JPWO2009133882A1 - 細菌毒素ワクチン - Google Patents

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Abstract

志賀毒素タンパク質等の細菌毒素タンパク質を、植物細胞を用いて効率よく生産する。志賀毒素タンパク質等の細菌毒素タンパク質が、下記の特徴(A)及び(B)を有するペプチドを介してタンデムに連結されたハイブリッドタンパク質をコードするDNAを含むDNA構築物を用いて植物細胞を形質転換し、植物細胞に前記細菌毒素タンパク質を生産させる。(A)アミノ酸の個数が12〜30個;(B)プロリンの含有率が20〜35%。

Description

本発明は、志賀毒素、コレラ毒素、大腸菌易熱性毒素などの細菌毒素により引き起こされる疾患に対するワクチンに用いるハイブリッドタンパク質、及び該ハイブリッドタンパク質を生産するためのDNA構築物に関する。
志賀毒素(Stx、ベロ毒素)は、病原性大腸菌のうち腸管出血性大腸菌(enterohemorrhagic Escherichia coli)が産生するタンパク質性外毒素である。志賀毒素は、出血性腸炎、溶血性尿毒症症候群、脳症などを引き起こす。
志賀毒素は、大きくStx1とStx2に分けられ、更にそれぞれがサブクラスに分けられる。Stx2としては、例えばブタ浮腫病を引き起こすStx2eが挙げられる。ブタ浮腫病は、離乳後1〜2週の子豚に高発生することが知られている。浮腫病菌の感染による致死率は、50〜90%と極めて高い。
また、コレラ毒素(CT)は、Vibrio choleraeが産生するタンパク質性外毒素である。CTは、激しい下痢や嘔吐を引き起こすことが知られている。
また、大腸菌易熱性毒素(LT)は、毒素原性大腸菌(enterotoxigenic Escherichia coli)が産生するタンパク質性内毒素である。LTは、下痢や嘔吐を引き起こすことが知られている。
Stx、LT、CTのいずれの細菌毒素も、細胞への付着に関与するBサブユニット5量体と毒性を持つAサブユニット1量体からなることが知られている。また、LTとCTは、構造的にも機能的にも類似していることが知られている。
これらの細菌毒素による疾患を予防する方法としては、ワクチンを、注射もしくは経鼻スプレーにより投与したり、経口的に投与したりする方法が知られている。
例えば、無毒化したStx2eタンパク質を組換え大腸菌を用いて生産させ、注射によりブタに投与する技術が知られている(非特許文献1)。しかしながら、組換え大腸菌による、無毒化したStx2eタンパク質の生産量は十分ではないという問題や注射によるワクチンの投与は、人間の労力がかかるなどの問題があった。
また、ワクチンを経口的に投与する方法については、労力軽減の観点から畜産分野で関心が高まっている。このような背景において、細菌毒素タンパク質を、トランスジェニック技術を用いて植物に生産させる技術の開発が行われている。例えば、LTタンパク質のBサブユニット(LTB)をコードするDNAを含み、該DNAを発現するトランスジェニック植物について記載されている(特許文献1、特許文献2)。また、LTタンパク質又はCTタンパク質をコードするDNAを発現するトランスジェニック植物について記載されている(特許文献3)。しかしながら、これらの技術では、タンパク質の生産量が十分でないという問題があった。また、LTBをレタスに生産させた例が報告されている(非特許文献2)。この研究では、コドンを改変したLTタンパク質のBサブユニットの遺伝子を、植物高発現プロモーターであるカリフラワーモザイクウイルス35S RNAプロモーター(CaMV35S)と、エンハンサーであるKozak配列を用いて、レタス内で発現させている。その結果、LTタンパク質のBサブユニットがレタスの総可溶性タンパク質の約2.0質量%蓄積したことが報告されている。しかしながら、この程度のタンパク質の蓄積量では、トランスジェニック植物を利用して細菌病の防除を効率的に行うには不十分であると考えられる。すなわち、目的の細菌毒素タンパク質を植物細胞内で効率良く生産、蓄積させる必要がある。
本発明者らは、植物由来の分泌シグナルペプチドがアミノ末端に付加されたStx2eタンパク質を、植物由来のアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の5'−非翻訳領域(ADH5’UTR)を用いて発現させることにより、Stx2eタンパク質をレタス等の植物に効率良く生産させ、植物体に高濃度で蓄積させることができることを見い出し、特許出願を行っている(特許文献4)。
特表平10−507916号公報 特開2000−166411号公報 特表2002−533068号公報 国際公開第2009/004842号パンフレット Makino et al., Microbial Pathogenesis, Volume 31,Number 1, July 2001, pp. 1-8(08) Kim et al., Protein Expression and Purification, Volume 51, Number 1, Jan 2006, pp. 22-27(06)
本発明は、Stxタンパク質、及びこれに類似の高次構造を有する他の細菌毒素タンパク質を、植物細胞を用いて、より効率よく生産することを課題とする。
本発明者らは、Stx2e、CT等の細菌毒素のタンパク質を特定の配列のペプチドを介して2つ又は3つタンデムに連結したハイブリッドタンパク質を、植物細胞に生産させた結果、細菌毒素のタンパク質を植物細胞内に高濃度に蓄積させることに成功し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は以下のとおりである。
(1)2つ又は3つの、志賀毒素タンパク質、コレラ毒素タンパク質又は大腸菌易熱性毒素タンパク質が、それぞれ、下記の特徴(A)及び(B)を有するペプチドを介してタンデムに連結された、ハイブリッドタンパク質、
(A)アミノ酸の個数が12〜30個;
(B)プロリンの含有率が20〜35%。
(2)前記ペプチドが、さらに下記の特徴(C)を有する、(1)に記載のハイブリッドタンパク質、
(C)プロリンが、2アミノ酸置き、又は3アミノ酸置きに配置される。
(3)前記ペプチドが、配列番号2、82又は84で表されるアミノ酸配列からなる、(2)に記載のハイブリッドタンパク質。
(4)2つの、志賀毒素タンパク質、コレラ毒素タンパク質又は大腸菌易熱性毒素タンパク質が、配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるペプチドを介してタンデムに連結された、(3)に記載のハイブリッドタンパク質。
(5)志賀毒素タンパク質が、志賀毒素タンパク質のBサブユニットである、(1)〜(4)の何れかに記載のハイブリッドタンパク質。
(6)志賀毒素タンパク質が、Stx2eタンパク質である、(1)〜(5)の何れかに記載のハイブリッドタンパク質。
(7)コレラ毒素タンパク質が、コレラ毒素タンパク質のBサブユニットである、(1)〜(4)の何れかに記載のハイブリッドタンパク質。
(8)配列番号10、12、14又は16で表されるアミノ酸配列を有する、(4)に記載のハイブリッドタンパク質。
(9)配列番号86、88、90、92、94、96、98又は100で表されるアミノ酸配列を有する、(3)に記載のハイブリッドタンパク質。
(10)アミノ末端に植物由来の分泌シグナルペプチドが付加された、(1)〜(9)の何れかに記載のハイブリッドタンパク質。
(11)カルボキシル末端に小胞体残留シグナルペプチドが付加された、(10)に記載のハイブリッドタンパク質。
(12)アミノ末端に葉緑体移行シグナルペプチドが付加された、(1)〜(9)の何れかに記載のハイブリッドタンパク質。
(13)(1)〜(12)の何れかに記載のハイブリッドタンパク質をコードするDNAを含むDNA構築物。
(14)配列番号9、11、13又は15で表される塩基配列を有するDNAを含む(13)に記載のDNA構築物。
(15)配列番号85、87、89、91、93、95、97又は99で表される塩基配列を有するDNAを含む(13)に記載のDNA構築物。
(16)ハイブリッドタンパク質をコードするDNAが、植物由来のアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の5’−非翻訳領域に発現可能に連結されている、(13)〜(15)の何れかに記載のDNA構築物。
(17)前記植物由来のアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の5’−非翻訳領域がタバコ由来である、(16)に記載のDNA構築物。
(18)配列番号24〜29の何れかで表される塩基配列を有する(17)に記載のDNA構築物。
(19)配列番号101〜111の何れかで表される塩基配列を有する(17)に記載のDNA構築物。
(20)(13)〜(19)の何れかに記載のDNA構築物を含む組み換えベクター。
(21)(20)に記載の組み換えベクターで形質転換された形質転換体。
(22)形質転換体が形質転換植物細胞又は形質転換植物である、(21)に記載の形質転換体。
(23)(21)又は(22)に記載の形質転換体から得られる種子。
(24)配列番号2、82又は84で表されるアミノ酸配列からなるペプチド。
Stx2eB発現ベクターのデザインを示す図である。図において、→は翻訳開始点を表し、▽は翻訳後に切断される部位を表す。 レタスプロトプラストを用いた一過性発現実験で得られた、Stx2eBの蓄積レベルを示す写真である。 レタスプロトプラストを用いた一過性発現実験で得られた、CTBの蓄積レベルを示す写真である。 Stx2eB−YFPの融合タンパク質をコードするDNA構築物のデザインを示す図である。図において、→は翻訳開始点を表し、▽は翻訳後に切断される部位を表す。 タバコ培養細胞プロトプラストを用いた一過性発現実験で得られた、Stx2eB−YFPの融合タンパク質の局在を示す写真である。 タバコ培養細胞プロトプラストを用いた一過性発現実験で得られた、Stx2eB−YFPの融合タンパク質の局在を示す写真である。 タバコ培養細胞プロトプラストを用いた一過性発現実験で得られた、ARF1pWTとARF1pDNの共発現における、液胞型GFP、およびStx2eB−YFPの融合タンパク質の局在を示す写真である。 タバコ培養細胞(BY2)を用いた形質転換実験で得られた、Stx2eBの蓄積レベルを示す写真である。各レーンの数字は、クローン番号を示す。 タバコ培養細胞(BY2)を用いた形質転換実験で得られた、Stx2eBの蓄積レベルを示す写真である。各レーンの数字は、クローン番号を示す。 タバコ培養細胞(BY2)を用いた形質転換実験で得られた、Stx2eBの蓄積レベルを示す写真である。各レーンの数字は、クローン番号を示す。 タバコ培養細胞(BY2)を用いた形質転換実験で得られた、Stx2eBの蓄積レベルを示すグラフである。各数字は、クローン番号を示す。 Stx2eBのmRNAレベルとStx2eBの蓄積レベルの関係を示すグラフである。 Stx2eBをコードするDNA構築物のデザインを示す図である。Aは小胞体型、Bは細胞質型、Cは葉緑体型のDNA構築物のデザインを示す。 CTBをコードするDNA構築物のデザインを示す図である。Aは小胞体型、Bは細胞質型、Cは葉緑体型のDNA構築物のデザインを示す。 レタスプロトプラストを用いた一過性発現実験で得られた、Stx2eBの蓄積レベルを示す写真である。 レタスプロトプラストを用いた一過性発現実験で得られた、CTBの蓄積レベルを示す写真である。 タバコ培養細胞(BY2)を用いた形質転換実験で得られた、Stx2eBの蓄積レベルを示す写真である。各レーンの数字は、クローン番号を示す。 タバコ植物体を用いた形質転換実験で得られた、Stx2eBの蓄積レベルを示す写真である。各レーンの数字は、クローン番号を示す。 タバコ植物体を用いた形質転換実験で得られた、Stx2eBの蓄積レベルを示す写真である。各レーンの数字は、クローン番号を示す。 Stx2eBをコードするDNA構築物のデザインを示す図である。 CTBをコードするDNA構築物のデザインを示す図である。 タバコ培養細胞(BY2)を用いた形質転換実験で得られた、Stx2eBの蓄積レベルを示す写真である。 タバコ培養細胞(BY2)を用いた形質転換実験で得られた、CTBの蓄積レベルを示す写真である。
本発明のハイブリッドタンパク質は、2つ又は3つの、志賀毒素(Stx)タンパク質、コレラ毒素(CT)タンパク質又は大腸菌易熱性毒素(LT)タンパク質が、それぞれ、下記の特徴(A)及び(B)を有するペプチドを介してタンデムに連結されている。
(A)アミノ酸の個数が12〜30個;
(B)プロリンの含有率が20〜35%。
