KR101130191B1 - 세포 바이오매스로부터 폴리하이드록시알카노에이트(˝ｐｈａｓ˝) 를 회수하는 방법 - Google Patents

세포 바이오매스로부터 폴리하이드록시알카노에이트(˝ｐｈａｓ˝) 를 회수하는 방법 Download PDF

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Abstract

박테리아의 세포 바이오매스로부터 폴리하이드록시알카노에이트 (PHA)를 회수하는 방법으로서, 상기 바이오매스는 발효에 의해, 수성 현탁액 중 세포 바이오매스 슬러리의 형태로 얻어지는 것이고, 하기 단계를 포함하는 방법: 슬러리를 PHA 용매의 주입, 교반 및 가열 조작으로 처리하여, PHA가 용해된 PHA 용매, 물 및 불용성 잔류물를 포함하는 현탁액을 형성시키는 단계; PHA가 농후한 용매를 회수하는 단계; PHA 용매의 용액을 급속히 냉각시켜, 용해된 PHA를 침전시키는 단계; 용매 중에 침전된 PHA의 현탁액을 미세여과하여, 침전된 PHA가 농축된 페이스트를 분리하는 단계; 농축된 PHA 페이스트를 물로 세척하고, 가열 및 교반 하여, 용매 증발을 촉진하고 PHA 과립을 함유하는 현탁액을 수득하는 단계; PHA 과립을 교반 및 전단하고, 잔류 용매를 고갈시키는 단계; 및 현탁액으로부터 정제된 PHA 입자를 분리하는 단계.
폴리하이드록시알카노에이트, 바이오매스, 발효, 현탁액, 퓨젤유

Description

세포 바이오매스로부터 폴리하이드록시알카노에이트 (˝ＰＨＡＳ˝) 를 회수하는 방법{PROCESS FOR RECOVERING POLYHYDROXIALKANOATES (˝ＰＨＡＳ˝) FROM CELLULAR BIOMASS}
본 발명은, 환경에 공격적이지 않은 비-할로겐화 용매를 채택함으로써, 박테리아의 습한 바이오매스(biomass)로부터 폴리하이드록시알카노에이트(PHA)를 추출 및 회수하는, 공업적으로 실행가능한 것으로 이미 인정받은 방법으로서, 일반적으로 사탕수수를 사용하는 설탕 및 알코올 산업에서 유래하는 재생가능한 원료 및 에너지 공급원을 이용함으로써, 고순도 및 고 분자량의 폴리하이드록시알카노에이트 (PHA)를 수득하게 하는 방법에 관한 것이다.
환경에 공격적이지 않은 공정을 통해, 재생가능한 원료 및 에너지 공급원을 사용하여 생분해성 및 생체적합성 재료를 생산할 필요성에 대해서는, 현재 범세계적으로 산업분야에 잘 알려져 있다.
현대 사회에서는, 플라스틱 재료의 대규모 사용은 기술 개발의 역사에 한 획을 그었지만, 이러한 재료의 활용 증가는 각종 심각한 환경문제를 야기하고 있다. 석유화학 유래의 플라스틱 수지 산업의 경우, 연간 생산량은 약 2억 톤에 이른다. 이들 재료는 자연적 분해에 대한 내성이 매우 강해서, 주로 대도시 중심 부근에 위 치한 폐기 구역에 급속히 축적되고 있다. 이러한 문제점으로 인해, 생분해성 플라스틱 수지의 개발은 세계적 관심을 끌었고, 주로 재생가능한 공급원을 사용하는 청정기술 (clean technology)에 의해 생산된 것들이 관심을 끌었다. 이러한 사실들의 연관성을 고려할 때, 이들 신소재 사용에 대한 시장 잠재성은 막대하다. 이들 생분해성 생체고분자의 응용분야에 있어서는, 일회용 재료, 예를 들면 포장재, 화장품 및 독성 농약 용기, 의약품 등과 같은 제품이 시장에서 더 큰 성공의 기회를 제공한다.
생분해성 생체고분자의 한 주요 부류는 폴리하이드록시알카노에이트 (PHA)로서, 다수의 생물체에 의해 천연 합성되는 폴리에스터이다. 문헌에 기재된 대표 종만도 170 가지가 넘으므로, PHA에 대한 상업적 관심은 생분해성뿐만 아니라 이들의 열적-기계적 특성 및 생산 비용에도 직접적으로 관련되어 있다. 따라서, 일부의 PHA 만이 공업적 적용이 가능한데, 가장 대표적인 종은 PHB (폴리-3-하이드록시뷰티레이트), PHB-V (폴리(하이드록시뷰티레이트-코-하이드록시발레레이트)), P4HB (폴리(4-하이드록시뷰티레이트)), P3HB4HB (폴리(3-하이드록시뷰티레이트-코-4-하이드록시뷰티레이트)) 및 일부 PHAmcl (중간 사슬의 폴리하이드록시알카노에이트)이며, 상기 마지막 부류의 전형적인 대표 종은 PHHx (폴리하이드록시헥사노에이트)이다.
PHA의 화학 구조는 하기 단위의 반복에 의해 형성된 중합체 사슬로 설명될 수 있는데:
Figure 112006043259519-pct00001
[식 중, R은 다양한 길이의 알킬 또는 알케닐기이고, m 및 n은 정수이다], 상기 언급한 중합체에서는 R 및 m이 하기 값을 갖는 것으로 추정된다:
PHB: R = CH3, m = 1
PHB-V: R = CH3 또는 CH3-CH2-, m = 1
P4HB: R = H, m = 2
P3HB-4HB: R = H 또는 CH3, m = 1 또는 2
PHHx: R = CH3-CH2-CH2-, m = 1
대부분의 PHA는 통상적인 압출 및 사출 장비로, 좋은 가공을 위해 상당한 변형을 필요로 하지 않고도 가공할 수 있다. 또한, 이들 고분자는 예를 들면 식품 산업용 포장 재료로서 사용되도록 주형 및 코팅 필름 시스템으로 가공할 수도 있다.
이들 고분자의 개발 단계의 함수로서, 단기 사용의 개인 위생 제품용 포장재를 경량으로 생산하는 데에도 사용할 수 있다. 상기 고분자는 또한 농약, 엔진 오일, 일회용 기저귀 등의 용기 및 포장재를 제작하는 데에도 사용할 수 있다. 더욱이, 생분해성의 고유 특성이 필요한 분야, 예컨대: 쓰레기 봉투, 골프 티 (golf tee), 낚시용품, 및 기타 야외에서 플라스틱 재료를 취급하는 데 직접적으로 관련 된 제품에, 잘 정의된 기술적 및 상업적 견지에 따라 PHA를 적용할 수 있다.
농업 분야에서는, PHA는 화분, 재조림용 튜브 (reforestation tubes), 온실 및 덮개용 필름에 적용될 수 있으며, 주로 방출 제어 시스템 영양소, 거름, 제초제 및 살충제에 적용될 수 있다.
생체의료 분야에서는, PHA는 이들의 완전한 생체적합성으로 인해, 그리고 이물질의 존재에 대한 수용 생물체의 반응이 적기 때문에, 방출 제어용 약물의 마이크로캡슐화, 의료용 봉합사 및 골절용 고정 핀에 사용될 수 있다. 또한, 생체 내 생분해 속도가 매우 느리긴 하나 연속적이고 완전하기 때문에, PHA는 재흡수 가능한 인공보철용 기초 구조물로서 적용하는 데 대해 뛰어난 잠재성을 나타낸다.
지난 20년간의 자연 과학, 특히 바이오테크놀러지에서의 위대한 발전은 PHA의 상업적 제조에서 가장 다양한 천연의 또는 유전자 변형된 생물체를 사용할 수 있게 했다. 본 발명과 특히 연관이 있는 것은, 상당한 양의 상기 고분자를 내부에서 생산하고 축적할 수 있는 일정 박테리아 균주를 사용하는 것이다. 높은 세포 밀도, 높은 세포 내 고분자 함량, 및 산업 공정에 적합한 수율에 달하게 하는 특정 조건 하에서 배양된 상기 박테리아 균주는, 다양한 재생가능한 원료, 예컨대 사탕수수, 당밀 또는 가수분해된 셀룰로오스 추출물을 이용할 수 있다.
미국특허 제 3107172 호에 개시된 바와 같이, (PHA 가용화제를 사용하지 않고) 자연 상태의 박테리아 세포를 형성가능한 재료로서 적용하기 위한 노력이 있었으나, 대부분의 경우 PHA의 상업적 응용분야는 목적하는 플라스틱 특성을 얻기에 충분히 높은 순도를 요구한다. 생체고분자. 특히 PHA를 가공하는 데 적합한 순도 수준에 도달하기 위해서는, 보통 잔류 바이오매스로부터 PHA의 추출 및 회수를 위한 용매의 이용이 불가피한 단계가 필요하다.
