DE60019098T2

DE60019098T2 - Verfahren zur reinigung von polyhydroxyalkanoaten

Info

Publication number: DE60019098T2
Application number: DE60019098T
Authority: DE
Inventors: Daniel Horowitz
Original assignee: Metabolix Inc
Current assignee: Yield10 Bioscience Inc
Priority date: 1999-05-12
Filing date: 2000-05-12
Publication date: 2006-02-02
Anticipated expiration: 2020-05-13
Also published as: CA2373131C; WO2000068409A1; ES2239004T3; JP4790912B2; JP2002543794A; AU4844000A; CA2373131A1; US20020058316A1; AU750835B2; DE60019098D1; EP1175499B1; ATE292188T1; EP1175499A1; US6340580B1

Description

Hintergrund der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft generell Verfahren zur Gewinnung von Polyhydroxyalkanoaten ("PHAs") aus mikrobieller oder pflanzlicher Biomasse. Das verbesserte Verständnis der PHA-Biosynthesewege hat den Einsatz von Mikroorganismen, sowohl natürlicher als auch rekombinanter, sowie von Pflanzenzellen für die Erzeugung nennenswerter PHA-Mengen ermöglicht. Allerdings bestehen noch Schwierigkeiten hinsichtlich der Entwicklung einer effizienten und kosteneffektiven Gewinnung des PHA in nützlicher Qualität und Reinheit aus diesen biologischen Ausgangsmaterialien. Zu den bisherigen Verfahren zur Isolierung und Reinigung von PHAs aus Biomasse gehören zum Beispiel Verfahren, die wässrige Lösemittel einsetzen, sowie Verfahren, die organische Lösemittel einsetzen.
Zum Beispiel offenbart das US-Patent Nr. 5 364 778 an Byrom ein wässriges Verfahren, bei dem PHA-haltige Biomasse in Form einer wässrigen Aufschlämmung gehalten wird, in der das PHA im Allgemeinen unlöslich ist. Die Aufschlämmung wird verschiedenen Behandlungen unterzogen, die so ausgelegt sind, dass die nicht aus PHA bestehende Biomasse verdaut, abgebaut oder auf andere Weise wasserlöslich gemacht wird. Diese solubilisierte Biomasse wird dann durch Zentrifugation, Filtration oder andere Verfahren aus der Aufschlämmung entfernt. Verfahren auf Wasserbasis haben jedoch im Allgemeinen gewisse Nachteile, die sich insbesondere auf die Verarbeitung im großen Maßstab beziehen. Beispiele für diese Nachteile sind, dass (a) eine effektive Reinigung erschwert ist, da viele Verunreinigungen, einschließlich einiger Tenside, die für die Solubilisierungsbehandlungen nützlich sind, fest an die Oberfläche der PHA-Partikel adsorbiert sein können, (b) viele Volumina (d.h. große Mengen) Waschwasser für diesen Prozess erforderlich sein können, was zur Bildung von gebrauchtem Waschwasser und den entsprechenden Schwierigkeiten hinsichtlich der Entsorgung führt, (c) mehrere Solubilisierungsbehandlungen für die Gewinnung von PHA hoher Reinheit erforderlich sein können, (d) das Trocknen der wasserbasierten PHA-Aufschlämmung zeitaufwendig und teuer sein kann, (e) PHA-Partikel zu einem extensiven Verschmutzen von Filtermembranen, Zentrifugen und anderen im Prozess eingesetzten Materialien führen können und (f) Solubilisierungsbehandlungen, damit sie wirklich effektiv sind, teure Reagenzien und lange Prozesszeiten und/oder hohe Temperaturen erfordern können.
Beispiele für Prozesse auf der Basis von Verfahren, die organische Lösemittel einsetzen, werden in den US-Patenten Nr. 4 101 533 an Lafferty el al. und Nr. 5 422 257 an Ohleyer offenbart. Bei diesen Verfahren wird ein organisches Lösemittel für das in einer Biomasse enthaltene PHA mit der Biomasse gemischt, was zur Auflösung des PHA führt. Die organische Lösung, die das PHA enthält, wird dann von der verbleibenden unlöslichen Biomasse durch Filtration, Zentrifugation oder andere Verfahren abgetrennt. Die organische Lösung wird dann zur Gewinnung des PHA vom Lösemittel befreit. Diese Wege unter Einsatz organischer Lösemittel leiden unter Nachteilen, die den Nachteilen ähnlich sind, die mit den Wegen unter Einsatz wässriger Lösemittel verbunden sind, und die daraus bestehen, dass (a) ein relativ großes Lösemittelvolumen erforderlich ist, um das PHA vollständig aus der Biomasse zu extrahieren, (b) die Biomasse u.U. vor der Lösemittelextraktion getrocknet werden muss, was teuer und zeitaufwendig sein kann, und (c) das Lösemittel u.U. neben dem PHA auch Verunreinigungen, wie Lipide oder andere hydrophobe biologische Materialien, extrahiert, was eine Weiterverarbeitung des Extrakts zur Gewinnung von PHA mit zufriedenstellender Reinheit erforderlich macht. Es wäre deshalb vorteilhaft, verbesserte, kosteneffektivere Prozesse zur Gewinnung von PHA aus PHA-haltiger Biomasse zu entwickeln.