志賀毒素(Stx)は、1型(Stx1)及び2型(Stx2)に分けられる。Stx1は、a〜dのサブクラスに、Stx2はa〜gのサブクラスにそれぞれ分類される。志賀毒素タンパク質は、毒性本体である1つのAサブユニットと腸管粘膜への侵入へ関与する5つのBサブユニットからなる。
このうち、例えば、Stx2eはブタ浮腫病毒素として知られており、そのAサブユニット(Stx2eA)は配列番号4のアミノ酸配列で表され、Bサブユニット(Stx2eB)は配列番号6のアミノ酸配列で表される。
Stx2eA及びStx2eBは、ブタに投与して免疫応答を引き起こすことができる限り、それぞれ、配列番号4又は配列番号6で表されるアミノ酸配列における1個又は数個のアミノ酸が、置換、欠失、挿入又は付加されていてもよい。前記「数個」としては、例えば、Stx2eAにおいて、好ましくは2〜30個、さらに好ましくは2〜20個、より好ましくは2〜10個であり、Stx2eBにおいて、好ましくは2〜10個、さらに好ましくは2〜5個、より好ましくは2〜3個である。
また、Stx2eA及びStx2eBは、それぞれ、配列番号4又は配列番号6で表されるアミノ酸配列と、好ましくは85%以上、さらに好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上の同一性を有し、かつブタに投与して免疫応答を引き起こすことができるものであってもよい。
コレラ毒素(CT)タンパク質は、毒性本体である1つのAサブユニット(CTA)と、配列番号8のアミノ酸配列で表される腸管粘膜への侵入へ関与する5つのBサブユニット(CTB)からなる。
CTBは、動物に投与して免疫応答を引き起こすことができる限り、配列番号8で表されるアミノ酸配列における1個又は数個のアミノ酸が、置換、欠失、挿入又は付加されていてもよい。前記「数個」としては、好ましくは2〜10個、さらに好ましくは2〜5個、より好ましくは2〜3個である。
また、CTBは、配列番号8で表されるアミノ酸配列と、好ましくは85%以上、さらに好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上の同一性を有し、かつ動物に投与して免疫応答を引き起こすことができるものであってもよい。
大腸菌易熱性毒素(LT)タンパク質は、毒性本体である1つのAサブユニットと腸管粘膜への侵入へ関与する5つのサブユニットからなる。
本明細書では、志賀毒素、コレラ毒素、大腸菌易熱性毒素を、まとめて「細菌毒素」ともいう。
前記ペプチドのアミノ酸の個数は、好ましくは12〜25個、さらに好ましくは12〜22個である。また、前記ペプチドのプロリンの含有率は、好ましくは、20〜27%、さらに好ましくは、20〜25%である。
また、前記ペプチドにおいて、プロリンは、好ましくは2つ置き、又は3つ置きに配置される。但し、この場合でも、ペプチドの末端においては、プロリン以外のアミノ酸が、5つ以内、好ましくは4つ以内の範囲で連続していてもよい。
また、前記ペプチドにおいては、プロリン以外のアミノ酸のうち、セリン、グリシン、アルギニン、リジン、スレオニン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン及びアスパラギン酸の合計含有率は、好ましくは70%以上、さらに好ましくは80%以上、より好ましくは90%以上である。また、前記ペプチドにおいては、プロリン以外のアミノ酸のうち、セリン、グリシン及びアスパラギンの合計含有率は、好ましくは70%以上、さらに好ましくは80%以上、より好ましくは90%以上である。また、前記ペプチドにおいては、プロリン以外のアミノ酸のうち、セリン及びグリシンの合計含有率は、好ましくは70%以上、さらに好ましくは80%以上、より好ましくは90%以上である。これは、これらのアミノ酸を多く含むペプチドは、二次構造(ベータシート構造やヘリックス構造)をとりにくいためである。
一方、前記ペプチドにおいては、プロリン以外のアミノ酸のうち、アラニン、メチオニン及びグルタミン酸の合計含有率は、好ましくは30%以下、さらに好ましくは20%以下、より好ましくは10%以下である。これは、これらのアミノ酸を多く含むペプチドは、ヘリックス構造をとりやすいためである。また、前記ペプチドにおいては、プロリン以外のアミノ酸のうち、トリプトファン、ロイシン、イソロインシン、チロシン、フェニルアラニン及びバリンの合計含有率は、好ましくは20%以下、さらに好ましくは10%以下、より好ましくは5%以下である。これは、これらのアミノ酸を多く含むペプチドは、ベータシート構造及びヘリックス構造をとりやすいためである。
前記ペプチドは、好ましくは、配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるペプチド(PG12)、配列番号82で表されるアミノ酸配列からなるペプチド(PG17)、又は、配列番号84で表されるアミノ酸配列からなるペプチド(PG22)から選ばれる。
本発明のハイブリッドタンパク質は、2つ又は3つの、AサブユニットとBサブユニットのハイブリッドタンパク質が、前記ペプチドを介してタンデムに連結されていてもよいし、2つ又は3つのAサブユニットが、前記ペプチドを介してタンデムに連結されていてもよいし、2つ又は3つのBサブユニットが、前記ペプチドを介してタンデムに連結されていてもよい。ただし、本発明のハイブリッドタンパク質が、Aサブユニットを含む場合には、Aサブユニットは無毒化されていることが好ましい。本発明のハイブリッドタンパク質は、2つ又は3つのBサブユニットが、前記ペプチドを介してタンデムに連結されていることが好ましい。また、本発明のハイブリッドタンパク質は、2つのBサブユニットが、PG12を介してタンデムに連結されていることが好ましい。
また、本発明のハイブリッドタンパク質は、さらにそのC末端に前記ペプチドが付加されていることが好ましい。特に、本発明のハイブリッドタンパク質は、そのC末端にPG12が付加されていることが好ましい。
本発明のハイブリッドタンパク質は、例えば、配列番号10、12、14、16、86、88、90、92、94、96、98又は100で表されるアミノ酸配列を有する。配列番号10で表されるアミノ酸配列を有するハイブリッドタンパク質は、2つのStx2eBが、PG12を介してタンデムに連結されている。配列番号12で表されるアミノ酸配列を有するハイブリッドタンパク質は、2つのCTBが、PG12を介してタンデムに連結されている。配列番号14で表されるアミノ酸配列を有するハイブリッドタンパク質は、2つのStx2eBが、PG12を介してタンデムに連結され、さらにそのC末端にPG12が連結されている。配列番号16で表されるアミノ酸配列を有するハイブリッドタンパク質は、2つのCTBが、PG12を介してタンデムに連結され、さらにそのC末端にPG12が連結されている。配列番号86で表されるアミノ酸配列を有するハイブリッドタンパク質は、3つのStx2eBが、それぞれ、PG12を介してタンデムに連結されている。配列番号88で表されるアミノ酸配列を有するハイブリッドタンパク質は、3つのStx2eBが、それぞれ、PG12を介してタンデムに連結され、さらにそのC末端にPG12が連結されている。配列番号90で表されるアミノ酸配列を有するハイブリッドタンパク質は、2つのStx2eBが、PG17を介してタンデムに連結され、さらにそのC末端にPG12が連結されている。配列番号92で表されるアミノ酸配列を有するハイブリッドタンパク質は、2つのStx2eBが、PG22を介してタンデムに連結され、さらにそのC末端にPG12が連結されている。配列番号94で表されるアミノ酸配列を有するハイブリッドタンパク質は、3つのCTBが、それぞれ、PG12を介してタンデムに連結されている。配列番号96で表されるアミノ酸配列を有するハイブリッドタンパク質は、3つのCTBが、それぞれ、PG12を介してタンデムに連結され、さらにそのC末端にPG12が連結されている。配列番号98で表されるアミノ酸配列を有するハイブリッドタンパク質は、2つのCTBが、PG17を介してタンデムに連結され、さらにそのC末端にPG12が連結されている。配列番号100で表されるアミノ酸配列を有するハイブリッドタンパク質は、2つのCTBが、PG22を介してタンデムに連結され、さらにそのC末端にPG12が連結されている。
前記PG12、PG17又はPG22などのペプチドを、前記細菌毒素タンパク質を連結するためのリンカーとして使用することにより、該細菌毒素タンパク質の植物細胞への蓄積レベルが増大する。
本発明のハイブリッドタンパク質は、好ましくは、そのアミノ末端に植物由来の分泌シグナルペプチド、又は葉緑体移行シグナルペプチドが付加されている。ここで、「付加」とは、前記分泌シグナルペプチドが、前記ペプチドを介して連結した2つ又は3つの前記細菌毒素タンパク質のアミノ末端に、直接結合している場合も、他のペプチドを介して結合している場合も含む概念である。
分泌シグナルペプチドは、好ましくはナス科(Solanaceae)、アブラナ科(Brassicaceae)、キク科(Asteraceae)に属する植物、さらに好ましくはタバコ属(Nicotiana)、シロイヌナズナ属(Arabidopsis)、アキノノゲシ属(Lactuca)等に属する植物、より好ましくはタバコ(Nicotiana tabacum)、シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)、レタス(Lactuca sativa)等に由来する。
また、好ましくはタバコのβ−Dグルカンエキソヒドロラーゼ(β-D-glucan exohydrolase)、タバコの38kDa ペルオキシダーゼ(GenBank Accession D42064)に由来する。
前記分泌シグナルペプチドとしては、例えば、タバコのβ−Dグルカンエキソヒドロラーゼに由来する、配列番号18で表されるアミノ酸配列を有しているペプチドが挙げられる。
葉緑体移行シグナルペプチドとしては、例えば、レタスRbcs(ルビスコスモールサブユニット)(GenBank ACCESSION D14001)由来葉緑体移行シグナルペプチド(トランジットペプチド、T.P.、配列番号79)が挙げられる。また、レタスRbcs由来葉緑体移行シグナルペプチドをコードするDNAの塩基配列は、例えば配列番号80で表される。本明細書において、アミノ末端に葉緑体移行シグナルペプチドが付加されたハイブリッドタンパク質を、葉緑体型(Chl)のハイブリッドタンパク質ともいい、該葉緑体型のハイブリッドタンパク質をコードするDNA構築物を、葉緑体型のDNA構築物ともいう。葉緑体型のハイブリッドタンパク質は、特にタバコなどの葉緑体が発達している植物に効率良く蓄積する。
また、アミノ末端に、分泌シグナルペプチドも葉緑体移行シグナルペプチドも付加されていないハイブリッドタンパク質を、細胞質型(Cyt)のハイブリッドタンパク質ともいい、該細胞質型のハイブリッドタンパク質をコードするDNA構築物を、細胞質型のDNA構築物ともいう。細胞質型のハイブリッドタンパク質においては、特に、3つの細菌毒素のBサブユニットが、前記ペプチドを介してタンデムに連結されていることが好ましい。
さらに、本発明のハイブリッドタンパク質は、そのカルボキシル末端に、小胞体残留シグナルペプチド、液胞移行シグナルペプチド等のシグナルペプチドが付加されていてもよい。ここで、「付加」とは、シグナルペプチドが、前記ハイブリッドタンパク質のカルボキシル末端に、直接結合している場合も、他のペプチドを介して結合している場合も含む概念である。本明細書において、アミノ末端に分泌シグナルペプチドが付加され、かつカルボキシル末端に小胞体残留シグナルペプチドが付加されたハイブリッドタンパク質を、小胞体型(ER)のハイブリッドタンパク質ともいい、該小胞体型のハイブリッドタンパク質をコードするDNA構築物を、小胞体型のDNA構築物ともいう。小胞体型のハイブリッドタンパク質は、特にレタスなどに効率良く蓄積する。
本発明のハイブリッドタンパク質は、そのカルボキシル末端に、好ましくは、小胞体残留シグナルペプチドが付加されている。小胞体残留シグナルペプチドとしてはKDEL配列(配列番号19)、HDEL配列(配列番号20)、KDEF配列(配列番号21)又はHDEF配列(配列番号22)を含む小胞体残留シグナルペプチドが挙げられる。
