CN107760657B - sn-2选择性胞外脂肪酶用培养基及其使用方法 - Google Patents

sn-2选择性胞外脂肪酶用培养基及其使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种sn‑2选择性胞外脂肪酶用培养基及其使用方法。本发明的发明人在前期已从土壤中分离出了一株具有高产sn‑2选择性脂肪酶的黑曲霉菌株CCTCC NO.M 2012538。实验表明用其酶发酵液水解甘油三酯发现1,3‑DG/1,2‑DG的比值高于6，1,3‑DG的得率高于16.34％，而所产酶活力为8u/mL。本发明发现，不同的诱导剂、碳源、氮源以及不同的培养方法对产脂肪酶基因的表达会产生极大的影响，因此对培养基的优化和培养方法的选择极其重要。申请人筛选出一种适当的培养基及培养方法，并使酶活力从最初的8u/ml增加到20u/ml，为油脂改性，废水处理，婴儿食品开发奠定了基础。

Description

sn-2选择性胞外脂肪酶用培养基及其使用方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其是一种sn-2选择性胞外脂肪酶用培养基及其使用方法。
背景技术
脂肪酶(EC3.1.1.3)，即三酰基甘油水解酶，不仅能够在油-水界面水解长链脂肪酸甘油酯生成游离脂肪酸，甘油二酯、甘油单酯和甘油，还能在非水相系统中发生酯合成反应、转酯化反应、酸解反应、醇解反应等，是一种重要的生物催化剂。此外它还具有位置专一性、结构专一性、光学异构专一性、和脂肪酸专一性，从而可对产物进行精确的控制。因此，目前已被广泛应用于油脂改造、食品加工、药物合成、生物能源开发、废水处理等现代工业领域。
脂肪酶最早发现于动物的胰腺当中，之后人们相继在植物、微生物中也发现的脂肪酶，其中以微生物产脂肪酶种类最多。目前已发现至少有100种产脂肪酶菌，约65个属，其中包括细菌28个属、真菌 23个属，酵母10个属、放线菌4个属。与动植物脂肪酶相比，微生物脂肪酶稳定性更高，选择性强，底物特异性更广，具有广泛的pH 适用范围和强有机溶剂耐受性，是目前主要的工业脂肪酶来源。因此通过优化发酵条件来提高菌株产脂肪酶能力是一项极其重要的工作。
1,3-甘油二酯(1,3-DAG)是一种健康的油脂，它在体内消化酶的作用下直接生成甘油和游离的脂肪酸，然后直接转化为能量从而不在体内累积，因此减少了肥胖疾病产生的机率。但1,3-甘油二酯在天然油脂中含量比较少，因此开发一种制备1,3-甘油二酯的方法尤为重要，目前制备1,3-DAG是最为环保和可行的方法是生物酶法，而该法常用的一种酶是脂肪酶。用脂肪酶法制备1,3-DAG主要是酯合成、甘油解、转酯化法、甘油三酯水解四种，甘油三酯直接水解法又是其中最简单可行的方式，但这需要脂肪酶能专一性水解Sn-2位酯键才能实现，目前在国内外研究中关于具有Sn-2选择性的脂肪酶的报道极少。
发明内容
本发明的目的是：提供一种sn-2选择性胞外脂肪酶用培养基及其使用方法，它能使得用微生物生产胞外脂肪酶能力得以提高。
本发明是这样实现的：sn-2选择性胞外脂肪酶用培养基，按质量百分比计算，包括1.5-2.5％的芝麻油，0.8-1.2％的玉米，0.5-0.8％的牛肉膏，0.70-0.75％蛋白胨做复合氮源，0.03-0.05％MgSO47H2O， 0.45-0.55％K2HPO4，0.18-0.22％(NH4)SO4，0.008-0.012％CaCl2以及 0.45-0.55％NaCl2，其余为水，pH为7.0～7.5。
按质量百分比计算，包括2％的芝麻油，1％的玉米面，0.6％的牛肉膏，0.72％蛋白胨，0.04％MgSO47H2O，0.5％K2HPO4，0.2％(NH4)SO4， 0.01％CaCl2及0.5％NaCl2。