Es ist deshalb ein Ziel dieser Erfindung, ein Verfahren zur Gewinnung von PHA aus PHA-haltiger Biomasse mittels eines Prozesses bereit zu stellen, der einfacher und vergleichsweise schneller ist, wässrige und/oder organische Lösemittel effizienter einsetzt und möglicherweise ein reineres PHA-Produkt liefert als herkömmliche Prozesse.
Es ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Gewinnung von PHA aus PHA-haltiger Biomasse mittels eines Prozesses bereit zu stellen, der wirtschaftlich in einem Herstellungsprozess im kommerziellen Maßstab eingesetzt werden kann.
Zusammenfassung der Erfindung
Es wird ein Verfahren zur Isolierung und Reinigung von PHA aus einer PHA-haltigen Biomasse bereit gestellt. Das Verfahren schließt den Schritt des Extrahierens von PHA aus der Biomasse mittels wenigstens eines Lösemittel, wobei die Biomasse gleichzeitig einem Filtrationsprozess zur Entfernung von Zellen unterzogen wird, ein. Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird PHA-haltige Biomasse (zum Beispiel eine wässrige Aufschlämmung von mikrobiellen Zellen, die aus einem Fermentationsprozess erhalten wurden) zur Gewinnung von PHA direkt über eine Diafiltration unter Verwendung eines organischen Lösemittels extrahiert.
Bei einem bevorzugten Diafiltrationsprozess wird eine wässrige Aufschlämmung mikrobieller Zellen, die PHA enthalten, durch eine Filtermembran rezirkuliert, wobei die Membran eine Porengröße besitzt, die ausreichend klein ist, um einzelne Zellen oder Aggregate von Zellen, wie sie in der Aufschlämmung vorkommen können, zurück zu halten. Es erfolgt ein Flüssigkeitsfluss durch die Filtermembran unter Bedingungen, bei denen ein Druckabfall über die Filtermembran vorliegt. Während die Flüssigkeit zunehmend aus der Aufschlämmung der Biomasse entfernt wird, wird ein organisches Lösemittel, vorzugsweise ein wassermischbares Lösemittel, das auch ein Lösemittel für das PHA ist, zur Aufschlämmung der Biomasse gegeben. Die Zugabe des Lösemittels sollte mit einer Geschwindigkeit erfolgen, die angenähert gleich der Geschwindigkeit ist, mit der die Flüssigkeit durch den Filter tritt, damit das Volumen der Aufschlämmung der Biomasse gleich bleibt. Mit dem Ansteigen der Konzentration des organischen Lösemittels in der Aufschlämmung werden verschiedene Verunreinigungen, die unlöslich in Wasser sind, in der Lösemittel-Wasser-Mischung gelöst und treten durch die Filtermembran. Wenn die Konzentration des organischen Lösemittels eine bestimmte Höhe erreicht, wird das PHA löslich und fließt durch die Filtermembran. Das PHA-haltige Filtrat wird dann zur Gewinnung des Polymers vom Lösemittel befreit.
Das Verfahren hat die Vorteile, dass (a) es nicht generell erforderlich ist, die Biomasse vor der Lösemittelextraktion zu trocknen, (b) es leicht möglich ist, das PHA von anderen Verunreinigungen abzutrennen, um relativ reines PHA in nur einem Prozess zu erhalten, da die Biomasse einem Konzentrationsgradienten des Lösemittels ausgesetzt wird, (c) der gesamte Prozess der Extraktion und Reinigung von PHA aus der Biomasse mittels eines Minimums an Prozessschritten und mit minimaler Ausrüstung durchgeführt werden kann, und (d) das Verfahren Lösemittel effizient einsetzt, insbesondere wenn die Aufschlämmung der Biomasse relativ konzentriert ist und die Diafiltration als Diafiltration bei konstantem Volumen durchgeführt wird. Außerdem ist es, durch die Verwendung flüchtiger organischer Lösemittel, relativ einfach, die PHA-Lösungen vom Lösemittel zu befreien und das Lösemittel aus den im Diafiltrationsprozess erzeugten Filtraten zu gewinnen und wieder zu verwenden.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Es ist ein Verfahren zur Isolierung und Reinigung von Polyhydroxyalkanoaten ("PHAs") aus Biomasse, die PHAs aufweist, entwickelt worden. Das Verfahren schließt den Schritt des Extrahierens von PHA aus der Biomasse mittels wenigstens eines Lösemittel, wobei die Biomasse gleichzeitig einem Filtrationsprozess zur Entfernung von Zellen unterzogen wird, ein.
I. Die PHA-haltige Biomasse
Die Biomassematerialien stammen aus PHA-produzierenden Pflanzen oder PHA-produzierenden Mikroorganismen.
Polymerzusammensetzungen
So wie der Begriff „Polyhydroxyalkanoat" und „PHA" hier verwendet wird, bezieht er sich auf Polymere, die eine oder mehr Einheiten, zum Beispiel zwischen 10 und 100 000, und vorzugsweise zwischen 100 und 30 000 Einheiten mit der folgenden Formel I enthalten: -OCR¹R²(CR³R⁴)_nCO-, wobei n eine ganze Zahl ist, zum Beispiel zwischen 1 und 15, und, bei einer bevorzugten Ausführungsform, zwischen 1 und 4; und
wobei R¹, R², R³ und R⁴ unabhängig voneinander Kohlenwasserstoffgruppen, einschließlich von langkettigen Kohlenwasserstoffgruppen, halogen- und hydroxysubstituierte Gruppen, Hydroxylgruppen, Halogengruppen, Stickstoff-substituierte Gruppen, Sauerstoff-substituierte Gruppen und/oder Wasserstoffatome sein können.