液胞移行シグナルペプチドとしては、好ましくはナス科(Solanaceae)、アブラナ科(Brassicaceae)、キク科(Asteraceae)に属する植物、さらに好ましくはタバコ属(Nicotiana)、シロイヌナズナ属(Arabidopsis)、セイヨウワサビ属(Armoracia)等に属する植物、より好ましくはタバコ(Nicotiana tabacum)、シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)、セイヨウワサビ(Armoracia rusticana)等に由来する。また、好ましくは、キチナーゼに由来する。タバコキチナーゼ由来の液胞移行シグナルペプチドのアミノ酸配列は、配列番号76で表される。また、タバコキチナーゼ由来の液胞移行シグナルペプチドをコードするDNAの塩基配列は、例えば配列番号75で表される。
また、好ましくは、セイヨウワサビペルオキシダーゼC1a アイソザイムに由来する。セイヨウワサビペルオキシダーゼC1a アイソザイム由来の液胞移行シグナルペプチドのアミノ酸配列は、配列番号78で表される。また、セイヨウワサビペルオキシダーゼC1a アイソザイム由来の液胞移行シグナルペプチドをコードするDNAの塩基配列は、例えば配列番号77で表される。本明細書において、アミノ末端に分泌シグナルペプチドが付加され、かつカルボキシル末端に液胞移行シグナルペプチドが付加されたハイブリッドタンパク質を、液胞型(Vac)のハイブリッドタンパク質ともいい、該液胞型のハイブリッドタンパク質をコードするDNA構築物を、液胞型のDNA構築物ともいう。
本発明のハイブリッドタンパク質は、化学的に合成することもできるし、遺伝子工学的に生産することもできる。遺伝子工学的に生産する方法については、後述する。
本発明のDNA構築物は、本発明のハイブリッドタンパク質をコードするDNAを含むことを特徴とする。
すなわち、本発明のDNA構築物は、2つ又は3つの細菌毒素タンパク質をコードするDNAが、前記ペプチドをコードするDNAを介してタンデムに連結されているDNAを含む。前記ペプチドをコードするDNAは、例えば配列番号1(PG12)、配列番号81(PG17)、配列番号83(PG22)で表される。細菌毒素タンパク質をコードするDNAとして、例えばStx2eAをコードするDNA(配列番号3)、Stx2eBをコードするDNA(配列番号5)やCTBをコードするDNA(配列番号7)が挙げられる。前記ペプチドをコードするDNAと細菌毒素タンパク質をコードするDNAは、終止コドンを除いて読み枠を合わせて連結される。
細菌毒素タンパク質をコードするDNAは、例えば、配列番号3、5、7の塩基配列に基づいて、一般的な遺伝子工学的な手法により得ることができる。具体的には、各細菌毒素を生産する細菌より、常法に従ってcDNAライブラリーを調製し、該ライブラリーから上記塩基配列に基づいて作製したプローブを用いて所望のクローンを選択する。また、上記塩基配列を基にした化学合成、上記塩基配列の5’及び3’末端の塩基配列をプライマーとし、ゲノムDNAを鋳型としたPCRなどにより合成することもできる。
本発明のハイブリッドタンパク質をコードするDNAは、例えば、配列番号9、11、13、15、85、87、89、91、93、95、97又は99で表される。
ハイブリッドタンパク質をコードするDNAは、該タンパク質を生産させる宿主細胞に応じて、ハイブリッドタンパク質の翻訳量が増大するように、ハイブリッドタンパク質を構成するアミノ酸を示すコドンが適宜改変されていることも好ましい。
コドン改変の方法としては、例えばKang et al. (2004)の方法を参考にすることができる。また、宿主細胞において使用頻度の高いコドンを選択したり、GC含量が高いコドンを選択したり、宿主細胞のハウスキーピング遺伝子において使用頻度の高いコドンを選択したりする方法が挙げられる。
また、ハイブリッドタンパク質をコードするDNAは、配列番号9、11、13、15、85、87、89、91、93、95、97又は99の塩基配列を有するDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAであってもよい。「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。例えば、同一性が高い二つのDNAどうし、好ましくは80%以上、より好ましくは90%以上、特に好ましくは95%以上の同一性を有する2つのDNAがハイブリダイズするが、それより同一性の低い2つのDNAがハイブリダイズしない条件が挙げられる。例えば2×SSC(330mM NaCl、30mM クエン酸)、42℃が挙げられ、好ましくは0.1×SSC(330mM NaCl、30mM クエン酸)、60℃が挙げられる。
本発明のDNA構築物において、好ましくは、前記ハイブリッドタンパク質をコードするDNAが、エンハンサーに発現可能に連結されている。ここで、「発現可能」とは、本発明のDNA構築物が適切なプロモーターを含むベクターに挿入され、該ベクターが適切な宿主細胞に導入された場合に、宿主細胞内で前記ハイブリッドタンパク質が生産されることをいう。また、「連結」とは、2つのDNAが直接結合している場合も、他の塩基配列を介して結合している場合も含む概念である。
エンハンサーとしては、Kozak配列や植物由来のアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の5’−非翻訳領域が挙げられる。特に好ましくは、前記ハイブリッドタンパク質をコードするDNAが、植物由来のアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の5’−非翻訳領域に発現可能に連結されている。
アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の5’−非翻訳領域とは、アルコールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の転写開始点から、翻訳開始点(ATG、メチオニン)の前までの塩基配列を含む領域をいう。該領域は、翻訳量増大機能を有している。「翻訳量増大機能」とは、構造遺伝子にコードされた情報が、転写後、翻訳されてタンパク質が産生される際に、翻訳により産生されるタンパク質量を増大させる機能をいう。前記領域は、植物に由来すればよいが、好ましくはナス科(Solanaceae)、アブラナ科(Brassicaceae)、キク科(Asteraceae)に属する植物、さらに好ましくはタバコ属(Nicotiana)、シロイヌナズナ属(Arabidopsis)、アキノノゲシ属(Lactuca)等に属する植物、より好ましくはタバコ(Nicotiana tabacum)、シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)、レタス(Lactuca sativa)等に由来する。
前記アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の5’−非翻訳領域としては、例えばタバコ(Nicotiana tabacum)由来のアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の5’−非翻訳領域(NtADH5'UTR)である、配列番号23で表される塩基配列からなる領域が特に好ましい。
植物由来のアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の5’−非翻訳領域は、例えば、アルコールデヒドロゲナーゼを高発現している植物培養細胞のアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子から単離することができる(特開2003−79372号公報参照)。また、タバコのアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の5’−非翻訳領域等、その塩基配列が確定しているものについては、化学合成、又は該領域の5’及び3’末端の塩基配列をプライマーとし、ゲノムDNAを鋳型としたPCRなどにより合成することもできる。また、塩基配列が確定している前記領域の一部をプローブとして用いることにより、他の植物のアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の5’−非翻訳領域を探索し、これを単離することもできる。
また、配列番号23の塩基配列で表されるような前記アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の5’−非翻訳領域は、翻訳量増大機能を保持している限り、1又は数個の塩基の置換、欠失、挿入又は付加を有していてもよい。前記「数個」としては、好ましくは2〜10個、さらに好ましくは2〜5個、特に好ましくは2〜3個である。
また、前記アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の5’−非翻訳領域と好ましくは85%以上、特に好ましくは90%以上の同一性を有し、かつ翻訳量増大機能を保持しているDNAを使用してもよい。
前記領域が目的とする翻訳量増大機能を有するか否かについては、例えばタバコ培養細胞においてGUS(β−グルクロニダーゼ)遺伝子又はルシフェラーゼ遺伝子をレポーター遺伝子としたトランジェントアッセイ、染色体に組み込ませた形質転換細胞でのアッセイ等により確認することができる。
本発明のDNA構築物は、例えば、配列番号24〜29、配列番号101〜111の何れかで表される塩基配列を有する。
配列番号24で表される塩基配列を有するDNA構築物は、タバコ由来のアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の5’−非翻訳領域(NtADH5'UTR、配列番号23)に、2つのStx2eBタンパク質を、PG12を介してタンデムに連結したハイブリッドタンパク質をコードするDNA(配列番号9)を連結したDNA構築物である。また、配列番号25で表される塩基配列を有するDNA構築物は、NtADH5'UTRに、2つのCTBタンパク質を、PG12を介してタンデムに連結したハイブリッドタンパク質をコードするDNA(配列番号11)を連結したDNA構築物である。
配列番号26で表される塩基配列を有するDNA構築物は、NtADH5'UTRに、2つのStx2eBタンパク質を、PG12を介してタンデムに連結し、アミノ末端に分泌シグナルペプチドを、カルボキシル末端に小胞体残留シグナルペプチドを付加したハイブリッドタンパク質をコードするDNAを連結したDNA構築物である。また、配列番号27で表される塩基配列を有するDNA構築物は、NtADH5'UTRに、2つのCTBタンパク質を、PG12を介してタンデムに連結し、アミノ末端に分泌シグナルペプチドを、カルボキシル末端に小胞体残留シグナルペプチドを付加したハイブリッドタンパク質をコードするDNAを連結したDNA構築物である。
配列番号28で表される塩基配列を有するDNA構築物は、NtADH5'UTRに、2つのStx2eBタンパク質を、PG12を介してタンデムに連結し、アミノ末端に分泌シグナルペプチドを付加し、カルボキシル末端にPG12を連結し、さらにそのカルボキシル末端に小胞体残留シグナルペプチドを付加したハイブリッドタンパク質をコードするDNAを連結したDNA構築物である。また、配列番号29で表される塩基配列を有するDNA構築物は、NtADH5'UTRに、2つのCTBタンパク質を、PG12を介してタンデムに連結し、アミノ末端に分泌シグナルペプチドを付加し、カルボキシル末端にPG12を連結し、さらにそのカルボキシル末端に小胞体残留シグナルペプチドを付加したハイブリッドタンパク質をコードするDNAを連結したDNA構築物である。
配列番号101で表される塩基配列を有するDNA構築物は、NtADH5'UTRに、2つのStx2eBタンパク質を、PG12を介してタンデムに連結し、カルボキシル末端にPG12を連結したハイブリッドタンパク質をコードするDNAを連結したDNA構築物である。
配列番号102で表される塩基配列を有するDNA構築物は、NtADH5'UTRに、2つのStx2eBタンパク質を、PG17を介してタンデムに連結し、アミノ末端に分泌シグナルペプチドを付加し、カルボキシル末端にPG12を連結し、さらにそのカルボキシル末端に小胞体残留シグナルペプチドを付加したハイブリッドタンパク質をコードするDNAを連結したDNA構築物である。また、配列番号103で表される塩基配列を有するDNA構築物は、NtADH5'UTRに、2つのStx2eBタンパク質を、PG22を介してタンデムに連結し、アミノ末端に分泌シグナルペプチドを付加し、カルボキシル末端にPG12を連結し、さらにそのカルボキシル末端に小胞体残留シグナルペプチドを付加したハイブリッドタンパク質をコードするDNAを連結したDNA構築物である。
配列番号104で表される塩基配列を有するDNA構築物は、NtADH5'UTRに、2つのStx2eBタンパク質を、PG12を介してタンデムに連結し、アミノ末端に葉緑体移行シグナルペプチドを付加し、カルボキシル末端にPG12を連結したハイブリッドタンパク質をコードするDNAを連結したDNA構築物である。
