CN104342421A - 一种生产瑞替普酶的发酵培养基及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于生产瑞替普酶的发酵培养基及其制备方法,所述发酵培养基主要由KH2PO4、K2HPO4 ·2H2O、(NH4)2SO4、FeSO4·7H2O、CaCl2·2H2O、CoCl2·6H2O、CuSO4·5H2O、MnSO4·H2O、Na2MoO4·2H2O、20%酪蛋白、MgSO4、50mg/ml卡那霉素、葡萄糖、柠檬酸、消泡剂、酵母提取物和H2O组成,按照各组培养液组成要求在蒸馏水中溶解并用氢氧化钠调节pH值,最后在发酵罐中灭菌即得。本发明采用的发酵培养基减轻了现有工艺发酵中对菌体生长和蛋白表达的抑制作用,使瑞替普酶大肠杆菌表达水平高,稳定性好,提高了瑞替普酶的产率。
Description
技术领域:
本发明涉及一种用于生产瑞替普酶的发酵培养基及其制备方法,属于微生物发酵工程领域。
背景技术
现今心脑血管疾病已是人类健康的最大威胁之一,患病人数逐年上升,而且发病年龄也越发年轻化,田文静等在“乳糖诱导瑞替普酶在大肠杆菌中的可溶性表达”(中国生化药物杂志, 2011, 32(5))一文中指出全世界每年心血管疾病患者多达1300万。在中国,每年需要进行脑梗塞、心肌梗塞等血栓类疾病治疗的人数就上百万,因此研制和生产高效的溶栓药就显得十分必要。赵友春等在“第三代溶血栓药物研究进展”(药学进展, 2004, 28(2): 72-75)中介绍到,目前溶栓药物已发展到第三代,具有快速溶栓,治愈率高,半衰期长,副作用小等优点,在临床上具有较强的竞争性,但价格也比较昂贵,所以,生产出低成本的溶血栓药物具有显著的经济效益和重大的社会意义。另外,赵友春等在“提高溶栓新药瑞替普酶生产得率的中试研究”(化工科技, 2003, 11(1): 15-17)一文中报道,目前多数是对瑞替普酶菌株的构建和复性纯化研究,而鲜有报道实际生产中是如何进行菌株工业化发酵生产。现有技术中,瑞替普酶的工业生产中主要采用大肠杆菌进行培养,采用更有效的培养技术来提高菌体的发酵密度,能够提供产物的产率,而选择合适的发酵培养基,不仅可以减少培养体积,强化下游分离提取,还可以缩短生产周期,减少设备投资,从而降低生产成本,极大地提高产品的市场竞争力。
发明内容
因此,本发明的目的是提供一种用于生产瑞替普酶的培养基。
本发明的另一目的是提供上述用于生产瑞替普酶的培养基的制备方法。
为达到上述目的,本发明的技术方案是:
一种用于生产瑞替普酶的发酵培养基,主要由KH2PO4、K2HPO4 ·2H2O、(NH4)2SO4、FeSO4·7H2O、CaCl2·2H2O、CoCl2·6H2O、CuSO4·5H2O、MnSO4·H2O、Na2MoO4·2H2O、20%酪蛋白、MgSO4、卡那霉素、葡萄糖、柠檬酸、消泡剂、酵母提取物和H2O组成,其中培养基的主要组成为:
A液:每升H2O中含KH2PO4 25-40g、K2HPO4 ·2H2O 57.5-80g、(NH4)2SO4 17.5-25.8g、FeSO4·7H2O 0.008-0.015g;
B液:每升H2O中含CaCl2·2H2O 0.8-1.6g、CoCl2·6H2O 1.60-2.93g、CuSO4·5H2O 1.5-2.5g、FeSO4·7H2O 1.80-2.87g、MnSO4·H2O 1.0-1.93g、Na2MoO4·2H2O 1.60-2.67g;
C液:每升H2O中含20%酪蛋白25.0-42.0ml、1M MgSO4 16.0-37.0ml、50mg/ml卡那霉素10.0-23.5ml、70%葡萄糖772.5-867.5ml、40%(NH4)2SO4 80-120ml、5%柠檬酸1.5-5.0ml。
