CN111265657B - 超氧化物歧化酶固体制剂及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提出了超氧化物歧化酶固体制剂及其制备方法，所述超氧化物歧化酶固体制剂含有超氧化物歧化酶，其中，所述超氧化物歧化酶预先经过高压激活处理。预先将经过高压激活处理的超氧化物歧化酶制成固体制剂，可以有效地避免经高压激活处理而改变的超氧化物歧化酶构象恢复，从而避免酶活降低，使其长时间处于高酶活状态，延长保质期，可应用于食品、医药和化妆品领域中，应用前景广泛。

Description

超氧化物歧化酶固体制剂及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物领域。具体地，本发明涉及超氧化物歧化酶固体制剂及其制备方法。
背景技术
超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)是一类广泛存在于各类生物体内的氧化还原金属酶，能清除体内超氧自由基阴离子，有效地预防超氧自由基阴离子对机体的损害作用，具有抗氧化、延缓衰老作用。
高压加工技术(High Pressure Processing，HPP)、高压技术（Ultra-highPressure，UHP）或高静压技术（High Hydrostatic Pressure，HHP）是指在100～1000 MPa的压力下处理食品，以达到杀菌、钝酶和加工食品目的。通常，高压力条件下会破坏蛋白质三级结构，改变或丧失酶活性中心，从而达到钝酶效果。但在适当压力作用下，会使某些类型酶的构象发生变化，使酶的活性中心暴露，增加其与底物接触，具有激酶作用。
然而，目前高压技术应用于超氧化物歧化酶仍有待研究。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题至少之一。
需要说明的是，本发明是基于发明人的下列发现而完成的：
发明人发现，经高压激活处理的SOD虽然短时间内活性提高，但是，随着保存时间的延长，其构象容易恢复，出现酶活降低现象。
有鉴于此，发明人对经高压激活处理的SOD进行深入研究，发现其存在状态会显著影响酶活，相比于以液体形式存在，SOD以固体形式存在时，可以更好地避免构象恢复，从而避免酶活降低，使其长时间处于高酶活状态，延长保质期。
为此，在本发明的一个方面，本发明提出了一种超氧化物歧化酶固体制剂。根据本发明的实施例，所述超氧化物歧化酶固体制剂含有超氧化物歧化酶，其中，所述超氧化物歧化酶预先经过高压激活处理。由此，预先将经过高压激活处理的超氧化物歧化酶以固体制剂形式存在，可以有效地避免经高压激活处理而改变的超氧化物歧化酶构象恢复，从而避免酶活降低，使其长时间处于高酶活状态，延长保质期。由此，根据本发明实施例的超氧化物歧化酶固体制剂中超氧化物歧化酶活力高，保质期长，可应用于食品、医药和化妆品领域中，应用前景广泛。
根据本发明的实施例，上述超氧化物歧化酶固体制剂还可以具有下列附加技术特征：
根据本发明的实施例，所述超氧化物歧化酶来源于可食用植物或微生物，所述可食用植物选自猕猴桃、木瓜、柠檬、桑葚、沙棘、蓝莓或刺梨，优选刺梨和沙棘；所述微生物选自大肠杆菌或酵母菌。
根据本发明的实施例，所述超氧化物歧化酶固体制剂进一步含有益生元和益生菌的至少之一。
根据本发明的实施例，所述超氧化物歧化酶具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列或者与SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列具有至少80%同源性的同源氨基酸序列，所述同源氨基酸序列中第15位为T、第67位为G、第87位为I、第143位为V。
根据本发明的实施例，编码所述超氧化物歧化酶的核苷酸序列为SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列或者与SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列具有至少80%同源性的同源核酸序列，所述同源核酸序列中第43位至第45位为ACG，第199位至第201位为GGC，第259位至第261位为ATT，第427位至第429位为GTA。