sn-2选择性胞外脂肪酶用培养基的使用方法，包括如下步骤：
1)将黑曲霉CCTCC NO.M2012538接种于种子培养基中，在28-32 ℃，150-200rpm下培养18-36h制得种子发酵液：
2)将上述得到的发酵种子液按质量百分比为1-4％的接种量接种所述的胞外脂肪酶用培养基中，装液量为50-250ml，在转速为 150-200rpm，30～36℃范围内培养50-60h即得。
所述的种子培养基是，按质量百分比计算，将牛肉膏0.25-0.35％，蛋白胨0.45-0.55％，葡萄糖0.45-0.55％和Nacl 0.45-0.55％，其余为水，pH7.0；将上述物质配好之后在121℃下灭菌20min，获得种子培养基。
由于采用了上述技术方案，与现有技术相比，本发明的发明人在前期已从土壤中分离出了一株具有高产sn-2选择性脂肪酶的黑曲霉菌株CCTCC NO.M 2012538(已保藏于中国典型培养物保藏中心 (CCTCC)，其保藏编号为NO.M20 12538，该菌株已经在前期申报过专利，并获得了授权)。实验表明用其酶发酵液水解甘油三酯发现 1,3-DG/1,2-DG的比值高于6，1,3-DG的得率高于16.34％，而所产酶活力为8u/mL。本发明发现，不同的诱导剂、碳源、氮源以及不同的培养方法对产脂肪酶基因的表达会产生极大的影响，因此对培养基的优化和培养方法的选择极其重要。申请人筛选出一种适当的培养基及培养方法，并使酶活力从最初的8u/ml增加到20u/ml，为油脂改性，废水处理，婴儿食品开发奠定了基础。
附图说明
图1为不同碳源对黑曲霉CCTCC NO.2012538发酵生产胞外脂肪酶的影响；
图2为不同氮源对黑曲霉CCTCC NO.2012538发酵生产胞外脂肪酶的影响；
图3为不同诱导剂对黑曲霉CCTCC NO.2012538发酵生产胞外脂肪酶的影响；
图4为不同pH对黑曲霉CCTCC NO.2012538发酵生产胞外脂肪酶的影响；
图5为不同培养时间对黑曲霉CCTCC NO.2012538发酵生产胞外脂肪酶的影响；
图6为不同培养温度对黑曲霉发酵CCTCC NO.2012538生产胞外脂肪酶的影响；
图7为温度对sn-2胞外脂肪酶酶活力的影响；
图8为sn-2胞外脂肪酶的热稳定性；
图9-10为pH对sn-2胞外脂肪酶酶活力的影响；
图11为sn-2胞外脂肪酶的pH稳定性；
图12为金属离子对sn-2胞外脂肪酶酶活力的影响；
图13为底物对sn-2胞外脂肪酶酶活力的影响；
图14为sn-2胞外脂肪酶的Lineweaver-Burk曲线。
具体实施方式
本发明的实施例1：sn-2选择性胞外脂肪酶用培养基，按质量百分比计算，包括2％的芝麻油，1％的玉米面，0.6％的牛肉膏，0.72％蛋白胨，0.04％MgSO47H2O，0.5％K2HPO4，0.2％(NH4)SO4，0.01％CaCl2及0.5％NaCl2，其余为水，pH为7.0～7.5。
sn-2选择性胞外脂肪酶用培养基的使用方法，包括如下步骤：
1)按质量百分比计算，将牛肉膏0.3％，蛋白胨0.5％，葡萄糖 0.5％和Nacl0.5％，其余为水，pH7.0；将上述物质配好之后在121 ℃下灭菌20min，获得种子培养基，将黑曲霉CCTCC NO.M2012538接种于种子培养基中，在30℃，180rpm下培养24h制得种子发酵液：
2)将上述得到的发酵种子液按质量百分比为2％的接种量接种所述的胞外脂肪酶用培养基中，装液量为150ml，在转速为180rpm，34 ℃范围内培养54h即得。
本发明的实施例2：胞外sn-2脂肪酶活力测定方法
脂肪酶活力测定方法采用橄榄油乳法为底物的酸碱滴定法：
