CN102660613A - 用于重组鸡干扰素α的高密度发酵培养基及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种用于重组鸡干扰素α的高密度发酵培养基及其制备方法，所述发酵培养基主要由葡萄糖、蛋白胨、酵母粉、KH2PO4、K2HPO4、Na2HPO4·12H2O、(NH4)2SO4、NH4Cl、MnSO4·5H2O、CoCl2·6H2O、Na2MoO4·2H2O、ZnCl2、CuSO4·5H2O、H3BO4、FeSO4·7H2O、CaCl2·2H2O、MgSO4·7H2O、消泡剂和H2O组成，通过蒸馏水溶解并用氨水调节pH值，最后在发酵罐内灭菌制得；所述发酵培养基减轻了传统工艺发酵过程中对菌体生长及蛋白表达的抑制作用，实现了重组大肠杆菌的高密度生长，提高了重组鸡α干扰素蛋白的产率。

Description

用于重组鸡干扰素α的高密度发酵培养基及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物发酵领域，尤其是一种用于重组鸡干扰素α的高密度发酵培养基及其制备方法。
背景技术
干扰素是一类在同种细胞上具有抗病毒活性的糖蛋白，通过抑制病毒DNA和RNA的复制达到预防和治疗效果，是脊椎动物抵抗病毒、细菌、寄生虫感染及肿瘤侵袭的重要组分。同时干扰素还具有神经、免疫、内分泌调节等多种生物学功能。1957年自lsaacs和Lindenmann发现干扰素以来，干扰素已经显示出了极强的抗病毒、免疫调节活性和广阔的应用前景。因而，干扰素的研究越来越受到人们的广泛关注。与传统的宠物保健治疗药物相比，干扰素在治疗效果及使用时机方面显示出了极大的优越性。
目前，干扰素等蛋白类药物的工业生产中使用最多的工程菌为大肠杆菌，采用高密度培养技术来提高菌体的发酵密度，从而最终提高产物的比生产率。高密度发酵目的的实现，除了重组菌本身的表达性质之外，还必须有重组菌生长和产物表达的最适培养基组成等条件。目前生产重组鸡α干扰素的高密度发酵培养基中大多有葡萄糖为碳源，在培养前期过程中就极易产生乙酸，造成重组菌生长和表达的抑制效应。因此，选择合适的发酵培养基不仅可以减少培养体积，强化下游分离提取，而且可以缩短生产周期、减少设备投资从而降低生产成本，能极大地提高在市场上得竞争力。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种用于重组鸡干扰素α的高密度发酵培养基。
本发明所要解决的另一技术问题在于提供上述用于重组鸡干扰素α的高密度发酵培养基的制备方法。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：
一种用于重组鸡干扰素α的高密度发酵培养基，主要由葡萄糖、蛋白胨、酵母粉、KH2PO4、K2HPO4、Na2HPO4·12H2O、(NH4)2SO4、NH4Cl、MnSO4·5H2O、CoCl2·6H2O、Na2MoO4·2H2O、ZnCl2、CuSO4·5H2O、H3BO4、FeSO4·7H2O、CaCl2·2H2O、MgSO4·7H2O、消泡剂和H2O组成，其中每1L H2O中含有葡萄糖5～10g、蛋白胨5～10g、酵母粉5～10g、KH2PO4 2～4g、K2HPO4 1～4g、Na2HPO4·12H2O 2～7g、(NH4)2SO40.6～1.2g、NH4Cl 0.1～0.3g、MnSO4·5H2O 0.001～0.01g、CoCl2·6H2O 0.004～0.01g、Na2MoO4·2H2O 0.001～0.005g、ZnCl2 0.001～0.01g、CuSO4·5H2O 0.001～0.01g、H3BO4 0.002～0.012g、FeSO4·7H2O 0.01～0.02g、CaCl2·2H2O 0.01～0.04g、MgSO4·7H2O 0.1～0.6g、消泡剂0.1～0.3g。
