CN113456808A - 含有超氧化物歧化酶和维生素c的组合物、食品或药品 - Google Patents
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Abstract
本发明提出了组合物、含有其的食品或药品及制备方法，所述组合物的原料包括：超氧化物歧化酶和维生素C；制备所述组合物的方法包括：将超氧化物歧化酶和维生素C进行混合，得到混合物；将所述混合物进行高压处理，得到所述组合物。本发明的组合物中超氧化物歧化酶的活性高，稳定性强，有助于SOD在加工和贮藏过程中维持较高活性，更好地发挥作用，应用前景广泛。
Description
技术领域
本发明涉及食品医药领域，具体地，本发明自涉及含有超氧化物歧化酶和维生素C的组合物、食品或药品。
背景技术
ROS是机体代谢过程中产生的对细胞有毒害作用的一种物质，超氧化物歧化酶（SOD）可以有效的降低体内ROS的水平，从而保护细胞免受ROS的损害。
由于酶对外界环境比较敏感，因此SOD在食品加工和贮藏过程中极其容易失活，如何克服SOD在食品加工和贮藏过程中不稳定是食品工业中亟需解决的问题。
发明内容
本发明提出了一种含有超氧化物歧化酶和维生素C的组合物、食品或药品和制备组合物的方法，该组合物中超氧化物歧化酶的活性高，稳定性强，有助于SOD在加工和贮藏过程中维持较高活性，更好地发挥作用，应用前景广泛。
在本发明的一个方面，本发明提出了一种组合物。根据本发明的实施例，原料包括：超氧化物歧化酶和维生素C；制备所述组合物的方法包括：将超氧化物歧化酶和维生素C进行混合，得到混合物；将所述混合物进行高压处理，得到所述组合物。
研究发现，一些小分子化合物（如Vc、阿魏酸等）和高压处理分别作用于SOD，均可以起到提高SOD酶活的作用。但是，发明人发现，其中某些小分子化合物与SOD共同经高压处理后，会存在SOD酶活降低的现象。有鉴于此，发明人经过大量实验筛选发现，SOD与Vc经高压处理后，可以显著提高酶活，经高温热处理后酶活降幅小，稳定性高。由此，可以SOD在加工和贮藏过程中维持较高活性，有助于更好地发挥作用。
根据本发明的实施例，上述组合物还可以具有下列附加技术特征：
根据本发明的实施例，所述超氧化物歧化酶与所述维生素C的摩尔浓度为1:（5~10）。发明人经过大量实验得到上述较优配比，由此，经高压处理后可以有效地提高SOD酶活，且SOD稳定性强。
根据本发明的实施例，所述高压处理是在300~500MPa的压力、20~40℃的温度下进行10~20分钟。由此，可以有效地提高SOD酶活，且SOD稳定性强。
根据本发明的实施例，所述超氧化物歧化酶是通过下列方式获得的：将CuZnSOD基因进行扩增，得到扩增产物；将所述扩增产物插入到载体上，构建重组载体；将所述重组载体转化到酵母中，得到重组菌株；将所述重组菌株进行发酵培养，收集发酵液，从中提取出超氧化物歧化酶。相比于原核微生物，真核微生物酵母可以高效表达SOD基因，获得的SOD产量高，且酶活性好。
根据本发明的实施例，所述CuZnSOD基因来源于刺梨。刺梨的SOD酶本身具有较好的酶活性，并且经高压处理可以显著提高酶活性。
根据本发明的实施例，所述酵母为毕赤酵母。SOD基因可在毕赤酵母中高效表达，SOD产量高，酶活性好。
根据本发明的实施例，所述CuZnSOD基因具有如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列或者与其具有至少80%同源性的核苷酸序列。
ATGGCAAAGGGTGTTGCTGTACTTTGCTCCAGTGAGGGTGTTACGGGAACTATCCTCTTCACCCAAGAGGGAGATGGCCCAACTACTGTGACTGGAAACGTTTCTGGCCTCAAGCCTGGGCTTCATGGTTTCCATGTTCATGCTCTTGGTGACACAACAAACGGTTGCATGTCAACTGGACCACACTTCAATCCTGCTGGCAAAGAGCATGGTGCTCCTGAAGATGAGAATCGTCATGCTGGTGATCTTGGAAATATCATTGTTGGGGATGATGGAACTGCTACCTTCACAATTGTTGACAAGCAGATTCCTCTCACTGGACCACATTCTATCATTGGTAGGGCGGTTGTTGTCCATGGAGACCCTGATGACCTTGGCAAGGGTGGACATGAGCTTAGCAAATCCACTGGAAATGCTGGAGGCAGGGTAGCTTGTGGTATTATTGGTCTCCAAGGATGA（SEQ ID NO：1）
根据本发明的实施例，进行所述扩增之前，为了能够成功在毕赤酵母中表达，根据酵母密码子偏好性，将所述CuZnSOD基因进行密码子优化。
根据本发明的实施例，所述密码子优化后的基因序列具有如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列或者与其具有至少80%同源性的核苷酸序列。
ATGGCAAAGGGTGTGGCCGTCCTGTGTTCCTCAGAGGGAGTCACCGGTACTATCTTATTTACCCAGGAAGGTGACGGACCTACAACAGTGACGGGAAATGTATCAGGACTGAAACCTGGACTACACGGTTTTCACGTTCATGCTCTGGGAGATACAACTAATGGCTGTATGAGTACCGGTCCCCACTTTAACCCTGCTGGCAAAGAGCACGGAGCCCCAGAGGACGAGAACAGGCATGCCGGTGATCTAGGCAACATTATCGTTGGCGATGACGGCACTGCCACGTTTACAATCGTAGACAAGCAGATCCCCTTGACCGGACCTCATTCCATAATTGGAAGGGCAGTTGTAGTCCACGGTGACCCCGACGATTTGGGAAAAGGAGGCCATGAGCTAAGTAAATCCACAGGCAATGCAGGTGGCAGAGTAGCCTGCGGAATTATTGGCCTGCAAGGTTGA（SEQ ID NO：2）