配列番号105で表される塩基配列を有するDNA構築物は、NtADH5'UTRに、3つのStx2eBタンパク質を、それぞれ、PG12を介してタンデムに連結し、カルボキシル末端にPG12を連結したハイブリッドタンパク質をコードするDNAを連結したDNA構築物である。
配列番号106で表される塩基配列を有するDNA構築物は、NtADH5'UTRに、3つのStx2eBタンパク質を、それぞれ、PG12を介してタンデムに連結し、アミノ末端に分泌シグナルペプチドを付加し、カルボキシル末端にPG12を連結し、さらにそのカルボキシル末端に小胞体残留シグナルペプチドを付加したハイブリッドタンパク質をコードするDNAを連結したDNA構築物である。
配列番号107で表される塩基配列を有するDNA構築物は、NtADH5'UTRに、3つのStx2eBタンパク質を、それぞれ、PG12を介してタンデムに連結し、アミノ末端に葉緑体移行シグナルペプチドを付加し、カルボキシル末端にPG12を連結したハイブリッドタンパク質をコードするDNAを連結したDNA構築物である。
配列番号108で表される塩基配列を有するDNA構築物は、NtADH5'UTRに、2つのCTBタンパク質を、PG12を介してタンデムに連結し、カルボキシル末端にPG12を連結したハイブリッドタンパク質をコードするDNAを連結したDNA構築物である。
配列番号109で表される塩基配列を有するDNA構築物は、NtADH5'UTRに、2つのCTBタンパク質を、PG17を介してタンデムに連結し、アミノ末端にシグナルペプチドを付加し、カルボキシル末端にPG12を連結し、さらにそのカルボキシル末端に小胞体残留シグナルペプチドを付加したハイブリッドタンパク質をコードするDNAを連結したDNA構築物である。また、配列番号110で表される塩基配列を有するDNA構築物は、NtADH5'UTRに、2つのCTBタンパク質を、PG22を介してタンデムに連結し、アミノ末端にシグナルペプチドを付加し、カルボキシル末端にPG12を連結し、さらにそのカルボキシル末端に小胞体残留シグナルペプチドを付加したハイブリッドタンパク質をコードするDNAを連結したDNA構築物である。
配列番号111で表される塩基配列を有するDNA構築物は、NtADH5'UTRに、2つのCTBタンパク質を、PG12を介してタンデムに連結し、アミノ末端に葉緑体移行シグナルペプチドを付加し、カルボキシル末端にPG12を連結したハイブリッドタンパク質をコードするDNAを連結したDNA構築物である。
本発明のDNA構築物は、一般的な遺伝子工学的手法により作製することができ、植物由来のアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の5’−非翻訳領域、植物由来の分泌シグナルペプチドをコードするDNA、葉緑体移行シグナルペプチドをコードするDNA、及び細菌毒素タンパク質をコードするDNA、小胞体残留シグナルペプチドをコードするDNAなどの各DNAを、それぞれ、適当な制限酵素により切断し、適当なリガーゼで連結することで構築することができる。
本発明の組換えベクターは、本発明のDNA構築物を含むことを特徴とする。本発明の組換えベクターは、本発明のハイブリッドタンパク質をコードするDNAが、ベクターが導入される宿主細胞において発現可能なように、ベクター内に挿入されていればよい。ベクターは、宿主細胞において複製可能なものであれば特に制限されず、例えば、プラスミドDNA、ウィルスDNA等が挙げられる。また、ベクターは薬剤耐性遺伝子等の選択マーカーを含むことが好ましい。プラスミドDNAは、大腸菌やアグロバクテリウムからアルカリ抽出法(Birnboim, H. C. & Doly, J. (1979) Nucleic acid Res 7: 1513)又はその変法等により調製することができる。また、市販のプラスミドとして、例えばpBI221、pBI121、pBI101、pIG121Hm等を用いることもできる。ウィルスDNAとしては、例えばpTB2(Donson et al., 1991)等を用いることができる(Donson J., Kerney CM., Hilf ME., Dawson WO. Systemic expression of a bacterial gene by a tobacco mosaic virus-based vector. Proc. Natl. Acad. Sci.(1991) 88: 7204-7208を参照。)
ベクター内で用いられるプロモーターは、ベクターが導入される宿主細胞に応じて適宜選択することができる。例えば、カリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーター(Odell et al.1985 Nature 313:810)、イネのアクチンプロモーター(Zhang et al.1991 Plant Cell 3:1155)、トウモロコシのユビキチンプロモーター(Cornejo et al.1993 Plant Mol.Biol.23:567)等が好ましく用いられる。また、ベクター内で用いられるターミネーターも、同様にベクターが導入される宿主細胞に応じて適宜選択することができる。例えば、ノパリン合成酵素遺伝子転写ターミネーター、カリフラワーモザイクウイルス35Sターミネーター等が好ましく用いられる。
本発明の組換えベクターは、例えば以下のようにして作製することができる。
まず、本発明のDNA構築物を適当な制限酵素で切断又はPCRによって制限酵素部位を付加し、ベクターの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入する。
本発明の形質転換体は、本発明の組換えベクターで形質転換されていることを特徴とする。形質転換に用いられる宿主細胞は真核細胞及び原核細胞の何れでもよい。
真核細胞としては、植物細胞が好ましく用いられ、中でもキク科(Asteraceae)、ナス科、アブラナ科、アカザ科に属する植物の細胞が好ましく用いられる。さらに、アキノノゲシ属(Lactuca)に属する植物の細胞、中でもレタス(Lactuca sativa)細胞が好ましく用いられる。宿主細胞としてレタス細胞を用いる場合は、ベクターは、カリフラワーモザイクウイルス35S RNAプロモーター等を用いることができる。
原核細胞としては、大腸菌(Escherichia coli)、アグロバクテリウム(Agrobacterium tumefaciens)等が用いられる。
本発明の形質転換体は、一般的な遺伝子工学的手法を用いて、本発明のベクターを宿主細胞に導入することにより作製することができる。例えば、アクロバクテリウムを利用した導入方法(Hood, et al., 1993, Transgenic, Res. 2:218,Hiei, et al.,1994 Plant J. 6:271)、エレクトロポレーション法(Tada, et al., 1990, Theor.Appl.Genet, 80:475)、ポリエチレングリコール法(Lazzeri, et al., 1991, Theor. Appl. Genet. 81:437)、パーティクルガン法(Sanford, et al., 1987, J. Part. Sci. tech. 5:27)、ポリカチオン法(Ohtsuki)などの方法を用いることが可能である。
本発明のベクターを宿主細胞に導入した後、選択マーカーの表現型によって本発明の形質転換体を選抜することができる。また、選抜した形質転換体を培養することにより、前記細菌毒素タンパク質を生産することができる。培養に用いる培地及び条件は、形質転換体の種に応じて適宜選択することができる。
また、宿主細胞が植物細胞の場合には、選抜した植物細胞を常法に従って培養することにより、植物体を再生することができ、植物細胞内又は植物細胞の細胞膜外に前記細菌毒素タンパク質を蓄積させることができる。例えば、植物細胞の種類により異なるが、ジャガイモであればVisserら(Theor.Appl.Genet 78:594(1989))の方法が挙げられ、タバコであればNagataとTakebe(Planta 99:12(1971))の方法が挙げられる。
レタスの場合は0.1 mg /lのNAA(ナフタレン酢酸)、0.05 mg/lのBA(ベンジルアデニン)および0.5 g/lのpolyvinylpyrrolidoneを含むMS培地でシュートの再生が可能であり、再生したシュートを0.5 g/lのpolyvinylpyrrolidoneを含む1/2 MS培地で培養することで発根が可能である。
また、本発明の種子は、上記のようにして再生した植物体から種子を採取することにより得ることができる。本発明の種子は適当な方法で播種し栽培することにより、前記細菌毒素タンパク質を生産する植物体とすることができ、このような植物体も、本発明の形質転換体に含まれる。
<1>一過性発現実験
(1)Stx2eB一過性発現ベクターの構築
Stx2eタンパク質のBサブユニット(Stx2eB)をコードするDNA(配列番号5)が、タバコアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の5'非翻訳領域(NtADH5'UTR)に連結されたDNA構築物を含むベクターを以下のようにして作製した。
ベクターのデザインを図1に示す。
1×Stx2eB(PG12)は、Stx2eBをコードするDNAにPG12をコードするDNAを連結したDNAを含むDNA構築物を示す。2×Stx2eB(PG12)は、2つのStx2eBをコードするDNAを、PG12をコードするDNAをスペーサーとして連結したDNAを含むDNA構築物を示す。
また、3つのStx2eBをコードするDNAを、PG12をコードするDNAをスペーサーとして連結したDNA構築物、3×Stx2eB(PG12)、及び4つのStx2eBをコードするDNAを、PG12をコードするDNAをスペーサーとして連結したDNA構築物、4×Stx2eB(PG12)も作製した。
具体的手法を以下に示す。
Kozak-stx2eb-Fプライマー(配列番号30)とstx2eb-R プライマー(配列番号31)を用いてPCRを行い、Stx2eBの成熟領域(ペリプラズムへの分泌シグナルペプチドを除く、Ala19〜Asn87)をコードするDNA断片を増幅した。得られたDNA断片をpBluescript II SKのEcoRV ギャップにクローニングした。得られたプラスミドをHindIII で切断し、T4 DNA polymerase で処理した後セルフライゲーションを行い、HindIII サイトをNheI サイトに変換した(plasmid 1)。
Stx2eBを、以下のようにして植物細胞における一過性発現用ベクター、pBI221(Clontech 社)のマルチクローニングサイト(MCS)に挿入した。
MCSにSalI、KpnI及びSmaIサイトを導入するために、SalKpnSma-F(配列番号32)とSalKpnSma-R (配列番号33)をアニーリング後、T4 polynucleotide kinase (T4 PNK)(TaKaRa 社)を用いてリン酸化し、pBI221 のSacI ギャップに挿入した(plasmid 2)。Plasmid 1 からXbaI とKpnI でStx2eB 断片を切り出し、plasmid 2に挿入し、カリフラワーモザイクウイルス35S RNA プロモーター(35S pro.)とノパリン合成酵素遺伝子転写ターミネーター(NOS-T)の間に配置した(plasmid 3)。
タバコアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の5'非翻訳領域(NtADH 5’UTR、配列番号23)を、ADH-221(Sato et. al., 2004(下記参照)) を鋳型として、ADH XbaI-F プライマー(配列番号34)及びADH NsiI-R プライマー(配列番号35)を用いたPCR により増幅した。β-D glucan exohydrolase(GenBank ACCESSION AB017502)の分泌シグナルペプチド(配列番号18)をコードするDNA領域(配列番号17)を、タバコゲノムDNAを鋳型にして、βD NsiI-F プライマー(配列番号36)およびβD BamHI-R プライマー(配列番号37)を用いて増幅した。得られたNtADH 5'UTR および分泌シグナルペプチドの各DNA断片をNsiI (TOYOBO社製)で処理し、Ligation High (TOYOBO社)を用いてライゲーションした後、末端を平滑化してpBluescript II SK (Stratagene社製)のEcoRV ギャップにクローニングした(plasmid 4)。
