WO2010000719A1 - Verfahren zur isolierung von polyhydroxyalkanoaten - Google Patents

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WO2010000719A1
WO2010000719A1 PCT/EP2009/058153 EP2009058153W WO2010000719A1 WO 2010000719 A1 WO2010000719 A1 WO 2010000719A1 EP 2009058153 W EP2009058153 W EP 2009058153W WO 2010000719 A1 WO2010000719 A1 WO 2010000719A1
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WO
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hydroxybutyrate
acid
poly
polyhydroxyalkanoate
diaphragm
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PCT/EP2009/058153
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Rajan Hollmann
Bryan Cooper
Peter PREISHUBER-PFLÜGL
Arnold Schneller
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Basf Se
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G63/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming a carboxylic ester link in the main chain of the macromolecule
    • C08G63/88—Post-polymerisation treatment
    • C08G63/90—Purification; Drying
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G63/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming a carboxylic ester link in the main chain of the macromolecule
    • C08G63/88—Post-polymerisation treatment
    • C08G63/89—Recovery of the polymer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/62—Carboxylic acid esters
    • C12P7/625—Polyesters of hydroxy carboxylic acids

Definitions

  • the invention relates to a process for the isolation of polyhydroxyalkanoates from a production cell.
  • the cell fragments are separated from the polyhydroxyalkanoate granules by means of a continuous jet separator;
  • Polyhydroxyalkanoates e.g. Polyhydroxybutyrate (PHB) can be synthesized with the help of bacteria.
  • PHA Polyhydroxyalkanoates
  • PHB Polyhydroxybutyrate
  • biotechnological methods are described in Biopolymer, Wiley-VCH, 2002.
  • the PHB is present in the bacterial cells at the end of the fermentation in the form of granules surrounded by a protein coat (J. Biol. Chem. 1989, Vol. 264 (6), pages 3286-3291). In order to obtain a sufficiently pure PHB, it must be separated from the bacterial cells.
  • the raw materials produced by bioengineering contain, in addition to the desired polyhydroxyalkanoate, the microorganisms which produced the polyhydroxyalkanoate (production cells, biomass or non-polyhydroxyalkanoate mass).
  • the isolation of the polyhydroxyalkanoate from the biomass can be a) by dissolving the biomass, b) by extraction of the polyhydroxyalkanoate in a suitable extraction agent or c) by mechanical digestion of the biomass (production cell) and subsequent separation of the cell fragments from the polyhydroxyalkanoate (PHA). Granules are achieved.
  • the most common method involves extracting the PHA granules from the biomass with a solvent (work-up b).
  • solvents have a number of disadvantages.
  • One is forced to invest in a complex and expensive infrastructure for the handling and recovery of solvents.
  • the extracted biomass must be freed from solvent residues before being reused as fertilizer or animal feed. Since PHB only dissolves insufficiently in many solvents, the amounts of solvent that are needed, are very large.
  • PHB polyhydroxybutyrate
  • the object was therefore to find a method that leads to a complete separation of the cell fragments of the production cell from the polyhydroxyalkanoate granules formed.
  • the necessary equipment is technically available and upscale capable, so that the process can be easily transferred to industrial scale.
  • a particular embodiment of the method according to the invention in step i) mechanically closes off the production cells.
  • the chemical-free digestion has advantages. It has been described that cells of the PHB-producing bacterium Alcaligenes eutrophus can be disrupted with the aid of a homogenizer (biological Separation 1991, 2, pages 155-166). The PHB granules present in the cells could be almost completely removed from the cells after four passes through a homogenizer. The cell suspension is forced through a valve in this homogenizer type. By adjusting the gap between the valve cone and the valve seat, turbulence is generated. The suspension emerging from the valve then impinges on a steel plate. The pressure of this machine is therefore limited to 1500 bar.
  • PHA-containing cells of, in particular, Alcaligenes eutrophus can be very well digested with a high-pressure homogenizer, as described below.
  • a high-pressure homogenizer which operates at pressures of 2000 and more atm.
  • it consists of the following arrangement:
  • a) consists of a diaphragm with at least one inlet nozzle and a diaphragm with at least one outlet nozzle, wherein optionally takes place in the space between the diaphragms, a mechanical energy input or
  • b) consists of a diaphragm with at least one inlet nozzle and a baffle plate, wherein optionally takes place in the space between the diaphragm and the baffle plate, a mechanical energy input.
  • the homogenizing device for isolating the polyhydroxyalkanoates consists, for example, of a screen with at least one inlet nozzle and a screen with at least one outlet nozzle, the nozzles being arranged axially relative to one another. There may be a static mixer in the space between the panels. If necessary, a mechanical energy input also takes place in the intermediate space.
  • the diaphragms which can be used according to the method of the invention have at least one opening, ie at least one nozzle.
  • the two panels can each have any number of openings, but preferably not more than 5 openings each, more preferably no more than three openings, very particularly preferably no more than two openings and particularly preferably no more than one each Opening.
  • Both diaphragms can have a different or the same number of openings, preferably both diaphragms have the same number of openings.
  • the apertures are perforated plates with at least one opening each.
  • the second panel is replaced by a screen, i. the second aperture has a plurality of openings or nozzles.
  • the usable sieves can span a large range of pore sizes, as a rule the pore sizes are between 0.1 and 250 ⁇ m, preferably between 0.2 and 200 ⁇ m, particularly preferably between 0.3 and 150 ⁇ m and in particular between 0, 5 and 100 microns.
  • the openings or nozzles can have any conceivable geometric shape, they can be, for example, circular, oval, angular with any number of corners, which may optionally also be rounded, or else star-shaped. Preferably, the openings have a circular shape.
  • the apertures of the entrance aperture are generally 0.05 mm to 1 cm in diameter, preferably from 0.08 mm to 0.8 mm, more preferably from 0.1 to 0.5 mm, and especially from 0.2 to 0 , 4 mm.
  • the openings of the exit aperture generally have a diameter of 0.5 mm to 1 cm, preferably from 5 mm to 50 mm, particularly preferably from 10 to 20 mm.
  • the two panels are preferably constructed so that the openings or nozzles are arranged axially to each other.
  • axial arrangement is to be understood that the flow direction generated by the geometry of the nozzle opening is identical in both panels.
  • the opening directions of the inlet and outlet nozzles do not have to lie on a line, they can also be moved in parallel, as can be seen from the above statements.
  • the panels are aligned in parallel.
  • the outlet nozzle has larger openings. This leads to a calming of the turbulence.
  • a baffle is not necessary in this case.
  • the thickness of the panels can be arbitrary.
  • the apertures preferably have a thickness in the range from 0.1 to 100 mm, preferably from 0.5 to 30 mm and particularly preferably from 1 to 10 mm.
  • the thickness (I) of the diaphragms is selected such that the quotient of diameter (d) of the openings and thickness (I) is in the range of 1: 1, preferably 1: 1, 5 and particularly preferably 1: 2.
  • the gap between the two panels can be of any desired length, as a rule the length of the intermediate space is 1 to 500 mm, preferably 10 to 300 mm and particularly preferably 20 to 100 mm.
  • a static mixer In the space between the panels may be a static mixer, which can fill the distance between the two panels completely or partially.