根据本发明的实施例，所述微生物为基因工程菌，所述基因工程菌中含有连接有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列或者所述同源核酸序列的表达载体。
根据本发明的实施例，所述超氧化物歧化酶的酶活力不低于2×105 U/g。
根据本发明的实施例，超氧化物歧化酶固体制剂在4℃下保存60天后，所述超氧化物歧化酶的活性降低不大于20%。
在本发明的另一方面，本发明提出了一种制备前面所述超氧化物歧化酶固体制剂的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：对原料进行提取处理，以便得到含有超氧化物歧化酶的提取物；对所述提取物进行高压激活处理，以便得到激活产物；将所述激活产物进行干燥处理，以便得到所述超氧化物歧化酶固体制剂。如前所述，根据本发明实施例的方法所得到的超氧化物歧化酶固体制剂中超氧化物歧化酶活高，保质期长。并且，该制备方法操作简便，易于实施，适于规模化生产。
根据本发明的实施例，所述高压激活处理的压力为200～600 MPa，时间为1～20min，温度为6~18℃。
根据本发明的实施例，所述方法进一步包括：将所述超氧化物歧化酶固体制剂置于真空包装容器中，并进行抽真空、充气和热封处理；其中，填充的气体选自CO2和N2的至少之一，气体体积单位为ml；SOD酶重量单位为g，超氧化物歧化酶重量与气体总体积比为1:0.2~1:2。
根据本发明的实施例，获得所述提取物的方法包括：将可食用植物或含有微生物的发酵液进行细胞破碎处理，制成浆液，以便得到所述提取物。
根据本发明的实施例，获得所述提取物的方法进一步包括下列至少之一的步骤：将所述浆液进行过滤及离心处理，收集上清液；对所述上清液进行双道超滤分离处理，收集截留液，以便得到所述提取物。
根据本发明的实施例，所述细胞破碎处理制成浆液的过程中体系温度为0~30℃。
根据本发明的实施例，所述离心处理的转速为1000～4000 rpm，温度为0~10℃，时间为0~30min且不为0min。
根据本发明的实施例，所述双道超滤分离处理中，第一次分离采用管式膜，孔径为60～120 kD；第二道分离采用卷式膜，孔径为8～30 kD。
根据本发明的实施例，所述微生物为基因工程菌，所述基因工程菌中含有连接有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列或者所述同源核酸序列的表达载体。
根据本发明的实施例，所述干燥处理包括冷冻干燥处理和/或喷雾干燥处理。
根据本发明的实施例，进行所述干燥处理之前，预先将激活产物与助干剂混合，所述助干剂为β-环糊精、麦芽糊精和/或可溶性淀粉，所述助干剂的添加量为0~50质量%。
根据本发明的实施例，所述冷冻干燥处理的冷阱温度为-45 ℃～-80 ℃，真空度为15～30 Pa，干燥时间为12～48 h。
根据本发明的实施例，所述喷雾干燥处理的进风口温度为140～180 ℃，出风口温度为55～70 ℃，进料流量为3～12 mL/min。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1显示了根据本发明一个实施例的制备超氧化物歧化酶固体制剂方法的流程示意图；
图2显示了根据本发明一个实施例的超氧化物歧化酶固体制剂的热稳定性分析示意图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
本发明提出了超氧化物歧化酶固体制剂及其制备方法，下面将分别对其进行详细描述。
超氧化物歧化酶固体制剂
在本发明的一个方面，本发明提出了一种超氧化物歧化酶固体制剂。根据本发明的实施例，该超氧化物歧化酶固体制剂含有超氧化物歧化酶，其中，超氧化物歧化酶预先经过高压激活处理。如前所述，预先将经过高压激活处理的超氧化物歧化酶以固体制剂形态存在，可以有效地避免经高压激活处理而改变的构象恢复，从而减少酶活降低，使其长时间处于高酶活状态，延长保质期。由此，根据本发明实施例的超氧化物歧化酶固体制剂中超氧化物歧化酶活高，保质期长，可应用于食品、医药和化妆品领域中，应用前景广泛。
