CN101906387B - 一种植酸酶及其生产菌株、生产方法 - Google Patents

一种植酸酶及其生产菌株、生产方法 Download PDF

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本发明提供一种植酸酶及其生产菌株、生产方法，该植酸酶是由保藏编号为CGMCC No.2980的植酸酶生产菌株通过液体发酵生产的。本发明提供的植酸酶生产菌株无花果曲霉Aspergillus ficuum NTG-23菌株，可以通过微生物发酵技术而大量生产植酸酶，并且该植酸酶对动物胃肠道酸性生理环境具有良好的耐受(最适pH值为1.3，)，可以有效发挥其酶学功能，同时对饲料加工过程中的热处理具有良好耐受(最适温度为67℃)，是一株性状优良的植酸酶生产菌株。实验表明，本发明的植酸酶生产菌株在37℃、pH 2.5(50mM Gly-HCl缓冲液)条件下，以植酸钠为底物，酶活高达48.5U/mg。

Description

一种植酸酶及其生产菌株、生产方法
技术领域
本发明涉及一种植酸酶及其生产菌株、生产方法，具体涉及一种采用无花果曲霉Aspergillus ficuum生产的植酸酶以及相应的生产方法。
背景技术
植酸(phytic acid)，即肌醇六磷酸，是植物籽实中磷的主要贮存形式，其中60％～70％的磷是以植酸盐的形式存在的。单胃动物消化道中由于缺乏植酸盐分解酶，必须在饲料中添加价格昂贵的无机磷酸盐，不仅提高了饲料成本，而且不能消化吸收的无机磷随粪便排出，造成环境污染；此外，植酸盐能螯合蛋白质、矿物等营养因子，降低了营养因子的利用率，被认为是抗营养因子。植酸酶(phytase)可以将植物性饲料中的植酸及其盐分解为肌醇和磷酸，增加可利用磷的含量，降低植酸对矿物质和蛋白质的螯合，解除植酸的抗营养作用，增加动物对蛋白质和某些金属离子的吸收能力。目前，饲料中添加植酸酶的效果已经在世界范围内得到了确证。但是目前植酸酶在饲料中的推广和应用还相当有限，主要原因在于植酸酶在天然材料中的含量太低，难以大量生产；很多植酸酶产品不能够耐受动物胃肠道中低pH值的生理环境而影响其活性；同时，由于植酸酶的热不稳定性，其在饲料加工、贮藏、使用过程中活性会降低。
发明内容
因此，本发明的目的是寻找一株性状优良的植酸酶生产菌株，并通过该菌株的发酵大量生产植酸酶，得到的植酸酶对动物胃肠道酸性生理环境具有良好的耐受性，可以有效发挥其酶学功能，同时对饲料加工过程中的热处理具有良好耐受性。
本发明提供了一种植酸酶生产菌株，该菌株的保藏编号为CGMCC No.2980。该菌株属于曲霉属，命名为无花果曲霉(Aspergillus ficuum)NTG-23，于2009年3月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC，地址：北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所)。
本发明还提供了由上述植酸酶生产菌株生产的植酸酶。该植酸酶的最适pH值为1.3，最适温度为67℃。
本发明还提供了一种生产植酸酶的方法，该方法包括采用上述植酸酶生产菌株通过液体发酵生产植酸酶。
具体来说，上述方法包括以下步骤：
(1)将上述植酸酶生产菌株在马铃薯葡萄糖液体培养基(PD培养基)中培养；
(2)收集菌丝体加水后破碎，离心取上清液；
(3)上清液经纯化得植酸酶。
其中，步骤(1)中的培养条件优选为27℃下，150rpm振荡培养4天。
其中，步骤(2)中破碎后在4℃下静置4小时后再离心。
其中，步骤(3)可以包括以下步骤：
(1)DEAE-纤维素(DEAE-Cellulose)阴离子交换柱层析；
(2)CM-纤维素(CM-Cellulose)离子交换柱层析。
优选地，上述DEAE-Cellulose阴离子交换柱层析采用pH为9.4的10mM NH4HCO3水溶液、300mM NaCl水溶液、1M NaCl水溶液分段洗脱，流速为5ml/3分钟；优选地，上述CM-Cellulose离子交换柱层析采用pH为4.0的10mM NaAc水溶液、0～0.8M NaCl水溶液进行线性洗脱，流速为1ml/分钟。
本发明还进一步提供了一种饲料添加剂，该添加剂中包含上述植酸酶。
本发明提供的无花果曲霉(Aspergillus ficuum)NTG-23菌株，可以通过微生物发酵技术大量生产植酸酶，并且该植酸酶对动物胃肠道酸性生理环境具有良好的耐受(最适pH值为1.3，)，可以有效发挥其酶学功能，同时对饲料加工过程中的热处理具有良好耐受(最适温度为67℃)，是一株性状优良的植酸酶生产菌株。实验表明，本发明的植酸酶生产菌株在37℃、pH 2.5(50mM Gly-HCl缓冲液)条件下，以植酸钠为底物，酶活高达48.5U/mg。
本发明提供的植酸酶生产菌株为无花果曲霉(Aspergillus ficuum)NTG-23，于2009年3月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC，地址：北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所)，保藏编号为CGMCC No.2980。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1为700nm处植酸酶检测溶液的光吸收值(A 700nm)与无机磷的浓度([PO4 3-])关系的标准曲线，其中以KH2PO4为标准品，回归方程为Y＝0.106X+0.5624(R2＝0.9977)；
图2为无花果曲霉植酸酶DEAE-Cellulose离子交换柱层析洗脱曲线(10mM pH 9.4 NH4HCO3水溶液)；
图3为无花果曲霉植酸酶CM-Cellulose离子交换柱层析洗脱曲线(10mM pH 4.0NaAC水溶液)；
图4为无花果曲霉植酸酶最适pH值曲线，从中得到其最适pH值为1.3；
图5为无花果曲霉植酸酶最适温度值曲线，从中得到其最适温度为67℃。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
