CN114250259A - 一种猪圆环2型病毒Cap蛋白病毒样颗粒的发酵培养基 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种猪圆环2型病毒Cap蛋白病毒样颗粒(Cap‑VLP)的发酵培养基，所述培养基含有如下配比的组分：胰蛋白胨7‑13重量份，酵母提取物7‑13重量份，氯化钠7‑13重量份，甘油7‑13重量份，磷酸氢二钠15‑25重量份，磷酸二氢钾6‑12重量份，硫酸镁4‑8重量份，硫酸铵3‑9重量份，硫酸铜1‑4重量份，氯化钴1‑4重量份，生物素0.001‑0.002重量份。本发明还公开了使用前述培养基进行Cap蛋白病毒样颗粒发酵的方法。本发明的培养基和方法无需纯化步骤，相比传统的方法更为高效。
Description
技术领域
本发明属于发酵技术领域，具体涉及一种猪圆环2型病毒Cap蛋白病毒样颗粒的发酵培养基及其发酵方法。
背景技术
猪圆环病毒(Porcine circovirus,PCV)是目前已知的最小的动物病毒之一，该病毒属圆环病毒科圆环病毒属，是一种无囊膜的单链环状DNA病毒。该病毒可感染猪的淋巴组织导致免疫系统被抑制；尤其幼龄断奶仔猪引起断奶仔猪多系统衰竭综合症(Post-weaning mutil-systemic wasting syndrome,PMWS)。患PMWS的断奶仔猪因T淋巴细胞受干扰，是PCV2病毒复制的靶细胞之一，将持续产生炎症反应。因PCV2侵入猪的淋巴组织，在细胞中持续复制，造成白细胞数量不断减少，机体免疫能力被破坏，免疫反应被抑制，使淋巴细胞进一步被损伤，更容易感染其他病原体，引起一系列疾病。
Cap蛋白是PCV2病毒重要的结构和功能蛋白，可刺激机体产生特异性免疫应答，是2型圆环病毒疫苗研制重点，也是新型基因工程疫苗研究主流方向。病毒样颗粒(Virus-like particles,VLP)是由病毒结构蛋白自组装构成的空纳米颗粒，不含病毒遗传物质，在结构上与病毒粒子相似。随着基因工程手段越来越多的应用于疫苗研制领域，VLP成为当今病毒性疫苗研究的热点。研究表明，Cap蛋白可以自组装成VLP，即Cap-VLP，后者具有良好的免疫原性，可以作为PCV2疫苗的活性成分。
生产Cap-VLP的主流方法之一是通过大肠杆菌表达Cap蛋白(即发酵)，分离纯化Cap蛋白后，使其自组装成Cap-VLP。目前，该方法面临如下问题：1、产品收率低；2、产生的杂蛋白(Cap蛋白以外的蛋白)较多，对纯化的平台工艺提出更高要求，增加了生产成本。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种新的发酵方法及发酵培养基。
本发明的技术方案包括：
一种猪圆环2型病毒Cap蛋白病毒样颗粒的发酵培养基，所述培养基含有如下配比的组分：
胰蛋白胨7-13重量份，酵母提取物7-13重量份，氯化钠7-13重量份，甘油7-13重量份，磷酸氢二钠15-25重量份，磷酸二氢钾6-12重量份，硫酸镁4-8重量份，硫酸铵3-9重量份，硫酸铜1-4重量份，氯化钴1-4重量份，生物素0.001-0.002重量份。
如前述的培养基，所述培养基含有如下配比的组分：
胰蛋白胨10重量份，酵母提取物10重量份，氯化钠10重量份，甘油9重量份，磷酸氢二钠17重量份，磷酸二氢钾8重量份，硫酸镁6重量份，硫酸铵5重量份，硫酸铜1重量份，氯化钴1重量份，生物素0.001重量份。
如前述的培养基，其特征在于，所述培养基还含有消泡剂。
如前述的培养基，所述消泡剂为0.2体积份；
当所述重量份为g时，所述体积份为mL。
如前述的培养基，所述培养基含有如下浓度的组分：
胰蛋白胨7-13g/L，酵母提取物7-13g/L，氯化钠7-13g/L，甘油7-13g/L，磷酸氢二钠15-25g/L，磷酸二氢钾6-12g/L，硫酸镁4-8g/L，硫酸铵3-9g/L，硫酸铜1-4g/L，氯化钴1-4g/L，生物素1-2ug/L，消泡剂0.2ml/L。