  • the static mixer extends over the entire length of the gap between the two panels.
  • Static mixers are known in the art. It may be, for example, a valve mixer or a static mixer with holes, a fluted fins or interlocking webs. Furthermore, it may be a static mixer in helical form or in N-shape or such with heatable or coolable mixing elements
  • a mechanical energy input can still take place in the intermediate space between the two diaphragms.
  • the energy can be introduced, for example, in the form of mechanical vibrations, ultrasound or rotational energy. This creates a turbulent flow that causes the particles in the gap to not agglomerate.
  • the mixing device may consist of a diaphragm with at least one inlet nozzle and a baffle plate, wherein, if appropriate, there is a static mixer in the intermediate space between the diaphragm and the baffle plate.
  • a mechanical energy input can take place in the intermediate space.
  • the second panel is replaced by a baffle plate.
  • the baffle plate usually has a diameter which is 0.5 to 20%, preferably 1 to 10% smaller than the pipe diameter at the point at which the baffle plate is installed.
  • the baffle plate can have any geometric shape, preferably in the form of a round disc, so that an annular gap can be seen in frontal supervision. It is also conceivable, for example, the shape of a slot or a channel.
  • the baffle plate can be mounted at different distances to the first panel analogous to the second panel in the variant described above.
  • the gap between the diaphragm and the baffle plate is arbitrarily long, as a rule, the length of the intermediate space is 1 to 500 mm, preferably 10 to 300 mm and particularly preferably 20 to 100 mm.
  • the process according to the invention has several advantages over the processes known from the prior art, since particularly high yields of high molecular weight polyhydroxyalkanoate are obtained.
  • polyhydroxyalkanoates with Mn of 50,000 to 2,000,000 and in particular of 100,000 to 200,000 can be realized with this work-up variant.
  • the temperature at which the emulsification of the crude emulsion to finely divided emulsion by the process according to the invention is carried out is usually 0 to 150 0 C, preferably, 5 to 80 0 C, particularly preferably 20 to 40 ° C. In this case, all homogenizing units used in the device can be tempered.
  • Homogenization is typically carried out at pressures above atmospheric pressure, i. > 1 bar performed. However, the pressures do not exceed a value of 10,000 bar, so that preference is given to setting homogenization pressures of> 1 bar to 10,000 bar, preferably 5 to 2,500 bar, and particularly preferably 100 to 2,000 bar.
  • the production cell concentrations used in the process according to the invention are approximately from 20 to 300 g / L, preferably 50-220 g / L.
  • a production cell is any type of cell or cell structure; in particular, such cells of animal, vegetable or microbial origin. Likewise preferred are production cells of recombinant organisms. Particularly suitable production cells are prokaryotes (including archaea) or eukaryotes, especially bacteria including halobacteria and methanococci, fungi, insect cells, plant cells and mammalian cells, more preferably Alcaligenes eutrophus, Escherichia coli, Bacillus subtilis, Bacillus.
  • the production cell can be used directly after the cultivation (eg fermentation) in the process according to the invention; but it is also possible to First killing onszelle, for example by sterilization, and optionally to enrich the cell mass by filtration of the culture medium.
  • Polyhydroxyalkanoates are understood as meaning biotechnologically produced polymers. Specifically, these include: poly-3-hydroxybutyrate (P-3HB), poly-4-hydroxybutyrate (P-4HB), poly-3-hydroxybutyrate / co-3-hydroxyvalerate (P-3HBco-3HV), poly-3-hydroxybutyrate / co-4-hydroxybutyrate (P-3HB-co-4HB), poly-3-hydroxybutyrate / co-3-hydroxyhexanoate (P-3HB-co-3HHx), and poly-3-hydroxybutyrate / co-3-hydroxyoctanoate (P -3HB-co-3HO).
  • P-3HB poly-3-hydroxybutyrate
  • P-4HB poly-4-hydroxybutyrate
  • P-3HBco-3HV poly-3-hydroxybutyrate / co-3-hydroxyvalerate
  • P-3HB-co-4HB poly-3-hydroxybutyrate / co-4-hydroxybutyrate
  • P-3HB-co-3HHx poly-3-hydroxybutyrate / co-3-hydroxy
  • step ii) the cell fragments are separated from the polyhydroxyalkanoate granules by means of a continuous jet separator.
  • the pellets consisting of the polyhydroxyalkanoate granules are constantly removed through the nozzles, while the cell fragments are constantly effectively separated in the overflow (actual "clear") .
  • the PHA granules can be spiked with clear water and recentrifuged to obtain an aqueous suspension of PHA granules of appealing purity can then be dried in a known manner, for example by spray-drying, with the aid of the following steps iii) and iv), this can be lowered dramatically.
  • Nozzle separators are also known by the term Westfalia Separator. A detailed description can be obtained, for example, at www.gea-westfalia.de.
  • the VisCon® system is mentioned, in which the nozzles are viscosity-controlled. This eliminates the need to adjust the separator parameters (discharge times) under changed feed conditions and, as a result, constant solids discharge concentrations are achieved.
  • the nozzles are not on the edge of the drum but on a smaller diameter in the drum. The introduction via the hydrohermetic inlet and the outlet via the nozzles increase the cell activity of the separated cells.
  • step iii) the previously concentrated polyhydroxyalkanoate granules are washed with an aqueous alkali solution.
  • Alkali solution is generally understood to mean hydroxides such as alkaline earth metal and in particular alkali metal hydroxides, carbonates such as alkaline earth metal and in particular alkali metal carbonates and bicarbonates such as alkaline earth and in particular alkali metal bicarbonates.
  • Hydroxides are preferably used in a concentration of 0.01 to 1 mol / l.
  • Carbonates and bicarbonates are usually used in a concentration of 0.01 to 2 mol / l.
  • the treatment with alkali solution can be carried out at temperatures between 0 to 120 0 C, preferably 10 to 60 0 C.
  • the temperature in the process according to the invention is chosen so that no appreciable amounts of polyhydroxyalkanoate ( ⁇ 5%) in Go solution.
  • the alkali solution is generally adjusted to a final hydroxide concentration of from 0.001 to 1 mol / l, preferably from 0.01 to 0.5 mol / l, and in particular from 0.05 to 0.2 mol / l.
  • the polymer After treatment with alkali solution, the polymer is removed from the aqueous solution. This can be done for example by filtration, centrifugation, sedimentation or hydrocyclone.
  • the alkali solution used may be in liquid or solid form for this purpose.
  • step iv By treatment with an acid in step iv), the content of alkali and alkaline earth metals of the polyhydroxyalkanoate granules can be lowered and thus the thermal stability of the polyhydroxyalkanoates can be increased.
  • the treatment with acid can be understood as a washing process. Unlike the method described in DE 19712702, the polyhydroxyalkanoates are not dissolved by the acid in the process according to the invention.
  • the acids of the present invention include both Lewis acids and Bronsted acids.
  • Lewis defined an acid as a substance which is an electrophilic electron pair acceptor.
  • Bronsted an acid is a compound that can donate protons to reactants.
  • the acid may be present as a solid, liquid or gas. Furthermore, the acid may be present as a solution in an organic solvent or water.
  • aqueous acids are particularly preferred.
  • Mineral acids are preferably used in a concentration of 0.01 to 1 mol / l.
