CN103374589A - 一种参与丁醇生成的醇脱氢酶及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种参与丁醇生成的醇脱氢酶及其应用。具体地，在众多的参与丁醇合成的基因中，发明人发现CA_C3375醇脱氢酶醇脱氢酶是丙酮丁醇梭菌中溶剂生物合成(特别是丁醇合成)的正调控基因，该基因的存在显著提高了丙酮丁醇梭菌中丁醇的产量；该基因的缺失可以显著降低丙酮丁醇梭菌丁醇的生产能力。本发明还构建了丁醇生产能力提高的CA_C3375醇脱氢酶过表达的丙酮丁醇梭菌。

Description

一种参与丁醇生成的醇脱氢酶及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地，本发明涉及一种参与丁醇生成的醇脱氢酶及其应用。

背景技术

醇脱氢酶(ADH；EC 1.1.1.1，1.1.1.2，或1.1.1.71)是生物体中丁醇、乙醇、异丙醇等代谢途径的关键酶。醇脱氢酶催化醛或酮还原生成相应的初级或次级醇，其反应式如下：

醇是厌氧代谢中一种普遍产物，同时代谢中间物作为电子受体接受电子从而再生辅酶NAD(P)⁺。

超过半数的梭菌属菌可以产生一种或多种醇：如甲醇，乙醇，丙醇，异丙醇，n-丁醇，异丁醇(2-甲基-1-丁醇)和异戊醇(3-甲基-1-丁醇)等，其中丁醇和乙醇是最常见的两种产物。丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)属于革兰氏阳性菌，GC含量30.9％，2001年完成全基因组测序。它是一类产孢子的厌氧梭菌，能发酵产生丙酮、乙醇和丁醇等溶剂。在丙酮丁醇发酵过程中，丁醇是最具经济价值的溶剂。为提高生物丁醇相对化学法生产的经济性，一方面可以开发利用廉价底物的工程菌，另一方面可以提高发酵产物中高副加值产品丁醇的比例，从而提高产物/原料转化率。一般的丙酮丁醇梭菌如ATCC 824在发酵生产溶剂的过程中，丁醇的比例约为60％左右。通过土样分离、化学诱变及抗性筛选，及代谢工程改造，敲除丙酮生成途径关键酶，产丁醇比例进一步提高到80％。

为进一步增加产物丁醇的比例，有必要进一步降低副产物乙醇的产生，对醇脱氢酶的功能鉴定就至关重要。由于醇脱氢酶的底物特异性、催化活性大小、表达量与生物丁醇/乙醇的产量紧密相关，同时醇脱氢酶与微生物细胞内重要代谢辅因子NAD(P)+/NAD(P)H动态平衡的维持关系密切。对醇脱氢酶基因、表达调控、酶学性质、蛋白质结构等方面研究对丁醇代谢工程的改造具有重要的意义。因此目前本领域迫切需要对参与调控丁醇产生的醇脱氢酶进行鉴定和功能验证。

发明内容

本发明的目的就是提供一种参与丁醇生成的醇脱氢酶及其应用。

在本发明的第一方面，提供了一种分离的CA_C3375醇脱氢酶或其编码基因的用途，它被用于调节丙酮丁醇梭菌产生溶剂的能力。

在另一优选例中，所述的调节包括：上调(或提高)和下调(或降低)。

在另一优选例中，所述的溶剂选自下组：乙醇，丙酮，丁醇，或其组合。

在另一优选例中，所述的溶剂为丁醇。

在另一优选例中，所述的CA_C3375醇脱氢酶选自下组：(i)具有SEQ IDNO.：29所示氨基酸序列的多肽；(ii)将SEQ ID NO.：29所示氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的、由(i)衍生的多肽；(iii)氨基酸序列与SEQ ID NO.：29所示氨基酸序列的同源性≥90％(较佳地≥95％，更佳地≥97％，更佳地≥99％)、由(1)衍生的多肽。

在另一优选例中，所述CA_C3375醇脱氢酶的编码基因是选自下组的一种或多种：(1)编码如SEQ ID NO.：29所述多肽的多核苷酸；(2)序列如SEQ IDNO.：1所示的多核苷酸；(3)序列与SEQ ID NO.：1所示序列的同源性≥95％(较佳地≥97％，更佳的≥99％)的多核苷酸；(4)与(1)-(3)任一所述的多核苷酸序列互补的多核苷酸。

在本发明的第二方面，提供了一种提高丙酮丁醇梭菌产生丁醇能力的方法，包括步骤：提高丙酮丁醇梭菌中CA_C3375醇脱氢酶基因的表达水平，或提高丙酮丁醇梭菌中CA_C3375醇脱氢酶的活性。

在另一优选例中，所述的提高是指，与野生型丙酮丁醇梭菌相比，CA_C3375醇脱氢酶基因的mRNA表达水平提高10％以上，或CA_C3375醇脱氢酶的表达或活性上升10％以上。

在另一优选例中，所述的提高通过选自下组的一种或多种方式实现：导入额外的CA_C3375醇脱氢酶、引入提高CA_C3375醇脱氢酶的表达或活力的突变、或引入瞬时表达CA_C3375醇脱氢酶的表达载体。

在本发明的第三方面，提供了一种丙酮丁醇梭菌，所述丙酮丁醇梭菌中CA_C3375醇脱氢酶基因的表达水平或CA_C3375醇脱氢酶的活性提高。

在另一优选例中，所述的提高是指，与野生型丙酮丁醇梭菌相比，CA_C3375醇脱氢酶基因的mRNA表达水平提高10-100％，或CA_C3375醇脱氢酶的表达或活性提高10-100％。

在另一优选例中，所述的提高通过选自下组的一种或多种方式实现：导入额外的CA_C3375醇脱氢酶、引入提高CA_C3375醇脱氢酶的表达或活力的突变、或引入瞬时表达CA_C3375醇脱氢酶的表达载体。

在另一优选例中，所述的野生型丙酮丁醇梭菌为：丙酮丁醇梭菌Clostridium acetobutylicumATCC 8249。

在本发明的第四方面，提供了本发明的第三方面所述丙酮丁醇梭菌的用途，它被用于生产溶剂。

在另一优选例中，所述的溶剂选自下组：乙醇，丙酮，丁醇，或其组合。

在另一优选例中，所述的溶剂为丁醇。

在本发明的第五方面，提供了一种生产丁醇的方法，包括步骤：

(A)在适合的条件下，培养本发明的第三方面所述的丙酮丁醇梭菌，获得含有丁醇的培养物；和(B)从所述的培养物中分离和/或纯化丁醇。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。

图1显示醇脱氢酶中断菌株的菌落PCR鉴定结果，其中，WT代表以C.acetobutylicum ATCC 824基因组为模板的阴性对照；bdhI mutant为电转化得到的bdhI突变菌株；bdhII mutant为电转化得到的bdhII突变菌株；3375mutant为电转化得到的CA_C3375突变菌株；Marker为1kb DNAladder。

图2显示醇脱氢酶突变株中导入拜氏梭菌ALD基因的菌落PCR验证结果，其中，pSY8-ALD为电转化得到的表达ALD菌株；Control为未表达ALD的野生型菌株；Marker为1kb DNAladder。

图3显示各个菌株发酵48小时产量结果。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，首次在众多参与丁醇生产有关的基因中，发现CA_C3375醇脱氢酶是丙酮丁醇梭菌中溶剂(特别是丁醇)生物合成的正调控基因，该基因的存在显著提高了丙酮丁醇梭菌中丁醇的合成，该基因的缺失可以显著降低丙酮丁醇梭菌丁醇的生产能力。本发明还构建了CA_C3375醇脱氢酶过表达的的丙酮丁醇梭菌，该菌株的丁醇生产能力提高。在此基础上完成了本发明。

术语

如本文所用，术语“丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)”是一种在适当的条件下，可以生产有机溶剂的厚壁菌门细菌。所述的有机溶剂包括(但不限于)：甲醇，乙醇，丙醇，异丙醇，n-丁醇，异丁醇(2-甲基-1-丁醇)和异戊醇(3-甲基-1-丁醇)等。

本发明涉及的丙酮丁醇梭菌可以为市售的或微生物保藏机构的普通丙酮丁醇梭菌，且具有生产所述有机溶剂的能力，较佳地，本发明具有较高的生产丁醇的能力的菌株为丙酮丁醇梭菌ATCC824。

如本文所用，术语“调控基因”是指用于调节控制特定结构基因表达的基因。正调控基因指可以提高或者维持结构基因表达的基因，负调控基因则是可以降低结构基因表达的基因。

如本文所用，术语“基因转移”是指将外源的遗传物质由供体菌导入到受体菌内的过程，其可以通过转化、接合转移、转导、细胞融合等手段来实现。

如本文所用，术语“接合转移”是指细菌通过性菌毛相互连接沟通，将遗传物质(主要是质粒DNA)从供体菌转移给受体菌。

如本文所用，术语“基因失活”是指降低目的基因的活性或表达、或降低目的基因编码多肽的产生和分泌，基因失活的方法包括(但不限于)：基因中断、基因敲除、RNA干扰、基于同源重组的基因缺失、基于二类内含子或转座子的基因插入失活，基于siRNA或shRNA的RNA干扰、miRNA等。

本发明涉及一种丙酮丁醇梭菌发酵生产丁醇过程中起正调控作用的醇脱氢酶多肽及其编码基因，其Locus_tag为CA_C3375，所述基因的NCBI序列号为NC_003030。

优选地，所述基因的核苷酸序列如下：

atgaaagcca taacttttga aggcatgaac aatgttaagg ttaaaaatgt aaatgacccg    60

aatatcataa aaaatgatga tgcaattatt aaaataactt ctactacaat atgtggttcc    120

gaccttcatc ttcttcgtgg aaccatgcca aaagttcctc atggatttat tataggccat    180

gaagcaatgg gaattgttga agaaacagga aaggaagtca caaacttaaa aaaaggtgat    240

agagtaattg tgccttttcc tgtttcctgc ggtcactgct ggtactgtac tcacggtctt    300

tctagccaat gcgataactc aaacgagcat ggtgaagttg gtgctatata tggatacggt    360

gatttaatgg gaggctacga tggcggtcag gctgaatact taagagttcc atatgcaaac    420

tttgggccta aattagtacc tgaaaatctt acagatgaac aggttctttt tctaactgat    480

atacttccaa cttcttattg gggcacaata gtaaatggag gagttaagca aggtgacacc    540

gtagtcgttc ttggctgtgg tccagttgga cttttagctc aaaaatgggc agcttatgca    600

ggtgcttcta gaataatcgc agtagataac atagactata gattagagca tgcaaaaaaa    660

tacaactcag cagaaatatt aaacttcaat gactacgaca atacaggaga atacatcaaa    720

gaaataactc atggaggagc agacgttgta attgactgtg ttggaatgga cggagaaagg    780

tctcctattg aaaatgtaga aactctatta aaaatacagg gtggttcaaa gtccgcaata    840

gaaatatcaa ctcaagcagt aagaagaggt ggaacagtat ctgttgtcgg cgtttacggt    900

gcaagataca ataactttcc ttttggagac ttcttctcta gaaatataac cataaaaact    960

ggtcaatgcc cagcacattc ttatgtagat gttattttag atctcataaa gcaaaataaa    1020

tttgatgcta ctgatataat aactcatact atgtctcttt ctgatggtga aaaagcatat    1080

aatttattca ataataaact tgataattgt ataaaagtca tattaaaacc ataa          1134

(SEQ ID NO.：1)

所述多肽的氨基酸序列如下：

MKAITFEGMN NVKVKNVNDP NIIKNDDAII KITSTTICGS DLHLLRGTMP KVPHGFIIGH    60

EAMGIVEETG KEVTNLKKGD RVIVPFPVSC GHCWYCTHGL SSQCDNSNEH GEVGAIYGYG    120

DLMGGYDGGQ AEYLRVPYAN FGPKLVPENL TDEQVLFLTD ILPTSYWGTI VNGGVKQGDT    180

VVVLGCGPVG LLAQKWAAYA GASRIIAVDN IDYRLEHAKK YNSAEILNFN DYDNTGEYIK    240

EITHGGADVV IDCVGMDGER SPIENVETLL KIQGGSKSAI EISTQAVRRG GTVSVVGVYG    300

ARYNNFPFGD FFSRNITIKT GQCPAHSYVD VILDLIKQNK FDATDIITHT MSLSDGEKAY    360

NLFNNKLDNC IKVILKP                                                   377

(SEQ ID NO.：29)

本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。

本发明还包括具有CA_C3375醇脱氢酶活性的蛋白片段及其类似物。如本文所用，术语“片段”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然CA_C3375醇脱氢酶蛋白相同的生物学功能或活性的多肽。

本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是：(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的；或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽；或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽；或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根据本文的定义这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

本发明还包括与本发明的CA_C3375醇脱氢酶蛋白具有50％或以上(优选60％以上，70％以上，80％以上，更优选90％以上，更优选95％以上，最优选98％以上，如99％)同源性的具有相同或相似功能的多肽或蛋白。在蛋白质变体可以经过若干个(通常为1-60个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)取代、缺失或添加至少一个氨基酸所得的衍生序列，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在所述蛋白中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能，在C末端和/或\末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。这些保守性变异最好根据表1进行替换而产生。

表1

本发明包括CA_C3375醇脱氢酶蛋白质类似物与天然CA_C3375醇脱氢酶蛋白的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些蛋白的类似物包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分了生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的蛋白并不限于上述例举的代表性的蛋白。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外蛋白的化学衍生形式如乙酸化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在蛋白质合成和加工中进行糖基化修饰。这种修饰可以通过将蛋白暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。

本发明还提供了编码CA_C3375醇脱氢酶多肽、蛋白或其变体的多核苷酸序列。本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括：DNA、基因组DNA或人工合成的DNA，DNA可以是单链的或是双链的。

编码成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。

术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。

根据本文所述的核苷酸序列，本技术领域人员可方便地用各种通用方法制得本发明的编码核酸。这些方法例如但不限于：PCR，DNA人工合成等，具体的方法可参见J.萨姆布鲁克，《分子克隆实验指南》。作为本发明的一种实施方式，可通过分段合成核苷酸序列再进行重叠延伸PCR的方法来构建本发明的编码核酸序列。

本发明所述的降低或消除是通过基因敲除、基因中断或基因突变而使得CA_C3375醇脱氢酶基因的表达水平，和/或CA_C3375醇脱氢酶多肽的表达水平或活性被降低或被消除。在另一优选例中，通过基因敲除使得丙酮丁醇梭菌中CA_C3375醇脱氢酶基因失活或基本失活。所述的基因敲除包括：同框敲除、或基因替换敲除。本领域的普通技术人员也可以使用RNAi、siRNA、microRNA、或构建dsRNA等方法降低或消除醇脱氢酶基因表达。

本发明的中CA_C3375醇脱氢酶多肽或其编码基因可以被用于调控丙酮丁醇梭菌生产有机溶剂，尤其是丁醇的能力。所述的调节包括上调(或提高)和下调(或降低)。

在丙酮丁醇梭菌EA2018中，其基因组和pSOL1质粒上注释为“丁醇脱氢酶”或“醇脱氢酶”的有九种(见表1)，其中六种位于基因组上，三种位于pSOL1质粒上。功能上已经鉴定的有BdhI、BdhII，二者均可催化丁醛还原为丁醇和乙醛还原为乙醇的反应，并且对前一反应有更高的催化效率。被鉴定具有醇脱氢酶功能的还有位于梭菌产溶剂大质粒上的AAD和AdhE2，AAD和AdhE2同时具有丁醛/乙醛脱氢酶和丁醇/乙醇脱氢酶的功能，AAD被认为是丙酮丁醇梭菌产溶剂过程最主要的醛脱氢酶。AdhE2被鉴定为在中性PH高NAD(P)H条件下参与丁醇生成的另一个双功能醛/醇脱氢酶。

表2

Locus_tag	可能的功能
		CA C3298	NADH-依赖的丁醇脱氢酶B(BDH II)
CA C3299	NADH--依赖的丁醇脱氢酶A(BDH I)
		CA_C3335	短链醇脱氢酶家族酶
CA_C3375	醇脱氢酶
		CA_C3392	NADH-依赖的丁醇脱氢酶
CA_C3484	短链醇脱氢酶家族蛋白
		CA_P0059	醇脱氢酶
CA P0162	双功能乙酰CoA/醇脱氢酶(AAD)
		CA P0035	双功能乙酰CoA/醇脱氢酶(AdhE2)

表2显示丙酮丁醇梭菌EA2018基因组和pSOL1质粒上的醇脱氢酶(加粗下划线表示功能已鉴定)。

发酵生产丁醇

本发明的丙酮丁醇梭菌菌株可用于通过生物法制备丁醇或其衍生物。其中，所述的盐包括(但并不限于)：盐酸盐，硫酸盐，磷酸盐、醋酸盐，柠檬酸盐、其他有机羧酸盐等。

本发明的生产方法，除了生产菌的不同之外，其他条件与现有技术中发酵生产的方法基本相同。本发明菌株的发酵条件与一般的丙酮丁醇梭菌相近，即在含碳源、氮源和微量元素的培养基中，在pH5.0-9.0(较佳地pH7.0-7.5)和20-45℃(较佳地25-40℃)发酵。

在本发明中，“菌丝体”、“发酵液”或“培养液”可通过在适合生长的条件下培养本发明菌株，使其生长至一定的菌丝体浓度来获得。用于培养本发明菌株的培养基中的营养源没有特别的限制。本领域技术人员可以根据公知的技术来选择合适的碳源、氮源和其他营养源。例如，碳源可以是木糖、葡萄糖、淀粉、糊精、果糖、蔗糖、甘油、肌醇、甘露醇等。氮源可以是胨、大豆粉、黄豆饼粉、肉膏、蛋白粉、麦皮、米糖、酵母粉、玉米浆、铵盐以及其他有机物或无机含氮化合物。另外，培养基中还可适当加入一些无机盐类，如氯化钠、磷酸盐(如磷酸二氢钾和磷酸氢二钾等)、硫酸锰、硫酸铵、硫酸镁、碳酸钙等金属盐。通常可采用各种已知的常规培养基，如LB琼脂培养基、营养琼脂培养基、葡萄糖酵母膏琼脂培养基和牛肉浸汁琼脂培养基等对本菌株进行斜面固体培养并4℃环境下进行初步保藏。

在一个具体实施方案中，用于培养本发明菌株的培养基具有以下组成(％表示质量/体积)：

溶液1：40g D-葡萄糖，20g D-木糖，加H₂O定溶至850mL；

溶液2：NH₄Ac 2.2g，K₂HPO₄0.5g，KH₂PO₄0.5g，加H₂O定溶至100mL；

溶液3：2.0g MgSO₄·7H₂O，0.1g MnSO₄·H₂O，0.1g NaCl，0.1g FeSO₄·7H₂O；

溶液4：100ml蒸馏水中加入100mg氨基苯酸，100mg维生素B1，1mg生物素；

溶液1和溶液2高温湿热灭菌，溶液3和溶液4过滤除菌，待溶液1和2冷却后再加入10mL溶液3和1mL溶液4，混匀分装成95mL/瓶后，配制培养基时在培养体系中添加1％CaCO3，以N2排除瓶中的空气。

然而，本领域技术人员应当理解，本发明并不局限于本文中列举的这些具体培养基配方。培养本发明中的菌株的温度、pH、气液比、罐压、转速等条件没有特别严格的限制，只要该条件适合该菌的生长即可。在培养时可采用豆油等消泡剂进行消泡。在一些较佳的实施方案中，pH宜控制在6.5～8.0之间，培养温度宜在25～40℃之间。应理解，本发明的发酵可以是连续发酵，也可以是间歇式发酵。

本发明的主要优点包括：

(1)鉴定了一种与丙酮丁醇梭菌中丁醇合成密切相关的基因，从而为以提高丁醇的产量为目标的代谢工程改造提供了很好的基因靶点。

(2)通过基因工程方法构建了CA_C3375醇脱氢酶缺失突变体，丁醇的生产效率明显降低，在缺失株中回复所述基因，丁醇产量也得到回复，在野生型菌株中过表达所述基因，丁醇的产量大大提高；

(3)本发明的CA_C3375醇脱氢酶能够改善现有技术中丁醇产量低的技术难题。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold SpringHarbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实验材料

丙酮丁醇梭菌ATCC 824：丙酮丁醇梭菌(C.acetobutylicum)ATCC 824购自美国典型微生物保藏中心。

丙酮丁醇梭菌EA2018：实验室早期通过土样分离、化学诱变及抗性筛选，获得高产丁醇菌株EA2018，于1994年11月18日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：NO M94061，且公开于专利文献CN 1143677A中。

丙酮丁醇梭菌突变株EA2018D：EA2018D不产丁醇、丙醇，可以排除AAD和AdhE2对产物丁醇/乙醇比例的影响，在其中导入拜氏梭菌(C.beijerinckii NCIMB 8052)来源的丁酰辅酶A特异的醛脱氢酶8052ALD，回复丁醇的产生，同时对不同的醇脱氢酶基因中断失活，鉴定不同醇脱氢酶的功能。

EA2018D的具体获得方法如下：将红霉素抗性质粒电转导入EA2018，涂布红霉素抗性CGM平板，通过PCR扩增红霉素抗性基因验证获得的转化子，将验证正确的转化子在CGM(红霉素抗性)液体培养基中传代，每24小时转接一次，每次接种量2％，从7天开始，每天涂一块一平板，并通过扩增pSOL1质粒上特有的adc和ctfAB基因作PCR验证pSOL1质粒是否丢失。pSOL1质粒丢失的单菌继续在CGM培养基中传代，以丢失初始转入的红霉素抗性质粒。将pSOL1质粒丢失的单菌在CGM液体培养基中传代，每24小时转接一次，每次接种量2％，从7天开始，每天涂一块CGM平板，并作PCR扩增红霉素基因验证质粒是否丢失。

质粒pWJ为E.coli和C.acetobutylicum的穿梭质粒，在C.acetobutylicum中表达红霉素抗性基因，序列如SEQ ID NO.：22。

质粒pSY8，序列如SEQ ID NO.：23所示，甲砜霉素抗性。

质粒pANS1，序列如SEQ ID NO.：24所示，具有壮观霉素抗性。

菌株E.coli ER2275购自NEB公司。

重组质粒载体pWJ-3375、pWJ-bdhI、pWJ-bdhII分别指用于敲除adh3375、bdhI、bdhII基因的重组质粒载体。

本发明中提及的3375-intron、bdhI-intron、bdhII-intron片段指在IBS，EBS2，EBS1d位点碱基经修改后，用于敲除醇脱氢酶基因的片段，属于L1.LtrB内含子一部分，所述的L1.LtrB二类内含子为原核二类内含子，包括ltrA基因。

本发明中使用的PCR纯化和DNA胶回收纯化均购自华舜生物制品有限公司，Targetron^TMGene Knockout System(TA0100)Kit购自Sigma-Aldrich，基因组抽提试剂盒购自上海生工生物工程有限公司。

本发明使用的酶和试剂为：KOD plus DNA聚合酶，限制性内切酶，Taq聚合酶购自Fermentas，T4连接酶和小牛碱性磷酸酶(CIAP)均购自TaKaRa公司。

其他常规试剂均为国产或进口分装。

实施例1

构建pWJ-3375、pWJ-bdhI、pWJ-bdhII质粒载体

通过PCR，扩增3375、bdhI、bdhII基因的TargeTron片断，经XhoI及BsrGI双酶切，与同样酶切的pWJ载体分别连接，得到的敲除质粒pWJ-3375、pWJ-bdhI、pWJ-bdhII。其中，扩增3375、bdhI、bdhII targetron的模板及引物设计源于Sigma-Aldrich公司的TargeTron^TMGene Knockout System(TA0100)Kit。

具体步骤如下：

1.1引物设计与合成

参考Targetron^TMGene Knockout System(TA0100)Kit提供的方法，根据3375(SEQ ID NO.：1)、bdhI(SEQ ID NO.：2)、bdhII(SEQ ID NO.：3)的基因序列，分别设计引物3375-IBS(SEQ ID NO.：4)、3375-EBS1d(SEQ ID NO.：5)、3375-EBS2(SEQ ID NO.：6)、bdhI-IBS(SEQ ID NO.：7)、bdhI-EBS1d(SEQID NO.：8)和bdhI-EBS2(SEQ ID NO.：9)bdhII-IBS(SEQ ID NO.：10)、bdhII-EBS1d(SEQ ID NO.：11)和bdhII-EBS2(SEQ ID NO.：12)用于构建pWJ-3375、pWJ-bdhI、pWJ-bdhII质粒载体。另外，使用由TargetronTMGeneKnockout System(TA0100)Kit提供的通用引物EBS。

1.2PCR扩增

使用通用方法，利用Sigma-Aldrich的TargetronTMGene Knockout System(TA0100)Kit进行PCR扩增，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收在350bp处的条带，该条带即为3375-TargeTron、bdhI-TargeTron、bdhII-TargeTron片段，然后使用华舜公司的胶回收试剂盒纯化回收PCR产物3375-TargeTron、bdhI-TargeTron、bdhII-TargeTron片段。

1.3构建pWJ-3375、pWJ-bdhI、pWJ-bdhII重组质粒载体

将PCR纯化后获得的3375-TargeTron、bdhI-TargeTron、bdhII-TargeTron片段使用XhoI及BsrGI进行酶切，同时使用XhoI及BsrGI酶切载体pWJ，酶切后产物采用华舜公司的胶回收试剂盒纯化回收。

回收后的酶切片段使用T4DNA连接酶分别与酶切后的载体连接，连接反应在16℃水浴锅中进行，反应时间10hr，将连接产物转化入E.coli DH5αCaCl₂化学感受态细胞，添加1mL LB液体培养基复苏1hr后涂布到LB固体培养基(添加氨苄青霉素，浓度100μg/mL)平板上。以IBS和EBS1d引物对长出的菌落进行PCR检测。菌落PCR可以扩增出350bp特异性条带，表明连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞后获得的阳性转化子含有重组质粒pWJ-3375、pWJ-bdhI、pWJ-bdhII。

实施例2

Clostridium acetobutylicum ATCC824 3375、bdhI、bdhII基因的中断失活

将pWJ-3375、pWJ-bdhI、pWJ-bdhII质粒经E.coli ER2275/pANS1在Cac8I位点甲基化后，电转Clostridium acetobutylicum EA2018D，复苏过夜后，取300μl细胞液涂布于红霉素(40μg/mL)平板，厌氧箱内37℃培养48-96小时后，挑取单菌进行菌落PCR验证，具体步骤如下：

2.1pWJ-3375、pWJ-bdhI、pWJ-bdhII质粒的甲基化

将pANS1质粒经化学转化入E.coli ER2275，获得菌株E.coliER2275/pANS1。

CaCl₂法制备E.coli ER2275/pANS1的化学感受态细胞，将pWJ-3375、pWJ-bdhI、pWJ-bdhII质粒分别转化E.coli ER2275/pANS1，由于pANS1质粒具有壮观霉素抗性，故在含有100μg/mL氨苄青霉素，50μg/mL壮观霉素的LB培养基平板上过夜培养，然后挑取单菌落接至4mL添加有100μg/mL氨苄青霉素，50μg/mL壮观霉素的LB培养基中，过夜培养。将获得的含pANS1及pWJ-3375、pWJ-bdhI、pWJ-bdhII的E.coli ER2275，用质粒抽提试剂盒抽提质粒，获得Cac824I识别位点已甲基化的质粒pWJ-3375、pWJ-bdhI、pWJ-bdhII。

2.2电转pWJ-3375、pWJ-bdhI、pWJ-bdhII质粒入Clostridium acetobutylicumEA2018D

在CGM培养基(2g(NH₄)₂SO₄，1g K₂HPO₄，0.5g KH₂PO₄，0.1g MgSO₄.7H₂O，0.015g FeSO₄.7H₂O，0.01g CaCl₂，0.01g MnSO₄.H₂O，0.002g CoCl₂，0.002g ZnSO₄，2g Tryptone，1g Yeast Extraction，50g Glucose，2％agar溶于1L水中)平板上划线培养C.acetobutylicum EA2018D，培养大约48hr后挑取单菌落接入5mL CGM液体培养基中培养，大约培养16hr后按1％接入50mL CGM液体培养基中，当培养菌体的OD600达到0.6-0.7之间时取出培养菌用于电转感受态制备。取出30mL菌液，放于50mL离心管中以4500rpm 4℃10min离心，弃上清，加入30mL 4℃ETM缓冲液(270mM蔗糖，0.6mM Na₂HPO₄，4.4mM NaH₂PO₄，10mM MgCl₂)悬浮，4500rpm 4℃10min离心，弃上清，加入3mL4℃的ET缓冲液(270mM蔗糖，0.6mM Na₂HPO₄，4.4mM NaH₂PO₄)中。以下步骤在冰上操作，吸取180μL菌液加入预先已加入20μL(约1～3μg)pWJ-3375、pWJ-bdhI、pWJ-bdhII质粒的EP管中，混匀后转入电转杯中(2mm)，使用Bio-Rad MicroPulser^TM电转仪电转，电压2.0kV，其余参考使用手册，电击后迅速加入常温的CGM培养基1mL，37℃培养8hr左右，取200μL细胞液涂布于红霉素(40μg/mL)CGM平板，培养约3-4天。

2.3菌落PCR验证

pWJ-3375、pWJ-bdhI、pWJ-bdhII质粒转化入C.acetobutylicum EA2018D中后，可能将二类内含子的部分序列插入基因组的3375、bdhI、bdhII基因中，是否插入可以通过以插入位点上下游的引物加以验证。以引物SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14，SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16，SEQ ID NO.17和SEQ IDNO.18鉴定，未插入内含子的野生型菌将分别扩增出903bp、833bp、1047bp的条带，因为已知插入内含子的大小大约为914bp，因此如果有内含子插入那么扩增出的条带分别为1817bp、1747bp、1961bp。

PCR反应体系采用与实施例1相同的反应体系，引物为SEQ ID NO.：13和SEQ ID NO.：14，SEQ ID NO.：15和SEQ ID NO.：16，SEQ ID NO.：17和SEQ IDNO.：18。PCR反应条件：95℃5min；95℃30s，53℃30s，72℃2min，30个循环；72℃5min。

取PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1所示，WT：以C.acetobutylicum EA2018D基因组为模板的阴性对照；bdhI mutant：电转化得到的bdhI突变菌株；bdhII mutant：电转化得到的bdhII突变菌株；3375mutant：电转化得到的3375突变菌株；Marker为1kb DNA ladder。

结果表明，得到的转化子为插入了内含子的突变体。

实验例3

构建拜氏梭菌8052来源的醛脱氢酶的表达质粒

通过PCR扩增拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii NCIMB 8052)醛脱氢酶(ALD)片段(SEQ ID NO.21)，经PstI及BglII双酶切，与同样酶切的pSY8载体连接，得到的表达质粒p SY8-ALD。

3.1引物设计与合成

根据拜氏梭菌醛脱氢酶基因序列(SEQ ID NO.：21)(包含基因本身启动子和终止子区域)，设计引物ald-FW(SEQ ID NO.：19)、ALD-REV(SEQ ID NO.：20)用于构建p SY8-ALD质粒载体。

3.2拜氏梭菌NCIMB 8052基因组抽提

取过夜培养梭菌细胞，收集菌体，按AxyPrepTM Bacterial Genomic DNAMiniprep Kit提供方法进行基因组抽提。

3.3PCR扩增醛脱氢酶基因

以前一步抽提得到的8052基因组为模板，50ul PCR反应体系，使用KODplus DNA聚合酶进行PCR扩增。PCR反应条件：95℃5min；95℃30s，53℃30s，72℃2.5min，30个循环；72℃10min。将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收在1.9kb处的条带，该条带即为ald基因片段，然后使用华舜公司的胶回收试剂盒纯化回收PCR产物ald片段。

3.4构建p SY8-ALD重组质粒载体

将PCR纯化后获得的ald基因片段使用PstI及BglII进行酶切，同时使用PstI及BglII酶切载体pSY8，酶切后产物采用华舜公司的胶回收试剂盒纯化回收。回收后的酶切片段使用T4DNA连接酶分别与酶切后的载体连接，连接反应在16℃水浴锅中进行，反应时间10hr，将连接产物转化入E.coli DH5αCaCl₂化学感受态细胞，添加1mL LB液体培养基复苏1hr后涂布到LB固体培养基(添加氨苄青霉素，浓度100μg/mL)平板上。以ald-FW和ald-REV引物对长出的菌落进行PCR检测。菌落PCR可以扩增出1.9kb特异性条带，进一步通过质粒酶切验证和测序表明连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞后获得的阳性转化子含有重组质粒p SY8-ALD。

实施例4

在醇脱氢酶突变株2018DΔadh3375、2018DΔbdhI、2018DΔbdhII分别表达拜氏梭菌8052来源的醛脱氢酶

对pSY8-ALD质粒经E.coli ER2275/pANS1在Cac8I位点甲基化后，分别电转醇脱氢酶中断菌株Clostridium acetobutylicum 2018DΔadh3375、2018DΔbdhI、2018DΔbdhII，复苏过夜后，取300μl细胞液涂布于红霉素(40μg/mL)平板，厌氧箱内37℃培养48-96小时后，挑取单菌进行菌落PCR验证，具体步骤如下：

4.1p SY8-ALD质粒的甲基化

将pANS1质粒经化学转化入E.coli ER2275，获得菌株E.coliER2275/pANS1。

CaCl2法制备E.coli ER2275/pANS1的化学感受态细胞，然后将p SY8-ALD质粒转化E.coli ER2275/pANS1，由于pANS1质粒具有壮观霉素抗性，故在含有100μg/mL氨苄青霉素，50μg/mL壮观霉素的LB培养基平板上过夜培养，然后挑取单菌落接至4mL添加有100μg/mL氨苄青霉素，50μg/mL壮观霉素的LB培养基中，过夜培养。将获得的含pANS1及p SY8-ALD  的E.coli ER2275，用质粒抽提试剂盒抽提质粒，获得Cac824I识别位点已甲基化的质粒pSY8-ALD。

4.2电转p SY8-ALD质粒入醇脱氢酶突变株2018DΔadh3375、2018DΔbdhI、2018DΔbdhII

在CGM培养基(2g(NH₄)₂SO₄，1g K₂HPO₄，0.5g KH₂PO₄，0.1g MgSO₄.7H₂O，0.015g FeSO₄.7H₂O，0.01g CaCl₂，0.01g MnSO₄.H₂O，0.002g CoCl₂，0.002g ZnSO₄，2g Tryptone，1g Yeast Extraction，50g Glucose，2％agar溶于1L水中)平板上分别划线培养2018DΔadh3375、2018DΔbdhI、2018DΔbdhII，培养大约48hr后挑取单菌落接入5mL CGM液体培养基中培养，大约培养16hr后按1％接入50mL CGM液体培养基中，当培养菌体的OD600达到0.6-0.7之间时取出培养菌用于电转感受态制备。取出30mL菌液，放于50mL离心管中以4500rpm 4℃10min离心，弃上清，加入30mL 4℃ETM缓冲液(270mM蔗糖，0.6mM Na₂HPO₄，4.4mM NaH₂PO₄，10mM MgCl₂)悬浮，4500rpm 4℃10min离心，弃上清，加入3mL 4℃的ET缓冲液(270mM蔗糖，0.6mMNa₂HPO₄，4.4mM NaH₂PO₄)中。以下步骤在冰上操作，吸取180μL菌液加入预先已加入20μL(约1～3μg)p SY8-ALD质粒的EP管中，混匀后转入电转杯中(2mm)，使用Bio-Rad MicroPulser^TM电转仪电转，电压2.0kV，其余参考使用手册，电击后迅速加入常温的CGM培养基1mL，37℃培养8hr左右，取200μL细胞液涂布于红霉素(40μg/mL)CGM平板，培养约3-4天。

4.3菌落PCR验证

p SY8-ALD质粒转化入C.acetobutylicum EA2018D中后，可以通过以8052ALD基因上下游的引物加以验证。以引物SEQ ID NO.：19和SEQ ID NO.：20鉴定，导入pSY8-ALD质粒菌株将扩增出1.9Kb的条带，PCR反应体系采用与实施例3相同的反应体系，引物为SEQ ID NO.：19和SEQ ID NO.：20，PCR反应条件：95℃5min；95℃30s，53℃30s，72℃2.5min，30个循环；72℃5min。

取PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图2所示，对照为电转导入p SY8空载体的菌株，lane2、3、4、5均为导入pSY8-ALD质粒的菌株。结果表明，pSY8-ALD质粒已经分别成功导入醇脱氢酶突变株2018DΔadh3375、2018DΔbdhI、2018DΔbdhII。

实施例5

2018DΔadh3375、2018DΔbdhI、2018DΔbdhII醇脱氢酶突变株的发酵

对中断了醇脱氢酶的Clostridium acetobutylicum菌株2018DΔadh3375、2018DΔbdhI、2018DΔbdhII在P2培养基中发酵。具体过程为：从CGM平板上挑取单菌接入5mL CGM液体培养基中，过夜培养，以1％接种入50mL CGM培养基中，培养8～10hr菌浓OD600达到0.4，以5％接入P2培养基中。P2培养基的成分为：溶液1∶40g D-葡萄糖，20g D-木糖，加H₂O定溶至850mL；溶液2：NH₄Ac 2.2g，K₂HPO₄0.5g，KH₂PO₄0.5g，加H₂O定溶至100mL；溶液3：2.0g MgSO₄·7H₂O，0.1g MnSO₄·H₂O，0.1g NaCl，0.1g FeSO₄·7H₂O；溶液4：100ml蒸馏水中加入100mg氨基苯酸(ρ-aminobenzoic acid)，100mg维生素B1(thiamine)，1mg生物素(biotin)；溶液1和溶液2高温湿热灭菌，溶液3和溶液4过滤除菌，待溶液1和2冷却后再加入10mL溶液3和1mL溶液4，混匀分装成95mL/瓶后，配制培养基时在培养体系中添加1％CaCO3，以N2排除瓶中的空气。发酵的对照菌株为2018D/pSY8-ALD。丙酮、丁醇和乙醇由Agela7890A气相色谱仪测定完成。

发酵结果(图3)表明，中断醇脱氢酶3375，丁醇产量、比例与2018D/pSY8-ALD相比产物浓度显著下降，表明3375参与2018D/pSY8-ALD工程菌株中丁醇的生成，并且相比已知的醇脱氢酶bdhA、bdhB发挥更主要的作用。总溶剂比例的下降也表明，3375相比bdhI、bdhII具有更好的丁醇脱氢酶特异性。

表3

菌株	丙酮	乙醇	丁醇	丁醇/总溶剂	标准方差	N
							2018DΔ3375/ald	0.01	0.38	3.95	0.91	0.76	3
2018DΔbdhB/ald	0.01	0.35	6.13	0.94	0.66	3
							2018DΔbdhA/ald	0.01	0.50	9.16	0.95	1.59	3
Δ2018D/ald	0.03	0.44	8.76	0.95	-	1

表3：醇脱氢酶突变株表达ALD发酵48小时溶剂产量

实施例6

构建3375基因的回补质粒和过表达质粒

通过PCR扩增丙酮丁醇梭菌Clostridium acetobutylicum ATCC824CACCA_C3375醇脱氢酶，经HindIII和PstI双酶切，与同样酶切的pSY8-ALD载体连接，得到回补质粒pSY8-ALD-3375。回补质粒pSY8-ALD-3375经BamH1和EcoRI双酶切，与同样酶切的pIMPI-Pptb载体连接，得到过表达质粒p IMPI-Pptb-3375。pIMPI-Pptb载体全序列如SEQ ID NO：30所示。

具体方法如下：

1.1引物设计与合成

根据丙酮丁醇梭菌醇脱氢酶基因序列，设计引物3375-FW1(SEQ ID NO.：25)和3375-REV1(SEQ ID NO.：26)，用于构建pSY8-ALD-3375质粒载体，引物3375-FW2(SEQ ID NO.：27)、3375-REV2(SEQ ID NO.：28)用于构建pIMPI-Pptb-3375。

1.2丙酮丁醇梭菌ATCC 824基因组抽提

取过夜培养梭菌细胞，收集菌体，按AxyPrepTM Bacterial Genomic DNAMiniprep Kit提供方法进行基因组抽提。

1.3PCR扩增

以前一步抽提得到的8052基因组为模板，使用KOD plus DNA聚合酶进行PCR扩增。PCR反应条件：95℃5min；95℃30s，53℃30s，72℃2.5min，30个循环；72℃10min。将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，分别回收在1.5kb、1.2kb处的条带，该条带即为3375基因片段，然后使用华舜公司的胶回收试剂盒纯化回收PCR产物3375片段。

1.4构建p SY8-ALD-3375、p IMPI-Pptb-3375质粒载体

将PCR纯化后获得的3375基因片段分别使用HindIII及PstI、BamHI及EcoRI进行酶切，同时使用HindIII及PstI酶切载体pSY8-ALD，BamHI及EcoRI酶切载体p IMPI，酶切后产物采用华舜公司的胶回收试剂盒纯化回收。回收后的酶切片段使用T4-DNA连接酶分别与酶切后的载体连接，连接反应在16℃水浴锅中进行，反应时间10hr，将连接产物转化入E.coli DH5αCaCl₂化学感受态细胞，添加1mL LB液体培养基复苏1hr后涂布到LB固体培养基(添加氨苄青霉素，浓度100μg/mL)平板上。

以3375-FW1(SEQ ID NO.：25)和3375-REV1(SEQ ID NO.：26)引物、3375-FW2(SEQ ID NO.：27)和3375-REV2(SEQ ID NO.：28)对长出的菌落进行PCR检测。菌落PCR分别可以扩增出1.5kb、1.2kb特异性条带，进一步通过质粒酶切验证和测序表明连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞后获得的阳性转化子分别含有重组质粒p SY8-ALD-3375、p IMPI-Pptb-3375。

实施例7

在醇脱氢酶突变株2018DΔadh3375、模式菌株ATCC 824中分别表达3375回补质粒p SY8-ALD-3375和过表达质粒p IMPI-Pptb-3375

对p SY8-ALD-3375、p IMPI-Pptb-3375质粒经E.coli ER2275/pANS1在Cac8I位点甲基化后，分别电转醇脱氢酶中断菌株2018DΔ3375、ATCC824，复苏过夜后，取300μl细胞液分别涂布于甲砜霉素(17μg/mL)、红霉素(40μg/mL)平板，厌氧箱内37℃培养48-96小时后，挑取单菌进行菌落PCR验证，具体步骤如下：p SY8-ALD-3375、p IMPI-Pptb-3375质粒的甲基化方法同实施例2；电转p SY8-ALD-3375、p IMPI-Pptb-3375质粒入醇脱氢酶突变株2018DΔadh3375、ATCC824的方法同实施例2。

菌落PCR验证：p SY8-ALD-3375质粒转化入2018DΔadh3375中后，可以通过以3375基因上下游的引物加以验证。以引物SEQ ID No.25和SEQ ID No.26鉴定，导入p SY8-ALD-3375质粒菌株将扩增出1.5Kb的条带。pIMPI-Pptb-3375质粒转化入ATCC824中后，可以引物以引物SEQ ID No.27和SEQ ID No.28鉴定，导入pIMPI-Pptb-3375质粒菌株将扩增出1.2kb的条带。PCR反应体系采用与实施例3相同的反应体系，引物分别为SEQ ID NO.：25和SEQ ID NO.：26、SEQ IDNO.：25和SEQ ID NO.：26。PCR反应条件：95℃5min；95℃30s，53℃30s，72℃1min40s，30个循环；72℃5min。

实施例8

3375回补菌株2018DΔadh3375/pSY8-ALD-3375、和3375过表达菌株824/pIMPI-Pptb-CA_C3375醇脱氢酶突变株的发酵

发酵方法同实验例5。

回补实验结果表明，菌株2018DΔadh3375/pSY8-ALD-3375生产定丁醇的能力得到恢复；

过表达实验结果表明，3375过表达菌株824/pIMPI-Pptb-CA_C337生产丁醇的能力得到提高。

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在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种分离的CA_C3375醇脱氢酶或其编码基因的用途，其特征在于，它被用于调节丙酮丁醇梭菌产生溶剂的能力。

2.如权利要求1所述的CA_C3375醇脱氢酶，其特征在于，所述的溶剂选自下组：乙醇，丙酮，丁醇，或其组合。

3.如权利要求1所述的CA_C3375醇脱氢酶，其特征在于，所述的CA_C3375醇脱氢酶选自下组：

(i)具有SEQ ID NO.：29所示氨基酸序列的多肽；

(ii)将SEQ ID NO.：29所示氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的、由(i)衍生的多肽；

(iii)氨基酸序列与SEQ ID NO.：29所示氨基酸序列的同源性≥90％(较佳地≥95％，更佳地≥97％，更佳地≥99％)、由(1)衍生的多肽。

4.如权利要求1所述的CA_C3375醇脱氢酶，其特征在于，所述CA_C3375醇脱氢酶的编码基因是选自下组的一种或多种：

(1)编码如SEQ ID NO.：29所述多肽的多核苷酸；

(2)序列如SEQ ID NO.：1所示的多核苷酸；

(3)序列与SEQ ID NO.：1所示序列的同源性≥95％(较佳地≥97％，更佳的≥99％)的多核苷酸；

(4)与(1)-(3)任一所述的多核苷酸序列互补的多核苷酸。

5.一种提高丙酮丁醇梭菌产生丁醇能力的方法，其特征在于，包括步骤：提高丙酮丁醇梭菌中CA_C3375醇脱氢酶基因的表达水平，或提高丙酮丁醇梭菌中CA_C3375醇脱氢酶的活性。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的提高是指，与野生型丙酮丁醇梭菌相比，CA_C3375醇脱氢酶基因的mRNA表达水平提高10％以上，或CA_C3375醇脱氢酶的表达或活性上升10％以上；

较佳地，所述的提高通过选自下组的一种或多种方式实现：导入额外的CA_C3375醇脱氢酶、引入提高CA_C3375醇脱氢酶的表达或活力的突变、或引入瞬时表达CA_C3375醇脱氢酶的表达载体。

7.一种丙酮丁醇梭菌，其特征在于，所述丙酮丁醇梭菌中CA_C3375醇脱氢酶基因的表达水平或CA_C3375醇脱氢酶的活性提高。

8.如权利要求7所述的丙酮丁醇梭菌，其特征在于，所述的提高是指，与野生型丙酮丁醇梭菌相比，CA_C3375醇脱氢酶基因的mRNA表达水平提高10-100％，或CA_C3375醇脱氢酶的表达或活性提高10-100％；

较佳地，所述的提高通过选自下组的一种或多种方式实现：导入额外的CA_C3375醇脱氢酶、引入提高CA_C3375醇脱氢酶的表达或活力的突变、或引入瞬时表达CA_C3375醇脱氢酶的表达载体。

9.权利要求7所述丙酮丁醇梭菌的用途，其特征在于，它被用于生产溶剂。

10.一种生产丁醇的方法，其特征在于，包括步骤：

(A)在适合的条件下，培养权利要求7所述的丙酮丁醇梭菌，获得含有丁醇的培养物；和

(B)从所述的培养物中分离和/或纯化丁醇。

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