优选地,上述用于生产瑞替普酶的发酵培养基,其中培养基的主要组成为:
A液:每升H2O中含KH2PO4 30-35g、K2HPO4 ·2H2O 62.5-75.0g、(NH4)2SO4 20-23.33g、FeSO4·7H2O 0.010-0.013g;
B液:每升H2O中含CaCl2·2H2O 1.0-1.4g、CoCl2·6H2O 2.0-2.53g、CuSO4·5H2O 1.8-2.2g、FeSO4·7H2O 2.0-2.67g、MnSO4·H2O 1.20-1.73g、Na2MoO4·2H2O 1.80-2.47g;
C液:每升H2O中含20%酪蛋白30.0-37.0ml、1M MgSO4 21.5-32.0ml、50mg/ml卡那霉素13.0-20.0ml、70%葡萄糖797-843ml、40%(NH4)2SO4 90-110ml、5%柠檬酸2.5-4.0ml。
更加优选地,上述用于生产瑞替普酶的发酵培养基,其中培养基的主要组成为:
A液:每升H2O中含KH2PO4 32.50g、K2HPO4 ·2H2O 68.75g、(NH4)2SO4 21.67g、FeSO4·7H2O 0.012g;
B液:每升H2O中含CaCl2·2H2O 1.20g、CoCl2·6H2O 2.27g、CuSO4·5H2O 2.0g、FeSO4·7H2O 2.33g、MnSO4·H2O 1.47g、Na2MoO4·2H2O 2.13g;
C液:每升H2O中含20%酪蛋白33.33ml、1M MgSO4 26.67ml、50mg/ml卡那霉素16.67ml、70%葡萄糖800ml、40%(NH4)2SO4 100ml、5%柠檬酸3.33ml。
更加优选地,上述用于生产瑞替普酶的发酵培养基,其中培养基的主要组成为:
A液:每升H2O中含KH2PO4 33.0g、K2HPO4 ·2H2O 70.0g、(NH4)2SO4 22.0g、FeSO4·7H2O 0.011g;
B液:每升H2O中含CaCl2·2H2O 1.3g、CoCl2·6H2O 2.3g、CuSO4·5H2O 1.9g、FeSO4·7H2O 2.5g、MnSO4·H2O 1.4g、Na2MoO4·2H2O 2.0g;
C液:每升H2O中含20%酪蛋白35ml、1M MgSO4 28ml、50mg/ml卡那霉素18ml、70%葡萄糖821ml、40%(NH4)2SO4 95ml、5%柠檬酸3.0ml。
上述用于生产瑞替普酶的发酵培养基,其中酵母提取物的浓度为12%-18%,每升H2O中含消泡剂为0.3-0.7ml。
上述用于生产瑞替普酶的发酵培养基的制备方法,具体制备步骤如下:
(1)A、B、C组分配制:
A液:1200ml,按上述各组分的配比精确称取规定的重量份,在蒸馏水中溶解,用氢氧化钠调节pH为7.0,然后定容至1200ml,即得;
B液:150ml,按上述各组分的配比精确称取规定的重量份,在适量蒸馏水中溶解,然后定容至150ml,即得;
C液:600ml,按上述各组分的配比精确称取规定的重量份,其中70%葡萄糖加热溶解后,单独在115℃下灭菌20min;其余组分除卡那霉素外,充分混匀,然后在121℃下灭菌20min,冷却后加入已灭菌的葡萄糖,混合均匀后,再加入卡那霉素,混匀,用蒸馏水补至600ml,即得;
(2)酵母提取物配制:500ml,精确称取规定的重量份,在蒸馏水中溶解,配制成浓度为12-18%的溶液,115℃下灭菌20min,即得;
