CN115786318B - 褐藻胶裂解酶截短体Algt1及其应用 - Google Patents
褐藻胶裂解酶截短体Algt1及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN115786318B CN115786318B CN202211639427.7A CN202211639427A CN115786318B CN 115786318 B CN115786318 B CN 115786318B CN 202211639427 A CN202211639427 A CN 202211639427A CN 115786318 B CN115786318 B CN 115786318B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- algt
- algt1
- algin
- lyase
- enzyme activity
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 235000010443 alginic acid Nutrition 0.000 title claims abstract description 82
- 229920000615 alginic acid Polymers 0.000 title claims abstract description 82
- 108090000856 Lyases Proteins 0.000 title claims abstract description 42
- 102000004317 Lyases Human genes 0.000 title claims abstract description 42
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims abstract description 24
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 claims abstract description 22
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 11
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 claims abstract description 10
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 5
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 5
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 5
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims abstract description 3
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 claims abstract description 3
- 108010004131 poly(beta-D-mannuronate) lyase Proteins 0.000 claims description 17
- 229940072056 alginate Drugs 0.000 claims description 15
- -1 small molecule alginate oligosaccharides Chemical class 0.000 claims description 12
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 claims description 7
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 claims description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 6
- 241001506991 Komagataella phaffii GS115 Species 0.000 claims description 4
- FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 6-{[2-carboxy-4,5-dihydroxy-6-(phosphanyloxy)oxan-3-yl]oxy}-4,5-dihydroxy-3-phosphanyloxane-2-carboxylic acid Chemical compound O1C(C(O)=O)C(P)C(O)C(O)C1OC1C(C(O)=O)OC(OP)C(O)C1O FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 claims description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 abstract description 56
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 abstract description 56
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 45
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 abstract description 10
- FKNQFGJONOIPTF-UHFFFAOYSA-N Sodium cation Chemical compound [Na+] FKNQFGJONOIPTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 9
- 229910001415 sodium ion Inorganic materials 0.000 abstract description 9
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 7
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 abstract description 5
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 abstract description 4
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 abstract description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 16
- IXPNQXFRVYWDDI-UHFFFAOYSA-N 1-methyl-2,4-dioxo-1,3-diazinane-5-carboximidamide Chemical compound CN1CC(C(N)=N)C(=O)NC1=O IXPNQXFRVYWDDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 235000010413 sodium alginate Nutrition 0.000 description 15
- 239000000661 sodium alginate Substances 0.000 description 15
- 229940005550 sodium alginate Drugs 0.000 description 15
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 14
- 238000000034 method Methods 0.000 description 10
