JPWO2009133882A1 - 細菌毒素ワクチン - Google Patents
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Abstract
志賀毒素タンパク質等の細菌毒素タンパク質を、植物細胞を用いて効率よく生産する。志賀毒素タンパク質等の細菌毒素タンパク質が、下記の特徴（Ａ）及び（Ｂ）を有するペプチドを介してタンデムに連結されたハイブリッドタンパク質をコードするＤＮＡを含むＤＮＡ構築物を用いて植物細胞を形質転換し、植物細胞に前記細菌毒素タンパク質を生産させる。（Ａ）アミノ酸の個数が１２〜３０個；（Ｂ）プロリンの含有率が２０〜３５％。
Description
本発明は、志賀毒素、コレラ毒素、大腸菌易熱性毒素などの細菌毒素により引き起こされる疾患に対するワクチンに用いるハイブリッドタンパク質、及び該ハイブリッドタンパク質を生産するためのＤＮＡ構築物に関する。
志賀毒素（Ｓｔｘ、ベロ毒素）は、病原性大腸菌のうち腸管出血性大腸菌（enterohemorrhagic Escherichia coli）が産生するタンパク質性外毒素である。志賀毒素は、出血性腸炎、溶血性尿毒症症候群、脳症などを引き起こす。
志賀毒素は、大きくＳｔｘ１とＳｔｘ２に分けられ、更にそれぞれがサブクラスに分けられる。Ｓｔｘ２としては、例えばブタ浮腫病を引き起こすＳｔｘ２ｅが挙げられる。ブタ浮腫病は、離乳後１〜２週の子豚に高発生することが知られている。浮腫病菌の感染による致死率は、５０〜９０％と極めて高い。
また、コレラ毒素（ＣＴ）は、Vibrio choleraeが産生するタンパク質性外毒素である。ＣＴは、激しい下痢や嘔吐を引き起こすことが知られている。
また、大腸菌易熱性毒素（ＬＴ）は、毒素原性大腸菌（enterotoxigenic Escherichia coli）が産生するタンパク質性内毒素である。ＬＴは、下痢や嘔吐を引き起こすことが知られている。
Ｓｔｘ、ＬＴ、ＣＴのいずれの細菌毒素も、細胞への付着に関与するＢサブユニット５量体と毒性を持つＡサブユニット１量体からなることが知られている。また、ＬＴとＣＴは、構造的にも機能的にも類似していることが知られている。
志賀毒素は、大きくＳｔｘ１とＳｔｘ２に分けられ、更にそれぞれがサブクラスに分けられる。Ｓｔｘ２としては、例えばブタ浮腫病を引き起こすＳｔｘ２ｅが挙げられる。ブタ浮腫病は、離乳後１〜２週の子豚に高発生することが知られている。浮腫病菌の感染による致死率は、５０〜９０％と極めて高い。
また、コレラ毒素（ＣＴ）は、Vibrio choleraeが産生するタンパク質性外毒素である。ＣＴは、激しい下痢や嘔吐を引き起こすことが知られている。
また、大腸菌易熱性毒素（ＬＴ）は、毒素原性大腸菌（enterotoxigenic Escherichia coli）が産生するタンパク質性内毒素である。ＬＴは、下痢や嘔吐を引き起こすことが知られている。
Ｓｔｘ、ＬＴ、ＣＴのいずれの細菌毒素も、細胞への付着に関与するＢサブユニット５量体と毒性を持つＡサブユニット１量体からなることが知られている。また、ＬＴとＣＴは、構造的にも機能的にも類似していることが知られている。
これらの細菌毒素による疾患を予防する方法としては、ワクチンを、注射もしくは経鼻スプレーにより投与したり、経口的に投与したりする方法が知られている。
例えば、無毒化したＳｔｘ２ｅタンパク質を組換え大腸菌を用いて生産させ、注射によりブタに投与する技術が知られている（非特許文献１）。しかしながら、組換え大腸菌による、無毒化したＳｔｘ２ｅタンパク質の生産量は十分ではないという問題や注射によるワクチンの投与は、人間の労力がかかるなどの問題があった。
また、ワクチンを経口的に投与する方法については、労力軽減の観点から畜産分野で関心が高まっている。このような背景において、細菌毒素タンパク質を、トランスジェニック技術を用いて植物に生産させる技術の開発が行われている。例えば、ＬＴタンパク質のＢサブユニット（LTB）をコードするＤＮＡを含み、該ＤＮＡを発現するトランスジェニック植物について記載されている（特許文献１、特許文献２）。また、ＬＴタンパク質又はＣＴタンパク質をコードするＤＮＡを発現するトランスジェニック植物について記載されている（特許文献３）。しかしながら、これらの技術では、タンパク質の生産量が十分でないという問題があった。また、LTBをレタスに生産させた例が報告されている（非特許文献２）。この研究では、コドンを改変したＬＴタンパク質のＢサブユニットの遺伝子を、植物高発現プロモーターであるカリフラワーモザイクウイルス35S RNAプロモーター（CaMV35S）と、エンハンサーであるKozak配列を用いて、レタス内で発現させている。その結果、ＬＴタンパク質のＢサブユニットがレタスの総可溶性タンパク質の約２．０質量％蓄積したことが報告されている。しかしながら、この程度のタンパク質の蓄積量では、トランスジェニック植物を利用して細菌病の防除を効率的に行うには不十分であると考えられる。すなわち、目的の細菌毒素タンパク質を植物細胞内で効率良く生産、蓄積させる必要がある。
本発明者らは、植物由来の分泌シグナルペプチドがアミノ末端に付加されたＳｔｘ２ｅタンパク質を、植物由来のアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の５'−非翻訳領域（ＡＤＨ５’ＵＴＲ）を用いて発現させることにより、Ｓｔｘ２ｅタンパク質をレタス等の植物に効率良く生産させ、植物体に高濃度で蓄積させることができることを見い出し、特許出願を行っている（特許文献４）。
例えば、無毒化したＳｔｘ２ｅタンパク質を組換え大腸菌を用いて生産させ、注射によりブタに投与する技術が知られている（非特許文献１）。しかしながら、組換え大腸菌による、無毒化したＳｔｘ２ｅタンパク質の生産量は十分ではないという問題や注射によるワクチンの投与は、人間の労力がかかるなどの問題があった。
また、ワクチンを経口的に投与する方法については、労力軽減の観点から畜産分野で関心が高まっている。このような背景において、細菌毒素タンパク質を、トランスジェニック技術を用いて植物に生産させる技術の開発が行われている。例えば、ＬＴタンパク質のＢサブユニット（LTB）をコードするＤＮＡを含み、該ＤＮＡを発現するトランスジェニック植物について記載されている（特許文献１、特許文献２）。また、ＬＴタンパク質又はＣＴタンパク質をコードするＤＮＡを発現するトランスジェニック植物について記載されている（特許文献３）。しかしながら、これらの技術では、タンパク質の生産量が十分でないという問題があった。また、LTBをレタスに生産させた例が報告されている（非特許文献２）。この研究では、コドンを改変したＬＴタンパク質のＢサブユニットの遺伝子を、植物高発現プロモーターであるカリフラワーモザイクウイルス35S RNAプロモーター（CaMV35S）と、エンハンサーであるKozak配列を用いて、レタス内で発現させている。その結果、ＬＴタンパク質のＢサブユニットがレタスの総可溶性タンパク質の約２．０質量％蓄積したことが報告されている。しかしながら、この程度のタンパク質の蓄積量では、トランスジェニック植物を利用して細菌病の防除を効率的に行うには不十分であると考えられる。すなわち、目的の細菌毒素タンパク質を植物細胞内で効率良く生産、蓄積させる必要がある。
本発明者らは、植物由来の分泌シグナルペプチドがアミノ末端に付加されたＳｔｘ２ｅタンパク質を、植物由来のアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の５'−非翻訳領域（ＡＤＨ５’ＵＴＲ）を用いて発現させることにより、Ｓｔｘ２ｅタンパク質をレタス等の植物に効率良く生産させ、植物体に高濃度で蓄積させることができることを見い出し、特許出願を行っている（特許文献４）。
本発明は、Ｓｔｘタンパク質、及びこれに類似の高次構造を有する他の細菌毒素タンパク質を、植物細胞を用いて、より効率よく生産することを課題とする。
本発明者らは、Ｓｔｘ２ｅ、ＣＴ等の細菌毒素のタンパク質を特定の配列のペプチドを介して２つ又は３つタンデムに連結したハイブリッドタンパク質を、植物細胞に生産させた結果、細菌毒素のタンパク質を植物細胞内に高濃度に蓄積させることに成功し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は以下のとおりである。
すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１）２つ又は３つの、志賀毒素タンパク質、コレラ毒素タンパク質又は大腸菌易熱性毒素タンパク質が、それぞれ、下記の特徴（Ａ）及び（Ｂ）を有するペプチドを介してタンデムに連結された、ハイブリッドタンパク質、
（Ａ）アミノ酸の個数が１２〜３０個；
（Ｂ）プロリンの含有率が２０〜３５％。
（２）前記ペプチドが、さらに下記の特徴（Ｃ）を有する、（１）に記載のハイブリッドタンパク質、
（Ｃ）プロリンが、２アミノ酸置き、又は３アミノ酸置きに配置される。
（３）前記ペプチドが、配列番号２、８２又は８４で表されるアミノ酸配列からなる、（２）に記載のハイブリッドタンパク質。
（Ａ）アミノ酸の個数が１２〜３０個；
（Ｂ）プロリンの含有率が２０〜３５％。
（２）前記ペプチドが、さらに下記の特徴（Ｃ）を有する、（１）に記載のハイブリッドタンパク質、
（Ｃ）プロリンが、２アミノ酸置き、又は３アミノ酸置きに配置される。
（３）前記ペプチドが、配列番号２、８２又は８４で表されるアミノ酸配列からなる、（２）に記載のハイブリッドタンパク質。
（４）２つの、志賀毒素タンパク質、コレラ毒素タンパク質又は大腸菌易熱性毒素タンパク質が、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるペプチドを介してタンデムに連結された、（３）に記載のハイブリッドタンパク質。
（５）志賀毒素タンパク質が、志賀毒素タンパク質のＢサブユニットである、（１）〜（４）の何れかに記載のハイブリッドタンパク質。
（６）志賀毒素タンパク質が、Ｓｔｘ２ｅタンパク質である、（１）〜（５）の何れかに記載のハイブリッドタンパク質。
（７）コレラ毒素タンパク質が、コレラ毒素タンパク質のＢサブユニットである、（１）〜（４）の何れかに記載のハイブリッドタンパク質。
（８）配列番号１０、１２、１４又は１６で表されるアミノ酸配列を有する、（４）に記載のハイブリッドタンパク質。
（９）配列番号８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８又は１００で表されるアミノ酸配列を有する、（３）に記載のハイブリッドタンパク質。
（１０）アミノ末端に植物由来の分泌シグナルペプチドが付加された、（１）〜（９）の何れかに記載のハイブリッドタンパク質。
（１１）カルボキシル末端に小胞体残留シグナルペプチドが付加された、（１０）に記載のハイブリッドタンパク質。
（１２）アミノ末端に葉緑体移行シグナルペプチドが付加された、（１）〜（９）の何れかに記載のハイブリッドタンパク質。
（５）志賀毒素タンパク質が、志賀毒素タンパク質のＢサブユニットである、（１）〜（４）の何れかに記載のハイブリッドタンパク質。
（６）志賀毒素タンパク質が、Ｓｔｘ２ｅタンパク質である、（１）〜（５）の何れかに記載のハイブリッドタンパク質。
（７）コレラ毒素タンパク質が、コレラ毒素タンパク質のＢサブユニットである、（１）〜（４）の何れかに記載のハイブリッドタンパク質。
（８）配列番号１０、１２、１４又は１６で表されるアミノ酸配列を有する、（４）に記載のハイブリッドタンパク質。
（９）配列番号８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８又は１００で表されるアミノ酸配列を有する、（３）に記載のハイブリッドタンパク質。
（１０）アミノ末端に植物由来の分泌シグナルペプチドが付加された、（１）〜（９）の何れかに記載のハイブリッドタンパク質。
（１１）カルボキシル末端に小胞体残留シグナルペプチドが付加された、（１０）に記載のハイブリッドタンパク質。
（１２）アミノ末端に葉緑体移行シグナルペプチドが付加された、（１）〜（９）の何れかに記載のハイブリッドタンパク質。
（１３）（１）〜（１２）の何れかに記載のハイブリッドタンパク質をコードするＤＮＡを含むＤＮＡ構築物。
（１４）配列番号９、１１、１３又は１５で表される塩基配列を有するＤＮＡを含む（１３）に記載のＤＮＡ構築物。
（１５）配列番号８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７又は９９で表される塩基配列を有するＤＮＡを含む（１３）に記載のＤＮＡ構築物。
（１６）ハイブリッドタンパク質をコードするＤＮＡが、植物由来のアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の５’−非翻訳領域に発現可能に連結されている、（１３）〜（１５）の何れかに記載のＤＮＡ構築物。
（１７）前記植物由来のアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の５’−非翻訳領域がタバコ由来である、（１６）に記載のＤＮＡ構築物。
（１８）配列番号２４〜２９の何れかで表される塩基配列を有する（１７）に記載のＤＮＡ構築物。
（１９）配列番号１０１〜１１１の何れかで表される塩基配列を有する（１７）に記載のＤＮＡ構築物。
（１４）配列番号９、１１、１３又は１５で表される塩基配列を有するＤＮＡを含む（１３）に記載のＤＮＡ構築物。
（１５）配列番号８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７又は９９で表される塩基配列を有するＤＮＡを含む（１３）に記載のＤＮＡ構築物。
（１６）ハイブリッドタンパク質をコードするＤＮＡが、植物由来のアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の５’−非翻訳領域に発現可能に連結されている、（１３）〜（１５）の何れかに記載のＤＮＡ構築物。
（１７）前記植物由来のアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の５’−非翻訳領域がタバコ由来である、（１６）に記載のＤＮＡ構築物。
（１８）配列番号２４〜２９の何れかで表される塩基配列を有する（１７）に記載のＤＮＡ構築物。
（１９）配列番号１０１〜１１１の何れかで表される塩基配列を有する（１７）に記載のＤＮＡ構築物。
（２０）（１３）〜（１９）の何れかに記載のＤＮＡ構築物を含む組み換えベクター。
（２１）（２０）に記載の組み換えベクターで形質転換された形質転換体。
（２２）形質転換体が形質転換植物細胞又は形質転換植物である、（２１）に記載の形質転換体。
（２３）（２１）又は（２２）に記載の形質転換体から得られる種子。
（２４）配列番号２、８２又は８４で表されるアミノ酸配列からなるペプチド。
（２１）（２０）に記載の組み換えベクターで形質転換された形質転換体。
（２２）形質転換体が形質転換植物細胞又は形質転換植物である、（２１）に記載の形質転換体。
（２３）（２１）又は（２２）に記載の形質転換体から得られる種子。
（２４）配列番号２、８２又は８４で表されるアミノ酸配列からなるペプチド。
本発明のハイブリッドタンパク質は、２つ又は３つの、志賀毒素（Ｓｔｘ）タンパク質、コレラ毒素（ＣＴ）タンパク質又は大腸菌易熱性毒素（ＬＴ）タンパク質が、それぞれ、下記の特徴（Ａ）及び（Ｂ）を有するペプチドを介してタンデムに連結されている。
（Ａ）アミノ酸の個数が１２〜３０個；
（Ｂ）プロリンの含有率が２０〜３５％。
（Ａ）アミノ酸の個数が１２〜３０個；
（Ｂ）プロリンの含有率が２０〜３５％。
志賀毒素（Ｓｔｘ）は、１型（Ｓｔｘ１）及び２型（Ｓｔｘ２）に分けられる。Ｓｔｘ１は、ａ〜ｄのサブクラスに、Ｓｔｘ２はａ〜ｇのサブクラスにそれぞれ分類される。志賀毒素タンパク質は、毒性本体である１つのＡサブユニットと腸管粘膜への侵入へ関与する５つのＢサブユニットからなる。
このうち、例えば、Ｓｔｘ２ｅはブタ浮腫病毒素として知られており、そのＡサブユニット（Ｓｔｘ２ｅＡ）は配列番号４のアミノ酸配列で表され、Ｂサブユニット（Ｓｔｘ２ｅＢ）は配列番号６のアミノ酸配列で表される。
Ｓｔｘ２ｅＡ及びＳｔｘ２ｅＢは、ブタに投与して免疫応答を引き起こすことができる限り、それぞれ、配列番号４又は配列番号６で表されるアミノ酸配列における１個又は数個のアミノ酸が、置換、欠失、挿入又は付加されていてもよい。前記「数個」としては、例えば、Ｓｔｘ２ｅＡにおいて、好ましくは２〜３０個、さらに好ましくは２〜２０個、より好ましくは２〜１０個であり、Ｓｔｘ２ｅＢにおいて、好ましくは２〜１０個、さらに好ましくは２〜５個、より好ましくは２〜３個である。
また、Ｓｔｘ２ｅＡ及びＳｔｘ２ｅＢは、それぞれ、配列番号４又は配列番号６で表されるアミノ酸配列と、好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の同一性を有し、かつブタに投与して免疫応答を引き起こすことができるものであってもよい。
このうち、例えば、Ｓｔｘ２ｅはブタ浮腫病毒素として知られており、そのＡサブユニット（Ｓｔｘ２ｅＡ）は配列番号４のアミノ酸配列で表され、Ｂサブユニット（Ｓｔｘ２ｅＢ）は配列番号６のアミノ酸配列で表される。
Ｓｔｘ２ｅＡ及びＳｔｘ２ｅＢは、ブタに投与して免疫応答を引き起こすことができる限り、それぞれ、配列番号４又は配列番号６で表されるアミノ酸配列における１個又は数個のアミノ酸が、置換、欠失、挿入又は付加されていてもよい。前記「数個」としては、例えば、Ｓｔｘ２ｅＡにおいて、好ましくは２〜３０個、さらに好ましくは２〜２０個、より好ましくは２〜１０個であり、Ｓｔｘ２ｅＢにおいて、好ましくは２〜１０個、さらに好ましくは２〜５個、より好ましくは２〜３個である。
また、Ｓｔｘ２ｅＡ及びＳｔｘ２ｅＢは、それぞれ、配列番号４又は配列番号６で表されるアミノ酸配列と、好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の同一性を有し、かつブタに投与して免疫応答を引き起こすことができるものであってもよい。
コレラ毒素（ＣＴ）タンパク質は、毒性本体である１つのＡサブユニット（ＣＴＡ）と、配列番号８のアミノ酸配列で表される腸管粘膜への侵入へ関与する５つのＢサブユニット（ＣＴＢ）からなる。
ＣＴＢは、動物に投与して免疫応答を引き起こすことができる限り、配列番号８で表されるアミノ酸配列における１個又は数個のアミノ酸が、置換、欠失、挿入又は付加されていてもよい。前記「数個」としては、好ましくは２〜１０個、さらに好ましくは２〜５個、より好ましくは２〜３個である。
また、ＣＴＢは、配列番号８で表されるアミノ酸配列と、好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の同一性を有し、かつ動物に投与して免疫応答を引き起こすことができるものであってもよい。