取4ml橄榄油乳化液，加入5mL浓度为0.025mol/L的PBS(pH7.5) 缓冲液中，然后在空白组加入15ml乙醇，之后在38℃水浴锅中保温 10min后加入1ml酶液反应15min，在样品组中加入15ml的乙醇终止反应，最后滴2滴浓度为1％的酚酞，用浓度为0.05mol/l的NaoH标准溶液滴定以测定酶活。
橄榄油乳化法测定底物底物配制方法：A液和B液(表1)混合，然后用超声细胞破碎仪搅拌37min形成乳白色聚乙烯醇(PVA)橄榄油乳化液。
底物组成 配方
A 4gPVA，100ml蒸馏水
B 橄榄油33ml
计算公式：
Figure RE-GDA0001538687190000041
式中：X—脂肪酶活力，U/ml
Vb—样品耗碱量
Va—空白耗碱量
t—酶反应时间
50—0.05mol/l的NaoH相当于脂肪酸50umol
n—酶液稀释倍数
碳源优化
本实验首先通过改变碳源研究了不同碳源对sn-2胞外脂肪酶活力的影响，结果表明当使用玉米面做碳源时其酶活可达9.0±0.24u/ml,明显高于麦芽糖、葡萄糖、可溶性淀粉、蔗糖、糊精作碳源时所测的酶活，其中蔗糖作碳源时所得酶活最低，仅为2.6±0.27u/ml，还不足玉米面作碳源所得酶活的1/3。(见图1)
氮源优化
在实验案例二的基础上，我们采用单因素实验(见图2)研究用(NH4)2SO4、 NH4Cl、豆饼粉、酵母粉、牛肉膏和蛋白胨单独作碳源情况下对酶活的影响，发现牛肉膏和蛋白胨都能显著影响酶活，其酶活分别为3.6±0.11和4.3±0.14。因此我们进行了2因素3水平的正交分析，以分析牛肉膏和蛋白胨作为复合氮源的最佳配方。
表1复合氮源(牛肉膏*蛋白胨)：
Figure RE-GDA0001538687190000051
诱导剂优化
将基础发酵培养基中的橄榄油替换成2％的花生油、菜籽油、芝麻油和大豆油。在30℃，180rpm下培养48h得到菌液测定各组酶活(参见实施案例一)。结果表明当使用芝麻油作诱导剂时酶活力最高可达9.5±0.2u/ml，大豆油和花生油次之，常用的橄榄油作诱导剂测得酶活力为8.2±0.21u/ml，而菜籽油效果最差。(见图3)
正交实验确定最优培养基配方
在以上基础上，实施了4因素9水平的正交实验，得到最优培养基配方如下。
表2正交试验L9(34)正交表
Figure RE-GDA0001538687190000052
Figure RE-GDA0001538687190000061
正交试验结果
Figure RE-GDA0001538687190000062
装液量优化
在以上案例基础上，选择不用的装液量体积125ml、100ml、50ml、25ml、共4组发酵生产胞外脂肪酶测量脂肪酶活力，所测得脂肪酶活力分别为6.3u/ml、 6.6u/ml、10u/ml、9.0u/ml。
pH优化
在以上实施案例基础上，调节发酵培养基pH为5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、 8.0、8.5分别测定酶活，结果表明当pH为5.5时，所测酶活仅有1u/ml；而当 pH为6.0时，酶活为5.3u/ml；当pH达到大于6.5酶活显著增加，当pH范围在7.0～7.5时酶活显示较高水平。因此我们选用pH范围为7.0～7.5进行下一步发酵条件优化。(见图4)
培养时间优化
在上述实验案例的基础上，选择不同发酵时间为24h、30h、36h、42h、48h、 54h、60h、66h、72h共9组测定酶活，结果表明当增加发酵时间，酶活力线性增加，当发酵时间提高到54h，测得酶活最高为19u/ml.，而当发酵时间大于54h 时所测酶活开始下降，因此我们选用发酵时间为54h进行下一步发酵条件优化 (见图5)。
培养温度优化
