CN106868074B - 一种高活性花生壳多糖及其制备方法 - Google Patents

一种高活性花生壳多糖及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种高活性花生壳多糖及其制备方法，属于天然产物制备的技术领域。本发明采用定点突变的方式获得内切葡聚糖酶和外切纤维素酶的突变体，并进行复配，采用超声波辅助酶解与提取的方式，从花生壳中同步获取活性多糖与黄酮类化合物。本发明采用的复合酶及制备工艺提高了复合酶最适水解温度及酶活，简化了操作步骤，节约了提取时间，不仅实现了同步制取花生壳黄酮类化合物与水溶性多糖，并且实现了中高温条件下多糖的同步酶解和提取，所得活性多糖中黄酮含量高，抗氧化活性和抑菌性强，具有多种生理功能，应用范围广。

Description

一种高活性花生壳多糖及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种高活性花生壳多糖及其制备方法，属于天然产物制备的技术领域。
背景技术
多糖类物质一般是存在生物活体内的一种天然物质，直接参与生物体的基本代谢过程，对生物体的代谢过程产生积极影响。具有预防心血管疾病、预防糖尿病、清除人体有害物质、提高人体免疫力等显著的生理功能。可以作为预防、减轻症状、辅助治疗心血管等疾病的功能性食品，也可以作为食品添加剂或营养强化剂广泛应用于食品、保健品以及医药制品中，以补充人体所需的膳食纤维量，增加产品保健功能，改进产品风味，提高产品品质和附加值等。活性多糖的提取方法包括化学法、酶法、化学-酶结合法、发酵法、超声辅助法、微波辅助法等多种方法。
黄酮类化合物是泛指具有15个碳原子的多元酚化合物，广泛存在于自然界，具有多种生物活性，在体内具有改善微循环、改变体内酶活性、降血脂、降胆固醇、抗自由基、抗氧化、增强免疫功能、抑菌、抗病毒和抗炎症等多种功能活性。正是因其所具备的多种调节人体生理功能和治疗人类疾病的作用而使黄酮类物质成为目前高端功能性营养化学品的代表，产品利润、市场空间远高于一般的食品或健康食品。目前，通常采用化学法合成、植物提取以及运用微生物生物合成等方式获取黄酮类物质。
我国是世界上最大的花生生产国和消费国，在花生加工利用过程中，每年产生几百万吨的花生壳废弃物，除少部分加工成为粗饲料和可食用菌的培养基外，多数花生壳作为燃料或成为垃圾，而花生壳约占花生重量的三分之一，含有有65％-80％的粗纤维素、10％的半纤维素以及其他一些活性成分并未得到有效的开发利用，资源浪费严重。本发明运用生物学手段结合农产品加工技术将花生壳中的纤维素进行改性处理，获得富含黄酮类化合物的高活性花生壳多糖，所得产品绿色安全，可应用于功能食品中，不仅为花生壳资源的高值化利用提供生产依据，延长花生加工产业链，而且契合人们的消费需求，具有重要的应用与经济价值。
纤维素酶在分解纤维素时起生物催化作用，可以将纤维素分解成寡糖或单糖。纤维素酶根据其催化反应功能的不同可分为内切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶。内切葡聚糖酶随机切割纤维素多糖链内部的无定型区，产生不同长度的寡糖和新链的末端。外切葡聚糖酶作用于这些还原性和非还原性的纤维素多糖链的末端，释放葡萄糖或纤维二糖。研究认为纤维素的水解是两种的酶协同作用，才能将纤维素彻底的水解。我们发现商业化纤维素酶可以使花生壳中纤维素水解获得活性多糖，但是目前商业化纤维素酶酶解最适温度为50-60℃而多糖的最佳提取温度为60-80℃，为了防止纤维素酶的失效，必须将酶解与提取分为两步进行。因此提取效率低，提取时间长，耗能低。
本发明通过对来源于里氏木霉的内切葡聚糖酶1EGI和外切纤维素酶1CEL内部氨基酸进行定点突变，获得了耐高温的纤维素酶复合酶，将两种酶的最适温度提高了10度以上。使用本发明的纤维素酶复合酶可以有效解决当前多糖制备过程中酶解与提取不能同步进行的问题，酶制剂用量少，提取时间短，提取效率高，多糖活性好，黄酮含量高。
发明内容
本发明提供了一种耐高温且能高效降解花生壳的复合酶，其降解产物为富含黄酮的花生多糖。该复合酶由内切葡聚糖酶突变体和外切纤维素酶突变体组成，所述突变是对氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.3所示的来源于里氏木霉的内切葡聚糖酶1EGI和外切纤维素酶1CEL内部氨基酸进行定点突变，从而提高了两种突变体所组成的复合酶的酶解温度。
所述突变是将内切葡聚糖酶1EGI第99位的丝氨酸突变为苯丙氨酸，第241位的天冬氨酸突变为亮氨酸，得到突变体1EGIS99FD241L；将外切纤维素酶1CEL第210位的半胱氨酸突变为赖氨酸，得到突变体1CELC210K。
在本发明的一种实施方式中，所述内切葡聚糖酶突变体1EGIS99FD241L、外切纤维素酶突变体1CELC210K的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4所示。