如前述的培养基，所述培养基含有如下浓度的组分：
胰蛋白胨10g/L，酵母提取物10g/L，氯化钠10g/L，甘油9g/L，磷酸氢二钠17g/L，磷酸二氢钾8g/L，硫酸镁6g/L，硫酸铵5g/L，硫酸铜1g/L，氯化钴1g/L，生物素1ug/L，消泡剂0.2ml/L。
一种猪圆环2型病毒Cap蛋白病毒样颗粒的发酵培养方法，所述方法是用前述的培养基用于培养大肠杆菌，发酵生产猪圆环2型病毒Cap蛋白病毒样颗粒的方法；
所述大肠杆菌菌体内携带表达Cap蛋白的基因片段；优选地，所述表达Cap蛋白的基因片段如SEQIDNO.1所示。
如前述的方法，所述表达Cap蛋白的基因片段位于pET28a载体的XhoI位点。
如前述的方法，包括如下步骤：
1)所述大肠杆菌接种到前述培养基中，氨水控制pH6.90±0.1，37℃通气搅拌培养，当溶解氧第一次低于40％时，通过调整搅拌转速和通气量控制溶解氧在40％±5％范围内；
2)诱导前补料：根据600nm下OD值进行补料，补料规则为：
当OD≤5时，流加速度为1ml/min；当5≤OD≤10时，流加速度为3ml/min；当10≤OD≤18，流加速度为6ml/min。当OD达到20±3，停止补料；
诱导前补料由如下组分组成：
LB培养基500±50体积份，甘油500±50体积份；
3)诱导：当pH出现反弹迹象，开始降低温度至32℃进行诱导，IPTG终浓度为1mM；期间进行诱导中补料，流加速度3ml/min；
所述诱导中补料由如下组分组成：
LB培养基150±15体积份，甘油250±25体积份，4g/L氯化铵250±25体积份，30％(m/v)硫酸镁100±10体积份，50％(m/v)葡萄糖200±20体积份；
4)富集菌体，PBS重悬，裂解菌体，离心，收集上清；
步骤3)所述pH出现反弹迹象指：当停止补料、停止补碱后，pH出现上升现象。
如前述的方法，所述诱导前补料配方为：LB培养基500±50体积份，甘油500±50体积份；
和/或，所述诱导中补料由如下组分组成：
LB培养基150体积份，甘油250体积份，4g/L氯化铵250体积份，30％(m/v)硫酸镁100体积份，50％(m/v)葡萄糖200体积份。
使用本发明的发酵培养基发酵猪圆环2型病毒Cap蛋白病毒样颗粒，产生的杂蛋白极少，显著优于市售培养基。将本发明的培养基用于猪圆环2型病毒Cap蛋白病毒样颗粒的工业化生产，可极大程度减少纯化难度和纯化能耗，节约生产成本，提高生产效率，产业化前景十分良好。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1：菌液上清蛋白电泳图；泳道1～3分别对应培养基1～3。
图2：PCV2 Cap-VLP电镜图。
具体实施方式
实施例1本发明发酵方法
一、菌种
菌种为大肠杆菌(Chaperone competent cells pGro7/BL21(DE3))，菌种包含了携带目的基因(表达Cap蛋白的基因)的表达载体pET28a，所述目的基因的序列如SEQ IDNO.1所示，位于载体的XhoI(酶切位点)位置。
SEQ ID NO.1:
atgacctacccgcgtcgtcgtttccgtcgtcgtcgtcaccgtccgcgttctcacctgggt 60
cagatcctgcgtcgtcgtccgtggctggttcacccgcgtcaccgttaccgttggcgtcgt 120
aaaaacggtatcttcaacacccgtctgtctcgtaccatcggttacaccgttaaaaaaacc 180
accgttcgtaccccgtcttggaacgttgacatgatgcgtttcaacatcaacgacttcctg 240
ccgccgggtggtggttctaacccgctgaccgttccgttcgaatactaccgtatccgtaaa 300
gttaaagttgaattctggccgtgctctccgatcacccagggtgaccgtggtgttggttct 360