  • Carboxylic acids and sulfonic acids are generally used in a concentration of 0.01 to 2 mol / l.
  • liquid acids inorganic or organic acids are used.
  • Preferred acids are sulfuric acid, hydrochloric acid, phosphoric acid, phosphonous acid, nitric acid, nitrous acid, carbonic acid, silicic acid, hypochlorous acid, Perchloric acid, sulfamic acid, acetic acid, formic acid, propionic acid, sulfonic acid, sulfonic acid, methanesulfonic acid, trifluoromethanesulfonic acid or citric acid.
  • Preferred gaseous acids are SO 2, SO 3 or CO 2.
  • the polyhydroxyalkanoate may be present during the treatment in solution, as a slurry, as a melt or as a solid.
  • the treatment with acid can be carried out continuously or discontinuously.
  • the treatment with acid can be carried out at temperatures between 0 to 120 0 C, preferably 10 to 6O 0 C. the temperature in the ER inventive method As already mentioned above, chosen so that no significant quantities of polyhydroxyalkanoate ( ⁇ 5%) in Go solution.
  • the acid is adjusted to a final acid concentration of from 0.001 to 1 mol / l, preferably from 0.01 to 0.5 mol / l, and in particular from 0.05 to 0.2 mol / l.
  • the polymer After treatment with acid, the polymer is removed from the aqueous solution. This can be done for example by filtration, centrifugation, sedimentation or hydrocyclone.
  • the acid used may be in liquid, solid or gaseous state.
  • Solid acid is understood in particular to mean ion exchangers.
  • ion exchangers with acidic groups such as sulfonic acids, phosphoric acids and carboxylic acids.
  • the acid can be present as a gas.
  • the excess acid can be removed by degassing the polyhydroxyalkanoate solution or by extracting the gaseous acid into a second liquid phase.
  • a bleaching step may be included. Suitable bleaches are 0.001 to 0.2 M hypochlorite and / or hydrogen peroxide solution. If alkali hypochlorite is used, it may be advantageous to carry out the bleaching step v) directly after step iii) and finally to wash with acid (step iv). In some cases it has proven to be beneficial proved to perform the sheet step vi-1) following the acid wash iv).
  • the following arrangement I was chosen as the high-pressure homogenizer for the digestion of the production cells.
  • An aperture with 14 x 0.2 mm holes was used as the inlet nozzle.
  • the fermentation broth was in the form of a suspension and was forced through the screen at a pressure of about 2000 atm.
  • the suspension was vortexed before it hit the second orifice which served as the exit nozzle.
  • the cell suspension was passed through a conical bore on the exit orifice and then emerged from a single bore (diameter 1 5 mm) out of the diaphragm block
  • the outlet diaphragm was arranged centrically opposite the holes of the inlet nozzle.
  • the nozzle separator used was a device from GEA Westfalia type HFC-15.
  • Example 1 a Isolation of 3-hydroxy-polyhydoxy-butyrate (3-PHB) from E. coli
  • the starting point of the method was 200 L of an E. coli fermentation broth containing 57.7 g / L of dry biomass, of which 60.6% of 3-polyhydroxybutyrate, cooled to 4 ° C. in the fermenter.
  • the fermentation was carried out according to B.S. Kim, S.Y. Lee, H.N. Chang in Biotechnology Letters, Vol. 14, pp. 81 1-816 (1992).
  • the culture broth was completely run at 1750 bar pressure over a high-pressure homogenizer and cooled at the exit to 12 ° C. Subsequently, the cell homogenate was diluted with deionized water to a solids content of 22.3 g / L.
  • the concentrate was treated with KOH to a final concentration of 0.2 mol / L and stirred at 30 0 C for 1 h. It was then centrifuged, the supernatant discarded and the pellet resuspended in deionised water, recentrifuged and the supernatant discarded again (washing step).
  • iv) This was followed by a washing step with sulfuric acid in a final concentration of 0.1 mol / L and a further wash with deionized water. Drying took place in a vacuum drying oven at 40 ° C.
  • Example 1 The polymer of Example 1 is significantly more stable under thermal stress due to less contamination with proteins and DNA (lower nitrogen content). Under thermal stress, as typically occurs during processing, it comes in example 1 a to a smaller degradation of the molecular weight.
  • the determination of the thermal stability was made by the decrease of the melt viscosity at a temperature of between 175 and 185 ° C (see PA Dailey et al., J. of Applied Polymer Science, Vol. 98, pages 66 to 74 (2005); Figure 4 and Equation 5).
  • the slope of the straight line can be used to relate the thermal stability of the investigated polymers. The lower the slope of the line, the more thermally stable is the material in question.
  • Example 1 had a significantly lower slope than a 3-PHB produced by solvent extraction, as described in WO2005052175.
  • a bleaching step can be connected.
  • the bleaching of a 5% (w / w) suspension of the product of variant 1 in 0.08 mol / L of sodium hypochlorite for 15 minutes at room temperature followed by washing with deionized water reduced the nitrogen content to 0.018%.
  • Example 2a Isolation of 3-hydroxy-polyhydoxybutyrate (3-PHB) from E. coli production cells
  • the starting point of the method was 200 L of an E. coli fermentation broth containing 66.7 g / L dry biomass, of which 61.5% PHB, cooled to
  • Example 2b) was carried out analogously to Example 2a, except that in step iii) KOH was used instead of NaOH.
  • Example 2c) was carried out analogously to Example 2a, except that in step iii) NaOH was added to a final concentration of 0.1 mol / L and 0.5 h at 30 0 C stirred.
  • Comparative Example 2d was carried out as in Example 2a, except that step iii) was dispensed with.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Isolierung von Polyhydroxyalkanoaten aus Produktionszellen, dadurch gekennzeichnet, dass i) die Produktionszellen aufgeschlossen werden, anschließend ii) die Zellfragmente von den Polyhydroxyalkanoat-Körnchen mittels eines kontinuierlich arbeitenden Düsenseparators abgetrennt werden; iii) die aufkonzentrierten Polyhydroxyalkanoat-Körnchen mit einer wässrigen Alkali-Lösung und anschließend vi) mit einer wässrigen Säure gewaschen werden.

Description

Verfahren zur Isolierung von Polyhydroxyalkanoaten
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Isolierung von Polyhydroxyalkanoaten aus einer Produktionszelle.
i) die Produktionszellen aufgeschlossen werden, anschließend
ii) die Zellfragmente von den Polyhydroxyalkanoat-Körnchen mittels eines kontinuierlich arbeitenden Düsenseparators abgetrennt werden;
iii) die aufkonzentrierten Polyhydroxyalkanoat-Körnchen mit einer wässrigen
Alkali-Lösung und anschließend
vi) mit einer wässrigen Säure gewaschen werden.
Polyhydroxyalkanoate (PHA) wie z.B. Polyhydroxybutyrate (PHB) können mit Hilfe von Bakterien synthetisiert werden. Beispielsweise sind in Biopolymer, Wiley-VCH, 2002 derartige biotechnologische Verfahren beschrieben.
Das PHB liegt am Ende der Fermentation in den Bakterienzellen in Form von Körnchen vor, die von einer Proteinhülle umgeben sind (J. Biol. Chem. 1989, Vol. 264(6), Seiten 3286 - 3291 ). Um ein ausreichend reines PHB zu erhalten, muss dieses von den Bak- terienzellen getrennt werden.
