CN114958609B - 调控dna复制或修复的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了调控DNA复制或修复的方法,涉及分子生物学技术领域,解决目前不清楚如何调控DNA复制或损伤应答的技术问题,包括Spd1基因敲除或dGTP/dNTP丰度的代谢信号调控DNA复制或修复的方法。本发明利用可以转运外源dNTP的FY2317菌株,制备原生质体,利用半离体的体系证明过量的dNTP,特别是脱氧核糖鸟苷酸(dGTP)可以模拟Spd1缺失菌株的表型,显著提高染色质的松弛程度。发现了一种新的调控染色质松弛程度的遗传机制,可以影响DNA损伤修复的应答机制。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域,更具体的是涉及DNA复制或修复技术领域。
背景技术
脱氧核糖核苷酸是真核生物遗传物质的基本结构单元,其合成机制受到极其严格的调控。核糖核苷酸还原酶(RNR)是催化dNTP合成的关键限速步骤,其酶活性受到亚基组装、亚细胞定位、氧化还原状态和dNTP丰度负反馈等多个层次的调节。受细胞周期、DNA合成和DNA损伤状态的影响,RNR的活性不断变化,dNTP的浓度会在细胞周期中动态增减,并直接影响DNA复制和修复的速率。例如,Somyajit等(Somyajit,K.,et al.,Redox-sensitivealteration of replisome architecture safeguards genome integrity.Science,2017.358(6364):p.797-802.)发现dNTP合成的效率通过氧化还原状态决定DNA复制的速率。
染色质的构象对DNA代谢具有重要的调节功能。紧缩的染色质有利于 DNA完整性的保持,但DNA的复制、修复和转录等生理过程依赖于染色质结构的松弛,因此在不同细胞周期的DNA代谢过程中,染色质结构的松弛和紧缩是一个动态变化的过程,而维持该过程的平衡至关重要。dNTP是DNA合成的原料,缺失dNTP或dA/T/C/GTP四种的失衡可能导致DNA突变。但目前如何调控DNA复制或损伤应答是未知的。
发明内容
本发明的目的在于:为了解决目前不清楚如何调控DNA复制或损伤应答的技术问题,本发明提供调控DNA复制或修复的方法。
本发明为了实现上述目的具体采用以下技术方案:调控DNA复制或修复的方法,所述方法包括Spd1基因敲除或dGTP/dNTP丰度的代谢信号调控DNA 复制或修复的方法;
dGTP/dNTP丰度的代谢信号调控DNA复制或修复的方法包括如下步骤:
步骤1、FY2317菌株于YPDA平板上复苏;
步骤2、挑取FY2317菌株的单克隆菌落并培养至OD600=0.6,获得培养液;步骤3、从培养液中收集106个细胞,离心并用PBS洗涤一次后重悬于CSE缓冲液中,加入100T消解酶至终浓度1mg/mL,孵育(显微镜观察细胞壁的破碎程度,保证90%以上的细胞形成原生质体);
步骤4、孵育后离心并用PBS洗涤细胞一次后重悬于含有dNTP/ dATP/dCTP/dGTP/dTTP的CSE缓冲液中,再次孵育;
步骤5、离心,收集菌体沉淀e,后重悬于不含EDTA的CSE缓冲液中,加入MNase反应,反应后加入过量的EDTA(pH=8.0)终止酶切反应,收集菌体沉淀f并提取DNA,并进行琼脂糖凝胶电泳。
本申请的技术方案中,spd1基因敲除导致dNTP过多可以导致染色质更加松弛,人为地提高外源性dNTP的掺入也可以导致染色质更加松弛,单独地提高dGTP的含量使dNTP库的是失衡能更剧烈地松弛染色质,dGTP是dNTP调控染色质松弛状态的关键组分。因此,dNTP的代谢状态(丰度,平衡和dGTP 的含量)可以影响染色质的松弛程度,由此调控DNA复制和损伤应答。本发明发现了一种调控染色质松弛程度影响DNA代谢的方法,可以通过突变控制dNTP合成的基因或人为地掺入dGTP来实现,该方法具有重要的应用价值。
进一步的,步骤1具体为:FY2317菌株于YPDA平板上复苏,28-32℃倒置培养3-5天。优选的,30℃倒置培养3天。
进一步的,步骤2中,挑取FY2317菌株的单克隆菌落于含有100mL YPD 培养基的锥形瓶中,30℃振荡(200rpm)培养至OD600=0.6。