实施例1植酸酶的制备
1、实验材料
无花果曲霉(Aspergillus ficuum)二甲双胍(NTG)突变株NTG23；
PD培养基：马铃薯200克，去皮切成1厘米见方，置于1000毫升水中，煮沸30分钟，八层纱布过滤，收集滤液，加葡萄糖20克，补水至1000毫升，pH值自然，分装后121℃湿热灭菌30分钟。
2、技术路线
(1)植酸酶活性检测方法：硫酸亚铁-钼蓝法(Ferroussulfate-molybdenum blue method；Huang，2008)。
(2)纯化路线：通过液体培养获得无花果曲霉菌丝，经过组织破碎、去离子水抽提，获得植酸酶粗提液，利用离子交换柱层析、凝胶过滤层析、SDS-PAGE凝胶电泳等手段，获得纯化的植酸酶；
3、实验方法
(1)植酸酶粗样品溶液的获得
A.ficuum于PD培养基，27℃下，150rpm振荡培养4天
                    ↓
          8,000rpm离心15分钟，收集菌丝
                    ↓
     组织破碎，加4倍量蒸馏水，4℃下提取4小时
                    ↓
       10,000rpm离心15分钟，收集上清液
                    ↓
            即为植酸酶粗样品溶液
(2)离子交换柱层析
①DEAE-Cellulose阴离子交换柱层析(D3为活性组分)
10mM NH4HCO3(pH 9.4)水缓冲液平衡DEAE-Cellulose
    层析柱(2.5×10cm)，上粗样品(调pH 9.4)
                    ↓
用10mM NH4HCO3(pH 9.4)水溶液，+300mM，1M NaCl水溶液
        进行分段洗脱，流速5ml/3分钟
                    ↓
       部分收集器收集洗脱液，每管5ml，
          测定各管洗脱液的A 280nm
                    ↓
    测定各分段洗脱部分洗脱液的植酸酶活性
          合并有植酸酶活性的洗脱液
                    ↓
            充分透析，超滤浓缩
                    ↓
            得到D3组分(活性组分)
②CM-Cellulose离子交换柱层析(D3C2为活性组分)
10mM NaAc(pH4.0)水缓冲液平衡CM-Cellulose
层析柱(1.0×15cm)，上样(D3组分，pH 4.0)
                ↓
以10mM NaAc(pH4.0)水溶液洗去不吸附组分后，
      进行10mM NaAc(pH4.0)水溶液
0～0.8M NaCl水溶液线性洗脱，流速1ml/分钟
                ↓
    部分收集器收集洗脱液，每管3ml，
       测定各管洗脱液的A 280nm
                ↓
测定各分段洗脱部分洗脱液的植酸酶活性
      合并具有植酸酶活性的洗脱液
                ↓
        充分透析，超滤浓缩
                ↓
           得到D3C2组分
(3)植酸酶检测方法(硫酸亚铁-钼蓝法)：取酶液50μl，加入950μl5mM植酸钠溶液(以50mM、pH 2.5 Gly-HCl缓冲液配制)，37℃水浴反应30分钟，加1ml 10％三氯乙酸(TCA)终止反应，再加2ml显色液显色5分钟，测定A700nm光吸收值。显色液组分：1％钼酸铵、3.2％硫酸亚铁和7.2％硫酸。对照组在水浴反应前以TCA终止反应。酶活单位(U)定义为37℃下每分钟释放1μmol无机磷所需要的酶量。
实施例2植酸酶性质的表征
利用纯化的植酸酶，研究其最适温度、pH值、离子对植酸酶活性的影响、底物多样性等酶学性质。
(1)植酸酶最适温度的测定
检测方法：硫酸亚铁-钼蓝法，分别在30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃下检测植酸酶活性。图5为无花果曲霉植酸酶最适温度值曲线，从中得到其最适温度为67℃。
(2)植酸酶最适pH值的测定
检测方法：硫酸亚铁-钼蓝法，分别以不同pH值缓冲液配制植酸钠溶液，在37℃下反应并检测活性。图4为无花果曲霉植酸酶最适pH值曲线，从中得到其最适pH值为1.3。
(3)离子对无花果曲霉植酸酶活性的影响
将25μl植酸酶与等体积20mM、10mM、5mM和2.5mM的不同离子(Ca2+、Mg2+、Zn2+等)在4℃下孵育2小时，硫酸亚铁-钼蓝法检测其活性，以同体积去蒸馏水替代离子作为空白对照。
表1不同浓度离子对植酸酶活性的影响
Figure G2009100865138D00061
由表1可知，不同浓度离子对植酸酶活性无明显作用，但1.25～10mM的EDTA-2Na对无花果曲霉植酸酶活性有10％左右的促进作用。
(4)底物多样性研究
用50mM、pH 1.5Gly-HCl缓冲液分别配制5mM不同底物(植酸钠、三磷酸腺苷(ATP)、二磷酸腺苷(ADP)、单磷酸腺苷(AMP)、6-磷酸葡萄糖(G-6-P)、6-磷酸果糖(F-6-P)、4-硝基苯基磷酸二钠(pNPP)和β-甘油磷酸钠)，取50μl酶液，加入950μl相应底物溶液，37℃水浴反应30分钟，硫酸亚铁-钼蓝法测定酶活性，以同体积去蒸馏水替代底物作为空白对照。无花果曲霉植酸酶底物多样性结果见表2，无花果曲霉植酸酶对各底物均有降解活性。
表2无花果曲霉植酸酶对各底物的相对活性
Figure G2009100865138D00071
(5)无花果曲霉植酸酶回收率、纯化倍数见表3，37℃、pH 2.5(50mM Gly-HCl缓冲液)条件下，以植酸钠为底物，以50g新鲜菌丝体为材料，纯化的植酸酶活性为48.5U/mg。
表3无花果曲霉植酸酶回收率、纯化倍数
Figure G2009100865138D00072