(3)在发酵罐中添加纯化水8L、消泡剂5ml和1200mlA液、150mlB液,121℃下灭菌20分钟,冷却至30℃时,再加入之前单独灭菌的15%酵母提取物500ml和C液600ml,混匀,即得。
利用本发明的培养基,在重组大肠杆菌发酵过程中避免或减少了乙酸的生产,减轻了现有工艺发酵中对菌体生长和蛋白表达的抑制作用,使瑞替普酶大肠杆菌表达水平高,稳定性好,提高了瑞替普酶的单位产量,降低了生产成本,对大规模工业生产具有非常重要的意义。
具体实施方式:
下面结合实施例对本发明所述技术方案作进一步的说明。
制备实施例:
下面制备实施例中制备各目的菌体的试剂所用的方法、仪器和操作方式均为本领域常规的方法、仪器和操作方式,其中所用的各种试剂均为生化试剂、分析纯,购自普通试剂公司,主要设备等来源如下表1所示:
表1
序号 | 名称 | 生产厂商 | 规格/型号 |
1 | 发酵罐 | 瑞士比欧生物工程公司 | 19L,NLF22型 |
2 | 泡敌 | 江苏省海安石油化工厂 | 20Kg,消泡王FAG470 |
实施例1
一种用于生产瑞替普酶的发酵培养基,由KH2PO4、K2HPO4 ·2H2O、(NH4)2SO4、FeSO4·7H2O、CaCl2·2H2O、CoCl2·6H2O、CuSO4·5H2O、MnSO4·H2O、Na2MoO4·2H2O、20%酪蛋白、MgSO4、卡那霉素、葡萄糖、柠檬酸、消泡剂、酵母提取物和H2O组成,其中主要组成为:
A液:每升H2O中含KH2PO4 32.5g、K2HPO4 ·2H2O 68.75g、(NH4)2SO4 21.67g、FeSO4·7H2O 0.012g;
B液:每升H2O中含CaCl2·2H2O 1.2g、CoCl2·6H2O 2.27g、CuSO4·5H2O 2.0g、FeSO4·7H2O 2.33g、MnSO4·H2O 1.47g、Na2MoO4·2H2O 2.13g;
C液:每升H2O中含20%酪蛋白33.33ml、1M MgSO4 26.67ml、50mg/ml卡那霉素16.67ml、70%葡萄糖800ml、40%(NH4)2SO4 100ml、5%柠檬酸3.33ml。
上述用于生产瑞替普酶的发酵培养基的制备方法,具体制备步骤如下:
(1)A、B、C组分配制:
A液:1200ml,按上述各组分的配比精确称取规定的重量份,在蒸馏水中溶解,用氢氧化钠调节pH为7.0,然后定容至1200ml,即得;
B液:150ml,按上述各组分的配比精确称取规定的重量份,在适量蒸馏水中溶解,然后定容至150ml,即得;
C液:600ml,按上述各组分的配比精确称取规定的重量份,其中70%葡萄糖加热溶解后,单独在115℃下灭菌20min;其余组分除卡那霉素外,充分混匀,然后在121℃下灭菌20min,冷却后加入已灭菌的葡萄糖,混合均匀后,再加入卡那霉素,混匀,用蒸馏水补至600ml,即得;
(2)酵母提取物配制:500ml,精确称取规定的重量份,在500ml蒸馏水中溶解,配制成浓度为15%的溶液,115℃下灭菌20min,即得;
(3)在发酵罐中添加纯化水8L、消泡剂5ml和1200mlA液、150mlB液,121℃下灭菌20分钟,冷却至30℃时,再加入之前单独灭菌的15%酵母提取物500ml和C液600ml,混匀,即得。
实施例2
一种用于生产瑞替普酶的发酵培养基,由KH2PO4、K2HPO4 ·2H2O、(NH4)2SO4、FeSO4·7H2O、CaCl2·2H2O、CoCl2·6H2O、CuSO4·5H2O、MnSO4·H2O、Na2MoO4·2H2O、20%酪蛋白、MgSO4、卡那霉素、葡萄糖、柠檬酸、消泡剂、酵母提取物和H2O组成,其中主要组成为:
A液:每升H2O中含KH2PO4 25g、K2HPO4 ·2H2O 57.5g、(NH4)2SO4 17.5g、FeSO4·7H2O 0.008g;
B液:每升H2O中含CaCl2·2H2O 0.8g、CoCl2·6H2O 1.6g、CuSO4·5H2O 1.5g、FeSO4·7H2O 1.8g、MnSO4·H2O 1.0g、Na2MoO4·2H2O 1.6g;
C液:每升H2O中含20%酪蛋白25.0ml、1M MgSO4 16.0ml、50mg/ml卡那霉素10.0ml、70%葡萄糖867.5ml、40%(NH4)2SO4 80ml、5%柠檬酸1.5ml。
上述用于生产瑞替普酶的发酵培养基的制备方法,具体制备步骤如下:
(1)A、B、C组分配制:
A液:1200ml,按上述各组分的配比精确称取规定的重量份,在蒸馏水中溶解,用氢氧化钠调节pH为7.0,然后定容至1200ml,即得;
B液:150ml,按上述各组分的配比精确称取规定的重量份,在适量蒸馏水中溶解,然后定容至150ml,即得;
C液:600ml,按上述各组分的配比精确称取规定的重量份,其中70%葡萄糖加热溶解后,单独在115℃下灭菌20min;其余组分除卡那霉素外,充分混匀,然后在121℃下灭菌20min,冷却后加入已灭菌的葡萄糖,混合均匀后,再加入卡那霉素,混匀,用蒸馏水补至600ml,即得;
(2)酵母提取物配制:500ml,精确称取规定的重量份,在500ml蒸馏水中溶解,配制成浓度为12%的溶液,115℃下灭菌20min,即得;
(3)在发酵罐中添加纯化水8L、消泡剂5ml和1200mlA液、150mlB液,121℃下灭菌20分钟,冷却至30℃时,再加入之前单独灭菌的15%酵母提取物500ml和C液600ml,混匀,即得。
实施例3
一种用于生产瑞替普酶的发酵培养基,由KH2PO4、K2HPO4 ·2H2O、(NH4)2SO4、FeSO4·7H2O、CaCl2·2H2O、CoCl2·6H2O、CuSO4·5H2O、MnSO4·H2O、Na2MoO4·2H2O、20%酪蛋白、MgSO4、卡那霉素、葡萄糖、柠檬酸、消泡剂、酵母提取物和H2O组成,其中主要组成为:
A液:每升H2O中含KH2PO4 40g、K2HPO4 ·2H2O 80g、(NH4)2SO425.8g、FeSO4·7H2O 0.015g;
B液:每升H2O中含CaCl2·2H2O 1.6g、CoCl2·6H2O 2.93g、CuSO4·5H2O 2.5g、FeSO4·7H2O 2.87g、MnSO4·H2O 1.93g、Na2MoO4·2H2O 2.67g;
C液:每升H2O中含20%酪蛋白42.0ml、1M MgSO4 37.0ml、50mg/ml卡那霉素23.5ml、70%葡萄糖772.5ml、40%(NH4)2SO4 120ml、5%柠檬酸5.0ml。
上述用于生产瑞替普酶的发酵培养基的制备方法,具体制备步骤如下:
(1)A、B、C组分配制:
A液:1200ml,按上述各组分的配比精确称取规定的重量份,在蒸馏水中溶解,用氢氧化钠调节pH为7.0,然后定容至1200ml,即得;
B液:150ml,按上述各组分的配比精确称取规定的重量份,在适量蒸馏水中溶解,然后定容至150ml,即得;
C液:600ml,按上述各组分的配比精确称取规定的重量份,其中70%葡萄糖加热溶解后,单独在115℃下灭菌20min;其余组分除卡那霉素外,充分混匀,然后在121℃下灭菌20min,冷却后加入已灭菌的葡萄糖,混合均匀后,再加入卡那霉素,混匀,用蒸馏水补至600ml,即得;
(2)酵母提取物配制:500ml,精确称取规定的重量份,在500ml蒸馏水中溶解,配制成浓度为18%的溶液,115℃下灭菌20min,即得;