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 4
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 4
- 238000002330 electrospray ionisation mass spectrometry Methods 0.000 description 4
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 4
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 4
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 3
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 3
- AEMOLEFTQBMNLQ-AZLKCVHYSA-N (2r,3s,4s,5s,6r)-3,4,5,6-tetrahydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound O[C@@H]1O[C@@H](C(O)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O AEMOLEFTQBMNLQ-AZLKCVHYSA-N 0.000 description 2
- AEMOLEFTQBMNLQ-SYJWYVCOSA-N (2s,3s,4s,5s,6r)-3,4,5,6-tetrahydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound O[C@@H]1O[C@H](C(O)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O AEMOLEFTQBMNLQ-SYJWYVCOSA-N 0.000 description 2
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PAYRUJLWNCNPSJ-UHFFFAOYSA-N Aniline Chemical compound NC1=CC=CC=C1 PAYRUJLWNCNPSJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N N-Butanol Chemical compound CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002144 chemical decomposition reaction Methods 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- DMBHHRLKUKUOEG-UHFFFAOYSA-N diphenylamine Chemical compound C=1C=CC=CC=1NC1=CC=CC=C1 DMBHHRLKUKUOEG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 2
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000512259 Ascophyllum nodosum Species 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- 241000620209 Escherichia coli DH5[alpha] Species 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 241001349105 Microbulbifer thermotolerans Species 0.000 description 1
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N Nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000008589 Obesity Diseases 0.000 description 1
- 241000199919 Phaeophyceae Species 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012505 Superdex™ Substances 0.000 description 1
- 229920001284 acidic polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 150000004805 acidic polysaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 1
- 150000002016 disaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 230000005611 electricity Effects 0.000 description 1
- 230000001804 emulsifying effect Effects 0.000 description 1
- 238000005265 energy consumption Methods 0.000 description 1
- 230000007071 enzymatic hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006047 enzymatic hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 230000037356 lipid metabolism Effects 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 229910001453 nickel ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000020824 obesity Nutrition 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000379 polymerizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 101150116497 sacm1l gene Proteins 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 1
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 150000004044 tetrasaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 230000008719 thickening Effects 0.000 description 1
- 150000004043 trisaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 description 1
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
本发明涉及褐藻胶裂解酶截短体Algt1及其应用，属于基因工程和酶工程领域，所述截短体Algt1的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，其核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示。本发明还提供包含所述基因的重组表达载体和重组菌株；本发明截短体Algt1的酶活和热稳定性相较于野生型褐藻胶裂解酶Algt都得到提升。Algt1的酶活为Algt的3.43倍。Algt 35℃水浴2h保留60.33％初始酶活，Algt135℃水浴2h后能保留75.36％初始酶活。Algt1具有良好的热稳定性和钠离子抗性。同时Algt1具有内切和外切双功能，截短体可以在底物浓度为20％的条件下，高效制备褐藻胶寡糖，主要产物是聚合度为1‑4的褐藻胶寡糖。