accgctgttatcctggacgacaacttcgttaccaaagctaacgctctgacctacgacccg 420
tacgttaactactcttctcgtcacaccatcacccagccgttctcttaccactctcgttac 480
ttcaccccgaaaccggttctggaccgtaccatcgactacttccagccgaacaacaaacgt 540
aaccagctgtggctgcgtctgcagaccaccggtaacgttgaccacgttggtctgggtacc 600
gctttcgaaaactctatctacgaccaggactacaacatccgtatcaccatgtacgttcag 660
ttccgtgaattcaacctgaaagacccgccgctgaacccgaaataa 705
二、用品
1、试剂与耗材
LB培养基，金源康大肠杆菌培养基，百诺吉大肠杆菌培养基，胰蛋白胨，酵母提取物，氯化钠，甘油，磷酸氢二钠，磷酸二氢钾，硫酸镁，硫酸铵，硫酸铜，氯化钴，生物素，消泡剂。
2、主要仪器设备
75L不锈钢细菌培养罐，大容量高速冷冻离心机，电子天平，高压灭菌锅，冷却循环水机，纯蒸汽发生器，恒温振荡器，生物安全柜，紫外分光光度计，光学显微镜，烧杯，量筒，三角瓶等。
三、发酵方法
1、种子液制备
配制种子液LB培养基，121℃30min灭菌，冷却待用。
一级种子：挑选单菌落，接入30ml LB培养基，同时加入抗生素(终浓度：kana50ug/ml，CHL 20ug/ml)，置于37℃、220rpm恒温摇床，摇菌培养10h。
二级种子：按照1:100接种量，将一级种子液分别接入1000ml/2L×3三角瓶中，置于32℃、220rpm恒温摇床，摇菌培养至OD范围在1.5-2.5之间。
2、不同培养基的配置
培养基1(本发明培养基)：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物10g/L，氯化钠10g/L甘油9g/L磷酸氢二钠17g/L，磷酸二氢钾8g/L，硫酸镁6g/L硫酸铵5g/L硫酸铜1g/L，氯化钴1g/L，生物素1ug/L，消泡剂0.2ml/L。
培养基2：JYK大肠杆菌培养基(大肠杆菌高表达培养基，内蒙古金源康生物工程有限公司)。
培养基3：BNJ大肠杆菌培养基(大肠杆菌高密度发酵培养基，四川百诺吉科技有限公司)。
3、发酵罐准备
按照相应比例称取各组分，各配制50L发酵液培养基溶解于用40L水，转入75L不锈钢罐后，121℃，30min实消，完成后冷却至培养温度，待用。
4、发酵罐培养
按照6:100体积比，将二级种子接入75L事先准备好的发酵罐中(装液量50L)，同时加入抗生素(终浓度：kana(硫酸卡那霉素)50ug/ml，CHL(氯霉素)20ug/ml，阿拉伯糖0.7g/L)，氨水控制pH6.90±0.1，基础转速和基础通气量(200rpm、35L/min)，37℃培养，当DO(溶解氧)第一次低于40％时候，通过调整DO与转速、通气量控制DO在40％±5％。同时开始流加补料液。
补料配方如下：
当OD达到5±0.5时，流加速度为1ml/min；当OD达到7.5±2.5时，流加速度为3ml/min；当OD达到14±4时，流加速度为6ml/min。当OD达到20±1时，停止补料。当pH出现反弹迹象(当停止补料、停止补碱后，pH出现上升现象)，开始降低温度至32℃，加入终浓度为1mM的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导，持续5h。诱导过程中，控制DO在30％上下，流加速度为3ml/min。培养结束后，10000g，7min离心收菌。
注：以上OD均为波长600nm下测定值。
四、检测
1、电泳检测