需要说明的是，本发明对于固体制剂的形态不做严格限定，例如可以为块状或粉状等，具体可以根据实际情况灵活选择，优选粉剂。由此，方便携带和食用，利于吸收。
根据本发明的实施例，超氧化物歧化酶来源于可食用植物或微生物。相比于动物来源的超氧化物歧化酶，可食用植物或微生物来源的超氧化物歧化酶容易获得。
根据本发明的实施例，可食用植物可以选自猕猴桃、木瓜、柠檬、桑葚、沙棘、蓝莓或刺梨。上述可食用植物的超氧化物歧化酶本身的酶活高，热稳定性好。并且，发明人发现，并非所有来源的SOD酶经高压处理后均可以提高酶活性，例如月季，上述可食用植物经高压激活后可以提高酶活性，其中，刺梨和沙棘的效果较佳，刺梨更优，刺梨本身酶活较高，且经高压处理后酶活显著提升，热稳定性强，90℃以下仍可以保持较高的活性，进而对于环境温度要求不高，便于应用和保存。
根据本发明的实施例，微生物选自大肠杆菌或酵母菌。该微生物可以表达超氧化物歧化酶，既可以是野生型微生物，例如野生型大肠杆菌或酵母菌，也可以是基因工程菌，例如携带有超氧化物歧化酶编码基因的表达载体的大肠杆菌或酵母菌，由此可以实现超氧化物歧化酶高表达。
根据本发明的实施例，超氧化物歧化酶固体制剂进一步含有益生元和益生菌的至少之一。由此，以便进一步提高超氧化物歧化酶的益生效果，提升营养价值。本发明对于益生元和益生菌的类型不做严格限定，可以根据实际需要选择本领域所公知的益生元和益生菌，例如益生元选自膳食纤维、菊粉、微藻、低聚糖、一些天然植物提取物（如果蔬、中草药、野生植物等）、蛋白水解物等，益生菌选自双歧杆菌、副干酪乳杆菌、嗜热链球菌和嗜酸乳杆菌等。
根据本发明的实施例，超氧化物歧化酶具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列或者与SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列具有至少80%同源性的同源氨基酸序列，同源氨基酸序列中第15位为T、第67位为G、第87位为I、第143位为V。SEQ ID NO：1所示氨基酸序列为刺梨中的超氧化物歧化酶序列，该酶本身具有较高的酶活性和热稳定性，并且经超高压激活处理后可显著提高酶活性。进一步地，发明人发现，该酶及与其具有至少80%同源性（例如至少85%、至少90%、至少95%、至少99%）的酶的活性和热稳定性接近，且经高压激活处理后的酶活也接近。并且，发明人推断SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的第15位、第67位、第87位和第143位可能是影响酶活性、热稳定性及经高压激活后酶活能否提高的功能位点。
MAKGVAVLCSSEGVTGTILFTQEGDGPTTVTGNVSGLKPGLHGFHVHALGDTTNGCMSTGPHFNPAGKEHGAPEDENRHAGDLGNIIVGDDGTATFTIVDKQIPLTGPHSIIGRAVVVHGDPDDLGKGGHELSKSTGNAGGRVACGIIGLQG（SEQ ID NO：1）
根据本发明的实施例，编码超氧化物歧化酶的核苷酸序列为SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列或者与SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列具有至少80%同源性的同源核酸序列，所述同源核酸序列中第43位至第45位为ACG，第199位至第201位为GGC，第259位至第261位为ATT，第427位至第429位为GTA。由此，该超氧化物歧化酶具有高酶活性及热稳定性，且经高压激活处理后酶活显著提高。
ATGGCAAAGGGTGTTGCTGTACTTTGCTCCAGTGAGGGTGTTACGGGAACTATCCTCTTCACCCAAGAGGGAGATGGCCCAACTACTGTGACTGGAAACGTTTCTGGCCTCAAGCCTGGGCTTCATGGTTTCCATGTTCATGCTCTTGGTGACACAACAAACGGTTGCATGTCAACTGGACCACACTTCAATCCTGCTGGCAAAGAGCATGGTGCTCCTGAAGATGAGAATCGTCATGCTGGTGATCTTGGAAATATCATTGTTGGGGATGATGGAACTGCTACCTTCACAATTGTTGACAAGCAGATTCCTCTCACTGGACCACATTCTATCATTGGTAGGGCGGTTGTTGTCCATGGAGACCCTGATGACCTTGGCAAGGGTGGACATGAGCTTAGCAAATCCACTGGAAATGCTGGAGGCAGGGTAGCTTGTGGTATTATTGGTCTCCAAGGATGA（SEQ ID NO：2）