优选的，上述用于重组鸡干扰素α的高密度发酵培养基，其中每1L H2O中含有葡萄糖7～10g、蛋白胨5～7g、酵母粉5～7g、KH2PO4 2～3g、K2HPO4 1～3g、Na2HPO4·12H2O 2～4g、(NH4)2SO4 0.6～1.0g、NH4Cl 0.1～0.2g、MnSO4·5H2O0.001～0.006g、CoCl2·6H2O 0.004～0.01g、Na2MoO4·2H2O 0.001～0.004g、ZnCl2 0.001～0.005g、CuSO4·5H2O 0.001～0.007g、H3BO4 0.002～0.006g、FeSO4·7H2O 0.01～0.02g、CaCl2·2H2O 0.01～0.02g、MgSO4·7H2O 0.3～0.6g、消泡剂0.1～0.2g。
优选的，上述用于重组鸡干扰素α的高密度发酵培养基，其中每1L H2O中含有葡萄糖10g、蛋白胨6g、酵母粉6g、KH2PO4 2g、K2HPO4 1g、Na2HPO4·12H2O 2g、(NH4)2SO4 0.6g、NH4Cl 0.1g、MnSO4·5H2O 0.001g、CoCl2·6H2O0.004g、Na2MoO4·2H2O 0.001g、ZnCl2 0.001、CuSO4·5H2O 0.001g、H3BO4 0.002g、FeSO4·7H2O 0.01g、CaCl2·2H2O 0.01、MgSO4·7H2O 0.4g、消泡剂0.1g。
优选的，上述用于重组鸡干扰素α的高密度发酵培养基，其中每1L H2O中含有葡萄糖8g、蛋白胨5g、酵母粉5g、KH2PO4 3g、K2HPO4 2g、Na2HPO4·12H2O3g、(NH4)2SO4 0.8g、NH4Cl 0.2g、MnSO4·5H2O 0.005g、CoCl2·6H2O 0.01g、Na2MoO4·2H2O 0.003g、ZnCl2 0.005、CuSO4·5H2O 0.005g、H3BO4 0.004g、FeSO4·7H2O0.01g、CaCl2·2H2O 0.01、MgSO4·7H2O 0.6g、消泡剂0.2g。
优选的，上述用于重组鸡干扰素α的高密度发酵培养基，其中每1L H2O中含有葡萄糖5g、蛋白胨5g、酵母粉10g、KH2PO4 2g、K2HPO4 1g、Na2HPO4·12H2O 7g、(NH4)2SO4 0.6g、NH4Cl 0.1g、MnSO4·5H2O 0.001g、CoCl2·6H2O0.01g、Na2MoO4·2H2O 0.001g、ZnCl2 0.001g、CuSO4·5H2O 0.001g、H3BO4 0.012g、FeSO4·7H2O 0.02g、CaCl2·2H2O 0.01g、MgSO4·7H2O 0.1g、消泡剂0.3g。
上述用于重组鸡干扰素α的高密度发酵培养基的制备方法，具体制备步骤如下：
(1)按上述各组分的配比精确称取规定重量的组分；
(2)在蒸馏水溶液中溶解；
(3)用50％氨水溶液调节pH值至6.8～7.4；
(4)在发酵罐内，121℃，20分钟条件下灭菌，即得。
优选的，上述用于重组鸡干扰素α的高密度发酵培养基的制备方法，所述步骤(4)中发酵罐容积为50L。
本发明的有益效果是：
上述用于重组鸡干扰素α的高密度发酵培养基，在重组大肠杆菌发酵过程中避免或减少了乙酸的生成，减轻了传统工艺发酵过程中对菌体生长及蛋白表达的抑制作用，实现了重组大肠杆菌的高密度生长，提高了重组鸡α干扰素蛋白的产率，从而有效降低了生产成本；其制备方法简单，适合规模化工业生产的需要。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明所述技术方案作进一步的说明。