유럽특허 EPA-01455233 A2 호에는, PHA를 함유하는 세포의 수성 현탁액의 소화를, 비-PHA 세포 물질을 가용화하기 위해 효소 및/또는 계면활성제를 사용하여 실시하는 데 대한 몇 가지 가능성이 기재되어 있다. 상기 특허에는, 용매를 사용하는 공정에 있어 가능한 제한 요소로서, 상기 공정이 대량의 용매를 필요로 하고, 따라서 생산 비용이 높다는 사실이 언급되어 있다. 그럼에도 불구하고 고순도 생성물을 원할 경우, 상기 용매 단계는 제거되지 않는다고 언급되어 있다. 더욱이, 상기 공정에 사용되는 효소가 비교적 적은 양 (건조 세포 물질에 대해 1%)으로 첨가되더라도, 상기 효소는 매우 비싸고, 용매가 사용되는 경우와는 반대로 공정 중에 회수될 수 없다. 또한, 세포 물질을 고도로 희석시킬 필요가 있는데, 이는 공정 중에 다량의 용출액을 발생시킨다.
통상 제시되는 추출 공정은 기본적으로, 생체고분자를 함유하는 건조 또는 습한 세포 바이오매스를, 상기 고분자를 가용화시키는 용매와 격렬한 접촉에 노출시킨 후, 세포 잔류물을 분리하는 단계로 이루어진다. 그 후, 상기 생체고분자를 함유하는 용액에는 불용화제가 첨가되는데, 이는 용매 중의 생체고분자의 침전을 유발하는 것이다 (예를 들면, 1991년 7월 16일에 출원되고 1993년 2월 24일에 공개된 브라질 특허 PI 9103116-8 호를 참조).
박테리아 바이오매스로부터의 PHA의 추출 및 회수에 대한 문헌에서 종종 언급되는 유기 용매를 통한 추출 공정에서는, 이용되는 용매가 부분적으로 할로겐화 된 탄화수소로서, 예컨대 클로로폼 (특허 US-3275610 호), 메틸렌-에탄올 클로라이드 (US-3044942 호), 비등점이 65 내지 170℃ 범위 내인 클로로에테인 및 클로로프로페인, 1,2-다이클로로에테인 및 1,2,3-트라이클로로프로페인 (특허 EP-0014490 B1 호 및 EP 2446859 호)이다.
다이클로로메테인, 다이클로로에테인 및 다이클로로프로페인과 같은 기타 할로겐화 화합물은 미국 특허 제 4,562,245 호 (1985), 제 4,310,684 호 (1982), 제 4,705,604 호 (1987) 및 유럽특허 제 036.699 호 (1981) 및 독일특허 제 239.609 호 (1986)에 언급되어 있다.
할로겐화 용매를 이용하는, 바이오매스로부터의 생체고분자의 추출 및 정제 공정은, 환경 및 인체 건강에 매우 공격적이기 때문에 지금은 완전히 금지되어 있다. 따라서 세포 바이오매스로부터의 생체고분자의 잠재적 추출제로서 사용될 용매는 먼저 환경에 공격적이지 않아야 한다는 조건을 만족시켜야 한다.
이러한 관점에서, 브라질 특허 PI 9302312-0 호 (1993년에 출원되고 2002년 4월 30일에 허여됨)는 박테리아 바이오매스로부터 생체고분자를 추출하는 방법으로서, 탄소수 3의 장쇄 알코올 또는 이로부터 유도된 아세테이트를 용매로서 채택하는 방법을 제시한다. 상기 특허에서는 아이소아밀 알코올 (3-메틸-1-뷰탄올), 아밀 아세테이트 (또는 아밀-아세트산 에스터), 및 알코올 발효의 부산물로서 얻어지는 고급 알코올의 혼합물로서 아이소아밀 알코올을 주성분으로 하는 퓨젤유 (fusel oil)가 선호된다. 상기 특허는 또한, 불용화제 또는 반 용매 (counter-solvent) 및/또는 한계적 비 용매 (marginal non-solvent)의 이용을 필요로 하지 않고, 단일 용매를 추출제 (extractor) 및 정제제 (purifier)로서 사용하는 것을 특징으로 한다. PHA 용액의 용질 (생체고분자)의 침전은 용액의 냉각을 통해 수행된다.
미국특허 제 6,043,063 호 (1998년 4월 14일에 출원되고 2000년 3월 28일에 허여됨), US 6,087,471 호 (1998년 4월 14일에 출원되고 2000년 6월 11일에 허여됨), 및 국제특허출원 WO-98/46783 호 (1997년 4월 15일에 출원됨)에는 바이오매스로부터 생체고분자를 추출하는 데 용매로서 잠재적으로 사용될 수 있는 비-할로겐화 용매의 방대한 목록이 개시되고 있으나, 이들 중 다수는 높은 비용 외에도 까다로운 공업적 취급, 독성과 같은 특징을 나타낸다. 상기 방대한 목록에는 브라질 특허 PI 9302312-0 호에 언급된 용매도 포함되는데, 생체고분자와의 비적합성으로 인해, 또는 독성, 폭발성 및 높은 비용으로 인해, 적은 수의 용매만이 식물성 또는 박테리아 바이오매스로부터 생체고분자를 추출하는 데 공업적으로 사용될만한 잠재성을 갖는다. 또한, 1996년 8월 16일에 출원되고 1999년 7월 6일에 공개된 브라질 특허 PI 96102256 호는 보다 더 선택적인데, 이는 식물성 또는 박테리아 바이오매스로부터 생체고분자를 추출하는 데 유용한 가능한 용매로서, 그 중 특히 광유 및 식물성유, (초임계 및 고가의 추출 기술을 요하는) 탄산가스 외에도, 인체 건강에 매우 유해한 화합물들이 포함되어 있기 때문이다. 동시에, 상기 특허는 보건 및 환경에 잠재적으로 유해한 용매를 피해야 할 필요성을 고려한다.
생체고분자는 열 민감성이므로, 다시 말하면 일정치 초과의 온도에 처하면, 비가역적으로 분해되고 분자량이 감소 되어, 상기 고분자를 열가소성으로 특징짓는 특성이 확실히 영향을 받게 되므로, 공업적으로 사용될만한 잠재성을 갖는 용매의 목록은 보다 더 제한적이 됨을 반드시 염두에 두어야 한다.
생체고분자의 추출을 촉진하기 위해 선택한 용매의 공업적 이용에 대한 잠재성은, 생체고분자의 분자량에 상당한 변화를 유발하지 않으면서도 추출을 가능하게 하는 적합한 방법이 수반될 때 더욱 증가 될 것이다. 놀랍게도, 생체고분자를 가용화하기 위해 약 70℃ 초과로 가열할 필요가 있는 용매의 경우, 상기 생체고분자가 공정 중 상기 온도에 더 오래 노출될수록 더 많이 분해되는데, 이 사실은 상기 고분자의 열가소성 특성을 돌이킬 수 없이 손상시킬 수 있다. PHA가 추출 공정 중에 변형을 덜 받을수록, 이의 가능한 상업적 용도의 범위는 더 넓어질 것이다.
문헌에 교시되어 있듯이, 생체고분자, 특히 PHA의 분해 동역학은 0차 반응을 따른다 (예를 들면, Berger, E.의 석사학위논문: 'Elaboration des techniques de separation pour des biopolymeres d'origine bacterienne: les acides poly-β-hydroxyalcanoiques', Departement de Genie Chimique-Ecole Polytechnique - Universite de Montreal, Canada, 1990년, 72-75면 참조). 생체고분자가 온도 T 에 노출되는 시간에 대한 분자량 분해율의 비를 dMW/dt 로 고려하면, 상기 분해율을 정의하는 일반식은:
[일반식 1]
(dMW/dt)T = k
[식 중, k 는 주어진 온도 T 에서의 주어진 용매에 대한 상수이다]이다.
따라서 일반식 1 을 시간 간격 0 내지 t 에 대해 적분하면, 하기를 얻는다:
[일반식 2]
MWT = k.t + MWo
[식 중, MWT 는 용매 S 중, 주어진 온도 T 에 대해 추출 시간 t 가 경과한 후의 생체고분자의 분자량이고;
MWo 는 추출 처리하기 전의 시간 t = 0 에서, 바이오매스에 함유된 생체고분자의 분자량이고;
K 는 주어진 온도 T 및 용매 S 에 대한 비례상수이다].