ＣＴＢは、動物に投与して免疫応答を引き起こすことができる限り、配列番号８で表されるアミノ酸配列における１個又は数個のアミノ酸が、置換、欠失、挿入又は付加されていてもよい。前記「数個」としては、好ましくは２〜１０個、さらに好ましくは２〜５個、より好ましくは２〜３個である。
また、ＣＴＢは、配列番号８で表されるアミノ酸配列と、好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の同一性を有し、かつ動物に投与して免疫応答を引き起こすことができるものであってもよい。
大腸菌易熱性毒素（ＬＴ）タンパク質は、毒性本体である１つのＡサブユニットと腸管粘膜への侵入へ関与する５つのサブユニットからなる。
本明細書では、志賀毒素、コレラ毒素、大腸菌易熱性毒素を、まとめて「細菌毒素」ともいう。
本明細書では、志賀毒素、コレラ毒素、大腸菌易熱性毒素を、まとめて「細菌毒素」ともいう。
前記ペプチドのアミノ酸の個数は、好ましくは１２〜２５個、さらに好ましくは１２〜２２個である。また、前記ペプチドのプロリンの含有率は、好ましくは、２０〜２７％、さらに好ましくは、２０〜２５％である。
また、前記ペプチドにおいて、プロリンは、好ましくは２つ置き、又は３つ置きに配置される。但し、この場合でも、ペプチドの末端においては、プロリン以外のアミノ酸が、５つ以内、好ましくは４つ以内の範囲で連続していてもよい。
また、前記ペプチドにおいて、プロリンは、好ましくは２つ置き、又は３つ置きに配置される。但し、この場合でも、ペプチドの末端においては、プロリン以外のアミノ酸が、５つ以内、好ましくは４つ以内の範囲で連続していてもよい。
また、前記ペプチドにおいては、プロリン以外のアミノ酸のうち、セリン、グリシン、アルギニン、リジン、スレオニン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン及びアスパラギン酸の合計含有率は、好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上である。また、前記ペプチドにおいては、プロリン以外のアミノ酸のうち、セリン、グリシン及びアスパラギンの合計含有率は、好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上である。また、前記ペプチドにおいては、プロリン以外のアミノ酸のうち、セリン及びグリシンの合計含有率は、好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上である。これは、これらのアミノ酸を多く含むペプチドは、二次構造（ベータシート構造やヘリックス構造）をとりにくいためである。
一方、前記ペプチドにおいては、プロリン以外のアミノ酸のうち、アラニン、メチオニン及びグルタミン酸の合計含有率は、好ましくは３０％以下、さらに好ましくは２０％以下、より好ましくは１０％以下である。これは、これらのアミノ酸を多く含むペプチドは、ヘリックス構造をとりやすいためである。また、前記ペプチドにおいては、プロリン以外のアミノ酸のうち、トリプトファン、ロイシン、イソロインシン、チロシン、フェニルアラニン及びバリンの合計含有率は、好ましくは２０％以下、さらに好ましくは１０％以下、より好ましくは５％以下である。これは、これらのアミノ酸を多く含むペプチドは、ベータシート構造及びヘリックス構造をとりやすいためである。
前記ペプチドは、好ましくは、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるペプチド（ＰＧ１２）、配列番号８２で表されるアミノ酸配列からなるペプチド（ＰＧ１７）、又は、配列番号８４で表されるアミノ酸配列からなるペプチド（ＰＧ２２）から選ばれる。
一方、前記ペプチドにおいては、プロリン以外のアミノ酸のうち、アラニン、メチオニン及びグルタミン酸の合計含有率は、好ましくは３０％以下、さらに好ましくは２０％以下、より好ましくは１０％以下である。これは、これらのアミノ酸を多く含むペプチドは、ヘリックス構造をとりやすいためである。また、前記ペプチドにおいては、プロリン以外のアミノ酸のうち、トリプトファン、ロイシン、イソロインシン、チロシン、フェニルアラニン及びバリンの合計含有率は、好ましくは２０％以下、さらに好ましくは１０％以下、より好ましくは５％以下である。これは、これらのアミノ酸を多く含むペプチドは、ベータシート構造及びヘリックス構造をとりやすいためである。
前記ペプチドは、好ましくは、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるペプチド（ＰＧ１２）、配列番号８２で表されるアミノ酸配列からなるペプチド（ＰＧ１７）、又は、配列番号８４で表されるアミノ酸配列からなるペプチド（ＰＧ２２）から選ばれる。
本発明のハイブリッドタンパク質は、２つ又は３つの、ＡサブユニットとＢサブユニットのハイブリッドタンパク質が、前記ペプチドを介してタンデムに連結されていてもよいし、２つ又は３つのＡサブユニットが、前記ペプチドを介してタンデムに連結されていてもよいし、２つ又は３つのＢサブユニットが、前記ペプチドを介してタンデムに連結されていてもよい。ただし、本発明のハイブリッドタンパク質が、Ａサブユニットを含む場合には、Ａサブユニットは無毒化されていることが好ましい。本発明のハイブリッドタンパク質は、２つ又は３つのＢサブユニットが、前記ペプチドを介してタンデムに連結されていることが好ましい。また、本発明のハイブリッドタンパク質は、２つのＢサブユニットが、ＰＧ１２を介してタンデムに連結されていることが好ましい。
また、本発明のハイブリッドタンパク質は、さらにそのＣ末端に前記ペプチドが付加されていることが好ましい。特に、本発明のハイブリッドタンパク質は、そのＣ末端にＰＧ１２が付加されていることが好ましい。
本発明のハイブリッドタンパク質は、例えば、配列番号１０、１２、１４、１６、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８又は１００で表されるアミノ酸配列を有する。配列番号１０で表されるアミノ酸配列を有するハイブリッドタンパク質は、２つのＳｔｘ２ｅＢが、ＰＧ１２を介してタンデムに連結されている。配列番号１２で表されるアミノ酸配列を有するハイブリッドタンパク質は、２つのＣＴＢが、ＰＧ１２を介してタンデムに連結されている。配列番号１４で表されるアミノ酸配列を有するハイブリッドタンパク質は、２つのＳｔｘ２ｅＢが、ＰＧ１２を介してタンデムに連結され、さらにそのＣ末端にＰＧ１２が連結されている。配列番号１６で表されるアミノ酸配列を有するハイブリッドタンパク質は、２つのＣＴＢが、ＰＧ１２を介してタンデムに連結され、さらにそのＣ末端にＰＧ１２が連結されている。配列番号８６で表されるアミノ酸配列を有するハイブリッドタンパク質は、３つのＳｔｘ２ｅＢが、それぞれ、ＰＧ１２を介してタンデムに連結されている。配列番号８８で表されるアミノ酸配列を有するハイブリッドタンパク質は、３つのＳｔｘ２ｅＢが、それぞれ、ＰＧ１２を介してタンデムに連結され、さらにそのＣ末端にＰＧ１２が連結されている。配列番号９０で表されるアミノ酸配列を有するハイブリッドタンパク質は、２つのＳｔｘ２ｅＢが、ＰＧ１７を介してタンデムに連結され、さらにそのＣ末端にＰＧ１２が連結されている。配列番号９２で表されるアミノ酸配列を有するハイブリッドタンパク質は、２つのＳｔｘ２ｅＢが、ＰＧ２２を介してタンデムに連結され、さらにそのＣ末端にＰＧ１２が連結されている。配列番号９４で表されるアミノ酸配列を有するハイブリッドタンパク質は、３つのＣＴＢが、それぞれ、ＰＧ１２を介してタンデムに連結されている。配列番号９６で表されるアミノ酸配列を有するハイブリッドタンパク質は、３つのＣＴＢが、それぞれ、ＰＧ１２を介してタンデムに連結され、さらにそのＣ末端にＰＧ１２が連結されている。配列番号９８で表されるアミノ酸配列を有するハイブリッドタンパク質は、２つのＣＴＢが、ＰＧ１７を介してタンデムに連結され、さらにそのＣ末端にＰＧ１２が連結されている。配列番号１００で表されるアミノ酸配列を有するハイブリッドタンパク質は、２つのＣＴＢが、ＰＧ２２を介してタンデムに連結され、さらにそのＣ末端にＰＧ１２が連結されている。
前記ＰＧ１２、ＰＧ１７又はＰＧ２２などのペプチドを、前記細菌毒素タンパク質を連結するためのリンカーとして使用することにより、該細菌毒素タンパク質の植物細胞への蓄積レベルが増大する。
また、本発明のハイブリッドタンパク質は、さらにそのＣ末端に前記ペプチドが付加されていることが好ましい。特に、本発明のハイブリッドタンパク質は、そのＣ末端にＰＧ１２が付加されていることが好ましい。
本発明のハイブリッドタンパク質は、例えば、配列番号１０、１２、１４、１６、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８又は１００で表されるアミノ酸配列を有する。配列番号１０で表されるアミノ酸配列を有するハイブリッドタンパク質は、２つのＳｔｘ２ｅＢが、ＰＧ１２を介してタンデムに連結されている。配列番号１２で表されるアミノ酸配列を有するハイブリッドタンパク質は、２つのＣＴＢが、ＰＧ１２を介してタンデムに連結されている。配列番号１４で表されるアミノ酸配列を有するハイブリッドタンパク質は、２つのＳｔｘ２ｅＢが、ＰＧ１２を介してタンデムに連結され、さらにそのＣ末端にＰＧ１２が連結されている。配列番号１６で表されるアミノ酸配列を有するハイブリッドタンパク質は、２つのＣＴＢが、ＰＧ１２を介してタンデムに連結され、さらにそのＣ末端にＰＧ１２が連結されている。配列番号８６で表されるアミノ酸配列を有するハイブリッドタンパク質は、３つのＳｔｘ２ｅＢが、それぞれ、ＰＧ１２を介してタンデムに連結されている。配列番号８８で表されるアミノ酸配列を有するハイブリッドタンパク質は、３つのＳｔｘ２ｅＢが、それぞれ、ＰＧ１２を介してタンデムに連結され、さらにそのＣ末端にＰＧ１２が連結されている。配列番号９０で表されるアミノ酸配列を有するハイブリッドタンパク質は、２つのＳｔｘ２ｅＢが、ＰＧ１７を介してタンデムに連結され、さらにそのＣ末端にＰＧ１２が連結されている。配列番号９２で表されるアミノ酸配列を有するハイブリッドタンパク質は、２つのＳｔｘ２ｅＢが、ＰＧ２２を介してタンデムに連結され、さらにそのＣ末端にＰＧ１２が連結されている。配列番号９４で表されるアミノ酸配列を有するハイブリッドタンパク質は、３つのＣＴＢが、それぞれ、ＰＧ１２を介してタンデムに連結されている。配列番号９６で表されるアミノ酸配列を有するハイブリッドタンパク質は、３つのＣＴＢが、それぞれ、ＰＧ１２を介してタンデムに連結され、さらにそのＣ末端にＰＧ１２が連結されている。配列番号９８で表されるアミノ酸配列を有するハイブリッドタンパク質は、２つのＣＴＢが、ＰＧ１７を介してタンデムに連結され、さらにそのＣ末端にＰＧ１２が連結されている。配列番号１００で表されるアミノ酸配列を有するハイブリッドタンパク質は、２つのＣＴＢが、ＰＧ２２を介してタンデムに連結され、さらにそのＣ末端にＰＧ１２が連結されている。
前記ＰＧ１２、ＰＧ１７又はＰＧ２２などのペプチドを、前記細菌毒素タンパク質を連結するためのリンカーとして使用することにより、該細菌毒素タンパク質の植物細胞への蓄積レベルが増大する。
本発明のハイブリッドタンパク質は、好ましくは、そのアミノ末端に植物由来の分泌シグナルペプチド、又は葉緑体移行シグナルペプチドが付加されている。ここで、「付加」とは、前記分泌シグナルペプチドが、前記ペプチドを介して連結した２つ又は３つの前記細菌毒素タンパク質のアミノ末端に、直接結合している場合も、他のペプチドを介して結合している場合も含む概念である。
分泌シグナルペプチドは、好ましくはナス科（Solanaceae）、アブラナ科（Brassicaceae）、キク科(Asteraceae)に属する植物、さらに好ましくはタバコ属（Nicotiana）、シロイヌナズナ属（Arabidopsis）、アキノノゲシ属(Lactuca)等に属する植物、より好ましくはタバコ(Nicotiana tabacum)、シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)、レタス(Lactuca sativa)等に由来する。
また、好ましくはタバコのβ−Ｄグルカンエキソヒドロラーゼ（β-D-glucan exohydrolase）、タバコの38kDa ペルオキシダーゼ(GenBank Accession D42064)に由来する。
前記分泌シグナルペプチドとしては、例えば、タバコのβ−Ｄグルカンエキソヒドロラーゼに由来する、配列番号１８で表されるアミノ酸配列を有しているペプチドが挙げられる。
葉緑体移行シグナルペプチドとしては、例えば、レタスRbcs（ルビスコスモールサブユニット）(GenBank ACCESSION D14001)由来葉緑体移行シグナルペプチド（トランジットペプチド、T.P.、配列番号７９）が挙げられる。また、レタスRbcs由来葉緑体移行シグナルペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列は、例えば配列番号８０で表される。本明細書において、アミノ末端に葉緑体移行シグナルペプチドが付加されたハイブリッドタンパク質を、葉緑体型（Chl）のハイブリッドタンパク質ともいい、該葉緑体型のハイブリッドタンパク質をコードするＤＮＡ構築物を、葉緑体型のＤＮＡ構築物ともいう。葉緑体型のハイブリッドタンパク質は、特にタバコなどの葉緑体が発達している植物に効率良く蓄積する。
また、アミノ末端に、分泌シグナルペプチドも葉緑体移行シグナルペプチドも付加されていないハイブリッドタンパク質を、細胞質型（Cyt）のハイブリッドタンパク質ともいい、該細胞質型のハイブリッドタンパク質をコードするＤＮＡ構築物を、細胞質型のＤＮＡ構築物ともいう。細胞質型のハイブリッドタンパク質においては、特に、３つの細菌毒素のＢサブユニットが、前記ペプチドを介してタンデムに連結されていることが好ましい。
分泌シグナルペプチドは、好ましくはナス科（Solanaceae）、アブラナ科（Brassicaceae）、キク科(Asteraceae)に属する植物、さらに好ましくはタバコ属（Nicotiana）、シロイヌナズナ属（Arabidopsis）、アキノノゲシ属(Lactuca)等に属する植物、より好ましくはタバコ(Nicotiana tabacum)、シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)、レタス(Lactuca sativa)等に由来する。
また、好ましくはタバコのβ−Ｄグルカンエキソヒドロラーゼ（β-D-glucan exohydrolase）、タバコの38kDa ペルオキシダーゼ(GenBank Accession D42064)に由来する。
前記分泌シグナルペプチドとしては、例えば、タバコのβ−Ｄグルカンエキソヒドロラーゼに由来する、配列番号１８で表されるアミノ酸配列を有しているペプチドが挙げられる。
葉緑体移行シグナルペプチドとしては、例えば、レタスRbcs（ルビスコスモールサブユニット）(GenBank ACCESSION D14001)由来葉緑体移行シグナルペプチド（トランジットペプチド、T.P.、配列番号７９）が挙げられる。また、レタスRbcs由来葉緑体移行シグナルペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列は、例えば配列番号８０で表される。本明細書において、アミノ末端に葉緑体移行シグナルペプチドが付加されたハイブリッドタンパク質を、葉緑体型（Chl）のハイブリッドタンパク質ともいい、該葉緑体型のハイブリッドタンパク質をコードするＤＮＡ構築物を、葉緑体型のＤＮＡ構築物ともいう。葉緑体型のハイブリッドタンパク質は、特にタバコなどの葉緑体が発達している植物に効率良く蓄積する。
また、アミノ末端に、分泌シグナルペプチドも葉緑体移行シグナルペプチドも付加されていないハイブリッドタンパク質を、細胞質型（Cyt）のハイブリッドタンパク質ともいい、該細胞質型のハイブリッドタンパク質をコードするＤＮＡ構築物を、細胞質型のＤＮＡ構築物ともいう。細胞質型のハイブリッドタンパク質においては、特に、３つの細菌毒素のＢサブユニットが、前記ペプチドを介してタンデムに連結されていることが好ましい。
さらに、本発明のハイブリッドタンパク質は、そのカルボキシル末端に、小胞体残留シグナルペプチド、液胞移行シグナルペプチド等のシグナルペプチドが付加されていてもよい。ここで、「付加」とは、シグナルペプチドが、前記ハイブリッドタンパク質のカルボキシル末端に、直接結合している場合も、他のペプチドを介して結合している場合も含む概念である。本明細書において、アミノ末端に分泌シグナルペプチドが付加され、かつカルボキシル末端に小胞体残留シグナルペプチドが付加されたハイブリッドタンパク質を、小胞体型（ER）のハイブリッドタンパク質ともいい、該小胞体型のハイブリッドタンパク質をコードするＤＮＡ構築物を、小胞体型のＤＮＡ構築物ともいう。小胞体型のハイブリッドタンパク質は、特にレタスなどに効率良く蓄積する。
本発明のハイブリッドタンパク質は、そのカルボキシル末端に、好ましくは、小胞体残留シグナルペプチドが付加されている。小胞体残留シグナルペプチドとしてはＫＤＥＬ配列（配列番号１９）、ＨＤＥＬ配列（配列番号２０）、ＫＤＥＦ配列（配列番号２１）又はＨＤＥＦ配列（配列番号２２）を含む小胞体残留シグナルペプチドが挙げられる。
本発明のハイブリッドタンパク質は、そのカルボキシル末端に、好ましくは、小胞体残留シグナルペプチドが付加されている。小胞体残留シグナルペプチドとしてはＫＤＥＬ配列（配列番号１９）、ＨＤＥＬ配列（配列番号２０）、ＫＤＥＦ配列（配列番号２１）又はＨＤＥＦ配列（配列番号２２）を含む小胞体残留シグナルペプチドが挙げられる。
液胞移行シグナルペプチドとしては、好ましくはナス科（Solanaceae）、アブラナ科（Brassicaceae）、キク科（Asteraceae）に属する植物、さらに好ましくはタバコ属（Nicotiana）、シロイヌナズナ属（Arabidopsis）、セイヨウワサビ属（Armoracia）等に属する植物、より好ましくはタバコ（Nicotiana tabacum）、シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)、セイヨウワサビ(Armoracia rusticana)等に由来する。また、好ましくは、キチナーゼに由来する。タバコキチナーゼ由来の液胞移行シグナルペプチドのアミノ酸配列は、配列番号７６で表される。また、タバコキチナーゼ由来の液胞移行シグナルペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列は、例えば配列番号７５で表される。