根据本发明的实施例，微生物为基因工程菌，基因工程菌中含有连接有SEQ IDNO：2所示的核苷酸序列或者同源核酸序列的表达载体。由此，采用该基因工程菌表达的超氧化物歧化酶具有较好的酶活性和热稳定性，对于环境温度要求不高，便于应用和保存。具体地，该基因工程菌可以为大肠杆菌或酵母菌，表达载体可以为质粒。
根据本发明的实施例，超氧化物歧化酶的酶活力不低于2×105 U/g。由此，该超氧化物歧化酶具有较高的活性。
根据本发明的实施例，超氧化物歧化酶固体制剂在4℃下保存60天后，超氧化物歧化酶的活性降低不大于20%（例如不大于15%、不大于10%或不大于6%）。由此，通过将经高压激活处理的超氧化物歧化酶制成固体制剂，以避免经高压激活处理而改变的构象恢复，从而减少酶活降低，使其长时间处于高酶活状态，保质期长。
制备超氧化物歧化酶固体制剂的方法
在本发明的另一方面，本发明提出了一种制备前面所述超氧化物歧化酶固体制剂的方法。根据本发明的实施例，参见图1，该制备方法包括：
S100 提取处理
在该步骤中，对原料进行提取处理，以便得到含有超氧化物歧化酶的提取物。由此，以便于从原料中提取出超氧化物歧化酶。
根据本发明的实施例，获得提取物的方法包括：将可食用植物或含有微生物的发酵液进行细胞破碎处理，制成浆液，以便得到提取物。由此，以便于释放超氧化物歧化酶。
根据本发明的实施例，微生物为基因工程菌，基因工程菌中含有连接有SEQ IDNO：2所示的核苷酸序列或者同源核酸序列的表达载体。由此，采用该基因工程菌可以表达刺梨中的超氧化物歧化酶，该超氧化物歧化酶具有较好的热稳定性，对于环境温度要求不高，便于应用和保存。
根据本发明的实施例，细胞破碎处理制成浆液的过程中体系温度为0~30℃。由此，可以维持超氧化物歧化酶活性，避免酶活降低，其中，4~10℃效果更佳，可以更好地避免超氧化物歧化酶酶活降低。
根据本发明的实施例，获得提取物的方法进一步包括下列至少之一的步骤：将浆液进行过滤及离心处理，收集上清液；对上清液进行双道超滤分离处理，收集截留液，以便得到提取物。通过过滤及离心处理，以便出去纤维等物质。然后进行双道超滤分离，以便于浓缩分离获得纯度较高的超氧化物歧化酶。
根据本发明的实施例，离心处理的转速为1000～4000 rpm，温度为0~10℃，时间为0~30min且不为0min。由此，既可以除去杂质，也可以避免超氧化物歧化酶沉淀。
根据本发明的实施例，双道超滤分离处理中，第一次分离采用管式膜，孔径为60～120 kD；第二道分离采用卷式膜，孔径为8～30 kD。由此，以便获得高得率和纯度的超氧化物歧化酶。
S200 高压激活处理
在该步骤中，对提取物进行高压激活处理，以便得到激活产物。
根据本发明的实施例，高压激活处理的压力为200～600 MPa，时间为1～20 min，温度为6~18℃。发明人经过大量实验得到上述较优高压激活处理条件，由此，获得的超氧化物歧化酶活性较高。
S300 干燥处理
在该步骤中，将激活产物进行干燥处理，以便得到超氧化物歧化酶固体制剂。由此，以便于得到超氧化物歧化酶固体制剂。
根据本发明的实施例，干燥处理包括冷冻干燥处理和/或喷雾干燥处理。由此，在干燥过程中可以避免影响超氧化物歧化酶活性。在一些实施例中，可以将干燥处理所得到的粉剂压片制成块状或片状的制剂，具体工艺可以根据实际情况灵活选择，本发明不做严格限定。
根据本发明的实施例，进行干燥处理之前，预先将激活产物与助干剂混合，助干剂为β-环糊精、麦芽糊精和/或可溶性淀粉，助干剂的添加量为0~50质量%（基于激活产物的质量）。由此，可以有效提高固体制剂的干燥性，防止吸潮。
根据本发明的实施例，冷冻干燥处理的冷阱温度为-45 ℃～-80 ℃，真空度为15～30 Pa，干燥时间为12～48 h。由此，以便于加快激活产物干燥，且避免超氧化物歧化酶活性降低。