在实施案例五、六、八、九的基础上，本实验还研究了不同发酵温度对黑曲霉发酵CCTCC NO.2012538生产sn-2胞外脂肪酶活力的影响，通过调节发酵温度为24℃、27℃、30℃、33℃、36℃分别测定酶活，结果表明当发酵温度为30～36℃时所测酶活都显示较高趋势，其酶活最高可达到20.6u/ml。因此，黑曲霉 CCTCC NO.2012538发酵生产胞外脂肪酶最佳温度范围为30～36℃。(见图6)
sn-2选择性的研究
将上述案例得到的脂肪酶进行甘油三酯水解反应，然后进行高效液相检测，结果见表3
表3高效液相检测结果(％)
Figure RE-GDA0001538687190000071
脂肪酶对1,3甘油二酯和1,2甘油二酯的选择性计算公式为：
Figure RE-GDA0001538687190000072
Figure RE-GDA0001538687190000073
胞外sn-2脂肪酶分离纯化
(1)丙酮沉淀法对胞外sn-2脂肪酶初步提纯：
在以上实施案例的基础上，取粗酶液40mL放入烧杯中，在冰水浴、磁力搅拌器搅拌下缓慢加入2.5倍体积的预冷丙酮(-18℃预冷2小时)，然后将粗酶液和丙酮的混合物在-18℃冰箱内放置1h，在10000r/min，4℃条件下将混合液体离心15分钟得到沉淀，用pH 7.0的0.05mol/L的Tris-HCl缓冲液20mL 溶解沉淀，然后10000r/min，4℃条件下离心15分钟，最后取上清液即初步纯化后的脂肪酶，然后计算酶活力回收率以及纯化倍数。酶的比活力(Specific Activity)是酶纯度的量度,即指单位重量的蛋白质中所具有酶的活力单位数，一般用IU/mg蛋白质来表示，一般来说，酶的比活力越高，酶越纯。发现在该条件下脂肪酶酶活力回收率为73.2±1.36％，纯化倍数为2.13±0.072。
丙酮沉淀过程中酶活力回收率及纯化倍数计算公式如下：
Figure RE-GDA0001538687190000081
Figure RE-GDA0001538687190000082
Figure RE-GDA0001538687190000083
(2)反胶束法对胞外sn-2脂肪酶进一步纯化：
前萃取：取丙酮沉淀后的脂肪酶粗品中添加一定量的NaCl使其终浓度为 0.075M，并调节溶液的pH为9.0，从而得到反胶束萃取前萃的水相溶液。将一定量的表面活性剂溶于对应的有机溶剂体系中制成反胶束萃取前萃的有机相溶液，有机体系为CTAB/异辛烷/正丁醇/正己醇体系，其中CTAB浓度为125mM，三种溶剂体积为75％异辛烷/15％正丁醇/10％正己醇。然后将水相和有机相等体积混合并在30℃,200r/min的振荡器中振荡反应30分钟，反应后的混合物在4000 r/min，4℃下离心15分钟，取上层有机相。
反萃取：一定量的KCl溶于缓冲液中，使KCl的终浓度为1.0mol/L并调节缓冲液的pH为7.0。将上述的新鲜水相和反胶束萃取前萃分离得到的有机相等体积混合，在30℃,200r/min的振荡器中振荡反应30分钟，反应后的混合物在4000r/min，4℃下离心15分钟，取下层水相即反胶束萃取后的脂肪酶溶液。
在该条件下计算纯化倍数和酶回收率。最终得到前萃取效率达到了90.3±3.2％。反萃取效率为85.05±2.9％，总的萃取效率(脂肪酶酶活力回收率)为 76.8％，纯化倍数为4.76±0.092。发酵液中的脂肪酶经过丙酮沉淀和反胶束分离提纯，整个过程的纯化倍数达到10.14。
反胶束萃取过程中酶活力回收率及纯化倍数计算：
Figure RE-GDA0001538687190000091
Figure RE-GDA0001538687190000092
Figure RE-GDA0001538687190000093
Figure RE-GDA0001538687190000094
Figure RE-GDA0001538687190000095
胞外sn-2脂肪酶酶学性质研究
(1)温度对胞外Sn-2脂肪酶的影响