收集上述三种培养基所得菌体，PBS重悬菌体后反复冻融3次，超声波破碎，离心，取上清各25μl进行12.5％SDS-PAGE检验PCV2 Cap蛋白的表达情况。
2、电镜检测
将培养基1收集的上清液进行电镜观察VLP颗粒。
五、结果和结论
电泳检测结果如图1所示：大肠杆菌工程菌发酵后成功表达目的蛋白PCV2 Cap蛋白，其中本发明培养基培养得到的菌体的裂解液上清蛋白条带主次分明，目标蛋白条带颜色深，杂蛋白条带少且颜色浅；而市售培养基对应菌体裂解液上清条带较多且颜色都较深。该结果说明：本发明培养基得到的菌体的裂解液中杂蛋白远低于市售培养液。
如图2所示，本发明培养基中的菌体的裂解液上清(未经过纯化步骤)富含形状规则的颗粒。该结果表明：Cap蛋白高效自组装成为了Cap-VLP。
综上，本发明的培养基可以使得携带PCV2 Cap蛋白编码基因的大肠杆菌工程菌高效产生目标蛋白Cap蛋白(即Cap蛋白发酵)，产生的杂蛋白很少，远低于使用市售大肠杆菌培养基的情形。而且在纯化之前，本发明所得裂解液上清内的Cap蛋白可以高效地自组装成VLP，能达到Cap-VLP生产的目的。
将本发明的培养基用于产业上的Cap蛋白发酵，将十分有利于简化后期蛋白纯化工艺，减少能耗，提高生产效率。
SEQUENCE LISTING
<110> 成都天邦生物制品有限公司
史记生物技术(南京)有限公司
<120> 一种猪圆环2型病毒Cap蛋白病毒样颗粒的发酵培养基
<130> GY768-2019P017349CC
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 705
<212> DNA
<213> 猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type 2）
<400> 1
atgacctacc cgcgtcgtcg tttccgtcgt cgtcgtcacc gtccgcgttc tcacctgggt 60
cagatcctgc gtcgtcgtcc gtggctggtt cacccgcgtc accgttaccg ttggcgtcgt 120
aaaaacggta tcttcaacac ccgtctgtct cgtaccatcg gttacaccgt taaaaaaacc 180
accgttcgta ccccgtcttg gaacgttgac atgatgcgtt tcaacatcaa cgacttcctg 240
ccgccgggtg gtggttctaa cccgctgacc gttccgttcg aatactaccg tatccgtaaa 300
gttaaagttg aattctggcc gtgctctccg atcacccagg gtgaccgtgg tgttggttct 360
accgctgtta tcctggacga caacttcgtt accaaagcta acgctctgac ctacgacccg 420
tacgttaact actcttctcg tcacaccatc acccagccgt tctcttacca ctctcgttac 480
ttcaccccga aaccggttct ggaccgtacc atcgactact tccagccgaa caacaaacgt 540
aaccagctgt ggctgcgtct gcagaccacc ggtaacgttg accacgttgg tctgggtacc 600
gctttcgaaa actctatcta cgaccaggac tacaacatcc gtatcaccat gtacgttcag 660
ttccgtgaat tcaacctgaa agacccgccg ctgaacccga aataa 705
Claims (10)
1.一种猪圆环2型病毒Cap蛋白病毒样颗粒的发酵培养基，其特征在于，所述培养基含有如下配比的组分：