进一步的,步骤3具体为:从培养液中收集106个细胞,1000-10000x g离心1-5分钟(优选为5000x g离心5分钟),收集菌体沉淀a,将该菌体沉淀a 细胞重悬于1mL PBS,1000-10000x g离心1-5分钟(优选为5000x g离心5 分钟),收集菌体沉淀b,将该菌体沉淀b细胞重悬于1mL CSE缓冲液中(20mM Citrate/Phosphate pH5.6,40mM EDTA,1.2M Sorbitol),加入100T消解酶至终浓度1mg/mL,37℃孵育10-30分钟(优选为20分钟)。
进一步的,步骤4具体为:孵育后1000-10000x g离心1-5分钟(优选为 5000x g离心5分钟),收集菌体沉淀c,将该菌体沉淀c细胞重悬于1mL PBS, 5000x g离心5分钟,收集菌体沉淀d,将该菌体沉淀d细胞重悬于1mL不含 EDTA的CSE缓冲液中,加入dNTP/dATP/dCTP/dGTP/dTTP,37℃旋转再次孵育2-4小时。
更进一步的,dNTP的加入量为0.1mM,dATP,dCTP,dGTP及dTTP的加入量分别为0.025mM。
进一步的,步骤5具体为5000x g离心5分钟,收集菌体沉淀e,将该菌体沉淀e重悬于1mL不含EDTA的CSE缓冲液中,加入1000胶单位MNase, 37℃反应5-60分钟。
更进一步的,终止酶切反应后5000x g离心5分钟,收集菌体沉淀g,利用高纯度DNA回收试剂盒提取DNA(Roche,11732668001)回收经酶切的基因组DNA。
更进一步的,琼脂糖凝胶电泳为制备4%浓度的琼脂糖凝胶,将回收的经酶切的基因组DNA上样并置于BIO-RAD水平电泳槽中进行电泳(2V/cm),1h 后终止电泳。
更进一步的,通过凝胶成像系统(BIORAD,ChemDoc XRS)采集图像。
本申请中:
真核生物的染色质结构在基因转录、DNA修复等各种生物学过程中发生动态变化,其松弛程度和组蛋白修饰受到多种机制的严密调控。在研究DNA修复机制的过程中,发现敲除S期抑制基因(Spd1)可以逆转多种DNA损伤应答(DDR)突变体的表型缺陷,该遗传相互作用涉及到DDR的多个信号转导通路。由于Spd1的主要功能是抑制脱氧核糖核苷酸(dNTP)的生物合成,假设敲除Spd1可以通过改变dNTP库的水平或组分,以一种未知的机制影响DNA损伤应答。进一步分析发现,Spd1缺陷促进染色质松弛,导致突变菌株的染色质对微球菌核酸酶的敏感,由此推测dNTP水平的增高可以促进染色质的紧密程度。最后,利用可以转运外源dNTP的FY2317菌株,制备原生质体,利用半离体的体系证明过量的dNTP,特别是脱氧核糖鸟苷酸(dGTP)可以模拟Spd1 缺失菌株的表型,显著提高染色质的松弛程度。综上所述,本发明发现了一种新的调控染色质松弛程度的遗传机制,可以影响DNA损伤修复的应答机制。
本发明的有益效果如下:
1、利用可以转运外源dNTP的FY2317菌株,制备原生质体,利用半离体的体系证明过量的dNTP,特别是脱氧核糖鸟苷酸(dGTP)可以模拟Spd1缺失菌株的表型,显著提高染色质的松弛程度,发现了一种新的调控染色质松弛程度的遗传机制,可以影响DNA损伤修复的应答机制;
2、染色质的松弛可以增强基因的表达,针对蛋白功能不足导致的疾病可以通过特定的dNTP药物促进其表达进行补偿。
3、染色质松弛可以强烈地改变DNA代谢的生理过程,正常细胞可以自身调节应对这种刺激,但肿瘤细胞由于DNA结构的异常对该刺激的应对不足,更容易造成染色体灾变,可以特异性地杀死肿瘤细胞。
4、染色质松弛更有利于DNA修复,对于某些修复基因突变造成基因组不稳定的肿瘤风险人群,可以利用该机制干预恢复DNA修复水平以降低罹患肿瘤的风险。
附图说明
图1是Spd1-d逆转关键DDR基因rad3突变体对基因毒物的过度敏感图;
图2是野生型、spd1-d、wdr70-d及双敲除菌株的DAPI(细胞核)和Calcoflour (细胞壁)染色图;
图3是野生型和wdr70-d提取染色质进行MNase体外消化后的琼脂糖电泳图;
图4是wt和spd1-d菌株的染色质进行体外MNase消化后的琼脂糖电泳图;
