CN102016006A - 具有异丙醇生产能力的棒状细菌转化体 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种具有异丙醇生产能力的转化体，其特征在于，通过将下述(a)～(d)的基因导入棒状细菌而得到：(a)编码具有乙酰辅酶A乙酰转移酶(Acetyl-CoA acetyltransferase)活性的酶的外源性基因；(b)编码具有乙酰乙酰辅酶A：乙酸辅酶A转移酶(Acetoacetyl CoA:acetateCoA transferase)活性的酶的外源性基因；(c)编码具有乙酰乙酸脱羧酶(Aeetoacetate decarboxylase)活性的酶的外源性基因；(d)编码具有异丙醇脱氢酶(Isopropanol dehydrogenase)活性的酶的外源性基因。
Description
技术领域
本发明涉及异丙醇生产技术。更具体而言，涉及为赋予异丙醇生产功能而进行了特定的基因操作的棒状细菌的转化体和利用该转化体的高效的异丙醇制备技术。
背景技术
异丙醇作为涂料或油墨等的工业用溶剂以及各种工业原料，目前世界上每年大约生产180万吨，即使在日本每年也大约生产18万吨。另外，从异丙醇经过简单的脱水反应，可以转变为作为目前在日本年产310万吨的聚丙烯的原料的丙烯。
但是，所有这些制品都来自化石原油资源。
从全球变暖问题、化石资源枯竭问题以及近年来原油价格高涨问题等地球环境方面的问题考虑，另外，从降低重要化学制品原料资源的海外依赖度的观点考虑，都迫切需要开发利用与基本全部进口的原油资源不同的可再生资源制造能源和化学制品的方法。利用生物质等可再生资源高效制造异丙醇的技术是可以解决这些各种问题的策略之一。
关于利用微生物从生物质原料生成异丙醇的方法有如下报道：进行丙酮-丁醇发酵的一种梭菌除丁醇之外还同时生产异丙醇(异丙醇-丁醇发酵)。这是因为，通过表现该发酵模式的梭菌所具有的异丙醇脱氢酶的催化反应，丙酮被还原从而产生异丙醇。
近年来，在世界各国生物燃料的生产利用提高的过程中，作为利用丙酮-丁醇发酵得到的生物燃料，丁醇的生产研究再次受到关注，但这些都是以生产丁醇为主要目的的研究，而基本没有以生产异丙醇为目的研究。
迄今为止，作为生产异丙醇的细菌，报道了作为异丙醇-丁醇发酵菌而已知的梭菌属细菌、拜式梭菌(Clostridium beijerinckii)、金黄丁酸梭菌(Clostridium aurantibutyricum)等(非专利文献1)。
但是，利用梭菌属细菌的异丙醇生产存在以下的问题。
(1)利用梭菌属细菌进行的异丙醇-丁醇发酵以丁醇为主要发酵代谢产物，异丙醇的生产率低(异丙醇/丁醇生成比约为1/5-1/10)。
(2)梭菌属细菌在增殖和生产异丙醇的过程中需要绝对厌氧性条件。因此，需要在厌氧条件下进行培养，即，需要将培养装置内部用氮气等惰性气体等取代等繁杂的培养操作，并且由于增殖速度极其缓慢，因此与之相应的异丙醇生产速度低。为了解决这些问题，考虑利用增殖速度高的好氧性微生物，但是，具有高效生产异丙醇的能力、并且能在有氧条件下增殖的微生物(好氧性细菌或兼性厌氧细菌)还属未知。
(3)异丙醇-丁醇发酵中，在细胞增殖期生成乙酸和丁酸，在细胞增殖停止的稳定期中发酵培养液pH的酸性化成为向溶剂(异丙醇、丁醇)生成期转移的诱因，代谢系统发生大幅变化(代谢迁移(shift))从而生成异丙醇和丁醇。这样，发酵过程需要严密的控制，且从发酵开始后到生成异丙醇和丁醇之前需要花费时间。另外，这些梭菌会由于转移到孢子形成期而停止生成异丙醇和丁醇，有不能长时间持续生成等问题。
因此，期望进行解决这些问题的新型异丙醇生产微生物的创制和生产方法的开发。
作为使用梭菌属细菌的异丙醇生产技术，公开了如下所述的技术。
非专利文献1中公开了如下内容：拜式梭菌(Clostridium beijerinckii)除丁醇外还生成异丙醇，金黄丁酸梭菌(Clostridium aurantibutyricum)除丁醇和丙酮外还生成异丙醇。
另外，非专利文献2和非专利文献3中公开了将梭菌属细菌固定从而连续生产异丙醇的技术；非专利文献4中公开了使用具有凝聚性的梭菌属细菌来生产异丙醇的技术；非专利文献5中公开了在梭菌属细菌的异丙醇-丁醇发酵中，通过添加高分子树脂，吸附作为产物的异丙醇和丁醇从而减轻产物抑制的技术。但是，这些是以生产丁醇为主要目的的技术，并且，均为使用梭菌属细菌在厌氧条件下生产异丙醇的技术，对上述的(1)、(2)、(3)等中指出的问题，丝毫没有起到根本的解决作用。
另一方面，虽然不是异丙醇的生产技术，但作为使用梭菌属细菌生产丙酮-丁醇的技术，公开了以下的技术。
专利文献1中公开了通过调控与孢子形成相关的基因使孢子形成期延迟，从而提高丁醇生产的技术；专利文献2和非专利文献6中公开了在连续发酵法中，通过气提法来连续提取丁醇的技术；非专利文献7和非专利文献8中公开了将梭菌属细菌固定来生产丁醇的技术；非专利文献9中公开了在连续发酵法中使用高浓度的梭菌属细菌的菌体，并将菌体重复利用的技术。这些技术被认为也能够应用于使用梭菌属细菌的异丙醇-丁醇发酵中，但是均为使用梭菌属细菌在厌氧条件下进行的生产技术这一点没有任何改变，对于上述的问题丝毫没有起到从根本上解决的作用。
作为使用梭菌属细菌以外的微生物的异丙醇生产技术，有如下技术。
本发明人已经提出了使用大肠杆菌(Escherichia coli)作为宿主的异丙醇生产技术(专利文献3和非专利文献10)。非专利文献11公开了将选自丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)、大肠杆菌(Escherichia coli)、拜式梭菌(Clostridium beijerinckii)和布氏热厌氧杆菌(Thermoanaerobacter brockii)的微生物来源的编码乙酰辅酶A乙酰转移酶、乙酰乙酰辅酶A：乙酸辅酶A转移酶、乙酰乙酸脱羧酶和异丙醇脱氢酶的基因在作为宿主的大肠杆菌(Escherichia coli)内进行表达从而生产异丙醇的技术。
但是，上述技术中，为了能够使用微生物更高效地生产异丙醇，还存在改善的余地。
专利文献1：PCT公开公报WO2006007530
专利文献2：美国公开专利公报US 2005089979
专利文献3：日本特愿2007-222633
非专利文献1：Applied and Environmental Microbiology，Vol.45，1983，p1160-1163.
非专利文献2：Enzyme and Microbial Technology，Vol.5，1983，p46-54.
非专利文献3：Biotechnology and Bioengineering，Vol.39，1992，p148-156.
非专利文献4：Applied Microbiology and Biotechnology，Vol.32，1989，p22-26.
非专利文献5：Applied Microbiology and Biotechnology，Vol.25，1986，p29-31.
非专利文献6：Bioprocess and Biosystems Engineering，Vol.27，2005，p207-214.
非专利文献7：Pakistan Journal of Biological Sciences，Vol.9，2006，p1923-1928.
非专利文献8：Applied Biochemistry and Biotechnology，Vol.113-116，2004，p887-898.
非专利文献9：Journal of Biotechnol，Vol.120，p197-206.
非专利文献10：Applied Microbiology and Biotechnology，Vol.77，2008，p1219-1224.
非专利文献11：Applied and Environmental Microbiology，Vol.73，2007，p7814-7818.
发明内容
本发明的目的在于提供，能够以可再生资源为原料来生产异丙醇的重组微生物和能够使用该微生物高效制造异丙醇的方法。
本发明人为解决所述课题，进行了反复研究，结果发现，通过将编码具有乙酰辅酶A乙酰转移酶活性的酶的外源性基因、编码具有乙酰乙酰辅酶A：乙酸辅酶A转移酶活性的酶的外源性基因、编码具有乙酰乙酸脱羧酶活性的酶的外源性基因、和编码具有异丙醇脱氢酶活性的酶的外源性基因导入到棒状细菌中而创制的转化体可高效生产异丙醇。
根据本发明的使用棒状细菌作为宿主的技术，与使用大肠杆菌作为宿主的技术相比，可以发现若干优良特征。
大肠杆菌(Escherichia coli)在3.5％的异丙醇存在下就不能增殖，与此相对，棒状细菌即使在5％的异丙醇存在下也能够增殖，棒状细菌与大肠杆菌(Escherichia coli)相比，对异丙醇具有更高的耐受性(参见后述实施例)。这表明在进行高浓度的异丙醇生产时，作为宿主，棒状细菌优于大肠杆菌(Escherichia coli)。即，能够以高浓度生产异丙醇这一点意味着从发酵液中回收纯化异丙醇所需的能量少，作为工业上的制造方法具有高优越性。
另外，本发明人目前已经公开了使基因重组型谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)在还原条件下的反应液中反应，从而在增殖抑制的状态下高效生产乳酸、琥珀酸或乙醇的技术(专利第3869788号)。
此次，本发明人发现，本发明的基因重组型棒状细菌在增殖抑制条件下可高效地生产异丙醇(参见后述的实施例)。
该发现意味着物质生产中使用的碳质的流向专一地朝向目标产物，而不用于增殖。并且还意味着伴随增殖分裂而产生的分泌物实现了实质性的抑制。该发现也使本发明的利用重组型棒状细菌的异丙醇生产技术成为高效、低能耗型的回收纯化方法。
因此，通过重组技术赋予棒状细菌异丙醇生产能力，是比利用重组型大肠杆菌等、与增殖相伴地生产异丙醇的技术更高效的技术。
本发明是基于上述见解完成的，提供以下的微生物及使用该微生物的异丙醇制造方法。
(1)一种具有异丙醇生产能力的转化体，其特征在于，通过将下述(a)～(d)的基因导入棒状细菌而得到，
(a)编码具有乙酰辅酶A乙酰转移酶(Acetyl-CoA acetyltransferase)活性的酶的外源性基因；
(b)编码具有乙酰乙酰辅酶A：乙酸辅酶A转移酶(Acetoacetyl CoA:acetate CoA transferase)活性的酶的外源性基因；
(c)编码具有乙酰乙酸脱羧酶(Acetoacetate decarboxylase)活性的酶的外源性基因；
(d)编码具有异丙醇脱氢酶(Isopropanol dehydrogenase)活性的酶的外源性基因。
(2)如上述(1)所述的转化体，其中，
使用在严格条件下与具有序列编号13的碱基序列的DNA、或具有与序列编号13的碱基序列的DNA互补的碱基序列的DNA杂交，并且编码具有乙酰辅酶A乙酰转移酶活性的多肽的DNA，作为(a)编码具有乙酰辅酶A乙酰转移酶活性的酶的外源性基因；
使用在严格条件下与具有序列编号14的碱基序列的DNA、或具有与序列编号14的碱基序列的DNA互补的碱基序列的DNA杂交，并且编码具有乙酰乙酰辅酶A：乙酸辅酶A转移酶活性的多肽的DNA，作为(b)编码具有乙酰乙酰辅酶A：乙酸辅酶A转移酶活性的酶的外源性基因；
使用在严格条件下与具有序列编号15的碱基序列的DNA、或具有与序列编号15的碱基序列的DNA互补的碱基序列的DNA杂交，并且编码具有乙酰乙酸脱羧酶活性的多肽的DNA，作为(c)编码具有乙酰乙酸脱羧酶活性的酶的外源性基因；
使用在严格条件下与具有序列编号16的碱基序列的DNA、或具有与序列编号16的碱基序列的DNA互补的碱基序列的DNA杂交，并且编码具有异丙醇脱氢酶活性的多肽的DNA，作为(d)编码具有异丙醇脱氢酶活性的酶的外源性基因。
(3)上述(1)或(2)所述的转化体，其中，
(a)编码具有乙酰辅酶A乙酰转移酶活性的酶的外源性基因、(b)编码具有乙酰乙酰辅酶A：乙酸辅酶A转移酶活性的酶的外源性基因、(c)编码具有乙酰乙酸脱羧酶活性的酶的外源性基因、和(d)编码具有异丙醇脱氢酶活性的酶的外源性基因，相同或不同，为来源于选自由丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)、大肠杆菌(Escherichia coli)、赤红球菌(Rhodococcus ruber)、拜式梭菌(Clostridium beijerinckii)、金黄丁酸梭菌(Clostridium aurantibutyricum)、糖乙酸多丁醇梭菌(Clostridium saccharoperbutylacetonicum)、糖丙酮丁醇梭菌(Clostridium saccharoacetobutylicum)、巴氏芽孢梭菌(Clostridium pasteurianum)、生孢梭菌(Clostridium sporogenes)、尸毒梭菌(Clostridium cadaveris)、假破伤风梭菌(Clostridium tetanomorphum)和真氧产碱杆菌(Ralstonia eutropha)组成的组中的微生物的基因。
(4)上述(1)～(3)中任一项所述的转化体，其特征在于，(b)编码具有乙酰乙酰辅酶A：乙酸辅酶A转移酶活性的酶的外源性基因是大肠杆菌(Escherichia coli)来源的基因，和/或(d)编码具有异丙醇脱氢酶活性的酶的外源性基因是赤红球菌(Rhodococcus ruber)来源的基因。
(5)上述(1)～(4)中任一项所述的转化体，其特征在于，棒状细菌选自由棒杆菌属细菌、短杆菌属细菌和节杆菌属细菌组成的组。
(6)谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ISO1转化体(保藏编号NITE BP-561)、或谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ISO2转化体(保藏编号NITE BP-562)。
(7)一种制造异丙醇的方法，包括将上述(1)～(6)中任一项所述的转化体在含有糖类的培养基中进行培养的步骤，和从培养物中回收异丙醇的步骤。
发明效果
本发明的转化体可以极其有效地从糖类生产异丙醇。
根据本发明，能够以可再生资源为原料高效地生产异丙醇，并能够构建新型的不依赖于石油资源原料的异丙醇工业生产方法。
附图说明
图1是表示实施例1的第(2)项中制作的质粒pCRA725-SSI11-ACE的制作方法的示意图。
图2是表示实施例1的第(2)项中制作的质粒pCRC204的示意图。
图3是表示异丙醇存在下的大肠杆菌(Escherichia coli)JM109/pCRC202和谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ISO2的增殖曲线的图。
具体实施方式
以下对本发明进行详细说明。
(I)具有异丙醇生产能力的转化体
本发明的具有异丙醇生产能力的转化体是将以下的(a)～(d)的基因导入到棒状细菌而得到的转化体：
(a)编码具有乙酰辅酶A乙酰转移酶活性的酶的外源性基因；
(b)编码具有乙酰乙酰辅酶A：乙酸辅酶A转移酶活性的酶的外源性基因；
(c)编码具有乙酰乙酸脱羧酶活性的酶的外源性基因；
(d)编码具有异丙醇脱氢酶活性的酶的外源性基因。
宿主
本发明中作为转化对象的宿主，只要是经含有异丙醇生产相关基因群的重组载体进行转化，并表达这些基因所编码的异丙醇生产相关酶从而可以生产异丙醇的棒状细菌，则没有特别限定。
棒状细菌是指《伯杰氏细菌学鉴定手册》[Bargeys Manual of Determinative Bacteriology、第8卷、599(1974)]所定义的一群微生物，主要能在通常的有氧条件下增殖，则没有特别限定。具体示例可以列举：棒杆菌属细菌、短杆菌属细菌、节杆菌属细菌、分枝杆菌属细菌或细球菌属细菌等。
另外，作为棒状细菌，具体而言，作为棒杆菌属细菌可以列举：谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)R(FERM P-18976)、ATCC13032、ATCC13058、ATCC13059、ATCC13060、ATCC13232、ATCC13286、ATCC13287、ATCC13655、ATCC13745、ATCC13746、ATCC13761、ATCC14020或ATCC31831等。
作为短杆菌属细菌可以列举：乳糖发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)ATCC13869、黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)MJ-233(FERM BP-1497)或者MJ-233AB-41(FERM BP-1498)、或产氨短杆菌(Brevibacterium ammoniagenes)ATCC6872等。
作为节杆菌属细菌可以列举：球形节杆菌(Arthrobacter globiformis)ATCC8010、ATCC4336、ATCC21056、ATCC31250、ATCC31738或ATCC35698等。
作为分枝杆菌属细菌可以列举：牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)ATCC19210或ATCC27289等。
作为细球菌属细菌可以列举：弗氏微球菌(Micrococcus freudenreichii)239号(FERM P-13221)、藤黄微球菌(Micrococcus luteus)240号(FERM P-13222)、脲微球菌(Micrococcus ureae)IAM1010或玫瑰色微球菌(Micrococcus roseus)IFO3764等。
另外，这些棒状细菌除野生株以外，还可以是其突变株或人工基因重组体。例如，作为这样的棒状细菌可以列举：乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase)基因阻断(破壊)株、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyruvate carboxylase)基因阻断株、苹果酸脱氢酶(malate dehydrogenase)基因阻断株等。
作为本发明中的宿主的棒状细菌，优选棒杆菌属细菌，特别优选谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)R(FERM P-18976)。
异丙醇生产相关基因
作为上述(a)～(d)的异丙醇生产相关基因，如果含有这些基因的DNA片段的碱基序列已知，则可以使用按照该序列合成的DNA片段。即使在DNA序列未知的情况下，也可以基于异丙醇生产相关酶蛋白间的保守氨基酸序列，通过杂交法、PCR法来获取片段。还可以使用基于其它已知异丙醇生产相关基因序列而设计的混合引物，通过简并PCR来获取片段。
上述(a)～(d)的异丙醇生产相关基因只要可以保持异丙醇生产活性，则碱基序列的一部分可以取代为其它碱基，也可以删除，还可以插入新的碱基，另外碱基序列的一部分也可以发生转座。这些衍生物中的任何一种都可以用于本发明。上述“一部分”，例如以氨基酸残基换算，可以为1至数个(通常为1-5个，优选为1-3个，更优选为1-2个)。
上述(a)～(d)的基因通常在异丙醇生产菌中具有。作为生产异丙醇的细菌，可以列举作为丁醇-异丙醇发酵菌而已知的梭菌属细菌、拜式梭菌(Clostridium beijerinckii)、金黄丁酸梭菌(Clostridium aurantibutyricum)等[Geprge，H.A.等，Acetone，Isopropanol，and Butanol Production by Clostridium beijerinckii(syn.Clostridium butylicum)and Clostridium aurantibutyricum.Appl.Environ.Microbiol.45：1160-1163(1983)]，已经报道了从乙酰辅酶A通过四步反应可以生成异丙醇[Mitchell，W.J.，Physiology of carbohydrate to solvent conversion by clostridia.Adv.Microb.Physiol.39：31-130(1998)]。
这些梭菌属细菌中的异丙醇生成路径，即从乙酰辅酶A到异丙醇的代谢路径，具体而言，由催化从乙酰辅酶A到乙酰乙酰辅酶A的反应的乙酰辅酶A乙酰转移酶(Acetyl-CoA acetyltransferase)(别名硫解酶(Thiolase))(以下，将其基因记为“thl”，将酶记为“THL”)、催化从乙酰乙酰辅酶A到乙酰乙酸的反应的乙酰乙酰辅酶A：乙酸辅酶A转移酶(Acetoacetyl CoA:acetate CoA transferase)(以下，将其基因记为“atoAD”，将酶记为“CTF”)、催化从乙酰乙酸到丙酮的反应的乙酰乙酸脱羧酶(Acetoacetate decarboxylase)(以下，将其基因记为“adc”，将酶记为“ADC”)、和催化从丙酮到异丙醇的反应的异丙醇脱氢酶(Isopropanol dehydrogenase)(别名伯-仲醇脱氢酶(Primary-secondary alcohol dehydrogenase))(以下，将其基因记为“adh”，将酶记为“ADH”)所构成。
在本发明中使用该代谢系统。另外，只要具有异丙醇生成功能，则上述(a)～(d)的基因的来源微生物的种类、组合及顺序等没有限制。
另外，上述(a)～(d)的基因也可以从不具有异丙醇生产能力的细菌中获取。具体而言，可以列举以下的示例。
梭菌属细菌不生产异丙醇，但报道了进行丁醇-丙酮发酵的丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)、糖乙酸多丁醇梭菌(Clostridium saccharoperbutylacetonicum)、糖丙酮丁醇梭菌(Clostridium saccharoacetobutylicum)、巴氏芽孢梭菌(Clostridium pasteurianum)、生孢梭菌(Clostridium sporogenes)、尸毒梭菌(Clostridium cadaveris)、假破伤风梭菌(Clostridium tetanomorphum)等[Geprge，H.A.等，Acetone，Isopropanol，and Butanol Production by Clostridium beijerinckii(syn.Clostridium butylicum)and Clostridium aurantibutyricum.Appl.Environ.Microbiol.45：1160-1163(1983)]。据报道，这些进行丁醇-丙酮发酵的梭菌属细菌为了生成丙酮，具有编码从乙酰辅酶A到丙酮的三个步骤的酶(THL、CTF和ADC)的基因[Nolling，J.等，Genome sequence and comparative analysis of the solvent-producing bacterium Clostridiumacetobutylicum.J.Bacteriol.183：4823-4838]。因此，可以分别使用上述进行丁醇-丙酮发酵的梭菌属细菌来源的编码THL的基因、编码CTF的基因和编码ADC的基因来代替进行丁醇-异丙醇发酵的拜式梭菌(Clostridium beijerinckii)、金黄丁酸梭菌(Clostridium aurantibutyricum)等来源的编码THL的基因、编码CTF的基因和编码ADC的基因，或者与这些基因中的一种或两种以上一起使用。
另外，目前，通过对超过600种的生物物种进行基因组解析，并通过与基因数据库进行同源性检索，能够容易地提取多种生物物种来源的目的基因的信息和分离该基因。因此，也能够容易地分离出上述梭菌属细菌以外的生物物种来源的编码THL的基因、编码CTF的基因、编码ADC的基因和编码ADH的基因。以与上述梭菌属细菌来源的异丙醇生产相关基因具有较高同源性的基因为例，作为编码THL的基因，可以列举：产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、破伤风梭菌(Clostridium tetani)、克氏梭菌(Clostridium kluyveri)、丁酸梭菌(Clostridium butyricum)、诺氏梭菌(Clostridium novyi)、肉毒梭菌(Clostridium botulinum)、热解糖梭菌(Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum)、サ一モシナス カルボキシデイボランス(Thermosinus carboxydivorans)、艰难梭菌(Clostridium difficile)、生氢氧化碳嗜热菌(Carboxydothermus hydrogenoformans)、腾冲嗜热厌氧杆菌(Thermoanaerobacter tengcongensis)、还原脱硫肠状菌(Desulfotomaculum reducens)、海洋螺菌属细菌(Oceanospirillum sp.)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)等来源的编码THL的基因。
作为编码CTF的基因，可以列举：腾冲嗜热厌氧杆菌(Thermoanaerobacter tengcongensis)、大肠杆菌(Escherichia coli)K12等来源的编码CTF的基因。
作为编码ADC的基因，可以列举：红色糖多孢菌(Saccharopolyspora erythraea)、黑胡桃链霉菌(Streptomyces nogalater)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、除虫链霉菌(Streptomyces avermitilis)等来源的编码ADC的基因。
作为编码ADH的基因，可以列举：赤红球菌(Rhodococcus ruber)、产乙醇热厌氧杆菌(Thermoanaerobacter ethanolicus)、腾冲嗜热厌氧杆菌(Thermoanaerobacter tengcongensis)、布氏热厌氧杆菌(Thermoanaerobacter brockii)、サ一モシナス カルボキシデイボランス(Thermosinus carboxydivorans)、巴氏甲烷八叠球菌(Methanosarcina barkeri)等来源的编码ADH的基因。
因此，只要各自显示出相同的酶催化反应，就可以使用例如在此列举的其它生物物种来源的编码THL的基因、编码CTF的基因、编码ADC的基因和编码ADH的基因来代替上述进行丁醇-异丙醇发酵或丁醇-丙酮发酵的梭菌属细菌来源的编码THL的基因、编码CTF的基因、编码ADC的基因和编码ADH的基因，或者与这些基因中的一种或两种以上一起使用。
在本发明中，作为上述(a)～(d)的基因，优选分别使用来源于选自由丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)、大肠杆菌(Escherichia coli)、赤红球菌(Rhodococcus ruber)、拜式梭菌(Clostridium beijerinckii)、金黄丁酸梭菌(Clostridium aurantibutyricum)、糖乙酸多丁醇梭菌(Clostridium saccharoperbutylacetonicum)、糖丙酮丁醇梭菌(Clostridium saccharoacetobutylicum)、巴氏芽孢梭菌(Clostridium pasteurianum)、生孢梭菌(Clostridium sporogenes)、尸毒梭菌(Clostridium cadaveris)、假破伤风梭菌(Clostridium tetanomorphum)和真氧产碱杆菌(Ralstonia eutropha)组成的组中的相同或不同的微生物的编码THL的基因、编码CTF的基因、编码ADC的基因和编码ADH的基因。
在本发明中，上述(b)的基因优选为大肠杆菌(Escherichia coli)来源的基因，和/或(d)的基因优选为赤红球菌(Rhodococcus ruber)来源的基因。
在本发明中，作为上述(a)～(d)的基因，最优选使用丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)来源的编码THL、ADC的各基因、大肠杆菌(Escherichia coli)来源的编码CTF的基因和赤红球菌(Rhodococcus ruber)来源的编码ADH的基因。
在本发明中，还优选：
使用在严格条件下与具有序列编号13的碱基序列的DNA、或具有与序列编号13的碱基序列的DNA互补的碱基序列的DNA杂交，并且编码具有乙酰辅酶A乙酰转移酶活性的多肽的DNA，作为(a)编码具有乙酰辅酶A乙酰转移酶活性的酶的外源性基因；
使用在严格条件下与具有序列编号14的碱基序列的DNA、或具有与序列编号14的碱基序列的DNA互补的碱基序列的DNA杂交，并且编码具有乙酰乙酰辅酶A：乙酸辅酶A转移酶活性的多肽的DNA，作为(b)编码具有乙酰乙酰辅酶A：乙酸辅酶A转移酶活性的酶的外源性基因；
使用在严格条件下与具有序列编号15的碱基序列的DNA、或具有与序列编号15的碱基序列的DNA互补的碱基序列的DNA杂交，并且编码具有乙酰乙酸脱羧酶活性的多肽的DNA，作为(c)编码具有乙酰乙酸脱羧酶活性的酶的外源性基因；
使用在严格条件下与具有序列编号16的碱基序列的DNA、或具有与序列编号16的碱基序列的DNA互补的碱基序列的DNA杂交，并且编码具有异丙醇脱氢酶活性的多肽的DNA，作为(d)编码具有异丙醇脱氢酶活性的酶的外源性基因。
序列编号13和15的碱基序列的DNA是丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)来源的基因。另外，序列编号13是编码THL的thl基因的碱基序列；序列编号15是编码ADC的adc基因的碱基序列。序列编号14的碱基序列的DNA是大肠杆菌(Escherichia coli)来源的基因。另外，序列编号14是编码CTF的atoAD基因的碱基序列。序列编号16的碱基序列的DNA是赤红球菌(Rhodococcus ruber)来源的基因。另外，序列编号16是编码ADH的adh基因的碱基序列。
本发明中，“严格条件”是指通常的条件，例如《分子克隆实验室手册》(Molecular Cloning，A Laboratory Manual)，第二版，1989，第二卷，p11.45等所记载的条件。具体而言，是指在比完全杂交的解链温度(Tm)低5～10℃的温度下发生杂交的情况。
此处，更优选的“严格条件”是指，在序列间存在90％以上、更优选95％以上、特别优选98％以上的同源性时发生杂交的情况。这样的“严格条件”，记载于上述《分子克隆实验室手册》(Molecular Cloning，A Laboratory Manual)，第二版，冷泉港实验室出版社(1989)，特别是第11.45节“寡核苷酸引物的杂交条件”(Conditions for Hybridization of Oligonucleotide Probes)，此处可以使用记载的条件。
本发明中，碱基序列间的同源性是使用计算软件GENETYX(注册商标)Ver.8(基因公司制造)计算出的值。
另外，本发明中，与某一DNA在严格条件下杂交的DNA，例如，在严格条件下与具有与序列编号13的碱基序列的DNA互补的碱基序列的DNA杂交的DNA，优选与序列编号13的碱基序列具有约90％以上的序列同源性，更优选具有约95％以上的序列同源性，特别优选具有约98％以上的序列同源性。
作为用于通过PCR(polymerase chain reaction，聚合酶链式反应)法将各种生物来源的编码THL的外源性基因、编码CTF的外源性基因、编码ADC的外源性基因和编码ADH的外源性基因的各序列进行扩增的寡核苷酸引物组，可以列举以下引物组。作为这样的引物组，可以列举例如：用于扩增编码THL的基因的由序列编号1和2的碱基序列表示的引物组；用于扩增编码CTF的基因的由序列编号5和6的碱基序列表示的引物组；用于扩增编码ADC的基因的由序列编号3和4的碱基序列表示的引物组；用于扩增编码ADH的基因的由序列编号7和8的碱基序列表示的引物组等。
PCR法可以利用公知的PCR装置，例如热循环仪等。PCR的循环依照公知技术进行即可，例如，设变性、退火、延伸为一个循环，通常为10～100循环，优选约20～50循环。作为PCR的模板，使用从显示上述异丙醇生成路径的酶活性的微生物中分离出的DNA，通过PCR法，可以扩增分别编码THL、CTF、ADC和ADH的基因的cDNA。通过PCR法得到的基因可以导入到适当的克隆载体中。作为克隆方法，可以使用pGEM-T easy载体系统(Promega公司制造)、TOPO TA-克隆系统(Invitrogen公司制造)、Mighty克隆试剂盒(Takara公司制造)等可通过商业销售获得的PCR克隆系统等。另外，方法的一个示例在实施例中有详细记述，也可以基于已知的编码THL的基因、编码CTF的基因、编码ADC的基因和编码ADH的基因各自的碱基序列，通过使用恰当设计的合成引物作为模板的杂交法，来获得含有该区域的DNA片段。
载体的构建
接下来，将含有由PCR法得到的基因的克隆载体导入到微生物，例如大肠杆菌(Escherichia coli)JM109菌株等中，从而转化该菌株。将该转化后的菌株在含有适当抗生素(例如氨苄青霉素、氯霉素等)的培养基中进行培养，并从培养物中回收菌体。从回收的菌体中提取质粒DNA。质粒DNA的提取可以通过公知的技术进行，或者也可以使用市售的质粒提取试剂盒来简便地提取。作为市售的质粒提取试剂盒，可以列举QIAquick质粒纯化试剂盒(商品名：Qiaquick plasmid purification kit，QIAGEN公司制造)等。通过确定该提取的质粒DNA的碱基序列，可以确认编码THL的基因、编码CTF的基因、编码ADC的基因和编码ADH的基因的各序列。DNA碱基序列可以通过公知的方法，例如双脱氧末端终止法等进行确定。另外，也可以利用毛细管电泳系统，使用多荧光技术进行检测来确定碱基序列。另外，也可以使用DNA测序仪，例如ABI PRISM 3730xl DNA分析仪(应用生物系统公司制造)等来确定。
上述方法可以基于基因工程实验的常规方法来进行。各种微生物的载体和外源基因的导入及表达方法在很多实验书籍中都有记载，[例如，Sambrook，J.和Russel，D.W.，《分子克隆实验室手册》(Molecular Cloning，A Laboratory Manual)(第三版)，冷泉港实验室出版社(2001)；或Ausubel，F.等，最新分子生物学实验方法汇编(Current protocols in molecular biology)，Green Publishing and Wiley Interscience，纽约(1987)等]，因此可以按照这些记载进行载体的选择、基因的导入和表达。
种类广泛的启动子适合在本发明中使用。这样的启动子可以从包含酵母、细菌及其它细胞供给源在内的多种公知的供给源得到，只要是在棒状细菌中具有使目的基因开始转录的功能的碱基序列，则任何一种都可以。作为这样的启动子的适当例，例如在棒状细菌中可以使用lac、trc、tac启动子等。本发明中使用的启动子根据需要可以进行修饰从而改变其调控机制。另外，对于配置在目的基因下游的调控序列下的终止子，只要是在棒状细菌中具有使该基因转录终止的功能的碱基序列，也是任何一种都可以。
然后，在所述的棒状细菌中，使编码THL、CTF、ADC、ADH的各基因在质粒上或染色体上进行表达。例如，使用质粒将这些基因导入到能够进行表达的调控序列下。此处，“调控序列下”是指，这些基因通过与例如启动子、诱导物、操纵子、核糖体结合位点和转录终止子等的共同工作，可以进行转录翻译。作为为实现这样的目的而使用的质粒载体，只要是含有在棒状细菌内掌控自主复制功能的基因的质粒载体即可。作为其具体例，可以列举例如：乳酸发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)2256来源的pAM330[日本特开昭58-67699号公报]、[Miwa，K.等，Cryptic plasmids in glutamic acid-producing bacteria，Agric.Biol.Chem，48：2901-2903(1984)]和[Yamaguchi，R.等，Determination of the complete nucleotide sequence ofthe Brevibacterium lactofermentum plasmid pAM330 and the analysis ofits genetic information.Nucleic Acids Symp.Ser.16：265-267(1985)]、谷氨酸棒杆菌ATCC13058来源的pHM1519[Miwa，K.等，Cryptic plasmids in glutamic acid-producing bacteria.Agric.Biol.Chem.48：2901-2903(1984)]和pCRY30[Kurusu，Y.等，Identification of plasmid partition function in coryneform bacteria.Appl.Environ.Microbiol.57：759-764(1991)]、谷氨酸棒杆菌T250来源的pCG4[日本特开昭57-183799]、[Katsumata，R.等，Protoplast transformation of glutamate-producing bacteria with plasmid DNA.J.Bacteriol.159：306-311(1984)]、pAG1、pAG3、pAG14、pAG50[日本特开昭62-166890号公报]、pEK0、pEC5、pEKEx1[Eikmanns，B.J.等，A family of Corynebacterium glutamicum/Escherichia coli shuttle vectors for cloning，controlled gene expression，and promoter probing.Gene，102：93-98(1991)]及其衍生物等。还可以列举噬菌体DNA等，只要能够在宿主中进行复制，则也可以使用其它任何一种载体。另外，载体优选含有内部具有各种限制性酶切位点的多克隆位点，或含有单一的限制性酶切位点。
本发明的转化棒状细菌的创制中所使用的质粒载体，可以如下构建：例如在使用丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)来源的编码THL、ADC的各基因、大肠杆菌(Escherichia coli)来源的编码CTF的基因和赤红球菌(Rhodococcus ruber)来源的编码ADH的基因的情况下，可以将确认过碱基序列的该基因与适当的启动子、终止子等调控序列连接后，插入到上述例示的任何一个质粒载体的适当的限制性酶切位点处。详细内容记载于实施例中。
转化
作为将含有目的基因的质粒载体导入大肠杆菌(Escherichia coli)和棒状细菌中的方法，可以通过例如电穿孔法、氯化钙/氯化铷法、磷酸钙法、DEAE-葡聚糖介导的转染等公知的方法进行。具体而言，例如大肠杆菌的情况下，可以进行氯化钙法或电穿孔法[例如，Sambrook，J.和Russel，D.W.《分子克隆实验室手册》(Molecular Cloning，A Laboratory Manual)(第三版)，冷泉港实验室出版社，(2001)；或Ausubel，F.等，最新分子生物学实验方法汇编(Current protocols in molecular biology)，Green Publishing and Wiley Interscience，纽约(1987)等]等，或者通过使用大肠杆菌JM109的感受态细胞(宝酒造株式会社制造)的方法、依照该公司的试验规程来进行；棒状细菌的情况下，可以通过公知的方法[Kurusu，Y.等，Electroporation-transformation system for Coryneform bacteria by auxotrophic complementation.Agric.Biol.Chem.54：443-447(1990)]和[Vertes A.A.等，Presence of mrr-and mcr-like restriction systems in Coryneform bacteria.Res.Microbiol.144：181-185(1993)]来进行电脉冲法。
上述方法可以基于基因工程实验的常规方法来进行。大肠杆菌和放线菌等各种微生物的载体的信息和外源基因的导入及表达方法在很多实验书籍中都有记载(例如，Sambrook，J.和Russel，D.W.，《分子克隆实验室手册》(Molecular Cloning，A Laboratory Manual)，第三版，冷泉港实验室出版社，2001；Hopwood，D.A.、Bibb，M.J.、Chater，K.F.、Bruton，C.J.、Kieser，H.M.、Lydiate，D.J.、Smith，C.P.、Ward，J.M.、Schrempf，H.《链霉菌遗传操作实验室手册》(Genetic manipulation of Streptomyces:A laboratory manual)，约翰因斯研究所，诺维奇，英国，1985等)，因此可以按照这些记载进行载体的选择、基因的导入和表达。
本发明的转化体为了提高异丙醇生产率，可以进一步含有基因修饰，所述基因修饰可产生选自由糖酵解系统的流量增加、对异丙醇、渗透压或有机酸的耐受性增加和副产物(可以理解为指目标产物以外的含碳分子)生产减少组成的组中的一种以上特征。这样的基因修饰具体而言可以通过外源性基因的过量表达和/或内源性基因的失活、经典诱变、筛选和/或目标突变体的挑选来导入。
另外，转化体可以通过使用紫外线、X射线或化学试剂等的人工突变导入方法来产生突变，这样得到任何一种突变株只要具有作为本发明目的的异丙醇生产能力，就可以作为本发明的转化微生物来使用。
这样创制出的本发明的棒状细菌转化体(以下仅称为转化体)，使用微生物培养中通常使用的培养基进行培养即可。作为该培养基，通常可以使用含有碳源、氮源、无机盐类及其它营养物质等的天然培养基或合成培养基等。
作为碳源，可以列举例如：葡萄糖、果糖、蔗糖、甘露糖、麦芽糖、甘露醇、木糖、半乳糖、淀粉、糖蜜、山梨醇或甘油等糖类和糖醇；乙酸、柠檬酸、乳酸、富马酸、马来酸或葡萄糖酸等有机酸；乙醇等醇等。另外，根据需要，也可以使用正构烷烃等烃等。碳源可以单独使用一种，或者也可以两种以上混合使用。这些碳源在培养基中的浓度通常为约0.1～10％(重量)、优选为约0.5～10％(重量)。
作为氮源，可以列举氮化合物，例如：氯化铵、硫酸铵、硝酸铵、乙酸铵等无机或有机铵化合物、尿素、氨水、硝酸钠或硝酸钾等，但并不限定于这些。另外，也可以使用玉米浆、肉类提取物、蛋白胨、NZ-胺、蛋白质水解产物或氨基酸等含氮有机化合物等。氮源可以单独使用一种，或者也可以两种以上混合使用。氮源在培养基中的浓度因所使用的氮化合物而异，通常为约0.1～10％(重量)，优选为约0.5～10％(重量)。
作为无机盐类，可以列举例如：磷酸二氢钾、磷酸氢钾、硫酸镁、氯化钠、硝酸亚铁、硫酸锰、硫酸锌、硫酸钴或碳酸钙等。这些无机盐可以单独使用一种，或者也可以两种以上混合使用。无机盐类在培养基中的浓度因所使用的无机盐而异，通常为约0.01～1％(重量)、优选为约0.05～1％(重量)。
作为营养物质，可以列举例如：肉类提取物、蛋白胨、多聚蛋白胨、酵母提取物、干酵母、玉米浆、脱脂奶粉、脱脂大豆盐酸水解物或者动植物或微生物菌体提取物、它们的分解产物等。营养物质在培养基中的浓度因所使用的营养物质而异，通常为约0.1～10％(重量)，优选为约0.5～10％(重量)。另外，根据需要，也可以添加维生素类。作为维生素类，可以列举例如：生物素、硫胺素(维生素B1)、吡哆醇(维生素B6)、泛酸、肌醇、烟酸等。
培养基的pH优选为约5～8。
作为优选的棒状细菌用培养基，可以列举：A培养基[Inui，M.等，Metabolic analysis of Corynebacterium glutamicum during lactate and succinate productions under oxygen deprivation conditions.J.Mol.Microbiol.Biotechnol.7：182-196(2004)]、BT培养基[Omumasaba，C.A.等，Corynebacterium glutamicum glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase isoforms with opposite，ATP-dependent regulation.J.Mol.Microbiol.Biotechnol.8：91-103(2004)]等。
培养温度通常为约15～45℃，优选约25～35℃，培养时间可以为约1～7天。
然后，将转化体的培养菌体进行回收。作为从如上所述得到的培养物中回收分离培养菌体的方法，没有特别限定，可以使用例如离心分离或膜分离等公知的方法。
可以对回收的培养菌体进行处理，并将得到的菌体处理物用于下一步骤。作为所述菌体处理物，可以是对培养菌体进行任何处理后所得到的处理物，可以列举例如用丙烯酰胺或卡拉胶等将菌体固定后得到的固定化菌体等。
(II)异丙醇的制造方法
从如上所述得到的培养物中回收分离的转化体的培养菌体或其菌体处理物，通常供给有氧条件下或厌氧条件下的反应培养基中的异丙醇生成反应。包含将上述转化体在含有糖类的培养基(反应培养基)中进行培养的步骤，和从培养物中回收异丙醇的步骤的异丙醇制造方法也是本发明之一。
异丙醇的生成方式可以使用分批式、分批补料式(流加式)、连续式中的任何一种生成方式。
反应培养基(反应液)中含有作为异丙醇的原料的有机碳源(例如，糖类等)即可。作为有机碳源，只要是本发明的转化体在生化学反应中可以利用的物质即可。
具体而言，作为糖类，可以列举：葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、果糖或甘露糖等单糖类；纤维二糖、蔗糖或乳糖、麦芽糖等二糖类；或者糊精或可溶性淀粉等多糖类等。特别优选C6糖和C5糖等单糖类，但棒状细菌有时不能利用木糖、阿拉伯糖等C5单糖类。在这样的情况下，只要赋予细菌可利用这些单糖的功能即可。另外，本发明中，也可以使用两种以上糖的混合糖。
更优选有机化合物的生成反应中使用的反应培养基通常含有转化体或其处理物为维持其代谢功能所必需的成分，即各种糖类等碳源；蛋白质合成所必需的氮源；及磷、钾或钠等的盐类；以及铁、锰或钙等微量金属盐。这些成分的添加量可以根据所需的反应时间、目标有机化合物生产物的种类或所使用的转化体的种类等来进行适当确定。根据所使用的转化体，有时也优选添加特定的维生素类。碳源、氮源、无机盐类、维生素、微量金属盐可以使用公知的物质，例如增殖培养步骤中例示的物质。
培养基的pH通常优选为约6～8。
转化体或其菌体处理物与糖类的反应，优选在本发明的转化体或其菌体处理物能够进行活动的温度条件下进行，可以根据转化体或其菌体处理物的种类等进行适当选择。通常为约25～35℃即可。
最后，收集如上所述在反应培养基中生成的异丙醇。其方法可以使用生物加工中使用的公知的方法。作为这样的公知的方法，可以列举：异丙醇生成液的蒸馏法、膜渗透法、有机溶剂提取法等，可以根据反应液的组成和副产物等来适当确定其分离纯化收集方法。
另外，本发明还提供对于通过所述条件下的反应从糖类等生产异丙醇的方法有显著改善的生产异丙醇的重组转化体。
实施例
以下，通过实施例对本发明进行详细说明，但本发明并不限于这些实施例。
实施例1谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ISO1和谷氨
酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ISO2的创制
(1)异丙醇生产基因群的克隆
异丙醇生物合成路径(从乙酰辅酶A到异丙醇)由乙酰辅酶A乙酰转移酶(Acetyl-CoA acetyltransferase)、乙酰乙酰辅酶A：乙酸辅酶A转移酶(Acetoacetyl CoA:acetate CoA transferase)、乙酰乙酸脱羧酶(Acetoacetate decarboxylase)和异丙醇脱氢酶(Isopropanol dehydrogenase)这四个步骤(四种酶)构成。通过以下的PCR法来扩增编码这四种酶的基因。
以丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)ATCC 824菌株的染色体和质粒DNA(从美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)获得；ATCC 824D-5)为模板，分别使用引物1和2(序列编号1和2)、引物3和4(序列编号3和4)通过PCR扩增乙酰辅酶A乙酰转移酶基因(thl)和乙酰乙酸脱羧酶基因(adc)。乙酰乙酰辅酶A：乙酸辅酶A转移酶基因(atoAD)以大肠杆菌(Escherichia coli)JM109菌株的染色体为模板，使用引物5和6(序列编号5和6)通过PCR进行扩增。PCR使用GeneAmp PCR System 9700(应用生物系统公司制造)，在PCR反应1(94℃30秒、58℃30秒、72℃1.5分钟、30个循环；模板DNA 10ng、反应液、dNTP 0.2mM、Prime Star DNA聚合酶(TAKARA公司制造)2U、5×Prime Star缓冲液6μL、引物各0.2μM、最终液量30μL)的条件下进行。使用上述扩增后的反应液3μL，用0.8％的琼脂糖凝胶进行电泳，在thl基因、atoAD基因和adc基因的情况下可以分别检测到约1.2kb、约1.3kb和约0.7kb的DNA片段。使用Minelute PCR纯化试剂盒(QIAGEN公司制造)纯化扩增后的DNA片段。
将赤红球菌(Rhodococcus ruber)DSM 44541菌株利用胰化酪蛋白胨(Trypticase peptone)培养基(Becton Dickinson公司制造)在30℃下液体振荡培养。培养16小时后，将5mL培养液进行离心分离[微量高速冷却离心机MX-301(トミ一精工公司制造)5000rpm，10分钟]，并将沉淀后的菌体用于提取染色体DNA。使用Isoplant II(日本基因公司制造)，按照附带的操作规程来提取染色体DNA。以赤红球菌(Rhodococcus ruber)DSM 44541菌株的染色体DNA为模板，使用引物7和8(序列编号7和8)，通过上述PCR反应1的条件扩增异丙醇脱氢酶基因(adh)。使用扩增后的反应液3μL，用0.8％的琼脂糖凝胶进行电泳，可以检测到包含adh基因的约1.0kb的DNA片段。使用Minelute PCR纯化试剂盒纯化扩增后的DNA片段。
为了获得基因表达启动子(tac启动子)，以pKK223-3(Pharmacia 公司制造)为模板，使用引物9和10(序列编号9和10)，通过上述PCR反应1的条件扩增包含tac启动子的约0.2kb的DNA片段。反应终止后，使用Minelute PCR纯化试剂盒(QIAGEN公司制造)纯化扩增后的DNA片段。
将通过上述PCR反应1得到的约1.3kb的包含atoAD基因的DNA片段、约0.7kb的包含adc基因的DNA片段和约1.0kb的包含adh基因的DNA片段分别与tac启动子连接，该连接按照以下程序进行。即，将上述三种各DNA片段和包含tac启动子的DNA片段以各约100ng的量分别进行混合，之后向其中混合dNTP 0.2mM、Prime Star DNA聚合酶(TAKARA公司制造)2U、5×Prime Star缓冲液6μL各试剂，使最终液量为30μL。将该反应液在PCR反应2(94℃30秒、52℃30秒、72℃1.5分钟、30个循环)的条件下，使用GeneAmp PCR System 9700进行反应。反应终止后，为了得到tac启动子与各基因(atoAD、adc和adh)相连接的DNA片段，以该反应液0.5μL为模板，分别使用引物6和9、引物4和11(序列编号11)、引物8和12(序列编号12)，按照上述PCR反应1的条件，通过PCR进行扩增。使用扩增后的反应液3μL，用0.8％的琼脂糖凝胶进行电泳，可以检测到在tac启动子上连接有atoAD基因的约1.5kb的DNA片段(Ptac-atoAD)、在tac启动子上连接有adc基因的约0.9kb的DNA片段(Ptac-adc)、和在tac启动子上连接有adh基因的约1.2kb的DNA片段(Ptac-adh)。这些DNA片段通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，并使用Minelute凝胶提取试剂盒(QIAGEN公司制造)从凝胶中进行回收。
按照操作说明书，将上述未连接tac启动子的约1.2kb的thl DNA片段、连接有tac启动子的约1.5kb的包含Ptac-atoAD的DNA片段、约0.9kb的包含Ptac-adc的DNA片段和约1.2kb的包含Ptac-adh的DNA片段分别与pGEM-T载体(Promega公司制造)相连接，通过氯化钙法[Journal of Molecular Biology，53，159(1970)]转化大肠杆菌JM109，并涂布到含有氨苄青霉素50μg/mL的LB琼脂培养基(将多聚蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl 5g和琼脂15g溶解于蒸馏水1L中)上。将各培养基上的生长菌株通过常规方法进行液体培养，从培养液中抽提质粒DNA，并用限制性内切酶将该质粒分别进行切割，由此确认插入片段。进而通过对该插入片段进行测序来确认目标DNA序列的构建。将包含thl基因(序列编号13)的质粒、包含atoAD基因(序列编号14)的质粒、包含adc基因(序列编号15)的质粒和包含adh基因(序列编号16)的质粒分别命名为pGEM-thl、pGEM-Ptac-atoAD、pGEM-Ptac-adc和pGEM-Ptac-adh。另外，DNA测序仪使用ABI PRISM 3100(应用生物系统公司制造)，测序反应使用ABI PRISM循环测序试剂盒(应用生物系统公司制造)。将由此制备的质粒pGEM-thl、pGEM-Ptac-atoAD、pGEM-Ptac-adc和pGEM-Ptac-adh分别用限制性内切酶EcoRI和BamHI、BamHI和SphI、SphI和SmaI以及EcoRI进行切割后，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，并使用Minelute凝胶提取试剂盒(QIAGEN公司制造)从凝胶中回收，由此，分别得到未连接tac启动子的包含thl基因的约1.2kb的EcoRI-BamHI DNA片段、连接有tac启动子的包含Ptac-atoAD基因的约1.5kb的BamHI-SphI DNA片段、包含Ptac-adc基因的约0.9kb的SphI-SmaI DNA片段和包含Ptac-adh基因的约1.2kb的EcoRI DNA片段。
(2)表达质粒pCRA725-SSIl 1-ACE和pCRC203的构建与谷氨酸棒
杆菌(Corynebacterium glutamicum)ISO1和谷氨酸棒杆菌
(Corynebacterium glutamicum)ISO2的创制
将上述(1)项中获得的未连接tac启动子的包含thl基因的约1.2kb的EcoRI-BamHI DNA片段、连接有tac启动子的包含Ptac-atoAD基因的约1.5kb的BamHI-SphI DNA片段和包含Ptac-adc基因的约0.9kb的SphI-SmaI DNA片段各100ng，与预先用EcoRI和SmaI消化过的pCRC200[Applied Microbiology and Biotechnology.77：853-860(2007)]10ng全部混合，通过DNA连接试剂盒进行连接反应。另外，由于pCRC200在克隆位点上游含有tac启动子，因此结果在thl基因上也连接有tac启动子。使用该连接液通过氯化钙法转化大肠杆菌(Escherichia coli)JM109，并利用氯霉素抗性筛选保持有含有目的基因片段的质粒DNA的大肠杆菌株，由此得到质粒pCRC203(图1、序列编号17)。
然后，为了将连接有tac启动子的thl-atoAD-adc基因簇(遺伝子セツト)以无抗性标记的方式导入到谷氨酸棒杆菌R的染色体中，根据文献信息[Appl.Environ.Microbiol.，第71卷，3369-3372(2005)]确定了对于该微生物的生长非必须的染色体区域，并将thl-atoAD-adc基因簇插入到染色体SSI11区域内。如下所述通过PCR法扩增该SSI11区域的DNA序列。
进行PCR时使用引物13和14(序列编号18和19)。另外，任何一个引物在末端均添加有XbaI位点。
模板DNA使用谷氨酸棒杆菌R的染色体DNA。染色体DNA的提取使用Isoplant II(日本基因公司制造)，按照附带的操作规程来进行。PCR使用LA Taq HS DNA聚合酶(TAKARA公司制造)，在PCR反应3(94℃30秒、55℃30秒、72℃3分钟、30个循环)的条件下进行。PCR反应液的组成如下所示。
反应液组成
(10×)PCR缓冲液： 10μL
2.5mM dNTP混合液： 8μL
模板DNA： 2μL(DNA含量为500ng以下)
上述两种引物： 各0.5μl(最终浓度为0.2μM)
LA Taq HS DNA聚合酶： 0.5μL
灭菌蒸馏水： 79μL
将以上物质混合并进行PCR反应。
使用如上所述生成的反应液，用0.8％的琼脂糖凝胶进行电泳，可以检测到包含SSI11区域的约2.0kb的DNA片段。
将上述用限制性内切酶XbaI处理后的扩增产物与用XbaI进行限制性内切酶处理后的染色体基因导入用质粒pCRA725[J.Mol.Microbiol.Biotechnol.，第8卷，243-254(2004)，(日本特开2006-124440)]混合，并向其中添加Mighty克隆试剂盒(TAKARA公司制造)，然后按照操作说明书进行反应。使用该连接液通过氯化钙法转化大肠杆菌(Escherichia coli)JM109，并筛选保持有含有目的基因片段的质粒DNA的大肠杆菌株，由此得到插入有包含SSI11区域的长约2.0kb的DNA片段的质粒pCRA725-SSI11(序列编号20)。
使用5’末端磷酸化的引物15和16(序列编号21和22)，以质粒pCRC203为模板，通过PCR法扩增thl-atoAD-adc基因簇。使用扩增后的反应液3μL，用0.8％的琼脂糖凝胶进行电泳，可以检测到在tac启动子上连接有thl、atoAD和adc基因的约3.8kb的DNA片段。将该DNA片段通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，并使用Minelute凝胶提取试剂盒(QIAGEN公司制造)从凝胶中回收。将该DNA片段100ng与预先在EcoRV处理后用碱性磷酸酶(TAKARA公司制造)脱磷酸化后的pCRA725-SSI11 10ng混合，并通过DNA连接试剂盒进行连接反应。使用该连接液通过氯化钙法转化大肠杆菌(Escherichia coli)JM109，并筛选保持有含有目的基因片段的质粒DNA的大肠杆菌株，由此得到质粒pCRA725-SSI11-ACE(图1、序列编号23)。
染色体基因导入用载体pCRA725是不能在谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)R内进行复制的质粒。使用pCRA725-SSI11-ACE，通过电脉冲法[Agric.Biol.Chem.，第54卷，443-447(1990)和Res.Microbiol.，第144卷，181-185(1993)]分别转化谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)R和谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)R ldhA突变体[J.Mol.Microbiol.Biotechnol.，第8卷，243-254(2004)]，并通过含有卡那霉素50μg/mL的A琼脂培养基[(NH2)2CO 2g、(NH4)2SO4 7g、KH2PO4 0.5g、K2HPO4 0.5g、MgSO4·7H2O 0.5g、0.06％(w/v)Fe2SO4·7H2O+0.042％(w/v)MnSO4·2H2O1mL、0.02％(w/v)生物素溶液1mL、0.01％(w/v)硫胺素溶液2mL、酵母提取物2g、维生素分析酪蛋白水解物7g、葡萄糖40g和琼脂15g(每1L)]筛选基因导入株。
将得到的基因重组菌株分别命名为谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ACE1和谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ACE2。
制作将上述(1)项得到的连接有tac启动子的包含adh基因的约1.2kb的DNA片段插入到谷氨酸棒杆菌的可自主复制的质粒pCRB1[American Chemical Society Symposium Series 862：Fermentation Biotechnology，American Chemical Society，Washington，175-191(2003)]的EcoRI位点上的质粒。具体而言，将连接有tac启动子的包含adh基因的EcoRI DNA片段100ng与预先在EcoRI处理后用碱性磷酸酶脱磷酸化的pCRB1 10ng混合，并通过DNA连接试剂盒进行连接反应。使用该连接液通过氯化钙法转化大肠杆菌(Escherichia coli)JM109，并筛选保持有含有目的基因片段的质粒DNA的大肠杆菌株，由此得到质粒pCRC204(图2、序列编号24)。通过电脉冲法，用质粒pCRC204转化谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ACE1和谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ACE2。使用含有50μg/mL卡那霉素和5μg/mL氯霉素的A琼脂培养基筛选转化株。得到的基因重组株分别命名为谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ISO1和谷氨酸棒杆菌
实施例2使用谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ISO1和
谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ISO2在有氧条件下进行的
异丙醇生产实验
将上述实施例1(2)创制的谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ISO1和谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ISO2分别涂布到含有5μg/mL氯霉素和50μg/mL卡那霉素的A琼脂培养基上，30℃下在暗处静置20小时。
用铂接种环将上述在平皿中生长的谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ISO1和ISO2分别向装有含有5μg/mL氯霉素和50μg/mL卡那霉素的A液体培养基(从A琼脂培养基中除去琼脂而制备)10mL的试管中接种一环，在30℃进行15小时有氧振荡培养。
将在上述条件下生长的谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ISO1和谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ISO2分别接种到装有含有5μg/mL氯霉素和50μg/mL卡那霉素的A液体培养基100mL的容量500mL的三角烧瓶中，在30℃进行有氧振荡培养。此时，每12小时向培养液中添加2.5g碳酸氢钠。
异丙醇的定量通过将取样的反应液进行离心分离(4℃、15000×g、10分钟)并用GC/MS分析得到的上清液来进行。GC/MS分析使用连接有DB-WAX毛细管柱(30m×0.25mm×0.25μm；J&W scientific公司制造，USA)的岛津制作所公司制造的气相色谱质谱分析仪(GC-MSQP-2010 plus)进行。分析条件是：氦气流量为1.0mL/分钟，分流比设定为1∶20，GC柱箱的条件为在40℃保持5分钟后以10℃/分钟升温至230℃。每一个样品的分析时间为24分钟。质谱分析仪设定接口为250℃、离子源为200℃、电子轰击电压(EI电压)为70eV。
谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ISO1在34小时后在反应液中生产55μM的异丙醇；谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ISO2在34小时后在反应液中生产1300μM的异丙醇。
实施例3使用谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ISO1和
谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ISO2在还原(增殖抑制)条
件下进行的异丙醇生产实验
将上述实施例1(2)创制的谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ISO1和谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ISO2分别涂布到含有5μg/mL氯霉素和50μg/mL卡那霉素的A琼脂培养基上，30℃下在暗处静置20小时。
用铂接种环将上述在平皿中生长的谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ISO1和谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ISO2分别向装有含有5μg/mL氯霉素和50μg/mL卡那霉素的A液体培养基10mL的试管中接种一环，在30℃进行15小时有氧振荡培养。
将在上述条件下生长的谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ISO1和谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ISO2分别接种到装有含有5μg/mL氯霉素和50μg/mL卡那霉素的A液体培养基500mL的容量2L的三角烧瓶中，在30℃进行15小时有氧振荡培养。
如此培养增殖的各菌体分别通过离心分离(4℃、5000×g、15分钟)进行回收。将得到的各菌体分别悬浮于BT(-尿素)液体培养基[0.7％硫酸铵、0.05％磷酸二氢钾、0.05％磷酸氢二钾、0.05％七水合硫酸镁、0.0006％七水合硫酸铁、0.00042％一水合硫酸锰、0.00002％生物素、0.00002％硫胺素盐酸盐]中，使终浓度为5％。将该各菌体悬浮液50mL分别装入容量100mL的培养基瓶中，在还原条件下添加葡萄糖和NaHCO3，使葡萄糖为200mM、NaHCO3为150mM，并在保持于33℃的水浴中搅拌的同时进行反应。在反应时间为8小时和34小时后分别添加葡萄糖和NaHCO3，使葡萄糖为200mM、NaHCO3为150mM。此时，在使用5N的氨水通过PH控制器(Able公司制造、型号：DT-1023)控制反应液的pH不低于7.5的同时进行反应。异丙醇的定量通过上述实施例2所记载的方法进行。另外，此时，未发现菌体浓度的变化，增殖受到抑制。
谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ISO1在34小时后在反应液中生产790μM的异丙醇；谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ISO2在34小时后在反应液中生产332μM的异丙醇。
实施例4异丙醇存在下的大肠杆菌(Escherichia
coli)JM109/pCRC202和谷氨酸棒杆(Corynebacterium glutamicum)ISO2
的增殖
使用作为异丙醇生产株的大肠杆菌(Escherichia coli)JM109/pCRC202(日本特愿2007-222633；保藏编号FERM P-21340)和实施例1制作的谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ISO2，将大肠杆菌(Escherichia coli)JM109/pCRC202接种到含有50μg/mL氯霉素的3mL LB(Luria-Bertani)培养基(1％胰化蛋白胨、0.5％酵母提取物、0.5％氯化钠)中，将谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ISO2接种到含有5μg/mL氯霉素和50μg/mL卡那霉素的A液体培养基[(NH2)2CO 2g、(NH4)28O4 7g、KH2PO4 0.5g、K2HPO4 0.5g、MgSO4·7H2O0.5g、0.06％(w/v)Fe2SO4·7H2O+0.042％(w/v)MnSO4·2H2O 1mL、0.02％(w/v)生物素溶液1mL、0.01％(w/v)硫胺素溶液2mL、酵母提取物2g、维生素分析酪蛋白水解物7g、葡萄糖40g、溶解于1L蒸馏水中]中，并将大肠杆菌(Escherichia coli)JM109/pCRC202在37℃下振荡培养16小时，将谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ISO2在33℃下振荡培养16小时。
将在上述条件下生长的大肠杆菌(Escherichia coli)JM109/pCRC202和谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ISO2分别接种到装有含有0～5.0％(vol/vol)各浓度异丙醇的10mL LB培养基(含有50μg/mL氯霉素)和10mL A液体培养基(含有5μg/mL氯霉素和50μg/mL卡那霉素)的试管中，将大肠杆菌(Escherichia coli)JM109/pCRC202在37℃下、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ISO2在33℃下分别进行有氧振荡培养，并随时间推移对浊度进行测定。浊度的测定使用Novaspec II分光光度计(Amersham Pharmacia biotech制造)。
结果，大肠杆菌(Escherichia coli)JM109/pCRC202在3.5％的异丙醇存在下就不进行增殖，与此相对，谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ISO2即使在5％的异丙醇存在下也能够增殖(图3)。这表明在进行高浓度的异丙醇生产时，作为宿主，棒状细菌优于大肠杆菌(Escherichia coli)。
在大肠杆菌(Escherichia coli)JM109/pCRC202的增殖曲线(图3(a))中，黑点(●)是异丙醇为0％、四方形(■)是异丙醇为1％、菱形(◆)是异丙醇为2％、叉号(×)是异丙醇为3.5％(均在含有50μg/mL氯霉素的LB培养基中)时的增殖曲线。在谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ISO2的增殖曲线(图3(b))中，黑点(●)是异丙醇为0％、四方形(■)是异丙醇为1％、菱形(◆)是异丙醇为2％、三角(▲)是异丙醇为5％(均在含有5μg/mL氯霉素和50μg/mL卡那霉素的A液体培养基中)时的增殖曲线。
产业实用性
本发明的转化体可以从糖类极其有效地生产异丙醇，因此有用。
根据本发明，能够以可再生资源为原料高效地生产异丙醇，并能够构建新型的不依赖于石油资源原料的异丙醇工业生产方法。
Claims (7)
1.一种具有异丙醇生产能力的转化体，其特征在于，通过将下述(a)～(d)的基因导入棒状细菌而得到，
(a)编码具有乙酰辅酶A乙酰转移酶活性的酶的外源性基因；
(b)编码具有乙酰乙酰辅酶A：乙酸辅酶A转移酶活性的酶的外源性基因；
(c)编码具有乙酰乙酸脱羧酶活性的酶的外源性基因；
(d)编码具有异丙醇脱氢酶活性的酶的外源性基因。
2.如权利要求1所述的转化体，其中，
使用在严格条件下与具有序列编号13的碱基序列的DNA、或具有与序列编号13的碱基序列的DNA互补的碱基序列的DNA杂交，并且编码具有乙酰辅酶A乙酰转移酶活性的多肽的DNA，作为(a)编码具有乙酰辅酶A乙酰转移酶活性的酶的外源性基因；
使用在严格条件下与具有序列编号14的碱基序列的DNA、或具有与序列编号14的碱基序列的DNA互补的碱基序列的DNA杂交，并且编码具有乙酰乙酰辅酶A：乙酸辅酶A转移酶活性的多肽的DNA，作为(b)编码具有乙酰乙酰辅酶A：乙酸辅酶A转移酶活性的酶的外源性基因；
使用在严格条件下与具有序列编号15的碱基序列的DNA、或具有与序列编号15的碱基序列的DNA互补的碱基序列的DNA杂交，并且编码具有乙酰乙酸脱羧酶活性的多肽的DNA，作为(c)编码具有乙酰乙酸脱羧酶活性的酶的外源性基因；
使用在严格条件下与具有序列编号16的碱基序列的DNA、或具有与序列编号16的碱基序列的DNA互补的碱基序列的DNA杂交，并且编码具有异丙醇脱氢酶活性的多肽的DNA，作为(d)编码具有异丙醇脱氢酶活性的酶的外源性基因。
3.如权利要求1或2所述的转化体，其中，
(a)编码具有乙酰辅酶A乙酰转移酶活性的酶的外源性基因、(b)编码具有乙酰乙酰辅酶A：乙酸辅酶A转移酶活性的酶的外源性基因、(c)编码具有乙酰乙酸脱羧酶活性的酶的外源性基因、和(d)编码具有异丙醇脱氢酶活性的酶的外源性基因，相同或不同，为来源于选自由丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)、大肠杆菌(Escherichia coli)、赤红球菌(Rhodococcus ruber)、拜式梭菌(Clostridium beijerinckii)、金黄丁酸梭菌(Clostridium aurantibutyricum)、糖乙酸多丁醇梭菌(Clostridium saccharoperbutylacetonicum)、糖丙酮丁醇梭菌(Clostridium saccharoacetobutylicum)、巴氏芽孢梭菌(Clostridium pasteurianum)、生孢梭菌(Clostridium sporogenes)、尸毒梭菌(Clostridium cadaveris)、假破伤风梭菌(Clostridium tetanomorphum)和真氧产碱杆菌(Ralstonia eutropha)组成的组中的微生物的基因。
4.如权利要求1～3中任一项所述的转化体，其特征在于，(b)编码具有乙酰乙酰辅酶A：乙酸辅酶A转移酶活性的酶的外源性基因为来源于大肠杆菌(Escherichia coli)的基因，和/或(d)编码具有异丙醇脱氢酶活性的酶的外源性基因为来源于赤红球菌(Rhodococcus ruber)的基因。
5.如权利要求1～4中任一项所述的转化体，其特征在于，棒状细菌选自由棒状杆菌属细菌、短杆菌属细菌和节杆菌属细菌组成的组。
6.谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ISO1转化体(保藏编号NITE BP-561)、或谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ISO2转化体(保藏编号为NITE BP-562)。
7.一种制造异丙醇的方法，包括将权利要求1～6中任一项所述的转化体在含有糖类的培养基中进行培养的步骤，和从培养物中回收异丙醇的步骤。
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