Description
技术领域
本发明属于基因工程和酶工程领域，具体涉及一种褐藻胶裂解酶截短体Algt1及其应用。
背景技术
褐藻胶是一种存在于褐藻细胞壁及细胞间质的水溶性酸性多糖，由β-D-甘露糖醛酸(β-D-mannuronic acid，简称M)及其C5差向异构体α-L-古洛糖醛酸(α-L-guluronicacid，简称G)两种糖醛酸单体通过1，4糖苷键随机聚合而成。人工养殖的海带是褐藻胶的主要来源，我国的褐藻胶生产总量位居世界前列。褐藻胶具有较强的吸水性，可以用于食品增稠、乳化等方面。但由于褐藻胶分子量较大，难以直接被人体吸收，限制了其在食品行业的应用。与褐藻胶对比，其降解产物褐藻胶寡糖分子量低、易被人体吸收。褐藻胶寡糖的功效受其聚合度影响，聚合度为1-4的褐藻胶寡糖具有抗肥胖、抗氧化和调节脂质代谢的作用，因此定向制备特定聚合度的褐藻胶寡糖具有重要意义。
目前褐藻胶寡糖的制备方法分为化学降解法、物理降解法和酶解法。其中化学降解法只能将褐藻胶进行初步降解并且反应不易控制，耗时较长，反应后酸不易被除去；物理降解法设备耗能高、产物分子量高；相对而言，酶解法反应温和、绿色环保，能制备特定聚合度的褐藻胶寡糖，是一种极具应用前景的褐藻胶寡糖制备方法。褐藻胶的高粘度性质限制了褐藻胶裂解酶的流动性以及酶与底物结合的能力，同时褐藻胶的粘度随着温度上升而降低，所以具有高酶活和良好热稳定性的褐藻胶裂解酶在工业生产上能克服褐藻胶的高粘度性质并更好地发挥作用。在工业生产上，越高的底物浓度代表消耗更少的水电和更小的反应容器从而减少经济成本，所以能在高底物浓度条件下生产褐藻胶寡糖的方法是极具实际意义的。
发明内容
本发明的目的在于提供一种褐藻胶裂解酶截短体，对比野生型褐藻胶裂解酶，该截短体的酶活和热稳定性均得到提升，在制备褐藻胶寡糖方面具有更好的应用潜力和价值。
为实现上述目的，本发明采用技术方案为：
一种野生型褐藻胶裂解酶Algt，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
SEQ ID NO.1：
MKRFKATPAMTIGCAAFLSVYMAAANASIQNPGFESDWDNWTDSDPSAISGVAYSGSKSAKITGSGGRFEQQVSVQTGTNYRLTAYVNGDGTVGAVVNGTTYDADVSSSNWQAVNVEFNSGSAQSVTVFGAYNGGEGRFDNFTLEALGDSGSCQSGSNLSVSAAYDDGTNDGHGPANVLDGSLADESRWSSEGVKWITLDLGSVKNVEGVDIAWYKGDQRISYFYIETSTDNSNWTTVLSGGQSSGTSADMEHYDVSNIEARYVRLTGTGNSANSWNSILEFDVIGCGDGSDGGSSSGGGSSSGGGSSSGGSSGGSSSGSGNLDPTLPPSGNFELVDWYLSIPTDNDGNGKADSIKENELSGGYENSSYFYTASDGGMVFRCPIAGYKTSTNTSYTRTELREMLRRGDTSIDTQGVNKNNWVFGSAPSSARNAAGGVDGVLRATLAVNHVTTTGDSSQVGRVIIGQIHANDDEPLRLYYRKLPGNSKGSIYFAHEPEGGSDQWYEMIGSRSSSASDPADGIALNEVFSYEIKVVGNTLTVTISRDGKDDVVKSVDMSDSGYDSSDQYQYFKAGVYNQNNTGDDDDYVQATFYALENSHDGYPY
一种编码上述野生型褐藻胶裂解酶Algt的基因，其核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。
SEQ ID NO.2：
atgaaacgctttaaagcaaccccagcgatgacgatcggttgcgcggctttcttgagtgtttacatggccgccgccaatgcttccattcaaaatcccgggtttgaaagtgactgggataattggacggattcagacccatccgcaatttccggcgttgcctatagtgggagcaaatctgccaaaatcaccggcagtggcggccgctttgagcaacaggtatccgtccaaaccggaactaattatcggctaaccgcttatgtcaatggcgatggaactgtgggcgctgtcgtaaacggcactacctatgatgcggatgtttccagttcaaactggcaggcggtcaatgtggagtttaacagtggtagcgcgcaaagcgtcactgtgtttggggcctataatggtggtgaaggccggtttgataattttactctcgaggcgttgggtgactccggaagctgccagtctggtagcaatctttccgtttccgcagcatacgacgacggcactaatgatggtcacggccccgctaatgtactggacggcagcctcgcggatgaatcccgctggtcatccgaaggagtgaagtggataactctcgatctcggtagcgtaaaaaatgtggaaggagtggatatcgcttggtacaagggtgaccagcgtatcagctatttctatattgaaacctccactgacaacagcaactggaccactgtgttgagcggcggtcagtccagtggtaccagcgccgacatggagcactatgatgtttccaatatcgaagcccgctatgtgcgcctcactggcaccggcaacagcgccaatagctggaacagcatcctcgagttcgatgttatcggttgcggcgatggctcagatggaggttccagctccggcggcggttccagttctggcggcggttccagttctggcggcagctcaggcggaagctctagtggtagcggaaacctcgacccgactctgccgccgtccggcaacttcgagctggtggattggtacttgagcattcccaccgataacgatggcaacggtaaagccgactccatcaaggaaaacgagttgagcggcggatacgagaacagcagttatttctacactgcaagtgacggcggcatggtattccgttgccccatcgctggctataagacctccaccaacacctcttacacccgtaccgaactacgggaaatgctgcgccggggcgataccagtatcgatacccagggcgtcaacaaaaacaactgggtatttggtagtgcaccttcatccgcccgtaacgcagccggtggcgtggatggtgttttgcgcgcgacgctagcagtcaaccacgttaccaccacaggtgacagcagtcaggtcggtcgcgttatcatcgggcagatacacgctaatgatgacgaaccgctgcgcctctactaccgcaagttgccgggtaactctaagggctcgatctattttgcccatgagcctgaaggtggcagcgatcagtggtatgaaatgatcggcagccgctccagcagtgcctcggatcccgctgatggtatcgcgttgaacgaagtgttcagttatgaaattaaagtggtaggtaatacgctcaccgtcaccatttctcgcgatggcaaagacgatgtcgttaagagtgtcgacatgagtgatagcggctacgatagctcggatcaataccaatacttcaaggccggtgtgtataaccaaaataatacaggcgatgacgatgactatgtccaggcgacattttacgctctggaaaatagtcacgacggctatccctactga.
