CN109706129B - 一种富含sod的饲用复合酶制剂的固态发酵制备方法 - Google Patents

一种富含sod的饲用复合酶制剂的固态发酵制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种富含SOD的饲用复合酶制剂的固态发酵制备方法，包括以下步骤；取海洋红酵母、黑曲霉菌种按1～5％的接种量接种于一级种子培养基中单菌培养，温度设置在28～32℃，搅拌转速为50～120r/min或通入无菌空气控制溶氧在50～65％以及处于pH6.0，培养24～36h培养即得一级种子液，海洋红酵母可以提高饲养的效果并增强动物体的免疫功能，减少抗生素的用量，是优良的添加剂，黑曲霉菌用作发酵菌种，主要是利用此黑曲霉分泌产生糖化酶、柠檬酸、葡萄糖酸、五倍子酸等的功能，一级培养基和二级培养基中酵母利用葡萄糖作为碳源，可以迅速的测取数据和增加准确性，方便大规模的生产和使用，胰蛋白胨作为氮源，相较于硫酸铵营养更加全面，提高菌数。

Description

一种富含SOD的饲用复合酶制剂的固态发酵制备方法
技术领域
本发明涉及到一种SOD复合酶发酵制备方法，特别涉及一种富含SOD的饲用复合酶制剂的固态发酵制备方法。
背景技术
超氧化物歧化酶SOD，是生物体内重要的抗氧化酶，广泛分布于各种生物体内，如动物，植物，微生物等，SOD具有特殊的生理活性，是生物体内清除自由基的首要物质。现已证实，由氧自由基引发的疾病多达60多种。它可对抗与阻断因氧自由基对细胞造成的损害，并及时修复受损细胞，复原因自由基造成的对细胞伤害，以保证动物和人体的健康。
目前市场上大多数SOD产品主要来源于动物血液、内脏等，由于原材料有限、纯化困难等原因，导致SOD的纯度低、产量少；特别是随着世界各地疯牛病、禽流感、口蹄疫以及由动物传播的SARS等恶性传染病的不时报道，生产动物源血液制品的风险加大，现在以限制从动物血液提取SOD，寻找天然微生物和植物来源的SOD，构建高效表达系统和生产工艺，是实现SOD产业化生产的重要途径。
发明内容
本发明的目的在于提供一种富含SOD的饲用复合酶制剂的固态发酵制备方法，具有工艺简单、发酵活力高的优点，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种富含SOD的饲用复合酶制剂的固态发酵制备方法，包括以下步骤；
S1：取海洋红酵母、黑曲霉菌种按1～5％的接种量接种于一级种子培养基中单菌培养，温度设置在28～32℃，搅拌转速为50～120r/min或通入无菌空气控制溶氧在50～65％以及处于pH6.0，培养24～36h培养即得一级种子液；
S2：将一级种子液按5～10％的接种量分别接种于二级种子培养基中，温度设置在在28～32℃，搅拌转速为50～120r/min或通入无菌空气控制溶氧在50～65％，培养即得二级种子液；
S3：将二级种子液按10～15％的接种量接种于固体发酵培养基中，在28～35℃培养72～96h，通入无菌空气控制溶氧在50～65％，得到混合培养基，在发酵48～96h按每升混合培养基流加营养液2～6ml/h，同时控制pH为5.7～6.5，培养80～96h后即得酶活达到800U/g以上的SOD复合酶；
S4：将SOD复合酶固体培养基进行喷雾干燥，即可得到酶活达到1500U/g以上的固体SOD复合酶。
进一步地，步骤S1中海洋红酵母一级种子培养基的成分为麦芽汁10～20g/L，酵母浸膏10～20g/L，胰蛋白胨10～20g/L，葡萄糖10～20g/L，硫酸铜1～3gg/L，硫酸锌1～3g/L，121℃灭菌20min；黑曲霉菌一级种子培养基的成分为葡萄糖30～50g/L、酵母浸膏10～20g/L、硫酸铵2～3g/L、磷酸二氢钾2～3g/L、硫酸镁0.5～1g/L、氯化锰0.2～0.5g/L，121℃灭菌20min。
进一步地，步骤S3中固体发酵培养基的成分为：玉米20～30％、豆粕8～12％、麸皮5～10％，刺梨0.6～1％、葡萄糖0.2～0.5％、硫酸铜0.2～0.5％、硫酸锌0.2～0.5％、水50～60％；营养液的成分为：糖蜜20～40g/L、尿素5～10g/L余量为水。