Die Formel -(CR³R⁴)_n- ist, wie sie hier verwendet wird, so definiert, dass sie die folgenden Formeln einschließt:
-CR³R⁴- (wobei n = 1),
-CR³R⁴CR^3'R^4'- (wobei n = 2) und
-CR³R⁴CR^3'R^4'CR^3''R^4''- (wobei n = 3),
wobei R³, R⁴, R^3', R^4', R^3'' und R^4'' unabhängig voneinander Kohlenwasserstoffgruppen, einschließlich von langkettigen Kohlenwasserstoffgruppen, halogen- und hydroxysubstituierte Gruppen, Hydroxylgruppen, Halogengruppen, Stickstoff-substituierte Gruppen, Sauerstoff-substituierte Gruppen und/oder Wasserstoffatome sein können. Somit schließt die Formel I Einheiten ein, die von 2-Hydroxysäuren (n = 0), 3-Hydroxysäuren (n = 1), 4-Hydroxysäuren (n = 2), 5-Hydroxysäuren (n = 3) und 6-Hydroxysäuren (n = 4) abgeleitet sind.
Diese Einheiten können, in einem Homopolymer, alle gleich sein, oder sie können mehrere unterschiedliche Einheiten sein, wie zum Beispiel in einem Copolymer oder Terpolymer. Die Polymere haben typischerweise ein Molekulargewicht von über 300, zum Beispiel zwischen 300 und 107, und bei einer bevorzugten Ausführungsform von 10 000 bis 10 000 000 Dalton.
Zu bevorzugten PHAs gehören Poly-3-hydroxyoctanoat (PHO) oder andere mikrobielle Polyester, die Hydroxysäuren, und zwar C6- bis C14-Hydroxysäuren, aufweisen. Zu weiteren bevorzugten Polymeren gehören Poly-3-hydroxybutyrat-co-3-hydroxyvalerat, Poly-3-hydroxybutyrat-co-3-hydroxypropionat, Poly-3-hydroxybutyrat-co-4-hydroxybutyrat, Poly-3-hydroxybutyrat-co-4-hydroxyvalerat, Poly-3-hydroxybutyrat-co-3-hydroxyhexanoat, Poly-3-hydroxy butyrat-co-3-hydroxyoctanoat, Poly-4-hydroxybutyrat, Poly-3-hydroxypropionat und Poly-4-hydroxyvalerat.
Quellen für PHA-haltige Biomasse
Die PHA-Biomasse wird typischerweise in einem Fermentationsprozess erzeugt (wobei die biologische Quelle ein Mikroorganismus ist, der die PHAs natürlicherweise erzeugt, oder der über eine Manipulation der Kulturbedingungen und des Ausgangsmaterials oder der Mikroorganismen dazu gebracht werden kann, die PHAs zu produzieren), oder sie wird in einer Pflanze, oder einem Teil einer Pflanze, erzeugt, die gentechnisch so verändert wurde, dass sie PHAs erzeugt.
(i) Mikrobielle Quellen
Verfahren, die zur Produktion von PHA-Polymeren mit Mikroorganismen, die natürlicherweise Polyhydroxyalkanoate produzieren, verwendet werden können, werden im US-Patent Nr. 4 910 145 an Holmes et al. und bei Braunegg et. al., J. Biotechnology 65: 127–161 (1998) beschrieben.
Verfahren zur Erzeugung von PHAs in natürlichen oder gentechnologisch veränderten Organismen werden beschrieben bei Madison & Huisman, Microbiol. Mol. Biol. Rev. 63: 1–53 (1999), Choi & Lee, Appl. Microbiol. Biotechnol. 51: 13–21 (1999), Witholt & Kessler, Current Opinion in Biotechnology 10: 279–285 (1999), Williams & Peoples, CHEMTECH 26: 38–44 (1996), in den US-Patenten Nr. 5 245 023, 5 250 430, 5 480 794, 5 512 669 und 5 534 432 an Peoples und Sinskey und im US-Patent Nr. 5 563 239 an Hubbs et al.. Das US-Patent Nr. 5 292 860 an Shiotani et al. beschreibt die Herstellung des PHA-Copolymers Poly(3-hydroxybutyrat-co-3-hydroxyhexanoat. Das US-Patent Nr. 5 871 890 an Naylor beschreibt die Herstellung von PHAs über das Fermentieren von Alcaligenes eutrophus auf Nährmedien aus pflanzlichem Öl.