本发明的第二个目的是提供一种提高内切葡聚糖酶1EGI和外切纤维素酶1CEL高温下水解花生壳活性的方法，是将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的内切葡聚糖酶蛋白质分子内部第99位的丝氨酸突变为苯丙氨酸，第241位的天冬氨酸突变为亮氨酸，将氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的外切纤维素酶蛋白质分子内部第210位的半胱氨酸突变为赖氨酸。
关于突变体命名：以“酶分子亲本氨基酸位点取代后氨基酸”表示突变体，比如1CELC210K，是指在外切纤维素酶亲本氨基酸序列的基础上将第210位的半胱氨酸C突变为赖氨酸K。本发明中，以SEQ ID NO.1所示的序列为内切葡聚糖酶亲本序列，以SEQ ID NO.3所示的序列为外切纤维素酶亲本序列。
本发明的第三个目的是提供一种富含黄酮类化合物的活性多糖的制备方法，包括如下制备步骤：
(1)花生壳经清洗、烘干、超微粉碎后与水混合，添加由内切葡聚糖酶突变体和外切纤维素酶突变体组成的复合酶，超声波辅助酶解和提取花生壳中的水溶性多糖和黄酮类化合物；
(2)真空抽滤步骤(1)所得混合物，保留抽滤液，并经真空旋转蒸发得到浓缩液，浓缩液冷却后，加入预冷的乙醇，并于4℃条件下放置12h，离心收集沉淀，同时保留上清液；
(3)步骤(2)所得沉淀加水复溶，离心收集上清液，加入预冷的乙醇，并于4℃条件下放置12h，离心收集沉淀，经真空干燥得到活性多糖；
(4)步骤(2)所得上清液经真空旋转蒸发除去乙醇，选择截留分子量为20kDa的超滤膜进行超滤，保留透过液，所得透过液溶解步骤(3)所得活性多糖，该混合物经冷冻干燥获得富含黄酮类化合物的活性多糖。
所述内切葡聚糖酶突变体与外切纤维素酶突变体复配的比例为5:4～3:1。
所述超声波辅助酶解的条件为：按料液比1:10～1:30混合粉碎的花生壳与水，每50g花生壳添加0.5～2.2g复合酶，60-80℃下超声波辅助酶解和提取3-15min。
本发明还要求保护所述富含黄酮类化合物的活性多糖，或者利用生产富含黄酮类化合物的活性多糖的方法生产得到的富含黄酮类化合物的活性多糖在食品、农业或制备药物方面的应用。
本发明的有益效果：
本发明通过定点突变的方式，分别将内切葡糖酶和外切纤维素酶底物结合位点和酶反应中心活性位点中的氨基酸进行突变，提高了二者的最适反应温度和高温环境的酶活稳定性，同时提高了对花生壳的水解活性；并通过复配两种酶蛋白的突变体实现高效制备花生壳活性多糖，活性多糖得率达到90％，在同等条件下，比野生型酶蛋白酶解花生壳后的多糖得率提高了70％，比商业纤维素酶制剂酶解后的多糖得率提高了38.8％。运用该复合酶加工处理花生壳实现了多糖酶解和提取的同步进行，比传统提取方法减少一个操作步骤，节省提取时间50％以上适合大规模工业生产。
本发明的另一个有益效果是采用超声波辅助复合酶酶解及提取的工艺方法，实现了高效同步制备活性多糖和黄酮类化合物的目的，并采用乙醇沉淀结合超滤分离的方法获得了富含黄酮类化合物的活性多糖，其中黄酮含量高达18.1mg/g，普通花生多糖中黄酮含量低于4mg/g。所得富含黄酮类化合物的活性多糖具有显著的抗氧化活性和抑菌活性，阳离子交换能力高，具有增强免疫功能、抑菌、抗病毒和抗炎症等多种功能活性，能够食品、医药、化学等多个领域应用。
具体实施方式
实施例1
清洗干燥后的花生壳经超微粉碎仪粉碎，得花生壳粉末，与水以1:20的比例混合，每50g花生壳添加0.9g由内切葡聚糖酶突变体与外切纤维素酶突变体组成的复合酶，内切葡聚糖酶突变体与外切纤维素酶突变体的复配比例为5:2，65℃的条件下超声波辅助酶解提取10min。所得混合物进行真空抽滤，保留抽滤液。抽滤液经真空旋转蒸发，得到浓缩液；浓缩液冷却后，加入预冷的乙醇，并于4℃条件下放置12h，离心收集沉淀，同时保留上清液。
所得沉淀加水复溶，离心收集上清液，加入预冷的乙醇，并于4℃条件下放置12h，离心收集沉淀，经真空干燥得到活性多糖；所得上清液经真空旋转蒸发除去乙醇，选择截留分子量为20kDa的超滤膜进行超滤，保留透过液，所得透过液溶解真空干燥后的活性多糖，该混合物经冷冻干燥获得富含黄酮类化合物的活性多糖。
所得富含黄酮类化合物的活性多糖对NaOH溶液具有明显的缓冲能力，表明具有阳离子交换能力；经液相色谱检测，活性多糖中木犀草素(黄酮)含量为15.2mg/g；对DPPH自由基和羟自由基清除能力的IC50分别为4.7％和1.1％(g/mL，W/V)，即当清除50％的DPPH自由基和羟自由基时，所需活性多糖的浓度分别为4.7％和1.1％；浓度为100mg/mL的活性多糖溶液与浓度为5μg/mL的VC溶液的铁还原力相当；对大肠杆菌、尖孢镰刀菌、金黄色葡萄球菌具有明显的抑制作用。
实施例2
