CN114921433A

CN114921433A - 一种α-转氨酶突变体及其在合成L-草铵膦中的应用

Info

Publication number: CN114921433A
Application number: CN202210517111.4A
Authority: CN
Inventors: 金利群; 赵梦洁; 刘汉林; 薛亚平; 柳志强; 郑裕国
Original assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Current assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Priority date: 2022-05-12
Filing date: 2022-05-12
Publication date: 2022-08-19
Anticipated expiration: 2042-05-12
Also published as: CN114921433B

Abstract

本发明公开了一种α‑转氨酶突变体及其在合成L‑草铵膦中的应用，所述α‑转氨酶突变体是将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第131位或214位进行单突变或多突变获得的。本发明α‑转氨酶突变体可催化20mM底物2‑羰基‑4‑[羟基(甲基)膦酰基]丁酸转化为L‑草铵膦，转化率达96.37％，相比较于野生型，CkTA‑W131Y突变体对PPO的特异性活性提高了1.5倍，CkTA‑A214V突变体对PPO的特异性活性提高了2.8倍，双突变CkTA‑W131Y‑A214V对PPO的特异性活性提高了3.7倍，其最适反应温度为35℃，最适pH为8.5，产物ee值大于99.9％。

Description

一种α-转氨酶突变体及其在合成L-草铵膦中的应用

(一)技术领域

本发明属于生物工程技术领域，涉及一种来自柯氏柠檬酸杆菌(Citrobacterkoseri)的α-转氨酶突变体及其在微生物催化2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸不对称合成L-草铵膦中的应用。

(二)背景技术

草铵膦(glufosinate-ammonium)为广谱、触杀型、灭生性、非残留除草剂，其化学名称为4-[羟基(甲基)膦酰基]-D,L-高丙氨酸，化学式为C₅H₁₅N₂O₄P，分子量为198.157。草铵膦是外消旋体混合物(结构式见图1)，只有L-型具有植物毒性，其除草活性为外消旋混合物的2倍。L-草铵膦具有低毒、活性高和环境相容性好等特点，其发挥活性作用的速度比百草枯慢而优于草甘膦，成为与草甘膦和百草枯并存的非选择性除草剂。L-草铵膦(L-PPT)作为全球重要的转基因作物耐受型除草剂有广阔的市场应用前景，若草铵膦产品能以L-构型的纯光学异构体形式使用，可显著降低草铵膦的使用量，这对于提高原子经济性、降低使用成本、减轻环境压力具有重要意义。

制备光学纯L-草铵膦的方法主要两种：化学法和生物法。化学法合成L-PPT主要分为低温定向合成法、不对称催化加氢合成法、不对称氰基加成法、不对称Michael加成反应、Strecker反应等。化学法具有原子经济性高的特点，但是化学合成L-PPT通常步骤冗长，合成路线复杂，产率和对映体选择性比较低，其反应条件往往比较苛刻，在单一的催化反应中得不到足够的立体选择性，引起了一系列的环境问题，产品也不符合药物要求。相比而言，生物法不对称合成L-PPT的显著优点在于它的理论产率可达到100％，因具有立体选择性高、反应条件温和、产率高及产物易于分离纯化以及环境污染小等优点而备受关注，研究生物酶法生产L-PPT的路线具有十分重要的产业价值和显著的社会效益。

目前，利用酶催化不对称合成L-PPT主要应用的是氨基酸脱氢酶和转氨酶，转氨酶(Transaminase,TA,EC 2.6.1.X)是依赖磷酸吡哆醛(PLP)的酶，其催化的转胺过程由两步可逆反应组成。首先活性中心催化Lys的氨基与PLP的醛基通过形成内部醛亚胺的形式相连，然后由氨基供体的氨基取代Lys的氨基与PLP形成一个外部醛亚胺；在催化残基Lys作用下发生质子转移，先后形成醌型结构中间体和酮亚胺中间体，最后由酮亚胺中间体水解生成产物酮和5′-磷酸吡哆胺(PMP)；第二步反应将PMP的氨基转移至潜手性酮上生成手性胺，同时完成辅酶循环再生。根据氨基被转移到不同的氨基供体的位置，可以分为α-转氨酶和ω-转氨酶，α-转氨酶催化底物α位置的羰基接受氨基供体的氨基转移反应，ω-转氨酶在反应中转移的氨基距离羧基较远，缺少羧基的化合物，如酮酸、醛和酮可以作为ω-转氨酶的底物。转氨酶催化得到的产物具有立体选择性高、辅因子可再生的特点，并且反应条件温和、过程简单。因此，转氨酶被更广泛地应用于合成医药和农药中间体。

在诸多草铵膦的生物法合成路线中，酮酸路线因原料价廉易得并且可以避免使用剧毒氰化物，而成为适宜L-PPT工业化开发生产的路线。目前L-PPT的生物合成报道中，转氨酶是应用比较广泛的一种催化剂，但是满足工业化大规模生产的工业酶还比较缺乏，本发明旨在为不对称合成L-PPT提供一种高效的生物催化剂。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种α-转氨酶突变体及其在不对称合成L-草铵膦中的应用，该突变体的活性和底物耐受性均得到提高，且能够利用廉价氨基供体催化2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸不对称合成L-草铵膦。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种α-转氨酶突变体，所述α-转氨酶突变体是将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第131位或214位进行单突变或多突变获得的。所述SEQ ID NO.1所示氨基酸序列编码核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

优选，所述转氨酶突变体是将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列突变为下列之一：(1)第131位色氨酸突变为酪氨酸(W131Y，氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，核苷酸序列如SEQID NO.4所示)；(2)第214位丙氨酸突变为缬氨酸(A214V，氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示)；(3)第131位色氨酸突变为酪氨酸且第214位丙氨酸突变为缬氨酸(W131Y/A214V，氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示)。

由于氨基酸序列的特殊性，对以上任何氨基酸序列所示的多肽的片段或其变体，如其保守性变体、生物活性片段或衍生物，只要该多肽的片段或多肽变体与前述氨基酸序列同源性在95％以上，均属于本发明保护范围之列。所述改变可包括氨基酸序列中氨基酸的缺失、插入或替换；对于变体的保守性改变，所替换的氨基酸具有与原氨基酸相似的结构或化学性质，如用亮氨酸替换异亮氨酸，变体也可具有非保守性改变，如用色氨酸替换甘氨酸。

