGCTTAGAGATGTGAGCGATTAGGTC；
利用细菌基因组抽提试剂盒，以抽提细菌基因组DNA为模板，分别配合各基因的正反向引物进行PCR扩增，PCR反应体系及反应条件为：50μl反应体系，包含37μl H2O、5μl 10×Taq buffer、4μl dNTP(2.5mM)、正反引物各1μl、1μl Taq DNA Polymerase及1μl DNA模板；PCR反应程序为94℃变性10min；94℃变性，1min，50℃退火1min，72℃延伸1min，进行30个循环，最后72℃延伸8min。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶成像系统拍照观察，结果显示GAPDH、fliC基因扩增成功，且扩增产物大小与目的基因一致。
对扩增产物回收后进行测序，结果表明，fliC基因的序列与NCBI中已公开的序列存在明显的差异；本发明获得的氨基酸序列为SEQ ID NO:1的fliC蛋白相比于NCBI中的fliC基因存在10个以上氨基的区别(图1)。获得的甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)的氨基酸序列为SEQ ID NO:2，NCBI比对结果表明GAPDH与NCBI中已公开的序列一致。
而免疫效果表明，用氨基酸序列为SEQ ID NO:1的fliC蛋白制成的疫苗对ET株的免疫效果明显好于NCBI中已公开的fliC蛋白制成的疫苗的免疫效果。
实施例2：重组蛋白的表达及与脂多糖进行偶联
1)GAPDH、fliC基因表达载体的构建：将扩增的迟钝爱德华氏菌GAPDH、fliC基因产物切胶回收进行纯化，纯化产物经BamHⅠ和XholⅠ双酶切后,连接至原核表达载体pET32a，分别构建其表达载体pET32a-GAPDH、pET32a-fliC，并将表达载体转化至大肠杆菌BL21(DE3)，于含氨苄青霉素的LB平板上培养，待长出菌落后，利用PCR方法筛选阳性克隆表达菌，将PCR检测为阳性克隆的菌株进一步利用测序进行确认。
2)重组蛋白的表达与纯化：经测序确认载体中插入序列正确后，将筛选到的迟钝爱德华氏菌GAPDH、fliC阳性克隆表达菌分别接种于含氨苄青霉素的LB培养基内，在摇床上培养至指数生长期时，加入终浓度为1mM的IPTG诱导表达6h，离心收集菌体，经超声破碎后，以Ni离子螯合的亲和层析柱(HisTrap HP 1ml,GE)对重组蛋白进行纯化，洗脱产物经尿素浓度梯度透析后，最后以PBS进行透析，透析完成后对样品进行冷冻干燥以浓缩样品，SDS-PAGE检测纯化的重组蛋白。迟钝爱德华氏菌fliC重组蛋白分子量为63kDa，该目的基因编码416个氨基酸，表达的蛋白片段理论分子量为43kDa，质粒pET32a的标签蛋白大小则约为20kDa左右，结果与理论大小相符；GAPDH重组蛋白分子量为55kDa，该目的基因编码331个氨基酸，表达的蛋白片段理论分子量为35kDa，质粒pET32a的标签蛋白大小则约为20kDa左右，结果与理论大小相符。
3)重组蛋白与LPS的偶联：将110mg脂多糖干粉溶解于10ml蒸馏水中，往该LPS水溶液中加入400mg固体NaIO4，混合孵育2min，然后加入220μl乙醇胺终止氧化反应，将反应产物加入孔径为3K大小的透析袋中，置于0.01mol/L的PBS中，在4℃条件下透析过夜，期间换两次透析液。同时，称取390mg碳化二亚胺(EDC)，溶解于5ml蒸馏水中，然后加入90mg纯化后的GAPDH重组蛋白，利用1M HCl将反应体系pH调整至5.4,室温震荡孵育2h。将上述完成氧化反应后的LPS与含EDC的重组GAPDH蛋白溶解混合，在22℃条件下孵育1h，最后将反应液置于PBS缓冲液中透析过夜，期间更换透析液，最后将透析后的溶液在8000g下离心30min，所得上清即为GAPDH与LPS的偶联粗制物。FliC与LPS的偶联同样参照以上方法进行。