Die biotechnologisch hergestellten Rohmassen enthalten neben dem gewünschten Polyhydroxyalkanoat die Mikroorganismen, die das Polyhydroxyalkanoat produziert haben (Produktionszellen, Biomasse oder nicht-Polyhydroxyalkanoat-Masse). Die Iso- lierung des Polyhydroxyalkanoats aus der Biomasse kann a) durch Lösen der Biomasse, b) durch Extraktion des Polyhydroxyalkanoats in einem geeigneten Extraktionsmittel oder c) durch mechanischen Aufschluss der Biomasse (Produktionszelle) und anschließender Trennung der Zellfragmente von den Polyhydroxyalkanoat (PHA)- Körnchen erreicht werden.
Die häufigste Methode hierzu besteht in der Extraktion der PHA-Körnchen aus der Biomasse mit einem Lösungsmittel (Aufarbeitung b). Die Verwendung von Lösungsmitteln hat eine Reihe von Nachteilen zur Folge. Man ist gezwungen, in eine aufwendige und kostspielige Infrastruktur für die Handhabung und Rückgewinnung der Lösungsmit- tel zu investieren. Die extrahierte Biomasse muss vor der Weiterverwendung als Dünge- oder Futtermittel von den Lösungsmittelresten befreit werden. Da PHB sich nur ungenügend in vielen Lösungsmitteln löst, sind die Mengen an Lösungsmittel, die benötigt werden, sehr groß.
Zum Abbau und Lösen der Biomasse (Aufarbeitung a)) können beispielsweise Enzyme oder chemische Verfahren verwendet werden. Zusätzlich können oberflächenaktive Verbindungen beigefügt werden. Eine Kombination mehrere Verfahren ist möglich. Die Freisetzung des gebildeten Polyhydroxybutyrats (PHB) aus gentechnisch modifizierten Escherichia coli Zellen ist in Research In Microbiology 2005, 156, Seiten 865-873 beschrieben worden. Hier wird eine Autolyse nachgeschaltet. Die genauen Autolysenbe- dingungen sind nicht beschrieben. Autolyse ist ein Prozess der Selbstauflösung der Zellen durch eigene Enzyme. Diese Herstellmethode hat folgende Nachteile. Da die Autolyse unvollständig verläuft und Zellfragmente sowie PHB-Körnchen noch aneinander haften, werden nur ca. 80% des gebildeten PHB' freigesetzt.
Eine interessante mechanische Aufarbeitung c) wird in WO 2007/135039 beschrieben. Der Aufschluss der Produktionszellen erfolgt mittels einer Hochdruckhomogenisiervorrichtung, die Abtrennung der Zellfragmente der Produktionszelle von den gebildeten Polyhydroxyalkanoat-Körnchen erfolgt über einen Düsenseparator. Dieses Verfahren ist recht effizient, wenn man von Produktionszellen mit einem sehr hohen Polyhydroxy- alkanoat-Anteil startet. In anderen Fällen gelingt die Abtrennung der Zellfragmente (Zellwände) nicht immer voll zufrieden stellend. Protein-(Stickstoff)-haltige Verunreinigungen führen zu farblichen Veränderungen (siehe Biotechnology Techniques, VoI 1 1 , No. 6, June 1997, Seite 411 , linke Spalte, letzter Absatz) und zu einer geringeren thermischen Stabilität der Polyhydroxyalkanoate (Polymer Degradation and Stability 52 (1996), Seite 38, linke Spalte).
Die Aufgabe bestand daher darin, ein Verfahren zu finden, dass zu einer vollständigen Abtrennung der Zellfragmente der Produktionszelle von den gebildeten Polyhydroxyalkanoat-Körnchen führt.
Diese Aufgabe wird durch die eingangs erwähnte, vierstufige Aufarbeitung hervorragend gelöst. Das Verfahren zeichnet sich folglich gegenüber den herkömmlichen Verfahren durch eine hohe Effizienz, Wirtschaftlichkeit und eine exzellente Prozessfähigkeit aus.
Die notwendigen Apparate sind technisch verfügbar und beliebig upscale-fähig, so dass das Verfahren problemlos in den industriellen Maßstab übertragen werden kann.
Eine besondere Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens schließt im Schritt i) die Produktionszellen mechanisch auf. Der chemikalienfreie Aufschluss hat Vorteile. Es ist beschrieben worden, dass man Zellen des PHB-produzierenden Bakteriums Alcaligenes eutrophus mit Hilfe eines Homogenisators aufschließen kann (Bio- Separation 1991 , 2, Seiten 155-166). Die in den Zellen vorhandenen PHB-Körnchen konnten nach viermaliger Passage durch einen Homogenisator fast vollständig aus den Zellen herausgelöst werden. Die Zellsuspension wird bei diesem Homogenisatortyp durch ein Ventil gepresst. Durch Verstellung des Spaltenabstandes zwischen Ventilke- gel und Ventilsitz wird Turbulenz erzeugt. Die aus dem Ventil austretende Suspension prallt dann auf eine Stahlplatte. Der Druck dieser Maschine ist deshalb auf 1500 bar begrenzt.
Zur Erzeugung hoher Drücke werden großen Mengen elektrischen Stroms benötigt. Ein Zellaufschluss mit einem Homogenisator ist insbesondere dann wirtschaftlich, wenn die Zellen nach einer einzigen Passage vollständig aufgeschlossen werden. Die in Bioseparation 1991 , 2, Seiten 155-166 beschriebene Methode hat den Nachteil, dass vier Passagen durch den Homogenisator benötigt werden.
Wir haben nun festgestellt, dass PHA-haltige Zellen von insbesondere Alcaligenes eutrophus mit einem Hochdruckhomogenisator, wie er im folgenden beschrieben ist, sich sehr gut aufschließen lässt. Dabei werden bei einmaliger Passage durch den Hochdruckhomogenisator bei einem Druck von 2000 und mehr bar über 99% der Zellen aufgeschlossen und PHA nahezu vollständig freigesetzt. Gegenstand der vorlie- genden Erfindung ist daher auch der Aufschluss mittels eines Hochdruckhomogenisators, der mit Drucken von 2000 und mehr atm arbeitet. Beispielsweise besteht er aus folgender Anordnung:
Beispiele für geeignete Homogenisiervorrichtungen:
a) aus einer Blende mit wenigstens einer Eintrittsdüse und einer Blende mit wenigstens einer Austrittsdüse besteht, wobei im Zwischenraum zwischen den Blenden gegebenenfalls eine mechanische Energieeinbringung erfolgt oder
b) aus einer Blende mit wenigstens einer Eintrittsdüse und einer Prallplatte besteht, wobei im Zwischenraum zwischen der Blende und der Prallplatte gegebenenfalls eine mechanische Energieeinbringung erfolgt.
Ausführungsform a)
Die Homogenisiervorrichtung zur Isolierung der Polyhydroxyalkanoate besteht beispielsweise aus einer Blende mit wenigstens einer Eintrittsdüse und einer Blende mit wenigstens einer Austrittsdüse, wobei die Düsen axial zueinander angeordnet sind. Im Zwischenraum zwischen den Blenden kann sich ein statischer Mischer befinden. Ge- gebenenfalls erfolgt in dem Zwischenraum zusätzlich eine mechanische Energieeinbringung. Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren einsetzbaren Blenden weisen wenigstens eine Öffnung, d.h. wenigstens eine Düse auf. Dabei können die beiden Blenden jeweils eine beliebige Anzahl an Öffnungen aufweisen, bevorzugt jedoch nicht mehr als jeweils 5 Öffnungen, besonders bevorzugt nicht mehr als jeweils drei Öffnungen, ganz beson- ders bevorzugt nicht mehr als jeweils zwei Öffnungen und insbesondere bevorzugt nicht mehr als jeweils eine Öffnung. Beide Blenden können eine unterschiedliche oder dieselbe Anzahl an Öffnungen aufweisen, bevorzugt haben beide Blenden dieselbe Anzahl an Öffnungen. Im Allgemeinen handelt es sich bei den Blenden um perforierte Platten mit mindestens je einer Öffnung.
In einer anderen Ausführungsform dieses erfindungsgemäßen Verfahrens ist die zweite Blende durch ein Sieb ersetzt, d.h. die zweite Blende hat eine Vielzahl von Öffnungen bzw. Düsen. Die einsetzbaren Siebe können einen großen Bereich an Porengrößen überspannen, in der Regel liegen die Porengrößen zwischen 0,1 und 250 μm, be- vorzugt zwischen 0,2 und 200 μm, besonders bevorzugt zwischen 0,3 und 150 μm und insbesondere zwischen 0,5 und 100 μm.
Die Öffnungen bzw. Düsen können jede denkbare geometrische Form haben, sie können beispielsweise kreisrund, oval, eckig mit beliebige vielen Ecken, die gegebenen- falls auch abgerundet sein können, oder auch sternförmig sein. Bevorzugt haben die Öffnungen eine kreisrunde Form.
Die Öffnungen der Eintrittsblende haben in der Regeln einen Durchmesser von 0,05 mm bis 1 cm, bevorzugt von 0,08 mm bis 0,8 mm, besonders bevorzugt von 0,1 bis 0,5 mm und insbesondere von 0,2 bis 0,4 mm. Die Öffnungen der Austrittsblende haben in der Regel einen Durchmesser von 0,5 mm bis 1 cm, bevorzugt von 5 mm bis 50 mm, besonders bevorzugt von 10 bis 20 mm.
Die beiden Blenden sind vorzugsweise so konstruiert, dass die Öffnungen bzw. Düsen axial zueinander angeordnet sind. Unter axialer Anordnung soll verstanden werden, dass die durch die Geometrie der Düsenöffnung erzeugte Strömungsrichtung bei beiden Blenden identisch ist. Die Öffnungsrichtungen der Eintritts- und Austrittsdüse müssen dazu nicht auf einer Linie liegen, sie können auch parallel verschoben sein, wie aus den obigen Ausführungen hervorgeht. Vorzugsweise sind die Blenden parallel ausgerichtet.
Es sind jedoch andere Geometrien, insbesondere nicht parallele Blenden oder unterschiedliche Öffnungsrichtungen der Ein- und Austrittsdüse möglich. Im Zweiblendensystem (Eintritts- und Austrittsblende) weist wie oben ausgeführt die Austrittsdüse grö- ßere Öffnungen auf. Dadurch kommt es zu einer Beruhigung der Turbulenz. Ein Prallblech ist in diesem Fall nicht notwendig. Die Dicke der Blenden kann beliebig sein. Bevorzugt haben die Blenden eine Dicke im Bereich von 0,1 bis 100 mm, bevorzugt von 0,5 bis 30mm und besonders bevorzugt von 1 bis 10 mm. Dabei ist die Dicke (I) der Blenden so gewählt, dass der Quotient aus Durchmesser (d) der Öffnungen und Dicke (I) im Bereich von 1 :1 , bevorzugt 1 :1 ,5 und besonders bevorzugt 1 :2 beträgt.
Der Zwischenraum zwischen den beiden Blenden kann beliebig lang sein, in der Regel beträgt die Länge des Zwischenraums 1 bis 500 mm, bevorzugt 10 bis 300 mm und besonders bevorzugt 20 bis 100 mm.
Im Zwischenraum zwischen den Blenden kann sich ein statischer Mischer befinden, der die Strecke zwischen den beiden Blenden ganz oder teilweise ausfüllen kann. Bevorzugt erstreckt sich der statische Mischer über die gesamte Länge des Zwischenraums zwischen den beiden Blenden. Statische Mischer sind dem Fachmann bekannt. Es kann sich dabei beispielsweise um einen Ventil-Mischer handeln oder um einen statischen Mischer mit Bohrungen, einen aus geriffelten Lamellen oder einen aus ineinander greifenden Stegen. Weiterhin kann es sich um einen statischen Mischer in Wendel-Form oder in N-Form oder um einen solchen mit heiz- oder kühlbaren Mischelementen handeln
Zusätzlich zu dem statischen Mischer kann in dem Zwischenraum zwischen den beiden Blenden noch eine mechanische Energieeinbringung erfolgen. Die Energie kann beispielsweise in Form von mechanischen Schwingungen, Ultraschall oder Rotationsenergie eingebracht werden. Dadurch wird eine turbulente Strömung erzeugt, die be- wirkt, dass die Partikel im Zwischenraum nicht agglomerieren.
Ausführungsform b)
Alternativ zu dieser ersten Variante kann die Mischvorrichtung aus einer Blende mit wenigstens einer Eintrittsdüse und einer Prallplatte bestehen, wobei sich im Zwischenraum zwischen der Blende und der Prallplatte gegebenenfalls ein statischer Mischer befindet. Alternativ oder zusätzlich zu dem statischen Mischer kann in dem Zwischenraum eine mechanische Energieeinbringung erfolgen.
Für die Blende mit Eintrittsdüse, dem Zwischenraum mit statischem Mischer und der mechanischen Energieeinbringung gilt das oben Gesagte.
In dieser Variante wird die zweite Blende durch eine Prallplatte ersetzt. Die Prallplatte hat in der Regel einen Durchmesser, der 0,5 bis 20 %, bevorzugt 1 bis 10 % kleiner ist als der Rohrdurchmesser an der Stelle, an der die Prallplatte eingebaut ist. Generell kann die Prallplatte jede geometrische Form haben, bevorzugt in Form einer runden Scheibe, so dass in Frontalaufsicht ein Ringspalt zu sehen ist. Denkbar ist beispielsweise auch die Form eines Schlitzes oder eines Kanals.
Die Prallplatte kann analog zur zweiten Blende bei der oben beschriebenen Variante in unterschiedlichen Abständen zur ersten Blende angebracht sein. Dadurch ist der Zwischenraum zwischen der Blende und der Prallplatte beliebig lang, in der Regel beträgt die Länge des Zwischenraums 1 bis 500 mm, bevorzugt 10 bis 300 mm und besonders bevorzugt 20 bis 100 mm.
Das erfindungsgemäße Verfahren weist gegenüber denen aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren einige Vorteile auf, da besonders hohe Ausbeuten des PoIy- hydroxyalkanoats mit hohem Molekulargewicht erhalten werden. Insbesondere lassen sich Polyhydroxyalkanoate mit Mn von 50.000 bis 2.000.000 und insbesondere von 100.000 bis 200.000 mit dieser Aufarbeitungsvariante realisieren.
Die Temperatur, bei der die Emulgierung der Rohemulsion zur feinteiligen Emulsion nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erfolgt, beträgt in der Regel 0 bis 1500C, bevorzugt, 5 bis 800C, besonders bevorzugt 20 bis 40°C. Dabei können alle in der Vor- richtung eingesetzten Homogenisiereinheiten temperierbar sein.
Die Homogenisierung wird in der Regel bei Drücken oberhalb des Atmosphärendrucks, d.h. > 1 bar durchgeführt. Dabei übersteigen die Drücke jedoch nicht einen Wert von 10 000 bar, so dass bevorzugt Homogenisierdrücke von > 1 bar bis 10 000 bar, bevor- zugt 5 bis 2 500 bar und besonders bevorzugt von 100 bis 2000 bar eingestellt werden.
Die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Produktionszellkonzentrationen betragen etwa von 20 bis 300 g/L, bevorzugt 50-220 g/L.
Als Produktionszelle wird dabei jede Art von Zelle oder Zellverband bezeichnet; insbesondere solche Zellen tierischen, pflanzlichen oder mikrobiellen Ursprungs. Gleichfalls bevorzugt sind Produktionszellen rekombinanter Organismen. Besonders gut geeignete Produktionszellen sind Prokaryonten (einschliesslich der Archaea) oder Eukaryon- ten, besonders Bakterien einschließlich Halobacterien und Methanococcen, Pilze, In- sektenzellen, Pflanzenzellen und Säugerzellen, besonders bevorzugt Alcaligenes eutrophus, Escherichia coli, Bacillus subtilis, Bacillus. megaterium, Aspergillus oryzea, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Pichia pastoris, Pseudomonas spec, Lactoba- cillen, Hansenula polymorpha, Trichoderma reesei, SF9 (bzw. verwandte Zellen). Besonders bevorzugt ist der Mikroorganismus Alcaligenes eutrophus.
Die Produktionszelle kann direkt nach der Kultivierung (z.B. Fermentation) in das erfindungsgemäße Verfahren eingesetzt werden; es ist aber auch möglich, die Produkti- onszelle erst abzutöten, beispielsweise durch Sterilisation, und gegebenenfalls die Zellmasse durch Filtration des Kultivierungsmediums anzureichern.
Unter Polyhydroxyalkanoaten werden biotechnologisch hergestellte Polymere verstan- den. Insbesondere sind darunter: Poly-3-hydroxybutyrat (P-3HB), Poly-4- hydroxybutyrat (P-4HB), Poly-3-hydroxybutyrat/co-3-hydroxyvaleriat (P-3HBco-3HV), Poly-3-hydroxybutyrat/co-4-hydroxybutyrat (P-3HB-co-4HB), Poly-3-hydroxybutyrat/co- 3-hydroxyhexanoat (P-3HB-co-3HHx) und Poly-3-hydroxybutyrat/co-3-hydroxyoctanoat (P-3HB-co-3HO) zu verstehen.
Im Schritt ii) werden die Zellfragmente von den Polyhydroxyalkanoat-Körnchen mittels eines kontinuierlich arbeitenden Düsenseparators getrennt. Der Pellet bestehend aus den Polyhydroxyalkanoat-Körnchen wird durch die Düsen ständig abgeführt, während die Zellfragmente ständig im Überlauf (eigentlicher „Klarlauf") effektiv abgetrennt wer- den. Es gibt keine Entleerung durch Öffnen der Trommel und dadurch auch keine Verluste, Verwirbelungen und ähnliche Instabilitäten, die zu Lasten einer effizienten Trennung gehen. Um eine noch höhere Reinheit zu erlangen, können die PHA-Körnchen mit klarem Wasser versetzt und erneut zentrifugiert werden. Auf diese Weise gelangt man zu einer wässrigen Suspension von PHA-Körnchen in ansprechender Reinheit, welche dann in bekannter Weise getrocknet werden kann, zum Beispiel durch Sprühtrocknung. Mit Hilfe der folgenden Schritte iii) und iv) kann dieser dramatisch gesenkt werden.
Düsenseparatoren sind auch bekannt unter dem Begriff Westfalia Separator. Eine de- taillierte Beschreibung ist beispielsweise unter www.gea-westfalia.de zu erhalten. Beispielhaft sei das VisCon®-System angeführt, bei dem die Düsen viskositätsgesteuert sind. Dadurch entfällt das Anpassen der Separatorparameter (Entleerungszeiten) bei veränderten Zulaufbedingungen und als Folge hiervon werden gleich bleibende Fest- stoffaustragskonzentrationen erreicht. Beim VisCon®-System liegen die Düsen nicht am Trommelrand, sondern auf einem kleineren Durchmesser in der Trommel. Die Einleitung über den hydrohermetischen Zulauf sowie der Ablauf über die Düsen erhöhen die Zellaktivität der abgetrennten Zellen.
In Schritt iii) werden die zuvor aufkonzentrierten Polyhydroxyalkanoat-Körnchen mit einer wässrigen Alkali-Lösung gewaschen.
Unter Alkali-Lösung versteht man in der Regel Hydroxide wie Erdalkali- und insbesondere Alkalihydroxide, Carbonate wie Erdalkali- und insbesondere Alkalicarbonate und Hydrogencarbonate wie Erdalkali- und insbesondere Alkalihydrogencarbonate. Hydroxide werden vorzugsweise in einer Konzentration von 0,01 bis 1 mol/l eingesetzt. Carbonate und Hydrogencarbonate werden in der Regel in einer Konzentration von 0,01 bis 2 mol/l eingesetzt.
Die Behandlung mit Alkali-Lösung kann bei Temperaturen zwischen 0 bis 1200C durchgeführt werden, bevorzugt 10 bis 600C. Wie oben bereits erwähnt wird die Temperatur im erfindungsgemäßen Verfahren so gewählt, dass keine nennenswerten Mengen an Polyhydroxyalkanoat (<5%) in Lösung gehen.
Mit der Alkali-Lösung stellt man in der Regel eine Hydroxidendkonzentration von 0,001 bis 1 mol/l, vorzugsweise 0,01 bis 0,5 mol/l, und insbesondere von 0,05 bis 0,2 mol/l ein.
Nach der Behandlung mit Alkali-Lösung wird das Polymer von der wässrigen Lösung entfernt. Dies kann beispielsweise durch Filtration, Zentrifugation, Sedimentation oder mittels Hydrocyclon erfolgen.
Die verwendete Alkali-Lösung kann dazu in flüssiger oder fester Form vorliegen.
Durch eine Behandlung mit einer Säure im Schritt iv) kann der Gehalt an Alkali- und Erdalkalimetallen der Polyhydroxyalkanoat-Körnchen erniedrigt und damit die thermische Stabilität der Polyhydroxyalkanoate erhöht werden.
Die Behandlung mit Säure kann als Waschvorgang verstanden werden. Anders als in dem in DE 19712702 beschriebenen Verfahren werden im erfindungsgemäßen Verfahren die Polyhydroxyalkanoate durch die Säure nicht aufgelöst.