清洗干燥后的花生壳经超微粉碎仪粉碎，得花生壳粉末，与水以1:15的比例混合，每50g花生壳添加0.65g由内切葡聚糖酶突变体与外切纤维素酶突变体组成的复合酶，内切葡聚糖酶突变体与外切纤维素酶突变体的复配比例为2:1，于温度为70℃的条件下微波辅助酶解和提取12min。所得混合物进行真空抽滤，保留抽滤液。抽滤液经真空旋转蒸发，得到浓缩液；浓缩液冷却后，加入预冷的乙醇，并于4℃条件下放置12h，离心收集沉淀，同时保留上清液。
所得沉淀加水复溶，离心收集上清液，加入预冷的乙醇，并于4℃条件下放置12h，离心收集沉淀，经真空干燥得到活性多糖；所得上清液经真空旋转蒸发除去乙醇，选择截留分子量为20kDa的超滤膜进行超滤，保留透过液，所得透过液溶解真空干燥后的活性多糖，该混合物经冷冻干燥获得富含黄酮类化合物的活性多糖。
所得富含黄酮类化合物的活性多糖对NaOH溶液具有明显的缓冲能力，表明具有阳离子交换能力；经液相色谱检测，活性多糖中木犀草素(黄酮)含量为13.8mg/g；对DPPH自由基和羟自由基清除能力的IC50分别为5.2％和2.7％(g/mL，W/V)，即当清除50％的DPPH自由基和羟自由基时，所需活性多糖的浓度分别为5.2％和2.7％；浓度为120mg/mL的活性多糖溶液与浓度为5μg/mL的VC溶液的铁还原力相当；对大肠杆菌、黄曲霉、尖孢镰刀菌、厚垣孢镰刀菌具有抑制作用。
实施例3
清洗干燥后的花生壳经超微粉碎仪粉碎，得花生壳粉末，与水以1:30的比例混合，每50g花生壳添加1.5g由内切葡聚糖酶突变体与外切纤维素酶突变体组成的复合酶，内切葡聚糖酶突变体与外切纤维素酶突变体的复配比例为3:2，于温度为79℃的条件下微波辅助酶解和提取8min。所得混合物进行真空抽滤，保留抽滤液。抽滤液经真空旋转蒸发，得到浓缩液；浓缩液冷却后，加入预冷的乙醇，并于4℃条件下放置12h，离心收集沉淀，同时保留上清液。
所得沉淀加水复溶，离心收集上清液，加入预冷的乙醇，并于4℃条件下放置12h，离心收集沉淀，经真空干燥得到活性多糖；所得上清液经真空旋转蒸发除去乙醇，选择截留分子量为20kDa的超滤膜进行超滤，保留透过液，所得透过液溶解真空干燥后的活性多糖，该混合物经冷冻干燥获得富含黄酮类化合物的活性多糖。
所得富含黄酮类化合物的活性多糖对NaOH溶液具有明显的缓冲能力，表明具有阳离子交换能力；经液相色谱检测，活性多糖中木犀草素(黄酮)含量为18.1mg/g；对DPPH自由基和羟自由基清除能力的IC50分别为4.5％和1.8％(g/mL，W/V)，即当清除50％的DPPH自由基和羟自由基时，所需活性多糖的浓度分别为4.5％和0.91.8％；浓度为110mg/mL的活性多糖溶液与浓度为5μg/mL的VC溶液的铁还原力相当；对大肠杆菌、尖孢镰刀菌、厚垣孢镰刀菌具有抑制作用。
实施例4
清洗干燥后的花生壳经超微粉碎仪粉碎，得花生壳粉末，与水以1:40的比例混合，每50g花生壳添加2.1g由内切葡聚糖酶突变体与外切纤维素酶突变体组成的复合酶，内切葡聚糖酶突变体与外切纤维素酶突变体的复配比例为3:2，于温度为75℃的条件下微波辅助酶解和提取11min。所得混合物进行真空抽滤，保留抽滤液。抽滤液经真空旋转蒸发，得到浓缩液；浓缩液冷却后，加入预冷的乙醇，并于4℃条件下放置12h，离心收集沉淀，同时保留上清液。
所得沉淀加水复溶，离心收集上清液，加入预冷的乙醇，并于4℃条件下放置12h，离心收集沉淀，经真空干燥得到活性多糖；所得上清液经真空旋转蒸发除去乙醇，选择截留分子量为20kDa的超滤膜进行超滤，保留透过液，所得透过液溶解真空干燥后的活性多糖，该混合物经冷冻干燥获得富含黄酮类化合物的活性多糖。
所得富含黄酮类化合物的活性多糖对NaOH溶液具有明显的缓冲能力，表明具有阳离子交换能力；经液相色谱检测，活性多糖中木犀草素(黄酮)含量为18.8mg/g；对DPPH自由基和羟自由基清除能力的IC50分别为5.5％和2.8％(g/mL，W/V)，即当清除50％的DPPH自由基和羟自由基时，所需活性多糖的浓度分别为5.5％和2.8％；浓度为95mg/mL的活性多糖溶液与浓度为5μg/mL的VC溶液的铁还原力相当；对大肠杆菌、尖孢镰刀菌、厚垣孢镰刀菌具有抑制作用。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东省花生研究所
<120> 一种高活性花生壳多糖及其制备方法
<130> 2014
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 371
<212> PRT
<213> 里氏木霉(Trichodermareesei)
<400> 1
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210 215 220
Gly Phe Ser Pro Tyr Gly Ser Gly Tyr Lys Ser Tyr Tyr Gly Pro Gly
225 230 235 240
Leu Thr Val Asp Thr Ser Lys Thr Phe Thr Ile Ile Thr Gln Phe Asn
245 250 255
Thr Asp Asn Gly Ser Pro Ser Gly Asn Leu Val Ser Ile Thr Arg Lys