(ii) Pflanzliche Quellen
PHA kann aus praktisch jedem beliebigen Pflanzentyp, einschließlich transgener Pflanzen, gewonnen werden, was viele Vorteile für die Produktion von PHAs bietet. Transgene Anbaupflanzen für die Produktion von PHAs können mittels Verfahren erhalten werden, die in diesem Gebiet zur Verfügung stehen ( US 5 245 023 und US-5 250 430, US 5 502 273 , US 5 534 432 , US 5 602 321 , US 5 610 041 , PCT WO 9100917, WO 9219747, WO 9302187, WO 9302194 und WO 9412014; Poirier et al., 1992, Science 256: 520–23, van der Leij & Witholt. 1995, Can. J. Microbiol. 41 (Suppl.): 222–38, Nawrath & Poirier, 1996, präsentiert auf The International Symposium on Bacterial Polyhydroxyalkanoates, Hrsg. Eggink et al., Davos, Schweiz, 18.–23. August; Williams & Peoples, 1996, CHEMTECH 26: 38–44). Die landwirtschaftliche Produktion transgener Pflanzen kann PHA-Polymere sowohl zu einem Preis als auch in einem Maßstab produzieren, der mit dem von petrochemisch gewonnenen Kunststoffen konkurrieren kann. Aus transgenen Pflanzen stammende PHA-Polymere oder ihre Derivate können in kommerziell nützlichen Formen verarbeitet und von pflanzlicher Biomasse abgetrennt werden. Die Lokalisation des PHA in der Anbaupflanze kann variiert werden, um die Ausbeute an PHA aus der Pflanze zu maximieren. Zum Beispiel können die Pflanzen einkeimblättrig oder zweikeimblättrig sein, und geeignete Materialien pflanzlichen Ursprungs können aus Wurzeln, Stängeln, Blättern, Blüten, Früchten und Samen gewonnen werden.
PHAs können aus pflanzlicher Biomasse isoliert werden, die von Pflanzen wie Sojabohnen, Baumwolle, Kokosnüssen, Erdnüssen, Rapssamen, Sonnenblumensamen, Oliven, Palmen, Sesamsamen, Leinsamen, Rizinus, Safflorsamen, Tabak, Zuckerrohr, Rutenhirse und Kartoffeln stammt. Zusätzlich zu den PHA-Polymeren kann das pflanzliche Öl in Samenpflanzen während der Verarbeitung isoliert und gewonnen werden, wie es in PCT WO 97/15681 an Metabolix Inc. und in der US-Serien-Nr. 081548 840 beschrieben wird. Die Verfahren zur Verarbeitung der pflanzlichen Biomasse können auf der Basis des jeweiligen PHA-Polymers oder -Derivats, das isoliert wird, und auf der Basis des Typs der Anbaupflanze und der Pflanzenbestandteile, die extrahiert werden, maßgeschneidert werden.
III. Verfahren zur Gewinnung von PHA aus Biomasse
Das Verfahren beinhaltet den Schritt des Extrahierens von PHA aus der Biomasse mittels wenigstens eines Lösemittels, wobei gleichzeitig die Biomasse zur Entfernung von Zellen einem Filtrationsprozess unterzogen wird.
Diafiltration
Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird PHA-haltige Biomasse (zum Beispiel eine wässrige Aufschlämmung mikrobieller Zellen, die durch einen Fermentationsprozess erhalten wurden) mittels einer Modifikation eines typischen Diafiltrationsprozesses, bei dem ein organisches Lösemittel anstelle eines wässrigen Verdünnungsmittels verwendet wird, direkt extrahiert. Standardprozesse der Diafiltration sind in diesem Fachgebiet gut bekannt und werden zum Beispiel by Zeman & Zydney, Microfiltration and Ultrafiltration Principles and Applications, Marcel Dekker Inc. New York, New York. S. 391–96 (1996) beschrieben. Während dieses modifizierten Prozesses wird das PHA, wenn die Konzentration des organischen Lösemittels ansteigt, solubilisiert, und es erscheint im Eluat, das gesammelt wird. Das PHA wird dann mittels Standardverfahren, einschließlich einer Fällung in einem Nicht-Lösemittel, einer Lösemittelverdampfung oder eines Stripping-Prozesses, aus dem Eluat gewonnen, um das PHA zu erhalten. Das lösemittelhaltige Eluat wird zurück behalten, und das Lösemittel wird durch eine Destillation oder andere Techniken, die in diesem Gebiet gut bekannt sind, gewonnen.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird PHA-haltige Biomasse (zum Beispiel eine wässrige Aufschlämmung mikrobieller Zellen, die durch einen Fermentationsprozess erhalten wurden) mittels einer Diafiltration unter Verwendung eines organischen Lösemittels zur Gewinnung von PHA direkt extrahiert.
Das Verfahren hat die Vorteile, dass (a) es nicht generell erforderlich ist, die Biomasse vor der Lösemittelextraktion zu trocknen, (b) es leicht möglich ist, das PHA von anderen Verunreinigungen abzutrennen, um relativ reines PHA in nur einem Prozess zu erhalten, da die Biomasse einem Konzentrationsgradienten des Lösemittels ausgesetzt wird, (c) der gesamte Prozess der Extraktion und Reinigung von PHA aus der Biomasse mittels eines Minimums an Prozessschritten und mit minimaler Ausrüstung durchgeführt werden kann, und (d) das Verfahren Lösemittel effizient einsetzt, insbesondere wenn die Aufschlämmung der Biomasse relativ konzentriert ist und die Diafiltration als Diafiltration bei konstantem Aufschlämmungsvolumen ("Diafiltration bei konstantem Volumen") durchgeführt wird. Außerdem ist es, durch die Verwendung flüchtiger organischer Lösemittel, relativ einfach, die PHA-Lösungen vom Lösemittel zu befreien und das Lösemittel aus den im Diafiltrationsprozess erzeugten Filtraten zu gewinnen und wieder zu verwenden.