Die erfindungsgemäßen Säuren umfassen sowohl Lewissäuren als auch Bronstedsäu- ren. Lewis definierte eine Säure als ein Stoff, welcher ein elektrophiler Elektronenpaarakzeptor ist. Nach der Definition von Bronsted ist eine Säure eine Verbindung, welche Protonen an Reaktionspartner abgeben kann.
Die Säure kann als Feststoff, Flüssigkeit oder Gas vorliegen. Weiterhin kann die Säure als Lösung in einem organischen Lösungsmittel oder Wasser vorliegen.
Insbesondere bevorzugt sind wässrige Säuren. Mineralsäuren werden vorzugsweise in einer Konzentration von 0,01 bis 1 mol/l eingesetzt. Carbonsäuren und Sulfonsäuren werden in der Regel in einer Konzentration von 0,01 bis 2 mol/l eingesetzt.
Als flüssige Säuren kommen anorganische oder organische Säuren zum Einsatz.
Bevorzugte Säuren sind Schwefelsäure, Salzsäure, Phosphorsäure, phosphonige Säure, Salpetersäure, salpetrige Säure, Kohlensäure, Kieselsäure, Hypochlorige Säure, Perchlorsäure, Amidosulfonsäure, Essigsäure, Ameisensäure, Propionsäure, Sulfon- säure, Sulfonige Säure, Methansulfonsäure, Trifluormethansulfonsäure oder Citronen- säure.
Bevorzugte gasförmige Säuren sind SO2, SO3 oder CO2.
Das Polyhydroxyalkanoat kann während der Behandlung in Lösung, als Aufschläm- mung, als Schmelze oder als Feststoff vorliegen.
Die Behandlung mit Säure kann kontinuierlich oder diskontinuierlich durchgeführt werden.
Die Behandlung mit Säure kann bei Temperaturen zwischen 0 bis 1200C durchgeführt werden, bevorzugt 10 bis 6O0C. Wie oben bereits erwähnt wird die Temperatur im er- findungsgemäßen Verfahren so gewählt, dass keine nennenswerten Mengen an Polyhydroxyalkanoat (<5%) in Lösung gehen.
Mit der Säure stellt man in der Regel eine Säureendkonzentration von 0,001 bis 1 mol/l, vorzugsweise 0,01 bis 0,5 mol/l, und insbesondere von 0,05 bis 0,2 mol/l ein.
Nach der Behandlung mit Säure wird das Polymer von der wässrigen Lösung entfernt. Dies kann beispielsweise durch Filtration, Zentrifugation, Sedimentation oder mittels Hydrocyclon erfolgen.
Die verwendete Säure kann dazu in flüssiger, fester oder gasförmigem Zustand vorliegen.
Eine bevorzugte Form ist die Verwendung einer festen Säure. Unter fester Säure werden insbesondere Ionenaustauscher verstanden. Alternativ ist die Verwendung von Ionenaustauschern mit sauren Gruppen wie Sulfonsäuren, Phosphorsäuren und Carbonsäuren.
Die Säure kann als Gas vorliegen. Die überschüssige Säure kann durch Entgasen der Polyhydroxyalkanoat-Lösung oder durch Extraktion der gasförmigen Säure in eine zweite flüssige Phase entfernt werden.
Zur weiteren Reduzierung des Stickstoffgehaltes kann ein Bleichschritt (Schritt v) eingefügt werden. Geeignete Bleichmittel sind 0,001 bis 0,2 M Hypochlorit und/oder Wasserstoffperoxid-Lösung. Sofern Alkalihypochlorit eingesetzt wird, kann es von Vorteil sein den Bleichschritt v) direkt im Anschluss an Schritt iii) durchzuführen und abschließend mit Säure zu waschen (Schritt iv). In manchen Fällen hat es sich als vorteilhaft erwiesen, den Blechschritt vi-1 ) im Anschluss an den Säurewaschgang iv) durchzuführen.
Verwendete Apparaturen:
Im Beispiel wurde als Hochdruckhomogenisator zum Aufschluss der Produktionszellen folgende Anordnung I gewählt. Als Eintrittsdüse wurde eine Blende mit 14 x 0,2 mm starken Bohrungen verwendet. Die Fermentationsbrühe lag als Suspension vor und wurde mit einem Druck von ca. 2000 atm durch die Blende gedrückt. Im Zwischenraum (15 mm lang und 8 mm im Durchmesser wurde die Suspension verwirbelt, bevor sie auf die zweite Blende auftrat, die als Austrittsdüse fungierte. Die Zellsuspension wurde durch eine konische Bohrung auf die Austrittsblende geführt und trat dann aus einer einzigen Bohrung (Durchmesser 1 , 5 mm) aus dem Blendenblock aus. Die Austrittsblende war gegenüber den Bohrungen der Eintrittsdüse zentrisch angeordnet.
Als Düsenseparator wurde ein Gerät der Firma GEA Westfalia Typ HFC-15 verwendet.
Beispiel 1 a: Isolierung von 3-Hydroxy-polyhydoxybutyrat (3-PHB) aus E. coli-
Produktionszellen
i) Ausgangspunkt des Verfahrens waren 200 L einer E. coli Fermentationsbrühe mit einem Gehalt von 57,7 g/L Biotrockenmasse, davon 60,6% 3- Polyhydroxybutyrat, gekühlt auf 4°C im Fermenter. Die Fermentation erfolgte nach B. S. Kim, S. Y. Lee, H. N. Chang in Biotechnology Letters, Vol. 14, Seiten 81 1-816 (1992). Die Kulturbrühe wurde bei 1750 bar Druck vollständig über einen Hochdruckhomogenisator gefahren und am Ausgang auf 12°C gekühlt. Anschließend wurde das Zellhomogenisat mit VE-Wasser auf einen Feststoffgehalt von 22,3 g/L verdünnt.
ii) In einem Düsenseparator Typ HFC-15 der Firma GEA Westfalia wurde bei einer Zulaufrate von 700 L/h die Trennung von PHB-Partikeln (Konzentrat) und Zelltrümmern (Überlauf) durchgeführt. Die Gesamttrockensubstanz im Konzentrat betrug 110,1 g/L, davon 90% 3-PHB. Im Überlauf befanden sich 7,7 g/L Gesamttrockensubstanz, davon 8,6% 3-PHB.
iii) das Konzentrat wurde mit KOH bis zu einer Endkonzentration von 0,2 mol/L versetzt und 1 h bei 300C gerührt. Danach wurde zentrifugiert, der Überstand verworfen und das Pellet in VE-Wasser resuspendiert, erneut zentrifugiert und der Überstand wiederum verworfen (Waschschritt). iv) Es folgte ein Waschschritt mit Schwefelsäure in einer Endkonzentration von 0,1 mol/L sowie ein weiterer Waschschritt mit VE-Wasser. Die Trocknung erfolgte im Vakuumtrockenschrank bei 400C.
Vergleichsbeispiel 1 b
Die Fahrweise der Schritte i), ii) und iv) erfolgte analog Beispiel 1a. Auf den Zwischenschritt iii) (Waschen mit KOH) wurde verzichtet.