根据本发明的实施例，喷雾干燥处理的进风口温度为140～180 ℃，出风口温度为55～70 ℃，进料流量为3～12 mL/min。由此，以便于加快激活产物干燥，且避免超氧化物歧化酶活性降低。
根据本发明的实施例，该方法进一步包括：将超氧化物歧化酶固体制剂置于真空包装容器中，并进行抽真空、充气和热封处理；其中，填充的气体选自CO2和N2的至少之一，气体体积单位为ml；SOD酶重量单位为g，超氧化物歧化酶重量与气体总体积比为1:0.2~1:2。由此，以便于对超氧化物歧化酶固体制剂进行密封保存，延长保质期，可于0-10℃条件下长期保存。
本领域技术人员能够理解的是，前面针对超氧化物歧化酶固体制剂所描述的特征和优点，同样适用于该制备超氧化物歧化酶固体制剂的方法，在此不再赘述。
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1
在该实施例中，按照下列方法制备SOD固体粉剂：
(1)选用新鲜无腐烂变质的刺梨的果实原料；
(2)清洗干净；
(3)将刺梨果实与冰水混合，进行细胞破碎，于4~10℃制成浆液；
(4)用60目滤网过滤，将果皮、果肉渣、籽与汁液分离，得到汁液；
(5)对汁液进行离心处理，其中离心转速为3000 rpm，时间为10 min，收集上清液；
(6)将上清液进行双道超滤分离处理，其中第一次分离采用管式膜，孔径为100kD，第二道分离采用卷式膜，孔径为10 kD，收集截留液；
(7)将截留液进行高压激酶处理，其中压力为550 MPa，时间为5 min，温度为16.5℃，得到激活产物；
(8)向激活产物中加入10质量%（激活产物质量）的β-环糊精；
(9)冷冻干燥处理，其中，冷阱温度为：-67 ℃，真空度为26 Pa，干燥时间为48h，得到SOD固体粉剂；
(10)将SOD固体粉剂置于真空包装容器中，抽真空，充气（CO2：N2=1：1，总体积与SOD固体粉剂质量比为1：1），最后热封。
实施例2
在该实施例中，按照下列方法制备SOD固体粉剂：
(1)选用新鲜无腐烂变质的刺梨的果实原料；
(2)清洗干净；
(3)将刺梨果实与冰水混合，进行细胞破碎，于4~10℃制成浆液；
(4)用60目滤网过滤，将果皮、果肉渣、籽与汁液分离，得到汁液；
(5)对汁液进行离心处理，其中离心转速为2000 rpm，时间为15 min，收集上清液；
(6)将上清液进行双道超滤分离处理，其中第一次分离采用管式膜，孔径为80 kD，第二道分离采用卷式膜，孔径为20 kD，收集截留液；
(7)将截留液进行高压激酶处理，其中压力为450 MPa，时间为4 min，温度为25℃，得到激活产物；
(8)向激活产物中加入2.5质量%（激活产物质量）的β-环糊精；
(9)喷雾干燥处理，其中，进风口温度为160 ℃，出风口温度为60 ℃，进料流量为5mL/min，得到SOD固体粉剂；
(10)将SOD固体粉剂置于真空包装容器中，抽真空，充气（CO2：N2=1：1，总体积与SOD固体粉剂质量比1：1），最后热封。
对比例1
按照实施例1的方法制备超氧化物歧化酶固体制剂，区别在于，不含步骤（7），直接将步骤（6）所得上清液进行步骤（8）。
实施例3
（1）将刺梨的SOD基因序列（SEQ ID NO：2）插入到pET-30a并导入到E.coli BL21(DE3)中，挑选BL21(DE3)（Pet30a-sod）接种于20mL 50 μg/ML LB培养基中，37℃ 220rpm振荡培养12h。
（2）取上述细胞10mL接种于1L 50 μg/ML LB培养基中，37℃ 220rpm振荡培养。
（3）当OD600=0.9时，加入IPTG至终浓度为1mM，37℃ 120rpm继续振荡培养5h。
（4）转移菌液至200mL离心瓶中，4℃ 7000g离心5min，富集菌体后用20mL细胞裂解缓冲液进行菌体重悬，对细胞全蛋白进行SDS-PAGE分析，得到SOD。
（5）SOD进行高压激酶处理，其中压力为550 MPa，时间为5 min，温度为16.5℃，得到激活产物。
（6）将激活产物中加入10质量%（激活产物质量）的β-环糊精，再进行冷冻干燥处理，其中，冷阱温度为：-67 ℃，真空度为26 Pa，干燥时间为48h，得到SOD固体粉剂。
稳定性分析