下述实施例中采用的发酵罐是镇江科润海生物工程设备有限公司生产的50L发酵罐；所采用的试剂均为普通化学试剂公司购买，所用消泡剂购自江苏斯德瑞克化工有限公司，YJG-1；目的蛋白测定采用SDS-PAGE法，采用BIO-RAD公司的蛋白电泳仪。
实施例1
一种用于重组鸡干扰素α的高密度发酵培养基，主要由葡萄糖、蛋白胨、酵母粉、KH2PO4、K2HPO4、Na2HPO4·12H2O、(NH4)2SO4、NH4Cl、MnSO4·5H2O、CoCl2·6H2O、Na2MoO4·2H2O、ZnCl2、CuSO4·5H2O、H3BO4、FeSO4·7H2O、CaCl2·2H2O、MgSO4·7H2O、消泡剂和H2O组成，其中葡萄糖8g、蛋白胨5g、酵母粉5g、KH2PO4 3g、K2HPO42g、Na2HPO4·12H2O 3g、(NH4)2SO4 0.8g、NH4Cl 0.2g、MnSO4·5H2O 0.005g、CoCl2·6H2O 0.01g、Na2MoO4·2H2O 0.003g、ZnCl2 0.005、CuSO4·5H2O 0.005g、H3BO4 0.004g、FeSO4·7H2O 0.01g、CaCl2·2H2O 0.01、MgSO4·7H2O 0.6g、消泡剂0.2g、H2O 1L。
上述用于重组鸡干扰素α的高密度发酵培养基的制备方法，具体制备步骤如下：
(1)按上述各组分的配比精确称取规定重量的组分；
(2)在蒸馏水溶液中溶解；
(3)用50％氨水溶液调节pH值至7.0；
(4)在发酵罐内，121℃，20分钟条件下灭菌，即得。
实施例2
一种用于重组鸡干扰素α的高密度发酵培养基，主要由葡萄糖、蛋白胨、酵母粉、KH2PO4、K2HPO4、Na2HPO4·12H2O、(NH4)2SO4、NH4Cl、MnSO4·5H2O、CoCl2·6H2O、Na2MoO4·2H2O、ZnCl2、CuSO4·5H2O、H3BO4、FeSO4·7H2O、CaCl2·2H2O、MgSO4·7H2O、消泡剂和H2O组成，其中葡萄糖10g、蛋白胨6g、酵母粉6g、KH2PO4 2g、K2HPO41g、Na2HPO4·12H2O 2g、(NH4)2SO4 0.6g、NH4Cl 0.1g、MnSO4·5H2O 0.001g、CoCl2·6H2O 0.004g、Na2MoO4·2H2O 0.001g、ZnCl2 0.001、CuSO4·5H2O 0.001g、H3BO4 0.002g、FeSO4·7H2O 0.01g、CaCl2·2H2O 0.01、MgSO4·7H2O 0.4g、消泡剂0.1g、H2O 1L。
上述用于重组鸡干扰素α的高密度发酵培养基的制备方法，具体制备步骤如下：
(1)按上述各组分的配比精确称取规定重量的组分；
(2)在蒸馏水溶液中溶解；
(3)用50％氨水溶液调节pH值至7.1；
(4)在发酵罐内，121℃，20分钟条件下灭菌，即得。
实施例3
一种用于重组鸡干扰素α的高密度发酵培养基，主要由葡萄糖、蛋白胨、酵母粉、KH2PO4、K2HPO4、Na2HPO4·12H2O、(NH4)2SO4、NH4Cl、MnSO4·5H2O、CoCl2·6H2O、Na2MoO4·2H2O、ZnCl2、CuSO4·5H2O、H3BO4、FeSO4·7H2O、CaCl2·2H2O、MgSO4·7H2O、消泡剂和H2O组成，其中葡萄糖10g、蛋白胨5g、酵母粉5g、KH2PO4 3g、K2HPO43g、Na2HPO4·12H2O 4g、(NH4)2SO4 0.6g、NH4Cl 0.1g、MnSO4·5H2O 0.006g、CoCl2·6H2O 0.01g、Na2MoO4·2H2O 0.001g、ZnCl2 0.001g、CuSO4·5H2O 0.007g、H3BO4 0.006g、FeSO4·7H2O 0.01g、CaCl2·2H2O 0.02g、MgSO4·7H2O 0.6g、消泡剂0.1g、H2O 1L。