一种褐藻胶裂解酶截短体Algt1，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
SEQ ID NO.3:
FELVDWYLSIPTDNDGNGKADSIKENELSGGYENSSYFYTASDGGMVFRCPIAGYKTSTNTSYTRTELREMLRRGDTSIDTQGVNKNNWVFGSAPSSARNAAGGVDGVLRATLAVNHVTTTGDSSQVGRVIIGQIHANDDEPLRLYYRKLPGNSKGSIYFAHEPEGGSDQWYEMIGSRSSSASDPADGIALNEVFSYEIKVVGNTLTVTISRDGKDDVVKSVDMSDSGYDSSDQYQYFKAGVYNQNNTGDDDDYVQATFYALENSHDGYPY
一种编码上述褐藻胶裂解酶截短体Algt1的基因，其核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示。
SEQ ID NO.4:
cttcgagctggtggattggtacttgagcattcccaccgataacgatggcaacggtaaagccgactccatcaaggaaaacgagttgagcggcggatacgagaacagcagttatttctacactgcaagtgacggcggcatggtattccgttgccccatcgctggctataagacctccaccaacacctcttacacccgtaccgaactacgggaaatgctgcgccggggcgataccagtatcgatacccagggcgtcaacaaaaacaactgggtatttggtagtgcaccttcatccgcccgtaacgcagccggtggcgtggatggtgttttgcgcgcgacgctagcagtcaaccacgttaccaccacaggtgacagcagtcaggtcggtcgcgttatcatcgggcagatacacgctaatgatgacgaaccgctgcgcctctactaccgcaagttgccgggtaactctaagggctcgatctattttgcccatgagcctgaaggtggcagcgatcagtggtatgaaatgatcggcagccgctccagcagtgcctcggatcccgctgatggtatcgcgttgaacgaagtgttcagttatgaaattaaagtggtaggtaatacgctcaccgtcaccatttctcgcgatggcaaagacgatgtcgttaagagtgtcgacatgagtgatagcggctacgatagctcggatcaataccaatacttcaaggccggtgtgtataaccaaaataatacaggcgatgacgatgactatgtccaggcgacattttacgctctggaaaatagtcacgacggctatccctactga.
本发明还提供包含上述褐藻胶裂解酶截短体Algt1基因的重组表达载体。
本发明还提供包含上述褐藻胶裂解酶截短体Algt1的重组菌株，所述菌株为毕赤酵母GS115。
褐藻胶裂解酶截短体Algt1在制备小分子褐藻胶寡糖中的应用，所述应用为利用褐藻胶裂解酶截短体Algt1将褐藻胶降解为聚合度为1-4的褐藻胶寡糖。
进一步地，所述降解的条件为：底物浓度20％，温度为40℃，反应时间6h。
本发明与现有技术相比的有益效果：
所述褐藻胶裂解酶Algt与其截短体Algt1的酶活和热稳定性比较，发现截短体Algt1的酶活和热稳定性都得到提升。Algt1的酶活为Algt的3.43倍。Algt35℃水浴2h保留60.33％初始酶活，Algt1 35℃水浴2h后能保留75.36％初始酶活。
所述褐藻胶裂解酶截短体Algt1的酶学性质：最适温度为40℃，最适pH为7.0，能够降解海藻酸钠、Poly M和Poly G。具有良好的热稳定性和钠离子抗性。同时具有内切和外切双功能，Algt1可以在底物浓度为20％的条件下，高效降解褐藻胶，主要产物是聚合度为1-4的褐藻胶寡糖。
附图说明
图1：本发明实施例提供的褐藻胶裂解酶Algt和Algt1的基因注释结果；其中，A和B分别为Algt1和Algt。
图2：本发明的褐藻胶裂解酶纯化后的SDS-PAGE电泳图，其中1为Algt1粗酶液；2为Algt粗酶液；3为Algt1纯化蛋白；4为Algt纯化蛋白。
图3：本发明的褐藻胶裂解酶温度变化对相对酶活的影响示意图；其中，A和B分别为Algt1和Algt。
图4：本发明的褐藻胶裂解酶pH变化对相对酶活的影响示意图；其中，A和B分别为Algt1和Algt。
图5：本发明的褐藻胶裂解酶在不同温度下放置不同时间酶活变化图；其中，A和B分别为Algt1和Algt。
图6：本发明的褐藻胶裂解酶钠离子浓度变化对相对酶活的影响示意图；其中，A和B分别为Algt1和Algt。