胰蛋白胨7-13重量份，酵母提取物7-13重量份，氯化钠7-13重量份，甘油7-13重量份，磷酸氢二钠15-25重量份，磷酸二氢钾6-12重量份，硫酸镁4-8重量份，硫酸铵3-9重量份，硫酸铜1-4重量份，氯化钴1-4重量份，生物素0.001-0.002重量份。
2.如权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述培养基含有如下配比的组分：
胰蛋白胨10重量份，酵母提取物10重量份，氯化钠10重量份，甘油9重量份，磷酸氢二钠17重量份，磷酸二氢钾8重量份，硫酸镁6重量份，硫酸铵5重量份，硫酸铜1重量份，氯化钴1重量份，生物素0.001重量份。
3.如权利要求1或2所述的培养基，其特征在于，所述培养基还含有消泡剂。
4.如权利要求3所述的培养基，其特征在于，所述消泡剂为0.2体积份；
当所述重量份为g时，所述体积份为mL。
5.如权利要求1或2所述的培养基，其特征在于，所述培养基含有如下浓度的组分：
胰蛋白胨7-13g/L，酵母提取物7-13g/L，氯化钠7-13g/L，甘油7-13g/L，磷酸氢二钠15-25g/L，磷酸二氢钾6-12g/L，硫酸镁4-8g/L，硫酸铵3-9g/L，硫酸铜1-4g/L，氯化钴1-4g/L，生物素1-2ug/L，消泡剂0.2ml/L。
6.如权利要求5所述的培养基，其特征在于，所述培养基含有如下浓度的组分：
胰蛋白胨10g/L，酵母提取物10g/L，氯化钠10g/L，甘油9g/L，磷酸氢二钠17g/L，磷酸二氢钾8g/L，硫酸镁6g/L，硫酸铵5g/L，硫酸铜1g/L，氯化钴1g/L，生物素1ug/L，消泡剂0.2ml/L。
7.一种猪圆环2型病毒Cap蛋白病毒样颗粒的发酵培养方法，其特征在于：所述方法是用权利要求5或6所述的培养基用于培养大肠杆菌，发酵生产猪圆环2型病毒Cap蛋白病毒样颗粒的方法；
所述大肠杆菌菌体内携带表达Cap蛋白的基因片段；优选地，所述表达Cap蛋白的基因片段如SEQ ID NO.1所示。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于：
所述表达Cap蛋白的基因片段位于pET28a载体的XhoI位点。
9.如权利要求8的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)所述大肠杆菌接种到权利要求5或6所述的培养基中，氨水控制pH6.90±0.1，37℃通气搅拌培养，当溶解氧第一次低于40％时，通过调整搅拌转速和通气量控制溶解氧在40％±5％范围内；
2)诱导前补料：根据600nm下OD值进行补料，补料规则为：
当OD≤5时，流加速度为1ml/min；当5≤OD≤10时，流加速度为3ml/min；当10≤OD≤18，流加速度为6ml/min。当OD达到20±3，停止补料；
诱导前补料由如下组分组成：
LB培养基500±50体积份，甘油500±50体积份；
3)诱导：当pH出现反弹迹象，开始降低温度至32℃进行诱导，IPTG终浓度为1mM；期间进行诱导中补料，流加速度3ml/min；
所述诱导中补料由如下组分组成：
LB培养基150±15体积份，甘油250±25体积份，4g/L氯化铵250±25体积份，30％(m/v)硫酸镁100±10体积份，50％(m/v)葡萄糖200±20体积份；
4)富集菌体，PBS重悬，裂解菌体，离心，收集上清；
步骤3)所述pH出现反弹迹象指：当停止补料、停止补碱后，pH出现上升现象。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于：
所述诱导前补料配方为：LB培养基500±50体积份，甘油500±50体积份；
和/或，所述诱导中补料由如下组分组成：
LB培养基150体积份，甘油250体积份，4g/L氯化铵250体积份，30％(m/v)硫酸镁100体积份，50％(m/v)葡萄糖200体积份。
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