Für Beispiel 1 a und Vergleichsbeispiel 1 b wurden 3-PHB-Gehalt, Gesamtstickstoff, Kaliumgehalt sowie Molekulargewicht der Proben vor (MW1 ) und nach einer thermischen Belastung (MW2) von 185°C über einen Zeitraum von 35 Minuten bestimmt. Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle aufgeführt.
Figure imgf000012_0001
Das Polymer aus Beispiel 1 ist auf Grund der geringeren Verunreinigung mit Proteinen und DNA (geringerer Stickstoffgehalt) deutlich stabiler unter thermischer Belastung. Bei thermischen Belastung, wie sie typischerweise bei einer Verarbeitung auftritt, kommt es bei Beispiel 1 a zu einem geringeren Abbau des Molekulargewichts. Die Bestimmung der thermischen Stabilität erfolgte über die Abnahme der Schmelzeviskosität bei einer Temperatur zwischen 175 und 185°C (siehe P.A. DaIy et al., J. of Applied PoIy- mer Science, Vol. 98, Seiten 66 bis 74 (2005); insbesondere Abbildung 4 und Gleichung 5). Anhand der Steigung der Geraden lässt sich die thermische Stabilität der untersuchten Polymere in Beziehung setzen. Je geringer die Steigung der Geraden, desto thermisch stabiler ist das betreffende Material. Beispiel 1 wies eine deutlich geringere Steigung auf als ein durch Lösemittelextraktion - wie in WO2005052175 be- schrieben - hergestelltes 3-PHB.
Zur weiteren Reduzierung des Stickstoffgehaltes kann ein Bleichschritt angeschlossen werden. Die Bleiche einer 5 % (w/w) Suspension des Produktes aus Variante 1 in 0,08 Mol/L Natriumhypochlorit für 15 Minuten bei Raumtemperatur mit anschließenden Waschschritten mit VE-Wasser reduzierte den Stickstoffgehalt auf 0,018%. Beispiel 2a: Isolierung von 3-Hydroxy-polyhydoxybutyrat (3-PHB) aus E. coli- Produktionszellen
i) Ausgangspunkt des Verfahrens waren 200 L einer E. coli Fermentationsbrühe mit einem Gehalt von 66,7 g/L Biotrockenmasse, davon 61 ,5% PHB, gekühlt auf
4°C im Fermenter. Die Fermentation erfolgte nach B. S. Kim, S. Y. Lee und H. N. Chang in Biotechnology Letters, Vol. 14, Seiten 81 1-816 (1992). Die Kulturbrühe wurde bei 1750 bar Druck vollständig über einen Hochdruckhomogenisator gefahren und am Ausgang nicht gekühlt. Anschließend wurde das Zellhomogenisat mit VE-Wasser auf einen Feststoffgehalt von 16,3 g/L verdünnt.
ii) In einem Düsenseparator Typ HFC-15 der Firma GEA Westphalia wurde bei einer Zulaufrate von 700 L/h die Trennung von PHB-Partikeln (Konzentrat) und Zelltrümmern (Überlauf) durchgeführt. Die Gesamttrockensubstanz im Konzentrat betrug 50,6 g/L, davon 90% PHB. Im Überlauf befanden sich 0,7 g/L Gesamttrockensubstanz, davon 25,6% PHB.
iii) Das Konzentrat wurde mit NaOH in einer Endkonzentration von 0,2 mol/L versetzt und 1 h bei 300C gerührt. Danach wurde zentrifugiert, der Überstand ver- worfen und das Pellet in VE-Wasser resuspendiert, erneut zentrifugiert und der
Überstand wiederum verworfen (Waschschritt).
iv) Es folgte ein Waschschritt mit Schwefelsäure in einer Endkonzentration von 0,1 mol/L sowie ein weiterer Waschschritt mit VE-Wasser. Die Trocknung erfolgt im Vakuumtrockenschrank bei 400C.
Beispiel 2b) wurde analog Beispiel 2a durchgeführt, nur wurde in Schritt iii) KOH anstelle von NaOH verwendet.
Beispiel 2c) wurde analog Beispiel 2a durchgeführt, nur wurde in Schritt iii) mit NaOH bis zu einer Endkonzentration von 0,1 mol/L versetzt und 0,5 h bei 300C gerührt.
Vergleichsbeispiel 2d wurde wie Beispiel 2a durchgeführt, lediglich wurde auf Schritt iii) verzichtet.
Für die beispiele 2a bis 2c und Vergleichsbeispiel 2d wurden 3-PHB-Gehalt, Gesamtstickstoff, Kaliumgehalt sowie Molekulargewicht der Proben bestimmt. Die Ergebnisse sind nachfolgend tabellarisch zusammengefasst.
Figure imgf000014_0001

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Isolierung von Polyhydroxyalkanoaten aus Produktionszellen, dadurch gekennzeichnet, dass
i) die Produktionszellen aufgeschlossen werden, anschließend
ii) die Zellfragmente von den Polyhydroxyalkanoat-Körnchen mittels eines kontinuierlich arbeitenden Düsenseparators abgetrennt werden;
iii) die aufkonzentrierten Polyhydroxyalkanoat-Körnchen mit einer wässrigen Alkali-Lösung und anschließend
iv) mit einer wässrigen Säure gewaschen werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die Produktionszellen in Schritt i) mittels einer Hochdruckhomogenisiervorrichtung aufgeschlossen werden.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Homogenisiervorrichtung
a) aus einer Blende mit wenigstens einer Eintrittsdüse und einer Blende mit wenigstens einer Austrittsdüse besteht, wobei im Zwischenraum zwischen den Blenden gegebenenfalls zusätzlich mechanische Energieeinbringung erfolgt oder
b) aus einer Blende mit wenigstens einer Eintrittsdüse und einer Prallplatte besteht, wobei im Zwischenraum zwischen der Blende und der Prallplatte gegebenenfalls mechanische Energieeinbringung erfolgt.
4. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der Produktionszelle um einen rekombinanten Organismus handelt.
5. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Po- lyhydroxyalkanoat um ein Poly-3-hydroxybutyrat (P-3HB), ein Poly-4- hydroxybutyrat (P-4HB), Poly-3-hydroxy-butyrat/co-3-hydroxyvaleriat (P-3HB-co- 3HV), Poly-3-Hydroxybutyrat/co-4-hydroxybutyrat (P-3HB-co-4HB), Poly-3- hydroxybutyrat/co-3-hydroxyhexanoat (P-3HB-co-3HHx) oder Poly-3- hydroxybutyrat/co-3-hydroxyoctanoat (P-3HB-co-3HO)handelt.
6. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die Alkali-Lösung in Stufe iiii) eine 0,01 bis 0,5 M Alkalihydroxid, Alkalicarbonat oder Alkalihydrogen- carbonat-Lösung ist.
7. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die wässrige Säure in Stufe iv) eine 0,01 bis 0,5 M Mineralsäure, Carbonsäure oder Sulfonsäure ist.
8. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass in einer weiteren Stufe v) Polyhydroxyalkanoat-Körnchen einem Bleichschritt unterzogen werden.
9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass im Bleichschritt vi-1 ) eine 0,001 bis 0,2 M Hypochlorit und/oder Wasserstoffperoxid-Lösung verwendet werden.
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