4)重组蛋白-LPS偶联物的纯化：各重组蛋白的偶联粗制物，利用Sephacryl S-300凝胶柱层析分离纯化各重组蛋白-LPS偶联物。具体为：首先将粗制偶联产物以孔径为0.22μm的滤膜过滤，然后往柱体积为120mL的Sephacryl S-300层析柱内上样10ml偶联粗制物，以PBS缓冲液作为平衡与洗脱缓冲液，均匀将流速控制为2ml/min，根据紫外吸收波收集样品，根据分子筛原理，分子量较大的偶联产物将会首先分离获得。将收集到的偶联产物以超纯水透析，然后进行冷冻干燥，-20℃保存备用。
实施例3：fliC和GAPDH二联亚单位口服微胶囊疫苗的制备
将上述制备的GAPDH、fliC与LPS的偶联产物按等重量混合后，然后将混合物总量为3:1的比例与黄芪多糖混合，将抗原混合物与海藻酸钠以1:4(W/W)比例混合，用蒸馏水配制成海藻酸钠-抗原乳浊液，其中海藻酸钠终浓度为2％，在混匀器的搅拌作用下包埋30min。将该乳浊液利用喷雾式锐孔凝固浴法，直接喷入经混匀器搅动的3％CaCl2溶液中，形成海藻酸钙微胶囊，乳浊液与CaCl2溶液的体积比为1:1，喷雾完毕后继续搅拌20min。离心收集海藻酸钙微胶囊，然后将微胶囊分散到0.2％的壳聚糖溶液中，充分搅拌30min，离心收集海藻酸钙-壳聚糖微胶囊，蒸馏水洗涤3次并离心后，再将收集的微胶囊分散在8％的甘露醇溶液中，混匀后冷冻，经冷冻干燥后，封盖包装，即为本发明所述的迟钝爱德华氏菌亚单位口服微胶囊疫苗。利用显微镜对制备的微胶囊进行表观特性观察，可见微胶囊颗粒大小均匀，平均直径为150±10μm。
实施例4：微胶囊疫苗对牙鲆的免疫保护效果
准备健康牙鲆共100尾，平均体重为50g±5g，利用可控温循环养殖系统对牙鲆暂养7天，水温控制为21℃，期间正常投喂商品化颗粒饲料。实验前，将鱼平均分为2组，每组50尾，在对供试鱼体禁食24h后，对免疫组鱼体投喂fliC亚单位口服微胶囊疫苗，投喂方法：将口服微胶囊疫苗与鱼饲料混合投入水体，供鱼体自由采食，使用剂量为：每kg体重鱼体投放微胶囊疫苗0.5g，连续投喂5天。首次投喂后15天，再次进行二次免疫，用法及用量与首次相同。对照组鱼体投喂以不含免疫原与黄芪多糖的海藻酸钠溶液制备的微胶囊颗粒，投喂方法与投喂量与免疫组相同，在首次投喂后35天，利用生理盐水配制迟钝爱德华氏菌活菌悬液，浓度为1×107CFU/ml，采用肌肉注射方式对实验鱼体进行攻毒，每尾注射100μl。攻毒后连续观察并记录鱼体发病与死亡状况，计算迟钝爱德华氏菌亚单位口服微胶囊疫苗对牙鲆的相对免疫保护率。结果显示对照组鱼体累计死亡率为95％，免疫组鱼体在攻毒后20天的累计死亡率为17.5％，通过计算得知，本发明研制的迟钝爱德华氏菌亚单位口服微胶囊疫苗对牙鲆的相对免疫保护率为81.6％。
而且，用迟钝爱德华氏菌ET菌株攻毒实验结果表明，本发明制备的微胶囊疫苗相比于市售的其它迟钝爱德华氏菌有关的疫苗的免疫效果明显更好(p＜0.05)，推测是由于fliC基因的氨基酸序列差异导致的。

Claims (7)

1.一种微胶囊疫苗，其特征在于，所述的微胶囊疫苗，其抗原为fliC蛋白和GAPDH蛋白。
2.如权利要求1所述的微胶囊疫苗，其特征在于，所述的fliC蛋白的氨基酸序列为SEQID NO:1。
3.如权利要求1所述的微胶囊疫苗，其特征在于，所述的GAPDH蛋白的氨基酸序列为SEQID NO:2。
4.如权利要求1所述的微胶囊疫苗，其特征在于，所述的fliC蛋白和GAPDH蛋白用脂多糖进行了偶联。
5.权利要求1所述的微胶囊疫苗的制备方法，其特征在于，所述的方法是将fliC蛋白和GAPDH蛋白与黄芪多糖混合，再与海藻酸钠混合，用蒸馏水配制成乳浊液，将乳浊液搅拌均匀后，喷入浓度为3％CaCl2的溶液中，形成海藻酸钙微胶囊，喷雾完毕后继续搅拌20min；离心收集海藻酸钙微胶囊，然后将微胶囊分散到0.2％的壳聚糖溶液中，充分搅拌后，离心收集微胶囊，蒸馏水洗涤后，再将收集的微胶囊分散在甘露醇溶液中，混匀后冷冻，经冷冻干燥后制成微胶囊疫苗。
6.权利要求1所述的微胶囊疫苗作为鱼类饲料添加剂的应用。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的鱼类为牙鲆或大菱鲆。
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