上述用于重组鸡干扰素α的高密度发酵培养基的制备方法，具体制备步骤如下：
(1)按上述各组分的配比精确称取规定重量的组分；
(2)在蒸馏水溶液中溶解；
(3)用50％氨水溶液调节pH值至6.9；
(4)在发酵罐内，121℃，20分钟条件下灭菌，即得。
实施例4
一种用于重组鸡干扰素α的高密度发酵培养基，主要由葡萄糖、蛋白胨、酵母粉、KH2PO4、K2HPO4、Na2HPO4·12H2O、(NH4)2SO4、NH4Cl、MnSO4·5H2O、CoCl2·6H2O、Na2MoO4·2H2O、ZnCl2、CuSO4·5H2O、H3BO4、FeSO4·7H2O、CaCl2·2H2O、MgSO4·7H2O、消泡剂和H2O组成，其中葡萄糖7g、蛋白胨7g、酵母粉7g、KH2PO4 2g、K2HPO41g、Na2HPO4·12H2O 2g、(NH4)2SO4 1.0g、NH4Cl 0.2g、MnSO4·5H2O 0.001g、CoCl2·6H2O 0.004g、Na2MoO4·2H2O  0.004g、ZnCl2 0.005g、CuSO4·5H2O0.001g、H3BO4 0.002g、FeSO4·7H2O 0.02g、CaCl2·2H2O  0.01g、MgSO4·7H2O0.3g、消泡剂0.2g、H2O 1L。
上述用于重组鸡干扰素α的高密度发酵培养基的制备方法，具体制备步骤如下：
(1)按上述各组分的配比精确称取规定重量的组分；
(2)在蒸馏水溶液中溶解；
(3)用50％氨水溶液调节pH值至7.2；
(4)在发酵罐内，121℃，20分钟条件下灭菌，即得。
实施例5
一种用于重组鸡干扰素α的高密度发酵培养基，主要由葡萄糖、蛋白胨、酵母粉、KH2PO4、K2HPO4、Na2HPO4·12H2O、(NH4)2SO4、NH4Cl、MnSO4·5H2O、CoCl2·6H2O、Na2MoO4·2H2O、ZnCl2、CuSO4·5H2O、H3BO4、FeSO4·7H2O、CaCl2·2H2O、MgSO4·7H2O、消泡剂和H2O组成，其中葡萄糖10g、蛋白胨10g、酵母粉5g、KH2PO4 4g、K2HPO4 4g、Na2HPO4·12H2O 2g、(NH4)2SO4 1.2g、NH4Cl 0.3g、MnSO4·5H2O 0.01g、CoCl2·6H2O 0.004g、Na2MoO4·2H2O 0.005g、ZnCl2 0.01g、CuSO4·5H2O 0.01g、H3BO4 0.002g、FeSO4·7H2O 0.01g、CaCl2·2H2O 0.04g、MgSO4·7H2O 0.6g、消泡剂0.1g、H2O 1L。
上述用于重组鸡干扰素α的高密度发酵培养基的制备方法，具体制备步骤如下：
(1)按上述各组分的配比精确称取规定重量的组分；
(2)在蒸馏水溶液中溶解；
(3)用50％氨水溶液调节pH值至7.4；
(4)在发酵罐内，121℃，20分钟条件下灭菌，即得。
实施例6
一种用于重组鸡干扰素α的高密度发酵培养基，主要由葡萄糖、蛋白胨、酵母粉、KH2PO4、K2HPO4、Na2HPO4·12H2O、(NH4)2SO4、NH4Cl、MnSO4·5H2O、CoCl2·6H2O、Na2MoO4·2H2O、ZnCl2、CuSO4·5H2O、H3BO4、FeSO4·7H2O、CaCl2·2H2O、MgSO4·7H2O、消泡剂和H2O组成，其中葡萄糖5g、蛋白胨5g、酵母粉10g、KH2PO42g、K2HPO41g、Na2HPO4·12H2O 7g、(NH4)2SO4 0.6g、NH4Cl 0.1g、MnSO4·5H2O 0.001g、CoCl2·6H2O 0.01g、Na2MoO4·2H2O 0.001g、ZnCl2 0.001g、CuSO4·5H2O 0.001g、H3BO4 0.012g、FeSO4·7H2O 0.02g、CaCl2·2H2O 0.01g、MgSO4·7H2O 0.1g、消泡剂0.3g、H2O 1L。