Claims (9)

1.一种植酸酶生产菌株，该菌株的保藏编号为CGMCC No.2980。
2.一种由权利要求1所述的植酸酶生产菌株生产的植酸酶，所述植酸酶的最适pH值为1.3，最适温度为67℃。
3.一种生产植酸酶的方法，该方法包括采用权利要求1所述的植酸酶生产菌株通过液体发酵生产植酸酶。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)将权利要求1所述的植酸酶生产菌株在PD培养基中培养；
(2)收集菌丝体加水后破碎，离心取上清液；
(3)上清液经纯化得植酸酶。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中的培养条件为27℃下，150rpm振荡培养4天。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中破碎后在4℃下静置4小时后再离心。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)包括以下步骤：
(1)DEAE-纤维素阴离子交换柱层析；
(2)CM-纤维素离子交换柱层析。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述DEAE-纤维素阴离子交换柱层析采用pH为9.4的10mM NH4HCO3水溶液、300mM NaCl水溶液、1M NaCl水溶液分段洗脱，流速为5ml/3分钟；所述CM-纤维素离子交换柱层析采用pH为4.0的10mM醋酸钠水溶液、0～0.8M NaCl水溶液进行线性洗脱，流速为1ml/分钟。
9.一种饲料添加剂，该饲料添加剂包含权利要求2所述的植酸酶。
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