图5是wt,spd1-d,wdr70-d和wdr70-d spd1-d菌株的染色质进行体外MNase 消化后的琼脂糖电泳图;
图6是dNTP掺入FY2317原生质球实验体系的流程图;
图7是FY2317菌株的原生质球体系中加入dNTP/dATP/dCTP/dGTP/dTTP MNase消化后的琼脂糖电泳图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚,下面将结合本发明实施例对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。
基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
实施例1
1材料与方法
1.1克隆形成实验(spotassay)
从培养皿中挑取单克隆裂殖酵母细胞于液体培养基中培养至对数生产期,计数106细胞并重悬于100ul蒸馏水中,10倍梯度稀释后依次取10uL细胞悬浊液滴在培养平板上,30℃培养箱中培养4天后采集图像。
1.2形态学实验
收集对数生长期细胞,重悬于4%PFA中固定5min,5000x g离心并用PBS 洗涤两次后于5%BSA/PBS中固定1小时,PBS洗涤细胞两次,加入含有 Calcofluor的DAPI染料(Vectorlabs,H1300),室温孵育10分钟后制片,于荧光显微镜下(OLYMPUSBX51)观察并采集图像。
1.3 MNase酶切反应
收集106对数生长期酵母细胞,5000x g离心并用PBS洗涤一次后重悬于 EDTA+CSE缓冲液(20mM Citrate/Phosphate pH5.6,40mM EDTA,1.2M Sorbitol) 中,加入100T消解酶(zymolyase)至终浓度1mg/mL,37℃孵育20分钟,PBS 洗涤细胞一次后重悬于无EDTA的CSE缓冲液中,加入1000胶单位MNase (NEB,M0247S)于37℃处理对应的时间。收集细胞并用高纯度DNA回收试剂盒提取DNA(Roche,11732668001)。
1.4琼脂糖电泳
称取高纯度琼脂糖(Thermo,16500500)并制备4%浓度的琼脂糖凝胶,将提取的DNA上样并于BIO-RAD电泳槽中进行电泳(2V/cm,1小时),利用凝胶成像系统(BIORAD,ChemDoc XRS)采集图像
1.5原生质体半离体体系
收集106对数生长期酵母细胞,5000x g离心并用PBS洗涤一次后重悬于CSE 缓冲液中,加入100T消解酶至终浓度1mg/mL,37℃孵育20分钟,PBS洗涤细胞一次后重悬于含有dNTP(天根,CD111)的CSE缓冲液中,37℃处理2 小时或4小时后进行MNase酶切。
实施例2
dGTP/dNTP丰度的代谢信号调控DNA复制或修复的方法,包括如下步骤:
步骤a、FY2317菌株(基因型为leu1-32::[hENT1 leu1+]his7-366::[hsv-tk his7+]ura4-D18 ade6-M210)于YPDA平板上复苏,30℃倒置培养3天;
步骤b、挑取FY2317菌株的单克隆菌落于含有100mL YPD培养基的锥形瓶中,30℃振荡(200rpm)培养至OD600=0.6;
步骤c取10uL培养液,利用血球计数板计数,共收集106个细胞,于 Eppendorf离心机中5000x g离心5分钟,收集菌体沉淀;
步骤d、用1mL PBS重悬细胞,5000x g离心5分钟,收集菌体沉淀;
步骤e、将细胞重悬于1mL CSE缓冲液(20mM Citrate/Phosphate pH5.6,40 mMEDTA,1.2M Sorbitol)中,加入100T消解酶(zymolyase)至终浓度1 mg/mL,37℃孵育20分钟,显微镜观察细胞壁的破碎程度,保证90%以上的细胞形成原生质体;
步骤f、5000x g离心5分钟,收集菌体沉淀;
步骤g、用1mL PBS重悬细胞,5000x g离心5分钟,收集菌体沉淀;
步骤h、将细胞重悬于1mL不含EDTA的CSE缓冲液中;
步骤i、加入dNTP/dATP/dCTP/dGTP/dTTP,dNTP的加入量为0.1mM, dATP,dCTP,dGTP及dTTP的加入量分别为0.025mM,37℃旋转孵育2-4h;