上述用于重组鸡干扰素α的高密度发酵培养基的制备方法，具体制备步骤如下：
(1)按上述各组分的配比精确称取规定重量的组分；
(2)在蒸馏水溶液中溶解；
(3)用50％氨水溶液调节pH值至6.8；
(4)在发酵罐内，121℃，20分钟条件下灭菌，即得。
将实施例1-6之一所述各组分用量按照相同比例增加或减少，所得各组分的用量配比关系均属于本发明的保护范围。
对照试验例
现有技术中用于重组鸡干扰素α的发酵培养基，主要由葡萄糖、蛋白胨、酵母粉、KH2PO4、K2HPO4、Na2HPO4·12H2O、NaCl、消泡剂和H2O组成，其中葡萄糖20g、蛋白胨10g、酵母粉10g、KH2PO4 3g、K2HPO4 2g、Na2HPO4·12H2O3g、NaCl 5g、消泡剂0.2g、H2O 1L。具体制备步骤如下：
(1)按上述各组分的配比精确称取规定重量的组分；
(2)在蒸馏水溶液中溶解；
(3)用50％氨水溶液调节pH值至7.0；
(4)在发酵罐内，121℃，20分钟条件下灭菌，即得。
现有技术中用于重组鸡干扰素α的补料培养基，主要由葡萄糖、酵母粉、蛋白胨、MgSO4·7H2O和H2O组成，其中葡萄糖600g，酵母粉50g，蛋白胨25g，MgSO4·7H2O 10g、H2O 1L。具体制备步骤如下：
(1)按上述各组分的配比精确称取规定重量的组分；
(2)在蒸馏水溶液中溶解；
(3)用50％氨水溶液调节pH值至7.0；
(4)装入补料瓶中在115℃，20分钟条件下灭菌，即得。
试验方法：
在上述发酵罐中按10％接入重组大肠杆菌种子后进行培养，在溶解氧第一次反弹时补加补料培养基，控制溶氧不低于20％，待菌体进入对数生长期开始添加IPTG诱导，至发酵结束，获得含重组鸡α干扰素的菌体并检测菌体的目的蛋白(重组鸡α干扰素)表达量。
其中实施例1-6与对照试验例采用相同的补料培养基，实施例1-6与对照试验例采用各自所述发酵培养基进行试验，结果见表1。
表1
  试验例   菌体重量   目的蛋白表达量
  实施例1   1651.4g   42.4％
  实施例2   1726.3g   45.7％
  实施例3   1653.1g   43.3％
  实施例4   1820.4g   42.7％
  实施例5   1648.7g   41.8％
  实施例6   1868.9g   48.1％
  对照试验例   986.4g   24.4％
上述参照实施例对该一种用于重组鸡干扰素α的高密度发酵培养基及其制备方法进行的详细描述，是说明性的而不是限定性的，可按照所限定范围列举出若干个实施例，因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改，应属本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种用于重组鸡干扰素α的高密度发酵培养基，其特征在于：主要由葡萄糖、蛋白胨、酵母粉、KH2PO4、K2HPO4、Na2HPO4·12H2O、(NH4)2SO4、NH4Cl、MnSO4·5H2O、CoCl2·6H2O、Na2MoO4·2H2O、ZnCl2、CuSO4·5H2O、H3BO4、FeSO4·7H2O、CaCl2·2H2O、MgSO4·7H2O、消泡剂和H2O组成，其中每1L H2O中含有葡萄糖5～10g、蛋白胨5～10g、酵母粉5～10g、KH2PO4 2～4g、K2HPO4 1～4g、Na2HPO4·12H2O 2～7g、(NH4)2SO4 0.6～1.2g、NH4Cl 0.1～0.3g、MnSO4·5H2O0.001～0.01g、CoCl2·6H2O 0.004～0.01g、Na2MoO4·2H2O 0.001～0.005g、ZnCl2 0.001～0.01g、CuSO4·5H2O 0.001～0.01g、H3BO4 0.002～0.012g、FeSO4·7H2O 0.01～0.02g、CaCl2·2H2O 0.01～0.04g、MgSO4·7H2O 0.1～0.6g、消泡剂0.1～0.3g。