また、好ましくは、セイヨウワサビペルオキシダーゼC1a アイソザイムに由来する。セイヨウワサビペルオキシダーゼC1a アイソザイム由来の液胞移行シグナルペプチドのアミノ酸配列は、配列番号７８で表される。また、セイヨウワサビペルオキシダーゼC1a アイソザイム由来の液胞移行シグナルペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列は、例えば配列番号７７で表される。本明細書において、アミノ末端に分泌シグナルペプチドが付加され、かつカルボキシル末端に液胞移行シグナルペプチドが付加されたハイブリッドタンパク質を、液胞型（Vac）のハイブリッドタンパク質ともいい、該液胞型のハイブリッドタンパク質をコードするＤＮＡ構築物を、液胞型のＤＮＡ構築物ともいう。
また、好ましくは、セイヨウワサビペルオキシダーゼC1a アイソザイムに由来する。セイヨウワサビペルオキシダーゼC1a アイソザイム由来の液胞移行シグナルペプチドのアミノ酸配列は、配列番号７８で表される。また、セイヨウワサビペルオキシダーゼC1a アイソザイム由来の液胞移行シグナルペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列は、例えば配列番号７７で表される。本明細書において、アミノ末端に分泌シグナルペプチドが付加され、かつカルボキシル末端に液胞移行シグナルペプチドが付加されたハイブリッドタンパク質を、液胞型（Vac）のハイブリッドタンパク質ともいい、該液胞型のハイブリッドタンパク質をコードするＤＮＡ構築物を、液胞型のＤＮＡ構築物ともいう。
本発明のハイブリッドタンパク質は、化学的に合成することもできるし、遺伝子工学的に生産することもできる。遺伝子工学的に生産する方法については、後述する。
本発明のＤＮＡ構築物は、本発明のハイブリッドタンパク質をコードするＤＮＡを含むことを特徴とする。
すなわち、本発明のＤＮＡ構築物は、２つ又は３つの細菌毒素タンパク質をコードするＤＮＡが、前記ペプチドをコードするＤＮＡを介してタンデムに連結されているＤＮＡを含む。前記ペプチドをコードするＤＮＡは、例えば配列番号１（ＰＧ１２）、配列番号８１（ＰＧ１７）、配列番号８３（ＰＧ２２）で表される。細菌毒素タンパク質をコードするＤＮＡとして、例えばＳｔｘ２ｅＡをコードするＤＮＡ（配列番号３）、Ｓｔｘ２ｅＢをコードするＤＮＡ（配列番号５）やＣＴＢをコードするＤＮＡ（配列番号７）が挙げられる。前記ペプチドをコードするＤＮＡと細菌毒素タンパク質をコードするＤＮＡは、終止コドンを除いて読み枠を合わせて連結される。
すなわち、本発明のＤＮＡ構築物は、２つ又は３つの細菌毒素タンパク質をコードするＤＮＡが、前記ペプチドをコードするＤＮＡを介してタンデムに連結されているＤＮＡを含む。前記ペプチドをコードするＤＮＡは、例えば配列番号１（ＰＧ１２）、配列番号８１（ＰＧ１７）、配列番号８３（ＰＧ２２）で表される。細菌毒素タンパク質をコードするＤＮＡとして、例えばＳｔｘ２ｅＡをコードするＤＮＡ（配列番号３）、Ｓｔｘ２ｅＢをコードするＤＮＡ（配列番号５）やＣＴＢをコードするＤＮＡ（配列番号７）が挙げられる。前記ペプチドをコードするＤＮＡと細菌毒素タンパク質をコードするＤＮＡは、終止コドンを除いて読み枠を合わせて連結される。
細菌毒素タンパク質をコードするＤＮＡは、例えば、配列番号３、５、７の塩基配列に基づいて、一般的な遺伝子工学的な手法により得ることができる。具体的には、各細菌毒素を生産する細菌より、常法に従ってｃＤＮＡライブラリーを調製し、該ライブラリーから上記塩基配列に基づいて作製したプローブを用いて所望のクローンを選択する。また、上記塩基配列を基にした化学合成、上記塩基配列の５’及び３’末端の塩基配列をプライマーとし、ゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲなどにより合成することもできる。
本発明のハイブリッドタンパク質をコードするＤＮＡは、例えば、配列番号９、１１、１３、１５、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７又は９９で表される。
本発明のハイブリッドタンパク質をコードするＤＮＡは、例えば、配列番号９、１１、１３、１５、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７又は９９で表される。
ハイブリッドタンパク質をコードするＤＮＡは、該タンパク質を生産させる宿主細胞に応じて、ハイブリッドタンパク質の翻訳量が増大するように、ハイブリッドタンパク質を構成するアミノ酸を示すコドンが適宜改変されていることも好ましい。
コドン改変の方法としては、例えばKang et al. (2004)の方法を参考にすることができる。また、宿主細胞において使用頻度の高いコドンを選択したり、GC含量が高いコドンを選択したり、宿主細胞のハウスキーピング遺伝子において使用頻度の高いコドンを選択したりする方法が挙げられる。
コドン改変の方法としては、例えばKang et al. (2004)の方法を参考にすることができる。また、宿主細胞において使用頻度の高いコドンを選択したり、GC含量が高いコドンを選択したり、宿主細胞のハウスキーピング遺伝子において使用頻度の高いコドンを選択したりする方法が挙げられる。
また、ハイブリッドタンパク質をコードするＤＮＡは、配列番号９、１１、１３、１５、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７又は９９の塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであってもよい。「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。例えば、同一性が高い二つのＤＮＡどうし、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上の同一性を有する２つのＤＮＡがハイブリダイズするが、それより同一性の低い２つのＤＮＡがハイブリダイズしない条件が挙げられる。例えば２×ＳＳＣ（３３０ｍＭ ＮａＣｌ、３０ｍＭ クエン酸）、４２℃が挙げられ、好ましくは０．１×ＳＳＣ（３３０ｍＭ ＮａＣｌ、３０ｍＭ クエン酸）、６０℃が挙げられる。
本発明のＤＮＡ構築物において、好ましくは、前記ハイブリッドタンパク質をコードするＤＮＡが、エンハンサーに発現可能に連結されている。ここで、「発現可能」とは、本発明のＤＮＡ構築物が適切なプロモーターを含むベクターに挿入され、該ベクターが適切な宿主細胞に導入された場合に、宿主細胞内で前記ハイブリッドタンパク質が生産されることをいう。また、「連結」とは、２つのＤＮＡが直接結合している場合も、他の塩基配列を介して結合している場合も含む概念である。
エンハンサーとしては、Ｋｏｚａｋ配列や植物由来のアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の５’−非翻訳領域が挙げられる。特に好ましくは、前記ハイブリッドタンパク質をコードするＤＮＡが、植物由来のアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の５’−非翻訳領域に発現可能に連結されている。
エンハンサーとしては、Ｋｏｚａｋ配列や植物由来のアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の５’−非翻訳領域が挙げられる。特に好ましくは、前記ハイブリッドタンパク質をコードするＤＮＡが、植物由来のアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の５’−非翻訳領域に発現可能に連結されている。
アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の５’−非翻訳領域とは、アルコールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の転写開始点から、翻訳開始点（ＡＴＧ、メチオニン）の前までの塩基配列を含む領域をいう。該領域は、翻訳量増大機能を有している。「翻訳量増大機能」とは、構造遺伝子にコードされた情報が、転写後、翻訳されてタンパク質が産生される際に、翻訳により産生されるタンパク質量を増大させる機能をいう。前記領域は、植物に由来すればよいが、好ましくはナス科（Solanaceae）、アブラナ科（Brassicaceae）、キク科(Asteraceae)に属する植物、さらに好ましくはタバコ属（Nicotiana）、シロイヌナズナ属（Arabidopsis）、アキノノゲシ属(Lactuca)等に属する植物、より好ましくはタバコ(Nicotiana tabacum)、シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)、レタス(Lactuca sativa)等に由来する。
前記アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の５’−非翻訳領域としては、例えばタバコ（Nicotiana tabacum）由来のアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の５’−非翻訳領域（NtADH5'UTR）である、配列番号２３で表される塩基配列からなる領域が特に好ましい。
前記アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の５’−非翻訳領域としては、例えばタバコ（Nicotiana tabacum）由来のアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の５’−非翻訳領域（NtADH5'UTR）である、配列番号２３で表される塩基配列からなる領域が特に好ましい。
植物由来のアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の５’−非翻訳領域は、例えば、アルコールデヒドロゲナーゼを高発現している植物培養細胞のアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子から単離することができる（特開２００３−７９３７２号公報参照）。また、タバコのアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の５’−非翻訳領域等、その塩基配列が確定しているものについては、化学合成、又は該領域の５’及び３’末端の塩基配列をプライマーとし、ゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲなどにより合成することもできる。また、塩基配列が確定している前記領域の一部をプローブとして用いることにより、他の植物のアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の５’−非翻訳領域を探索し、これを単離することもできる。
また、配列番号２３の塩基配列で表されるような前記アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の５’−非翻訳領域は、翻訳量増大機能を保持している限り、１又は数個の塩基の置換、欠失、挿入又は付加を有していてもよい。前記「数個」としては、好ましくは２〜１０個、さらに好ましくは２〜５個、特に好ましくは２〜３個である。
また、前記アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の５’−非翻訳領域と好ましくは８５％以上、特に好ましくは９０％以上の同一性を有し、かつ翻訳量増大機能を保持しているＤＮＡを使用してもよい。
また、前記アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の５’−非翻訳領域と好ましくは８５％以上、特に好ましくは９０％以上の同一性を有し、かつ翻訳量増大機能を保持しているＤＮＡを使用してもよい。
前記領域が目的とする翻訳量増大機能を有するか否かについては、例えばタバコ培養細胞においてＧＵＳ（β−グルクロニダーゼ）遺伝子又はルシフェラーゼ遺伝子をレポーター遺伝子としたトランジェントアッセイ、染色体に組み込ませた形質転換細胞でのアッセイ等により確認することができる。
本発明のＤＮＡ構築物は、例えば、配列番号２４〜２９、配列番号１０１〜１１１の何れかで表される塩基配列を有する。
配列番号２４で表される塩基配列を有するＤＮＡ構築物は、タバコ由来のアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の５’−非翻訳領域（NtADH5'UTR、配列番号２３）に、２つのＳｔｘ２ｅＢタンパク質を、ＰＧ１２を介してタンデムに連結したハイブリッドタンパク質をコードするＤＮＡ（配列番号９）を連結したＤＮＡ構築物である。また、配列番号２５で表される塩基配列を有するＤＮＡ構築物は、NtADH5'UTRに、２つのCTBタンパク質を、ＰＧ１２を介してタンデムに連結したハイブリッドタンパク質をコードするＤＮＡ（配列番号１１）を連結したＤＮＡ構築物である。
配列番号２４で表される塩基配列を有するＤＮＡ構築物は、タバコ由来のアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の５’−非翻訳領域（NtADH5'UTR、配列番号２３）に、２つのＳｔｘ２ｅＢタンパク質を、ＰＧ１２を介してタンデムに連結したハイブリッドタンパク質をコードするＤＮＡ（配列番号９）を連結したＤＮＡ構築物である。また、配列番号２５で表される塩基配列を有するＤＮＡ構築物は、NtADH5'UTRに、２つのCTBタンパク質を、ＰＧ１２を介してタンデムに連結したハイブリッドタンパク質をコードするＤＮＡ（配列番号１１）を連結したＤＮＡ構築物である。
配列番号２６で表される塩基配列を有するＤＮＡ構築物は、NtADH5'UTRに、２つのＳｔｘ２ｅＢタンパク質を、ＰＧ１２を介してタンデムに連結し、アミノ末端に分泌シグナルペプチドを、カルボキシル末端に小胞体残留シグナルペプチドを付加したハイブリッドタンパク質をコードするＤＮＡを連結したＤＮＡ構築物である。また、配列番号２７で表される塩基配列を有するＤＮＡ構築物は、NtADH5'UTRに、２つのCTBタンパク質を、ＰＧ１２を介してタンデムに連結し、アミノ末端に分泌シグナルペプチドを、カルボキシル末端に小胞体残留シグナルペプチドを付加したハイブリッドタンパク質をコードするＤＮＡを連結したＤＮＡ構築物である。
配列番号２８で表される塩基配列を有するＤＮＡ構築物は、NtADH5'UTRに、２つのＳｔｘ２ｅＢタンパク質を、ＰＧ１２を介してタンデムに連結し、アミノ末端に分泌シグナルペプチドを付加し、カルボキシル末端にＰＧ１２を連結し、さらにそのカルボキシル末端に小胞体残留シグナルペプチドを付加したハイブリッドタンパク質をコードするＤＮＡを連結したＤＮＡ構築物である。また、配列番号２９で表される塩基配列を有するＤＮＡ構築物は、NtADH5'UTRに、２つのCTBタンパク質を、ＰＧ１２を介してタンデムに連結し、アミノ末端に分泌シグナルペプチドを付加し、カルボキシル末端にＰＧ１２を連結し、さらにそのカルボキシル末端に小胞体残留シグナルペプチドを付加したハイブリッドタンパク質をコードするＤＮＡを連結したＤＮＡ構築物である。
配列番号１０１で表される塩基配列を有するＤＮＡ構築物は、NtADH5'UTRに、２つのＳｔｘ２ｅＢタンパク質を、ＰＧ１２を介してタンデムに連結し、カルボキシル末端にＰＧ１２を連結したハイブリッドタンパク質をコードするＤＮＡを連結したＤＮＡ構築物である。
配列番号１０２で表される塩基配列を有するＤＮＡ構築物は、NtADH5'UTRに、２つのＳｔｘ２ｅＢタンパク質を、ＰＧ１７を介してタンデムに連結し、アミノ末端に分泌シグナルペプチドを付加し、カルボキシル末端にＰＧ１２を連結し、さらにそのカルボキシル末端に小胞体残留シグナルペプチドを付加したハイブリッドタンパク質をコードするＤＮＡを連結したＤＮＡ構築物である。また、配列番号１０３で表される塩基配列を有するＤＮＡ構築物は、NtADH5'UTRに、２つのＳｔｘ２ｅＢタンパク質を、ＰＧ２２を介してタンデムに連結し、アミノ末端に分泌シグナルペプチドを付加し、カルボキシル末端にＰＧ１２を連結し、さらにそのカルボキシル末端に小胞体残留シグナルペプチドを付加したハイブリッドタンパク質をコードするＤＮＡを連結したＤＮＡ構築物である。
配列番号１０４で表される塩基配列を有するＤＮＡ構築物は、NtADH5'UTRに、２つのＳｔｘ２ｅＢタンパク質を、ＰＧ１２を介してタンデムに連結し、アミノ末端に葉緑体移行シグナルペプチドを付加し、カルボキシル末端にＰＧ１２を連結したハイブリッドタンパク質をコードするＤＮＡを連結したＤＮＡ構築物である。
配列番号１０５で表される塩基配列を有するＤＮＡ構築物は、NtADH5'UTRに、３つのＳｔｘ２ｅＢタンパク質を、それぞれ、ＰＧ１２を介してタンデムに連結し、カルボキシル末端にＰＧ１２を連結したハイブリッドタンパク質をコードするＤＮＡを連結したＤＮＡ構築物である。
配列番号１０６で表される塩基配列を有するＤＮＡ構築物は、NtADH5'UTRに、３つのＳｔｘ２ｅＢタンパク質を、それぞれ、ＰＧ１２を介してタンデムに連結し、アミノ末端に分泌シグナルペプチドを付加し、カルボキシル末端にＰＧ１２を連結し、さらにそのカルボキシル末端に小胞体残留シグナルペプチドを付加したハイブリッドタンパク質をコードするＤＮＡを連結したＤＮＡ構築物である。
配列番号１０７で表される塩基配列を有するＤＮＡ構築物は、NtADH5'UTRに、３つのＳｔｘ２ｅＢタンパク質を、それぞれ、ＰＧ１２を介してタンデムに連結し、アミノ末端に葉緑体移行シグナルペプチドを付加し、カルボキシル末端にＰＧ１２を連結したハイブリッドタンパク質をコードするＤＮＡを連結したＤＮＡ構築物である。
配列番号１０８で表される塩基配列を有するＤＮＡ構築物は、NtADH5'UTRに、２つのＣＴＢタンパク質を、ＰＧ１２を介してタンデムに連結し、カルボキシル末端にＰＧ１２を連結したハイブリッドタンパク質をコードするＤＮＡを連結したＤＮＡ構築物である。
配列番号１０９で表される塩基配列を有するＤＮＡ構築物は、NtADH5'UTRに、２つのＣＴＢタンパク質を、ＰＧ１７を介してタンデムに連結し、アミノ末端にシグナルペプチドを付加し、カルボキシル末端にＰＧ１２を連結し、さらにそのカルボキシル末端に小胞体残留シグナルペプチドを付加したハイブリッドタンパク質をコードするＤＮＡを連結したＤＮＡ構築物である。また、配列番号１１０で表される塩基配列を有するＤＮＡ構築物は、NtADH5'UTRに、２つのＣＴＢタンパク質を、ＰＧ２２を介してタンデムに連結し、アミノ末端にシグナルペプチドを付加し、カルボキシル末端にＰＧ１２を連結し、さらにそのカルボキシル末端に小胞体残留シグナルペプチドを付加したハイブリッドタンパク質をコードするＤＮＡを連結したＤＮＡ構築物である。