步骤j、5000x g离心5分钟,收集菌体沉淀;
步骤k、将细胞重悬于1mL不含EDTA的CSE缓冲液中;
步骤l、加入1000胶单位MNase(NEB,M0247S),37℃反应5-60min;
步骤m、加入过量的EDTA(pH=8.0)终止酶切反应;
步骤n、5000x g离心5分钟,收集菌体沉淀;
步骤o、利用高纯度DNA回收试剂盒提取DNA(Roche,11732668001) 回收经酶切的基因组DNA;
步骤p、制备4%浓度的琼脂糖凝胶,将回收的DNA上样并置于BIO-RAD 水平电泳槽中进行电泳(2V/cm),1h后终止电泳;
步骤q、通过凝胶成像系统(BIORAD,ChemDoc XRS)采集图像。
实施例3
菌株501,FY2317,cut5ts,rad3-d保存在National BioResource Project/YeastGenetic Resource Center(NBRP/YGRC)。
spd1-d,wdr70-d可以利用501菌株构建
构建方法(参考J,Wu JQ,Longtine MS,Shah NG,McKenzie A 3rd,Steever AB,Wach A,Philippsen P,Pringle JR.Heterologous modules for efficientand versatile PCR-based gene targeting in Schizosaccharomycespombe.Yeast.1998 Jul;14(10):943-51.doi:10.1002/(SICI)1097-0061(199807)14:10<943::AID-YEA292>3.0.CO;2-Y.PMID:9717240.表1中的引物序列也来自该论文)
1.设计带有对应基因同源序列(约100bp)的引物。
2.利用pKS-ura、pKS-hph为模板进行PCR扩增。
3.利用高纯度DNA回收试剂盒提取DNA(Roche,11732668001)回收PCR产物。
4.转化至501菌株中,并将细胞铺匀至带有土霉素的抗生素筛选(spd1-d) 或营养缺陷性(wdr70-d)培养平板上。
5.30摄氏度培养5天后,挑取单克隆进行培养、冻存,所得克隆便是对应基因敲除的菌株。
其中,目标菌株、模板质粒和对应的引物序列如表1所示。
表1目标菌株、模板质粒和对应的引物序列
实施例4
试验结果
Spd1基因敲除拯救多种DNA损伤应答缺陷菌株
本发明人之前研究证明敲除Spd1基因可以逆转Pcu4-Ddb1-CSN突变菌株的S期缺陷和对遗传毒物(genotoxicity)的过度敏感,提示dNTP增高对DNA 复制和修复的正向调控作用。
为进一步研究Spd1对DNA损伤应答的调控功能,结合文献报道和自建的 spd1-d与DDR双突变菌株(图1和表2),通过克隆形成实验测试Spd1与这些基因的遗传相互作用。发现spd1-d可以拯救DNA复制,细胞周期检查点和同源重组等多种DDR通路突变株对遗传毒物的敏感性。除了拯救Rad3、Cut5/Rad4、Chk1和Cds1等检查点突变体,spd1-d还可以缓解其他通路的缺陷,如带有DNA末端回切缺陷的wdr70-d。即dNTP合成增加可以为DNA应答和修复提供充足的原料,间接帮助克服DNA复制和检查点的缺陷;但这种理论并不能解释所有的遗传作用,如未见报道提示DNA末端回切需要大量的dNTP 供应。本发明人猜测,Spd1可能通过另外一种独立于dNTP丰度调控的机制促进DNA应答或修复。
表2本发明和文献报道的Spd1基因敲除株与多种DDR突变体的遗传相互作用
Spd1缺失可以增加染色质对MNase酶切的敏感度。
图2野生型、spd1-d、wdr70-d及双敲除菌株的DAPI(细胞核)和Calcoflour (细胞壁)染色,反映出wdr70-d染色质状态不同于野生型,并且可以被spd1-d 所恢复。图3从野生型和wdr70-d提取染色质进行MNase体外消化实验,显示 wdr70-d的染色质对MNase消化有明显抗性,提示其染色质较为浓缩。MNase 消化反应分别在5,20和60分钟终止。图4和图5同图3中实验方法,对所示菌株的染色质进行体外MNase消化实验。注意Spd1敲除可以提高wdr70-d染色质对MNase消化的敏感性,几乎回复到野生型的水平(图5)。
