CN102083885A

CN102083885A - 分离聚羟基链烷酸酯的方法

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Publication number: CN102083885A
Application number: CN2009801257496A
Authority: CN
Inventors: R·霍尔曼; B·库伯; P·普雷舒伯-普夫吕格尔; A·施耐德
Original assignee: BASF SE
Current assignee: BASF SE
Priority date: 2008-07-02
Filing date: 2009-06-30
Publication date: 2011-06-01
Also published as: US20110112274A1; WO2010000719A1; BRPI0913675A2; DE112009001441A5; US8313935B2

Abstract

本发明涉及一种从生产细胞中分离聚羟基链烷酸酯的方法，其特征在于：i)蒸解所述生产细胞，然后ii)通过连续射流分离器将细胞碎片与聚羟基链烷酸酯颗粒分离；iii)用碱性水溶液洗涤浓缩的聚羟基链烷酸酯颗粒，然后iv)用含水酸洗涤。

Description

分离聚羟基链烷酸酯的方法

本发明涉及一种从生产细胞中分离聚羟基链烷酸酯的方法。

i)分解所述生产细胞，然后

ii)通过连续射流分离器将细胞碎片与聚羟基链烷酸酯颗粒分离；

iii)用一种碱性水溶液洗涤浓缩的聚羟基链烷酸酯，然后

iv)用一种含水酸洗涤。

聚羟基链烷酸酯(PHA)——例如聚羟基丁酸酯(PHB)——可用细菌合成。例如，在Biopolymer，Wiley-VCH，2002中描述了这样的生物技术方法。

PHB在发酵末期以被蛋白质包膜包裹的颗粒形式存在于细菌细胞中(J.Biol.Chem.1989，vol.264(6)，3286-3291)。为获得足够纯的PHB，必须将其与细菌细胞分离。

用生物技术生产的粗混合物除了含有所需的聚羟基链烷酸酯外，还含有生产所述聚羟基链烷酸酯的微生物(生产细胞，生物质(biomass)，或非聚羟基链烷酸酯物质)。从生物质中分离聚羟基链烷酸酯的方法可以是a)溶解所述生物质，b)用合适的提取介质提取所述聚羟基链烷酸酯或c)将所述生物质(生产细胞)机械分解，然后将细胞碎片与所述聚羟基链烷酸酯(PHA)颗粒分离。

对此最常用的方法是利用溶剂将PHA颗粒从生物质中提取出来(处理b))。结果是使用溶剂有许多缺点。不得不投资复杂而昂贵的基础设施来处理和回收溶剂。提取出的生物质必须不含溶剂残余物才能进一步用作肥料或饲料。由于PHB在很多溶剂中仅能不充分地溶解，因而所需溶剂的量很多。

为分解和溶解所述生物质(处理a))，可使用例如酶或化学方法。此外，可加入表面活性化合物。可以多种方法组合使用。在Research In Microbiology 2005，156，865-873中描述了由基因修饰的大肠杆菌(Escherichia coli)细胞形成的聚羟基丁酸酯(PHB)的释放，并在后文提到了细胞自溶步骤。未描述确切的细胞自溶条件。细胞自溶是细胞通过其自身的酶而自溶解的过程。这种制备方法有以下缺点。由于自溶进行不完全并且细胞碎片和PHB颗粒仍相互粘着，因而仅能释放大约80％形成的PHB。

WO 2007/135039描述了一种值得注意的机械处理c)。生产细胞通过一种高压均化设备分解并将生产细胞的细胞碎片通过射流分离器与形成的聚羟基链烷酸酯颗粒分离。当具有极高聚羟基链烷酸酯含量的生产细胞作为起始物时此方法非常有效。在其他情况下，分离除去细胞碎片(细胞壁)并不总是完全令人满意地成功。蛋白质(含氮)杂质导致颜色改变(参见Biotechnology Techniques，Vol.11，No.6，June 1997，page 411，左栏最后一段)并导致聚羟基链烷酸酯具有较低的热稳定性(Polymer Degradation and Stability 52(1996)，page 38，左栏)。