(3)在发酵罐中添加纯化水8L、消泡剂5ml和1200mlA液、150mlB液,121℃下灭菌20分钟,冷却至30℃时,再加入之前单独灭菌的15%酵母提取物500ml和C液600ml,混匀,即得。
实施例4
一种用于生产瑞替普酶的发酵培养基,由KH2PO4、K2HPO4 ·2H2O、(NH4)2SO4、FeSO4·7H2O、CaCl2·2H2O、CoCl2·6H2O、CuSO4·5H2O、MnSO4·H2O、Na2MoO4·2H2O、20%酪蛋白、MgSO4、卡那霉素、葡萄糖、柠檬酸、消泡剂、酵母提取物和H2O组成,其中主要组成为:
A液:每升H2O中含KH2PO4 30.0g、K2HPO4 ·2H2O 75.0g、(NH4)2SO4 20.0g、FeSO4·7H2O 0.013g;
B液:每升H2O中含CaCl2·2H2O 1.4g、CoCl2·6H2O 2.0g、CuSO4·5H2O 2.2g、FeSO4·7H2O 2.0g、MnSO4·H2O 1.73g、Na2MoO4·2H2O 1.80g;
C液:每升H2O中含20%酪蛋白30.0ml、1M MgSO4 32.0ml、50mg/ml卡那霉素13.0ml、70%葡萄糖831ml、40%(NH4)2SO4 90ml、5%柠檬酸4.0ml。
上述用于生产瑞替普酶的发酵培养基的制备方法,具体制备步骤如下:
(1)A、B、C组分配制:
A液:1200ml,按上述各组分的配比精确称取规定的重量份,在蒸馏水中溶解,用氢氧化钠调节pH为7.0,然后定容至1200ml,即得;
B液:150ml,按上述各组分的配比精确称取规定的重量份,在适量蒸馏水中溶解,然后定容至150ml,即得;
C液:600ml,按上述各组分的配比精确称取规定的重量份,其中70%葡萄糖加热溶解后,单独在115℃下灭菌20min;其余组分除卡那霉素外,充分混匀,然后在121℃下灭菌20min,冷却后加入已灭菌的葡萄糖,混合均匀后,再加入卡那霉素,混匀,用蒸馏水补至600ml,即得;
(2)酵母提取物配制:500ml,精确称取规定的重量份,在500ml蒸馏水中溶解,配制成浓度为14%的溶液,115℃下灭菌20min,即得;
(3)在发酵罐中添加纯化水8L、消泡剂5ml和1200mlA液、150mlB液,121℃下灭菌20分钟,冷却至30℃时,再加入之前单独灭菌的15%酵母提取物500ml和C液600ml,混匀,即得。
实施例5
一种用于生产瑞替普酶的发酵培养基,由KH2PO4、K2HPO4 ·2H2O、(NH4)2SO4、FeSO4·7H2O、CaCl2·2H2O、CoCl2·6H2O、CuSO4·5H2O、MnSO4·H2O、Na2MoO4·2H2O、20%酪蛋白、MgSO4、卡那霉素、葡萄糖、柠檬酸、消泡剂、酵母提取物和H2O组成,其中主要组成为:
A液:每升H2O中含KH2PO4 35g、K2HPO4 ·2H2O 62.5g、(NH4)2SO4 23.33g、FeSO4·7H2O 0.01g;
B液:每升H2O中含CaCl2·2H2O 1.0g、CoCl2·6H2O 2.53g、CuSO4·5H2O 1.8g、FeSO4·7H2O 2.67g、MnSO4·H2O 1.2g、Na2MoO4·2H2O 2.47g;
C液:每升H2O中含20%酪蛋白37ml、1M MgSO4 21.5ml、50mg/ml卡那霉素20ml、70%葡萄糖809ml、40%(NH4)2SO4 110ml、5%柠檬酸2.5ml。
上述用于生产瑞替普酶的发酵培养基的制备方法,具体制备步骤如下:
(1)A、B、C组分配制:
A液:1200ml,按上述各组分的配比精确称取规定的重量份,在蒸馏水中溶解,用氢氧化钠调节pH为7.0,然后定容至1200ml,即得;
B液:150ml,按上述各组分的配比精确称取规定的重量份,在适量蒸馏水中溶解,然后定容至150ml,即得;
C液:600ml,按上述各组分的配比精确称取规定的重量份,其中70%葡萄糖加热溶解后,单独在115℃下灭菌20min;其余组分除卡那霉素外,充分混匀,然后在121℃下灭菌20min,冷却后加入已灭菌的葡萄糖,混合均匀后,再加入卡那霉素,混匀,用蒸馏水补至600ml,即得;
(2)酵母提取物配制:500ml,精确称取规定的重量份,在500ml蒸馏水中溶解,配制成浓度为17%的溶液,115℃下灭菌20min,即得;
(3)在发酵罐中添加纯化水8L、消泡剂5ml和1200mlA液、150mlB液,121℃下灭菌20分钟,冷却至30℃时,再加入之前单独灭菌的15%酵母提取物500ml和C液600ml,混匀,即得。
实施例6:低用量制得的对照培养基
按照实施例1的制备方法制备,其中主要培养基的组成如下:
A液:每升H2O中含KH2PO4 20g、K2HPO4 ·2H2O 50g、(NH4)2SO415g、FeSO4·7H2O 0.006g;
B液:每升H2O中含CaCl2·2H2O 0.5g、CoCl2·6H2O 1.4g、CuSO4·5H2O 1.3g、FeSO4·7H2O 1.5g、MnSO4·H2O 0.8g、Na2MoO4·2H2O 1.5g;
C液:每升H2O中含20%酪蛋白20ml、1M MgSO4 15ml、50mg/ml卡那霉素8ml、70%葡萄糖886ml、40%(NH4)2SO4 70ml、5%柠檬酸1.0ml。
实施例7:高用量制得的对照培养基
按照实施例1的制备方法制备,其中主要培养基的组成如下:
A液:每升H2O中含KH2PO4 45g、K2HPO4 ·2H2O 85g、(NH4)2SO426.8g、FeSO4·7H2O 0.016g;
B液:每升H2O中含CaCl2·2H2O 1.8g、CoCl2·6H2O 3.2g、CuSO4·5H2O 2.8g、FeSO4·7H2O 3.1g、MnSO4·H2O 2.03g、Na2MoO4·2H2O 2.8g;
C液:每升H2O中含20%酪蛋白45.0ml、1M MgSO4 38.5ml、50mg/ml卡那霉素25.0ml、70%葡萄糖756ml、40%(NH4)2SO4 130ml、5%柠檬酸5.5ml。
实验例:发酵结果评价
实验方法:瑞替普酶目的菌体制备工艺如下:
(1)种子活化:通过三次扩增获得发酵工作种子液:
第一次扩增:将表达瑞替普酶的工程菌株大肠杆菌在 LBA培养基上活化,然后挑取一个单菌落到LBA培养基中,培养基为18*180mm试管中装入10mlLB培养基,在37℃,125rpm,培养至OD600=0.8-1.0,得到一级种子培养液;
第二次扩增:将一级种子液按5%的接种量接种至100ml LB培养基,培养基为500ml三角瓶装入100mlLB培养基,在37℃,125rpm,培养至OD600=0.8-1.0,即得二级种子液;
第三次扩增:将二级种子液以5%的接种量接入1.5L LB培养基,培养基为5L三角瓶装入1.5L LB培养基,在37℃,125rpm,培养至OD600=0.8-1.2,即得发酵工作种子液;
(2)发酵前准备:在19L发酵罐中添加纯化水8L、5ml泡敌和1200mlA液、150mlB液,121℃灭菌20分钟,冷却至30℃时,再加入之前单独灭菌的15%酵母提取物500ml,600mlC液;校正溶氧电极,pH电极,然后在火焰保护下打开发酵罐的接种口,将发酵工作种子液全部接种于发酵罐中;