일례로서, PHB를 70% 함유하는, 건조 알칼리제네스 유트로푸스 (Alcaligenes eutrophus)의 바이오매스 20 g을 110℃에서 1500 g의 아이소아밀 알코올 (공업용 등급)과 혼합하고, 바이오매스로부터 불용성 입자를 제거하기 위해 상기 혼합물을 다양한 시간 동안 노출 및 여과 처리한다. 이어서, 수득한 PHB 용액을 30℃로 급속히 냉각시켜 PHB를 확실히 침전시킨 후, 이를 용매가 완전히 고갈될 때까지 실온에서 공기 기류 하에 여과 및 건조시킨다. 이어서, PHB를 GPC 기법 (겔 투과 크로마토그래피)으로 분자량을 측정하여, 선형 회귀 분석을 통한 수학적 조정 후에 하기의 분해식을 얻는다:
[일반식 3]
MWT = -9753.81.t + 1,000,000, R2 = 0.98
[식 중, MWT 는 110℃에서 아이소아밀 알코올로 추출한 후의 폴리하이드록시뷰티레이트의 분자량으로서, 달톤으로 나타내고;
T 는 아이소아밀 알코올 중 110℃의 추출 온도에 폴리하이드록시뷰티레이트를 노출시킨 시간으로서, 분으로 나타내며;
R 은 실험 치와 조정 식과의 상관계수이다].
따라서 일반식 3으로부터 보면, 원래 분자량이 1,000,000 Da인 폴리하이드록시뷰티레이트를 110℃에서 아이소아밀 알코올로 추출 처리하면, 5 분의 시간 동안 분자량이 951,230 Da; 15 분의 노출 시간 동안 853,692 Da; 30 분의 노출 시간 동안 707,410 Da; 60 분 동안 414,771 Da; 그리고 90 분 동안 122,230 Da이 될 것이다.
기계적 특성이 양호한 순수한 생성물을 수득하기 위해서는 추출 외에도 용매의 증발 및 건조와 같은 기타 조작이 필요하고, 이들 조작은 생체고분자로 하여금 재료에 관해 위험한 상황에 여러 번 노출되게 한다는 점을 고려할 때, 이러한 종류의 재료를 가공하는 데 따르는 고유한 어려움에 대해 상상하기란 어렵지 않다. 용매 외에도, 생성물을 열적으로 분해시키지 않는 적합한 방법이 요구된다.
따라서 예시적인 목적에서, 미국특허 제 6,043,063 호에 언급된 용매 및 이들 각각의 PHA 추출 온도 (괄호 안의 섭씨 온도)를 하기 목록에 나타내었다: 에틸 뷰티레이트 (120℃), 프로필 프로피오네이트 (118℃), 뷰틸 아세테이트 (120℃), 뷰틸 프로피오네이트 (123℃), 테트라하이드로퍼퓨릴 아세테이트 (121℃), 메틸 프로피오네이트 (75℃), 노르말-메틸 발레레이트 (115℃), 1-뷰탄올 (116℃), 2-메틸-1-뷰탄올 (117℃), 3-메틸-1-뷰탄올 (125℃ 및 126℃), 1-펜탄올 (125℃ 및 126℃), 3-펜탄올 (115℃), 아밀 알코올 (128℃), 1-헥산올 (134℃), 에틸렌 글라이콜 다이아세테이트 (137℃), 테트라하이드로퍼퓨릴 알코올 (117℃), 메틸-아밀-케톤 (120℃), 메틸-아이소뷰틸-케톤 (115℃), 아세토페논 (110℃), 1,2-다이아미노프로 페인 (115℃), 알파-메틸스타이렌 (126℃), 다이메틸 설폭사이드 (117℃), 프로필렌 카보네이트 (110℃), 1,2,3-트라이메틸-벤젠 (121℃), 다이메틸 아세타민 (90℃) 및 다이메틸 폼아마이드 (90℃). 이들 용매는, 생체고분자가 열적 분해에 조금만 노출되는 효과적인 공정이 수반될 경우에만, 공업적으로 사용될만한 잠재성을 가질 것이다. 그러나 수득 된 물질의 특성, 특히 생성물의 분자량에 대한 언급은 없다.
상기 방식의 PHA 추출의 공업적 실행가능성에 관한 기타 관련 사항으로는, 에너지 소비가 많은 방법이므로, 생성물의 이용가능성 또한 저렴하고 재생가능한 에너지 공급원과 밀접하게 관련이 있다는 점을 유념해야 한다는 것이다.
상기 언급한 모든 사항을 고려할 때, 일반적으로 PHA의 생분해성 및 지속성의 특성은, 석유화학 산업의 전통적 고분자에 비해 더 높은 가격을 정당화할 수 있음에도 불구하고, 시장이 이러한 가격을 소화해낼 가능성은 매우 제한적이다 (Braunegg G, Lefebvre G, Genser FK (1998) Polyhydroxyalkanoates, biopolyesters from renewable resources: Physiological and engineering aspects. J. Biotech., 65: 127-161).
이에 따라, PHA 생산을 위한 공업적 방법은: 생산 프로토콜이 단순하고 효율적인, 원료를 고분자를 전환 시키는 데 대해 높은 효율을 나타내는 미생물 균주; 낮은 비용 및 높은 수율의 원료; 생체고분자의 본래 특징을 최대한 보존하면서 고순도의 생성물을 고수율 및 고효율로, 환경에 공격적이지 않은 공정을 통해 수득할 수 있게 하는 고분자 추출 및 정제 절차를 고려해야 한다.
이러한 경제적 측면 외에도, 상기 고분자는 환경친화적인 생성물이므로, 전 공정이 적합해야 한다. 따라서, 어떤 생산 단계에서도 환경적으로 유해한 제품의 사용을 피해야 한다. 더욱이, 생산 공정을 이행하는 데 사용되는 에너지 공급원은 재생가능한 공급원으로부터 나와야 한다. 재생가능하지 않은 에너지 공급원만을 사용하면서, 환경에 대한 영향력이 낮은 플라스틱을 생산한다는 것은 이치에 맞지 않는다. 이러한 문제점에 대한 상당히 흥미로운 접근법은, 바이오플라스틱의 전 생산 연쇄 과정을 농업, 특히 설탕 및 알코올 산업에 접목시키는 것이다 (Nonato, R.V., Mantelatto, P.E., Rossell, C.E.V., "Integrated Production of Biodegradable Plastic (PHB), Sugar and Ethanol", Appl. Microbiol. Biotechnol. 57:1-5, 2001).
대체연료 생산에 있어 세계적으로 가장 큰 성공 사례 중 하나는 브라질의 설탕 및 알코올 산업으로서, 지구상에서 생산되는 알코올 및 설탕의 총생산량의 약 25%를 차지한다. PROALCOOL 브라질 프로그램의 초기에는 환경적으로 부정적인 이미지를 비추었지만, 이러한 종류의 산업은 실제로는 유지시켜야 할 기술의 일례이다. 생산 공정을 실행하는 데 필요한 모든 에너지는, 사탕수수 찌꺼기를 보일러에서 태워 열 및 전기 에너지를 생성함으로써, 현장에서 발생시킨다. 더욱이, 다른 연결된 공업 공정에서 사용할 수 있는 잉여량의 에너지가 생긴다.
알코올 발효의 부산물로서 얻어지는 설탕 및 당밀 및 천연 용매와 같은 저렴한 원료가 입수가능한 점과 더불어, 재생가능하고 저렴한 에너지는 설탕 및 알코올 산업을 바이오플라스틱 생산의 이상적인 거점이 되게 한다.
따라서 본 발명은, 사탕수수를 사용하는 설탕 및 알코올 산업으로부터 나오는 재생가능한 원료 및 에너지 공급원을 채택함으로써, 바람직하게는 습한 박테리아 바이오매스로부터, 환경에 공격적이지 않은 비-할로겐화 용매를 사용하여 폴리하이드록시알카노에이트 (PHA)를 회수하고, 고순도 및 고 분자량의 생성물을 생성하는 공업 공정을 가능하게 하는 데 필요한 상기 특징을 모두 포함한다.
발명의 개요
본 발명은, 발효를 통해, 그리고 수성 현탁액 중의 세포 바이오매스 슬러리로서 건조 세포물질 함량이 현탁액의 약 18 중량% 이상인 슬러리의 형태로 수득되는 박테리아 세포 바이오매스로부터 폴리하이드록시알키노에이트 (PHA)를 추출하고 회수하는, 이미 공업적으로 실행가능한 것으로 인정받은 방법에 관한 것이다. 본 발명을 실시하는 가능한 한 방식에서는, 발효된 배지 중의 현탁액 상태인 세포 바이오매스를 바이오매스 세포의 응집 및 농축 조작으로 처리함으로써, 농축된 세포 바이오매스를 수득한다.