因此目标是寻找一种可将生产细胞的细胞碎片与形成的聚羟基链烷酸酯颗粒完全分离的方法。

此目标通过开篇处提到的4-步骤处理出色地实现。此方法因高效、经济可行性和卓越的处理能力而从常规方法中脱颖而出。

必需的设备在技术上可获得并且可根据需要放大，因此所述方法可容易地用于工业规模。

本发明的一个具体实施方案在步骤i)中通过机械方法分解生产细胞。无化学试剂的分解有其优点。已描述可用均化器分解PHB-生产细菌真养产碱菌(Alcaligenes eutrophus)的细胞(Bioseparation 1991，2，155-166)。存在于细胞中的PHB颗粒实际上在4次通过均化器后可与细胞基本完全分离。在此类均质器中，细胞悬浮液被挤压通过一个阀(valve)。通过调节阀锥和阀座之间的空隙宽度产生湍流。然后使从所述阀挤出的悬浮液冲击钢板。因此该机器的压力限制在1500bar。

为产生较高压力，需要大量电能。用均化器分解细胞是经济的，在细胞单次通过后即完全分解的情况下尤为如此。在Bioseparation 1991，2，155-166中描述的方法的缺点是需要4次通过均化器。

发明人现已证实，含有PHA的细胞，特别是真养产碱菌，可用以下描述的高压均化器容易地分解。在这种情况下，在2000bar或更高压力下单次通过所述高压均化器，可分解超过99％的细胞并且PHA基本完全释放。因此本发明还涉及使用一种在2000大气压或更高压力下运行的高压均化器的分解方法。例如，所述均化器包括以下配置：

合适的均化设备的实例：

a)包括一个具有至少一个入口喷嘴的孔板和一个具有至少一个出口喷嘴的孔板，若合适，在所述孔板之间的中部空间引入机械能，或

b)包括一个具有至少一个入口喷嘴的孔板和一个冲击板(impact plate)，若合适，在所述孔板和所述冲击板之间的中部空间引入机械能。

实施方案a)

用于分离聚羟基链烷酸酯的均化器包括，例如，一个具有至少一个入口喷嘴的孔板和一个具有至少一个出口喷嘴的孔板，所述喷嘴相互轴向排列。在孔板之间的中部空间可放置一个静态混合器。若合适，在中部空间另外引入机械能。

可用于本发明方法的孔板具有至少一个孔，即至少一个喷嘴。两个孔板各自可具有任意所需数量的孔，但每个板优选不多于5个孔，特别优选不多于3个孔，极特别优选不多于2个孔，尤其优选不多于1个孔。两个孔板都可具有不同数目的孔或相同数目的孔，优选两个孔板具有相同数目的孔。通常，所述孔板是各自具有至少一个孔的冲孔板(perforated plate)。

在本发明的方法的另一个实施方案中，第二个孔板被一个筛网代替，即第二个孔板有许多孔和喷嘴。可用的筛网可涵盖大范围的孔径，一般地孔径为0.1至250μm，优选0.2至200μm，特别优选0.3至150μm，尤其优选0.5至100μm。

所述孔或喷嘴可具有任意可以想到的几何形状，例如为圆形、椭圆形、任意所需边数的多边形——其若合适也可以圆化，或者是星形的。优选地，所述孔为圆形。

入口孔板的孔的直径一般是0.05mm至1cm，优选为0.08mm至0.8mm，特别优选0.1至0.5mm，特别是0.2至0.4mm。出口孔板的孔的直径一般是0.5mm至1cm，优选5mm至50mm，特别优选10至20mm。

所述两个孔板优选以所述孔或喷嘴相互轴向排列的方式构造。轴向排列意指对于两个孔板而言由喷嘴孔的几何形状产生的流向相同。根据以上描述，用于此的入口喷嘴和出口喷嘴的孔向并不需要位于一条直线上，它们也可以平行移置。优选地，所述孔板平行取向。

但是，也可以是其他几何形状，特别是非平行的孔板，或入口喷嘴和出口喷嘴孔向不同。在如上所述的双孔板系统(入口孔板和出口孔板)中，出口喷嘴有较大的孔。从而使湍流平息。这种情况下不需要冲击板。

孔板的厚度可如所需。优选地，孔板的厚度为0.1至100mm，优选为0.5至30mm，特别优选1至10mm。孔板的厚度(I)应选择为使孔的直径(d)和厚度(I)的比为1∶1、优选1∶1.5、特别优选1∶2。

两个孔板之间的中部空间的长度可按需而定，一般地中部空间的长度为1至500mm，优选10至300mm，特别优选20至100mm。

在两个孔板之间的中部空间可放置一个静态混合器，其可完全或部分填充两个孔板之间的部分。优选地，所述静态混合器在两个孔板之间的中部空间的整个长度上延伸。静态混合器是本领域技术人员已知的。静态混合器可以是，例如阀式混合器(valve mixer)、带钻孔的静态混合器、由带槽片层制成的静态混合器或由接合肋(engaging rib)制成的静态混合器。此外，可以是螺旋形或N形的静态混合器，或者是具有可加热或可冷却的混合元件的静态混合器。

除了静态混合器，可在两个孔板之间的中部空间引入机械能。所述能可以例如以机械振动、超声波或转动能的形式引入。从而产生湍流，所述湍流具有使颗粒在中部空间不聚集的作用。

实施方案b)

与所述第一种方案不同，所述混合装置可包括一个具有至少一个入口喷嘴的孔板和一个冲击板，若合适，在孔板和冲击板之间的中部空间可放置静态混合器。或者，可不放置静态混合器而在中部空间引入机械能，或可除静态混合器之外，还在中部空间引入机械能。

上述内容适用于具有入口喷嘴的孔板，具有静态混合器和引入机械能的中部空间。

在该方案中，第二个孔板被一个冲击板代替。所述冲击板的直径一般比安装所述冲击板的位置处的管直径小0.5至20％，优选1至10％。

通常，所述冲击板可以是任意几何形状，优选为圆盘形，因此，前视图可见环形缝隙。也可能是例如狭缝(slot)或槽(channel)的形式。

所述冲击板可以与之前描述的方案中第二个孔板相似的方式固定于距第一个孔板不同距离处。因而孔板和冲击板之间的中部空间可具有任意所需的长度；通常，中部空间的长度为1至500mm，优选10至300mm，特别优选20至100mm。

本发明的方法相对于现有技术的已知方法具有一些优势，因为可特别高产率地获得高分子量聚羟基链烷酸酯。特别是，通过该处理方案可获得Mn为50000至2000000的聚羟基链烷酸酯，特别是100000至200000的聚羟基链烷酸酯。

将粗乳化物乳化以提供精细分散的乳化物的温度一般是0至150℃，优选5至80℃，特别优选20至40℃。在这种情况下所述装置中使用的所有均化部件(homogenizing unit)都可被加热/冷却。

均化一般在高于大气压的压力下进行，即＞1bar。然而在这种情况下压力不超过10 000bar，因此确定均化压力优选为＞1bar至10 000bar，优选5至2500bar，特别优选100至2000bar。

本发明的方法使用的生产细胞的浓度为约20至300g/l，优选50-220g/l。

这种情况下任意类型的细胞或细胞层都称为生产细胞；特别是动物细胞、植物细胞或来源于微生物的细胞。同样优选地，生产细胞为重组生物体。特别合适的生产细胞是原核细胞(包括古生菌)或真核细胞，特别是细菌(包括盐杆菌和甲烷球菌)、真菌、昆虫细胞、植物细胞和哺乳动物细胞，特别优选真养产碱菌(Alcaligenes eutrophus)、大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus.megaterium)、米曲霉(Aspergillus oryzea)、雪灰曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、假单胞菌种(Pseudomonas spec.)、乳杆菌(Lactobacillen)、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、里氏木霉(Trichoderma reesei)和SF9(或相关细胞)。特别优选地，所述微生物是真养产碱菌。

在本发明的方法中，生产细胞可在培养(例如发酵)后直接使用；但也可首先杀死生产细菌，例如通过灭菌(sterilization)，并且若合适通过滤除培养基来富集细胞物质(cell mass)。

聚羟基链烷酸酯意指通过生物技术生产的聚合物。特别是，它们意指以下聚合物：聚(3-羟基丁酸酯)(P-3HB)、聚(3-羟基丁酸酯)/共-3-羟基戊酸酯(P-3HB-共-3HV)、聚(3-羟基丁酸酯)/共-4-羟基丁酸酯(P-3HB-共-4HB)、聚(3-羟基丁酸酯)/共-3-羟基己酸酯(P-3HB-共-3HHx)和聚(3-羟基丁酸酯)/共-3-羟基辛酸酯(P-3HB-共-3HO)。

在步骤ii)中，通过连续射流分离器将细胞碎片与聚羟基链烷酸酯颗粒分离。包含聚羟基链烷酸酯颗粒的小球通过射流连续移除，而细胞碎片则有效地连续分离至溢流物(实际上是“澄清流(clear flow)”)中。不存在由于打开鼓筒(drum)而造成的排空，因此也就没有损失、涡流和类似的不稳定情况，而这些不稳定情况都会损害有效分离。为了达到更高的纯度，可将PHA颗粒和清水混合然后再次离心。由此可获得很纯的PHA颗粒的水悬浮液，然后可将其用已知的方法干燥，例如通过喷雾干燥。用以下的步骤iii)和iv)，这可显著减少。

射流分离器也称为Westfalia分离器。从例如www.gea-westfalia.de可获得详细的介绍。例如，可提及VisCon

系统，其中射流是粘度控制的。这避免了进料条件改变时对分离器参数(排空时间)的调整，从而实现了恒定固体排放浓度。在VisCon

系统中，射流不是位于鼓筒边缘，而是位于鼓筒内较小的直径上。通过水封(hydrohermetic)进料引入和通过射流排出增加了分离的细胞的细胞活性。

在步骤iii)中，用碱性水溶液洗涤之前浓缩的聚羟基链烷酸酯颗粒。

碱性溶液一般意指氢氧化物，如碱土金属氢氧化物，特别是碱金属氢氧化物；碳酸盐如碱土金属碳酸盐，特别是碱金属碳酸盐；和碳酸氢盐如碱土金属碳酸氢盐，特别是碱金属碳酸氢盐。

优选以0.01至1mol/l的浓度使用氢氧化物。碳酸盐和碳酸氢盐一般以0.01至2mol/l的浓度使用。

用碱性溶液处理可在0至120℃进行，优选10至60℃。如上所述，本发明方法中的温度选择为不会使显著量的聚羟基链烷酸酯(＜5％)进入溶液。

使用碱性溶液时，氢氧化物的最终浓度通常设置为0.001至1mol/l，优选0.01至0.5mol/l，特别是0.05至0.2mol/l。

在用碱性溶液处理后，将所述聚合物从水溶液中移出。可通过过滤、离心、沉降或借助水力旋流器进行此过程。

为此目的使用的碱性溶液可以是固体或液体形式。

通过步骤iv)的酸处理，可降低聚羟基链烷酸酯颗粒中的碱金属和碱土金属的含量，从而提高聚羟基链烷酸酯颗粒的热稳定性。

酸处理可理解为洗涤过程。与DE 19712702描述的方法相反，在本发明方法中，聚羟基链烷酸酯颗粒不被酸溶解。

本发明的酸不仅包括路易斯酸还包括布朗斯台德酸。路易斯将酸定义为具有亲电的电子对受体的物质。根据布朗斯台德的定义，酸是可以向反应对象释放质子的化合物。

所述酸可以以固体、液体或气体的形式存在。此外，所述酸可以以溶于有机溶剂或水的溶液的形式存在。

特别优选的是含水酸。无机酸优选以0.01至1mol/l的浓度使用。羧酸和磺酸一般以0.01至2mol/l的浓度使用。

可使用无机酸或有机酸作为液体酸。优选的酸是硫酸、盐酸、磷酸、亚膦酸、硝酸、亚硝酸、碳酸、硅酸、次氯酸、高氯酸、氨基磺酸、乙酸、甲酸、丙酸、磺酸、亚磺酸(sulfonous acid)、甲磺酸、三氟甲磺酸或柠檬酸。

优选地气体酸为SO₂、SO₃或CO₂。

在处理过程中，聚羟基链烷酸酯颗粒可存在于溶液中，或以浆体、熔体或固体的形式存在。

酸处理可连续或间歇进行。

酸处理可在0至120℃进行，优选10至60℃。如上所述，本发明方法的温度选择为不会使显著量的聚羟基链烷酸酯(＜5％)进入溶液。

使用酸时，通常将酸的最终浓度设定为0.001至1mol/l，优选0.01至0.5mol/l，特别是0.05至0.2mol/l。

用酸处理之后，将所述聚合物从水溶液中移出。可通过例如过滤、离心、沉降或借助水力旋流器进行此过程。

为此目的使用的酸可以是液态、固态或气态。

优选的形式是使用固体酸。固体酸意指特别是离子交换剂。可选择使用具有诸如磺酸、磷酸和羧酸的酸根离子的交换剂。

所述酸可以以气体的形式存在。多余的酸可通过对聚羟基链烷酸酯溶液脱气或将气体酸提取至另一个液相中而移除。

为了进一步减少含氮量，可引入漂白步骤(步骤v))。合适的漂白剂是0.001至0.2M次氯酸和/或过氧化氢溶液。若使用碱金属次氯酸盐，则可有利地在步骤iii)之后直接进行漂白步骤v)，最后用酸洗涤(步骤iv))。在一些情况下，已证明在酸洗涤操作(iv)后进行漂白步骤vi-1)是有利的。

使用的设备：

在实施例中，选择以下的配置I作为分解生产细胞的高压均化器。入口喷嘴使用具有14×0.2mm宽的钻孔的孔板。发酵液为一种悬浮液，并且在约2000大气压下挤压穿过所述孔板。在中部空间(长15mm直径8mm)，悬浮液在接触到充当出口喷嘴的第二块孔板之前形成涡流。细胞悬浮液穿过一个锥形钻孔抵达出口孔板，然后从一个单独的钻孔(直径1.5mm)离开孔板板块。所述出口孔板相对于入口喷嘴的钻孔居中放置。

射流分离器使用GEA Westfalia公司的HFC-15型仪器。

实施例1a：从大肠杆菌生产细胞中分离3-羟基聚羟基丁酸酯(3-PHB)

i)所述方法使用200l生物干物质含量为57.7g/l——其中含有60.6％的3-聚羟基丁酸酯——的大肠杆菌发酵液作为起始物，在发酵器中冷却至4℃。根据B.S.Kim，S.Y.Lee，H.N.Chang in Biotechnology Letters，Vol.14，811-816(1992)进行发酵。所述培养液在1750bar的压力下全部通过高压均化器，并在出口处冷却至12℃。然后用去离子水将细胞匀浆稀释至固体含量为22.3g/l。

ii)在GEA Westfalia的HFC-15型射流分离器中，以700l/h的进料速率分离PHB颗粒(浓缩物)和细胞碎片(溢流物)。浓缩物中的总干物质浓度是110.1g/l，其中含有90％的3-PHB。在溢流物中有7.7g/l的总干物质，其中含有8.6％的3-PHB。

iii)将所得浓缩物与KOH混合至终浓度为0.2mol/l，并在30℃搅拌1h。此后将混合物离心，丢弃上清液并用去离子水将颗粒再悬浮，再次离心并再次丢弃上清液(洗涤步骤)。

iv)接着用硫酸以终浓度为0.1mol/l进行洗涤步骤，并用去离子水进行再洗涤步骤。在真空干燥箱中在40℃进行干燥。

对比实施例1b

用与实施例1a类似的方式进行步骤i)、ii)和iv)的过程。不进行中间步骤iii)(用KOH洗涤)。

对于实施例1a和对比实施例1b，测定3-PHB含量、总氮、钾含量和185℃热应力35分钟处理前样本的分子量(M_w1)和处理后样本的分子量(M_w2)。结果在下表列出。

实施例1的聚合物由于蛋白质和DNA污染较低(氮含量较低)，在热应力下明显较稳定。在热应力处理期间，与通常在处理中出现的一样，在实施例1a中出现较少的分子量下降。通过在175至185℃下熔体粘度的下降测定热稳定性(参见P.A.Daly et al.，J.of Applied Polymer Science，Vol.98，66-74(2005)；特别是图4和方程式5)。所考察的聚合物的热稳定性可能与线的梯度有关。线的梯度越低，有关材料热稳定性越高。与溶剂提取产生的3-PHB——如WO2005052175描述——相比，实施例1具有明显更低的梯度。

为了进一步降低氮含量，可接着进行漂白步骤。将方案1的产品的5％(w/w)悬浮液在室温下在0.08mol/l的次氯酸钠中漂白15分钟，接着进行用去离子水洗涤的步骤，可将氮含量降至0.018％。

实施例2a：从大肠杆菌细胞中分离3-羟基-聚羟基丁酸酯(3-PHB)

i)所述方法使用200l生物干物质浓度为66.7g/l——其中含有61.5％的PHB——的大肠杆菌发酵液作为起始物，在发酵器中冷却至4℃。根据B.S.Kim，S.Y.Lee，H.N.Chang in Biotechnology Letters，Vol.14，811-816(1992)进行发酵。所述培养液在1750bar的压力下全部通过高压均化器，但在出口处不进行冷却。然后用去离子水将细胞匀浆稀释至固体含量为16.3g/l。

ii)在GEA Westfalia的HFC-15型射流分离器中以700l/h的进料速率分离PHB颗粒(浓缩物)和细胞碎片(溢流物)。浓缩物中的总干物质浓度是50.6g/l，其中含有90％的PHB。在溢流物中含有0.7g/l的总干物质，其中含有25.6％的PHB。

iii)将所得浓缩物与NaOH混合至终浓度为0.2mol/l，并在30℃搅拌1h。此后将所得混合物离心，丢弃上清液，并用去离子水将颗粒再悬浮，再次离心并再次丢弃上清液(洗涤步骤)。

iv)接着用硫酸以终浓度为0.1mol/l进行洗涤步骤，并用去离子水进行进一步洗涤。在真空干燥箱中在40℃进行干燥。

用与实施例2a相似的方式进行实施例2b)，仅在步骤iii)中，用KOH代替NaOH。

用与实施例2a相似的方式进行实施例2c)，仅在步骤iii)中加入NaOH至终浓度为0.1mol/l，并且在30℃搅拌0.5h。

用与实施例2a相似的方式进行对比实施例2d，但不进行步骤iii)。

对于实施例2a至2c和比较实施例2d，测定样本的3-PHB含量、总氮、钾含量以及分子量。结果在下表列出。

Claims

1.一种从生产细胞中分离聚羟基链烷酸酯的方法，包括

i)分解所述生产细胞，然后

iii)将浓缩的聚羟基链烷酸酯颗粒用一种碱性水溶液洗涤，然后

iv)用一种含水酸洗涤。

2.权利要求1的方法，其中在步骤i)中，所述生产细胞通过一种高压均化设备分解。

3.权利要求2的方法，其中所述均化设备

a)包括一个具有至少一个入口喷嘴的孔板和一个具有至少一个出口喷嘴的孔板，若合适，在所述孔板之间的中部空间另外引入机械能，或

b)包括一个具有至少一个入口喷嘴的孔板和一个冲击板，若合适，在所述孔板和所述冲击板的中部空间引入机械能。

4.权利要求1的方法，其中所述生产细胞为一种重组生物体。

5.权利要求1的方法，其中所述聚羟基链烷酸酯为聚(3-羟基丁酸酯)(P-3HB)、聚(4-羟基丁酸酯)(P-4HB)、聚(3-羟基丁酸酯)/共-3-羟基戊酸酯(P-3HB-共-3HV)、聚(3-羟基丁酸酯)/共-4-羟基丁酸酯(P-3HB-共-4HB)、聚(3-羟基丁酸酯)/共-3-羟基己酸酯(P-3HB-共-3HHx)或聚(3-羟基丁酸酯)/共-3-羟基辛酸酯(P-3HB-共-3HO)。

6.权利要求1的方法，其中步骤iii)中的碱性溶液是0.01至0.5M碱金属氢氧化物、碱金属碳酸盐或碱金属碳酸氢盐溶液。

7.权利要求1的方法，其中步骤iv)中的含水酸是0.01至0.5M无机酸、羧酸或磺酸。

8.权利要求1的方法，其中在一个另外的步骤v)中，将聚羟基链烷酸酯颗粒进行漂白步骤。

9.权利要求8的方法，其中在漂白步骤vi-1)中，使用0.001至0.2M次氯酸盐和/或过氧化氢溶液。