(3)发酵:控制发酵条件,发酵温度为37℃,用氨水调节pH值为6.6-6.9,初始溶氧量30%,调节转速为200rpm,发酵时间为24小时,每隔两小时转速提升25rpm,当OD600=20-22时,开始用蠕动泵进行补料,加D液,补料的流加速度为7ml/min;其中D液的组成和用量为: 3800ml,含20%酪蛋白7ml、1M MgSO4 50ml、50mg/ml卡那霉素3ml、A液300ml、70%葡萄糖1000ml、40%(NH4)2SO4 100ml、水2340ml;
(4)诱导:当OD600=30-32时,开始添加浓度为120g/L的IPTG 12ml进行诱导,5小时诱导表达结束后,收集菌液,4℃、转速为9000rpm条件下离心30分钟,分离,即得目的菌体。
其中步骤(2)中的发酵培养基按照实施例1-7的技术方案制备,得到实验样品按顺序编号为样品1-7;另外按照任启生等“重组人组织型纤溶酶原激活剂突变体基因的克隆、表达与生物活性鉴定”(生物技术, 2004, 14(5): 6-8)的方法制备得到对照样品1。观察各方法得到的目的菌体,见表2。
表2
样品 | 最终菌体湿重(g/L) | 目的蛋白表达率 |
样品1 | 42 | 33% |
样品2 | 36 | 32% |
样品3 | 43 | 34% |
样品4 | 38 | 33% |
样品5 | 39 | 34% |
样品6(对比) | 28 | 26% |
样品7(对比) | 33 | 27% |
对照样品1 | 25 | 20% |
以上结果表明,采用本发明所述培养基,表达水平较高,制备得到的重组大肠杆菌得到了稳定的生长,样品1-5与对比样品1相比,湿重增加约0.72倍,表达率提高了0.7倍,样品1-5与对比样品6-7相比,各考察指标均优于样品6-7,说明本发明所采用的培养基组成范围合理且优于现有技术,得到的目的菌体产率高、且工艺简便,有效降低了生产成本。
Claims (7)
1.一种用于生产瑞替普酶的发酵培养基,其特征在于,由KH2PO4、K2HPO4 ·2H2O、(NH4)2SO4、FeSO4·7H2O、CaCl2·2H2O、CoCl2·6H2O、CuSO4·5H2O、MnSO4·H2O、Na2MoO4·2H2O、20%酪蛋白、MgSO4、卡那霉素、葡萄糖、柠檬酸、消泡剂、酵母提取物和H2O组成,其中主要组成为:
A液:每升H2O中含KH2PO4 25-40g、K2HPO4 ·2H2O 57.5-80g、(NH4)2SO4 17.5-25.8g、FeSO4·7H2O 0.008-0.015g;
B液:每升H2O中含CaCl2·2H2O 0.8-1.6g、CoCl2·6H2O 1.60-2.93g、CuSO4·5H2O 1.5-2.5g、FeSO4·7H2O 1.80-2.87g、MnSO4·H2O 1.0-1.93g、Na2MoO4·2H2O 1.60-2.67g;
C液:每升H2O中含20%酪蛋白25.0-42.0ml、1M MgSO4 16.0-37.0ml、50mg/ml卡那霉素10.0-23.5ml、70%葡萄糖772.5-867.5ml、40%(NH4)2SO4 80-120ml、5%柠檬酸1.5-5.0ml。
2.根据权利要求1所述的用于生产瑞替普酶的发酵培养基,其特征在于:其中主要组成为:
A液:每升H2O中含KH2PO4 30-35g、K2HPO4 ·2H2O 62.5-75.0g、(NH4)2SO4 20-23.33g、FeSO4·7H2O 0.010-0.013g;