상기 공정에 따르면, 농축된 세포 바이오매스는 초기에, 용해된 PHA가 농후한 PHA 용매, 세포 바이오매스의 슬러리로부터 잔존하는 물, 및 농축된 세포 바이오매스의 불용성 잔류물을 함유하는 현탁액을 형성하기 위해, PHA 용매 주입, 격렬한 교반, 및 반응기 내부에서의 신속한 가열의 동시적 (concomitant) 조작을 포함하는 PHA 추출 단계를 거친다.
반응기에서 형성된 현탁액은 이어서 세포 바이오매스의 잔존하는 불용성 잔류물로부터, 용해된 PHA가 농후한 용매를 회수하기 위한 분리 조작을 거친다.
이어서, PHA가 농후한 PHA 용매 용액은 용해된 PHA를 실질적으로 모두 침전시키기에 충분한 온도로 급속하게 냉각된다.
본 발명의 방법은 하기 단계를 추가로 포함한다:
- 침전된 PHA의 농축된 페이스트를 분리하기 위해, 물 및 거기에 용해된 불순물을 함유하는, PHA 용매 중에 침전된 PHA의 현탁액을 냉각 미세여과하는 단계;
- 다공도가 높고, 취성 (brittle)이며 용이하게 전단 될 수 있는 PHA 과립을 함유하는 현탁액을 수득하기에 적당한 일정량의 용매의 일부, 잔류 용매 및 물의 증발을 촉진시키기 위해, 상기 농축된 PHA 페이스트를, 물로 세척하고 가열하고 교반 하는 동시적 조작으로 처리하는 단계;
- 현탁액 중의 정제된 PHA 입자를 수득하기 위해, 잔류 용매 및 물을 함유하는 현탁액 중에 수증기를 주입하여 잔류 용매를 추출하면서, 세척하고 가열한 PHA 과립을 교반 및 전단 처리하여 신속하게 파쇄하는 단계; 및
- 상기 현탁액으로부터 정제된 PHA 입자를 분리하는 단계.
발견된 PHA 중, 공업적으로 이용가능하고 본 발명에서 사용되는 것들은: 폴리-3-하이드록시뷰티레이트 (PHB), 폴리(하이드록시뷰티레이트-코-하이드록시발레레이트) (PHBV), 및 이들 중합체 및 공중합체의 혼합물이다.
본 발명의 기재 중에 사용된 용어 정의의 목록은 다음과 같다:
- "알케닐"은 C1 내지 Cn 길이의 불포화 탄소사슬을 의미하는데, 여기서 n 은 2 내지 약 20으로 변하며, 상기 탄소사슬은 선형, 분지형 또는 고리형일 수 있고, 불포화는 단일불포화 (monounsaturated), 즉 탄소사슬에 이중 또는 삼중 결합이 하나 있는 것; 또는 다중불포화 (polyunsaturated), 즉 탄소사슬에 두 개 이상의 이중 결합, 또는 두 개 이상의 삼중 결합, 또는 하나 이상의 이중 결합 및 하나 이상의 삼중 결합이 있는 것일 수 있다.
- "알킬"은 C1 내지 Cn 길이의 포화 탄소사슬을 의미하는데, 여기서 n 은 2 내지 약 20으로 변하며, 상기 탄소사슬은 선형, 분지형 또는 고리형일 수 있다.
- "세포 바이오매스"는, PHA 생산자 또는 고급 PHA 생산자가 되게끔 PHA를 천연적으로 또는 유전자 변형에 의해 생산할 수 있는, 임의의 미생물 또는 식물로부터 유래하는 바이오매스를 의미한다.
- "포함한다 (comprises)" 또는 "포함하는 (to comprise)"은, 최종 결과에 영향을 미치지 않는 기타 공정 또는 기타 단계, 또는 기타 화합물, 또는 기타 성분이 첨가되거나 존재할 수 있음을 의미한다. 상기 용어는 또한 용어: "~으로 구성된 (constituted of)", "~에 의해 구성된 (constituted by)", "본질적으로 ~으로 구성된 (constituted essentially of)" 및 "본질적으로 ~에 의해 구성된 (constituted essentially by)"으로 대체되거나, 이들을 대체할 수도 있다.
- "Da" 는 고분자의 분자량을 측정하는 단위인 달톤 (Dalton)을 의미한다.
- "바이오매스로부터 폴리하이드록시알카노에이트를 추출하기" 또는 "바이오매스로부터 폴리하이드록시알카노에이트의 추출"은, 단일 종류의 PHA를 생산하는 바이오매스에 의해 생산된 일정 PHA를 추출함 또는 그의 추출을 의미하며, 부가적으로는, PHA 생산 바이오매스가 한 종류 이상의 PHA를 생산하는 경우에 바이오매스에 의해 생산된 한 종류 이상의 PHA를 추출함 또는 그의 추출을 또한 의미한다.
- "조 추출물 (coarse extract)"은, 세포 매스로부터 추출한 물 및 불순물을 용해시켜 함유하는, PHA 세포 매스로부터 추출된 PHA가 농후한 PHA 용매, 및 PHA가 추출된 세포 바이오매스의 잔류물인 불용성 고체성분에 의해 구성된 현탁액을 의미한다.
- "폴리하이드록시알카노에이트" 및 "PHA"는 하기의 반복단위를 포함하는 중합체를 의미한다:
Figure 112006043259519-pct00002
[식 중, R 은 바람직하게는 H 또는 라디칼 알킬 또는 라디칼 알케닐이고, m 은 1 내지 4로 변한다].
- "실질적 대기압"은 대기압에 매우 근접한 압력, 즉 대기압과 동일하거나, 대기압보다 약간 높거나 낮은 압력을 의미한다.
- "추출 반응기"는 PHA 생산 세포 바이오매스로부터의 PHA 추출 조작이 실행되는 장비를 의미한다.
- 스트림 (용액 또는 현탁액)을 "급속하게 냉각"시킴은, 상기 스트림 (용액 또는 현탁액)을 팽창에 의해, 또 다른 냉각 스트림과의 열교환을 통해, 및/또는 열교환기에 의한 냉각에 의해 수 초 안에 냉각시키는 것을 의미한다.
- "용매"는, 용질이라 불리는 다른 물질을 용해시켜서, 분자 크기 또는 이온 크기 측면에서 용질이 용매 중에 균일하게 분산된, 용액이라 불리는 혼합물을 형성할 수 있는 물질을 의미한다.
- "PHA 용매"는 폴리하이드록시알카노에이트를 용해시킬 수 있는 물질을 의미한다.
- "농후한 (enriched) PHA 용매" 또는 "농후한 PHA 용매 용액"은 PHA 생산 세포 바이오매스로부터 추출한 PHA를 함유하는 PHA 용매 용액을 의미한다.
- "거의 없는" 또는 "실질적으로 없는"은 "매우 소량으로 있는", 또는 "미량으로 존재하는", 또는 "무의미한 양으로 있는", 또는 "거의 감지 불가능한 양으로 있는"을 의미한다.
본 발명은 사탕수수를 사용하는 설탕 및 알코올 산업에서 유래하는 재생가능한 원료 및 에너지 공급원을 채택함으로써, 환경에 공격적이지 않은 비-할로겐화 용매를 사용하고, 고순도 및 고 분자량의 폴리하이드록시알카노에이트 (PHA)를 수득하게 하는, 바람직하게는 미생물의 습한 바이오매스(물에 희석됨)로부터 폴리하이드록시알카노에이트 (PHA)를 추출 및 회수하는, 이미 공업적으로 실행가능한 것으로 인정받은 방법에 관한 것이다.
비교적 다수의 문헌에서 미생물 또는 식물성 바이오매스로부터 비-할로겐화 용매에 의한 PHA 추출에 대해 기재하고 있다. 그러나 상기한 교시를 상업적 규모로 적용하고자 하는 경우에는, 대부분 상업용 제품을 만들어내는 데 중요한 세포 내 생체고분자의 본래 특성이 보존된 생성물을 수득하는 데 많은 어려움이 있다. 상기 문헌의 대부분에서는, 고온에서의 생성물의 열 민감성에 별로 주목하지 않는 것을 볼 수 있다. PHA 추출에서 사용될 후보로서 고려된 대부분의 비-할로겐화 용매는 상기 용질에 대해 낮은 용해도를 나타내고, PHA 추출 및 회수를 위해 보통 70℃를 웃도는 고온을 필요로 한다. 상업적 규모에서 PHA 추출을 그런 용매로 처리하고자 하는 경우에는, PHA 회수에 필요한 시간이 보통 너무 길고, PHA를 비가역적인 방식으로 열적으로 열화시킨다. 이런 식으로 수득 된 생성물은 고온에 노출된 시간에 따라 매우 한정적인 수의 산업적 용도로 제한되거나 다른 종류의 용도로 제한된다.