图7：本发明的褐藻胶裂解酶降解海藻酸钠的产物TLC分析图；其中，A和B分别为Algt1和Algt。
图8：本发明的褐藻胶裂解酶Algt1降解底物浓度为20％的海藻酸钠、Poly M、PolyG的产物ESI-MS和FPLC分析图。其中A、B、C为降解海藻酸钠、Poly M、Poly G的ESI-MS图；D为降解不同底物的FPLC图。
具体实施方式
下面通过实施例来对本发明的技术方案做进一步解释，但本发明要保护的技术范围不受实施例任何形式上限制。
实施例1褐藻胶裂解酶的来源及序列分析
野生型褐藻胶裂解酶Algt来源于Microbulbifer thermotolerans DSM 19189，属于PL7家族，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。Algt含有3个结构域，CBM_4_9、F5_F8_type_C、Alginate_lyase2结构域。通过研究发现CBM_4_9和F5_F8_type_C区域的截短能增加褐藻胶裂解酶的酶活和热稳定性，所以将Algt的CBM_4_9和F5_F8_type_C结构域截短，并获得截短后的褐藻胶裂解酶Algt1，两个酶的结构域分析如图1所示。
实施例2褐藻胶裂解酶的表达及纯化
根据表达宿主毕赤酵母GS115的密码子偏好性，对SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.3进行优化并人工合成分别连接至pPIC9K载体。将载体采用热激法转入大肠杆菌DH5α感受态细胞中。使用含有氨苄青霉素的LB培养基平板进行筛选，挑选长出的单菌落进行测序，对测序结果正确的转换子进行收集，并将重组质粒命名为pPIC9K-Algt1和pPIC9K-Algt。将含pPIC9K-Algt1和pPIC9K-Algt质粒的DH5α单菌分别挑入LB培养基中培养20h，通过PlasmidDNA Kit试剂盒提取pPIC9K-Algt1和pPIC9K-Algt的质粒，并使用Sac1限制性内切酶对其进行线性化酶切处理，纯化处理后的产物将进行转化。将5μL需要转化的酶切产物转移至50μL毕赤酵母GS115感受态细胞中，并将上述混合样品转移至2mm电转杯中于冰上孵育15min，在工作电压为2kV、脉冲时间约为0.5ms的条件下进行电击，结束后立即加入预冷的1mL 1M山梨醇溶液，吸打混匀后转移至新的1.5mL离心管中，置于30℃培养箱中孵育1h，离心后涂布于MD培养基中，于30℃培养3-5天。将MD转化板上的转化子全部接于48孔板中发酵，条件为30℃、200rpm，每隔24h用1.0％甲醇诱导一次，共诱导三次。培养完成后对上清液测定酶活，选取酶活较高的转化子进行摇瓶发酵。采用DNS法验证所获蛋白是否具有酶活，1个酶活单位(U)定义为每1min产生1μmol还原糖所需的酶量。挑选所选阳性单菌落于20mL BMGY培养基中，使用甲醇诱导产酶。发酵条件为30℃、200rpm，从培养的第24h开始，每间隔24h添加1.0％的甲醇进行诱导表达，诱导三次后离心并收集上清液。
使用镍离子磁珠对摇瓶发酵酶液进行纯化，使用不同浓度梯度咪唑溶液洗脱。对所得纯化褐藻胶裂解酶酶液进行SDS-PAGE电泳检测。结果如图2所示，纯化效果较为明显，纯化后的酶液用于后续实验。
实施例3Algt1和Algt酶学性质研究
(1)温度对酶活性的影响
用pH 7.0的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液配制0.8％(w/v)的海藻酸钠，分别取100μL褐藻胶裂解酶Algt1和Algt的酶液，加入900μL上述海藻酸钠溶液并混合。取混合液分别置于30、35、40、45、50、55℃下反应30min，测定酶活。用DNS法测定Algt1的酶活，最适反应温度为酶活最高的测定温度并设其酶活为100％，其它温度下酶活与其的比值为该温度下的相对酶活。结果如图3所示，褐藻胶裂解酶Algt1和Algt的最适反应温度都为40℃，说明CBM_4_9和F5_F8_type_C结构域的截短不改变褐藻胶裂解酶的最适反应温度。
(2)pH对酶活性的影响
分别用CH3COOH-CH3COONa缓冲液(20mM,pH 4.0–6.0)、Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液(20mM,pH 6.0–8.0)和、NaOH-glycine缓冲液(20mM,pH 8.0–10.0)配制不同pH的0.8％(w/v)海藻酸钠。分别取100μL褐藻胶裂解酶Algt1和Algt的酶液，加入900μL上述不同pH海藻酸钠溶液并混合，40℃条件下反应30min。用DNS法测定Algt1的酶活，最适反应pH为酶活最高的测定温度并设其酶活为100％，其它pH下酶活与其的比值为该温度下的相对酶活。结果如图4所示，褐藻胶裂解酶Algt1和Algt的最适反应pH都为7.0，说明CBM_4_9和F5_F8_type_C结构域的截短不改变褐藻胶裂解酶的最适反应pH。