进一步地，步骤S3通过流加营养液的方式控制菌体生长速度，防止发酵培养后期菌体生长后劲不足控制，同时调整pH为5.5～6.5，诱导酶的生成，营养液的成分为：糖蜜20～40g/L、氨水5～10g/L余量为水。
进一步地，步骤S4中喷雾干燥将步骤S3所获得的液体经过喷嘴雾化呈微细的雾状水滴，与热介质直接接触，热介质的温度设置在100℃～150℃。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本富含SOD的饲用复合酶制剂的固态发酵制备方法，海洋红酵母从海洋泥中分离处来的单细胞真核生物，可以提高饲养的效果并增强动物体的免疫功能，减少抗生素的用量，是优良的添加剂，黑曲霉菌用作发酵菌种，主要是利用此黑曲霉分泌产生糖化酶、柠檬酸、葡萄糖酸、五倍子酸等的功能，一级培养基和二级培养基中酵母利用葡萄糖作为碳源，可以迅速的测取数据和增加准确性，方便大规模的生产和使用，胰蛋白胨作为氮源，相较于硫酸铵营养更加全面，提高菌数。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚；完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
一种富含SOD的饲用复合酶制剂的固态发酵制备方法，包括以下步骤；
步骤一：取海洋红酵母、黑曲霉菌种按1～5％的接种量接种于一级种子培养基中单菌培养，温度设置在28～32℃，搅拌转速为50～120r/min或通入无菌空气控制溶氧在50～65％以及处于pH6.0，培养24～36h培养即得一级种子液，海洋红酵母一级种子培养基的成分为麦芽汁10～20g/L，酵母浸膏10～20g/L，胰蛋白胨10～20g/L，葡萄糖10～20g/L，硫酸铜1～3gg/L，硫酸锌1～3g/L，121℃灭菌20min；黑曲霉菌一级种子培养基的成分为葡萄糖30～50g/L、酵母浸膏10～20g/L、硫酸铵2～3g/L、磷酸二氢钾2～3g/L、硫酸镁0.5～1g/L、氯化锰0.2～0.5g/L，121℃灭菌20min；
步骤二：将一级种子液按5～10％的接种量分别接种于二级种子培养基中，温度设置在在28～32℃，搅拌转速为50～120r/min或通入无菌空气控制溶氧在50～65％，培养即得二级种子液，二级种子培养基中与一级种子培养基的成分一致；
步骤三：将二级种子液按10～15％的接种量接种于固体发酵培养基中，固体发酵培养基的成分为：玉米20～30％、豆粕8～12％、麸皮5～10％，刺梨0.6～1％、葡萄糖0.2～0.5％、硫酸铜0.2～0.5％、硫酸锌0.2～0.5％、水50～60％；营养液的成分为：糖蜜20～40g/L、尿素5～10g/L余量为水，在28～35℃培养72～96h，通入无菌空气控制溶氧在50～65％，得到混合培养基，在发酵48～96h按每升混合培养基流加营养液2～6ml/h，通过流加营养液的方式控制菌体生长速度，防止发酵培养后期菌体生长后劲不足控制，同时调整pH为5.5～6.5，诱导酶的生成，营养液的成分为：糖蜜20～40g/L、氨水5～10g/L余量为水，同时控制pH为5.7～6.5，培养80～96h后即得酶活达到800U/g以上的SOD复合酶；
步骤四：将SOD复合酶固体培养基进行喷雾干燥，即可得到酶活达到1500U/g以上的固体SOD复合酶，喷雾干燥将步骤S3所获得的液体经过喷嘴雾化呈微细的雾状水滴，与热介质直接接触，热介质的温度设置在100℃～150℃。
本实施方式中防止发酵培养后期菌体生长后劲不足控制，同时快速的调整pH诱导酶的生成，增加了酶的活性，并从天然微生物和植物来源中的海洋红酵母、黑曲霉菌，不仅来源广泛，获取的途径简单，而且对其具有较深的研究在确保安全和存活率上有较好的。
实施例一：
一种富含SOD的饲用复合酶制剂的固态发酵制备方法，包括以下步骤；
步骤一：取海洋红酵母、黑曲霉菌种按2％的接种量接种于一级种子培养基中单菌培养，温度设置在29℃，搅拌转速为90r/min或通入无菌空气控制溶氧在55％以及处于pH6.0，培养30h培养即得一级种子液，海洋红酵母一级种子培养基的成分为麦芽汁15g/L，酵母浸膏15g/L，胰蛋白胨15g/L，葡萄糖15g/L，硫酸铜1g/L，硫酸锌1g/L，121℃灭菌20min；黑曲霉菌一级种子培养基的成分为葡萄糖40g/L、酵母浸膏15g/L、硫酸铵2g/L、磷酸二氢钾2g/L、硫酸镁0.7g/L、氯化锰0.3g/L，121℃灭菌20min；