260 265 270
Tyr Gln Gln Asn Gly Val Asp Val Pro Ser Ala Gln Pro Gly Gly Asp
275 280 285
Thr Ile Ser Ser Cys Pro Ser Ala Ser Ala Tyr Gly Gly Leu Ala Thr
290 295 300
Met Gly Lys Ala Leu Ser Ser Gly Met Val Leu Val Phe Ser Ile Trp
305 310 315 320
Asn Asp Asn Ser Gln Tyr Met Asn Trp Leu Asp Ser Gly Asn Ala Gly
325 330 335
Pro Cys Ser Ser Thr Glu Gly Asn Pro Ser Asn Ile Leu Ala Asn Asn
340 345 350
Pro Asn Thr His Val Val Phe Ser Asn Ile Arg Trp Gly Asp Ile Gly
355 360 365
Ser Thr Thr
370
<210> 3
<211> 434
<212> PRT
<213> 里氏木霉(Trichodermareesei)
<400> 3
Gln Ser Ala Cys Thr Leu Gln Ser Glu Thr His Pro Pro Leu Thr Trp
1 5 10 15
Gln Lys Cys Ser Ser Gly Gly Thr Cys Thr Gln Gln Thr Gly Ser Val
20 25 30
Val Ile Asp Ala Asn Trp Arg Trp Thr His Ala Thr Asn Ser Ser Thr
35 40 45
Asn Cys Tyr Asp Gly Asn Thr Trp Ser Ser Thr Leu Cys Pro Asp Asn
50 55 60
Glu Thr Cys Ala Lys Asn Cys Cys Leu Asp Gly Ala Ala Tyr Ala Ser
65 70 75 80
Thr Tyr Gly Val Thr Thr Ser Gly Asn Ser Leu Ser Ile Gly Phe Val
85 90 95
Thr Gln Ser Ala Gln Lys Asn Val Gly Ala Arg Leu Tyr Leu Met Ala
100 105 110
Ser Asp Thr Thr Tyr Gln Glu Phe Thr Leu Leu Gly Asn Glu Phe Ser
115 120 125
Phe Asp Val Asp Val Ser Gln Leu Pro Cys Gly Leu Asn Gly Ala Leu
130 135 140
Tyr Phe Val Ser Met Asp Ala Asp Gly Gly Val Ser Lys Tyr Pro Thr
145 150 155 160
Asn Thr Ala Gly Ala Lys Tyr Gly Thr Gly Tyr Cys Asp Ser Gln Cys
165 170 175
Pro Arg Asp Leu Lys Phe Ile Asn Gly Gln Ala Asn Val Glu Gly Trp
180 185 190
Glu Pro Ser Ser Asn Asn Ala Asn Thr Gly Ile Gly Gly His Gly Ser
195 200 205
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210 215 220
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225 230 235 240
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245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
Thr Val Val Thr Gln Phe Glu Thr Ser Gly Ala Ile Asn Arg Tyr Tyr
290 295 300
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305 310 315 320
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325 330 335
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340 345 350
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355 360 365