(3)褐藻胶裂解酶的底物偏好性
以0.8％(w/v)的海藻酸钠、poly G、poly M为底物，取900μL不同底物，分别加入100μL褐藻胶裂解酶Algt1和Algt的酶液，置于最适反应条件(40℃、pH7.0)下反应30min，采用DNS法测定酶活。结果如表1所示，褐藻胶裂解酶Algt1和Algt都能降解海藻酸钠、poly G、poly M，Algt1对三种底物的酶活都高于Algt，说明CBM_4_9和F5_F8_type_C结构域的截短可以提高褐藻胶裂解酶的酶活。
表1褐藻胶裂解酶Algt和其截短体Algt1酶活差异
(4)褐藻胶裂解酶耐热性
以0.8％(w/v)的海藻酸钠为底物，取900μL底物，分别加入100μL褐藻胶裂解酶Algt1和Algt的酶液，分别在35℃、40℃、45℃和50℃孵育0–2h后，对Algt1和Algt的残留活性进行测定。结果如图5所示，Algt1和Algt在40℃孵育1h后还可以保留83.6％和73.3％的初始酶活。总体而言，Algt1的热稳定性优于Algt，说明CBM_4_9和F5_F8_type_C结构域的截短可以提高褐藻胶裂解酶热稳定性。
(5)钠离子对褐藻胶裂解酶酶活的影响
配制不同钠离子浓度的0.8％(w/v)海藻酸钠作为底物，钠离子浓度范围为0-1600mM。取900μL底物，加入100μL褐藻胶裂解酶置于40℃、pH7.0的条件下反应30min，采用DNS法测定酶活，设置其中最高酶活为100％。结果如图6所示，在200-1200mM钠离子浓度范围内，Algt1的酶活得到提高；在200-1400mM钠离子浓度范围内，Algt的酶活得到提高，说明CBM_4_9和F5_F8_type_C结构域的截短不改变褐藻胶裂解酶钠离子激活特性。
实施例4Algt1和Algt降解模式分析
以0.8％(w/v)的海藻酸钠为底物，取900μL不同底物，分别加入100μL褐藻胶裂解酶Algt1和Algt并置于40℃、pH7.0的条件下反应90min。取不同时间段的反应液进行TLC测定。TLC的展开剂为甲酸、正丁醇、水(6:4:1)，显色剂为1mL盐酸、2mL苯胺、2g二苯胺、10mL磷酸溶于100mL丙酮中。将点样后的硅胶板放置于含有展开剂的容器中，重复展开两次。展开完毕后，喷洒显色剂，110℃显色10min。待显色效果明显后拍照记录，对照组为聚合度2-6的褐藻胶寡糖混合标准品。结果如图7所示，褐藻裂解酶Algt1和Algt的主要降解产物为褐藻胶单糖、二糖、三糖、四糖和DEH(4-deoxy-L-erythro-5-hexoseulose uronic acid)，DEH是由褐藻胶单糖非酶转化而形成的。Algt1和Algt都具有内切和外切功能，能同时获得褐藻胶单糖和褐藻胶寡糖，说明CBM_4_9和F5_F8_type_C结构域的截短不改变褐藻胶裂解酶降解模式。
实施案例5高底物浓度条件下，利用Algt1制备褐藻胶寡糖
称量200g海藻酸钠、Poly M和Poly G，分别倒入1000mL超纯水中，配制成不同底物原液，底物浓度为20％。向不同底物原液中加入50mL褐藻胶裂解酶Algt1，40℃条件下搅拌6h。为了去除杂质，将反应物以4000rpm离心10min，然后通过冷冻干燥纯化。在负离子模式下使用电喷雾电离质谱(ESI-MS)分析纯化后的产物。同时，利用FPLC检测纯化产物：使用SuperdexTM 30Increase10/300GL column，流动相为0.2M NH4HCO3，流速为0.3mL/min，并使用可变波长检测器(VWD)在235nm处检测。结果如图8所示，褐藻胶裂解酶Algt1能在高底物浓度条件下，6h内将海藻酸钠、PolyM、PolyG降解成聚合度为1-4的褐藻胶寡糖。该结果说明褐藻胶裂解酶Algt1是一种有效制备褐藻胶寡糖的工具，在工业应用上极具前景。
Claims (6)
1.一种褐藻胶裂解酶截短体Algt1，其特征在于，所述截短体Algt1的氨基酸序列如SEQID NO.3所示。
2.编码权利要求1所述截短体Algt1的基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
3.包含权利要求2所述基因的重组表达载体。
4.一种重组菌株，其特征在于，所述重组菌株包含权利要求2所述基因，菌株为毕赤酵母GS115。