配列番号１１１で表される塩基配列を有するＤＮＡ構築物は、NtADH5'UTRに、２つのＣＴＢタンパク質を、ＰＧ１２を介してタンデムに連結し、アミノ末端に葉緑体移行シグナルペプチドを付加し、カルボキシル末端にＰＧ１２を連結したハイブリッドタンパク質をコードするＤＮＡを連結したＤＮＡ構築物である。
本発明のＤＮＡ構築物は、一般的な遺伝子工学的手法により作製することができ、植物由来のアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の５’−非翻訳領域、植物由来の分泌シグナルペプチドをコードするＤＮＡ、葉緑体移行シグナルペプチドをコードするＤＮＡ、及び細菌毒素タンパク質をコードするＤＮＡ、小胞体残留シグナルペプチドをコードするＤＮＡなどの各ＤＮＡを、それぞれ、適当な制限酵素により切断し、適当なリガーゼで連結することで構築することができる。
本発明の組換えベクターは、本発明のＤＮＡ構築物を含むことを特徴とする。本発明の組換えベクターは、本発明のハイブリッドタンパク質をコードするＤＮＡが、ベクターが導入される宿主細胞において発現可能なように、ベクター内に挿入されていればよい。ベクターは、宿主細胞において複製可能なものであれば特に制限されず、例えば、プラスミドＤＮＡ、ウィルスＤＮＡ等が挙げられる。また、ベクターは薬剤耐性遺伝子等の選択マーカーを含むことが好ましい。プラスミドＤＮＡは、大腸菌やアグロバクテリウムからアルカリ抽出法（Birnboim, H. C. & Doly, J. (1979) Nucleic acid Res 7: 1513）又はその変法等により調製することができる。また、市販のプラスミドとして、例えばｐＢＩ２２１、ｐＢＩ１２１、ｐＢＩ１０１、ｐＩＧ１２１Ｈｍ等を用いることもできる。ウィルスＤＮＡとしては、例えばpTB2(Donson et al., 1991)等を用いることができる（Donson J., Kerney CM., Hilf ME., Dawson WO. Systemic expression of a bacterial gene by a tobacco mosaic virus-based vector. Proc. Natl. Acad. Sci.(1991) 88: 7204-7208を参照。）
ベクター内で用いられるプロモーターは、ベクターが導入される宿主細胞に応じて適宜選択することができる。例えば、カリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーター（Odell et al．1985 Nature 313：810）、イネのアクチンプロモーター（Zhang et al．1991 Plant Cell 3：1155）、トウモロコシのユビキチンプロモーター（Cornejo et al．1993 Plant Mol．Biol．23：567）等が好ましく用いられる。また、ベクター内で用いられるターミネーターも、同様にベクターが導入される宿主細胞に応じて適宜選択することができる。例えば、ノパリン合成酵素遺伝子転写ターミネーター、カリフラワーモザイクウイルス35Sターミネーター等が好ましく用いられる。
本発明の組換えベクターは、例えば以下のようにして作製することができる。
まず、本発明のＤＮＡ構築物を適当な制限酵素で切断又はＰＣＲによって制限酵素部位を付加し、ベクターの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入する。
まず、本発明のＤＮＡ構築物を適当な制限酵素で切断又はＰＣＲによって制限酵素部位を付加し、ベクターの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入する。
本発明の形質転換体は、本発明の組換えベクターで形質転換されていることを特徴とする。形質転換に用いられる宿主細胞は真核細胞及び原核細胞の何れでもよい。
真核細胞としては、植物細胞が好ましく用いられ、中でもキク科（Asteraceae）、ナス科、アブラナ科、アカザ科に属する植物の細胞が好ましく用いられる。さらに、アキノノゲシ属（Lactuca）に属する植物の細胞、中でもレタス（Lactuca sativa）細胞が好ましく用いられる。宿主細胞としてレタス細胞を用いる場合は、ベクターは、カリフラワーモザイクウイルス35S RNAプロモーター等を用いることができる。
原核細胞としては、大腸菌（Escherichia coli）、アグロバクテリウム（Agrobacterium tumefaciens）等が用いられる。
真核細胞としては、植物細胞が好ましく用いられ、中でもキク科（Asteraceae）、ナス科、アブラナ科、アカザ科に属する植物の細胞が好ましく用いられる。さらに、アキノノゲシ属（Lactuca）に属する植物の細胞、中でもレタス（Lactuca sativa）細胞が好ましく用いられる。宿主細胞としてレタス細胞を用いる場合は、ベクターは、カリフラワーモザイクウイルス35S RNAプロモーター等を用いることができる。
原核細胞としては、大腸菌（Escherichia coli）、アグロバクテリウム（Agrobacterium tumefaciens）等が用いられる。
本発明の形質転換体は、一般的な遺伝子工学的手法を用いて、本発明のベクターを宿主細胞に導入することにより作製することができる。例えば、アクロバクテリウムを利用した導入方法（Hood, et al., 1993, Transgenic, Res. 2：218，Hiei, et al.，1994 Plant J. 6：271）、エレクトロポレーション法（Tada, et al., 1990, Theor．Appl．Genet, 80：475）、ポリエチレングリコール法（Lazzeri, et al., 1991, Theor. Appl. Genet. 81：437）、パーティクルガン法（Sanford, et al., 1987, J. Part. Sci. tech. 5：27）、ポリカチオン法（Ohtsuki）などの方法を用いることが可能である。
本発明のベクターを宿主細胞に導入した後、選択マーカーの表現型によって本発明の形質転換体を選抜することができる。また、選抜した形質転換体を培養することにより、前記細菌毒素タンパク質を生産することができる。培養に用いる培地及び条件は、形質転換体の種に応じて適宜選択することができる。
また、宿主細胞が植物細胞の場合には、選抜した植物細胞を常法に従って培養することにより、植物体を再生することができ、植物細胞内又は植物細胞の細胞膜外に前記細菌毒素タンパク質を蓄積させることができる。例えば、植物細胞の種類により異なるが、ジャガイモであればVisserら（Theor．Appl．Genet 78：594（1989））の方法が挙げられ、タバコであればNagataとTakebe（Planta 99：12（1971））の方法が挙げられる。
本発明のベクターを宿主細胞に導入した後、選択マーカーの表現型によって本発明の形質転換体を選抜することができる。また、選抜した形質転換体を培養することにより、前記細菌毒素タンパク質を生産することができる。培養に用いる培地及び条件は、形質転換体の種に応じて適宜選択することができる。
また、宿主細胞が植物細胞の場合には、選抜した植物細胞を常法に従って培養することにより、植物体を再生することができ、植物細胞内又は植物細胞の細胞膜外に前記細菌毒素タンパク質を蓄積させることができる。例えば、植物細胞の種類により異なるが、ジャガイモであればVisserら（Theor．Appl．Genet 78：594（1989））の方法が挙げられ、タバコであればNagataとTakebe（Planta 99：12（1971））の方法が挙げられる。
レタスの場合は0.1 mg /ｌのNAA(ナフタレン酢酸)、0.05 mg/ｌのBA(ベンジルアデニン)および0.5 g/ｌのpolyvinylpyrrolidoneを含むMS培地でシュートの再生が可能であり、再生したシュートを0.5 g/lのpolyvinylpyrrolidoneを含む1/2 MS培地で培養することで発根が可能である。
また、本発明の種子は、上記のようにして再生した植物体から種子を採取することにより得ることができる。本発明の種子は適当な方法で播種し栽培することにより、前記細菌毒素タンパク質を生産する植物体とすることができ、このような植物体も、本発明の形質転換体に含まれる。
＜１＞一過性発現実験
（１）Stx2eB一過性発現ベクターの構築
Stx2eタンパク質のＢサブユニット（Stx2eB）をコードするＤＮＡ（配列番号５）が、タバコアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の5'非翻訳領域（NtADH5'UTR）に連結されたＤＮＡ構築物を含むベクターを以下のようにして作製した。
ベクターのデザインを図１に示す。
1×Stx2eB(PG12)は、Stx2eBをコードするＤＮＡにＰＧ１２をコードするＤＮＡを連結したＤＮＡを含むＤＮＡ構築物を示す。2×Stx2eB(PG12)は、２つのStx2eBをコードするＤＮＡを、ＰＧ１２をコードするＤＮＡをスペーサーとして連結したＤＮＡを含むＤＮＡ構築物を示す。
また、３つのStx2eBをコードするＤＮＡを、ＰＧ１２をコードするＤＮＡをスペーサーとして連結したＤＮＡ構築物、3×Stx2eB(PG12)、及び４つのStx2eBをコードするＤＮＡを、ＰＧ１２をコードするＤＮＡをスペーサーとして連結したＤＮＡ構築物、4×Stx2eB(PG12)も作製した。
具体的手法を以下に示す。
（１）Stx2eB一過性発現ベクターの構築
Stx2eタンパク質のＢサブユニット（Stx2eB）をコードするＤＮＡ（配列番号５）が、タバコアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の5'非翻訳領域（NtADH5'UTR）に連結されたＤＮＡ構築物を含むベクターを以下のようにして作製した。
ベクターのデザインを図１に示す。
1×Stx2eB(PG12)は、Stx2eBをコードするＤＮＡにＰＧ１２をコードするＤＮＡを連結したＤＮＡを含むＤＮＡ構築物を示す。2×Stx2eB(PG12)は、２つのStx2eBをコードするＤＮＡを、ＰＧ１２をコードするＤＮＡをスペーサーとして連結したＤＮＡを含むＤＮＡ構築物を示す。
また、３つのStx2eBをコードするＤＮＡを、ＰＧ１２をコードするＤＮＡをスペーサーとして連結したＤＮＡ構築物、3×Stx2eB(PG12)、及び４つのStx2eBをコードするＤＮＡを、ＰＧ１２をコードするＤＮＡをスペーサーとして連結したＤＮＡ構築物、4×Stx2eB(PG12)も作製した。
具体的手法を以下に示す。
Kozak-stx2eb-Fプライマー(配列番号３０)とstx2eb-R プライマー(配列番号３１)を用いてＰＣＲを行い、Ｓｔｘ２ｅＢの成熟領域(ペリプラズムへの分泌シグナルペプチドを除く、Ａｌａ１９〜Ａｓｎ８７)をコードするＤＮＡ断片を増幅した。得られたＤＮＡ断片をpBluescript II SKのEcoRV ギャップにクローニングした。得られたプラスミドをHindIII で切断し、T4 DNA polymerase で処理した後セルフライゲーションを行い、HindIII サイトをNheI サイトに変換した(plasmid 1)。
Stx2eBを、以下のようにして植物細胞における一過性発現用ベクター、ｐＢＩ２２１(Clontech 社)のマルチクローニングサイト（ＭＣＳ）に挿入した。
ＭＣＳにSalI、KpnI及びSmaIサイトを導入するために、SalKpnSma-F（配列番号３２）とSalKpnSma-R （配列番号３３）をアニーリング後、T4 polynucleotide kinase (T4 PNK)(TaKaRa 社)を用いてリン酸化し、pBI221 のSacI ギャップに挿入した(plasmid 2)。Plasmid 1 からXbaI とKpnI でStx2eB 断片を切り出し、plasmid 2に挿入し、カリフラワーモザイクウイルス35S RNA プロモーター（35S pro．）とノパリン合成酵素遺伝子転写ターミネーター（NOS-T）の間に配置した(plasmid 3)。
ＭＣＳにSalI、KpnI及びSmaIサイトを導入するために、SalKpnSma-F（配列番号３２）とSalKpnSma-R （配列番号３３）をアニーリング後、T4 polynucleotide kinase (T4 PNK)(TaKaRa 社)を用いてリン酸化し、pBI221 のSacI ギャップに挿入した(plasmid 2)。Plasmid 1 からXbaI とKpnI でStx2eB 断片を切り出し、plasmid 2に挿入し、カリフラワーモザイクウイルス35S RNA プロモーター（35S pro．）とノパリン合成酵素遺伝子転写ターミネーター（NOS-T）の間に配置した(plasmid 3)。
タバコアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の5'非翻訳領域（NtADH 5’UTR、配列番号２３）を、ADH-221(Sato et. al., 2004（下記参照）) を鋳型として、ADH XbaI-F プライマー（配列番号３４）及びADH NsiI-R プライマー（配列番号３５）を用いたPCR により増幅した。β-D glucan exohydrolase(GenBank ACCESSION AB017502)の分泌シグナルペプチド（配列番号１８）をコードするＤＮＡ領域(配列番号１７)を、タバコゲノムＤＮＡを鋳型にして、βD NsiI-F プライマー（配列番号３６）およびβD BamHI-R プライマー（配列番号３７）を用いて増幅した。得られたNtADH 5'UTR および分泌シグナルペプチドの各ＤＮＡ断片をNsiI (TOYOBO社製)で処理し、Ligation High (TOYOBO社)を用いてライゲーションした後、末端を平滑化してpBluescript II SK (Stratagene社製)のEcoRV ギャップにクローニングした（plasmid 4）。
Satoh et al., The 5'-untranslated region of the tobacco alcohol dehydrogenase gene functions as an effective translational enhancer in plant. J. Biosci. Bioeng. (2004) 98,1-8
Satoh et al., The 5'-untranslated region of the tobacco alcohol dehydrogenase gene functions as an effective translational enhancer in plant. J. Biosci. Bioeng. (2004) 98,1-8
Plasmid 4をNsiI で処理し、T4 DNA polymerase (TOYOBO社製)で末端を平滑化した後セルフライゲーションして、NtADH の開始コドン(atg)と分泌シグナルペプチドの開始コドンが一致するように連結した（plasmid 5）。
NtADH 5'UTR 断片および分泌シグナルペプチドの連結ＤＮＡを、plasmid 5 を鋳型として用い、ADH XbaI-F プライマー(配列番号３４)とβD BamHI-R プライマー(配列番号３５)を用いて増幅した。得られたDNA 断片を、XbaI とBamHI で処理し、plasmid 3のXbaI-BamHI ギャップに挿入した(plasmid 6)。
小胞体残留シグナル（配列番号３８）付加のために、HDEL-Fプライマー(配列番号３９)とHDEL-Rプライマー(配列番号４０)をアニーリングしてT4 PNK でリン酸化し、アルカリフォスファターゼ(AP)(TaKaRa社)で脱リン酸化処理したplasmid 6のBglIIギャップに挿入した(plasmid 7)。
Ｓｔｘ２ｅＢ検出用のペプチドタグとして、ＨＡタグを付加した。HA タグの付加のために、HA-F プライマー(配列番号４１)とHA-R プライマー(配列番号４２) をアニーリングしてT4 PNK でリン酸化した。得られたリン酸化ＨＡ断片を、plasmid 7のBglIIギャップに挿入した(plasmid 8)。
Stx2eBとHAタグの間にPG12スペーサー(配列番号２)を挿入した。PG12-F プライマー(配列番号４３)とPG12-R プライマー(配列番号４４) をアニーリングしてT4 PNK でリン酸化した。得られたリン酸化DNA断片を、plasmid 8のBglIIギャップに挿入した(1×Stx2eB(PG12))。
1×Stx2eB(PG12) からBamHIおよびBglIIを用いて2eB-PG12断片を切り出し、1×Stx2eB(PG12)のBamHIギャップに挿入した(2×Stx2eB(PG12))。また、1×Stx2eB(PG12) からBamHIおよびBglIIを用いてStx2eB-PG12断片を切り出し、2×Stx2eB(PG12)のBamHIギャップに挿入した(3×Stx2eB(PG12))。また、2×Stx2eB(PG12) からBamHIおよびBglIIを用いて2×(Stx2eB-PG12)断片を切り出し、2×Stx2eB(PG12)のBamHIギャップに挿入した(4×Stx2eB(PG12))。
（２）CTB一過性発現ベクターの構築
CTタンパク質のＢサブユニット（CTB）をコードするＤＮＡが、タバコアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の5'非翻訳領域に連結されたＤＮＡ構築物(2×CTB(PG12))を含むベクターを以下のようにして作製した。
CTタンパク質のＢサブユニット（CTB）をコードするＤＮＡが、タバコアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の5'非翻訳領域に連結されたＤＮＡ構築物(2×CTB(PG12))を含むベクターを以下のようにして作製した。
CTBの成熟領域(ペリプラズムへの分泌シグナルを除く、Thr22〜Asn124) (配列番号８)をコードするＤＮＡ(配列番号７)を作製した。まず、以下の10種類のプライマーを作製した。
CTB1：配列番号４５
CTB2：配列番号４６
CTB3：配列番号４７
CTB4：配列番号４８
CTB5：配列番号４９
CTB6：配列番号５０
CTB7：配列番号５１
CTB8：配列番号５２
CTB9：配列番号５３
CTB10：配列番号５４
CTB1：配列番号４５
CTB2：配列番号４６
CTB3：配列番号４７
CTB4：配列番号４８
CTB5：配列番号４９
CTB6：配列番号５０
CTB7：配列番号５１
CTB8：配列番号５２
CTB9：配列番号５３
CTB10：配列番号５４