本发明还涉及所述α-转氨酶突变体的编码基因。

由于核苷酸序列的特殊性，以上所示任何多核苷酸的变体，只要其与该多核苷酸具有90％以上同源性，均属于本发明保护范围之列。所述多核苷酸的突变体是指一种具有一个或多个核苷酸改变的多核苷酸序列。此多核苷酸的突变体可以是生的等位变异体或非生的变异体，包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变编码氨基酸的功能。

本发明还涉及含所述α-转氨酶突变体编码基因的表达载体，以及含所述表达载体的重组基因工程菌，所述表达载体以质粒pET28b(+)或能表达该酶的载体为基础载体；所述重组基因工程菌是将重组质粒转化进宿主菌细胞获得的，所述宿主菌包括E.coli BL21(DE3)细胞或能表达该酶的宿主细胞。

本发明还涉及一种所述α-转氨酶突变体在催化2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸(PPO)不对称合成L-草铵膦中的应用，具体的，所述应用为：将含α-转氨酶突变体编码基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体，经过超声破碎、镍柱纯化后获得的纯酶液作为催化剂，以PPO为底物，加入氨基供体和辅酶，以pH值为6～9的缓冲液为反应介质构成反应体系，在30～75℃、600rpm条件下反应(优选55℃)完全后，加入6M的HCl水溶液终止反应，反应液经分离纯化得到L-草铵膦；所述辅酶为5-磷酸吡哆醛(PLP)，所述氨基供体为L-谷氨酸(L-Glu)；所述反应体系中，催化剂加入量为1-10U/mL(优选4U/mL)；辅酶用量为0.02～25mM(优选0.2～2mM，更优选1mM)、底物PPO的初始浓度为10～160mM(优选20～100mM，更优选20mM)，氨基供体加入量为30～100mM(优选60mM)；所述反应介质优选pH 8.5的50mMTris-HCl缓冲液。

本发明所述催化剂按如下方法制备：(1)湿菌体：将含有α-转氨酶突变体基因的工程菌接种至含有终浓度50μg/mL卡那霉素抗性的LB液体培养基，37℃、200rpm下培养9h，培养液再以体积浓度1％接种量接种至新鲜的含有终浓度50μg/mL卡那霉素抗性的LB液体培养基中，于37℃、150rpm下培养至菌体OD₆₀₀达0.6～0.8，加入终浓度为0.1mM的异丙基-β-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导转氨酶蛋白表达，28℃下诱导培养12h后，4℃、8000rpm离心10min，弃去上清液，收集湿菌体；所述LB液体培养基组成：胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，溶剂为水，pH值7.0；121℃高压灭菌20min，使用前添加终浓度50μg/mL卡那霉素抗性；(2)粗酶液：将步骤(1)湿菌体悬浮在pH 8.5、50mM的Tris-HCl缓冲液中，超声破碎细胞10min，4℃，8000rpm离心10min，获得上清液，即为粗酶液；破碎条件：超声35W，超声2s，间歇2s；所述缓冲液体积用量以湿菌体重量计为10mL/g；(3)采用Biologic LP蛋白层析仪系统和Ni-NTA亲和柱分离纯化步骤(2)获得的粗酶液：先用超纯水冲洗Biologic LP蛋白层析仪系统和Ni-NTA亲和柱，再用缓冲液A冲洗Ni-NTA柱，流速为2mL/min，直至蛋白仪标线平稳不变；将粗酶液以2mL/min的流速上样，注意不要进入气泡；上样后，用缓冲液C以2mL/min的流速洗脱5-10个柱体积(优选10个)，除去未结合完全的蛋白；再用缓冲液B以2mL/min的速度洗脱5-10个柱体积(优选10个)，洗脱目的蛋白，根据紫外检测器的信号响应检测OD₂₈₀的值，当OD₂₈₀到达0.25并上升时开始收集洗脱液，OD₂₈₀降为0.25时停止收集洗脱液，将收集的洗脱液于透析袋(MD44，MW：8000)在pH 8.5，4℃，PBS缓冲液中透析24h，每6h换一次缓冲液，截留液即为纯酶液，4℃低温保存。缓冲液A：20mM Na₂HPO₄-NaH₂PO₄，300mMNaCl，pH 8.5，增加洗脱柱对核酸的结合活性；缓冲液B：20mM Na₂HPO₄-NaH₂PO₄，300mMNaCl，500mM咪唑，pH 8.5，把DNA从柱子上洗脱下来；缓冲液C：20mM Na₂HPO₄-NaH₂PO₄，300mMNaCl，20mM咪唑，pH 8.5，洗掉柱子里除核酸物质以外的杂质；缓冲液于冰浴中预冷。

与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：本发明提供了一种新的高活力α-转氨酶突变体，该突变体对草铵膦前体酮PPO具有较高的催化活力，可催化20mM底物2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸转化为L-草铵膦，转化率达96.37％，相比较于野生型，CkTA-W131Y突变体对PPO的特异性活性提高了1.5倍，CkTA-A214V突变体对PPO的特异性活性提高了2.8倍，双突变CkTA-W131Y-A214V对PPO的特异性活性提高了3.7倍，其最适反应温度为55℃，最适pH为8.5，产物ee值大于99.9％。

(四)附图说明

图1为草铵膦结构式。

图2为实施例2中α-转氨酶基因及突变体重组质粒PCR产物的琼脂糖凝胶(SDS-PAGE)电泳图；其中，泳道M为250bp DNA Ladder；泳道1为重组质粒CkTA；泳道2为重组质粒CkTA-W131Y；泳道3为重组质粒CkTA-A214V；泳道4为重组质粒CkTA-A214I；泳道5为重组质粒CkTA-A214L；泳道6为重组质粒CkTA-W131Y-A214V。

图3为α-转氨酶及突变体纯化前后的琼脂糖凝胶电泳(SDS-PAGE)图：泳道M为蛋白质分子量Marker；泳道1为实施例4制备的转氨酶CkTA粗酶液；泳道2为实施例4制备的CkTA-W131Y粗酶液；泳道3为实施例4制备的CkTA-A214V粗酶液；泳道4为实施例4制备的CkTA -W131Y-A214V粗酶液；泳道5为实施例5制备的纯化后的转氨酶CkTA；泳道6为实施例5制备的纯化后的转氨酶突变体CkTA -W131Y；泳道7为实施例5制备的纯化后的转氨酶突变体CkTA-A214V；泳道8为实施例5制备的纯化后的转氨酶突变体CkTA -W131Y-A214V。

图4为生物酶法不对称合成L-草铵膦反应过程示意图。

(五)具体实施方式

为了加深对本发明的理解，下面将结合具体实施例对本发明做进一步详细描述，该实施例仅用于解释本发明，并不对本发明的保护范围构成限定。

本发明实施例所述LB液体培养基组成：胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，溶剂为水，pH值7.0。

实施例1：α-转氨酶基因CkTA的来源和基因合成

根据NCBI数据库中BLAST获得来自柯氏柠檬酸杆菌(Citrobacterkoseri)的片段(GenBank accession:WP_071257673.1)，人工克隆得到α-转氨酶基因。依据大肠杆菌密码子偏好性进行密码子优化，通过基因工程的常规操作以全基因合成的方法合成α-转氨酶的氨基酸序列，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。在核酸序列末端加上6×His-tag标签，两端加入酶切位点Nco I和Xho I，将该基因克隆至pET28b(+)对应的Nco I和Xho I位点，获得重组表达载体pET28b/CkTA，重组质粒经测序无误后转化至表达宿主大肠杆菌E.coliBL21(DE3)，获得出发菌株E.coliBL21(DE3)/pET28b/CkTA。

SEQ ID NO.1序列如下：

MFQKVDAYAGDPILSLMERFKEDSRSDKVNLSIGLYYNEEGIIPQLKAVAEAEARINAQPHGASLYLPMEGLNTYRHTIAPLLFGADHPVLQQQRVATIQTLGGSGALKVGADFLKRYFPESAVWVSDPTWENHIAIFEGAGFEVSTYPWYDNATNGVRFNDLLATLNTLPARSIVLLHPCCHNPTGADLTHSQWDAVIEILKARELIPFLDIAYQGFGAGMEDDAYAIRAIASAGLPALVSNSFSKIFSLYGERVGGLSVVCEDAEAAGRVLGQLKATVRRNYSSPPNFGAQVVAAVLNDEALKASWLAEVEAMRTRILAMRQELVNVLNAEIPGRNFDYLLQQRGMFSYTGLSAAQVDRLRDEFGVYLIASGRMCVAGLNSGNVQRVAKAFAAVM。

SEQ ID NO.2：

ATGTTCCAGAAAGTTGATGCCTATGCGGGTGATCCGATTCTTAGCCTGATGGAGCGTTTTAAAGAGGATTCGCGCAGCGATAAAGTTAATTTAAGCATTGGTCTTTACTACAACGAGGAGGGTATTATTCCGCAGCTGAAAGCCGTTGCAGAAGCCGAAGCACGTATTAATGCACAGCCACATGGTGCCAGCCTGTATCTGCCGATGGAAGGATTAAATACCTATCGTCACACCATTGCACCCCTGTTATTTGGTGCAGATCATCCGGTGTTACAGCAGCAACGGGTGGCAACCATCCAAACATTAGGAGGTAGCGGTGCCCTGAAAGTTGGCGCAGATTTTTTAAAAAGATACTTTCCTGAGAGCGCAGTTTGGGTTAGTGATCCGACCTGGGAAAATCATATTGCAATTTTTGAAGGCGCCGGATTTGAAGTTAGTACCTATCCGTGGTATGACAATGCAACGAATGGGGTTCGTTTTAATGATCTGCTGGCAACCCTGAATACCCTGCCGGCCCGTAGCATTGTTCTGCTGCATCCGTGTTGTCATAATCCGACCGGCGCAGATCTGACCCATAGTCAGTGGGATGCGGTTATTGAAATTTTAAAAGCAAGAGAACTGATCCCTTTTCTGGATATTGCCTATCAAGGTTTTGGTGCGGGGATGGAAGATGATGCATATGCAATTCGTGCTATTGCGAGCGCGGGTCTGCCGGCACTGGTTTCAAATAGCTTTAGCAAAATTTTCTCCCTGTATGGTGAACGTGTTGGGGGGCTGAGCGTTGTGTGTGAAGATGCCGAAGCAGCAGGTCGGGTTTTAGGTCAGCTGAAGGCAACTGTTCGTCGTAATTATAGCAGCCCGCCTAATTTTGGTGCTCAGGTTGTTGCAGCGGTTTTAAATGATGAAGCGCTGAAGGCGAGTTGGCTGGCAGAAGTTGAAGCAATGCGGACCCGCATTTTAGCAATGCGGCAAGAATTAGTTAATGTTCTGAATGCAGAAATCCCAGGTCGTAATTTTGATTATTTACTGCAACAGCGGGGTATGTTTAGCTATACCGGACTGAGCGCAGCACAGGTTGATCGTTTACGTGATGAATTTGGCGTTTATCTGATTGCAAGCGGTCGTATGTGTGTTGCGGGTCTGAATAGCGGTAATGTTCAGCGTGTTGCCAAAGCATTTGCAGCAGTTATGTAA。

实施例2：α-转氨酶CkTA基因突变体库的构建

1、突变引物设计

根据实施例1全基因合成所得密码子优化后的α-转氨酶基因(SEQ ID NO.2所示)，为了找到识别α-酮酸底物的关键活性位点，基于大肠杆菌中的γ-氨基丁酸氨基转移酶构建了CkTA的同源性模型，CkTA与底物进行对接模拟和丙氨酸扫描诱变，发现吡啶环结构夹在W131和A214之间，因此确定与稳定PLP有关的关键残基为第131位和214位残基，在这两个位置引入定点突变，采用QuikChange Primer Design(Agilent)进行定点突变设计(表1，下划线为突变碱基)。

表1、突变位点及引物序列

位点	引物序列
		W131Y-f	5’-CCGACC<u>TAT</u>GAAAATCATATTGCAA-3’
W131Y-r	5’-ATTTTC<u>ATA</u>GGTCGGATCACTAACC-3’
		A214V-f	5’-GATATT<u>GTT</u>TATCAAGGTTTTGGTGCGGG-3’
A214V-r	5’-ACCTTGATA<u>AAC</u>AATATCCAGAAAAGGG-3’
		A214I-f	5’-GATATTATTTATCAAGGTTTTGGTGCGG-3’
A214I-r	5’-TTGATAAATAATATCCAGAAAAGGGA-3’
		A214L-f	5’-GATATTTTTTATCAAGGTTTTGGTGC-3’
A214L-r	5’-TTGATAAAAAATATCCAGAAAAGGGAT-3’

2、重组基因工程突变菌株

首先以重组载体pET28b/CkTA为模板，利用表1引物，采用QuikChange诱变试剂盒(购自Vazyme，中国南京)，利用PCR技术进行定点突变，分别得到重组质粒CkTA-W131Y(氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示)，CkTA-A214V(氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示)，CkTA-A214I，CkTA-A214L。然后以重组质粒CkTA-W131Y为模板，以上述引物A214V-f和A214V-r为引物，得到重组质粒CkTA-W131Y/A214V(氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示)。

PCR反应体系如下(总体积50μL)：10×DNA Polymerase Buffer 25μL，10mMdNTPmixture(dATP、dCTP、dGTP和dTTP各2.5mM)2μL，浓度均为50μM的正向引物、反向引物各1μL，模板DNA 1μL，DNA Polymerase 2μL，ddH₂O 18μL。

采用BioRad的PCR仪，PCR反应条件：预变性95℃5min，95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸6min，共30个循环，最后72℃延伸10min。

PCR产物进行DNA琼脂糖凝胶电泳阳性验证(如图2)，条带单一，大小符合理论值，将PCR产物在37℃，200r/min下进行DpnI酶消化模板1小时，用DNA回收纯化试剂盒(购自Axygen公司)对扩增产物进行纯化，具体步骤参照纯化试剂盒说明书。

取5μL纯化后的PCR产物，加入100μL冰浴的E.coli BL21(DE3)感受态细胞悬液中，冰上静置15min，将转化产物于42℃热击90s，迅速置于冰上冷却5min，向管中加入600μL的LB液体培养基，37℃，200r/min培养60min，取100μL上述菌液均匀涂布于含有终浓度50μg/mL卡那霉素的LB固体培养基，待菌液完全被培养基吸收后，37℃倒置培养12h，挑取单菌落验证为阳性克隆后，接种至含有50μg/mL卡那霉素的LB试管培养基，37℃，200r/min培养12h，获得重组基因工程突变菌株E.coli BL21(DE3)/pET28b/CkTA-W131Y，E.coli BL21(DE3)/pET28b/CkTA-A214V、E.coli BL21(DE3)/pET28b/CkTA-A214I、E.coli BL21(DE3)/pET28b/CkTA-A214L，E.coli BL21(DE3)/pET28b/CkTA-W131Y/A214V。

实施例3：α-转氨酶的诱导表达

将实施例1中的出发菌株E.coli BL21(DE3)/pET28b/CkTA和实施例2中的突变菌株E.coli BL21(DE3)/pET28b/CkTA-W131Y，E.coli BL21(DE3)/pET28b/CkTA-A214V、E.coli BL21(DE3)/pET28b/CkTA-A214I、E.coli BL21(DE3)/pET28b/CkTA-A214L、E.coliBL21(DE3)/pET28b/CkTA-W131Y/A214V分别接种至含有终浓度50μg/mL卡那霉素抗性的LB液体培养基，37℃、200rpm下培养9h，培养液再以体积浓度1％接种量接种至新鲜的含有终浓度50μg/mL卡那霉素抗性的LB液体培养基中，于37℃、150rpm下培养至菌体OD₆₀₀达0.6～0.8，加入终浓度为0.1mM的IPTG诱导转氨酶蛋白表达，28℃下诱导培养12h后，4℃、8000rpm离心10min，弃去上清液，收集湿菌体，即获得含有表达重组质粒的重组大肠杆菌E.coliBL21(DE3)/pET28b/CkTA及其突变体的湿菌体，该菌体可直接作为生物催化剂或者用于蛋白纯化。

实施例4：α-转氨酶的超声破碎

分别取实施例3方法制备的各个湿菌体1g悬浮在10mL的50mMTris-HCl缓冲液(pH8.5)中，超声破碎细胞。破碎条件：超声35W，超声2s，间歇2s，有效时间为10min，破碎过程置于冰浴中完成。4℃，8000rpm离心10min，获得上清液，即为转氨酶CkTA及其突变体的粗酶液，SDS-PAGE图见图3的泳道1-泳道4。

实施例5：α-转氨酶的蛋白纯化

采用蛋白层析仪系统(Biologic LP)，选用Ni-NTA亲和柱(40×12.6mm，Bio-Rad，USA)分离纯化实施例4制备的重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET28b/CkTA及其突变体的粗酶液作为上样液，纯化步骤如下:

(1)缓冲液配置：

缓冲液A(Binding buffer)：20mM Na₂HPO₄-NaH₂PO₄，300mMNaCl，pH 8.5，增加洗脱柱对核酸的结合活性；

缓冲液B(Elution buffer)：20mM Na₂HPO₄-NaH₂PO₄，300mMNaCl，500mM咪唑，pH8.5，把DNA从柱子上洗脱下来；

缓冲液C(Washing buffer)：20mM Na₂HPO₄-NaH₂PO₄，300mMNaCl，20mM咪唑，pH8.5，洗掉柱子里除核酸物质以外的杂质；缓冲液于冰浴中预冷。

(2)装柱平衡：将Ni-NTA柱安装在蛋白层析仪系统(Biologic LP)，先用超纯水冲洗整个系统，再用缓冲液A冲洗Ni-NTA柱，流速为2mL/min，直至蛋白层析仪标线平稳不变；

(3)上样：将粗酶液以2mL/min的流速泵入步骤(2)的Ni-NTA柱，上样量为10mL，注意不要进入气泡；

(4)杂蛋白洗脱：步骤(3)上样结束后，用缓冲液C以2mL/min的流速洗脱10个柱体积，除去未结合完全的蛋白；

(5)洗脱目的蛋白：步骤(4)洗脱结束后，用缓冲液B以2mL/min的速度洗脱10个柱体积，洗脱目的蛋白，根据蛋白层析仪紫外检测器的信号响应检测OD₂₈₀的值，当OD₂₈₀到达0.25并上升时开始收集洗脱液，OD₂₈₀降为0.25时停止收集；

(6)透析：步骤(5)收集的洗脱液于透析袋(MD44，MW：8000)在pH 8.5，4℃，PBS缓冲液中透析24h，每6h换一次缓冲液，截留液即为纯酶液，4℃低温保存。透析袋要在沸水中煮几次，除掉污染在袋上的核酸酶和蛋白水解酶，保存在无水乙醇中，防止染菌。

对获得的目的蛋白进行SDS-PAGE，结果如图3中泳道5-泳道8所示，α-转氨酶CkTA及其突变体蛋白在大肠杆菌中表达，单一条带，该转氨酶理论分子量为43.38kDa。

实施例6：α-转氨酶及其突变体酶活测定

(1)酶活检测标准条件：20mM2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸(PPO)，100mM L-谷氨酸(L-Glu)，1mM磷酸吡哆醛(PLP)，2μL实施例5方法制备的各个纯酶液，pH 8.5、0.05M的Tris-HCl缓冲液为反应介质构成1mL反应体系，于35℃、600rpm反应5min，加入5μL 6M的HCl水溶液终止反应。

(2)衍生化试剂：使用0.1M硼酸盐缓冲液(pH 9.8)将含有0.1g邻苯二甲醛和0.12gN-乙酰基-L-半胱氨酸的10mL无水乙醇溶液稀释至50mL。

(3)酶活检测：将步骤(1)反应液经12000rpm，4℃离心1min，取100μL上清液用900μL超纯水稀释后，取200μL稀释液与衍生化试剂按体积比1：2混合，并在30℃下衍生化反应5min，然后经0.22μm膜过滤后，滤液采用HPLC检测分析底物PPO和产物L-PPT的浓度，分别计算PPO的转化率和L-PPT的产率。

酶活单位(U)定义：在上述标准条件下，每分钟生成1μmol L-PPT所需的酶量定义为1U。比酶活定义为每毫克酶蛋白所具有的活力单位数，为U/(mg protein)。

α-转氨酶酶活如表2所示，结果表明突变体Mut-W131Y、Mut-A214V和Mut-W131Y/A214V的酶活相比出发菌株分别提高了1.5倍、2.8倍和3.7倍。

表2：α-转氨酶酶活测定

底物PPO液相检测条件：色谱柱

C18(4.6×250mm，Acchrom,China)柱，流动相：50mM磷酸二氢铵溶液(pH 3.8，含10％四丁基氢氧化铵)与乙腈的体积比为88:12。流速为1mL/min，检测波长为232nm，进样量10μL，柱温30℃，2-羰基-4-(羟基甲基氧膦基)-丁酸保留时间为9.7分钟。

产物L-PPT液相检测条件：采用配备荧光检测器的LC-U3000液相色谱仪，色谱柱

C18柱(4.6×250mm，Acchrom，China)；流动相：甲醇：0.05M乙酸铵(pH 5.7)，体积比为10：90；流速1.0mL/min；检测波长Ex＝340nm、Em＝450nm；进样量10μL；柱温35℃。L-PPT、D-PPT的保留时间分别为：10.6分钟，12.6分钟。

L-PPT非对映体过量e.e.值计算公式如下所示：

式中，C_L-PPT和C_D-PPT分别表示产物L-PPT和D-PPT的摩尔浓度，mol/L。

实施例7：确定催化α-转氨酶突变体的最适底物浓度

一个高的底物浓度的催化过程可有效简化产物的回收，降低整个反应过程成本，但是，过高的底物浓度又可能会抑制生物催化剂的活性。

将实施例5方法制备的E.coli BL21(DE3)/pET28b-CkTA-W131Y/A214V纯酶液作为催化用酶，测定酶的最适反应底物浓度，反应体系(1mL)组成：加入不同终浓度(20mM、30mM、40mM、50mM、60mM、70mM、80mM、90mM、100mM)的底物PPO，100mM的L-Glu，1mM的PLP，4U/ml的纯酶，反应介质为pH 8.5、0.05M的Tris-HCl缓冲液。置于35℃、600rpm的恒温金属浴中反应5min，加入5μL 6M的HCl水溶液终止反应，采用实施例6所述的HPLC测定底物PPO和产物L-PPT的浓度，分别计算PPO的转化率和L-PPT的产率，结果见表3所示，结果表明α-转氨酶突变体E.coli BL21(DE3)/pET28b-CkTA-W131Y/A214V在底物PPO浓度为20～100mM的转化率范围为78.34～90.37％，产物对映体过量均大于99％，尤以20mM PPO最佳，此时转化率为96.37％。

表3不同底物浓度对转化率的影响

实施例8：确定催化α-转氨酶突变体的最适氨基供体浓度

由于氨基供体过量有利于推动转氨反应向正反应进行，但其浓度过高，不仅不利于实现反应的经济性，多余的氨基供体也需要更多的缓冲溶液来溶解，因此对于其用量，需要一个最适的值。

将实施例5方法制备的E.coli BL21(DE3)/pET28b-CkTA-W131Y/A214V纯酶液作为催化用酶，反应体系(1mL)组成：终浓度20mM的底物PPO，不同加入终浓度(30mM、40mM、50mM、60mM、70mM和80mM)的L-Glu，1mM PLP，4U/ml的纯酶，反应介质为pH 8.5、0.05M的Tris-HCl缓冲液。置于35℃、600rpm的恒温金属浴中反应5min，用5μL 6M的HCl水溶液终止反应，采用实施例6所述的HPLC测定底物PPO和产物L-PPT的浓度，分别计算PPO的转化率和L-PPT的产率，结果见表4所示，产物对映体过量均大于99％。结果表明，转氨酶突变体E.coli BL21(DE3)/pET28b-CkTA-W131Y/A214V的反应速率随着L-谷氨酸的浓度升高而提高，综合考虑全细胞催化体系反应的成本和L-PPT收率两种因素，尤以浓度达60mM时最佳，此时转氨酶催化反应趋势与浓度达到70mM时相同，且24h转化率均能达到89.36％。

表4不同氨基供体浓度对转化率的影响

实施例9：确定催化α-转氨酶突变体的最适温度

将实施例5方法制备的E.coli BL21(DE3)/pET28b-CkTA-W131Y/A214V纯酶液作为催化用酶，反应体系(1mL)组成：终浓度20mM的底物PPO，60mM的L-Glu，1mM PLP，4U/ml的纯酶，反应介质为pH 8.5、0.05M的Tris-HCl缓冲液。置于不同温度(30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃)、600rpm的恒温金属浴中反应5min，用5μL 6M的HCl水溶液终止反应，采用实施例6所述的HPLC测定底物PPO和产物L-PPT的浓度，分别计算PPO的转化率和L-PPT的产率，结果见表5所示。结果表明，转氨酶突变体E.coli BL21(DE3)/pET28b-CkTA-W131Y/A214V在30-75℃，转化率范围为32.27～88.12％，产物对映体过量均大于99％，尤以55℃最佳，此时转化率为88.12％。

表5不同温度对转化率的影响

实施例10：确定催化α-转氨酶突变体的最适pH

将实施例5方法制备的E.coli BL21(DE3)/pET28b-CkTA-W131Y/A214V纯酶液作为催化用酶，反应体系(1mL)组成：终浓度20mM的底物PPO，60mM的L-Glu，1mM PLP，4U/ml的纯酶，反应介质为不同pH的缓冲液，其中反应介质为乙酸-乙酸钠(Acetate buffer，pH 5.0-6.0)，磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(PB buffer，pH 6.0-8.0)，Tris-盐酸缓冲液(Tris-HCl buffer，pH 7.0-9.0)。置于55℃、600rpm的恒温金属浴中反应5min，用5μL 6M的HCl水溶液终止反应，采用实施例6所述的HPLC测定测定底物PPO和产物L-PPT的浓度，分别计算PPO的转化率和L-PPT的产率，产物对映体过量均大于99％，结果见表6、表7和表8所示。

表6乙酸-乙酸钠缓冲体系不同pH对转化率的影响

表6结果表明乙酸-乙酸钠(Acetate buffer，pH 5.0-6.0)转化率范围为42.17～75.93％，尤以6.0最佳，此时转化率为75.93％。

表7磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲体系不同pH对转化率的影响

表7结果表明，磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(PB buffer，pH 6.0-8.5)转化率结果范围为65.92～89.14％，尤以pH 8.5最佳，此时转化率为89.14％。

表8Tris-盐酸缓冲液缓冲体系不同pH对转化率的影响

表8结果表明，Tris-盐酸缓冲液(Tris-HCl buffer，pH 7.0-9.0)转化率结果范围为73.14～93.5％，尤以pH 8.5最佳，此时转化率为93.5％。

E.coli BL21(DE3)/pET28b-CkTA-W131Y/A214V的最适缓冲体系为pH 8.5的Tris-盐酸缓冲液。

实施例11：辅酶PLP不同用量对α-转氨酶突变体酶活影响

将实施例5方法制备的E.coli BL21(DE3)/pET28b-CkTA-W131Y/A214V纯酶液作为催化用酶，反应体系(1mL)组成：终浓度20mM的底物PPO，60mM的L-Glu，加入不同浓度(0.02mM、0.04mM、0.06mM、0.08mM、1mM的PLP，4U/ml的纯酶，反应介质为pH 8.5、0.05M的Tris-HCl缓冲液。置于55℃、600rpm的恒温金属浴中反应5min，用5μL 6M的HCl水溶液终止反应，采用实施例6所述的HPLC测定底物PPO和产物L-PPT的浓度，分别计算PPO的转化率和L-PPT的产率，结果见表9所示，转化率结果范围为65.72～93.5％，产物对映体过量值均大于99％，尤以1mM PLP最佳，此时转化率为93.5％。

表9辅酶PLP不同用量对转化率的影响

由以上实验结果可知，本发明得到的含有转氨酶突变基因的重组大肠杆菌具有较强的转氨能力，可直接以含酶的菌体细胞为酶源进行生物催化反应，可以利用2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]-丁酸为底物，进行生物催化不对称合成高光学纯的农药——L-草铵膦。

序列表

<110> 浙江工业大学

<120> 一种α-转氨酶突变体及其在合成L-草铵膦中的应用

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 397

<212> PRT

<213> 柯氏柠檬酸杆菌(Citrobacter koseri)

<400> 1

Met Phe Gln Lys Val Asp Ala Tyr Ala Gly Asp Pro Ile Leu Ser Leu

1 5 10 15

Met Glu Arg Phe Lys Glu Asp Ser Arg Ser Asp Lys Val Asn Leu Ser

20 25 30

Ile Gly Leu Tyr Tyr Asn Glu Glu Gly Ile Ile Pro Gln Leu Lys Ala

35 40 45

Val Ala Glu Ala Glu Ala Arg Ile Asn Ala Gln Pro His Gly Ala Ser

50 55 60

Leu Tyr Leu Pro Met Glu Gly Leu Asn Thr Tyr Arg His Thr Ile Ala

65 70 75 80

Pro Leu Leu Phe Gly Ala Asp His Pro Val Leu Gln Gln Gln Arg Val

85 90 95

Ala Thr Ile Gln Thr Leu Gly Gly Ser Gly Ala Leu Lys Val Gly Ala

100 105 110

Asp Phe Leu Lys Arg Tyr Phe Pro Glu Ser Ala Val Trp Val Ser Asp

115 120 125

Pro Thr Trp Glu Asn His Ile Ala Ile Phe Glu Gly Ala Gly Phe Glu

130 135 140

Val Ser Thr Tyr Pro Trp Tyr Asp Asn Ala Thr Asn Gly Val Arg Phe

145 150 155 160

Asn Asp Leu Leu Ala Thr Leu Asn Thr Leu Pro Ala Arg Ser Ile Val

165 170 175

Leu Leu His Pro Cys Cys His Asn Pro Thr Gly Ala Asp Leu Thr His

180 185 190

Ser Gln Trp Asp Ala Val Ile Glu Ile Leu Lys Ala Arg Glu Leu Ile

195 200 205

Pro Phe Leu Asp Ile Ala Tyr Gln Gly Phe Gly Ala Gly Met Glu Asp

210 215 220

Asp Ala Tyr Ala Ile Arg Ala Ile Ala Ser Ala Gly Leu Pro Ala Leu

225 230 235 240

Val Ser Asn Ser Phe Ser Lys Ile Phe Ser Leu Tyr Gly Glu Arg Val

245 250 255

Gly Gly Leu Ser Val Val Cys Glu Asp Ala Glu Ala Ala Gly Arg Val

260 265 270

Leu Gly Gln Leu Lys Ala Thr Val Arg Arg Asn Tyr Ser Ser Pro Pro

275 280 285

Asn Phe Gly Ala Gln Val Val Ala Ala Val Leu Asn Asp Glu Ala Leu

290 295 300

Lys Ala Ser Trp Leu Ala Glu Val Glu Ala Met Arg Thr Arg Ile Leu

305 310 315 320

Ala Met Arg Gln Glu Leu Val Asn Val Leu Asn Ala Glu Ile Pro Gly

325 330 335

Arg Asn Phe Asp Tyr Leu Leu Gln Gln Arg Gly Met Phe Ser Tyr Thr

340 345 350

Gly Leu Ser Ala Ala Gln Val Asp Arg Leu Arg Asp Glu Phe Gly Val

355 360 365

Tyr Leu Ile Ala Ser Gly Arg Met Cys Val Ala Gly Leu Asn Ser Gly

370 375 380

Asn Val Gln Arg Val Ala Lys Ala Phe Ala Ala Val Met

385 390 395

<210> 2

<211> 856

<212> DNA

<213> 柯氏柠檬酸杆菌(Citrobacter koseri)

<400> 2

agccagaaag gagccagcgg ggaccgacag ccgaggagcg aaagaggacg cgcagcgaaa 60

agaaaagcag gcacacaacg aggagggaac cgcagcgaaa gccggcagaa gccgaagcac 120

gaaagcacag ccacagggcc agccgacgcc gaggaaggaa aaaccacgca caccagcacc 180

ccgagggcag acaccgggac agcagcaacg ggggcaacca ccaaacaagg aggagcgggc 240

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caagaaggcg ccggagaaga gaccaccggg agacaagcaa cgaaggggcg aagacgcggc 360

aacccgaaac ccgccggccc gagcagcgcg caccgggcaa accgaccggc gcagacgacc 420

caagcagggg agcggagaaa aaaagcaaga gaacgacccc ggaagccaca agggggcggg 480

gaggaagaga gcaagcaacg gcagcgagcg cgggcgccgg cacggcaaaa gcagcaaaac 540

cccgagggaa cggggggggc gagcggggga agagccgaag cagcaggcgg gaggcagcga 600

aggcaacgcg cgaaaagcag cccgccaagg gccaggggca gcggaaagag aagcgcgaag 660

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agaaacccag gcgaagaaac gcaacagcgg ggagagcaac cggacgagcg cagcacaggg 780

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aagcagcagc agagaa 856

<210> 3

<211> 397

<212> PRT

<213> 柯氏柠檬酸杆菌(Citrobacter koseri)

<400> 3

Met Phe Gln Lys Val Asp Ala Tyr Ala Gly Asp Pro Ile Leu Ser Leu

1 5 10 15

Met Glu Arg Phe Lys Glu Asp Ser Arg Ser Asp Lys Val Asn Leu Ser

20 25 30

Ile Gly Leu Tyr Tyr Asn Glu Glu Gly Ile Ile Pro Gln Leu Lys Ala

35 40 45

Val Ala Glu Ala Glu Ala Arg Ile Asn Ala Gln Pro His Gly Ala Ser

50 55 60

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65 70 75 80

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Asp Phe Leu Lys Arg Tyr Phe Pro Glu Ser Ala Val Trp Val Ser Asp

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Val Ser Thr Tyr Pro Trp Tyr Asp Asn Ala Thr Asn Gly Val Arg Phe

145 150 155 160

Asn Asp Leu Leu Ala Thr Leu Asn Thr Leu Pro Ala Arg Ser Ile Val

165 170 175

Leu Leu His Pro Cys Cys His Asn Pro Thr Gly Ala Asp Leu Thr His

180 185 190

Ser Gln Trp Asp Ala Val Ile Glu Ile Leu Lys Ala Arg Glu Leu Ile

195 200 205

Pro Phe Leu Asp Ile Ala Tyr Gln Gly Phe Gly Ala Gly Met Glu Asp

210 215 220

Asp Ala Tyr Ala Ile Arg Ala Ile Ala Ser Ala Gly Leu Pro Ala Leu

225 230 235 240

Val Ser Asn Ser Phe Ser Lys Ile Phe Ser Leu Tyr Gly Glu Arg Val

245 250 255

Gly Gly Leu Ser Val Val Cys Glu Asp Ala Glu Ala Ala Gly Arg Val

260 265 270

Leu Gly Gln Leu Lys Ala Thr Val Arg Arg Asn Tyr Ser Ser Pro Pro

275 280 285

Asn Phe Gly Ala Gln Val Val Ala Ala Val Leu Asn Asp Glu Ala Leu

290 295 300

Lys Ala Ser Trp Leu Ala Glu Val Glu Ala Met Arg Thr Arg Ile Leu

305 310 315 320

Ala Met Arg Gln Glu Leu Val Asn Val Leu Asn Ala Glu Ile Pro Gly

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Arg Asn Phe Asp Tyr Leu Leu Gln Gln Arg Gly Met Phe Ser Tyr Thr

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Gly Leu Ser Ala Ala Gln Val Asp Arg Leu Arg Asp Glu Phe Gly Val

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<212> DNA

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tgttgtcata atccgaccgg cgcagatctg acccatagtc agtgggatgc ggttattgaa 600

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<210> 5

<211> 397

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<213> 柯氏柠檬酸杆菌(Citrobacter koseri)

<400> 5

Met Phe Gln Lys Val Asp Ala Tyr Ala Gly Asp Pro Ile Leu Ser Leu

1 5 10 15

Met Glu Arg Phe Lys Glu Asp Ser Arg Ser Asp Lys Val Asn Leu Ser

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<210> 6

<211> 1194

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tgttgtcata atccgaccgg cgcagatctg acccatagtc agtgggatgc ggttattgaa 600

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gcaatgcggc aagaattagt taatgttctg aatgcagaaa tcccaggtcg taattttgat 1020

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<210> 7

<211> 397

<212> PRT

<213> 柯氏柠檬酸杆菌(Citrobacter koseri)

<400> 7

Met Phe Gln Lys Val Asp Ala Tyr Ala Gly Asp Pro Ile Leu Ser Leu

1 5 10 15

Met Glu Arg Phe Lys Glu Asp Ser Arg Ser Asp Lys Val Asn Leu Ser

20 25 30

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165 170 175

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210 215 220

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245 250 255

Gly Gly Leu Ser Val Val Cys Glu Asp Ala Glu Ala Ala Gly Arg Val

260 265 270

Leu Gly Gln Leu Lys Ala Thr Val Arg Arg Asn Tyr Ser Ser Pro Pro

275 280 285

Asn Phe Gly Ala Gln Val Val Ala Ala Val Leu Asn Asp Glu Ala Leu

290 295 300

Lys Ala Ser Trp Leu Ala Glu Val Glu Ala Met Arg Thr Arg Ile Leu

305 310 315 320

Ala Met Arg Gln Glu Leu Val Asn Val Leu Asn Ala Glu Ile Pro Gly

325 330 335

Arg Asn Phe Asp Tyr Leu Leu Gln Gln Arg Gly Met Phe Ser Tyr Thr

340 345 350

Gly Leu Ser Ala Ala Gln Val Asp Arg Leu Arg Asp Glu Phe Gly Val

355 360 365

Tyr Leu Ile Ala Ser Gly Arg Met Cys Val Ala Gly Leu Asn Ser Gly

370 375 380

Asn Val Gln Arg Val Ala Lys Ala Phe Ala Ala Val Met

385 390 395

<210> 8

<211> 1194

<212> DNA

<213> 柯氏柠檬酸杆菌(Citrobacter koseri)

<400> 8

atgttccaga aagttgatgc ctatgcgggt gatccgattc ttagcctgat ggagcgtttt 60

aaagaggatt cgcgcagcga taaagttaat ttaagcattg gtctttacta caacgaggag 120

ggtattattc cgcagctgaa agccgttgca gaagccgaag cacgtattaa tgcacagcca 180

catggtgcca gcctgtatct gccgatggaa ggattaaata cctatcgtca caccattgca 240

cccctgttat ttggtgcaga tcatccggtg ttacagcagc aacgggtggc aaccatccaa 300

acattaggag gtagcggtgc cctgaaagtt ggcgcagatt ttttaaaaag atactttcct 360

gagagcgcag tttgggttag tgatccgacc tatgaaaatc atattgcaat ttttgaaggc 420

gccggatttg aagttagtac ctatccgtgg tatgacaatg caacgaatgg ggttcgtttt 480

aatgatctgc tggcaaccct gaataccctg ccggcccgta gcattgttct gctgcatccg 540

tgttgtcata atccgaccgg cgcagatctg acccatagtc agtgggatgc ggttattgaa 600

attttaaaag caagagaact gatccctttt ctggatattg tttatcaagg ttttggtgcg 660

gggatggaag atgatgcata tgcaattcgt gctattgcga gcgcgggtct gccggcactg 720

gtttcaaata gctttagcaa aattttctcc ctgtatggtg aacgtgttgg ggggctgagc 780

gttgtgtgtg aagatgccga agcagcaggt cgggttttag gtcagctgaa ggcaactgtt 840

cgtcgtaatt atagcagccc gcctaatttt ggtgctcagg ttgttgcagc ggttttaaat 900

gatgaagcgc tgaaggcgag ttggctggca gaagttgaag caatgcggac ccgcatttta 960

gcaatgcggc aagaattagt taatgttctg aatgcagaaa tcccaggtcg taattttgat 1020

tatttactgc aacagcgggg tatgtttagc tataccggac tgagcgcagc acaggttgat 1080

cgtttacgtg atgaatttgg cgtttatctg attgcaagcg gtcgtatgtg tgttgcgggt 1140

ctgaatagcg gtaatgttca gcgtgttgcc aaagcatttg cagcagttat gtaa 1194

Claims

1.一种α-转氨酶突变体，其特征在于，所述α-转氨酶突变体是将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第131位或214位进行单突变或多突变获得的。

2.如权利要求1所述α-转氨酶突变体，其特征在于，所述转氨酶突变体是将SEQ IDNO.1所示氨基酸序列突变为下列之一：(1)第131位色氨酸突变为酪氨酸；(2)第214位丙氨酸突变为缬氨酸；(3)第131位色氨酸突变为酪氨酸且第214位丙氨酸突变为缬氨酸。

3.一种含权利要求1所述α-转氨酶突变体编码基因的表达载体。

4.一种含权利要求3所述表达载体的重组基因工程菌。

5.一种权利要求1所述α-转氨酶突变体在催化2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸不对称合成L-草铵膦中的应用。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述应用为：将含α-转氨酶突变体编码基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体，经过超声破碎、镍柱纯化后获得的纯酶液作为催化剂，以2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸为底物，加入氨基供体和辅酶，以pH值为6～9的缓冲液为反应介质构成反应体系，在30～75℃、600rpm条件下反应完全后，加入6M的HCl水溶液终止反应，反应液经分离纯化得到L-草铵膦；所述辅酶为5-磷酸吡哆醛，所述氨基供体为L-谷氨酸。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述反应体系中，催化剂加入量为1-10U/mL；辅酶用量为0.02～25mM、底物PPO的初始浓度为10～160mM，氨基供体加入量为30～100mM；所述反应介质为pH 8.5的50mM Tris-HCl缓冲液。

8.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述催化剂按如下方法制备：(1)湿菌体：将含有α-转氨酶突变体基因的工程菌接种至含有终浓度50μg/mL卡那霉素抗性的LB液体培养基，37℃、200rpm下培养9h，培养液再以体积浓度1％接种量接种至新鲜的含有终浓度50μg/mL卡那霉素抗性的LB液体培养基中，于37℃、150rpm下培养至菌体OD₆₀₀达0.6～0.8，加入终浓度为0.1mM的异丙基-β-硫代半乳糖苷，28℃下诱导培养12h后，4℃、8000rpm离心10min，弃去上清液，收集湿菌体；所述LB液体培养基组成：胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，溶剂为水，pH值7.0；(2)粗酶液：将步骤(1)湿菌体悬浮在pH 8.5、50mM Tris-HCl缓冲液中，超声破碎细胞10min，4℃，8000rpm离心10min，获得上清液，即为粗酶液；破碎条件：超声35W，超声2s，间歇2s；(3)采用Biologic LP蛋白层析仪系统和Ni-NTA亲和柱分离纯化步骤(2)获得的粗酶液：用超纯水冲洗Biologic LP蛋白层析仪系统和Ni-NTA亲和柱，流速为2mL/min，再用缓冲液A冲洗Ni-NTA柱，流速为2mL/min，直至蛋白仪标线平稳不变；将粗酶液以2mL/min的流速上样后，用缓冲液C以2mL/min的流速洗脱5-10个柱体积；再用缓冲液B以2mL/min的速度洗脱5-10个柱体积，根据紫外检测器的信号响应检测OD₂₈₀的值，当OD₂₈₀到达0.25并上升时开始收集洗脱液，OD₂₈₀降为0.25时停止收集洗脱液，将收集的洗脱液于透析袋中，在pH 8.5，4℃，PBS缓冲液中透析24h，每6h换一次缓冲液，截留液即为纯酶液；缓冲液A：20mM Na₂HPO₄-NaH₂PO₄，300mM NaCl，pH 8.5；缓冲液B：20mM Na₂HPO₄-NaH₂PO₄，300mMNaCl，500mM咪唑，pH 8.5；缓冲液C：20mM Na₂HPO₄-NaH₂PO₄，300mM NaCl，20mM咪唑，pH 8.5。