步骤二：将一级种子液按6％的接种量分别接种于二级种子培养基中，温度设置在在29℃，搅拌转速为90r/min或通入无菌空气控制溶氧在55％，培养即得二级种子液，二级种子培养基中与一级种子培养基的成分一致；
步骤三：将二级种子液按12％的接种量接种于固体发酵培养基中，固体发酵培养基的成分为：玉米25％、豆粕10％、麸皮7％，刺梨0.8％、葡萄糖0.3％、硫酸铜0.3％、硫酸锌0.3％、水54％；营养液的成分为：糖蜜30g/L、尿素7g/L余量为水，在30℃培养88h，通入无菌空气控制溶氧在55％，得到混合培养基，在发酵88h按每升混合培养基流加营养液4ml/h，通过流加营养液的方式控制菌体生长速度，防止发酵培养后期菌体生长后劲不足控制，同时调整pH为5.7，诱导酶的生成，营养液的成分为：糖蜜25g/L、氨水7g/L余量为水，同时控制pH为5.7，培养88h后即得酶活达到800U/g以上的SOD复合酶；
步骤四：将SOD复合酶固体培养基进行喷雾干燥，即可得到酶活达到1500U/g以上的固体SOD复合酶，喷雾干燥将步骤S3所获得的液体经过喷嘴雾化呈微细的雾状水滴，与热介质直接接触，热介质的温度设置在120℃。
在本实施例中，步骤二和三中搅拌转速为90r/min或通入无菌空气控制溶氧在55％以及温度设置在29℃，步骤三中营养液4ml/h，调整pH为5.7，发酵的时间设在88h。
实施例二：
一种富含SOD的饲用复合酶制剂的固态发酵制备方法，包括以下步骤；
步骤一：取海洋红酵母、黑曲霉菌种按2％的接种量接种于一级种子培养基中单菌培养，温度设置在31℃，搅拌转速为100r/min或通入无菌空气控制溶氧在60％以及处于pH6.0，培养30h培养即得一级种子液，海洋红酵母一级种子培养基的成分为麦芽汁15g/L，酵母浸膏15g/L，胰蛋白胨15g/L，葡萄糖15g/L，硫酸铜1g/L，硫酸锌1g/L，121℃灭菌20min；黑曲霉菌一级种子培养基的成分为葡萄糖40g/L、酵母浸膏15g/L、硫酸铵2g/L、磷酸二氢钾2g/L、硫酸镁0.7g/L、氯化锰0.3g/L，121℃灭菌20min；
步骤二：将一级种子液按6％的接种量分别接种于二级种子培养基中，温度设置在在31℃，搅拌转速为100r/min或通入无菌空气控制溶氧在60％，培养即得二级种子液，二级种子培养基中与一级种子培养基的成分一致；
步骤三：将二级种子液按12％的接种量接种于固体发酵培养基中，固体发酵培养基的成分为：玉米25％、豆粕10％、麸皮7％，刺梨0.8％、葡萄糖0.3％、硫酸铜0.3％、硫酸锌0.3％、水54％；营养液的成分为：糖蜜30g/L、尿素7g/L余量为水，在31℃培养88h，通入无菌空气控制溶氧在60％，得到混合培养基，在发酵88h按每升混合培养基流加营养液4ml/h，通过流加营养液的方式控制菌体生长速度，防止发酵培养后期菌体生长后劲不足控制，同时调整pH为5.7，诱导酶的生成，营养液的成分为：糖蜜25g/L、氨水7g/L余量为水，同时控制pH为5.7，培养88h后即得酶活达到800U/g以上的SOD复合酶；
步骤四：将SOD复合酶固体培养基进行喷雾干燥，即可得到酶活达到1500U/g以上的固体SOD复合酶，喷雾干燥将步骤S3所获得的液体经过喷嘴雾化呈微细的雾状水滴，与热介质直接接触，热介质的温度设置在120℃。
在本实施例中，步骤二和三中搅拌转速为100r/min或通入无菌空气控制溶氧在60％以及温度提高至31℃，并将步骤4中的pH提高至6.0。
实施例三：
一种富含SOD的饲用复合酶制剂的固态发酵制备方法，包括以下步骤；
步骤一：取海洋红酵母、黑曲霉菌种按2％的接种量接种于一级种子培养基中单菌培养，温度设置在32℃，搅拌转速为120r/min或通入无菌空气控制溶氧在65％以及处于pH6.0，培养30h培养即得一级种子液，海洋红酵母一级种子培养基的成分为麦芽汁15g/L，酵母浸膏15g/L，胰蛋白胨15g/L，葡萄糖15g/L，硫酸铜1g/L，硫酸锌1g/L，121℃灭菌20min；黑曲霉菌一级种子培养基的成分为葡萄糖40g/L、酵母浸膏15g/L、硫酸铵2g/L、磷酸二氢钾2g/L、硫酸镁0.7g/L、氯化锰0.3g/L，121℃灭菌20min；