上記で合成したプライマーを使用し、Kang et al.(2004)に記載の条件で、PCRを行った。すなわち、CTB1とCTB2、CTB3とCTB 4、CTB5とCTB 6、CTB7とCTB 8、CTB9とCTB 10の組み合わせでPCRを行い、それぞれ72bp（1＋2）、74bp（3＋4）、67bp（5＋6）、82bp（7＋8）、68bp（9＋10）のＤＮＡ断片を合成した。次にCTB1＋2とCTB3＋4、CTB3＋4とCTB5＋6、CTB5＋6とCTB7＋8、CTB7＋8とCTB9＋10の組み合わせで2nd PCRを行い、135bp（1＋2＋3＋4）、132bp（3＋4＋5＋6）、138bp（5＋6＋7＋8）および141bp（7＋8＋9＋10）のＤＮＡ断片を合成した。次にCTB1＋2＋3＋4とCTB3＋4＋5＋6、およびCTB5＋6＋7＋8とCTB7＋8＋9＋10の組み合わせで3rd PCRを行い、194bp（1＋2＋3＋4＋5＋6）および198bp（5＋6＋7＋8＋9＋10）のＤＮＡ断片を合成した。最後にCTB1＋2＋3＋4＋5＋6とCTB5＋6＋7＋8＋9＋10の組み合わせでPCRを行い、315bpのＣＴＢコード領域にBamHIサイトとBglIIサイトが付加されたＤＮＡ断片を合成した。
上記で作製したDNA断片をBamHIおよびBglIIで処理し、Plasmid 8のBamHI-BglIIギャップに挿入した(plasmid 9)。
CTBとHAタグの間にPG12スペーサー(配列番号２)を挿入した。PG12-F プライマー(配列番号４３)とPG12-R プライマー(配列番号４４) をアニーリングしてT4 PNK でリン酸化した。得られたリン酸化DNA断片を、plasmid 9のBglIIギャップに挿入した(1×CTB(PG12))。
1×CTB(PG12) からBamHIおよびBglIIを用いてCTB-PG12断片を切り出し、1×CTB(PG12)のBamHIギャップに挿入した(2×CTB(PG12))。
（３）レタスプロトプラストを用いた一過性発現実験
鉢植えしたレタス（Lactuca sativa）（グリーンウェーブ）の葉、約1gをメスで0.5cm四方程度に切り刻んでリーフディスクを作製した。リーフディスクを500mMマンニトールに浸漬し、1時間振盪した。リーフディスクを50mlのプロトプラスト化酵素溶液 (1.0% cellulose RS (ヤクルト本社), 0.25% macerozyme R-10 (ヤクルト本社), 400mM マンニトール, 8mM CaCl2, and 5mM Mes-KOH, pH 5.6)に浸漬し、室温で2時間振盪した。プロトプラスト懸濁液を、100μmおよび40μmのメッシュに通してリーフディスクを取り除いた。プロトプラスト懸濁液を60gで5分間遠心し、プロトプラストを沈殿させた。プロトプラストを167mMマンニトールおよび133mM CaCl2を含む水溶液に再懸濁し、40gで5分間遠心した。プロトプラストを333mMマンニトールおよび66.7mM CaCl2を含む水溶液に再懸濁し、40gで5分間遠心した。プロトプラストをW5 solution (154mM NaCl, 125mM CaCl2, 5mM KCl, 2mM Mes-KOH, pH 5.6)に懸濁し、氷上に1時間静置した。プロトプラスト懸濁液を40gで5分間遠心し、プロトプラスト濃度が2×106個/mlになるように、MaMg solution (400mM マンニトール, 15mM MgCl2, and 4mM Mes-KOH, pH 5.6)に懸濁した。
鉢植えしたレタス（Lactuca sativa）（グリーンウェーブ）の葉、約1gをメスで0.5cm四方程度に切り刻んでリーフディスクを作製した。リーフディスクを500mMマンニトールに浸漬し、1時間振盪した。リーフディスクを50mlのプロトプラスト化酵素溶液 (1.0% cellulose RS (ヤクルト本社), 0.25% macerozyme R-10 (ヤクルト本社), 400mM マンニトール, 8mM CaCl2, and 5mM Mes-KOH, pH 5.6)に浸漬し、室温で2時間振盪した。プロトプラスト懸濁液を、100μmおよび40μmのメッシュに通してリーフディスクを取り除いた。プロトプラスト懸濁液を60gで5分間遠心し、プロトプラストを沈殿させた。プロトプラストを167mMマンニトールおよび133mM CaCl2を含む水溶液に再懸濁し、40gで5分間遠心した。プロトプラストを333mMマンニトールおよび66.7mM CaCl2を含む水溶液に再懸濁し、40gで5分間遠心した。プロトプラストをW5 solution (154mM NaCl, 125mM CaCl2, 5mM KCl, 2mM Mes-KOH, pH 5.6)に懸濁し、氷上に1時間静置した。プロトプラスト懸濁液を40gで5分間遠心し、プロトプラスト濃度が2×106個/mlになるように、MaMg solution (400mM マンニトール, 15mM MgCl2, and 4mM Mes-KOH, pH 5.6)に懸濁した。
上記で作製した各Ｓｔｘ２ｅＢ一過性発現ベクター、CTB一過性発現ベクターを、それぞれ120μlのプロトプラスト懸濁液と混合した後、140μlのPEG solution (400mM マンニトール, 100mM Ca(NO3)2, and 40% PEG)を加えて穏やかに混和し、７分間インキュベートした。約20分間かけて1mlのW5 solutionをプロトプラスト懸濁液に添加した。遠心により沈殿させたプロトプラストに、400mM マンニトールとW5 solutionを4:1の割合で混ぜた溶液を1ml添加した。遠心により沈殿させたプロトプラストに、1%スクロース、400mM マンニトールおよび0.3mMカルベニシリンを含むLS培地を1ml添加し、暗所25℃で24時間培養した。
（４）ウェスタン解析
遠心により回収したプロトプラストに30μlのSDS-sample buffer(4% (w/v) SDS, 20% (w/v) glycerol, 0.05%(w/v) ブロモフェノールブルー, 300mM β−メルカプトエタノール, 125mM Tris-HCl, pH 6.8)を加え、95℃で2分間熱変性させ、試料とした。15%アクリルアミドゲルを用いてタンパク質を分離後、エレクトロトランスファー装置を用いてPVDFメンブレン(Hybond-P; Amersham 社）上にタンパク質をブロットした。抗HA抗体(No. 11 867 423 001, Roche)を用いて、Stx2eB及びCTBを検出した。
遠心により回収したプロトプラストに30μlのSDS-sample buffer(4% (w/v) SDS, 20% (w/v) glycerol, 0.05%(w/v) ブロモフェノールブルー, 300mM β−メルカプトエタノール, 125mM Tris-HCl, pH 6.8)を加え、95℃で2分間熱変性させ、試料とした。15%アクリルアミドゲルを用いてタンパク質を分離後、エレクトロトランスファー装置を用いてPVDFメンブレン(Hybond-P; Amersham 社）上にタンパク質をブロットした。抗HA抗体(No. 11 867 423 001, Roche)を用いて、Stx2eB及びCTBを検出した。
（ａ）Stx2eBの連結数の影響
結果を図２に示す。
1×Stx2eB(PG12)を発現させた場合には、約8.5kDaの位置にシグナルが検出された。2×Stx2eB(PG12)を発現させた場合は、約17kDaの位置に、1×Stx2eB(PG12)を発現させた場合と同程度のシグナルが検出された。3×Stx2eB(PG12)を発現させた場合は、約26kDaの位置に、1×Stx2eB(PG12)を発現させた場合より小さいシグナルが検出された。これらは、何れもDNA構築物のデザインから推定した分子量と一致していた。また、4×Stx2eB(PG12)を発現させた場合は、特異的シグナルは検出限界以下だった。
以上の結果から、2×Stx2eB(PG12)及び3×Stx2eB(PG12)を発現させると、複数のStx2eBタンパク質が連結したハイブリッドタンパク質が生産できることが明らかとなった。
また、上記各ＤＮＡ構築物は、ＨＡタグを１分子ずつ含むため（図１参照）、2×Stx2eB(PG12)を発現させた場合は、1×Stx2eB(PG12)を発現させた場合の約２倍のStx2eBタンパク質に相当するタンパク質を蓄積していると考えられる。すなわち、２つのStx2eBタンパク質をコードするＤＮＡを、ＰＧ１２をコードするＤＮＡを介して連結した場合には、極めて効率よくStx2eBタンパク質を生産できることが分かった。
一方、３つのStx2eBタンパク質をコードするＤＮＡ、４つのStx2eBタンパク質をコードするＤＮＡを、ＰＧ１２をコードするＤＮＡを介して連結した場合には、Ｓｔｘ２ｅＢタンパク質の生産は、１つのＳｔｘ２ｅＢタンパク質の同等以下であることが分かった。
結果を図２に示す。
1×Stx2eB(PG12)を発現させた場合には、約8.5kDaの位置にシグナルが検出された。2×Stx2eB(PG12)を発現させた場合は、約17kDaの位置に、1×Stx2eB(PG12)を発現させた場合と同程度のシグナルが検出された。3×Stx2eB(PG12)を発現させた場合は、約26kDaの位置に、1×Stx2eB(PG12)を発現させた場合より小さいシグナルが検出された。これらは、何れもDNA構築物のデザインから推定した分子量と一致していた。また、4×Stx2eB(PG12)を発現させた場合は、特異的シグナルは検出限界以下だった。
以上の結果から、2×Stx2eB(PG12)及び3×Stx2eB(PG12)を発現させると、複数のStx2eBタンパク質が連結したハイブリッドタンパク質が生産できることが明らかとなった。
また、上記各ＤＮＡ構築物は、ＨＡタグを１分子ずつ含むため（図１参照）、2×Stx2eB(PG12)を発現させた場合は、1×Stx2eB(PG12)を発現させた場合の約２倍のStx2eBタンパク質に相当するタンパク質を蓄積していると考えられる。すなわち、２つのStx2eBタンパク質をコードするＤＮＡを、ＰＧ１２をコードするＤＮＡを介して連結した場合には、極めて効率よくStx2eBタンパク質を生産できることが分かった。
一方、３つのStx2eBタンパク質をコードするＤＮＡ、４つのStx2eBタンパク質をコードするＤＮＡを、ＰＧ１２をコードするＤＮＡを介して連結した場合には、Ｓｔｘ２ｅＢタンパク質の生産は、１つのＳｔｘ２ｅＢタンパク質の同等以下であることが分かった。
なお、本実験で作製した、カルボキシル末端にＰＧ１２が付加されたＳｔｘ２ｅＢタンパク質（1×Stx2eB(PG12)）は、これが付加されないＳｔｘ２ｅＢタンパク質に比して、タンパク質の蓄積レベルが高い傾向にあることが判っている。これより、本発明のハイブリッドタンパク質は、カルボキシル末端にＰＧ１２が付加されることが好ましい形態であると推察される。
（ｂ）CTBの連結数の影響
結果を図３に示す。
1×CTB(PG12)を発現させた場合には、約20kDaの位置にシグナルが検出された。2×CTB(PG12)を発現させた場合は、約33kDa及び約35kDaの位置に、1×CTB(PG12)を発現させた場合よりも大きいシグナルが検出された。
以上の結果から、2×CTB(PG12)を発現させると、２つのCTBタンパク質が連結したハイブリッドタンパク質が生産できることが明らかとなった。これらは、何れもDNA構築物のデザインから推定した分子量と一致していた。
また、上記各ＤＮＡ構築物は、ＨＡタグを１分子ずつ含むため、2×CTB(PG12)を発現させた場合は、1×CTB(PG12)を発現させた場合の２倍より大きいCTBタンパク質に相当するタンパク質が蓄積していると考えられる。すなわち、２つのCTBタンパク質をコードするＤＮＡを、ＰＧ１２をコードするＤＮＡを介して連結した場合には、極めて効率よくCTBタンパク質を生産できることが分かった。
結果を図３に示す。
1×CTB(PG12)を発現させた場合には、約20kDaの位置にシグナルが検出された。2×CTB(PG12)を発現させた場合は、約33kDa及び約35kDaの位置に、1×CTB(PG12)を発現させた場合よりも大きいシグナルが検出された。
以上の結果から、2×CTB(PG12)を発現させると、２つのCTBタンパク質が連結したハイブリッドタンパク質が生産できることが明らかとなった。これらは、何れもDNA構築物のデザインから推定した分子量と一致していた。
また、上記各ＤＮＡ構築物は、ＨＡタグを１分子ずつ含むため、2×CTB(PG12)を発現させた場合は、1×CTB(PG12)を発現させた場合の２倍より大きいCTBタンパク質に相当するタンパク質が蓄積していると考えられる。すなわち、２つのCTBタンパク質をコードするＤＮＡを、ＰＧ１２をコードするＤＮＡを介して連結した場合には、極めて効率よくCTBタンパク質を生産できることが分かった。
（５）Stx2eBの局在解析
細胞におけるStx2eBの局在を解析するために、Stx2eBと黄色蛍光タンパク質YFPのハイブリッドタンパク質の一過性発現ベクターを作製した。ベクターのデザインを図４に示す。1×Stx2eB(PG12)-YFPは、１つのStx2eBタンパク質をコードするDNAとYFPをコードするDNAが連結したDNA構築物を示す。2×Stx2eB(PG12)-YFPは、２つのStx2eBタンパク質がPG12を介して連結したハイブリッドタンパク質をコードするDNAとYFPをコードするDNAが連結したDNA構築物を示す。また、スペーサーとしてＰＧ１２の代わりにRS(Arg Ser)を用いた2×Stx2eB(RS)-YFPも作製した。
以下に、具体的な手法を示す。
細胞におけるStx2eBの局在を解析するために、Stx2eBと黄色蛍光タンパク質YFPのハイブリッドタンパク質の一過性発現ベクターを作製した。ベクターのデザインを図４に示す。1×Stx2eB(PG12)-YFPは、１つのStx2eBタンパク質をコードするDNAとYFPをコードするDNAが連結したDNA構築物を示す。2×Stx2eB(PG12)-YFPは、２つのStx2eBタンパク質がPG12を介して連結したハイブリッドタンパク質をコードするDNAとYFPをコードするDNAが連結したDNA構築物を示す。また、スペーサーとしてＰＧ１２の代わりにRS(Arg Ser)を用いた2×Stx2eB(RS)-YFPも作製した。
以下に、具体的な手法を示す。
まず、YFPのDNA断片を、pEYFP(Clontech)を鋳型とし、YFP-Fプライマー(配列番号５５)およびYFP-Rプライマー(配列番号５６)を用いてPCRにより増幅した。得られたDNA断片をBamHIおよびBglIIで処理し、Plasmid 8のBamHI-BglIIギャップに挿入した(ER-YFP)。
plasmid 1からBamHIおよびBglIIを用いてStx2eB断片を切り出し、前記1×Stx2eB(PG12)のBamHIギャップに挿入した（2×Stx2eB(RS)）。
1×Stx2eB(PG12)、2×Stx2eB(RS)および2×Stx2eB(PG12)から、BamHI-BglIIを用いて、それぞれ、Stx2eB-PG12断片、2×(Stx2eB-RS)断片および2×(Stx2eB-PG12)断片を切り出し、ER-YFPのBamHIギャップに挿入した(1×Stx2eB(PG12)-YFP、2×Stx2eB(RS)-YFPおよび2×Stx2eB(PG12)-YFP)。
1×Stx2eB(PG12)、2×Stx2eB(RS)および2×Stx2eB(PG12)から、BamHI-BglIIを用いて、それぞれ、Stx2eB-PG12断片、2×(Stx2eB-RS)断片および2×(Stx2eB-PG12)断片を切り出し、ER-YFPのBamHIギャップに挿入した(1×Stx2eB(PG12)-YFP、2×Stx2eB(RS)-YFPおよび2×Stx2eB(PG12)-YFP)。
一方、小胞体を可視化するためのベクターとして、小胞体局在型の赤色蛍光タンパク質(mRFP、Campbell R.E. et al. (2002)（下記参照）)の発現ベクターを作製した。mRFP-Fプライマー(配列番号５７)とmRFP-R プライマー(配列番号５８)を用いてPCR を行った。得られたDNA断片をBamHIおよびBglIIで処理し、Plasmid 8のBamHI-BglIIギャップに挿入した(ER-mRFP)。
Campbell R.E. et al., A monomeric red fluorescent protein (2002) Proc. Nat. Acad. Sci. 99: 7877-7882
Campbell R.E. et al., A monomeric red fluorescent protein (2002) Proc. Nat. Acad. Sci. 99: 7877-7882
前記Stx2eBの発現ベクターとmRFP発現ベクターを上記の方法と同様にして、タバコ培養細胞（ＢＹ２）のプロトプラストに導入し、共焦点顕微鏡観察(LSM510, Zeiss)を用いて観察した。
結果を図５及び６に示す。
図５は、Stx2eB−YFPハイブリッドタンパク質の局在を示す。2×Stx2eB(PG12)-YFPを発現させた場合は、Stx2eB−YFPハイブリッドタンパク質が100個／細胞程度、顆粒状に局在しているのが観察された。1×Stx2eB(PG12)-YFP及び2×Stx2eB(RS)-YFPを発現させた場合には、顆粒は観察されなかった。
図６中、最左列の画像Ａは、あるプロトプラストにおけるｍＲＦＰの局在を示す。ｍＲＦＰの局在は、小胞体の位置を反映する。中列の画像Ｂは、同一のプロトプラストにおけるStx2eB−YFPハイブリッドタンパク質の局在を示す。最右列の画像は、画像Ａ及びＢの合成画像である。合成画像から、Stx2eB−YFPハイブリッドタンパク質は、小胞体に、顆粒状に局在していることが判る。
結果を図５及び６に示す。
図５は、Stx2eB−YFPハイブリッドタンパク質の局在を示す。2×Stx2eB(PG12)-YFPを発現させた場合は、Stx2eB−YFPハイブリッドタンパク質が100個／細胞程度、顆粒状に局在しているのが観察された。1×Stx2eB(PG12)-YFP及び2×Stx2eB(RS)-YFPを発現させた場合には、顆粒は観察されなかった。
図６中、最左列の画像Ａは、あるプロトプラストにおけるｍＲＦＰの局在を示す。ｍＲＦＰの局在は、小胞体の位置を反映する。中列の画像Ｂは、同一のプロトプラストにおけるStx2eB−YFPハイブリッドタンパク質の局在を示す。最右列の画像は、画像Ａ及びＢの合成画像である。合成画像から、Stx2eB−YFPハイブリッドタンパク質は、小胞体に、顆粒状に局在していることが判る。
（６）小胞輸送機能の影響
2×Stx2eB(PG12)の蓄積及び凝集が、タンパク質翻訳後のどの過程で起こるのか調べた。