B液:每升H2O中含CaCl2·2H2O 1.0-1.4g、CoCl2·6H2O 2.0-2.53g、CuSO4·5H2O 1.8-2.2g、FeSO4·7H2O 2.0-2.67g、MnSO4·H2O 1.20-1.73g、Na2MoO4·2H2O 1.80-2.47g;
C液:每升H2O中含20%酪蛋白30.0-37.0ml、1M MgSO4 21.5-32.0ml、50mg/ml卡那霉素13.0-20.0ml、70%葡萄糖797-843ml、40%(NH4)2SO4 90-110ml、5%柠檬酸2.5-4.0ml。
3.根据权利要求1或2所述的用于生产瑞替普酶的发酵培养基,其特征在于:其中主要组成为:
A液:每升H2O中含KH2PO4 32.50g、K2HPO4 ·2H2O 68.75g、(NH4)2SO4 21.67g、FeSO4·7H2O 0.012g;
B液:每升H2O中含CaCl2·2H2O 1.20g、CoCl2·6H2O 2.27g、CuSO4·5H2O 2.0g、FeSO4·7H2O 2.33g、MnSO4·H2O 1.47g、Na2MoO4·2H2O 2.13g;
C液:每升H2O中含20%酪蛋白33.33ml、1M MgSO4 26.67ml、50mg/ml卡那霉素16.67ml、70%葡萄糖800ml、40%(NH4)2SO4 100ml、5%柠檬酸3.33ml。
4.根据权利要求1或2所述的用于生产瑞替普酶的发酵培养基,其特征在于:其中各组成为:
A液:每升H2O中含KH2PO4 33.0g、K2HPO4 ·2H2O 70.0g、(NH4)2SO4 22.0g、FeSO4·7H2O 0.011g;
B液:每升H2O中含CaCl2·2H2O 1.3g、CoCl2·6H2O 2.3g、CuSO4·5H2O 1.9g、FeSO4·7H2O 2.5g、MnSO4·H2O 1.4g、Na2MoO4·2H2O 2.0g;
C液:每升H2O中含20%酪蛋白35ml、1M MgSO4 28ml、50mg/ml卡那霉素18ml、70%葡萄糖821ml、40%(NH4)2SO4 95ml、5%柠檬酸3.0ml。
5.根据权利要求1所述的用于生产瑞替普酶的发酵培养基,其特征在于:酵母提取物浓度为12%-18%,每升H2O中含消泡剂为0.3-0.7ml。
6.权利要求1-5任一所述的用于生产瑞替普酶的发酵培养基的制备方法,其特征在于:具体制备步骤如下:
(1)A、B、C组分配制:
A液:1200ml,按上述各组分的配比精确称取规定的重量份,在蒸馏水中溶解,用氢氧化钠调节pH为7.0,然后定容至1200ml,即得;
B液:150ml,按上述各组分的配比精确称取规定的重量份,在适量蒸馏水中溶解,然后定容至150ml,即得;
C液:600ml,按上述各组分的配比精确称取规定的重量份,其中70%葡萄糖加热溶解后,单独在115℃下灭菌20min;其余组分除卡那霉素外,充分混匀,然后在121℃下灭菌20min,冷却后加入已灭菌的葡萄糖,混合均匀后,再加入卡那霉素,混匀,用蒸馏水补至600ml,即得;
(2)酵母提取物配制:500ml,精确称取规定的重量份,在蒸馏水中溶解,配制成浓度为12-18%的溶液,115℃下灭菌20min,即得;
(3)在发酵罐中添加纯化水8L、消泡剂5ml和1200mlA液、150mlB液,121℃下灭菌20分钟,冷却至30℃时,再加入之前单独灭菌的15%酵母提取物500ml和C液600ml,混匀,即得。
7.根据权利要求1所述的用于生产瑞替普酶的发酵培养基的制备方法,其特征在于:所述步骤中发酵罐容积为19L。
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