Satoh et al., The 5'-untranslated region of the tobacco alcohol dehydrogenase gene functions as an effective translational enhancer in plant. J. Biosci. Bioeng. (2004) 98,1-8
Plasmid 4をNsiI で処理し、T4 DNA polymerase (TOYOBO社製)で末端を平滑化した後セルフライゲーションして、NtADH の開始コドン(atg)と分泌シグナルペプチドの開始コドンが一致するように連結した(plasmid 5)。
NtADH 5'UTR 断片および分泌シグナルペプチドの連結DNAを、plasmid 5 を鋳型として用い、ADH XbaI-F プライマー(配列番号34)とβD BamHI-R プライマー(配列番号35)を用いて増幅した。得られたDNA 断片を、XbaI とBamHI で処理し、plasmid 3のXbaI-BamHI ギャップに挿入した(plasmid 6)。
小胞体残留シグナル(配列番号38)付加のために、HDEL-Fプライマー(配列番号39)とHDEL-Rプライマー(配列番号40)をアニーリングしてT4 PNK でリン酸化し、アルカリフォスファターゼ(AP)(TaKaRa社)で脱リン酸化処理したplasmid 6のBglIIギャップに挿入した(plasmid 7)。
Stx2eB検出用のペプチドタグとして、HAタグを付加した。HA タグの付加のために、HA-F プライマー(配列番号41)とHA-R プライマー(配列番号42) をアニーリングしてT4 PNK でリン酸化した。得られたリン酸化HA断片を、plasmid 7のBglIIギャップに挿入した(plasmid 8)。
Stx2eBとHAタグの間にPG12スペーサー(配列番号2)を挿入した。PG12-F プライマー(配列番号43)とPG12-R プライマー(配列番号44) をアニーリングしてT4 PNK でリン酸化した。得られたリン酸化DNA断片を、plasmid 8のBglIIギャップに挿入した(1×Stx2eB(PG12))。
1×Stx2eB(PG12) からBamHIおよびBglIIを用いて2eB-PG12断片を切り出し、1×Stx2eB(PG12)のBamHIギャップに挿入した(2×Stx2eB(PG12))。また、1×Stx2eB(PG12) からBamHIおよびBglIIを用いてStx2eB-PG12断片を切り出し、2×Stx2eB(PG12)のBamHIギャップに挿入した(3×Stx2eB(PG12))。また、2×Stx2eB(PG12) からBamHIおよびBglIIを用いて2×(Stx2eB-PG12)断片を切り出し、2×Stx2eB(PG12)のBamHIギャップに挿入した(4×Stx2eB(PG12))。
(2)CTB一過性発現ベクターの構築
CTタンパク質のBサブユニット(CTB)をコードするDNAが、タバコアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の5'非翻訳領域に連結されたDNA構築物(2×CTB(PG12))を含むベクターを以下のようにして作製した。
CTBの成熟領域(ペリプラズムへの分泌シグナルを除く、Thr22〜Asn124) (配列番号8)をコードするDNA(配列番号7)を作製した。まず、以下の10種類のプライマーを作製した。
CTB1:配列番号45
CTB2:配列番号46
CTB3:配列番号47
CTB4:配列番号48
CTB5:配列番号49
CTB6:配列番号50
CTB7:配列番号51
CTB8:配列番号52
CTB9:配列番号53
CTB10:配列番号54
上記で合成したプライマーを使用し、Kang et al.(2004)に記載の条件で、PCRを行った。すなわち、CTB1とCTB2、CTB3とCTB 4、CTB5とCTB 6、CTB7とCTB 8、CTB9とCTB 10の組み合わせでPCRを行い、それぞれ72bp(1+2)、74bp(3+4)、67bp(5+6)、82bp(7+8)、68bp(9+10)のDNA断片を合成した。次にCTB1+2とCTB3+4、CTB3+4とCTB5+6、CTB5+6とCTB7+8、CTB7+8とCTB9+10の組み合わせで2nd PCRを行い、135bp(1+2+3+4)、132bp(3+4+5+6)、138bp(5+6+7+8)および141bp(7+8+9+10)のDNA断片を合成した。次にCTB1+2+3+4とCTB3+4+5+6、およびCTB5+6+7+8とCTB7+8+9+10の組み合わせで3rd PCRを行い、194bp(1+2+3+4+5+6)および198bp(5+6+7+8+9+10)のDNA断片を合成した。最後にCTB1+2+3+4+5+6とCTB5+6+7+8+9+10の組み合わせでPCRを行い、315bpのCTBコード領域にBamHIサイトとBglIIサイトが付加されたDNA断片を合成した。
上記で作製したDNA断片をBamHIおよびBglIIで処理し、Plasmid 8のBamHI-BglIIギャップに挿入した(plasmid 9)。
CTBとHAタグの間にPG12スペーサー(配列番号2)を挿入した。PG12-F プライマー(配列番号43)とPG12-R プライマー(配列番号44) をアニーリングしてT4 PNK でリン酸化した。得られたリン酸化DNA断片を、plasmid 9のBglIIギャップに挿入した(1×CTB(PG12))。
1×CTB(PG12) からBamHIおよびBglIIを用いてCTB-PG12断片を切り出し、1×CTB(PG12)のBamHIギャップに挿入した(2×CTB(PG12))。
(3)レタスプロトプラストを用いた一過性発現実験
鉢植えしたレタス(Lactuca sativa)(グリーンウェーブ)の葉、約1gをメスで0.5cm四方程度に切り刻んでリーフディスクを作製した。リーフディスクを500mMマンニトールに浸漬し、1時間振盪した。リーフディスクを50mlのプロトプラスト化酵素溶液 (1.0% cellulose RS (ヤクルト本社), 0.25% macerozyme R-10 (ヤクルト本社), 400mM マンニトール, 8mM CaCl2, and 5mM Mes-KOH, pH 5.6)に浸漬し、室温で2時間振盪した。プロトプラスト懸濁液を、100μmおよび40μmのメッシュに通してリーフディスクを取り除いた。プロトプラスト懸濁液を60gで5分間遠心し、プロトプラストを沈殿させた。プロトプラストを167mMマンニトールおよび133mM CaCl2を含む水溶液に再懸濁し、40gで5分間遠心した。プロトプラストを333mMマンニトールおよび66.7mM CaCl2を含む水溶液に再懸濁し、40gで5分間遠心した。プロトプラストをW5 solution (154mM NaCl, 125mM CaCl2, 5mM KCl, 2mM Mes-KOH, pH 5.6)に懸濁し、氷上に1時間静置した。プロトプラスト懸濁液を40gで5分間遠心し、プロトプラスト濃度が2×106個/mlになるように、MaMg solution (400mM マンニトール, 15mM MgCl2, and 4mM Mes-KOH, pH 5.6)に懸濁した。
上記で作製した各Stx2eB一過性発現ベクター、CTB一過性発現ベクターを、それぞれ120μlのプロトプラスト懸濁液と混合した後、140μlのPEG solution (400mM マンニトール, 100mM Ca(NO3)2, and 40% PEG)を加えて穏やかに混和し、7分間インキュベートした。約20分間かけて1mlのW5 solutionをプロトプラスト懸濁液に添加した。遠心により沈殿させたプロトプラストに、400mM マンニトールとW5 solutionを4:1の割合で混ぜた溶液を1ml添加した。遠心により沈殿させたプロトプラストに、1%スクロース、400mM マンニトールおよび0.3mMカルベニシリンを含むLS培地を1ml添加し、暗所25℃で24時間培養した。
(4)ウェスタン解析
遠心により回収したプロトプラストに30μlのSDS-sample buffer(4% (w/v) SDS, 20% (w/v) glycerol, 0.05%(w/v) ブロモフェノールブルー, 300mM β−メルカプトエタノール, 125mM Tris-HCl, pH 6.8)を加え、95℃で2分間熱変性させ、試料とした。15%アクリルアミドゲルを用いてタンパク質を分離後、エレクトロトランスファー装置を用いてPVDFメンブレン(Hybond-P; Amersham 社)上にタンパク質をブロットした。抗HA抗体(No. 11 867 423 001, Roche)を用いて、Stx2eB及びCTBを検出した。
(a)Stx2eBの連結数の影響
結果を図2に示す。
1×Stx2eB(PG12)を発現させた場合には、約8.5kDaの位置にシグナルが検出された。2×Stx2eB(PG12)を発現させた場合は、約17kDaの位置に、1×Stx2eB(PG12)を発現させた場合と同程度のシグナルが検出された。3×Stx2eB(PG12)を発現させた場合は、約26kDaの位置に、1×Stx2eB(PG12)を発現させた場合より小さいシグナルが検出された。これらは、何れもDNA構築物のデザインから推定した分子量と一致していた。また、4×Stx2eB(PG12)を発現させた場合は、特異的シグナルは検出限界以下だった。
以上の結果から、2×Stx2eB(PG12)及び3×Stx2eB(PG12)を発現させると、複数のStx2eBタンパク質が連結したハイブリッドタンパク質が生産できることが明らかとなった。
また、上記各DNA構築物は、HAタグを1分子ずつ含むため(図1参照)、2×Stx2eB(PG12)を発現させた場合は、1×Stx2eB(PG12)を発現させた場合の約2倍のStx2eBタンパク質に相当するタンパク質を蓄積していると考えられる。すなわち、2つのStx2eBタンパク質をコードするDNAを、PG12をコードするDNAを介して連結した場合には、極めて効率よくStx2eBタンパク質を生産できることが分かった。
一方、3つのStx2eBタンパク質をコードするDNA、4つのStx2eBタンパク質をコードするDNAを、PG12をコードするDNAを介して連結した場合には、Stx2eBタンパク質の生産は、1つのStx2eBタンパク質の同等以下であることが分かった。
なお、本実験で作製した、カルボキシル末端にPG12が付加されたStx2eBタンパク質(1×Stx2eB(PG12))は、これが付加されないStx2eBタンパク質に比して、タンパク質の蓄積レベルが高い傾向にあることが判っている。これより、本発明のハイブリッドタンパク質は、カルボキシル末端にPG12が付加されることが好ましい形態であると推察される。
(b)CTBの連結数の影響
結果を図3に示す。
1×CTB(PG12)を発現させた場合には、約20kDaの位置にシグナルが検出された。2×CTB(PG12)を発現させた場合は、約33kDa及び約35kDaの位置に、1×CTB(PG12)を発現させた場合よりも大きいシグナルが検出された。
以上の結果から、2×CTB(PG12)を発現させると、2つのCTBタンパク質が連結したハイブリッドタンパク質が生産できることが明らかとなった。これらは、何れもDNA構築物のデザインから推定した分子量と一致していた。
また、上記各DNA構築物は、HAタグを1分子ずつ含むため、2×CTB(PG12)を発現させた場合は、1×CTB(PG12)を発現させた場合の2倍より大きいCTBタンパク質に相当するタンパク質が蓄積していると考えられる。すなわち、2つのCTBタンパク質をコードするDNAを、PG12をコードするDNAを介して連結した場合には、極めて効率よくCTBタンパク質を生産できることが分かった。
(5)Stx2eBの局在解析
細胞におけるStx2eBの局在を解析するために、Stx2eBと黄色蛍光タンパク質YFPのハイブリッドタンパク質の一過性発現ベクターを作製した。ベクターのデザインを図4に示す。1×Stx2eB(PG12)-YFPは、1つのStx2eBタンパク質をコードするDNAとYFPをコードするDNAが連結したDNA構築物を示す。2×Stx2eB(PG12)-YFPは、2つのStx2eBタンパク質がPG12を介して連結したハイブリッドタンパク質をコードするDNAとYFPをコードするDNAが連結したDNA構築物を示す。また、スペーサーとしてPG12の代わりにRS(Arg Ser)を用いた2×Stx2eB(RS)-YFPも作製した。
以下に、具体的な手法を示す。