1、实施例1、2和对比例1所得固体粉剂以及实施例1的步骤（7）所得激活产物于4℃保存60天，采用南京建成SOD酶活检测试剂盒测定保存前后酶活性，结果如表1所示。
可以看出，实施例1与对比例1相比，经高压激活处理之后再进行干燥处理，酶活性显著提高了147.9%。相比于SOD酶（激活后）保存于液体中，SOD酶以固体粉剂的形式存在（实施例1和实施例2）容易维持其较高的活性。由此，可以推断出经高压激活处理的SOD酶在液体状态容易恢复其构象，导致酶活有所降低。对比例1中，虽然SOD酶的保留率高，但是SOD酶本身的酶活低，而且，由于压力传递需要依靠于液体，若将对比例1所得固体粉剂再进行高压处理，是无法有效地提高酶活性。
表1 稳定性分析
样品 SOD活性 U/g （初始） SOD活性 U/g （保存后） SOD酶活 保留率
实施例1 245567.84 215469.22 87.74%
实施例2 322847.13 304124.33 94.20%
对比例1（未激活） 99055.84 97817.10 98.750%
激活产物（液体） 27748.44 18091.98 65.2%
2、将实施例3所得SOD固体粉剂分别在固定温度（50、60、70、80和90ºC）下孵育10、20、30、40、50和60分钟。孵育结束后，立即将样品转移到冰水中，在2小时内测定酶活性。
结果如图2所示，可以看出，在50~80℃的范围内，SOD均可以长时间保持较高的酶活。当达到90℃时，短时间处理（0~20min）对SOD的酶活影响不大，长时间处理（20min以上）会导致酶活降低。由此，表明本发明的SOD固体粉剂具有较高的热稳定性。
酶活性分析
1、按照下列方式获得刺梨SOD酶、沙棘SOD酶和月季SOD酶
准确称取0.2 g月季、沙棘或者刺梨，加入1.8 mL的PBS，将样品破碎，然后冰浴上使用碾钵碾磨制备10%样品匀浆。再用PBS稀释5倍（加入8 mL PBS，清洗碾钵，收集清洗液）。稀释液进行4 ℃ 10000 g离心10 min。离心后取上清液，即为月季SOD酶粗提液、沙棘SOD酶粗提液和刺梨SOD酶粗提液。
2、分别将月季SOD酶粗提液、沙棘SOD酶粗提液和刺梨SOD酶粗提液进行高压激酶处理，其中压力为550 MPa，时间为5 min，温度为16.5℃。
3、采用南京建成SOD酶活检测试剂盒对刺梨SOD酶粗提液、高压激活刺梨SOD酶粗提液、月季SOD酶粗提液、高压激活月季SOD酶粗提液、沙棘SOD酶粗提液、高压激活沙棘SOD酶粗提液的酶活性进行检测。
结果如表2所示，可以看出，刺梨SOD酶活性比月季SOD酶活性高，且经高压处理后，刺梨SOD酶的酶活性显著提高，而月季SOD酶活性未有明显变化。由此，表明并非所有来源的SOD酶经高压处理后均可以提高酶活性。虽然沙棘SOD酶的酶活性低于刺梨SOD酶，但是，其经过高压处理后，酶活有所提高，优于月季SOD酶。
表2 酶活性
高压前酶活性（U/g） 高压后酶活性（U/g）
刺梨SOD酶（平行样1） 3625.9 4713.67
刺梨SOD酶（平行样2） 3894.5 4868.13
沙棘SOD酶（平行样1） 1423.74 1667.66
沙棘SOD酶（平行样2） 1649.23 1929.33
月季SOD酶（平行样1） 993.14 983.12
月季SOD酶（平行样2） 1076.92 1036.58
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、 “示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
序列表
<110> 中国农业大学
<120> 超氧化物歧化酶固体制剂及其制备方法
<130> PIDC3202790
<150> 2020101214910
<151> 2020-02-26
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 152
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Ala Lys Gly Val Ala Val Leu Cys Ser Ser Glu Gly Val Thr Gly
1 5 10 15