FY2317原生质体中掺入dGTP增加染色质的松弛程度。
图6dNTP掺入FY2317原生质球实验体系的步骤。图7FY2317菌株的原生质球体系中加入0.1mM的混合dNTP或0.025mM的dATP、dTTP、dCTP和 dGTP,37℃孵育2或4小时后,提取染色质,加入MNase体外消化20分钟。可见dNTP可以显著提高染色质对MNase的敏感性;并且0.025mM的dGTP 的效应与0.1mMdNTP相当,而其他dNTP种类没有染色质松弛效应。
Claims (10)
1.提高染色质松弛程度的方法,其特征在于,所述方法包括Spd1基因敲除或使用dNTP混合物或dGTP提高染色质松弛程度的方法;
使用dNTP混合物或dGTP提高染色质松弛程度的方法包括如下步骤:
步骤1、FY2317菌株于YPDA平板上复苏;
步骤2、挑取FY2317菌株的单克隆菌落并培养至OD600=0.6,获得培养液;
步骤3、从培养液中收集106个细胞,离心并用PBS洗涤一次后重悬于CSE缓冲液中,加入100T消解酶至终浓度1mg/mL,孵育;
步骤4、孵育后离心并用PBS洗涤细胞一次后重悬于含有dNTP混合物或dGTP的CSE缓冲液中,再次孵育;
步骤5、离心,收集菌体沉淀e,后重悬于不含EDTA的CSE缓冲液中,加入MNase反应,反应后加入过量的EDTA终止酶切反应,收集菌体沉淀f并提取DNA,并进行琼脂糖凝胶电泳。
2.根据权利要求1所述的提高染色质松弛程度的方法,其特征在于,步骤1具体为:FY2317菌株于YPDA平板上复苏,28-32℃倒置培养3-5天。
3.根据权利要求1所述的提高染色质松弛程度的方法,其特征在于,步骤2中,挑取FY2317菌株的单克隆菌落于含有100mLYPD培养基的锥形瓶中,30℃振荡培养至OD600=0.6。
4.根据权利要求1所述的提高染色质松弛程度的方法,其特征在于,步骤3具体为:从培养液中收集106个细胞,1000-10000xg离心1-5分钟,收集菌体沉淀a,将该菌体沉淀a细胞重悬于1mLPBS,1000-10000xg离心1-5分钟,收集菌体沉淀b,将该菌体沉淀b细胞重悬于1mLCSE缓冲液中,加入100T消解酶至终浓度1mg/mL,37℃孵育10-30分钟。
5.根据权利要求1所述的提高染色质松弛程度的方法,其特征在于,步骤4具体为:孵育后1000-10000xg离心1-5分钟,收集菌体沉淀c,将该菌体沉淀c细胞重悬于1mLPBS,5000xg离心5分钟,收集菌体沉淀d,将该菌体沉淀d细胞重悬于1mL不含EDTA的CSE缓冲液中,加入dNTP混合物或dGTP,37℃旋转再次孵育2-4小时。
6.根据权利要求5所述的提高染色质松弛程度的方法,其特征在于,dNTP混合物的加入量为0.1mM,dGTP的加入量为0.025mM。
7.根据权利要求1所述的提高染色质松弛程度的方法,其特征在于,步骤5具体为5000xg离心5分钟,收集菌体沉淀e,将该菌体沉淀e重悬于1mL不含EDTA的CSE缓冲液中,加入1000胶单位MNase,37℃反应5-60分钟。
8.根据权利要求7所述的提高染色质松弛程度的方法,其特征在于,终止酶切反应后5000xg离心5分钟,收集菌体沉淀g,利用高纯度DNA回收试剂盒提取DNA回收经酶切的基因组DNA。
9.根据权利要求8所述的提高染色质松弛程度的方法,其特征在于,琼脂糖凝胶电泳为制备4%浓度的琼脂糖凝胶,将回收的经酶切的基因组DNA上样并置于BIO-RAD水平电泳槽中进行电泳,1h后终止电泳。
10.根据权利要求9所述的提高染色质松弛程度的方法,其特征在于,通过凝胶成像系统采集图像。
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组蛋白H2B单泛素化参与DNA损伤修复的调控机制;曾鸣等;《中国科学(生命科学)》;第44卷(第7期);摘要,第704页右列第2段,第705页右列第2段,第708页左列最后1段-右列第1段 * |
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