2×Stx2eB(PG12)-YFPを、シロイヌナズナの小胞輸送調節タンパク質ARF1、又はそのドミナントネガティブ変異体ARF1（Q71L）（ARF1DN）と共発現させた。また、ARF1DNの共発現により、ゴルジ体へのタンパク質の輸送が阻害されるレポーターとして、液胞型GFP（vacuole-GFP）と各ARF1の共発現を行った。各ARF1の発現ベクターの構築は以下のように行った。なお、液胞型ＧＦＰ発現ベクターの作製は、下記文献を参照して行うことができる。
Di Sansebastiano et. al., Specific accumulation of GFP in a non-acidic vacuolar compartment via a C-terminal propeptide-mediated sorting pathway. Plant J. (1998) 15, 449-457
2×Stx2eB(PG12)の蓄積及び凝集が、タンパク質翻訳後のどの過程で起こるのか調べた。
2×Stx2eB(PG12)-YFPを、シロイヌナズナの小胞輸送調節タンパク質ARF1、又はそのドミナントネガティブ変異体ARF1（Q71L）（ARF1DN）と共発現させた。また、ARF1DNの共発現により、ゴルジ体へのタンパク質の輸送が阻害されるレポーターとして、液胞型GFP（vacuole-GFP）と各ARF1の共発現を行った。各ARF1の発現ベクターの構築は以下のように行った。なお、液胞型ＧＦＰ発現ベクターの作製は、下記文献を参照して行うことができる。
Di Sansebastiano et. al., Specific accumulation of GFP in a non-acidic vacuolar compartment via a C-terminal propeptide-mediated sorting pathway. Plant J. (1998) 15, 449-457
小胞輸送調節タンパク質として、シロイヌナズナARF1(GenBank Accession No. M95166)およびそのドミナントネガティブ変異体ARF1(Q71L) （Masaki Takeuchi et al., 2002（下記参照））の発現ベクターを構築した。シロイヌナズナ幼植物体から調製したcDNAを鋳型として、ARF1-Fプライマー(配列番号５９)およびARF1-Rプライマー(配列番号６０)を用いてPCRを行った。得られたDNA断片をpBluescript (Stratagene)のEcoRVギャップにサブクローニングした。また、ARFQL-Fプライマー(配列番号６１)およびARFQL-Rプライマー(配列番号６２)を用いてPCRを行い、71番目のグルタミン残基をロイシン残基に置換した。得られた各ARF1断片を、一過性発現用ベクターpBI221にサブクローニングした。
作製したそれぞれのベクターを、上記と同様の方法でタバコ培養細胞のプロトプラストに導入し、各タンパク質を共発現させ、2×Stx2eB(PG12)の局在を調べた。
結果を図７に示す。
2×Stx2eB(PG12)-YFPを、ARF1と共発現させた場合も、ARF1(Q71L)と共発現させた場合も、2×Stx2eB(PG12)-YFPを単独で発現させた場合と同様に顆粒が観察された。一方、ARF(Q711)との共発現は、小胞体からの液胞型GFPの移出を阻害した。これより、顆粒の形成は、小胞体からゴルジ体への小胞輸送過程に依存しないと推測された。
結果を図７に示す。
2×Stx2eB(PG12)-YFPを、ARF1と共発現させた場合も、ARF1(Q71L)と共発現させた場合も、2×Stx2eB(PG12)-YFPを単独で発現させた場合と同様に顆粒が観察された。一方、ARF(Q711)との共発現は、小胞体からの液胞型GFPの移出を阻害した。これより、顆粒の形成は、小胞体からゴルジ体への小胞輸送過程に依存しないと推測された。
＜２＞タバコ培養細胞を用いた形質転換実験
(１)形質転換用ベクターの構築
上記と同様にして、1×Stx2eB(PG12)、2×Stx2eB(PG12)、3×Stx2eB(PG12)、4×Stx2eB(PG12)を作製した。
さらに、ＰＧ１２に代えて、RS(Arg Ser)、PG7(配列番号６３)又はSG12(配列番号６４)をスペーサーに用いたＤＮＡ構築物、2×Stx2eB(RS)、2×Stx2eB(PG7)、2×Stx2eB(SG12)を以下の方法で作製した。
(１)形質転換用ベクターの構築
上記と同様にして、1×Stx2eB(PG12)、2×Stx2eB(PG12)、3×Stx2eB(PG12)、4×Stx2eB(PG12)を作製した。
さらに、ＰＧ１２に代えて、RS(Arg Ser)、PG7(配列番号６３)又はSG12(配列番号６４)をスペーサーに用いたＤＮＡ構築物、2×Stx2eB(RS)、2×Stx2eB(PG7)、2×Stx2eB(SG12)を以下の方法で作製した。
前記plasmid 8のStx2eBとHAタグの間にPG7スペーサー(配列番号６３)を挿入した。PG7-F プライマー(配列番号６５)とPG7-R プライマー(配列番号６６) をアニーリングしてT4 PNK でリン酸化した。得られたリン酸化DNA断片を、plasmid 8のBglIIギャップに挿入した(plasmid 10)。
また、Stx2eBとHAタグの間にSG12スペーサー(配列番号６４)を挿入した。SG12-F プライマー(配列番号６７)とSG12-R プライマー(配列番号６８) をアニーリングしてT4 PNK でリン酸化した。得られたリン酸化DNA断片を、plasmid 8のBglIIギャップに挿入した(plasmid 11)。
また、Stx2eBとHAタグの間にSG12スペーサー(配列番号６４)を挿入した。SG12-F プライマー(配列番号６７)とSG12-R プライマー(配列番号６８) をアニーリングしてT4 PNK でリン酸化した。得られたリン酸化DNA断片を、plasmid 8のBglIIギャップに挿入した(plasmid 11)。
Plasmid 1からBamHIおよびBglIIを用いてStx2eB断片を切り出し、1×Stx2eB(PG12)のBamHIギャップに挿入した(2×Stx2eB(RS))。Plasmid 10からBamHIおよびBglIIを用いてStx2eB-PG7断片を切り出し、1×Stx2eB(PG12)のBamHIギャップに挿入した(2×Stx2eB(PG7))。Plasmid 11からBamHIおよびBglIIを用いてStx2eB-SG12断片を切り出し、1×Stx2eB(PG12)のBamHIギャップに挿入した(2×Stx2eB(SG12))。
植物の安定形質転換体を用いて、Stx2eBの生産を行うために、前記各Stx2eB のＤＮＡ構築物を形質転換用ベクターにサブクローニングした（ベクターのデザインは、図１を参照）。1×Stx2eB(PG12)、2×Stx2eB(PG12)、3×Stx2eB(PG12)、4×Stx2eB(PG12)、2×Stx2eB(RS)、2×Stx2eB(PG7)および2×Stx2eB(SG12)をXbaIおよびSacIを用いてpBI121(Clontech 社)に挿入し、カリフラワーモザイクウイルス35S RNA プロモーター（35S pro．）とノパリン合成酵素遺伝子転写ターミネーター（NOS-T）の間に配置した。
（２）タバコ培養細胞の形質転換
作製した形質転換用ベクターを、エレクトロポレーション法を用いて、アグロバクテリウム(Agrobacterium tumefacience EHA105)に導入した。カナマイシン100 mg/l を含む5 mlのLB培地で28℃、2晩培養したアグロバテリウム培養液100 μlと、培養4日目のタバコ培養細胞(Nicotiana tabacum, cv BY2)の懸濁液 5〜10 mlをシャーレに入れて混合し、25℃で2 晩、暗所下で静置して共存培養した。アグロバクテリウムを除くため、シャーレの中の培養液を 15 mlの遠心管に移して遠心(1000 rpm, 5分間, 4℃)し、上清を取り除いた。改変LS培地を入れて遠心分離 (1000 rpm, 5分間, 4℃)し、細胞を洗浄した。この洗浄操作を4回繰り返し、アグロバクテリウムを除いた。残ったBY2細胞をカナマイシン（100 mg/l）の入った改変 LS寒天培地に置き、25℃で暗黒下に静置して培養した。約2-3週間後にカルス化した細胞を新しいプレートに移植し、増殖するクローンを選択した。
作製した形質転換用ベクターを、エレクトロポレーション法を用いて、アグロバクテリウム(Agrobacterium tumefacience EHA105)に導入した。カナマイシン100 mg/l を含む5 mlのLB培地で28℃、2晩培養したアグロバテリウム培養液100 μlと、培養4日目のタバコ培養細胞(Nicotiana tabacum, cv BY2)の懸濁液 5〜10 mlをシャーレに入れて混合し、25℃で2 晩、暗所下で静置して共存培養した。アグロバクテリウムを除くため、シャーレの中の培養液を 15 mlの遠心管に移して遠心(1000 rpm, 5分間, 4℃)し、上清を取り除いた。改変LS培地を入れて遠心分離 (1000 rpm, 5分間, 4℃)し、細胞を洗浄した。この洗浄操作を4回繰り返し、アグロバクテリウムを除いた。残ったBY2細胞をカナマイシン（100 mg/l）の入った改変 LS寒天培地に置き、25℃で暗黒下に静置して培養した。約2-3週間後にカルス化した細胞を新しいプレートに移植し、増殖するクローンを選択した。
（３）ウェスタン解析を用いたStx2eBタンパク質の半定量
平板培地にて培養したタバコ培養細胞を遠心チューブに回収し、細胞の重量1mg あたり1 μl のSDS-sample buffer を添加した。95℃で2分間熱変性させ、電気泳動用の試料とした。15% アクリルアミドゲルを用いてタンパク質を分離後、エレクトロトランスファー装置を用いてPVDFメンブレン(Hybond-P; Amersham ）上にタンパク質をブロットした。抗HA 抗体(No. 11 867 423 001, Roche)を用いて、Stx2eB タンパク質を検出した。濃度既知のHAタグ付きStx2eBの希釈系列を作製してゲルにロードし、シグナル強度を元に検量線を作成して、各サンプル中のStx2eBタンパク質量を算出した。
以下に、結果を示す。
平板培地にて培養したタバコ培養細胞を遠心チューブに回収し、細胞の重量1mg あたり1 μl のSDS-sample buffer を添加した。95℃で2分間熱変性させ、電気泳動用の試料とした。15% アクリルアミドゲルを用いてタンパク質を分離後、エレクトロトランスファー装置を用いてPVDFメンブレン(Hybond-P; Amersham ）上にタンパク質をブロットした。抗HA 抗体(No. 11 867 423 001, Roche)を用いて、Stx2eB タンパク質を検出した。濃度既知のHAタグ付きStx2eBの希釈系列を作製してゲルにロードし、シグナル強度を元に検量線を作成して、各サンプル中のStx2eBタンパク質量を算出した。
以下に、結果を示す。
（ａ）Stx2eBの連結数の影響
結果を図８及び９に示す。
1×Stx2eB(PG12)を発現させた場合には、約10kDa及び約17kDaの位置にシグナルが検出された。それぞれ、シグナルペプチドが切断されたStx2eB、及びシグナルペプチドが切断されていないStx2eBであると推定される。2×Stx2eB(PG12)を発現させた場合は、約19kDaの位置に、1×Stx2eB(PG12)を発現させた場合と同程度のシグナルが検出された。3×Stx2eB(PG12)を発現させた場合は、約26kDaの位置に、1×Stx2eB(PG12)を発現させた場合より小さいシグナルが検出された。何れも、DNA構築物のデザインから推定した分子量と一致していた。また、4×Stx2eB(PG12)を発現させた場合は、特異的シグナルは検出限界以下だった（データ非掲載）。
これより、1×Stx2eB(PG12)や3×Stx2eB(PG12)よりも、2×Stx2eB(PG12)の方がStx2eBが高蓄積することがわかった。
結果を図８及び９に示す。
1×Stx2eB(PG12)を発現させた場合には、約10kDa及び約17kDaの位置にシグナルが検出された。それぞれ、シグナルペプチドが切断されたStx2eB、及びシグナルペプチドが切断されていないStx2eBであると推定される。2×Stx2eB(PG12)を発現させた場合は、約19kDaの位置に、1×Stx2eB(PG12)を発現させた場合と同程度のシグナルが検出された。3×Stx2eB(PG12)を発現させた場合は、約26kDaの位置に、1×Stx2eB(PG12)を発現させた場合より小さいシグナルが検出された。何れも、DNA構築物のデザインから推定した分子量と一致していた。また、4×Stx2eB(PG12)を発現させた場合は、特異的シグナルは検出限界以下だった（データ非掲載）。
これより、1×Stx2eB(PG12)や3×Stx2eB(PG12)よりも、2×Stx2eB(PG12)の方がStx2eBが高蓄積することがわかった。
（ｂ）スペーサーの影響
結果を図１０及び図１１に示す。
Stx2eBに相当するシグナルの強度から、Stx2eBの蓄積レベルは、スペーサーとしてPG12を用いた場合が最も多かった。次いでPG7とSG12を用いた場合が同程度で多かった。また、RSを用いた場合が最も少なかった。このことから、２つのStx2eB 間のスペーサーの長さ及びアミノ酸配列が、2×Stx2eBタンパク質の蓄積レベルに影響を与えることがわかった。
結果を図１０及び図１１に示す。
Stx2eBに相当するシグナルの強度から、Stx2eBの蓄積レベルは、スペーサーとしてPG12を用いた場合が最も多かった。次いでPG7とSG12を用いた場合が同程度で多かった。また、RSを用いた場合が最も少なかった。このことから、２つのStx2eB 間のスペーサーの長さ及びアミノ酸配列が、2×Stx2eBタンパク質の蓄積レベルに影響を与えることがわかった。
（４）リアルタイムPCR によるmRNA の定量
タンパク質の蓄積レベルが転写レベルに影響を受けるのかを調べた。
上記で得られた各形質転換BY2細胞から、RNeasy Mini Kit (Qiagen)を用いてRNA を調製した。DNase 処理を行った後、Transcriptor Reverse Transcriptase (Roche)を用いて逆転写を行った。SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems)を用いて、リアルタイムPCR を行った。Stx2eB mRNA の定量には、各コンストラクト間で共通の配列である、NtADH 5'UTR とシグナルペプチドを含む領域を増幅するプライマーセット(配列番号６９および配列番号７０)を用いた。UBQ-Fプライマー(配列番号７１)およびUBQ-Rプライマー(配列番号７２)を用いてBY2ユビキチン遺伝子の発現量を定量し、stx2eB 遺伝子のmRNA レベルを補正した。なお1×Stx2eB(PG12) mRNAレベルは、定量値を1/2にして算出した。
結果を図１２に示す。
ｍRNAあたりのStx2eタンパク質の蓄積レベルは、2×Stx2eB (PG12)を発現させた細胞の方が、2×Stx2eB (RS)又は1×Stx2eB (PG12)を発現させた細胞よりも大きい傾向にあった。これより、スペーサーの相違は、転写レベルに影響を与えるのではなく、翻訳レベル或いは翻訳後のタンパク質の安定性に影響を与えることがわかった。また、2×Stx2eBタンパク質が顆粒状に局在していたという結果を併せて考察すると、スペーサーは、翻訳後のタンパク質の安定性に影響を与えているものと考えられる。
タンパク質の蓄積レベルが転写レベルに影響を受けるのかを調べた。
上記で得られた各形質転換BY2細胞から、RNeasy Mini Kit (Qiagen)を用いてRNA を調製した。DNase 処理を行った後、Transcriptor Reverse Transcriptase (Roche)を用いて逆転写を行った。SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems)を用いて、リアルタイムPCR を行った。Stx2eB mRNA の定量には、各コンストラクト間で共通の配列である、NtADH 5'UTR とシグナルペプチドを含む領域を増幅するプライマーセット(配列番号６９および配列番号７０)を用いた。UBQ-Fプライマー(配列番号７１)およびUBQ-Rプライマー(配列番号７２)を用いてBY2ユビキチン遺伝子の発現量を定量し、stx2eB 遺伝子のmRNA レベルを補正した。なお1×Stx2eB(PG12) mRNAレベルは、定量値を1/2にして算出した。
結果を図１２に示す。
ｍRNAあたりのStx2eタンパク質の蓄積レベルは、2×Stx2eB (PG12)を発現させた細胞の方が、2×Stx2eB (RS)又は1×Stx2eB (PG12)を発現させた細胞よりも大きい傾向にあった。これより、スペーサーの相違は、転写レベルに影響を与えるのではなく、翻訳レベル或いは翻訳後のタンパク質の安定性に影響を与えることがわかった。また、2×Stx2eBタンパク質が顆粒状に局在していたという結果を併せて考察すると、スペーサーは、翻訳後のタンパク質の安定性に影響を与えているものと考えられる。
＜３＞一過性発現実験
（１）Stx2eB一過性発現ベクターの構築
上記＜１＞（１）の方法で、1×Stx2eB(PG12)、2×Stx2eB(PG12)、3×Stx2eB(PG12)、4×Stx2eB(PG12)の一過性発現ベクターを構築した（図１３−Ａ）。以下、これらのベクターをそれぞれ、ER-1×Stx2eB(PG12)、ER-2×Stx2eB(PG12)、ER-3×Stx2eB(PG12)、ER-4×Stx2eB(PG12)という。なお、「ER」は小胞体型を意味する。
（１）Stx2eB一過性発現ベクターの構築
上記＜１＞（１）の方法で、1×Stx2eB(PG12)、2×Stx2eB(PG12)、3×Stx2eB(PG12)、4×Stx2eB(PG12)の一過性発現ベクターを構築した（図１３−Ａ）。以下、これらのベクターをそれぞれ、ER-1×Stx2eB(PG12)、ER-2×Stx2eB(PG12)、ER-3×Stx2eB(PG12)、ER-4×Stx2eB(PG12)という。なお、「ER」は小胞体型を意味する。
また、以下の方法で細胞質型（Cyt）のＤＮＡ構築物を含む一過性発現ベクター（図１３−Ｂ）、及び葉緑体型（Chl）のＤＮＡ構築物を含む発現ベクター（図１３−Ｃ）を構築した。なお、これらのＤＮＡ構築物は、小胞体型のハイブリッドタンパク質とできるだけ近い構造のハイブリッドタンパク質を発現させる目的で、小胞体残留シグナルペプチドをコードするＤＮＡを含むようにデザインされた。但し、当該ＤＮＡ構築物は、分泌シグナルペプチドをコードするＤＮＡを含まないので、生産されたハイブリッドタンパク質において、小胞体残留シグナルペプチドは、その機能（タンパク質の小胞体への残留）を発揮しない。