步骤二：将一级种子液按6％的接种量分别接种于二级种子培养基中，温度设置在在32℃，搅拌转速为120r/min或通入无菌空气控制溶氧在65％，培养即得二级种子液，二级种子培养基中与一级种子培养基的成分一致；
步骤三：将二级种子液按12％的接种量接种于固体发酵培养基中，固体发酵培养基的成分为：玉米25％、豆粕10％、麸皮7％，刺梨0.8％、葡萄糖0.3％、硫酸铜0.3％、硫酸锌0.3％、水54％；营养液的成分为：糖蜜30g/L、尿素7g/L余量为水，在32℃培养88h，通入无菌空气控制溶氧在65％，得到混合培养基，在发酵88h按每升混合培养基流加营养液4ml/h，通过流加营养液的方式控制菌体生长速度，防止发酵培养后期菌体生长后劲不足控制，同时调整pH为5.7，诱导酶的生成，营养液的成分为：糖蜜25g/L、氨水7g/L余量为水，同时控制pH为6.0，培养88h后即得酶活达到800U/g以上的SOD复合酶；
步骤四：将SOD复合酶固体培养基进行喷雾干燥，即可得到酶活达到1500U/g以上的固体SOD复合酶，喷雾干燥将步骤S3所获得的液体经过喷嘴雾化呈微细的雾状水滴，与热介质直接接触，热介质的温度设置在120℃。
在本实施例中，步骤二和三中搅拌转速为120r/min或通入无菌空气控制溶氧在65％以及温度提高至32℃，并将步骤3中的pH提高至6.5。
综上所述，本富含SOD的饲用复合酶制剂的固态发酵制备方法，海洋红酵母从海洋泥中分离处来的单细胞真核生物，可以提高饲养的效果并增强动物体的免疫功能，减少抗生素的用量，是优良的添加剂，黑曲霉菌用作发酵菌种，主要是利用此黑曲霉分泌产生糖化酶、柠檬酸、葡萄糖酸、五倍子酸等的功能，一级培养基和二级培养基中酵母利用葡萄糖作为碳源，可以迅速的测取数据和增加准确性，方便大规模的生产和使用，胰蛋白胨作为氮源，相较于硫酸铵营养更加全面，提高菌数。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (2)

1.一种富含SOD的饲用复合酶制剂的固态发酵制备方法，其特征在于，包括以下步骤；
S1：取海洋红酵母、黑曲霉菌种按1～5％的接种量分别接种于一级种子培养基中单菌培养，温度设置在28～32℃，搅拌转速为50～120r/min或通入无菌空气控制溶氧在50～65％，pH6.0条件下培养24～36h即得一级种子液；
S2：将一级种子液按5～10％的接种量分别接种于二级种子培养基中，温度设置在28～32℃，搅拌转速为50～120r/min或通入无菌空气控制溶氧在50～65％，培养即得二级种子液；
S3：将二级种子液按10～15％的接种量接种于固体发酵培养基中，在28～35℃培养72～96h，通入无菌空气控制溶氧在50～65％，得到混合培养基，再发酵48～96h，按每升混合培养基流加营养液2～6ml/h，同时控制pH为5.7～6.5，培养80～96h后即得酶活达到800U/g以上的SOD复合酶；
S4：将SOD复合酶进行喷雾干燥，即可得到酶活达到1500U/g以上的固体SOD复合酶；
步骤S1中海洋红酵母一级种子培养基的成分为麦芽汁10～20g/L，酵母浸膏10～20g/L，胰蛋白胨10～20g/L，葡萄糖10～20g/L，硫酸铜1～3g/L，硫酸锌1～3g/L，121℃灭菌20min；黑曲霉菌一级种子培养基的成分为葡萄糖30～50g/L、酵母浸膏10～20g/L、硫酸铵2～3g/L、磷酸二氢钾2～3g/L、硫酸镁0.5～1g/L、氯化锰0.2～0.5g/L，121℃灭菌20min；
步骤S3中固体发酵培养基的成分为：玉米20～30%、豆粕8～12%、麸皮5～10%，刺梨0.6～1%、葡萄糖0.2～0.5%、硫酸铜0.2～0.5%、硫酸锌0.2～0.5%、水50～60%；营养液的成分为：糖蜜20～40g/L、尿素5～10g/L，余量为水。
2.根据权利要求1所述的一种富含SOD的饲用复合酶制剂的固态发酵制备方法，其特征在于：步骤S4中为步骤S3所获得的SOD复合酶经过喷嘴雾化呈微细的雾状水滴，与热介质直接接触，热介质的温度设置在100℃~150℃。
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