在本发明的另一方面，本发明提出了一种食品或药品。根据本发明的实施例，所述食品或药品包含：前面所述的组合物。由此，根据本发明实施例的食品或药品中含有高活性和稳定性的SOD。
在本发明的又一方面，本发明提出了一种制备前面所述组合物的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：将超氧化物歧化酶和维生素C进行混合，得到混合物；将所述混合物进行高压处理，得到所述组合物。如前所述，SOD与Vc经高压处理后，可以显著提高酶活，经高温热处理后酶活降幅小，稳定性高，有助于SOD在加工和贮藏过程中维持较高活性，更好地发挥作用。并且，该方法操作简便易行，成本低，适于规模化生产。
根据本发明的实施例，所述高压处理是在300~500MPa的压力、20~40℃的温度下进行10~20分钟。由此，可以有效地提高SOD酶活，且SOD稳定性强。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1显示了根据本发明一个实施例的不同热处理时间下酶活性分析示意图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1
1、构建重组载体
将刺梨CuZnSOD基因的亚克隆对序列（SEQ ID NO：1）进行密码子优化，得到（SEQID NO：2所示的优化后序列。然后通过正向引物和反向引物进行PCR扩增。PCR扩增条件为98℃ 2min，98℃ 10s，57℃ 20s，72℃ 10s 共30个循环，72℃ 5min。产物电泳回收后分别用Eco RⅠ和Not Ⅰ双酶切，并将其插入到pPIC9K载体上，构建重组表达载体。
正向引物：CGGAATTCATGGCAAAGGGTGTGGCCGTC（SEQ ID NO：3），含有Eco RⅠ位点。
反向引物：TCAACCTTGCAGGCCAATAATATAGTTTAGCGGCCGC（SEQ ID NO：4），含有Not Ⅰ位点。
2、刺梨CuZnSOD在毕赤酵母中的表达
通过电击法将经Sca Ⅰ线性化的重组载体转入到毕赤酵母GS115中，涂布最小葡萄糖固体培养基（MD），于30℃培养2-7天。挑选出在基础甲醇培养基（MM）平板上生长缓慢和MD平板上生长良好的菌株进行重新培养，再接种于25mL的含有甘油的缓冲性复杂培养基（BMGY）中，30℃培养12h后再接种到1L BMGY培养基中30℃培养12h。离心菌体，用1L 含有甲醇的缓冲性复杂培养基（BMMY）重悬菌体，于培养瓶中继续培养36h，每12h添加0.5%的甲醇诱导。将最终所得的发酵液中提取出SOD，测得最终产量为5mg/mL。
3、高压处理SOD-Vc混合液
SOD溶液：称取步骤2获得的SOD（分子量为32kDa）溶解于10mL磷酸盐缓冲液中，得到CSOD=1×10-4mol/L的储备溶液。
Vc溶液：称取1.8 mg维生素C溶于10mL的水中，得到Cvc=1×10-3mol/L的储备溶液。
取100μL的SOD溶液，加入到10mL的离心管中，然后向离心管中加入100μL的Vc、溶液混匀，将所得SOD-Vc混合物进行高压处理，处理条件为400MPa，时间为15min，温度为30℃，得到高压调控产物。
对比例1
按照实施例1的方法操作，其中，不进行步骤3的高压处理。
对比例2
按照对比例1的方法操作，其中，不进行步骤3的高压处理，将Vc替换为阿魏酸。
对比例3
按照实施例1的方法操作，其中，步骤1和2如下：
将刺梨CuZnSOD基因（SEQ ID NO：1）构建于pET-30a(+)载体上，转化到E.coli BL21细胞中，挑选阳性克隆接种于LB培养基中37℃培养12h，将种子液以1:100接种到100mLLB培养基中，37℃，220rpm/min恒温培养5h，添加IPTG至终浓度为1mmol/mL，诱导4h后破碎菌体提取SOD。
对比例4
按照实施例1的方法操作，其中，将Vc替换为阿魏酸。
对比例5
按照实施例1的方法操作，其中，将Vc替换为儿茶素。
对比例6
按照对比例1的方法操作，其中，将Vc替换为儿茶素。
实施例2 酶活性和稳定性分析
取100μL的步骤3制得的SOD溶液作为空白对照组，取100μL的实施例1、对比例1~6作为实验组，放入80℃水浴锅中，孵育4个小时，每隔20min检测一次酶活性。
结果如图1所示，在0min时，即未进行热处理，Vc、阿魏酸、儿茶素作用于SOD均会提高SOD酶的活性。在高压处理下，Vc和阿魏酸作用的SOD活性均有所提高，其中，Vc效果更佳，而儿茶素的SOD活性有所降低，由此表明在儿茶素存在下，高压处理会抑制SOD酶活。
在高温处理后，实验组和对照组的SOD酶活均有不同程度的下降，其中，经Vc和高压作用的SOD酶活降幅最小。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、 “示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
序列表
<110> 中国农业大学
<120> 含有超氧化物歧化酶和维生素C的组合物、食品或药品
<130> BI3211563
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 459