NtADH 5'UTR 断片を、ADH XbaI-Fプライマー（配列番号３４）とADH BamHI-Rプライマー(配列番号１１２)を用いたPCRにより増幅し、得られたDNA 断片をXbaI とBamHI で処理した。NtADH 5'-UTR のXbaI-BamHI 断片を、ER-1×Stx2eB(PG12)、ER-2×Stx2eB(PG12)、ER-3×Stx2eB(PG12)およびER-4×Stx2eB(PG12)のそれぞれのXbaI-BamHI ギャップに挿入し、細胞質型Stx2eBベクターであるCyt-1×Stx2eB(PG12)、Cyt-2×Stx2eB(PG12)、Cyt-3×Stx2eB(PG12)およびCyt-4×Stx2eB(PG12)を作製した。
NtADH 5’-UTR断片を、ADH XbaI-F プライマー（配列番号３４）及びADH NsiI-R プライマー（配列番号３５）を用いたPCR により増幅した。レタスRbcs（ルビスコスモールサブユニット）(GenBank ACCESSION D14001)由来葉緑体移行シグナルペプチド（トランジットペプチド、T.P.）をコードするDNA 断片（配列番号８０）を、レタス葉cDNA を鋳型として、TP NsiI-F プライマー（配列番号１１３）およびTP BamHI-R プライマー (配列番号１１４)を用いてPCRにより増幅した。得られたNtADH 5'-UTR および分泌シグナルペプチドの各ＤＮＡ断片をNsiI (TOYOBO社製)で処理し、Ligation High (TOYOBO社)を用いてライゲーションした後、末端を平滑化してpBluescript II SK (Stratagene社製)のEcoRV ギャップにクローニングした（plasmid 12）。Plasmid 12をNsiI で処理し、T4 DNA polymerase (TOYOBO社製)で末端を平滑化した後セルフライゲーションして、NtADHの開始コドンとRbcsの開始コドンが一致するように融合した（plasmid 13）。Plasmid 13からXbaIとBamHIを用いてNtADH 5'-UTR-T.P.融合断片を切り出し、ER-1×Stx2eB(PG12)、ER-2×Stx2eB(PG12)、ER-3×Stx2eB(PG12)およびER-4×Stx2eB(PG12)のそれぞれのXbaI-BamHI ギャップに挿入し、葉緑体型Stx2eBベクターであるChl-1×Stx2eB(PG12)、Chl-2×Stx2eB(PG12)、Chl-3×Stx2eB(PG12) およびChl-4×Stx2eB(PG12)を作製した。
（２）CTB一過性発現ベクターの作製
上記＜１＞（２）の方法で、1×CTB(PG12)、2×CTB(PG12)の一過性発現ベクターを構築した（図１４−Ａ）。以下、これらのベクターをそれぞれ、ER-1×CTB(PG12)、ER-2×CTB(PG12)という。
上記＜１＞（２）の方法で、1×CTB(PG12)、2×CTB(PG12)の一過性発現ベクターを構築した（図１４−Ａ）。以下、これらのベクターをそれぞれ、ER-1×CTB(PG12)、ER-2×CTB(PG12)という。
また、以下の方法で細胞質型（Cyt）のＤＮＡ構築物を含む一過性発現ベクター（図１４−Ｂ）、及び葉緑体型（Chl）のＤＮＡ構築物を含む発現ベクター（図１４−Ｃ）を構築した。
ER-1×CTB(PG12) からBamHIおよびBglIIを用いてCTB-PG12断片を切り出し、上記＜３＞（１）で作製したCyt-1×Stx2eB(PG12)のBamHI-BglIIギャップおよびChl-1×Stx2eB(PG12)のBamHI-BglIIギャップに挿入して細胞質型及び葉緑体型の1×CTB(PG12)を作製した（Cyt-1×CTB(PG12)、Chl-1×CTB(PG12)）。
ER-1×CTB(PG12) からBamHIおよびBglIIを用いてCTB-PG12断片を切り出し、上記＜３＞（１）で作製したCyt-1×Stx2eB(PG12)のBamHI-BglIIギャップおよびChl-1×Stx2eB(PG12)のBamHI-BglIIギャップに挿入して細胞質型及び葉緑体型の1×CTB(PG12)を作製した（Cyt-1×CTB(PG12)、Chl-1×CTB(PG12)）。
続いて、ER-2×CTB(PG12) からBamHIおよびBglIIを用いて2×(CTB-PG12)断片を切り出し、Cyt-1×Stx2eB(PG12)のBamHI-BglIIギャップおよびChl-1×Stx2eB(PG12)のBamHI-BglIIギャップに挿入して細胞質型および葉緑体型の2×CTB(PG12)を作製した(Cyt-2×CTB(PG12)、Chl-2×CTB(PG12))。
（３）一過性発現実験及びウェスタン解析
上記＜１＞（３）と同様にしてレタスのプロトプラストを用いて一過性発現実験を行った。続いて、＜１＞（４）と同様にしてStx2eB、CTBを検出した。
上記＜１＞（３）と同様にしてレタスのプロトプラストを用いて一過性発現実験を行った。続いて、＜１＞（４）と同様にしてStx2eB、CTBを検出した。
（ａ）Stx2eBの連結数の影響
結果を図１５に示す。
ER-1×Stx2eB(PG12)を発現させた場合には、約10 kDaの位置にシグナルが検出された。ER-2×Stx2eB(PG12)を発現させた場合は、約19 kDaの位置に、ER-1×Stx2eB(PG12)を発現させた場合より大きいシグナルが検出された。ER-3×Stx2eB(PG12)を発現させた場合は、約27 kDaの位置に、ER-1×Stx2eB(PG12)を発現させた場合より大きいシグナルが検出された。これらは、何れもDNA構築物のデザインから推定した分子量と一致していた。また、ER-4×Stx2eB(PG12)を発現させた場合は、特異的シグナルは検出限界以下だった。
Cyt-1×Stx2eB(PG12)を発現させた場合には、特異的シグナルは検出限界以下だった。Cyt-2×Stx2eB(PG12)を発現させた場合は、約20 kDaの位置に、シグナルが検出された。Cyt-3×Stx2eB(PG12)を発現させた場合は、約30 kDaの位置に、シグナルが検出された。これらは、何れもDNA構築物のデザインから推定した分子量と一致していた。また、Cyt-4×Stx2eB(PG12)を発現させた場合は、特異的シグナルは検出限界以下だった。
Chl-1×Stx2eB(PG12)を発現させた場合には、約14 kDaの位置にわずかにシグナルが検出された。Chl-2×Stx2eB(PG12)を発現させた場合は、約22 kDaの位置に、ER-3×Stx2eB(PG12)を発現させた場合と同程度のシグナルが検出された。Chl-3×Stx2eB(PG12)を発現させた場合は、約30 kDaの位置に、Chl-2×Stx2eB(PG12)を発現させた場合と同程度のシグナルが検出された。これらは、何れもDNA構築物のデザインから推定した分子量と一致していた。また、Chl-4×Stx2eB(PG12)を発現させた場合は、約34 kDaの位置に、わずかにシグナルが検出された。
結果を図１５に示す。
ER-1×Stx2eB(PG12)を発現させた場合には、約10 kDaの位置にシグナルが検出された。ER-2×Stx2eB(PG12)を発現させた場合は、約19 kDaの位置に、ER-1×Stx2eB(PG12)を発現させた場合より大きいシグナルが検出された。ER-3×Stx2eB(PG12)を発現させた場合は、約27 kDaの位置に、ER-1×Stx2eB(PG12)を発現させた場合より大きいシグナルが検出された。これらは、何れもDNA構築物のデザインから推定した分子量と一致していた。また、ER-4×Stx2eB(PG12)を発現させた場合は、特異的シグナルは検出限界以下だった。
Cyt-1×Stx2eB(PG12)を発現させた場合には、特異的シグナルは検出限界以下だった。Cyt-2×Stx2eB(PG12)を発現させた場合は、約20 kDaの位置に、シグナルが検出された。Cyt-3×Stx2eB(PG12)を発現させた場合は、約30 kDaの位置に、シグナルが検出された。これらは、何れもDNA構築物のデザインから推定した分子量と一致していた。また、Cyt-4×Stx2eB(PG12)を発現させた場合は、特異的シグナルは検出限界以下だった。
Chl-1×Stx2eB(PG12)を発現させた場合には、約14 kDaの位置にわずかにシグナルが検出された。Chl-2×Stx2eB(PG12)を発現させた場合は、約22 kDaの位置に、ER-3×Stx2eB(PG12)を発現させた場合と同程度のシグナルが検出された。Chl-3×Stx2eB(PG12)を発現させた場合は、約30 kDaの位置に、Chl-2×Stx2eB(PG12)を発現させた場合と同程度のシグナルが検出された。これらは、何れもDNA構築物のデザインから推定した分子量と一致していた。また、Chl-4×Stx2eB(PG12)を発現させた場合は、約34 kDaの位置に、わずかにシグナルが検出された。
上記各ＤＮＡ構築物は、ＨＡタグを１分子ずつ含むため（図１３参照）、２つのStx2eBをコードするＤＮＡを発現させた場合、３つのStx2eBをコードするＤＮＡを発現させた場合は、１つのStx2eBをコードするＤＮＡを発現させた場合のそれぞれ約２倍、約３倍のStx2eBタンパク質に相当するタンパク質を蓄積していると考えられる。
従って、小胞体型（ER）、細胞質型（Cyt）、葉緑体型（Chl）の何れのＤＮＡ構築物を発現させた場合においても、１つのStx2eBタンパク質を発現させた場合より、２つ又は３つのStx2eBをスペーサーを介してタンデムに連結したタンパク質を発現させた場合の方が、Stx2eBを効率よく蓄積させることができることが判った。
従って、小胞体型（ER）、細胞質型（Cyt）、葉緑体型（Chl）の何れのＤＮＡ構築物を発現させた場合においても、１つのStx2eBタンパク質を発現させた場合より、２つ又は３つのStx2eBをスペーサーを介してタンデムに連結したタンパク質を発現させた場合の方が、Stx2eBを効率よく蓄積させることができることが判った。
（b）CTBの連結数の影響
結果を図１６に示す。
ER-1×CTB(PG12)を発現させた場合には、約17 kDaの位置にシグナルが検出された。ER-2×CTB(PG12)を発現させた場合は、約28 kDa及び30 kDaの位置に、ER-1×Stx2eB(PG12)を発現させた場合より大きいシグナルが検出された。これらは、何れもDNA構築物のデザインから推定した分子量と一致していた。
Cyt-1×CTB(PG12)を発現させた場合には、約14 kDaの位置にわずかにシグナルが検出された。Cyt-2×CTB(PG12)を発現させた場合は、約26 kDaの位置に、ER-2×CTB(PG12)を発現させた場合と同程度のシグナルが検出された。これらは、何れもDNA構築物のデザインから推定した分子量と一致していた。
Chl-1×CTB(PG12)を発現させた場合には、約14 kDaの位置にシグナルが検出された。Chl-2×CTB(PG12)を発現させた場合は、約26 kDaの位置に、ER-2×CTB(PG12)を発現させた場合と同程度のシグナルが検出された。これらは、何れもDNA構築物のデザインから推定した分子量と一致していた。
以上より、小胞体型（ER）、細胞質型（Cyt）、葉緑体型（Chl）の何れのＤＮＡ構築物を発現させた場合においても、１つのCTBタンパク質を発現させた場合より、２つのCTBをスペーサーを介してタンデムに連結したタンパク質を発現させた場合の方が、CTBを効率よく蓄積させることができることが判った。
結果を図１６に示す。
ER-1×CTB(PG12)を発現させた場合には、約17 kDaの位置にシグナルが検出された。ER-2×CTB(PG12)を発現させた場合は、約28 kDa及び30 kDaの位置に、ER-1×Stx2eB(PG12)を発現させた場合より大きいシグナルが検出された。これらは、何れもDNA構築物のデザインから推定した分子量と一致していた。
Cyt-1×CTB(PG12)を発現させた場合には、約14 kDaの位置にわずかにシグナルが検出された。Cyt-2×CTB(PG12)を発現させた場合は、約26 kDaの位置に、ER-2×CTB(PG12)を発現させた場合と同程度のシグナルが検出された。これらは、何れもDNA構築物のデザインから推定した分子量と一致していた。
Chl-1×CTB(PG12)を発現させた場合には、約14 kDaの位置にシグナルが検出された。Chl-2×CTB(PG12)を発現させた場合は、約26 kDaの位置に、ER-2×CTB(PG12)を発現させた場合と同程度のシグナルが検出された。これらは、何れもDNA構築物のデザインから推定した分子量と一致していた。
以上より、小胞体型（ER）、細胞質型（Cyt）、葉緑体型（Chl）の何れのＤＮＡ構築物を発現させた場合においても、１つのCTBタンパク質を発現させた場合より、２つのCTBをスペーサーを介してタンデムに連結したタンパク質を発現させた場合の方が、CTBを効率よく蓄積させることができることが判った。
＜４＞タバコ培養細胞を用いた形質転換実験
（１）形質転換用ベクターの構築
上記で作製したER-2×Stx2eB(PG12)、Cyt-1×Stx2eB(PG12)、Cyt-2×Stx2eB(PG12)、Cyt-3×Stx2eB(PG12)を用いて、形質転換実験を行った。
形質転換用ベクターの作製は、上記＜２＞（１）の方法と同様に行った。
（１）形質転換用ベクターの構築
上記で作製したER-2×Stx2eB(PG12)、Cyt-1×Stx2eB(PG12)、Cyt-2×Stx2eB(PG12)、Cyt-3×Stx2eB(PG12)を用いて、形質転換実験を行った。
形質転換用ベクターの作製は、上記＜２＞（１）の方法と同様に行った。
（２）タバコ培養細胞の形質転換及びウェスタン解析
形質転換実験及びウェスタン解析は、上記＜２＞（２）、（３）の方法と同様に行った。
結果を図１７に示す。
ER-2×Stx2eB(PG12)を発現させた場合には、約19 kDa、21kDaおよび23 kDaの位置にシグナルが検出された。Cyt-1×Stx2eB(PG12)を発現させた場合には、特異的シグナルは検出限界以下だった。Cyt-2×Stx2eB(PG12)を発現させた場合には、約19 kDaの位置にシグナルが検出された。Cyt-3×Stx2eB(PG12)を発現させた場合には、約27 kDaの位置に、Cyt-2×Stx2eB(PG12)を発現させた場合より大きいシグナルが検出された。
以上より、タバコ培養細胞の形質転換体においても、１つのStx2eBタンパク質を発現させた場合より、２つ又は３つのStx2eBをスペーサーを介してタンデムに連結したタンパク質を発現させた場合の方が、Stx2eBを効率よく蓄積させることができることが判った。また、タバコ培養細胞の形質転換体において、細胞質型のＤＮＡ構築物を発現させた場合には、特に、３つのStx2eBをスペーサーを介してタンデムに連結したタンパク質を発現させた場合に、Stx2eBを効率よく蓄積させることができることが判った。
また、タバコ培養細胞の形質転換体においては、細胞質型のＤＮＡ構築物を発現させた場合より、小胞体型のＤＮＡ構築物を発現させた場合の方が、Stx2eBを効率よく蓄積させることができることが判った。
形質転換実験及びウェスタン解析は、上記＜２＞（２）、（３）の方法と同様に行った。
結果を図１７に示す。
ER-2×Stx2eB(PG12)を発現させた場合には、約19 kDa、21kDaおよび23 kDaの位置にシグナルが検出された。Cyt-1×Stx2eB(PG12)を発現させた場合には、特異的シグナルは検出限界以下だった。Cyt-2×Stx2eB(PG12)を発現させた場合には、約19 kDaの位置にシグナルが検出された。Cyt-3×Stx2eB(PG12)を発現させた場合には、約27 kDaの位置に、Cyt-2×Stx2eB(PG12)を発現させた場合より大きいシグナルが検出された。
以上より、タバコ培養細胞の形質転換体においても、１つのStx2eBタンパク質を発現させた場合より、２つ又は３つのStx2eBをスペーサーを介してタンデムに連結したタンパク質を発現させた場合の方が、Stx2eBを効率よく蓄積させることができることが判った。また、タバコ培養細胞の形質転換体において、細胞質型のＤＮＡ構築物を発現させた場合には、特に、３つのStx2eBをスペーサーを介してタンデムに連結したタンパク質を発現させた場合に、Stx2eBを効率よく蓄積させることができることが判った。
また、タバコ培養細胞の形質転換体においては、細胞質型のＤＮＡ構築物を発現させた場合より、小胞体型のＤＮＡ構築物を発現させた場合の方が、Stx2eBを効率よく蓄積させることができることが判った。
＜５＞タバコ植物体を用いた形質転換実験
（１）形質転換用ベクターの構築
上記で作製したER-2×Stx2eB(PG12)、Chl-1×Stx2eB(PG12)、Chl-2×Stx2eB(PG12)、Chl-3×Stx2eB(PG12)を用いて、形質転換実験を行った。
形質転換用ベクターの作製は、上記＜２＞（１）の方法と同様に行った。
（１）形質転換用ベクターの構築
上記で作製したER-2×Stx2eB(PG12)、Chl-1×Stx2eB(PG12)、Chl-2×Stx2eB(PG12)、Chl-3×Stx2eB(PG12)を用いて、形質転換実験を行った。
形質転換用ベクターの作製は、上記＜２＞（１）の方法と同様に行った。
（２）タバコ植物体の形質転換
上記で作製したベクターを用いて、以下の方法により、タバコ植物体の形質転換を行った。
タバコ植物体(Nicotiana tabacum L. cv. Petit habana SR1)の種子を殺菌し、MS培地に播種した。無菌タバコの葉部を、葉脈を含まないように1×1 cm 程度の大きさに切り取り、滅菌水が入ったシャーレに葉の裏面が上になるように置き、上記＜２＞（２）で得られた100 mg/lのカナマイシンを含むLB培地で2晩培養したアグロバクテリウム懸濁液をシャーレに注いで3〜5分間浸した。葉片を取り出し、余分な菌液を滅菌キムタオルで拭き取り、カルス形成培地に置床して25℃で培養した。2〜3日後、アグロバクテリウムが培地上で見ることができるようになったら、葉片を50 mlチューブに移し、滅菌水で5回洗浄した後、カルス形成培地 (カナマイシン100 mg/l 、カルベニシリン250 mg/lを含む)に置床し、1〜2週間25℃で培養した。葉片が最初に比べて丸まり、表面に凹凸が生じたら、シュート形成培地 (カナマイシン100 mg/l、カルベニシリン250 mg/lを含む)に移した。さらに4〜6週間後、茎葉部の発達したシュートを切り取ってルート形成培地 (カナマイシン100 mg/l、カルベニシリン250 mg/lを含む)に移し、発根が見られるまで25℃で培養した。植物体がある程度の大きさに成長したものを鉢植えにした。