Thr Ile Leu Phe Thr Gln Glu Gly Asp Gly Pro Thr Thr Val Thr Gly
20 25 30
Asn Val Ser Gly Leu Lys Pro Gly Leu His Gly Phe His Val His Ala
35 40 45
Leu Gly Asp Thr Thr Asn Gly Cys Met Ser Thr Gly Pro His Phe Asn
50 55 60
Pro Ala Gly Lys Glu His Gly Ala Pro Glu Asp Glu Asn Arg His Ala
65 70 75 80
Gly Asp Leu Gly Asn Ile Ile Val Gly Asp Asp Gly Thr Ala Thr Phe
85 90 95
Thr Ile Val Asp Lys Gln Ile Pro Leu Thr Gly Pro His Ser Ile Ile
100 105 110
Gly Arg Ala Val Val Val His Gly Asp Pro Asp Asp Leu Gly Lys Gly
115 120 125
Gly His Glu Leu Ser Lys Ser Thr Gly Asn Ala Gly Gly Arg Val Ala
130 135 140
Cys Gly Ile Ile Gly Leu Gln Gly
145 150
<210> 2
<211> 459
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atggcaaagg gtgttgctgt actttgctcc agtgagggtg ttacgggaac tatcctcttc 60
acccaagagg gagatggccc aactactgtg actggaaacg tttctggcct caagcctggg 120
cttcatggtt tccatgttca tgctcttggt gacacaacaa acggttgcat gtcaactgga 180
ccacacttca atcctgctgg caaagagcat ggtgctcctg aagatgagaa tcgtcatgct 240
ggtgatcttg gaaatatcat tgttggggat gatggaactg ctaccttcac aattgttgac 300
aagcagattc ctctcactgg accacattct atcattggta gggcggttgt tgtccatgga 360
gaccctgatg accttggcaa gggtggacat gagcttagca aatccactgg aaatgctgga 420
ggcagggtag cttgtggtat tattggtctc caaggatga 459

Claims (2)

1.一种超氧化物歧化酶固体制剂，其特征在于，含有来源于刺梨的超氧化物歧化酶，
所述来源于刺梨的超氧化物歧化酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；
编码所述来源于刺梨的超氧化物歧化酶的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；
制备所述超氧化物歧化酶固体制剂的方法包括：
将含连接有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列的表达载体的基因工程菌进行表达，得到含有超氧化物歧化酶的菌液；
将所述菌液进行离心，富集菌液后进行菌体重悬，对细胞全蛋白进行SDS-PAGE分析，得到超氧化物歧化酶；
将所述超氧化物歧化酶进行高压激酶处理，其中压力为550 MPa，时间为5 min，温度为16.5℃，得到激活产物；
将所述激活产物加入质量比10%的β-环糊精，再进行冷冻干燥处理，其中，冷阱温度为：-67 ℃，真空度为26 Pa，干燥时间为48h，得到超氧化物歧化酶固体制剂。
2.根据权利要求1所述超氧化物歧化酶固体制剂，其特征在于，所述超氧化物歧化酶固体制剂进一步含有益生元和益生菌的至少之一。
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