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405 410 415
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420 425 430
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<210> 4
<211> 434
<212> PRT
<213> 里氏木霉(Trichodermareesei)
<400> 4
Gln Ser Ala Cys Thr Leu Gln Ser Glu Thr His Pro Pro Leu Thr Trp
1 5 10 15
Gln Lys Cys Ser Ser Gly Gly Thr Cys Thr Gln Gln Thr Gly Ser Val
20 25 30
Val Ile Asp Ala Asn Trp Arg Trp Thr His Ala Thr Asn Ser Ser Thr
35 40 45
Asn Cys Tyr Asp Gly Asn Thr Trp Ser Ser Thr Leu Cys Pro Asp Asn
50 55 60
Glu Thr Cys Ala Lys Asn Cys Cys Leu Asp Gly Ala Ala Tyr Ala Ser
65 70 75 80
Thr Tyr Gly Val Thr Thr Ser Gly Asn Ser Leu Ser Ile Gly Phe Val
85 90 95
Thr Gln Ser Ala Gln Lys Asn Val Gly Ala Arg Leu Tyr Leu Met Ala
100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
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145 150 155 160
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165 170 175
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195 200 205
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Tyr Ser Gly Asn Glu Leu Asn Asp Asp Tyr Cys Thr Ala Glu Glu Ala
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340 345 350
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370 375 380
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Ser Gly Val Pro Ala Gln Val Glu Ser Gln Ser Pro Asn Ala Lys Val
405 410 415
Thr Phe Ser Asn Ile Lys Phe Gly Pro Ile Gly Ser Thr Gly Asn Pro
420 425 430
Ser Gly

Claims (2)

1.一种高活性花生壳多糖的制备方法，包括如下步骤：
（1）花生壳经清洗、烘干、超微粉碎后与水混合，添加由内切葡聚糖酶突变体和外切纤维素酶突变体组成的复合酶，超声波辅助酶解和提取花生壳中的水溶性多糖和黄酮类化合物；
（2）真空抽滤步骤（1）所得混合物，保留抽滤液，并经真空旋转蒸发得到浓缩液，浓缩液冷却后，加入预冷的乙醇，并于4℃条件下放置12h，离心收集沉淀，同时保留上清液；
（3）步骤（2）所得沉淀加水复溶，离心收集上清液，加入预冷的乙醇，并于4℃条件下放置12h，离心收集沉淀，经真空干燥得到活性多糖；
（4）步骤（2）所得上清液经真空旋转蒸发除去乙醇，选择截留分子量为20 kDa的超滤膜进行超滤，保留透过液，所得透过液溶解步骤（3）所得活性多糖，该混合物经冷冻干燥获得富含黄酮类化合物的活性多糖；
所述内切葡聚糖酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；
所述外切纤维素酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示；
所述超声波辅助酶解的条件为：按料液比1:10~1:30混合粉碎的花生壳与水，每50g花生壳添加0.5~2.2g复合酶，60-80℃下超声波辅助酶解和提取3-15min。
2.根据权利要求1所述的复合酶，其特征在于，内切葡聚糖酶突变体与外切纤维素酶突变体复配的比例为5:4~3:1。
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