まず、YFPのDNA断片を、pEYFP(Clontech)を鋳型とし、YFP-Fプライマー(配列番号55)およびYFP-Rプライマー(配列番号56)を用いてPCRにより増幅した。得られたDNA断片をBamHIおよびBglIIで処理し、Plasmid 8のBamHI-BglIIギャップに挿入した(ER-YFP)。
plasmid 1からBamHIおよびBglIIを用いてStx2eB断片を切り出し、前記1×Stx2eB(PG12)のBamHIギャップに挿入した(2×Stx2eB(RS))。
1×Stx2eB(PG12)、2×Stx2eB(RS)および2×Stx2eB(PG12)から、BamHI-BglIIを用いて、それぞれ、Stx2eB-PG12断片、2×(Stx2eB-RS)断片および2×(Stx2eB-PG12)断片を切り出し、ER-YFPのBamHIギャップに挿入した(1×Stx2eB(PG12)-YFP、2×Stx2eB(RS)-YFPおよび2×Stx2eB(PG12)-YFP)。
一方、小胞体を可視化するためのベクターとして、小胞体局在型の赤色蛍光タンパク質(mRFP、Campbell R.E. et al. (2002)(下記参照))の発現ベクターを作製した。mRFP-Fプライマー(配列番号57)とmRFP-R プライマー(配列番号58)を用いてPCR を行った。得られたDNA断片をBamHIおよびBglIIで処理し、Plasmid 8のBamHI-BglIIギャップに挿入した(ER-mRFP)。
Campbell R.E. et al., A monomeric red fluorescent protein (2002) Proc. Nat. Acad. Sci. 99: 7877-7882
前記Stx2eBの発現ベクターとmRFP発現ベクターを上記の方法と同様にして、タバコ培養細胞(BY2)のプロトプラストに導入し、共焦点顕微鏡観察(LSM510, Zeiss)を用いて観察した。
結果を図5及び6に示す。
図5は、Stx2eB−YFPハイブリッドタンパク質の局在を示す。2×Stx2eB(PG12)-YFPを発現させた場合は、Stx2eB−YFPハイブリッドタンパク質が100個/細胞程度、顆粒状に局在しているのが観察された。1×Stx2eB(PG12)-YFP及び2×Stx2eB(RS)-YFPを発現させた場合には、顆粒は観察されなかった。
図6中、最左列の画像Aは、あるプロトプラストにおけるmRFPの局在を示す。mRFPの局在は、小胞体の位置を反映する。中列の画像Bは、同一のプロトプラストにおけるStx2eB−YFPハイブリッドタンパク質の局在を示す。最右列の画像は、画像A及びBの合成画像である。合成画像から、Stx2eB−YFPハイブリッドタンパク質は、小胞体に、顆粒状に局在していることが判る。
(6)小胞輸送機能の影響
2×Stx2eB(PG12)の蓄積及び凝集が、タンパク質翻訳後のどの過程で起こるのか調べた。
2×Stx2eB(PG12)-YFPを、シロイヌナズナの小胞輸送調節タンパク質ARF1、又はそのドミナントネガティブ変異体ARF1(Q71L)(ARF1DN)と共発現させた。また、ARF1DNの共発現により、ゴルジ体へのタンパク質の輸送が阻害されるレポーターとして、液胞型GFP(vacuole-GFP)と各ARF1の共発現を行った。各ARF1の発現ベクターの構築は以下のように行った。なお、液胞型GFP発現ベクターの作製は、下記文献を参照して行うことができる。
Di Sansebastiano et. al., Specific accumulation of GFP in a non-acidic vacuolar compartment via a C-terminal propeptide-mediated sorting pathway. Plant J. (1998) 15, 449-457
小胞輸送調節タンパク質として、シロイヌナズナARF1(GenBank Accession No. M95166)およびそのドミナントネガティブ変異体ARF1(Q71L) (Masaki Takeuchi et al., 2002(下記参照))の発現ベクターを構築した。シロイヌナズナ幼植物体から調製したcDNAを鋳型として、ARF1-Fプライマー(配列番号59)およびARF1-Rプライマー(配列番号60)を用いてPCRを行った。得られたDNA断片をpBluescript (Stratagene)のEcoRVギャップにサブクローニングした。また、ARFQL-Fプライマー(配列番号61)およびARFQL-Rプライマー(配列番号62)を用いてPCRを行い、71番目のグルタミン残基をロイシン残基に置換した。得られた各ARF1断片を、一過性発現用ベクターpBI221にサブクローニングした。
作製したそれぞれのベクターを、上記と同様の方法でタバコ培養細胞のプロトプラストに導入し、各タンパク質を共発現させ、2×Stx2eB(PG12)の局在を調べた。
結果を図7に示す。
2×Stx2eB(PG12)-YFPを、ARF1と共発現させた場合も、ARF1(Q71L)と共発現させた場合も、2×Stx2eB(PG12)-YFPを単独で発現させた場合と同様に顆粒が観察された。一方、ARF(Q711)との共発現は、小胞体からの液胞型GFPの移出を阻害した。これより、顆粒の形成は、小胞体からゴルジ体への小胞輸送過程に依存しないと推測された。
<2>タバコ培養細胞を用いた形質転換実験
(1)形質転換用ベクターの構築
上記と同様にして、1×Stx2eB(PG12)、2×Stx2eB(PG12)、3×Stx2eB(PG12)、4×Stx2eB(PG12)を作製した。
さらに、PG12に代えて、RS(Arg Ser)、PG7(配列番号63)又はSG12(配列番号64)をスペーサーに用いたDNA構築物、2×Stx2eB(RS)、2×Stx2eB(PG7)、2×Stx2eB(SG12)を以下の方法で作製した。
前記plasmid 8のStx2eBとHAタグの間にPG7スペーサー(配列番号63)を挿入した。PG7-F プライマー(配列番号65)とPG7-R プライマー(配列番号66) をアニーリングしてT4 PNK でリン酸化した。得られたリン酸化DNA断片を、plasmid 8のBglIIギャップに挿入した(plasmid 10)。
また、Stx2eBとHAタグの間にSG12スペーサー(配列番号64)を挿入した。SG12-F プライマー(配列番号67)とSG12-R プライマー(配列番号68) をアニーリングしてT4 PNK でリン酸化した。得られたリン酸化DNA断片を、plasmid 8のBglIIギャップに挿入した(plasmid 11)。
Plasmid 1からBamHIおよびBglIIを用いてStx2eB断片を切り出し、1×Stx2eB(PG12)のBamHIギャップに挿入した(2×Stx2eB(RS))。Plasmid 10からBamHIおよびBglIIを用いてStx2eB-PG7断片を切り出し、1×Stx2eB(PG12)のBamHIギャップに挿入した(2×Stx2eB(PG7))。Plasmid 11からBamHIおよびBglIIを用いてStx2eB-SG12断片を切り出し、1×Stx2eB(PG12)のBamHIギャップに挿入した(2×Stx2eB(SG12))。
植物の安定形質転換体を用いて、Stx2eBの生産を行うために、前記各Stx2eB のDNA構築物を形質転換用ベクターにサブクローニングした(ベクターのデザインは、図1を参照)。1×Stx2eB(PG12)、2×Stx2eB(PG12)、3×Stx2eB(PG12)、4×Stx2eB(PG12)、2×Stx2eB(RS)、2×Stx2eB(PG7)および2×Stx2eB(SG12)をXbaIおよびSacIを用いてpBI121(Clontech 社)に挿入し、カリフラワーモザイクウイルス35S RNA プロモーター(35S pro.)とノパリン合成酵素遺伝子転写ターミネーター(NOS-T)の間に配置した。
(2)タバコ培養細胞の形質転換
作製した形質転換用ベクターを、エレクトロポレーション法を用いて、アグロバクテリウム(Agrobacterium tumefacience EHA105)に導入した。カナマイシン100 mg/l を含む5 mlのLB培地で28℃、2晩培養したアグロバテリウム培養液100 μlと、培養4日目のタバコ培養細胞(Nicotiana tabacum, cv BY2)の懸濁液 5〜10 mlをシャーレに入れて混合し、25℃で2 晩、暗所下で静置して共存培養した。アグロバクテリウムを除くため、シャーレの中の培養液を 15 mlの遠心管に移して遠心(1000 rpm, 5分間, 4℃)し、上清を取り除いた。改変LS培地を入れて遠心分離 (1000 rpm, 5分間, 4℃)し、細胞を洗浄した。この洗浄操作を4回繰り返し、アグロバクテリウムを除いた。残ったBY2細胞をカナマイシン(100 mg/l)の入った改変 LS寒天培地に置き、25℃で暗黒下に静置して培養した。約2-3週間後にカルス化した細胞を新しいプレートに移植し、増殖するクローンを選択した。
(3)ウェスタン解析を用いたStx2eBタンパク質の半定量
平板培地にて培養したタバコ培養細胞を遠心チューブに回収し、細胞の重量1mg あたり1 μl のSDS-sample buffer を添加した。95℃で2分間熱変性させ、電気泳動用の試料とした。15% アクリルアミドゲルを用いてタンパク質を分離後、エレクトロトランスファー装置を用いてPVDFメンブレン(Hybond-P; Amersham )上にタンパク質をブロットした。抗HA 抗体(No. 11 867 423 001, Roche)を用いて、Stx2eB タンパク質を検出した。濃度既知のHAタグ付きStx2eBの希釈系列を作製してゲルにロードし、シグナル強度を元に検量線を作成して、各サンプル中のStx2eBタンパク質量を算出した。
以下に、結果を示す。
(a)Stx2eBの連結数の影響
結果を図8及び9に示す。
1×Stx2eB(PG12)を発現させた場合には、約10kDa及び約17kDaの位置にシグナルが検出された。それぞれ、シグナルペプチドが切断されたStx2eB、及びシグナルペプチドが切断されていないStx2eBであると推定される。2×Stx2eB(PG12)を発現させた場合は、約19kDaの位置に、1×Stx2eB(PG12)を発現させた場合と同程度のシグナルが検出された。3×Stx2eB(PG12)を発現させた場合は、約26kDaの位置に、1×Stx2eB(PG12)を発現させた場合より小さいシグナルが検出された。何れも、DNA構築物のデザインから推定した分子量と一致していた。また、4×Stx2eB(PG12)を発現させた場合は、特異的シグナルは検出限界以下だった(データ非掲載)。
これより、1×Stx2eB(PG12)や3×Stx2eB(PG12)よりも、2×Stx2eB(PG12)の方がStx2eBが高蓄積することがわかった。
(b)スペーサーの影響
結果を図10及び図11に示す。
Stx2eBに相当するシグナルの強度から、Stx2eBの蓄積レベルは、スペーサーとしてPG12を用いた場合が最も多かった。次いでPG7とSG12を用いた場合が同程度で多かった。また、RSを用いた場合が最も少なかった。このことから、2つのStx2eB 間のスペーサーの長さ及びアミノ酸配列が、2×Stx2eBタンパク質の蓄積レベルに影響を与えることがわかった。
(4)リアルタイムPCR によるmRNA の定量
タンパク質の蓄積レベルが転写レベルに影響を受けるのかを調べた。
上記で得られた各形質転換BY2細胞から、RNeasy Mini Kit (Qiagen)を用いてRNA を調製した。DNase 処理を行った後、Transcriptor Reverse Transcriptase (Roche)を用いて逆転写を行った。SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems)を用いて、リアルタイムPCR を行った。Stx2eB mRNA の定量には、各コンストラクト間で共通の配列である、NtADH 5'UTR とシグナルペプチドを含む領域を増幅するプライマーセット(配列番号69および配列番号70)を用いた。UBQ-Fプライマー(配列番号71)およびUBQ-Rプライマー(配列番号72)を用いてBY2ユビキチン遺伝子の発現量を定量し、stx2eB 遺伝子のmRNA レベルを補正した。なお1×Stx2eB(PG12) mRNAレベルは、定量値を1/2にして算出した。
結果を図12に示す。
mRNAあたりのStx2eタンパク質の蓄積レベルは、2×Stx2eB (PG12)を発現させた細胞の方が、2×Stx2eB (RS)又は1×Stx2eB (PG12)を発現させた細胞よりも大きい傾向にあった。これより、スペーサーの相違は、転写レベルに影響を与えるのではなく、翻訳レベル或いは翻訳後のタンパク質の安定性に影響を与えることがわかった。また、2×Stx2eBタンパク質が顆粒状に局在していたという結果を併せて考察すると、スペーサーは、翻訳後のタンパク質の安定性に影響を与えているものと考えられる。