본 발명은 공업적 규모로 실시될 방법으로서, 공정 단계가 하기를 가능하게 하는 방식으로 조합된 방법을 제공한다:
a) PHA의 본래 특성, 특히 그 분자량을 최대한 보존하기 위해, 세포 바이오매스로부터 추출된 대부분의 PHA가 고온에 노출되는 시간을 최소화하고, 비-할로겐화 용매를 사용하고, PHA의 분해를 최소화시킴;
b) 잔류 용매가 거의 존재하지 않고, 생산된 PHA의 특정한 추가적 탈색 및 정제 단계를 공정에 포함시킬 필요없이, 보통 99%를 초과하는 고순도의 생성물을 수득하고, 상기 생체고분자의 천연 색상을 보존함;
c) 바이오매스로부터 보통 90%를 초과하는 높은 수준의 PHA 회수를 달성함;
d) 통합적인 방식으로, 설탕 및 알코올 산업에서 유래하는 재생가능한 원료 및 에너지 공급원을 사용하여, 설탕 및 알코올을 생산하는 산업체의 이윤을 증가시킴.
본 발명의 방법은 천연의 또는 유전자 변형된 미생물 또는 식물에 의해 생산된 PHA, 또는 합성 생산된 PHA에 적용될 수 있다. PHA는 하기 단위의 반복에 의해 구성된 중합체이고:
Figure 112006043259519-pct00003
[식 중, R 은 다양한 길이의 알킬 또는 알케닐기이고, m 및 n 은 정수이다], 상기 언급한 중합체에서 R 및 m 은 하기 값을 갖는 것으로 추정된다:
PHB: R = CH3, m = 1
PHB-V: R = CH3 또는 CH3-CH2-, m = 1
P4HB: R = H, m = 2
P3HB-4HB: R = H 또는 CH3, m = 1 또는 2
PHHx: R = CH3-CH2-CH2-, m = 1
본 발명은 미생물의 바이오매스로부터 회수된 PHA, 바람직하게는 PHB (폴리-3-하이드록시뷰티레이트), PHB-V (폴리(하이드록시뷰티레이트-코-하이드록시발레레이트)), P4HB (폴리-4-하이드록시뷰티레이트), P3HB4HB (폴리(3-하이드록시뷰티레이트-코-4-하이드록시뷰티레이트) 및 일부 PHAmcl (중간길이 사슬의 폴리하이드록시알카노에이트) (상기 마지막 부류의 전형적인 대표물질은 PHHx (폴리하이드록시헥사노에이트)이다)에 적용된다.
생체고분자가 열분해 조건에 노출되는 시간이 짧은, 비-할로겐화 용매를 사용하여 PHA를 추출하는 방법.
본 발명은, 발효에 의해, 그리고 수성 현탁액 중의 세포 바이오매스 슬러리로서 건조 세포물질 함량이 현탁액의 약 18 중량% 이상인 슬러리의 형태로 수득되는 박테리아 세포 바이오매스의 발효 물질을 사용하는, 도 1에 예시된 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 세포 바이오매스로부터 형성된 농축된 슬러리가, 건조 물질의 최소 필요 농도에 달할 수 있는 발효로부터 직접 수득 되거나, 발효된 배지 중의 현탁액 상태의 상기 세포 바이오매스가 바이오매스 세포의 응집 및 농축 조작을 거치게 함으로써 수득 될 수 있다.
본 발명의 바람직한 한 형태에서는, 상기 공정에 공급될 수성 현탁액 상태의 세포 바이오매스를 물에 더욱 희석시켜, 물/발효된 물질의 질량비가 최대 약 3.0:1.0 이 되도록 할 수 있다.
본 발명을 실시하는 또 다른 방식에서는, 발효를 통해 수득 된 가공해야 할 박테리아 세포 바이오매스를 미리 열적으로 불활성화시킬 수 있다.
본 발명을 실시하는 또 다른 바람직한 방식에서는, 상기 응집 조작이, 희석된 세포 바이오매스를 약 1.5 내지 약 5.5의 pH로 산성화시키고, 또한 pH 약 7 내지 약 12에 도달할 때까지 알칼리화제를 첨가함으로써 실행되는 세포 바이오매의 응결 단계를 포함하며, 축적된 PHA를 함유하는 바이오매스 세포의 응집 조작은 응집제를 첨가함으로써 실행된다. 물에 희석된 세포 바이오매스의 산성화는 황산 및 인산 중 하나 이상으로 정의되는 산을 첨가함으로써 이루어질 수 있다. 알칼리화제는 수산화칼슘을 포함할 수 있다.
본 발명을 실시하는 또 다른 바람직한 방식에서는, 희석된 세포 바이오매스의 산성화가 pH 약 2.0 내지 약 3.0에 이르도록 실행되며, 알칼리화제의 첨가는 희석된 세포 바이오매스의 현탁액의 pH를 약 7 내지 약 12 범위로 조정하도록 이루어진다.
응집 단계에서의 상기 요소의 연속적 첨가는 인산칼슘이 형성되도록 하며, 이는 PHA를 함유하는 미생물의 세포벽과 다리를 형성하여 양전하를 띠게 되고, 응집제를 통해 박편 상으로 결집 되어, 이를 포함하는 액체의 밀도보다 높은 밀도를 나타내는 안정한 박편을 형성한다.
발효된 배지 중의 현탁액 상태의 박테리아 세포 바이오매스를 응결시키는 단계는 또한, 알칼리화제를 7 내지 약 12의 pH에 도달할 때까지 첨가함으로써 실시될 수도 있으며, 축적된 PHA를 함유하는 세포 바이오매스의 응집은 상기 언급한 바처럼 응집제를 첨가하여 실시한다.
그 후, PHA가 축적된 세포를 함유하는 형성된 박편은, 예를 들면 정적 경사분리기 (static decanter) 또는 원심력을 사용하는 중력의 작용에 의해, 예를 들면 이 경우에서는 원심분리기 또는 경사분리기를 채택하여, 발효에서 유래한 불순물을 함유하는, 주위의 발효된 액상 배지로부터 용이하게 분리된다.
원심분리기 또는 경사분리기를 사용하는 것이 선택 사양인 반면, 맑아진 용출액은 다시 산 및 염기로 처리되고, 응집되고 경사분리를 거쳐서, 수득 된 농축 슬러리는 원심분리기 또는 경사분리기에서 수득 된 다른 부분과 함께 후속 단계로 보내질 수 있다.
따라서 바이오매스의 응집이 일어나는 본 발명의 바람직한 형태에서는, 상기 방법은, 발효된 배지로부터 박편을 분리하고, 후속 공정 단계에 불리한 착색 요소 및 기타 가용성 염을 주로 제거함으로써, 거기에 용해된 세포 외 불순물의 부분적 제거를 촉진한다.
상기 방법은 또한, 상기 박편을 포함하는 액체에 비해 증가 된 밀도를 갖는 안정한 박편을 함유하는 농축된 바이오매스 슬러리의 형성을 가능하게 한다.
본 발명의 또 다른 바람직한 형태에서는, 응집된 세포 바이오매스가 농축 및 세척 공정을 거쳐, 18 내지 45% (중량/중량), 더욱 바람직하게는 25 내지 45% 범위의 농축된 바이오매스 슬러리로 된다.
상기 농축된 습한 바이오매스는 이어서, 세포 바이오매스를 약 90℃ 내지 (실질적인 대기압에서의) 용매의 비등점의 온도로의 가열을 신속하게 유발하고, PHA가 농후한 PHA 용매 및 세포 바이오매스 슬러리의 잔류 수를 포함하는 액체 상; 잔류 세포 바이오매스의 불용성 잔류물로 정의되는 고체상; 및 수증기 및 PHA 용매의 증기를 포함하는 증기 상을 형성시키기 위해, 반응기 내 격렬한 교반 하에, 바람직하게는 가열된 액체 형태 및 증기 형태의 PHA 용매를 주입함으로써, 세포 내 PHA의 추출을 거친다. 수증기 및 PHA 용매 증기는 응축되고 두 개의 액체 상: PHA 추출 및 회수 단계에서 공정으로 되돌아가는 용매-농후 상; 및 포함된 PHA 용매의 회수를 위해 공정 중에 재순환되는 용매-결핍 상으로 분리된다.
세포 바이오매스를 가열하는 것 외에도, 상기 절차는 또한, PHA 용매 및 물로 구성된 이중 혼합물인 증기 형태인, 슬러리와 함께 공급되는 물의 대부분을 제거하는 효과를 촉진한다. 이어서, 증기 상은 나중에 응축되도록 반응기로부터 추출될 수 있으며, 추출된 세포 바이오매스의 불용성 잔류물 외에도, PHA가 농후한 PHA 용매의 용액 및 용매에 용해된 적은 분량의 물로 구성된 현탁액이 남게 된다.