Bei einem bevorzugten Diafiltrationsprozess wird eine wässrige Aufschlämmung mikrobieller Zellen, die PHA enthalten, durch eine Filtermembran rezirkuliert, wobei die Membran eine Porengröße besitzt, die ausreichend klein ist, um einzelne Zellen oder Aggregate von Zellen, wie sie in der Aufschlämmung vorkommen können, zurück zu halten. Es erfolgt ein Fluss von Eluattlüssigkeit, die eine wässrige Lösung, eine Mischung aus einer wässrigen Lösung und einem mischbaren Lösemittel oder ein Lösemittel sein kann, durch die Filtermembran unter Bedingungen, bei denen ein Druckabfall über die Filtermembran vorliegt. Während die Flüssigkeit immer mehr aus der Aufschlämmung der Biomasse entfernt wird, wird ein organisches Lösemittel, vorzugsweise ein wassermischbares Lösemittel, das auch ein Lösemittel für das PHA ist, zur Aufschlämmung der Biomasse gegeben. Die Zugabe des Lösemittels sollte mit einer Geschwindigkeit erfolgen, die angenähert gleich der. Geschwindigkeit ist, mit der die Flüssigkeit durch den Filter tritt, damit das Volumen der Aufschlämmung der Biomasse gleich bleibt. Mit dem Ansteigen der Konzentration des organischen Lösemittels in der Aufschlämmung werden verschiedene Verunreinigungen, die unlöslich in Wasser sind, in der Lösemittel-Wasser-Mischung gelöst und treten durch die Filtermembran. Wenn die Konzentration des organischen Lösemittels eine bestimmte Höhe erreicht, wird das PHA löslich und fließt durch die Filtermembran. Das PHA-haltige Filtrat wird dann zur Gewinnung des Polymers vom Lösemittel befreit.
Organische Lösemittel und Wiedergewinnung des Lösemittels Lösemittel, die für das Extrahieren des PHA aus der Biomasse geeignet sind, sind beliebige mit Wasser mischbare Lösemittel, die imstande sind, das PHA zu extrahieren. Es ist in diesem Fachgebiet gut bekannt, welche Lösemittel für das Extrahieren der verschiedenen PHA-Polymerzusammensetzungen geeignet sind, wie es zum Beispiel in den US-Patenten Nr. 5 821 299 und 5 942 597 an Noda, dem US-Patent Nr. 6 043 063 and Kurdikar und in PCT WO 97/15681 an Metabolix Inc. beschrieben wird.
Ein bevorzugtes organisches Lösemittel für PHAs wie Poly-3-hydroxyoctanoat (PHO) oder andere mikrobielle Polyester, die C6- bis C14-Hydroxysäuren aufweisen, ist Aceton. Aceton ist auch für das Extrahieren von Poly-3-hydroxybutyrat-co-4-hydroxybutyrat geeignet. Andere Ketone und Alkohole, insbesondere Alkohole mit mehr als 2 C-Atomen, können wie oben beschrieben verwendet werden. Für PHO erfolgt die Solubilisierung des Polyesters typischerweise bei einer Acetonkonzentration von 85–98% in Wasser (auf Volumenbasis).
Zu organischen Lösemitteln, die für die hier beschriebenen Verfahren nützlich sind, gehören sowohl halogenierte als auch nichthalogenierte Lösemittel. Repräsentative Beispiele sind Lösemittel, die ausgewählt sind aus cyclischen und acyclischen (linearen und verzweigten) R'-OH-Alkoholen, wobei R' = C₄-C₁₀, cyclischen und acyclischen R''-COOR'''-Estern, wobei R'' = H oder C₁-C₆ und R''' = C₁-C₇, cyclischen und acyclischen R''-COOR'''-Estern, wobei R'' = H oder C₁-C₆ und R''' = C₁-C₇ und wobei wenigstens ein Sauerstoff wenigstens einen Kohlenstoff in R'' oder R''', cyclischen und acyclischen R¹-CON-(R²)₂-Amiden ersetzt, wobei R¹ = H oder C₁-C₆ und R² = C₁-C₆, und cyclischen und acyclischen R³-CO-R⁴-Ketonen, wobei R³ = C₁-C₆ und R⁴ = C₁-C₆.
Spezifische Beispiele sind Aceton, Butylacetat, Isobutylacetat, Ethylacetat, Isoamylacetat, Benzylacetat, 2-Methoxyethylacetat, Tetrahydrofurfurylacetat, Propylpropionat, Butylpropionat, Pentylpropionat, Butylbutyrat, Isobutylisobutyrat, Ethylbutyrat, Ethylvalerat, Methylvalerat, Benzylbenzoat, Methylbenzoat, Dimethylsuccinat, Dimethylglutarat, Dimethyladipat, Isobutylalkohol, 1-Butanol, 2-Methyl-1-butanol, 3-Methyl-1-butanol, 1-Pentanol, 3-Pentanol, Amylalkohol, Allylalkohol, Hexanol, Heptanol, Octanol, Cyclohexanol, 2-Ethylhexanol, Tetrahydrofurfurylalkohol, Furfurylalkohol, Benzylalkohol, 2-Furaldehyd, Methylisobutylketon, Methylethylketon, γ-Butyrolacton, Methyl-n-amylketon, 5-Methyl-2-hexanon, Ethylbenzol, 1,3-Dimethoxybenzol, Cumol, Benzaldehyd, 1,2-Propandiol, 1,2-Diaminopropan, Ethylenglycoldiethylether, 1,2,3-Trimethylbenzol, 1,2,4-Trimethylbenzol, 1,3-Dioxan, 1,4-Dioxan, 1-Nitropropan, Toluol-2,4-diisocyanat, Essigsäure, Acrylsäure, Essigsäureanhydrid, alpha-Methylstyrol, Acetophenon, Toluol, Ethylenglycoldiacetat, Dimethylsulfoxid, Dimethylacetamid, Dimethylformamid und Propylencarbonat.
Zu Lösemitteln, die verwendet werden können, gehören Lösemittel oder Lösemittelmischungen einschließlich chlorierter organischer Lösemittel wie Chloroform, Methylenchlorid, Dichlorethan, Trichlorethan, Tetrachlorethan und Dichloracetat. Zum Beispiel kann Kohlenwasserstoff-stabilisiertes Chloroform verwendet werden. Zu weiteren Lösemitteln, die zur Extraktion von PHAs aus mikrobiellen Quellen eingesetzt wurden und die verwendet werden können, gehören Alkylcarbonate, wie Propylencarbonat und Ethylencarbonat, Trifluorethanol, Essigsäureanhydrid, Dimethylformamid, Ethylacetoacetat, Triolein, Toluol, Dioxan, Tetrahydrofuran, Diethylether, Pyridin, Hydroxysäuren und Alkohole mit mehr als 3 Kohlenstoffatomen sowie Mischungen davon.
Die Rückgewinnung des Lösemittels kann mittels Verfahren durchgeführt werden, die Fachleuten auf diesem Gebiet gut bekannt sind, und zu denen eine Destillation oder eine Extraktion in ein zweites Lösemittel oder eine Lösemittelmischung, die nicht mit Wasser mischbar ist, und die anschließende Trennung durch Destillation gehören.
Gewinnung des PHA aus dem Eluat oder Filtrat
Sobald das Polymer im Filtrat oder Eluat erscheint ist es erforderlich, das Polymer aus dem Lösemittel zu gewinnen und auch das Lösemittel wiederzugewinnen. Die erforderlichen Techniken sind in diesem Gebiet ebenfalls gut bekannt, und zu ihnen gehören ein Lösemittelstripping oder eine Lösemittelverdampfung, ein Dampfstripping oder eine Lösemittelfällung mit einem Nicht-Lösemittel.
Die hier beschriebenen Zusammensetzungen und Verfahren werden durch die Bezugnahme auf die folgenden nicht-einschränkenden Beispiele noch besser verstanden werden.
Beispiel 1: Typische Produktion von PHA-haltiger mikrobieller Biomasse
Bakterien der Species Pseudomonas wurden zur Erzeugung von PHA wie folgt fermentiert. Octansäure (Prifrac 2901) wurde von Unichema International, Chicago, Illinois, bezogen. Alle anderen Chemikalien waren von analytischer Reinheit. Das Medium A enthielt entionisiertes Wasser plus die folgenden Zutaten (pro L Endvolumen): Octansäure (2,16 g), NaNH₄HPO₄ (3,8 g), K₂HPO₄ (5,7 g), KH₂PO₄ (3,7 g), MgSO₄ (0,12 g), CaCl₂ (20 mg), FeSO₄·7H₂O (40 mg), MnSO₄·H₂O (10 mg), CoCl₂·6H₂O (4,5 mg). ZnSO₄·7H₂O (2 mg), Na₂MoO₄·2H₂O (2 mg), CuCl₂·2 H₂O (1 mg), Al₂(SO₄)₃·16H₂O (1,3 mg), H₃BO₄ (465 μg), NiSO₄·6H₂O (180 μg) und Maisquellwasser (Sigma, 0,5 mL). Alle Komponenten mit Ausnahme der Octansäure wurden durch Erhitzen (121,5°C) oder Filtrieren sterilisiert und steril in das Gefäß transferiert. Der pH wurde auf 6,7 eingestellt und während aller Fermentierungsschritte bei diesem Wert (±0,1 pH-Einheiten) gehalten. Die Kontrolle des pH erfolgte mittels 30%igem (Gew./Gew.) wässrigem Ammoniak und 85%iger (Gew./Gew.) Phosphorsäure, die nach Bedarf über eine automatische pH-Steuereinheit zugegeben wurden. Antischaummittel (Breox FMT30, bezogen von Inspec Group, Southampton, GB) wurde nach Bedarf während der Fermentierungen zugegeben.
Die Kultur wurde wie unten beschrieben mit definierten Mediumdosen unter metabolischer ([DO]) Kontrolle gefüttert. Jede definierte Mediumdosis bestand aus drei Subdosen, die gleichzeitig durch separate Zugabeöffnungen zu der Kultur gegeben wurden. Die Subdosis Nr. 1 bestand aus Octansäure (1,46 g pro L Ausgangskulturvolumen), die Subdosis Nr. 2 bestand aus 30%igem (Gew./Gew.) wässrigem Ammoniak (0,36 g pro L Ausgangskulturvolumen), und die Subdosis Nr. 3 bestand aus 0,3 M MgSO₄) (0,4 mL pro L Ausgangskulturvolumen). Die Zeit, die für die Zugabe einer einzelnen definierten Mediumdosis in den Fermenter benötigt wurde, lag bei ungefähr zwei Minuten. Jede definierte Mediumdosis stellte ausreichend Nährstoff zur Erzeugung von ungefähr 1,3 g Gesamtfeststoff pro L bereit.