脂肪酶最适温度的测定范围为20-60℃，每个梯度相差5℃，脂肪酶样液的缓冲液体系为pH 6.5，0.05mol/L的Tris-HCl缓冲液，因为反胶束萃取后样液含有大量的KCl，所以采用超滤离心管进行脱盐处理。脂肪酶酶活力采用橄榄油乳化法测定，在测定酶活力的过程中采用改变反应温度来比较各个温度下脂肪酶酶活力的大小，从而判断该脂肪酶的最适温度。该研究表明脂肪酶的最适温度为35℃(p＜0.05)，当温度在40-50℃下能保持60％以上的酶活力，当温度高于60℃时，脂肪酶酶活力降低很快，只能维持37.51％的催化能力，因此该脂肪酶属于中温脂肪酶，在温度30-45℃下能保持较高的活性。(见图7)
(2)胞外Sn-2脂肪酶的热稳定性
将胞外Sn-2脂肪酶样液在温度25℃、35℃、45℃、55℃的条件下保温，每隔2小时取一些样液在35℃的条件下测脂肪酶水解酶活力，以未经热处理的酶活力为100％，热处理后的酶活分别与该酶活力做对比，比较12小时内脂肪酶在各温度下的酶活力稳定性。研究发现该胞外Sn-2脂肪酶在25℃有较好的稳定性，在该温度下保温12小时，酶活力损失率仅为18.92％，但是在35℃下保存12小时，酶活力损失率较高，残余酶活力仅为63.86％。该脂肪酶在高温条件下稳定性较差，在55℃下处理12小时，酶活力仅存23.33％，所以该脂肪酶是中温脂肪酶，能在低于25℃以下具有较好的稳定性，但对高温敏感。(见图8)
(3)pH对胞外Sn-2脂肪酶的影响
脂肪酶最适pH的测定范围为3-9(其中pH 3-7采用0.2M的磷酸氢二钠- 柠檬酸缓冲液，pH 8、9采用0.1M的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液)，采用橄榄油乳化法测定脂肪酶活力。之后缩小pH值梯度来进一步确定脂肪酶的最适pH。
实验表明该脂肪酶的最适pH为6.5(p＜0.05)，适宜pH范围为6-7.5。pH ＜5或pH＞8对酶催化反应有较强的抑制作用。当pH小于3时，脂肪酶完全失活，该酶催化的pH较窄。一般曲霉属真菌脂肪酶的最适pH为5.0-7.0，极少数曲霉脂肪酶的最适pH为碱性。(见图9)
(4)胞外Sn-2脂肪酶的pH稳定性
将脂肪酶样液调整其pH为5、6、6.5、7、8，并在各pH下于4℃冰箱放置 12小时，每一定时间取一次样，在35℃、pH 6.5条件下用橄榄油乳化法测量酶活力与未处理的脂肪酶酶活力进行比较，其中未经处理的脂肪酶的酶活力为 100％。结果得到图10表明，在pH 6-7的条件下，该脂肪酶具有极强的稳定性，尤其在pH 6.5-7的条件下处理12小时，酶活力损失率仅为13.1％和14.7％，这也验证了第三章分离纯化时，纯化后的酶保存在pH 6.5或7.0的缓冲液中，即使在4℃冰箱中保存几天，酶活力损失率也不大。但在pH 5或8条件下保存，酶活力损失率极高甚至失活，所以该脂肪酶属于中性脂肪酶。
(5)金属离子对胞外Sn-2脂肪酶的影响
将金属离子(Fe2+、Mg2+、Zn2+、Mn2+、Cu2+、Ni2+、Ca2+、Al3+)加入到 0.2mol/L，pH6.5磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，调节金属离子的终浓度为2 mmol/L。金属离子溶液和脂肪酶样液等体积混合，并在35℃下共育1小时，用橄榄油乳化法测量其酶活力，并以不添加金属离子的脂肪酶样液做对照得到图 11，研究发现Mg2+、Ca2+对脂肪酶具有较强的促进作用，而Zn2+、Mn2+、Al3+对脂肪酶的酶促反应具有一定的抑制作用，Fe2+、Cu2+、Ni2+有极强的抑制作用。对于二价金属离子而言，许多文献报道了Ca2+对脂肪酶具有促进作用，原因可能是Ca2+与底物形成长链脂肪酸钙盐。也有很多文献报道Ni2+、Hg2+、Co2+、Sn2+具有极强的抑制作用，Zn2+、Mg2+也可以抑制脂肪酶活力。