2.根据权利要求1所述的用于重组鸡干扰素α的高密度发酵培养基，其特征在于：其中每1L H2O中含有葡萄糖7～10g、蛋白胨5～7g、酵母粉5～7g、KH2PO4 2～3g、K2HPO4 1～3g、Na2HPO4·12H2O 2～4g、(NH4)2SO4 0.6～1.0g、NH4Cl 0.1～0.2g、MnSO4·5H2O 0.001～0.006g、CoCl2·6H2O 0.004～0.01g、Na2MoO4·2H2O 0.001～0.004g、ZnCl2 0.001～0.005g、CuSO4·5H2O 0.001～0.007g、H3BO4 0.002～0.006g、FeSO4·7H2O 0.01～0.02g、CaCl2·2H2O 0.01～0.02g、MgSO4·7H2O 0.3～0.6g、消泡剂0.1～0.2g。
3.根据权利要求1或2所述的用于重组鸡干扰素α的高密度发酵培养基，其特征在于：其中每1L H2O中含有葡萄糖10g、蛋白胨6g、酵母粉6g、KH2PO42g、K2HPO4 1g、Na2HPO4·12H2O 2g、(NH4)2SO4 0.6g、NH4Cl 0.1g、MnSO4·5H2O0.001g、CoCl2·6H2O 0.004g、Na2MoO4·2H2O 0.001g、ZnCl2 0.001、CuSO4·5H2O0.001g、H3BO4 0.002g、FeSO4·7H2O 0.01g、CaCl2·2H2O 0.01、MgSO4·7H2O 0.4g、消泡剂0.1g。
4.根据权利要求1或2所述的用于重组鸡干扰素α的高密度发酵培养基，其特征在于：其中每1L H2O中含有葡萄糖8g、蛋白胨5g、酵母粉5g、KH2PO43g、K2HPO4 2g、Na2HPO4·12H2O 3g、(NH4)2SO4 0.8g、NH4Cl 0.2g、MnSO4·5H2O0.005g、CoCl2·6H2O 0.01g、Na2MoO4·2H2O 0.003g、ZnCl2 0.005、CuSO4·5H2O0.005g、H3BO4 0.004g、FeSO4·7H2O 0.01g、CaCl2·2H2O 0.01、MgSO4·7H2O 0.6g、消泡剂0.2g。
5.根据权利要求1所述的用于重组鸡干扰素α的高密度发酵培养基，其特征在于：其中每1L H2O中含有葡萄糖5g、蛋白胨5g、酵母粉10g、KH2PO42g、K2HPO4 1g、Na2HPO4·12H2O 7g、(NH4)2SO4 0.6g、NH4Cl 0.1g、MnSO4·5H2O0.001g、CoCl2·6H2O 0.01g、Na2MoO4·2H2O 0.001g、ZnCl2 0.001g、CuSO4·5H2O0.001g、H3BO4 0.012g、FeSO4·7H2O 0.02g、CaCl2·2H2O 0.01g、MgSO4·7H2O0.1g、消泡剂0.3g。
6.权利要求1-5之一所述的用于重组鸡干扰素α的高密度发酵培养基的制备方法，其特征在于：具体制备步骤如下：
(1)按上述各组分的配比精确称取规定重量的组分；
(2)在蒸馏水溶液中溶解；
(3)用50％氨水溶液调节pH值至6.8～7.4；
(4)在发酵罐内，121℃，20分钟条件下灭菌，即得。
7.根据权利要求6所述的用于重组鸡干扰素α的高密度发酵培养基的制备方法，其特征在于：所述步骤(4)中发酵罐容积为50L。
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