따라서, 일례로서, 사용되는 PHA 용매는 뷰틸 아세테이트, 아이소뷰틸 아세테이트, 아밀 아세테이트, 아이소아밀 아세테이트, 아이소뷰틸 알코올, 1-뷰탄올, 1-펜탄올 (메틸 알코올), 2-메틸-1-뷰탄올, 3-메틸-1-뷰탄올 (아이소아밀 알코올), 3-펜탄올, 1-헥산올, 사이클로헥산올, 프로필 프로피오네이트, 뷰틸 프로피오네이트, 아이소뷰틸 프로피오네이트, 에틸 뷰티레이트, 아이소뷰틸 아이소뷰티레이트, 및 그의 혼합물로 이루어진 용매 군으로부터 선택할 수 있다. 바람직하게는, 상기 용매는 아이소아밀 알코올, 또는 아이소아밀 알코올의 이성체 혼합물이며, 더욱 바람직하게는, 아이소아밀 알코올은 에탄올 발효의 부산물인 퓨젤유의 분별증류로부터 수득 될 수 있는데, 상기 퓨젤유는 주로 아이소아밀 알코올 및 그의 이성체, 그밖에 에탄올, n-프로판올, 아이소뷰탄올, n-뷰탄올 및 물과 같은 불순물로 이루어진다.
추출 용매와 PHA 세포 바이오매스 간의 접촉은 제어된 조건 하에서, 그리고 상기 부분들 간의 격렬한 접촉을 가능하게 하고 불용성 바이오매스 잔류물이 균일한 입자 크기를 갖도록 보장하는 치수로 만들어진 교반 시스템에 의해 촉진되며, 이는 후속 조작을 용이하게 한다.
도 1 에 예시된 바와 같이, 본 발명의 바람직한 한 형태에서는, 본원에서는 스트림 F 라 명명되고, 용매에 용해된 PHA 및 물을 함유하는 현탁액 및 바이오매스 불용성 잔류물로 구성된 수득 된 스트림이 이후 원심분리 구성요소, 예를 들면 수력 사이클론 (hydrocyclone)으로 공급되는데, 여기에서는 낮은 강도의 원심력 (때때로 중력)을 가하면 하기의 두 개의 스트림이 생성되게 된다: 본원에서는 스트림 O 로 명명된, PHA 용매에 용해된 PHA 및 적은 분율의 물을 함유하는 용액 중에 바이오매스의 잔류 불용성 고체가 낮은 농도로 있는 현탁액으로 구성된 하나의 스트림; 및 본원에서는 스트림 U로 명명된, PHA 및 적은 분율의 용해된 물을 함유하는 용액 중에 바이오매스 불용성 잔류물이 농축된 현탁액을 함유하는 다른 스트림. 원심분리 구성요소로부터 유출되는 두 개의 스트림의 분리는, 스트림 U 가 스트림 F의 약 15 내지 35% (중량/중량)이 되고, 스트림 F 중에 원래 존재하는 고체를 약 55 내지 75% (중량/중량)로 함유하고, 또한 회수될 세포 내 PHA의 일정 분율을 함유하도록 이루어진다. 본원에 기재된 바와 같은 상기 두 스트림의 분리는, 예를 들면 수력 사이클론과 같은 정적이고 강하며 저렴한 장비에서, 낮은 강도의 원심력의 영향 하에 실시되므로, PHA 용매의 폭발성 및 인화성의 한계로 인해 불활성 기체 분위기의 사용을 필요로 하는 고가의 기계적 원심분리기의 사용을 불필요하게 한다.
본원에서는, 그러한 분리는 잔류 불용성 고체 입자의, 이들을 포함하는 용매에 비해 높은 밀도에 의해 보장되는데, 이러한 높은 밀도는, 인산칼슘 입자와 같은 무거운 입자가 세포 내 PHA를 함유하는 세포 및 세포 바이오매스의 구성성분에 결합되는 초기 응결에 의해 부여된다. 또 다른 중요한 효과는, 추출 중에 균일한 입도 분포를 갖는 입자를 생성시키는 추출 시스템의 용량으로서, 이는 낮은 강도의 원심분리 구성요소의 사용 하에서, 미추출된 세포 내 PHA를 함유하는 고체의 고효율 분리 및 농축을 보장한다.
경우에 따라, 스트림 O 는 막 미세여과 (membrane micro-filtration) 또는 프리코트 필터 (precoat filter) 여과 공정을 거칠 수 있는데, 여기서는 두 개의 스트림이 생성된다: 막을 투과하는 하나의 스트림 P, 및 막 농축물인 스트림 C. 스트림 O의 약 50% 내지 90% (중량/중량)이 되는 스트림 P 는 불용성 고체가 없으며, PHA, 물, 및 PHA 용매에 용해된 적은 분율의 회분 및 착색 화합물을 포함하는데, 이는 곧바로 약 45℃ 이하의 온도로 냉각된다. 스트림 O의 약 10 내지 50%가 되는 스트림 C 는, 추출된 바이오매스의 잔류 고체의 농도에 비해, 스트림 O 중의 이들 고체의 원래 함량의 약 2 내지 10 배로 농축되며, 일정 분율의 PHA, 물, 회분 및 착색 화합물을 PHA 용매에 용해된 채로 포함한다.
경우에 따라, 추출된 바이오매스의 불용성 잔류물이 농축되고 PHA는 결핍된 스트림 U 및 스트림 C는 합해져서, 예를 들면 여과에 의한 분리 공정에 의하는, PHA용매에 용해된 잔존 PHA의 회수 공정으로 보내질 수 있는데, 여기서는 PHA 용매에 용해된 PHA, 물, 회분, 착색 화합물을 함유하는 여과액 스트림 (F1 으로 명명됨), 및 추출된 바이오매스의 잔류 불용성 고체를 함유하는, 본원에서 T 로 명명된 최종 분말 (meal)이 생성된다.
경우에 따라, 스트림 U, 스트림 C, 및 새로운 양의 액체 및 증기 형태의 PHA 용매는, 적당한 교반 조건 하에서 다시 혼합되어, 앞서 언급한 공정을 다시 거치게 되는 새로운 스트림을 형성할 수 있다.
따라서 추출된 세포 바이오매스의 불용성 잔류물이 농축되고 PHA는 결핍된, 얻어지는 최종 용출액은 최종적으로, 예를 들면 여과에 의한 분리 공정에 의하는, PHA 용매에 용해된 잔존 PHA의 회수 공정을 거친다. 상기한 추출 공정은, 분자량이 최소 약 850,000 Da인 PHA를 함유하는 바이오매스 슬러리로부터 분자량이 최소 약 850,000 Da 인 PHA를 수득하기 위해, 약 10 내지 20 분보다 더 짧은 체류 시간 내에, 바이오매스에 원래 함유된 PHA의 약 95% (중량/중량)를 초과하는 양이 회수되게 하는 다수의 단계를 포함한다.
경우에 따라 또한, 원심 분리 구성요소 (예를 들면, 수력 사이클론)에서 실행된 공정으로부터 잔존하는 불용성 고체를 함유하는 스트림 O 는, 막 미세여과 공정을 거치지 않고, 불용성 고체를 분리하는 공정으로 보내져서, 용매에 용해된 PHA를 함유하고 바이오매스의 불용성 고체는 없는 여과액 스트림이 수득 되고, 상기 불용성 불순물을 함유하는 분말이 남겨 진다. 이렇게 회수된 PHA는 막 미세여과에 의해 수득 되는 것보다 약간 더 낮은 분자량을 갖는다.
상기 본 발명의 바람직한 형태에서는, 추출된 바이오매스의 불용성 잔류물을 함유하는 조 추출물 스트림 F 가, 원심 분리 구성요소 및 막 미세여과를 통과하지 않고, PHA 용매에 용해된 PHA의 회수 공정으로 직접 보내지는 수도 있는데, 이 경우, 이전 선택사양에 비해, PHA가 품질은 유사하나, 불용성 고체의 분리 공정으로 인해 고분자의 체류시간이 더 길어짐에 따라 약간 감소 된 분자량을 나타낸다.
세포 바이오매스의 불용성 잔류물이 없고, PHA 용매에 용해된 PHA, 물, 회분 및 일부 착색 화합물을 함유하는, 상기한 스트림 P 및 스트림 FI 는 약 45℃ 이하의 온도로 급속히 냉각될 때 PHA 침전을 유발하여, 분자량이 최소 약 1,000,000 Da 인 PHA를 함유하는 바이오매스 슬러리로부터 출발하는, 분자량이 최소 약 750,000 Da 인 현탁액을 형성한다. 이 침전은 결정종 (crystallization germ)의 도입에 의해 더욱 촉진될 수 있다.