<3>一過性発現実験
(1)Stx2eB一過性発現ベクターの構築
上記<1>(1)の方法で、1×Stx2eB(PG12)、2×Stx2eB(PG12)、3×Stx2eB(PG12)、4×Stx2eB(PG12)の一過性発現ベクターを構築した(図13−A)。以下、これらのベクターをそれぞれ、ER-1×Stx2eB(PG12)、ER-2×Stx2eB(PG12)、ER-3×Stx2eB(PG12)、ER-4×Stx2eB(PG12)という。なお、「ER」は小胞体型を意味する。
また、以下の方法で細胞質型(Cyt)のDNA構築物を含む一過性発現ベクター(図13−B)、及び葉緑体型(Chl)のDNA構築物を含む発現ベクター(図13−C)を構築した。なお、これらのDNA構築物は、小胞体型のハイブリッドタンパク質とできるだけ近い構造のハイブリッドタンパク質を発現させる目的で、小胞体残留シグナルペプチドをコードするDNAを含むようにデザインされた。但し、当該DNA構築物は、分泌シグナルペプチドをコードするDNAを含まないので、生産されたハイブリッドタンパク質において、小胞体残留シグナルペプチドは、その機能(タンパク質の小胞体への残留)を発揮しない。
NtADH 5'UTR 断片を、ADH XbaI-Fプライマー(配列番号34)とADH BamHI-Rプライマー(配列番号112)を用いたPCRにより増幅し、得られたDNA 断片をXbaI とBamHI で処理した。NtADH 5'-UTR のXbaI-BamHI 断片を、ER-1×Stx2eB(PG12)、ER-2×Stx2eB(PG12)、ER-3×Stx2eB(PG12)およびER-4×Stx2eB(PG12)のそれぞれのXbaI-BamHI ギャップに挿入し、細胞質型Stx2eBベクターであるCyt-1×Stx2eB(PG12)、Cyt-2×Stx2eB(PG12)、Cyt-3×Stx2eB(PG12)およびCyt-4×Stx2eB(PG12)を作製した。
NtADH 5’-UTR断片を、ADH XbaI-F プライマー(配列番号34)及びADH NsiI-R プライマー(配列番号35)を用いたPCR により増幅した。レタスRbcs(ルビスコスモールサブユニット)(GenBank ACCESSION D14001)由来葉緑体移行シグナルペプチド(トランジットペプチド、T.P.)をコードするDNA 断片(配列番号80)を、レタス葉cDNA を鋳型として、TP NsiI-F プライマー(配列番号113)およびTP BamHI-R プライマー (配列番号114)を用いてPCRにより増幅した。得られたNtADH 5'-UTR および分泌シグナルペプチドの各DNA断片をNsiI (TOYOBO社製)で処理し、Ligation High (TOYOBO社)を用いてライゲーションした後、末端を平滑化してpBluescript II SK (Stratagene社製)のEcoRV ギャップにクローニングした(plasmid 12)。Plasmid 12をNsiI で処理し、T4 DNA polymerase (TOYOBO社製)で末端を平滑化した後セルフライゲーションして、NtADHの開始コドンとRbcsの開始コドンが一致するように融合した(plasmid 13)。Plasmid 13からXbaIとBamHIを用いてNtADH 5'-UTR-T.P.融合断片を切り出し、ER-1×Stx2eB(PG12)、ER-2×Stx2eB(PG12)、ER-3×Stx2eB(PG12)およびER-4×Stx2eB(PG12)のそれぞれのXbaI-BamHI ギャップに挿入し、葉緑体型Stx2eBベクターであるChl-1×Stx2eB(PG12)、Chl-2×Stx2eB(PG12)、Chl-3×Stx2eB(PG12) およびChl-4×Stx2eB(PG12)を作製した。
(2)CTB一過性発現ベクターの作製
上記<1>(2)の方法で、1×CTB(PG12)、2×CTB(PG12)の一過性発現ベクターを構築した(図14−A)。以下、これらのベクターをそれぞれ、ER-1×CTB(PG12)、ER-2×CTB(PG12)という。
また、以下の方法で細胞質型(Cyt)のDNA構築物を含む一過性発現ベクター(図14−B)、及び葉緑体型(Chl)のDNA構築物を含む発現ベクター(図14−C)を構築した。
ER-1×CTB(PG12) からBamHIおよびBglIIを用いてCTB-PG12断片を切り出し、上記<3>(1)で作製したCyt-1×Stx2eB(PG12)のBamHI-BglIIギャップおよびChl-1×Stx2eB(PG12)のBamHI-BglIIギャップに挿入して細胞質型及び葉緑体型の1×CTB(PG12)を作製した(Cyt-1×CTB(PG12)、Chl-1×CTB(PG12))。
続いて、ER-2×CTB(PG12) からBamHIおよびBglIIを用いて2×(CTB-PG12)断片を切り出し、Cyt-1×Stx2eB(PG12)のBamHI-BglIIギャップおよびChl-1×Stx2eB(PG12)のBamHI-BglIIギャップに挿入して細胞質型および葉緑体型の2×CTB(PG12)を作製した(Cyt-2×CTB(PG12)、Chl-2×CTB(PG12))。
(3)一過性発現実験及びウェスタン解析
上記<1>(3)と同様にしてレタスのプロトプラストを用いて一過性発現実験を行った。続いて、<1>(4)と同様にしてStx2eB、CTBを検出した。
(a)Stx2eBの連結数の影響
結果を図15に示す。
ER-1×Stx2eB(PG12)を発現させた場合には、約10 kDaの位置にシグナルが検出された。ER-2×Stx2eB(PG12)を発現させた場合は、約19 kDaの位置に、ER-1×Stx2eB(PG12)を発現させた場合より大きいシグナルが検出された。ER-3×Stx2eB(PG12)を発現させた場合は、約27 kDaの位置に、ER-1×Stx2eB(PG12)を発現させた場合より大きいシグナルが検出された。これらは、何れもDNA構築物のデザインから推定した分子量と一致していた。また、ER-4×Stx2eB(PG12)を発現させた場合は、特異的シグナルは検出限界以下だった。
Cyt-1×Stx2eB(PG12)を発現させた場合には、特異的シグナルは検出限界以下だった。Cyt-2×Stx2eB(PG12)を発現させた場合は、約20 kDaの位置に、シグナルが検出された。Cyt-3×Stx2eB(PG12)を発現させた場合は、約30 kDaの位置に、シグナルが検出された。これらは、何れもDNA構築物のデザインから推定した分子量と一致していた。また、Cyt-4×Stx2eB(PG12)を発現させた場合は、特異的シグナルは検出限界以下だった。
Chl-1×Stx2eB(PG12)を発現させた場合には、約14 kDaの位置にわずかにシグナルが検出された。Chl-2×Stx2eB(PG12)を発現させた場合は、約22 kDaの位置に、ER-3×Stx2eB(PG12)を発現させた場合と同程度のシグナルが検出された。Chl-3×Stx2eB(PG12)を発現させた場合は、約30 kDaの位置に、Chl-2×Stx2eB(PG12)を発現させた場合と同程度のシグナルが検出された。これらは、何れもDNA構築物のデザインから推定した分子量と一致していた。また、Chl-4×Stx2eB(PG12)を発現させた場合は、約34 kDaの位置に、わずかにシグナルが検出された。
上記各DNA構築物は、HAタグを1分子ずつ含むため(図13参照)、2つのStx2eBをコードするDNAを発現させた場合、3つのStx2eBをコードするDNAを発現させた場合は、1つのStx2eBをコードするDNAを発現させた場合のそれぞれ約2倍、約3倍のStx2eBタンパク質に相当するタンパク質を蓄積していると考えられる。
従って、小胞体型(ER)、細胞質型(Cyt)、葉緑体型(Chl)の何れのDNA構築物を発現させた場合においても、1つのStx2eBタンパク質を発現させた場合より、2つ又は3つのStx2eBをスペーサーを介してタンデムに連結したタンパク質を発現させた場合の方が、Stx2eBを効率よく蓄積させることができることが判った。
(b)CTBの連結数の影響
結果を図16に示す。
ER-1×CTB(PG12)を発現させた場合には、約17 kDaの位置にシグナルが検出された。ER-2×CTB(PG12)を発現させた場合は、約28 kDa及び30 kDaの位置に、ER-1×Stx2eB(PG12)を発現させた場合より大きいシグナルが検出された。これらは、何れもDNA構築物のデザインから推定した分子量と一致していた。
Cyt-1×CTB(PG12)を発現させた場合には、約14 kDaの位置にわずかにシグナルが検出された。Cyt-2×CTB(PG12)を発現させた場合は、約26 kDaの位置に、ER-2×CTB(PG12)を発現させた場合と同程度のシグナルが検出された。これらは、何れもDNA構築物のデザインから推定した分子量と一致していた。
Chl-1×CTB(PG12)を発現させた場合には、約14 kDaの位置にシグナルが検出された。Chl-2×CTB(PG12)を発現させた場合は、約26 kDaの位置に、ER-2×CTB(PG12)を発現させた場合と同程度のシグナルが検出された。これらは、何れもDNA構築物のデザインから推定した分子量と一致していた。
以上より、小胞体型(ER)、細胞質型(Cyt)、葉緑体型(Chl)の何れのDNA構築物を発現させた場合においても、1つのCTBタンパク質を発現させた場合より、2つのCTBをスペーサーを介してタンデムに連結したタンパク質を発現させた場合の方が、CTBを効率よく蓄積させることができることが判った。
<4>タバコ培養細胞を用いた形質転換実験
(1)形質転換用ベクターの構築
上記で作製したER-2×Stx2eB(PG12)、Cyt-1×Stx2eB(PG12)、Cyt-2×Stx2eB(PG12)、Cyt-3×Stx2eB(PG12)を用いて、形質転換実験を行った。
形質転換用ベクターの作製は、上記<2>(1)の方法と同様に行った。
(2)タバコ培養細胞の形質転換及びウェスタン解析
形質転換実験及びウェスタン解析は、上記<2>(2)、(3)の方法と同様に行った。
結果を図17に示す。
ER-2×Stx2eB(PG12)を発現させた場合には、約19 kDa、21kDaおよび23 kDaの位置にシグナルが検出された。Cyt-1×Stx2eB(PG12)を発現させた場合には、特異的シグナルは検出限界以下だった。Cyt-2×Stx2eB(PG12)を発現させた場合には、約19 kDaの位置にシグナルが検出された。Cyt-3×Stx2eB(PG12)を発現させた場合には、約27 kDaの位置に、Cyt-2×Stx2eB(PG12)を発現させた場合より大きいシグナルが検出された。
以上より、タバコ培養細胞の形質転換体においても、1つのStx2eBタンパク質を発現させた場合より、2つ又は3つのStx2eBをスペーサーを介してタンデムに連結したタンパク質を発現させた場合の方が、Stx2eBを効率よく蓄積させることができることが判った。また、タバコ培養細胞の形質転換体において、細胞質型のDNA構築物を発現させた場合には、特に、3つのStx2eBをスペーサーを介してタンデムに連結したタンパク質を発現させた場合に、Stx2eBを効率よく蓄積させることができることが判った。
また、タバコ培養細胞の形質転換体においては、細胞質型のDNA構築物を発現させた場合より、小胞体型のDNA構築物を発現させた場合の方が、Stx2eBを効率よく蓄積させることができることが判った。
<5>タバコ植物体を用いた形質転換実験
(1)形質転換用ベクターの構築
上記で作製したER-2×Stx2eB(PG12)、Chl-1×Stx2eB(PG12)、Chl-2×Stx2eB(PG12)、Chl-3×Stx2eB(PG12)を用いて、形質転換実験を行った。
形質転換用ベクターの作製は、上記<2>(1)の方法と同様に行った。
(2)タバコ植物体の形質転換
上記で作製したベクターを用いて、以下の方法により、タバコ植物体の形質転換を行った。