(6)胞外Sn-2脂肪酶的底物特异性
将橄榄油、大豆油、玉米油、花生油、芝麻油、菜籽油配置成乳化液，将橄榄油乳化法的底物替换成这些乳化液，并在相同的酶反应条件下测量脂肪酶水解酶活力得到图12，结果表明玉米油、芝麻油、大豆油对脂肪酶酶活力具有极大的促进作用，菜籽油和橄榄油效果相差不大(p＞0.05)，花生油略好于橄榄油。这可能是因为玉米油、芝麻油、大豆油含有的亚油酸量较多，根据《国家食用油标准》可以得知，玉米油、芝麻油、大豆油分别含有大约34-65％、36-47％、50-59％的亚油酸，而橄榄油、菜籽油含有3-21％、11-23％的亚油酸。橄榄油、菜籽油含有较高的油酸，分别为55-83％、8-60％，玉米油和芝麻油油酸的含量也不低，大约为20-42％、34-45％，而大豆油含有17.7-28％的油酸，含量要低于玉米油和芝麻油的油酸含量。
(7)酶动力学测定
该指标采用p-NPP法测量脂肪酶的水解酶活力，因为在微量条件下，橄榄油乳化法的精准度要低于p-NPP法。在最适温度和pH的条件下，改变不同的底物浓度来测定脂肪酶酶活力。再用Lineweaver-Burk法，以反应速度的倒数对底物浓度的倒数作图得一直线，计算Km、Vm值。脂肪酶的动力学方程为y＝0.2496x +0.0269，拟合度为0.9988，根据酶动力学方程可以求出该脂肪酶的Vmax和Km，分别为37.17mM/min和9.28mM。米氏常数可以表示酶和底物的亲和力，说明该脂肪酶对p-NPP具有较好的亲和性(见图13)。

Claims (4)

1.一种sn-2选择性胞外脂肪酶用培养基，其特征在于：按质量百分比计算，包括1.5-2.5%的芝麻油，0.8-1.2%的玉米面，0.5-0.8%的牛肉膏，0.70-0.75%蛋白胨做复合氮源，0.03-0.05%MgSO4·7H2O，0.45-0.55%K2HPO4，0.18-0.22%(NH4)SO4，0.008-0.012%CaCl2以及0.45-0.55%NaCl，其余为水，pH为7.0～7.5；
具体使用方法如下：
1）将黑曲霉CCTCC NO.M2012538接种于种子培养基中，在28-32℃，150-200rpm下培养18-36h制得种子发酵液：
2）将上述得到的种子发酵液按质量百分比为1-4%的接种量接种所述的胞外脂肪酶用培养基中，装液量为50-250ml，在转速为150-200rpm，30～36℃范围内培养50-60h。
2.根据权利要求1所述的sn-2选择性胞外脂肪酶用培养基，其特征在于：按质量百分比计算，包括2%的芝麻油，1%的玉米面，0.6%的牛肉膏，0.72%蛋白胨，0.04%MgSO4·7H2O，0.5%K2HPO4，0.2%(NH4)SO4，0.01% CaCl2及0.5%NaCl。
3.一种如权利要求1所述的sn-2选择性胞外脂肪酶用培养基的使用方法，其特征在于，包括如下步骤：
1）将黑曲霉CCTCC NO.M2012538接种于种子培养基中，在28-32℃，150-200rpm下培养18-36h制得种子发酵液：
2）将上述得到的种子发酵液按质量百分比为1-4%的接种量接种所述的胞外脂肪酶用培养基中，装液量为50-250ml，在转速为150-200rpm，30～36℃范围内培养50-60h。
4.根据权利要求3所述的使用方法，其特征在于：所述的种子培养基是，按质量百分比计算，牛肉膏0.25-0.35%，蛋白胨0.45-0.55%，葡萄糖0.45-0.55%和NaCl 0.45-0.55%，其余为水，pH7.0；将上述物质配好之后在121℃下灭菌20min，获得种子培养基。
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