용해된 물, 회분 및 용해된 착색 화합물을 함유하는, 냉각에 의한 침전을 통해 수득 되는, PHA 용매 중의 PHA의 현탁액은 그 후, 바람직하게는 미세다공성 고분자막에 의한 분리 공정을 거친다. 상기 공정은, 막으로 공급되는 질량 흐름의 약 60% 내지 90%이고, PHA 용매, 물, 가용성 회분 및 PHA 용매에 용해된 착색 화합물을 포함하며, PHA는 거의 없는 투과액 스트림 PE; 및 공급된 스트림의 약 40% 내지 10%이고, 농축된 PHA 현탁액 및 PHA 용매에 용해된 일정 분획의 회분 및 착색 화합물로 구성된 또 다른 스트림을 수득하게 한다. 본 발명에서 기재한 바와 같은 상기 단계는, PHA 분자량의 보존에 매우 유리한 조건 하에서, 그리고 주위 온도에 가까운 온도를 채택하고 물리적 수단 (막)을 통한 공정으로, PHA 현탁액을 약 3.5 내지 8% (중량/중량)에 이르는 농도로 농축시키는 것 외에도, 또한 투과에 의해, PHA 현탁액의 구성성분이었던 용해된 불순물의 약 70% 내지 90%를 동시에 제거한다.
앞서 PHA가 농축된, PHA농도 3,5% 내지 810% (중량/중량) 범위의 (그리고 도 1에서 스트림 S 로 정의된) 현탁액은 이어서, 대기압에서의, 그리고 바람직하게는 다중 진공 효과로 인한 증발에 의한 농축 단계를 거치는데, 여기에는 PHA 현탁액, 및 공정 중에 회수되고 PHA 용매를 용해시켜 함유하는 약수 (weak water) 스트림 AF 가 동시에 공급된다. 상기 약수는 기본적으로 PHA, PHA 용매 및 물을 함유하는 현탁액을 수득하게 하는 비율로 증발기로 공급되어, 다공도가 높은 PHA 과립의 결집체로서 취성 결집 상태이고 용이하게 전단될 수 있는 결집체를 형성한다. 상기 현탁액은 이어서 증발과 동시에 기계적 전단 구성요소, 예를 들면 순환 원심 펌프에서 세분화 공정을 거치는데, 여기서는 다공도가 높고 취성인 PHA 과립의 결집체가 급속하고 적당하게 파괴되어 훨씬 미세한 PHA 입자의 현탁액을 수득하며, 상기 입자는 PHA 용매의 증발 공정 중에 풍족히 세척될 수 있다. 상기 현탁액에는 약수 스트림 (AF1)이 첨가되며, 이어서 최종 잔류 용매의 증발 (탈거)을 거치는데, 상기 최종 잔류 용매가, 이전 단계에서 수득 된 현탁액의 재순환과 동시에 생 수증기의 주입 시, 잔류액 (모액)으로부터 완전히 추출될 때까지 증발이 이루어진다. 증발 중에 전단 공정을 반복함으로써, PHA가 용매 없는 잔류액 중 현탁액 상태의 분말이 될 때까지, 제어된 PHA의 세분화를 실시할 수 있다. 따라서 공정의 마지막에는, 잔류액 (모액) 중에 미세하게 분산된 PHA 입자의 현탁액이 수득 되며, 상기 잔류액은 PHA로부터 제거된 불순물을 용해된 채로 함유한다. 상기 현탁액은 이어서 약 45℃ 이하로 급속히 냉각되고, 예를 들면 여과에 의해 액체로부터 고체를 분리하고, PHA 입자를 함유하는 여과된 케이크를 깨끗한 물로 헹구는 공정을 거친다.
따라서 이들 증발, 탈거, 냉각 및 여과의 최종 단계들은, 증발이 실시되는 동시에, 매질로부터 PHA 용매를 고갈시키고 PHA 분자량의 손상 없이 PHA 입자의 최종 정제를 실행하게 한다. 또한, 온화한 건조 조건을 사용할 수 있게 하기 위해, 즉 PHA가 온화한 온도 및 짧은 체류시간을 거치게 하기 위해, 건조 공정에 적당한, 40 내지 400 ㎛, 바람직하게는 약 100 내지 200 ㎛ 범위의 입도 분포를 갖는 입자를 수득하게 한다. 상기 건조 단계 후에 수득 된 PHA 생체고분자는 높은 수준의 순도, 지극히 낮은 수준의 잔류 용매, 착색, 회분 및 불순물, 및 높은 전체 수율, 즉 원래 바이오매스에 함유된 PHA에 대한 회수된 PHA의 양이 약 90% (중량/중량)을 초과함을 나타낸다.
본 발명을 실시하는 가능한 방식의 일례로서 제시된 첨부 도면을 참조하여, 본 발명을 하기에 설명하며, 본 발명의 단 하나의 도면인 도 1 은 상기 공정의 단순화된 흐름도이다.
실시예 1.1: 발효된 바이오매스의 불활성화
150 g/℃ 의 총건조 물질을 함유하고, PHB를 약 60 내지 75 중량% 함유하는 박테리아 세포에 의해 형성된, 알칼리제네스 유트로푸스 (Alcaligenes eutrophus)의 발효된 바이오매스 현탁액 10 ㎥을 4 ㎥/h 의 유속으로 재생성 열교환기 TCR1 에 통과시키고, 이어서 증기를 직접 주입하여 온도를 85℃로 올린다. 상기 현탁액을 유효용적 1 ㎥ 의 체류용기로 보내고, 교환기 TCR-1로 다시 펌핑하는데, 여기서 현탁액은 본 공정에 유입되는 바이오매스 현탁액에 의해 냉각되고, 상기 유입되는 바이오매스 현탁액은 대신 가열된다. 상기 공정에서 배출되는 약 45℃의 바이오매스 현탁액은 건조 물질 및 PHB의 농도가 사실상 변하지 않은 채 유지된다. 그러나 박테리아 세포는 이제 그들의 효소 시스템이 불활성화되었으므로, 축적된 PHB를 분해할 수 없다. 상기 현탁액을 이어서 응결 및 경사분리 공정으로 보낸다.
실시예 1.2: 발효된 바이오매스의 세척 및 농축
앞서 불활성화된 알칼리제네스 유트로푸스의 PHB 발효된 바이오매스 5 ㎥ 에, 적당한 교반 하에 물 5 ㎥을 첨가하고, 이어서 pH 2.8 내지 3.5에 이를 때까지 인산을 첨가하고, pH 7.0 내지 8.0에 이를 때까지 석회유 (milk of lime)를 첨가한다. 그 후, 응결된 바이오매스 현탁액에 10 내지 20 ppm의 음이온성 다가전해질을 첨가하고, 서서히 교반 한 후, 경사분리를 위해 정치시킨다. 이어서, 상청액을 제거하면, 건조 물질이 약 10 내지 12% 함유된 바이오매스 슬러리가 남겨 진다. 이어서, 수득한 슬러리를 약 1200 ㎏/h의 유속으로 원심 경사분리기에 공급한 후, 여기에 응집에 충분한 양의 다가전해질, 및 공급된 슬러리 유속의 약 20% (중량/중량)의 비율로 물을 첨가한다. 이어서, 맑아진 물질을 제거하여, 고체를 약 20 내지 25%로 함유하는 슬러리 약 2400 ㎏을 생성시키는데, 상기 고체의 70 내지 75%가 PHB에 해당한다.