5.褐藻胶裂解酶截短体Algt1在制备小分子褐藻胶寡糖中的应用，其特征在于，所述应用为利用权利要求1所述的褐藻胶裂解酶截短体Algt1将褐藻胶降解为聚合度为1-4的褐藻胶寡糖。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述降解的条件为：底物浓度20％(W/V)，温度为40℃，反应时间6h。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202211639427.7A CN115786318B (zh) | 2022-12-20 | 2022-12-20 | 褐藻胶裂解酶截短体Algt1及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202211639427.7A CN115786318B (zh) | 2022-12-20 | 2022-12-20 | 褐藻胶裂解酶截短体Algt1及其应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN115786318A CN115786318A (zh) | 2023-03-14 |
| CN115786318B true CN115786318B (zh) | 2024-05-07 |
Family
ID=85427274
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202211639427.7A Active CN115786318B (zh) | 2022-12-20 | 2022-12-20 | 褐藻胶裂解酶截短体Algt1及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN115786318B (zh) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117230051B (zh) * | 2023-11-16 | 2024-01-30 | 深圳润康生态环境股份有限公司 | 一种褐藻胶裂解酶突变体Pl7MaM及其制备方法与应用 |
Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106884025A (zh) * | 2017-05-02 | 2017-06-23 | 中国海洋大学 | 一种酶法水解定向制备褐藻胶寡糖的方法 |
| CN110452919A (zh) * | 2019-09-10 | 2019-11-15 | 南京工业大学 | 一种截短的褐藻胶裂解酶Aly7B-CDII基因及其应用 |
| WO2021012959A1 (zh) * | 2019-07-24 | 2021-01-28 | 江南大学 | 一种褐藻胶裂解酶及其应用 |
| CN112574980A (zh) * | 2020-12-09 | 2021-03-30 | 中国海洋大学 | 一种热稳定性和高酶活力的重组褐藻胶裂解酶及其应用 |
| CN113699140A (zh) * | 2021-10-28 | 2021-11-26 | 中国海洋大学 | 褐藻胶裂解酶及其应用 |
| WO2022078140A1 (zh) * | 2020-10-15 | 2022-04-21 | 中国热带农业科学院热带生物技术研究所 | 产褐藻胶裂解酶菌株及其应用 |
| EP4029931A1 (en) * | 2020-12-25 | 2022-07-20 | Beijing Leili Marine Bioindustry Inc. | Alginate lyase-producing genetic engineered strain and fermentation method thereof |
-
2022
- 2022-12-20 CN CN202211639427.7A patent/CN115786318B/zh active Active
Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106884025A (zh) * | 2017-05-02 | 2017-06-23 | 中国海洋大学 | 一种酶法水解定向制备褐藻胶寡糖的方法 |
| WO2021012959A1 (zh) * | 2019-07-24 | 2021-01-28 | 江南大学 | 一种褐藻胶裂解酶及其应用 |
| CN110452919A (zh) * | 2019-09-10 | 2019-11-15 | 南京工业大学 | 一种截短的褐藻胶裂解酶Aly7B-CDII基因及其应用 |
| WO2022078140A1 (zh) * | 2020-10-15 | 2022-04-21 | 中国热带农业科学院热带生物技术研究所 | 产褐藻胶裂解酶菌株及其应用 |
| CN112574980A (zh) * | 2020-12-09 | 2021-03-30 | 中国海洋大学 | 一种热稳定性和高酶活力的重组褐藻胶裂解酶及其应用 |