タバコ植物体(Nicotiana tabacum L. cv. Petit habana SR1)の種子を殺菌し、MS培地に播種した。無菌タバコの葉部を、葉脈を含まないように1×1 cm 程度の大きさに切り取り、滅菌水が入ったシャーレに葉の裏面が上になるように置き、上記<2>(2)で得られた100 mg/lのカナマイシンを含むLB培地で2晩培養したアグロバクテリウム懸濁液をシャーレに注いで3〜5分間浸した。葉片を取り出し、余分な菌液を滅菌キムタオルで拭き取り、カルス形成培地に置床して25℃で培養した。2〜3日後、アグロバクテリウムが培地上で見ることができるようになったら、葉片を50 mlチューブに移し、滅菌水で5回洗浄した後、カルス形成培地 (カナマイシン100 mg/l 、カルベニシリン250 mg/lを含む)に置床し、1〜2週間25℃で培養した。葉片が最初に比べて丸まり、表面に凹凸が生じたら、シュート形成培地 (カナマイシン100 mg/l、カルベニシリン250 mg/lを含む)に移した。さらに4〜6週間後、茎葉部の発達したシュートを切り取ってルート形成培地 (カナマイシン100 mg/l、カルベニシリン250 mg/lを含む)に移し、発根が見られるまで25℃で培養した。植物体がある程度の大きさに成長したものを鉢植えにした。
(3)ウェスタン解析
上記で作製した遺伝子組換えタバコ植物体の葉をサンプリングし、質量1mg あたり1 μl のSDS-sample buffer を添加した。95℃で2分間熱変性させ、電気泳動用の試料とした。15% アクリルアミドゲルを用いてタンパク質を分離後、エレクトロトランスファー装置を用いてPVDFメンブレン(Hybond-P; Amersham )上にタンパク質をブロットした。抗HA 抗体(No. 11 867 423 001, Roche)を用いて、Stx2eB タンパク質を検出した。
結果を図18及び19に示す。
ER-2×Stx2eB(PG12)、Chl-1×Stx2eB(PG12)、Chl-2×Stx2eB(PG12)、Chl-3×Stx2eB(PG12)で形質転換した植物体において、Stx2eBを高効率で蓄積するクローンが得られた。また、葉緑体型のDNA構築物についても、1つのStx2eBタンパク質を発現させた場合より、2つ又は3つのStx2eBをスペーサーを介してタンデムに連結したタンパク質を発現させた場合の方が、Stx2eBを効率よく蓄積するクローンを高い確率で得られることが判った。
なお、ER-2×Stx2eB(PG12)を発現させた場合のシグナルは、約15 kDa、約19 kDaおよび約22 kDaの位置に検出された。Chl-1×Stx2eB(PG12)を発現させた場合のシグナルは、約12 kDaの位置に検出された。Chl-2×Stx2eB(PG12)を発現させた場合のシグナルは、約19 kDaの位置に検出された。Chl-3×Stx2eB(PG12)を発現させた場合のシグナルは、約27 kDaの位置に検出された。これらは、何れもDNA構築物のデザインから推定した分子量と一致していた。
<6>タバコ培養細胞を用いた形質転換実験
(1)Stx2eB形質転換用ベクターの構築
上記<1>(1)の方法で、ER-2×Stx2eB(PG12)を作製した。ER-2×Stx2eB(PG17)、ER-2×Stx2eB(PG22)は以下の方法により作製した。DNA構築物のデザインを図20に示す。
PG7-F プライマー(配列番号65)とPG7-R プライマー(配列番号66) をアニーリングしてT4 PNK でリン酸化した。得られたリン酸化DNA断片を、<1>(1)で得たER-1×Stx2eB(PG12)のBglIIギャップに挿入した(plasmid 14)。
また、PG12-F プライマー(配列番号43)とPG12-R プライマー(配列番号44) をアニーリングしてT4 PNK でリン酸化した。得られたリン酸化DNA断片を、ER-1×Stx2eB(PG12)のBglIIギャップに挿入した(plasmid 15)。
Plasmid 14からBamHIおよびBglIIを用いてStx2eB-PG17断片を切り出し、ER-1×Stx2eB(PG12)のBamHIギャップに挿入した(2×Stx2eB(PG17))。Plasmid 15からBamHIおよびBglIIを用いてStx2eB-PG22断片を切り出し、ER-1×Stx2eB(PG12)のBamHIギャップに挿入した(ER-2×Stx2eB(PG22))。
植物の安定形質転換体を用いて、Stx2eBの生産を行うために、前記各Stx2eB のDNA構築物を形質転換用ベクターにサブクローニングした。すなわち、ER-2×Stx2eB(PG12)、ER-2×Stx2eB(PG17)、ER-2×Stx2eB(PG22)をXbaIおよびSacIを用いてpBI121(Clontech 社)に挿入し、カリフラワーモザイクウイルス35S RNA プロモーター(35S pro.)とノパリン合成酵素遺伝子転写ターミネーター(NOS-T)の間に配置した。
(2)CTB形質転換用ベクターの構築
上記<1>(2)の方法で、ER-2×CTB(PG12)を作製した。ER-2×CTB(PG17)、ER-2×CTB(PG22)は以下の方法により作製した。各DNA構築物のデザインを図21に示す。
PG7-F プライマー(配列番号65)とPG7-R プライマー(配列番号66) をアニーリングしてT4 PNK でリン酸化した。得られたリン酸化DNA断片を、<1>(2)で得たER-1×CTB(PG12)のBglIIギャップに挿入した(plasmid 16)。PG12-F プライマー(配列番号43)とPG12-R プライマー(配列番号44) をアニーリングしてT4 PNK でリン酸化した。得られたリン酸化DNA断片を、ER-1×CTB(PG12)のBglIIギャップに挿入した(plasmid 17)。
Plasmid 16からBamHIおよびBglIIを用いてCTB-PG17断片を切り出し、ER-1×CTB(PG12)のBamHIギャップに挿入した(ER-2×CTB(PG17))。Plasmid 17からBamHIおよびBglIIを用いてCTB-PG22断片を切り出し、ER-1×CTB(PG12)のBamHIギャップに挿入した(ER-2×CTB(PG22))。
植物の安定形質転換体を用いて、CTBの生産を行うために、前記各CTB のDNA構築物を形質転換用ベクターにサブクローニングした。すなわち、ER-2×CTB(PG12)、ER-2×CTB(PG17)、ER-2×CTB(PG22)をXbaIおよびSacIを用いてpBI121(Clontech 社)に挿入し、カリフラワーモザイクウイルス35S RNA プロモーター(35S pro.)とノパリン合成酵素遺伝子転写ターミネーター(NOS-T)の間に配置した。
(3)形質転換実験及びウェスタン解析
形質転換実験及びウェスタン解析は、上記<2>(2)、(3)の方法で行った。
(a)Stx2eBタンデム連結におけるスペーサーの長さの影響
結果を図22に示す。
ER-2×Stx2eB(PG17)、ER-2×Stx2eB(PG22)を発現させた場合は、ER-2×Stx2eB(PG12)を発現させた場合と同程度のシグナルが、検出された。これより、PG17、PG22の何れも、PG12と同じ効果を示すことが判った。
なお、ER-2×Stx2eB(PG12)を発現させた場合には、約19 kDaおよび約22 kDaの位置にシグナルが検出され、ER-2×Stx2eB(PG17)を発現させた場合には、約19 kDaおよび約22 kDaの位置にシグナルが検出され、ER-2×Stx2eB(PG22)を発現させた場合は、約20 kDaおよび約23 kDaの位置にシグナルが検出された。これらは、何れもDNA構築物のデザインから推定した分子量と一致していた。
(b)CTBタンデム連結におけるスペーサーの長さの影響
結果を図23に示す。
ER-2×CTB(PG17)、ER-2×CTB(PG22)を発現させた場合は、ER-2×CTB(PG12)を発現させた場合と同程度のシグナルが、検出された。これより、PG17、PG22の何れも、PG12と同じ効果を示すことが判った。
なお、ER-2×CTB(PG12)を発現させた場合には、約32 kDa、34 kDaおよび36 kDaの位置にシグナルが検出され、ER-2×CTB(PG17)を発現させた場合には、約32 kDa、34 kDaおよび36 kDaの位置にシグナルが検出され、ER-2×CTB(PG22)を発現させた場合は、約32 kDa、34 kDaおよび36 kDaの位置にシグナルが検出された。これらは、何れもDNA構築物のデザインから推定した分子量と一致していた。
本発明のハイブリッドタンパク質は、安定性が高く、高レベルで植物細胞内に蓄積する。また、本発明のDNA構築物を用いて植物に本発明のハイブリッドタンパク質を生産させることで、効率よい、志賀毒素、コレラ毒素、大腸菌易熱性毒素の経口ワクチンの生産が可能になる。
本発明は、免疫性を誘導するのに十分なレベルの細菌抗原を植物に発現させることを可能にする。本発明は、動物にトランスジェニック植物を食餌することで、動物に細菌抗原に対する免疫を低コストで付与することを可能にする。たとえば、ブタ浮腫病ワクチン、コレラワクチンの開発に有用である。

Claims (24)

  1. 2つ又は3つの、志賀毒素タンパク質、コレラ毒素タンパク質又は大腸菌易熱性毒素タンパク質が、それぞれ、下記の特徴(A)及び(B)を有するペプチドを介してタンデムに連結された、ハイブリッドタンパク質、
    (A)アミノ酸の個数が12〜30個;
    (B)プロリンの含有率が20〜35%。
  2. 前記ペプチドが、さらに下記の特徴(C)を有する、請求項1に記載のハイブリッドタンパク質、
    (C)プロリンが、2アミノ酸置き、又は3アミノ酸置きに配置される。
  3. 前記ペプチドが、配列番号2、82又は84で表されるアミノ酸配列からなる、請求項2に記載のハイブリッドタンパク質。
  4. 2つの、志賀毒素タンパク質、コレラ毒素タンパク質又は大腸菌易熱性毒素タンパク質が、配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるペプチドを介してタンデムに連結された、請求項3に記載のハイブリッドタンパク質。
  5. 志賀毒素タンパク質が、志賀毒素タンパク質のBサブユニットである、請求項1〜4の何れか一項に記載のハイブリッドタンパク質。
  6. 志賀毒素タンパク質が、Stx2eタンパク質である、請求項1〜5の何れか一項に記載のハイブリッドタンパク質。
  7. コレラ毒素タンパク質が、コレラ毒素タンパク質のBサブユニットである、請求項1〜4の何れか一項に記載のハイブリッドタンパク質。
  8. 配列番号10、12、14又は16で表されるアミノ酸配列を有する、請求項4に記載のハイブリッドタンパク質。
  9. 配列番号86、88、90、92、94、96、98又は100で表されるアミノ酸配列を有する、請求項3に記載のハイブリッドタンパク質。
  10. アミノ末端に植物由来の分泌シグナルペプチドが付加された、請求項1〜9の何れか一項に記載のハイブリッドタンパク質。
  11. カルボキシル末端に小胞体残留シグナルペプチドが付加された、請求項10に記載のハイブリッドタンパク質。
  12. アミノ末端に葉緑体移行シグナルペプチドが付加された、請求項1〜9の何れか一項に記載のハイブリッドタンパク質。
  13. 請求項1〜12の何れか一項に記載のハイブリッドタンパク質をコードするDNAを含むDNA構築物。
  14. 配列番号9、11、13又は15で表される塩基配列を有するDNAを含む請求項13に記載のDNA構築物。
  15. 配列番号85、87、89、91、93、95、97又は99で表される塩基配列を有するDNAを含む請求項13に記載のDNA構築物。
  16. ハイブリッドタンパク質をコードするDNAが、植物由来のアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の5’−非翻訳領域に発現可能に連結されている、請求項13〜15の何れか一項に記載のDNA構築物。
  17. 前記植物由来のアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の5’−非翻訳領域がタバコ由来である、請求項16に記載のDNA構築物。
  18. 配列番号24〜29の何れかで表される塩基配列を有する請求項17に記載のDNA構築物。
  19. 配列番号101〜111の何れかで表される塩基配列を有する請求項17に記載のDNA構築物。
  20. 請求項13〜19の何れか一項に記載のDNA構築物を含む組み換えベクター。
  21. 請求項20に記載の組み換えベクターで形質転換された形質転換体。
  22. 形質転換体が形質転換植物細胞又は形質転換植物である、請求項21に記載の形質転換体。
  23. 請求項21又は22に記載の形質転換体から得られる種子。
  24. 配列番号2、82又は84で表されるアミノ酸配列からなるペプチド。
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