Pseudomonas putida wurde als gefrorene Kultur gelagert und auf Platten mit 1,5%igem Agar (Medium A) vermehrt. Die gefrorenen Kulturen wurden aufgetaut, ausplattiert und 48 Stunden bei 30°C gezüchtet. Einzelne Kolonien wurden dann erneut ausplattiert und 24 Stunden bei 30°C gezüchtet. Einzelne Kolonien wurden dann ausgewählt und in Flüssigmedium A (1 L) transferiert und in einem Schüttler 24 Stunden bei 30°C gezüchtet. Diese Startkultur wurde dann in einen 150-L-Fermenter transferiert, der das definierte Medium A (60 L) von 30°C enthielt. Der Fermenter war mit einer einzelnen [DO]-Sonde und einer einzelnen pH-Sonde ausgerüstet. Die Kultur wurde bei 30°C unter Rühren (Rührgeschwindigkeit 150–600 Upm) und Begasung mit Umgebungsluft (60 L/min) mit einem Druck von 3 psi (20,7 MPa) im Gasraum fermentiert. Die Rührgeschwindigkeit wurde während der Fermentation immer mehr erhöht. Die Konzentration des gelösten Sauerstoffs wurde kontinuierlich registriert, und eine definierte Dosis an Medium wurde als Reaktion auf jede anhaltende (> 10 s), signifikante (Anstieg der Sättigung um > 10% über die aktuelle Basislinie) Zunahme des gemessenen DO-Wertes zugegeben. Während der ersten 8–9 Stunden der Fermentation nahm der DO-Wert stetig von 100% auf ca. 0% Sättigung ab. Danach blieb der DO-Wert bei einer Basislinie von ca. 0% Sättigung. Die Rührgeschwindigkeit und die Begasungsgeschwindigkeit wurden in diesen Bereichen so gesteuert, dass versucht wurde, einen DO-Wert = 1% Sättigung aufrecht zu erhalten. Anhaltende Zunahmen des DO-Wertes auf über 10% Sättigung wurden als die Folge einer Erschöpfung der Kohlenstoffquelle angesehen und lösten die automatische Zugabe einer definierten Mediumdosis aus. Die Zugabe jeder Dosis führte zu einer Abnahme des DO-Wertes zurück auf die Basislinie. Ein Feedback-Mechanismus verhinderte jedoch multiple Zugaben definierter Mediumdosen in dem Falle, in dem der DO-Wert nur langsam auf unter 10% Sättigung zurückkehrte. Insgesamt wurden 24 definierte Mediumdosen innerhalb der 21-stündigen Fermentation zugegeben.
Sofort nach dem Abschluss der obigen Fermentation wurde die Kultur steril in einen 1500-L-Fermenter transferiert, der 640 L des definierten Mediums A enthielt. Der Fermenter war mit einer einzelnen [DO]-Sonde und einer einzelnen pH-Sonde sowie mit einem massenspektrometrischen Analysator des Abgases ausgerüstet. Die Fermentation wurde unter Bedingungen durchgeführt, die den oben beschriebenen ähnlich waren, mit einer Temperatur von 30°C, unter Rühren (Rührgeschwindigkeit 60–210 Upm) und einer Begasung mit Umgebungsluft (600–950 L/min) bei einem Druck im Gasraum von 3 psi (20,7 MPa). Nach der Inokulation fiel der DO-Wert schnell (innerhalb von 3 Stunden) auf fast 0% Sättigung ab.
Die Rühr- und Begasungsgeschwindigkeit wurden so innerhalb der zuvor erwähnten Bereiche gehalten, dass versucht wurde, einen DO-Wert = 1% Sättigung aufrecht zu erhalten. Die Fermentation wurde 41 Stunden fortgesetzt.
Die letztlich erhaltene Kultur bestand aus 750 L, die 116,7 g/L an trockenen Feststoffen enthielt, von denen 66,3% PHA waren. Das PHA hatte die folgende Monomerzusammensetzung: R-3-Hydroxyhexansäure (10%), R-3-Hydroxyoctansäure (88%), R-3-Hydroxydecansäure (2%). Das isolierte Polymer hatte folgende Eigenschaften: M_w = 115 000, M_n = 70 000 (GPC in CHCl₃), T_m = 50°C und T_g = –38°C.
Beispiel 2: Gewinnung von PHA aus mikrobieller Biomasse
Eine Zellaufschlämmung, die Polyhydroxyalkanoat (PHA) enthielt, wurde zur Gewinnung eines gereinigten Polymers wie folgt verarbeitet. Zellen von Pseudomonas-sp.-Bakterien wurden wie im Beispiel 1 beschrieben auf einer kommerziellen Mischung fermentiert, die in erster Linie Octan- und Decansäuren (C810-Fettsäure, Procter & Gamble, Zusammensetzung 56% C8, 39% C10, Rest andere Fettsäuren) umfasste. Die Ausgangsaufschlämmung (5 L), die angenähert 13% (Gew./Gew.) an suspendierten Feststoffen umfasste, wurde 20 min bei 4000 g zentrifugiert. Die Pelletfraktion wurde so in entionisiertem Wasser resuspendiert, dass wieder das Ausgangsvolumen erhalten wurde, und dann wurde erneut unter identischen Bedingungen zentrifugiert. Die Pelletfraktion wurde dann so in Aceton resuspendiert, dass wieder das Ausgangsvolumen erhalten wurde. Diese Aufschlämmung, die zelluläres Material, Wasser und Aceton (gesamte Feststoffe = 12,8% (Gew./Gew.)) umfasste, wurde dann mittels der unten beschriebenen experimentellen Apparatur verarbeitet.
Die experimentelle Mikrofiltrationsapparatur umfasste eine explosionsgeschützte Pumpe mit exzentrischer Schraube (Allweiler) mit variabler Geschwindigkeit, die einen Fluss von wenigstens 15 L/min gegen einen Druck von 0,6 MPa im Gasraum zuwege brachte, einen Rohrkreislauf aus rostfreiem Stahl und Polypropylen und ein Gehäuse, das ein röhrenförmiges Mikrofiltrationselement aus Aluminiumoxidkeramik (US-Filter Membralox 1T1-70, nominale Ausschlussgröße 0,5 μm, Membranfläche 0,0055 m²). Außerdem war die Apparatur mit Manometern, Temperatursonden, einem Kugelventil für die Druckregulierung und einem 20-L-Tank mit Deckel für die Aufschlämmung ausgerüstet. Der Flüssigkeitsspiegel im Tank mit der Aufschlämmung wurde über die kontinuierliche Zugabe von Aceton über eine einstellbare Förderpumpe angenähert konstant gehalten. Während des Betriebs wurde die Aufschlämmung kontinuierlich durch die röhrenförmige keramische Membran mit einer Querströmumg von angenähert 15 L/min und einem durchschnittlichen Transmembrandruck von 0,3–0,6 MPa zirkuliert. Die Transmembran-Flussgeschwindigkeit lag im Bereich von 8–30 mL/min (90–330 L/m²/Stunde). Die Systemtemperatur wurde mittels eines am Pumpenkopf installierten Glycol/Wasser-Kühlmantels bei 20–32°C gehalten. Als Folge der kontinuierlichen Entnahme von Permeat und der kontinuierlichen Zugabe von reinem Aceton stieg die Acetonkonzentration in der Aufschlämmung während des Betriebs dauernd an.
Das aceton- und wasserhaltige Permeat wurde in mehreren aufeinanderfolgenden Fraktionen gesammelt. Wenn das Verhältnis von Aceton zu Wasser in der Aufschlämmung einen kritischen Wert von angenähert 9:1 (Gew./Gew.) überschritt, wurde das PHA-Copolymer löslich und trat durch die Keramikmembran. Die Konzentration des Polymers im Permeat wies einen Maximalwert von 5,8% (Gew./Gew.) auf. Das Permeat wurde gesammelt, bis die Konzentration der Feststoffe bei < 0,1% (Gew./Gew.) lag. Die PHA-haltigen Fraktionen wurden vereinigt (14 L), und das Polymer wurde durch die Zugabe von 10% (Vol./Vol.) entionisiertem Wasser ausgefällt. Das Filterkonzentrat umfasste Aceton, Wasser und praktisch PHA-freie Zelltrümmer.

Claims

Verfahren zur Isolierung und Reinigung von Polyhydroxyalkanoaten (PHAs), die aus einer PHA umfassenden Biomasse stammen, wobei das Verfahren umfasst das Extrahieren von PHA aus der Biomasse unter Einsatz wenigstens eines Lösemittels, wobei die Biomasse gleichzeitig einem Filtrationsprozess unterzogen wird, um das so extrahierte PHA von Zellen in der Biomasse abzutrennen.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Filtrationsprozess eine Diafiltration umfasst.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei der Diafiltrationsprozess bei konstantem Aufschlämmungsvolumen durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Biomasse einem Konzentrationsgradienten des Lösemittels ausgesetzt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Biomasse aus einer mikrobiellen Quelle stammt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Biomasse von einer Pflanze oder Teilen einer Pflanze stammt.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei die Pflanze eine Ölsaatpflanze ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Biomasse als eine wässrige Aufschlämmung bereit gestellt wird und das Lösemittel ein organisches Lösemittel ist.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei das organische Lösemittel Aceton ist.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei die wässrige Aufschlämmung und das organische Lösemittel eine Lösemittel-Wasser-Mischung bilden und das Verfahren ferner das allmähliche Erhöhen der Konzentration des organischen Lösemittels in der Lösemittel-Wasser-Mischung umfasst.
Verfahren nach Anspruch 10, das in einer Diafiltrationseinheit durchgeführt wird, die eine Filtermembran umfasst, wobei die Konzentration des organischen Lösemittels erhöht wird, um zu bewirken, dass sich die Verunreinigungen in der Biomasse, die wasserunlöslich sind, in der Lösemittel-Wasser-Mischung lösen und durch die Filtermembran treten.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei die Konzentration des organischen Lösemittels erhöht wird, um zu bewirken, dass sich das PHA in der Lösemittel-Wasser-Mischung löst und unter Bildung eines PHA-Filtrats durch die Filtermembran tritt.
Verfahren nach Anspruch 12, das ferner das Entfernen des Lösemittels aus dem PHA-Filtrat zur Gewinnung des PHA umfasst.