上記で作製したベクターを用いて、以下の方法により、タバコ植物体の形質転換を行った。
タバコ植物体(Nicotiana tabacum L. cv. Petit habana SR1)の種子を殺菌し、MS培地に播種した。無菌タバコの葉部を、葉脈を含まないように1×1 cm 程度の大きさに切り取り、滅菌水が入ったシャーレに葉の裏面が上になるように置き、上記＜２＞（２）で得られた100 mg/lのカナマイシンを含むLB培地で2晩培養したアグロバクテリウム懸濁液をシャーレに注いで3〜5分間浸した。葉片を取り出し、余分な菌液を滅菌キムタオルで拭き取り、カルス形成培地に置床して25℃で培養した。2〜3日後、アグロバクテリウムが培地上で見ることができるようになったら、葉片を50 mlチューブに移し、滅菌水で5回洗浄した後、カルス形成培地 (カナマイシン100 mg/l 、カルベニシリン250 mg/lを含む)に置床し、1〜2週間25℃で培養した。葉片が最初に比べて丸まり、表面に凹凸が生じたら、シュート形成培地 (カナマイシン100 mg/l、カルベニシリン250 mg/lを含む)に移した。さらに4〜6週間後、茎葉部の発達したシュートを切り取ってルート形成培地 (カナマイシン100 mg/l、カルベニシリン250 mg/lを含む)に移し、発根が見られるまで25℃で培養した。植物体がある程度の大きさに成長したものを鉢植えにした。
（３）ウェスタン解析
上記で作製した遺伝子組換えタバコ植物体の葉をサンプリングし、質量1mg あたり1 μl のSDS-sample buffer を添加した。95℃で2分間熱変性させ、電気泳動用の試料とした。15% アクリルアミドゲルを用いてタンパク質を分離後、エレクトロトランスファー装置を用いてPVDFメンブレン(Hybond-P; Amersham ）上にタンパク質をブロットした。抗HA 抗体(No. 11 867 423 001, Roche)を用いて、Stx2eB タンパク質を検出した。
上記で作製した遺伝子組換えタバコ植物体の葉をサンプリングし、質量1mg あたり1 μl のSDS-sample buffer を添加した。95℃で2分間熱変性させ、電気泳動用の試料とした。15% アクリルアミドゲルを用いてタンパク質を分離後、エレクトロトランスファー装置を用いてPVDFメンブレン(Hybond-P; Amersham ）上にタンパク質をブロットした。抗HA 抗体(No. 11 867 423 001, Roche)を用いて、Stx2eB タンパク質を検出した。
結果を図１８及び１９に示す。
ER-2×Stx2eB(PG12)、Chl-1×Stx2eB(PG12)、Chl-2×Stx2eB(PG12)、Chl-3×Stx2eB(PG12)で形質転換した植物体において、Stx2eBを高効率で蓄積するクローンが得られた。また、葉緑体型のＤＮＡ構築物についても、１つのStx2eBタンパク質を発現させた場合より、２つ又は３つのStx2eBをスペーサーを介してタンデムに連結したタンパク質を発現させた場合の方が、Stx2eBを効率よく蓄積するクローンを高い確率で得られることが判った。
なお、ER-2×Stx2eB(PG12)を発現させた場合のシグナルは、約15 kDa、約19 kDaおよび約22 kDaの位置に検出された。Chl-1×Stx2eB(PG12)を発現させた場合のシグナルは、約12 kDaの位置に検出された。Chl-2×Stx2eB(PG12)を発現させた場合のシグナルは、約19 ｋDaの位置に検出された。Chl-3×Stx2eB(PG12)を発現させた場合のシグナルは、約27 ｋDaの位置に検出された。これらは、何れもＤＮＡ構築物のデザインから推定した分子量と一致していた。
ER-2×Stx2eB(PG12)、Chl-1×Stx2eB(PG12)、Chl-2×Stx2eB(PG12)、Chl-3×Stx2eB(PG12)で形質転換した植物体において、Stx2eBを高効率で蓄積するクローンが得られた。また、葉緑体型のＤＮＡ構築物についても、１つのStx2eBタンパク質を発現させた場合より、２つ又は３つのStx2eBをスペーサーを介してタンデムに連結したタンパク質を発現させた場合の方が、Stx2eBを効率よく蓄積するクローンを高い確率で得られることが判った。
なお、ER-2×Stx2eB(PG12)を発現させた場合のシグナルは、約15 kDa、約19 kDaおよび約22 kDaの位置に検出された。Chl-1×Stx2eB(PG12)を発現させた場合のシグナルは、約12 kDaの位置に検出された。Chl-2×Stx2eB(PG12)を発現させた場合のシグナルは、約19 ｋDaの位置に検出された。Chl-3×Stx2eB(PG12)を発現させた場合のシグナルは、約27 ｋDaの位置に検出された。これらは、何れもＤＮＡ構築物のデザインから推定した分子量と一致していた。
＜６＞タバコ培養細胞を用いた形質転換実験
（１）Stx2eB形質転換用ベクターの構築
上記＜１＞（１）の方法で、ER-2×Stx2eB(PG12)を作製した。ER-2×Stx2eB(PG17)、ER-2×Stx2eB(PG22)は以下の方法により作製した。ＤＮＡ構築物のデザインを図２０に示す。
PG7-F プライマー(配列番号６５)とPG7-R プライマー(配列番号６６) をアニーリングしてT4 PNK でリン酸化した。得られたリン酸化DNA断片を、＜１＞（１）で得たER-1×Stx2eB(PG12)のBglIIギャップに挿入した(plasmid 14)。
また、PG12-F プライマー(配列番号４３)とPG12-R プライマー(配列番号４４) をアニーリングしてT4 PNK でリン酸化した。得られたリン酸化DNA断片を、ER-1×Stx2eB(PG12)のBglIIギャップに挿入した(plasmid 15)。
（１）Stx2eB形質転換用ベクターの構築
上記＜１＞（１）の方法で、ER-2×Stx2eB(PG12)を作製した。ER-2×Stx2eB(PG17)、ER-2×Stx2eB(PG22)は以下の方法により作製した。ＤＮＡ構築物のデザインを図２０に示す。
PG7-F プライマー(配列番号６５)とPG7-R プライマー(配列番号６６) をアニーリングしてT4 PNK でリン酸化した。得られたリン酸化DNA断片を、＜１＞（１）で得たER-1×Stx2eB(PG12)のBglIIギャップに挿入した(plasmid 14)。
また、PG12-F プライマー(配列番号４３)とPG12-R プライマー(配列番号４４) をアニーリングしてT4 PNK でリン酸化した。得られたリン酸化DNA断片を、ER-1×Stx2eB(PG12)のBglIIギャップに挿入した(plasmid 15)。
Plasmid 14からBamHIおよびBglIIを用いてStx2eB-PG17断片を切り出し、ER-1×Stx2eB(PG12)のBamHIギャップに挿入した(2×Stx2eB(PG17))。Plasmid 15からBamHIおよびBglIIを用いてStx2eB-PG22断片を切り出し、ER-1×Stx2eB(PG12)のBamHIギャップに挿入した(ER-2×Stx2eB(PG22))。
植物の安定形質転換体を用いて、Stx2eBの生産を行うために、前記各Stx2eB のＤＮＡ構築物を形質転換用ベクターにサブクローニングした。すなわち、ER-2×Stx2eB(PG12)、ER-2×Stx2eB(PG17)、ER-2×Stx2eB(PG22)をXbaIおよびSacIを用いてpBI121(Clontech 社)に挿入し、カリフラワーモザイクウイルス35S RNA プロモーター（35S pro．）とノパリン合成酵素遺伝子転写ターミネーター（NOS-T）の間に配置した。
（２）CTB形質転換用ベクターの構築
上記＜１＞（２）の方法で、ER-2×CTB(PG12)を作製した。ER-2×CTB(PG17)、ER-2×CTB(PG22)は以下の方法により作製した。各ＤＮＡ構築物のデザインを図２１に示す。
PG7-F プライマー(配列番号６５)とPG7-R プライマー(配列番号６６) をアニーリングしてT4 PNK でリン酸化した。得られたリン酸化DNA断片を、＜１＞（２）で得たER-1×CTB(PG12)のBglIIギャップに挿入した(plasmid 16)。PG12-F プライマー(配列番号４３)とPG12-R プライマー(配列番号４４) をアニーリングしてT4 PNK でリン酸化した。得られたリン酸化DNA断片を、ER-1×CTB(PG12)のBglIIギャップに挿入した(plasmid 17)。
Plasmid 16からBamHIおよびBglIIを用いてCTB-PG17断片を切り出し、ER-1×CTB(PG12)のBamHIギャップに挿入した(ER-2×CTB(PG17))。Plasmid 17からBamHIおよびBglIIを用いてCTB-PG22断片を切り出し、ER-1×CTB(PG12)のBamHIギャップに挿入した(ER-2×CTB(PG22))。
上記＜１＞（２）の方法で、ER-2×CTB(PG12)を作製した。ER-2×CTB(PG17)、ER-2×CTB(PG22)は以下の方法により作製した。各ＤＮＡ構築物のデザインを図２１に示す。
PG7-F プライマー(配列番号６５)とPG7-R プライマー(配列番号６６) をアニーリングしてT4 PNK でリン酸化した。得られたリン酸化DNA断片を、＜１＞（２）で得たER-1×CTB(PG12)のBglIIギャップに挿入した(plasmid 16)。PG12-F プライマー(配列番号４３)とPG12-R プライマー(配列番号４４) をアニーリングしてT4 PNK でリン酸化した。得られたリン酸化DNA断片を、ER-1×CTB(PG12)のBglIIギャップに挿入した(plasmid 17)。
Plasmid 16からBamHIおよびBglIIを用いてCTB-PG17断片を切り出し、ER-1×CTB(PG12)のBamHIギャップに挿入した(ER-2×CTB(PG17))。Plasmid 17からBamHIおよびBglIIを用いてCTB-PG22断片を切り出し、ER-1×CTB(PG12)のBamHIギャップに挿入した(ER-2×CTB(PG22))。
植物の安定形質転換体を用いて、CTBの生産を行うために、前記各CTB のＤＮＡ構築物を形質転換用ベクターにサブクローニングした。すなわち、ER-2×CTB(PG12)、ER-2×CTB(PG17)、ER-2×CTB(PG22)をXbaIおよびSacIを用いてpBI121(Clontech 社)に挿入し、カリフラワーモザイクウイルス35S RNA プロモーター（35S pro．）とノパリン合成酵素遺伝子転写ターミネーター（NOS-T）の間に配置した。
（３）形質転換実験及びウェスタン解析
形質転換実験及びウェスタン解析は、上記＜２＞（２）、（３）の方法で行った。
形質転換実験及びウェスタン解析は、上記＜２＞（２）、（３）の方法で行った。
（ａ）Stx2eBタンデム連結におけるスペーサーの長さの影響
結果を図２２に示す。
ER-2×Stx2eB(PG17)、ER-2×Stx2eB(PG22)を発現させた場合は、ER-2×Stx2eB(PG12)を発現させた場合と同程度のシグナルが、検出された。これより、PG17、PG22の何れも、PG12と同じ効果を示すことが判った。
なお、ER-2×Stx2eB(PG12)を発現させた場合には、約19 kDaおよび約22 kDaの位置にシグナルが検出され、ER-2×Stx2eB(PG17)を発現させた場合には、約19 kDaおよび約22 kDaの位置にシグナルが検出され、ER-2×Stx2eB(PG22)を発現させた場合は、約20 kDaおよび約23 kDaの位置にシグナルが検出された。これらは、何れもＤＮＡ構築物のデザインから推定した分子量と一致していた。
結果を図２２に示す。
ER-2×Stx2eB(PG17)、ER-2×Stx2eB(PG22)を発現させた場合は、ER-2×Stx2eB(PG12)を発現させた場合と同程度のシグナルが、検出された。これより、PG17、PG22の何れも、PG12と同じ効果を示すことが判った。
なお、ER-2×Stx2eB(PG12)を発現させた場合には、約19 kDaおよび約22 kDaの位置にシグナルが検出され、ER-2×Stx2eB(PG17)を発現させた場合には、約19 kDaおよび約22 kDaの位置にシグナルが検出され、ER-2×Stx2eB(PG22)を発現させた場合は、約20 kDaおよび約23 kDaの位置にシグナルが検出された。これらは、何れもＤＮＡ構築物のデザインから推定した分子量と一致していた。
（ｂ）CTBタンデム連結におけるスペーサーの長さの影響
結果を図２３に示す。
ER-2×CTB(PG17)、ER-2×CTB(PG22)を発現させた場合は、ER-2×CTB(PG12)を発現させた場合と同程度のシグナルが、検出された。これより、PG17、PG22の何れも、PG12と同じ効果を示すことが判った。
なお、ER-2×CTB(PG12)を発現させた場合には、約32 kDa、34 kDaおよび36 kDaの位置にシグナルが検出され、ER-2×CTB(PG17)を発現させた場合には、約32 kDa、34 kDaおよび36 kDaの位置にシグナルが検出され、ER-2×CTB(PG22)を発現させた場合は、約32 kDa、34 kDaおよび36 kDaの位置にシグナルが検出された。これらは、何れもＤＮＡ構築物のデザインから推定した分子量と一致していた。
結果を図２３に示す。
ER-2×CTB(PG17)、ER-2×CTB(PG22)を発現させた場合は、ER-2×CTB(PG12)を発現させた場合と同程度のシグナルが、検出された。これより、PG17、PG22の何れも、PG12と同じ効果を示すことが判った。
なお、ER-2×CTB(PG12)を発現させた場合には、約32 kDa、34 kDaおよび36 kDaの位置にシグナルが検出され、ER-2×CTB(PG17)を発現させた場合には、約32 kDa、34 kDaおよび36 kDaの位置にシグナルが検出され、ER-2×CTB(PG22)を発現させた場合は、約32 kDa、34 kDaおよび36 kDaの位置にシグナルが検出された。これらは、何れもＤＮＡ構築物のデザインから推定した分子量と一致していた。
本発明のハイブリッドタンパク質は、安定性が高く、高レベルで植物細胞内に蓄積する。また、本発明のＤＮＡ構築物を用いて植物に本発明のハイブリッドタンパク質を生産させることで、効率よい、志賀毒素、コレラ毒素、大腸菌易熱性毒素の経口ワクチンの生産が可能になる。
本発明は、免疫性を誘導するのに十分なレベルの細菌抗原を植物に発現させることを可能にする。本発明は、動物にトランスジェニック植物を食餌することで、動物に細菌抗原に対する免疫を低コストで付与することを可能にする。たとえば、ブタ浮腫病ワクチン、コレラワクチンの開発に有用である。
本発明は、免疫性を誘導するのに十分なレベルの細菌抗原を植物に発現させることを可能にする。本発明は、動物にトランスジェニック植物を食餌することで、動物に細菌抗原に対する免疫を低コストで付与することを可能にする。たとえば、ブタ浮腫病ワクチン、コレラワクチンの開発に有用である。
Claims (24)
- ２つ又は３つの、志賀毒素タンパク質、コレラ毒素タンパク質又は大腸菌易熱性毒素タンパク質が、それぞれ、下記の特徴（Ａ）及び（Ｂ）を有するペプチドを介してタンデムに連結された、ハイブリッドタンパク質、
（Ａ）アミノ酸の個数が１２〜３０個；
（Ｂ）プロリンの含有率が２０〜３５％。 - 前記ペプチドが、さらに下記の特徴（Ｃ）を有する、請求項１に記載のハイブリッドタンパク質、
（Ｃ）プロリンが、２アミノ酸置き、又は３アミノ酸置きに配置される。 - 前記ペプチドが、配列番号２、８２又は８４で表されるアミノ酸配列からなる、請求項２に記載のハイブリッドタンパク質。
- ２つの、志賀毒素タンパク質、コレラ毒素タンパク質又は大腸菌易熱性毒素タンパク質が、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるペプチドを介してタンデムに連結された、請求項３に記載のハイブリッドタンパク質。
- 志賀毒素タンパク質が、志賀毒素タンパク質のＢサブユニットである、請求項１〜４の何れか一項に記載のハイブリッドタンパク質。
- 志賀毒素タンパク質が、Ｓｔｘ２ｅタンパク質である、請求項１〜５の何れか一項に記載のハイブリッドタンパク質。
- コレラ毒素タンパク質が、コレラ毒素タンパク質のＢサブユニットである、請求項１〜４の何れか一項に記載のハイブリッドタンパク質。
- 配列番号１０、１２、１４又は１６で表されるアミノ酸配列を有する、請求項４に記載のハイブリッドタンパク質。
- 配列番号８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８又は１００で表されるアミノ酸配列を有する、請求項３に記載のハイブリッドタンパク質。
- アミノ末端に植物由来の分泌シグナルペプチドが付加された、請求項１〜９の何れか一項に記載のハイブリッドタンパク質。
- カルボキシル末端に小胞体残留シグナルペプチドが付加された、請求項１０に記載のハイブリッドタンパク質。
- アミノ末端に葉緑体移行シグナルペプチドが付加された、請求項１〜９の何れか一項に記載のハイブリッドタンパク質。
- 請求項１〜１２の何れか一項に記載のハイブリッドタンパク質をコードするＤＮＡを含むＤＮＡ構築物。
- 配列番号９、１１、１３又は１５で表される塩基配列を有するＤＮＡを含む請求項１３に記載のＤＮＡ構築物。
- 配列番号８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７又は９９で表される塩基配列を有するＤＮＡを含む請求項１３に記載のＤＮＡ構築物。
- ハイブリッドタンパク質をコードするＤＮＡが、植物由来のアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の５’−非翻訳領域に発現可能に連結されている、請求項１３〜１５の何れか一項に記載のＤＮＡ構築物。
- 前記植物由来のアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の５’−非翻訳領域がタバコ由来である、請求項１６に記載のＤＮＡ構築物。
- 配列番号２４〜２９の何れかで表される塩基配列を有する請求項１７に記載のＤＮＡ構築物。
- 配列番号１０１〜１１１の何れかで表される塩基配列を有する請求項１７に記載のＤＮＡ構築物。
- 請求項１３〜１９の何れか一項に記載のＤＮＡ構築物を含む組み換えベクター。
- 請求項２０に記載の組み換えベクターで形質転換された形質転換体。
- 形質転換体が形質転換植物細胞又は形質転換植物である、請求項２１に記載の形質転換体。
- 請求項２１又は２２に記載の形質転換体から得られる種子。
- 配列番号２、８２又は８４で表されるアミノ酸配列からなるペプチド。
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