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atggcaaagg gtgttgctgt actttgctcc agtgagggtg ttacgggaac tatcctcttc 60
acccaagagg gagatggccc aactactgtg actggaaacg tttctggcct caagcctggg 120
cttcatggtt tccatgttca tgctcttggt gacacaacaa acggttgcat gtcaactgga 180
ccacacttca atcctgctgg caaagagcat ggtgctcctg aagatgagaa tcgtcatgct 240
ggtgatcttg gaaatatcat tgttggggat gatggaactg ctaccttcac aattgttgac 300
aagcagattc ctctcactgg accacattct atcattggta gggcggttgt tgtccatgga 360
gaccctgatg accttggcaa gggtggacat gagcttagca aatccactgg aaatgctgga 420
ggcagggtag cttgtggtat tattggtctc caaggatga 459
<210> 2
<211> 459
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atggcaaagg gtgtggccgt cctgtgttcc tcagagggag tcaccggtac tatcttattt 60
acccaggaag gtgacggacc tacaacagtg acgggaaatg tatcaggact gaaacctgga 120
ctacacggtt ttcacgttca tgctctggga gatacaacta atggctgtat gagtaccggt 180
ccccacttta accctgctgg caaagagcac ggagccccag aggacgagaa caggcatgcc 240
ggtgatctag gcaacattat cgttggcgat gacggcactg ccacgtttac aatcgtagac 300
aagcagatcc ccttgaccgg acctcattcc ataattggaa gggcagttgt agtccacggt 360
gaccccgacg atttgggaaa aggaggccat gagctaagta aatccacagg caatgcaggt 420
ggcagagtag cctgcggaat tattggcctg caaggttga 459
<210> 3
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cggaattcat ggcaaagggt gtggccgtc 29
<210> 4
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tcaaccttgc aggccaataa tatagtttag cggccgc 37
Claims (10)
1.一种组合物，其特征在于，原料包括：超氧化物歧化酶和维生素C；
制备所述组合物的方法包括：
将超氧化物歧化酶和维生素C进行混合，得到混合物；
将所述混合物进行高压处理，得到所述组合物。
2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述超氧化物歧化酶与所述维生素C的摩尔浓度为1:（5~10）；所述高压处理是在300~500MPa的压力、20~40℃的温度下进行10~20分钟。
3.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述超氧化物歧化酶是通过下列方式获得的：
将CuZnSOD基因进行扩增，得到扩增产物；
将所述扩增产物插入到载体上，构建重组载体；
将所述重组载体转化到酵母中，得到重组菌株；
将所述重组菌株进行发酵培养，收集发酵液，从中提取出超氧化物歧化酶。
4.根据权利要求3所述的组合物，其特征在于，所述CuZnSOD基因来源于刺梨，所述酵母为毕赤酵母。
5.根据权利要求3所述的组合物，其特征在于，所述CuZnSOD基因具有如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列或者与其具有至少80%同源性的核苷酸序列。
6.根据权利要求3所述的组合物，其特征在于，进行所述扩增之前，将所述CuZnSOD基因进行密码子优化。
7.根据权利要求6所述的组合物，其特征在于，所述密码子优化后的基因序列具有如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列或者与其具有至少80%同源性的核苷酸序列。
8.一种食品或药品，其特征在于，包含：权利要求1~7任一项所述的组合物。
9.一种制备权利要求1~7任一项所述组合物的方法，其特征在于，包括：
将超氧化物歧化酶和维生素C进行混合，得到混合物；
将所述混合物进行高压处理，得到所述组合物。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述高压处理是在300~500MPa的压力、20~40℃的温度下进行10~20分钟。
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2021
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