| EP4029931A1 (en) * | 2020-12-25 | 2022-07-20 | Beijing Leili Marine Bioindustry Inc. | Alginate lyase-producing genetic engineered strain and fermentation method thereof |
| CN113699140A (zh) * | 2021-10-28 | 2021-11-26 | 中国海洋大学 | 褐藻胶裂解酶及其应用 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| A Recombinant Alginate Lyase Algt1 with Potential in Preparing Alginate Oligosaccharides at High-Concentration Substrate;Qingping Liang等;《Foods》;20231123;第12卷(第21期);第1-17页 * |
| Study on expression and action mode of recombinant alginate lyases based on conserved domains reconstruction;Min Yang等;《Applied Microbiology and Biotechnology》;20190219;第103卷(第2期);第807-817页 * |
| 海洋细菌海藻多糖降解酶的筛选及性质研究;闫军军等;《中国优秀硕士学位论文全文数据库》;20210831;第28-31页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN115786318A (zh) | 2023-03-14 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR100744479B1 (ko) | 사이코스 에피머화 효소에 의한 사이코스의 생산 방법 | |
| CN109355275B (zh) | 高热稳定性β-葡萄糖苷酶突变体及其应用 | |
| CN109486786A (zh) | 一种环糊精葡萄糖基转移酶突变体 | |
| CN109957536B (zh) | 一种枯草芽孢杆菌及其在海藻酸裂解酶生产中的应用 | |
| CN103468624B (zh) | 一种用于高效生产海藻糖的基因工程菌 | |
| CN115786318B (zh) | 褐藻胶裂解酶截短体Algt1及其应用 | |
| CN109022408B (zh) | 一种新型褐藻胶裂解酶Aly08及其应用 | |
| CN115948373B (zh) | 一种褐藻胶裂解酶突变体Pl7AaM及其应用 | |
| US20240060062A1 (en) | Agarase Mutant with Improved Thermal Stability and Application Thereof | |
| CN114480350A (zh) | 卡拉胶酶在降解κ-卡拉胶和红藻胶中的应用 | |
| CN110144341B (zh) | 海藻酸裂解酶突变体 | |
| CN103352031B (zh) | 一种糖基转移酶基因及应用 | |
| CN103421734A (zh) | 一种重组酪氨酸脱羧酶的可溶性高表达的方法及该酶的应用 | |
| CN103695323B (zh) | 一种稳定、高产α-转移葡萄糖苷酶的菌株 | |
| CN113403245A (zh) | 一种重组大肠杆菌固定化细胞及其应用 | |
| CN109456954B (zh) | 热稳定性提高的β-葡萄糖苷酶突变体及其应用 | |
| CN116286756A (zh) | 嗜热氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶突变体、编码基因及其应用 | |
| CN103695383B (zh) | 一种高效表达α-转移葡萄糖苷酶的黑曲霉菌株 | |
| CN107400667B (zh) | 一种含重组耐高温葡萄糖异构酶细胞的固定化方法 | |
| JP2016523090A (ja) | Ｃｈｉ９２タンパク質の新たな用途及びＣｈｉ９２タンパク質発現菌株 | |
| CN114836406A (zh) | 一种催化活力提高的琼胶酶突变体及其应用 | |
| CN111100855B (zh) | 一种紫菜多糖酶及其应用 | |
| CN111100854B (zh) | 一种适冷性海带淀粉酶及其应用 | |
| CN109055344A (zh) | 一种具有热恢复特性的褐藻胶裂解酶及其应用 | |
| CN114891665B (zh) | 一种海藻糖酶、重组菌及其在酵母制品水解中的应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |