CN110218719A - 一种好氧反硝化菌剂的制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种好氧反硝化菌剂的制备方法，属于反硝化菌应用技术领域。该技术方法将反硝化菌固定在以海藻酸钠SA和羧甲基纤维素钠CMC为载体，CaCl2为交联剂，在4℃下交联一定时间后形成的小球中，小球用蒸馏水洗净、风干得到好氧反硝化菌剂；制作过程依次包括：反硝化菌的活化，反硝化细菌扩大培养和固定化小球的制备，并测定了菌剂的反硝化活力。本发明制作所需的材料原料廉价易得可降解，制作工艺及设备要求简单。本发明获得的好氧反硝化菌剂在有氧气存在条件下反硝化效果仍然明显，为现有污水处理工艺中好氧硝化和厌氧反硝化分池进行、需要混合液回流等问题的解决，降低污水处理过程中的基建和运行费用，提供了较好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及生物脱氮及细菌固定化技术，具体涉及一种好氧反硝化菌剂的制备方法及其应用。
背景技术
氮是水体的营养素，也是环境水体污染的一项重要指标。水体中氮元素含量过高，会导致水体富营养化，从而引起藻类和其它浮游生物迅速繁殖，水体溶氧量下降，使得水体发黑发臭，鱼类及其它生物大量死亡的现象，水质下降。
反硝化细菌能将水体中的化合态氮转化为氮气从水体中释放出去。生物反硝化是自然界氮循环和污水处理系统的重要组成部分，在缺氧或厌氧条件下通过反硝化菌的反硝化作用将硝氮转化为氮气，释放到大气参与自然界氮的循环，水中含氮物质大量减少，降低水体富营养化及污水处理厂出水的潜在危险性，达到从自然水体和废水中脱氮的目的。生物反硝化更是世界上目前污水处理厂的重要生物过程。而常见的反硝化细菌是一类兼性厌氧微生物，当环境中有分子态氧存在时，反硝化细菌利用分子态氧作为最终电子受体，氧化分解有机物，而不进行反硝化作用。目前世界上大部分污水处理厂均采用分池法进行脱氮处理，即硝化和反硝化在两个不同的反应器内进行。以应用最为广泛的A2O为例，氨氮经过好氧池硝化作用转化为硝酸盐，好氧池混合液回流进入缺氧池，再缺氧池中利用反硝化微生物在厌氧或者缺氧条件下，将硝酸盐转化为氮气，完成污水的生物脱氮过程。这种工艺基建费用高，污水、污泥以及回流系统设计复杂，能耗较大且管理不便。另外，好氧池回流的混合液中溶解氧浓度较高，造成缺氧反硝化效果不好。
由前面的分析可知，造成目前污水处理系统问题的根本原因在于溶解氧对反硝化过程的干扰。若能够克服这种缺点，使得硝化/反硝化过程可以完成空间和时间上的统一，在同一个反应器内同时硝化/反硝化，便能够克服传统工艺的缺点，节省基建和运行费用。另外，硝化反硝化统一，更容易满足反硝化处理过程中对碳源和碱度等条件的要求，减少投药量，提高反硝化效果。
近年来固定化技术得到迅速发展，它是使生物催化剂(比如酶、微生物细胞、动植物细胞)经过包埋或固定，而更广泛而被有效利用的一个重要方法。常用的固定技术有吸附法、包埋法、交联法和膜截留法。本专利利用微生物固定化技术，将厌氧反硝化菌利用海藻酸钠(SA)和羧甲基纤维素钠(CMC)进行包埋，利用载体对氧产生的扩散阻力在颗粒内部缺氧区和厌氧区，使反硝化细菌得以生存代谢，从而保证厌氧反硝化菌即使在好氧条件下也能获得较高的反硝化效果。该法操作简单，对细胞活性影响较小，且细胞容量高。包埋材料可分为天然高分子多糖类和合成高分子化合物，制备后的固定化细胞球的强度高，反应速率快，降解效率高。
发明内容
鉴于传统生物脱氮技术基建费用高，污水、污泥以及回流系统设计复杂，能耗较大且管理不便以及氧气对传统反硝化效果影响较大等缺点，本发明提供了一种好氧反硝化菌剂的制备方法及其应用。本方法制备的固定化反硝化菌球可以延长反硝化细菌在系统中存留时间，避免外界因素尤其是氧气对细菌的干扰，能够有效提高好氧反硝化效果。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为：一种好氧反硝化菌剂的制备方法，包括以下步骤：
S1反硝化细菌的活化：将反硝化细菌菌种置于恒温摇床中于28-35℃、150-180r/min的条件下培养20-28h，然后向培养后的反硝化细菌菌种中加入灭过菌的甘油，制作含甘油体积浓度为25-35％反硝化菌储存液，将细菌储存液装入甘油管，置于冰箱中低于-18℃的温度下冷藏(可保存3-6个月)，备用；
S2反硝化细菌的扩大培养：将步骤S1中反硝化细菌甘油管中的细菌储存液接种到灭过菌的LB液体培养基中，而后置于恒温摇床中于28-35℃、150-180r/min的条件下扩大培养20-28h；获得扩大培养的反硝化细菌菌液；
S3固定化小球的制备：将步骤S2中获得的扩大培养的反硝化细菌菌液置于离心机中于转速3000-5000r/min的条件下，离心5-15min，离心结束后弃去上清液，用生理盐水清洗多次并重新悬浮于生理盐水中，制备细菌使用液；将制得的细菌使用液加入包埋剂中，搅拌混合均匀，然后将混合液逐滴加入CaCl2溶液交联剂中，在0-10℃下交联12-36h，再用蒸馏水洗净、干燥，得到小球状的好氧反硝化菌剂；其中，包埋剂为含质量分数1-4％海藻酸钠和质量分数1-4％的羧甲基纤维素混合液，通过将海藻酸钠和羧甲基纤维素加入水中，煮沸溶解、混合均匀、冷却后获得。
所述反硝化细菌为厌氧反硝化菌，可通过购买或者人工筛选获得，本申请为购得的Paracoccus denitrificans为兼性厌氧反硝化细菌。
所述细菌使用液和包埋剂的体积比为1:(35-50)。
所述CaCl2溶液交联剂的质量浓度为1-4％。
所述小球状的好氧反硝化菌剂粒径为3～4mm。
上述好氧反硝化菌剂的制备方法制备得到的好氧反硝化菌剂及其在反硝化方面的应用。
具体步骤为：将制备得到的小球状的好氧反硝化菌剂用蒸馏水洗净后按照1:(5～15)(好氧反硝化菌剂与反硝化培养基体积比)的体积比倒入盛有反硝化培养基(或者含硝酸盐废水)的血清瓶中，然后将血清瓶置于恒温摇床中于28-30℃、150-180r/min的条件下，敞口好氧培养，每隔4h取一次样，分别用紫外分光光度法和重氮偶合分光光度法测定样品中的硝酸盐和亚硝酸盐的含量，得出其反硝化效果。上述实验中所用的反硝化培养基配方如下：将0.35g NH4Cl、1.30g KNO3、3.0g葡萄糖、7.04g Na2HPO4、1.46g KH2PO4、0.06g MgSO4和0.06mL的微量元素溶解于600mL无菌水中，混合均匀即得反硝化培养基。
本发明的有益效果：本方法制备得到的凝胶小球状好氧反硝化菌剂将细菌与含氧的培养基(或水溶液)隔离，微生物凝胶小球状好氧反硝化菌剂内部存在对氧扩散的限制，从而形成大环境的好氧区和内部微环境的缺氧及厌氧区，有利于脱氮副球菌进行厌氧反硝化，从而保证了在有氧气存在条件下的高反硝化效果。
同时，本发明采用的海藻酸钠具有药物制剂辅料所需的稳定性、溶解性、粘性和安全性，生物可将降解而且生物活性高；羧甲基纤维素钠能够降低分子之间本身的氢键作用，从而降低共混膜的强度，提高共混膜的伸长率，且具有良好的吸湿性。两者的结合使制成的凝胶小球具有更高的强度和活性。本方法采用的氯化钙微毒、无臭、味微苦，吸湿性极强，氯化钙作为交联剂有利于提高膜的阻隔性能、机械性能及抗水性能，且增强了海藻酸钠和羧甲基纤维素钠的凝胶性。
附图说明
图1为本发明制备得到的小球状的好氧反硝化菌剂；
图2为本发明实施例1-4制备得到的小球状好氧反硝化菌剂的反硝化效果对比图；
图3为本发明实施例5制备得到的小球状好氧反硝化菌剂与传统的游离态生长的反硝化细菌的反硝化效果对比图。
具体实施方式
以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明；其中，厌氧反硝化菌菌种Paracoccus denitrificans和LB液体培养基为市售品。
实施例1
一种好氧反硝化菌剂的制备方法，包括以下步骤：
S1反硝化细菌的活化：将厌氧反硝化菌菌种Paracoccus denitrificans置于恒温摇床中于28℃、150r/min的条件下培养28h，然后向培养后的厌氧反硝化细菌菌种中加入灭过菌的甘油，制作含甘油体积浓度为30％反硝化菌储存液，将细菌储存液装入甘油管，置于冰箱中于-18℃冷藏备用；
S2反硝化细菌的扩大培养：将步骤S1中厌氧反硝化细菌甘油管制得的细菌储备液接种到灭过菌的100mL LB液体培养基中，然后置于恒温摇床中于28℃、150r/min的条件下培养24h；获得扩大培养的反硝化细菌菌液；
S3固定化小球的制备：将步骤S2中获得的扩大培养的反硝化细菌菌液置于离心机中于转速4000r/min的条件下离心10min，离心结束后弃去上清液，用生理盐水清洗多次，而后用生理盐水重新悬浮制备细菌使用液，将制得的悬浮菌液按体积比为1:40的比例加入包埋剂中，搅拌混合均匀，然后将混合液逐滴加入质量浓度为2％的CaCl2溶液交联剂中，在4℃下交联24h，再用蒸馏水洗净、自然风干干燥，得到粒径为3～4mm的小球状的好氧反硝化菌剂；其中，包埋剂为含1％(质量分数)海藻酸钠和2％(质量分数)羧甲基纤维素的混合液，通过将海藻酸钠和羧甲基纤维素加入水中，煮沸溶解、混合均匀、冷却后获得。
上述好氧反硝化菌剂的制备方法制备得到的小球状好氧反硝化菌剂在反硝化方面应用的具体步骤为：
本发明使用反硝化培养基验证好氧反硝化菌剂的应用效果，其反硝化培养基的配方如下：将0.35gNH4Cl、1.30g KNO3、3.0g葡萄糖、7.04g Na2HPO4、1.46g KH2PO4、0.06gMgSO4和0.06mL的微量元素溶解于600mL无菌水中，混合均匀即得反硝化培养基。将制备得到的小球状好氧反硝化菌剂用蒸馏水洗净后以1:10(好氧反硝化菌剂与反硝化培养基体积比)加入反硝化培养基中，然后将血清瓶置于恒温摇床中于28℃、150r/min的条件下，敞口好氧培养，每隔4h取一次样，分别用紫外分光光度法和重氮偶合分光光度法测定样品中的硝酸盐和亚硝酸盐的含量。
测定结果如图2所示，初始的硝酸盐浓度为286.5mg/L时，随着反应的进行硝酸盐浓度逐渐下降，去除率逐步升高，如第12h，16h，20h和24h的硝酸盐去除率分别为24％，49％，87％和98％。
实施例2
S1反硝化细菌的活化：将厌氧反硝化菌菌种Paracoccus denitrificans置于恒温摇床中于28℃、150r/min的条件下培养28h，然后向培养后的厌氧反硝化细菌菌种中加入灭过菌的甘油，制作含甘油体积浓度为30％反硝化菌储存液，将细菌储存液装入甘油管，置于冰箱中于-18℃冷藏备用；
S2反硝化细菌的扩大培养：将步骤S1中厌氧反硝化细菌甘油管制得的细菌储备液接种到灭过菌的100mL LB液体培养基中，然后置于恒温摇床中于28℃、150r/min的条件下培养24h；获得扩大培养的反硝化细菌菌液；
S3固定化小球的制备：将步骤S2中获得的扩大培养的反硝化细菌菌液置于离心机中于转速4000r/min的条件下离心10min，离心结束后弃去上清液，用生理盐水清洗多次，而后用生理盐水重新悬浮制备细菌使用液，将制得的悬浮菌液按体积比为1:40的比例加入包埋剂中，搅拌混合均匀，然后将混合液逐滴加入质量浓度为2％的CaCl2溶液交联剂中，在4℃下交联24h，再用蒸馏水洗净、自然风干干燥，得到粒径为3～4mm的小球状的好氧反硝化菌剂；其中，包埋剂为含2％(质量分数)海藻酸钠和2％(质量分数)羧甲基纤维素的混合液，通过将海藻酸钠和羧甲基纤维素加入水中，煮沸溶解、混合均匀、冷却后获得。
上述好氧反硝化菌剂的制备方法制备得到的小球状好氧反硝化菌剂在反硝化方面应用的具体步骤为：
将制备得到的小球状的好氧反硝化菌剂用蒸馏水洗净后，按体积比1:10(好氧反硝化菌剂与反硝化培养基体积比)加入含有反硝化培养基(配方与实施例1相同)的血清瓶中，然后将血清瓶置于恒温摇床中于28℃、150r/min的条件下，敞口好氧培养，每隔4h取一次样，分别用紫外分光光度法和重氮偶合分光光度法测定样品中的硝酸盐和亚硝酸盐的含量。
测定结果如图2所示，初始的硝酸盐浓度为286.5mg/L时，随着反应的进行硝酸盐浓度逐渐下降，去除率逐步升高，如第12h，16h，20h和24h的硝酸盐去除率分别为17％，37％，51％和97％。
实施例3
S1反硝化细菌的活化：将厌氧反硝化菌菌种Paracoccus denitrificans置于恒温摇床中于28℃、150r/min的条件下培养28h，然后向培养后的厌氧反硝化细菌菌种中加入灭过菌的甘油，制作含甘油体积浓度为30％反硝化菌储存液，将细菌储存液装入甘油管，置于冰箱中于-18℃冷藏备用；
S2反硝化细菌的扩大培养：将步骤S1中厌氧反硝化细菌甘油管制得的细菌储备液接种到灭过菌的100mL LB液体培养基中，然后置于恒温摇床中于28℃、150r/min的条件下培养24h；获得扩大培养的反硝化细菌菌液；
S3固定化小球的制备：将步骤S2中获得的扩大培养的反硝化细菌菌液置于离心机中于转速4000r/min的条件下离心10min，离心结束后弃去上清液，用生理盐水清洗多次，而后用生理盐水重新悬浮制备细菌使用液，将制得的悬浮菌液按体积比为1:40的比例加入包埋剂中，搅拌混合均匀，然后将混合液逐滴加入质量浓度为2％的CaCl2溶液交联剂中，在4℃下交联24h，再用蒸馏水洗净、自然风干干燥，得到粒径为3～4mm的小球状的好氧反硝化菌剂；其中，包埋剂为含2％(质量分数)海藻酸钠和1％(质量分数)羧甲基纤维素的混合液，通过将海藻酸钠和羧甲基纤维素加入水中，煮沸溶解、混合均匀、冷却后获得。
上述好氧反硝化菌剂的制备方法制备得到的小球状好氧反硝化菌剂在反硝化方面应用的具体步骤为：
将制备得到的小球状的好氧反硝化菌剂用蒸馏水洗净后，按体积比1:10(好氧反硝化菌剂与反硝化培养基体积比)加入含有反硝化培养基(配方与实施例1相同)的血清瓶中，然后将血清瓶置于恒温摇床中于28℃、150r/min的条件下，敞口好氧培养，每隔4h取一次样，分别用紫外分光光度法和重氮偶合分光光度法测定样品中的硝酸盐和亚硝酸盐的含量。
测定结果如图2所示，初始的硝酸盐浓度为286.5mg/L时，随着反应的进行硝酸盐浓度逐渐下降，去除率逐步升高，如第12h，16h，20h和24h的硝酸盐去除率分别为17％，45％，65％和91％。
实施例4
S1反硝化细菌的活化：将厌氧反硝化菌菌种Paracoccus denitrificans置于恒温摇床中于28℃、150r/min的条件下培养28h，然后向培养后的厌氧反硝化细菌菌种中加入灭过菌的甘油，制作含甘油体积浓度为30％反硝化菌储存液，将细菌储存液装入甘油管，置于冰箱中于-18℃冷藏备用；
S2反硝化细菌的扩大培养：将步骤S1中厌氧反硝化细菌甘油管制得的细菌储备液接种到灭过菌的100mL LB液体培养基中，然后置于恒温摇床中于28℃、150r/min的条件下培养24h；获得扩大培养的反硝化细菌菌液；
S3固定化小球的制备：将步骤S2中获得的扩大培养的反硝化细菌菌液置于离心机中于转速4000r/min的条件下离心10min，离心结束后弃去上清液，用生理盐水清洗多次，而后用生理盐水重新悬浮制备细菌使用液，将制得的悬浮菌液按体积比为1:40的比例加入包埋剂中，搅拌混合均匀，然后将混合液逐滴加入质量浓度为2％的CaCl2溶液交联剂中，在4℃下交联36h，再用蒸馏水洗净、自然风干干燥，得到粒径为3～4mm的小球状的好氧反硝化菌剂；其中，包埋剂为含2％(质量分数)海藻酸钠和2％(质量分数)羧甲基纤维素的混合液，通过将海藻酸钠和羧甲基纤维素加入水中，煮沸溶解、混合均匀、冷却后获得。
上述好氧反硝化菌剂的制备方法制备得到的小球状好氧反硝化菌剂在反硝化方面应用的具体步骤为：
将制备得到的小球状的好氧反硝化菌剂用蒸馏水洗净后，按体积比1:10(好氧反硝化菌剂与反硝化培养基体积比)加入含有反硝化培养基(配方与实施例1相同)的血清瓶中，然后将血清瓶置于恒温摇床中于28℃、150r/min的条件下，敞口好氧培养，每隔4h取一次样，分别用紫外分光光度法和重氮偶合分光光度法测定样品中的硝酸盐和亚硝酸盐的含量。
测定结果如图2所示，初始的硝酸盐浓度为286.5mg/L时，随着反应的进行硝酸盐浓度逐渐下降，去除率逐步升高，如第12h，16h，20h和24h的硝酸盐去除率分别为12％，61％，95％和99％。
实施例5
为了进一步验证本发明方法制备的好氧反硝化菌剂的在有氧气存在条件下反硝化能力及优势，开展如下实验：
(1)制备反硝化培养基：配方及制作方法与实施例1相同。
(2)固定化小球的制备和检测：先按照实例1中S2反硝化细菌的扩大培养的步骤进行接种培养，得到扩大培养的反硝化细菌菌液；然后按照实例1中S3固定化小球的制备的步骤中的方法制备小球状的好氧反硝化菌剂，但其中包埋剂由含质量分数2％海藻酸钠与质量分数2％羧甲基纤维素钠混合液构成，交联剂为质量浓度2％的氯化钙溶液，交联时间为24h；
取A和B两个容积为100mL的血清瓶，向两瓶中分别加入50mL上述步骤(1)所配置的反硝化培养基，然后按体积比1:10(好氧反硝化菌剂与反硝化培养基体积比)加入含有反硝化培养基的血清瓶A中；向血清瓶B中加入与血清瓶A中相同含量的游离态的反硝化菌使用液(即50mL×1/10×1/40)，再将A和B两个血清瓶都置于恒温摇床中于28℃、150r/min的条件下，敞口好氧培养，重复三次实验；
(3)硝酸盐亚硝酸盐的测定：从A和B两个血清瓶放入摇床后开始计时，每隔4h取一次样，分别采用紫外分光光度法以及重氮偶合分光光度法来测定样品中的硝酸盐和亚硝酸盐含量；经测定，在有氧气(敞口)培养条件下，小球状好氧反硝化菌剂对硝态氮的还原能力明显高于游离态细菌，还原速率达到7.96mg/(L·h)，总氮去除率达85.2％，而游离细菌仅为19.3％。如图3所示，实验证实，常见的反硝化菌在有氧气存在的条件下反硝化能力较弱，而在相同的有氧培养条件下，本发明所获得的好氧反硝化菌剂反硝化效果显著提高。
综上所述，本发明制作获得的好氧反硝化菌剂在有氧气存在条件下反硝化效果仍然明显，为现有污水处理工艺中好氧硝化和厌氧反硝化分池进行、需要混合液回流等问题的解决，降低污水处理过程中的基建和运行费用，提供了较好的应用前景。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种好氧反硝化菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1反硝化细菌的活化：将反硝化细菌菌种置于恒温摇床中于28-35℃、150-180r/min的条件下培养20-28h，然后向培养后的反硝化细菌菌种中加入灭过菌的甘油，制作含甘油体积浓度为25-35％反硝化菌储存液，将细菌储存液装入甘油管，置于冰箱中冷藏，备用；
S2反硝化细菌的扩大培养：将步骤S1中反硝化细菌甘油管中的细菌储存液接种到灭过菌的LB液体培养基中，而后置于恒温摇床中于28-35℃、150-180r/min的条件下扩大培养20-28h；获得扩大培养的反硝化细菌菌液；
S3固定化小球的制备：将步骤S2中获得的扩大培养的反硝化细菌菌液置于离心机中于转速3000-5000r/min的条件下，离心5-15min，离心结束后弃去上清液，用生理盐水清洗多次并重新悬浮于生理盐水中，制备细菌使用液；将制得的细菌使用液加入包埋剂中，搅拌混合均匀，然后将混合液逐滴加入CaCl2溶液交联剂中，在0-10℃下交联12-36h，再用蒸馏水洗净、干燥，得到小球状的好氧反硝化菌剂；其中，包埋剂为含质量分数1-4％海藻酸钠和质量分数1-4％的羧甲基纤维素混合液，通过将海藻酸钠和羧甲基纤维素加入水中，煮沸溶解、混合均匀、冷却后获得。
2.根据权利要求1所述的一种好氧反硝化菌剂的制备方法，其特征在于：所述冷藏温度低于-18℃。
3.根据权利要求1所述的一种好氧反硝化菌剂的制备方法，其特征在于：在步骤1中，所述反硝化细菌为厌氧反硝化菌。
4.根据权利要求1所述的一种好氧反硝化菌剂的制备方法，其特征在于：在步骤3中，所述细菌使用液和包埋剂的体积比为1：(35-50)。
5.根据权利要求1所述的一种好氧反硝化菌剂的制备方法，其特征在于：在步骤3中，所述CaCl2溶液交联剂的质量浓度为1-4％。
6.根据权利要求1所述的一种好氧反硝化菌剂的制备方法，其特征在于：在步骤3中，所述小球状的好氧反硝化菌剂粒径为3～4mm。
7.根据权利要求1-6任意一项所述的一种好氧反硝化菌剂的制备方法制备得到的好氧反硝化菌剂。
8.一种如权利要求7所述的好氧反硝化菌剂在反硝化方面的应用。
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