실시예 1.3.1: 단일 단계 추출에서의, 아이소아밀 알코올을 용매로 사용하는 PHB 추출 및 회수
건조 물질 25%로 농축되고, 분자량 1,000,000 Da의 PHB를 약 60 내지 75%로 함유하는 상기 알칼리제네스 유트로푸스 바이오매스를, 약 105℃로 유지된 기계 교반 되는 반응기에 350 내지 450 ㎏/h의 유속으로 공급하고, 여기서 상기 슬러리에 함유된 과량의 물을 증발시키기에 충분한 양인, 약 105℃로 가열된 아이소아밀 알 코올 및 135℃의 아이소아밀 알코올 증기 7290 ㎏/h를 첨가하여, 물 약 15%, 및 아이소아밀 알코올 85%로 구성된 증기의 스트림 약 1250 kg/h, 및 아이소아밀 알코올에 용해된 PHB (분자량 약 900,000 Da) 및 물, 그리고 추출된 바이오매스의 불용성 잔류물을 함유하는 현탁액의, 조 추출물이라 명명된 또 다른 스트림 약 8000 kg/h을 생성한다. 상기 조 추출물은 이어서 연속적으로 수력 사이클론으로 공급되는데, 여기서 상기 흐름은 하기의 두 개의 스트림으로 분리된다: 공급된 조 추출물에 원래 함유된 불용성 고체를 약 65%로 함유하고, 공급 유속의 약 75%에 해당하는 상부의 스트림; 및 공급된 흐름에 원래 함유된 불용성 고체를 75%로 함유하고, 공급된 흐름의 약 25%에 해당하는 하부의 또 다른 스트림. 불용성 고체가 결핍된, 수력사이클론의 상부 스트림은 이어서 6000 kg/h의 유속으로 막 미세여과 단위로 공급되어, 추출된 바이오매스의 잔류 불용성 고체가 농축된 스트림 약 1500 kg/h (1/4), 및 추출된 바이오매스의 잔류 불용성 고체는 없고, 분자량이 800,000 내지 880,000 Da 범위 내인, PHB가 농후한 투과액 스트림 4500 kg/h (3/4)을 생성한다. 상기 공정에서의 체류 시간은 약 3 내지 10 분이다. 수력 사이클론의 불용성 고체가 농후한 스트림 (하부상), 및 막의 불용성 고체가 농후한 스트림은 이어서 혼합되고, 2000 kg/h의 유속으로, 예를 들면 판상 필터 (plate filter)의 여과 단계로 보내져서, 분자량이 580,000 및 780,000 Da인 PHB가 농후한, 현탁액 중의 불용성 고체가 없는 PHB 용액인 스트림 약 1800 kg/h, 및 추출된 바이오매스의 불용성 고체를 함유하는 분말 약 200 kg/h를 생성한다. 상기 공정의 PHB 회수는, 바이오매스 흐름 및 순도에 따라, 바이오매스의 공급된 PHB에 대해 95% (중량/중량) 초과, 즉 50 내지 80 kg의 PHB/h 이다. 막 및 필터 추출 공정 모두에서 수득 된 여과액은, 용매 중의 PHB 침전을 보장하기 위해 약 45℃ 이하의 온도로 급속히 냉각된다. 막 미세여과에서 유래하는, 아이소아밀 알코올 중에 침전된 PHB는 분자량이 800,000 내지 870,000 Da 범위이고, 통상적 여과에서 유래하는 침전된 PHB는 분자량이 580,000 내지 780,000 Da 범위이다.
경우에 따라, 아이소아밀 알코올에 용해된 PHB (분자량 약 900,000 Da) 및 물, 및 추출된 바이오매스의 불용성 잔류물을 함유하는 현탁액인, 약 8000 kg/h의 조 추출물 스트림은 예를 들면 판상 필터의 여과 단계로 직접 보내지고, 여기서 하기 두 개의 스트림이 수득 된다: 분자량이 580,000 내지 780,000 Da인 PHB가 농후한, 현탁액 중의 불용성 고체가 없는 PHB 용액인 여과액 스트림 약 7800 kg/h; 및 추출된 바이오매스의 불용성 고체를 함유하는 분말 약 200 kg/h. 상기 공정에서 수득 된 여과액은 이어서, 용매 중의 PHB 침전을 보장하기 위해 약 45℃ 이하의 온도로 급속히 냉각된다. 아이소아밀 알코올 중에 침전된 PHB는 분자량이 80,000 내지 780,000 Da 범위이다.
상기 공정의 PHB 회수는, 바이오매스 흐름 및 순도에 따라, 바이오매스의 공급된 PHB에 대해 95% (중량/중량) 초과, 즉 50 내지 80 kg의 PHB/h 이다.
실시예 1.3.2: 3 단계 추출에서의, 아이소아밀 알코올을 용매로 사용한 PHB 추출 및 회수
세 개의 반응기가 직렬로 연결된 배치에서, 건조 물질 25%로 농축되고, 분자량 약 1,000,000 Da의 PHB를 약 60 내지 75%로 함유하는 상기 알칼리제네스 유트로 푸스 바이오매스를, 약 105℃로 유지된 기계 교반 되는 반응기에 350 내지 450 ㎏/h의 유속으로 공급한다. 제 3 반응기에서, 약 105℃로 가열된 아이소아밀 알코올이 7290 ㎏/h의 유속으로 공급된다. 135℃의 아이소아밀 알코올 증기는 상기 세 추출 단계에, 상기 슬러리에 함유된 과량의 물의 증발을 보장하기에 충분한 양으로 공급된다. 상기 절차는, 각각 물을 15% 및 아이소아밀 알코올을 85%로 함유하는 수증기 및 아이소아밀 알코올의 통합 스트림 약 1250 kg/h, 및 아이소아밀 알코올에 용해된 PHB 및 물, 그리고 추출된 바이오매스의 불용성 잔류물을 함유하는 현탁액의, 제 1 추출 단계로부터 유출되고 조 추출물이라 명명된 또 다른 스트림 약 8000 kg/h을 생성한다. 제 1 단계에서 유래하는 상기 조 추출물은 이어서 연속적으로 수력 사이클론 1로 공급되는데, 여기서 상기 흐름은 하기의 두 개의 스트림으로 분리된다: 공급된 조 추출물에 원래 함유된 불용성 고체를 약 40% 내지 45%로 함유하고, 공급 유속의 약 75%에 해당하는 상부 스트림; 및 공급된 흐름에 원래 함유된 불용성 고체를 약 55% 내지 60%로 함유하고, 공급된 흐름의 약 25%에 해당하며, 다음 단계 (2)로 보내지는 (하부의) 기저 스트림. 불용성 고체가 결핍된, 수력 사이클론 1의 상부 스트림은 이어서 6000 kg/h의 유속으로 막 미세여과 단위로 공급되어, 추출된 바이오매스의 잔류 불용성 고체가 농축된 스트림 약 2000 kg/h (1/3), 및 추출된 바이오매스의 잔류 불용성 고체가 없는 투과액 스트림 4000 kg/h (2/3)을 생성한다. 수력사이클론 1의 기저 스트림은 제 2 추출 단계로 보내지고, 여기서 수력 사이클론 3의 상부 스트림, 및 막 미세여과에서 생성된 불용성 고체가 농축된 스트림이 첨가된다. 추출된 바이오매스의 불용성 고체를 약 55 내지 65%로 함유하는 수력 사이클론 3의 기저 스트림은 이어서 2000 kg/h의 유속으로, 예를 들면 판상 필터의 여과 단계로 보내져서, 현탁액 중 불용성 고체가 없는 PHB 용액인 스트림 약 1800 kg/h, 및 추출된 바이오매스의 불용성 고체를 약 200 kg/h 함유하는 분말을 생성한다. 상기 공정의 PHB 회수는 바이오매스의 공급된 PHB에 대해 98% (중량/중량) 초과, 즉 51 내지 82 kg의 PHB/h 이다. 막 및 필터 추출 공정 모두에서 수득 된 여과액은, 용매인 아이소아밀 알코올 중의 PHB 침전을 보장하기 위해, 45℃ 이하의 온도로 급속히 냉각된다.
경우에 따라, 불용성 고체가 결핍된, 약 6000 kg/h의 수력 사이클론 1 의 상부 스트림은 이어서, 예를 들면 판상 필터의 여과 단계로 직접 보내지고, 여기서 하기의 두 개의 스트림이 수득 된다: 현탁액 중 불용성 고체가 없고, 분자량이 650,000 내지 780,000 Da 범위 내인 PHB가 농후한 PHB 용액인 여과액 스트림 약 5800 kg/h; 및 추출된 바이오매스의 불용성 고체를 함유하는 분말 약 200 kg/h. 상기 공정에서 수득 된 여과액은 이어서, 용매 중의 PHB 침전을 보장하기 위해 약 45℃ 이하의 온도로 급속히 냉각된다. 아이소아밀 알코올에 침전된 PHB는 분자량이 650,000 내지 780,000 Da 범위이다.
상기 절차의 PHB 회수는, 바이오매스 흐름 및 순도에 따라 바이오매스의 공급된 PHB에 대해 95% (중량/중량) 초과, 즉 50 내지 80 kg의 PHB/h 이다.
실시예 1.3.3: 아이소아밀 아세테이트를 용매로서 사용하는 PHB 추출 및 회수
아이소아밀 아세테이트에서의 PHB 용해도 시험:
500 ㎖ 둥근 바닥 증류 플라스크에, 건조 물질을 28.11%, 및 분자량이 1,000,000 Da인 PHB를 16.09%로 함유하는, 알칼리제네스 유트로푸스의 농축된 바이오매스 31 g, 및 아이소아밀 아세테이트 250 g을 첨가하였다. 이어서, 상기 현탁액은 교반 하에, 증류 플라스크에 연결된 가열요 (heating blanket)를 사용하여 용매 및 물을 증발 처리하였다. 이렇게 생성된 두 가지 증기는 응축을 위해 직선관 응축기 (Liebig 타입)로 보내지고, 수득 된 응축물은 Erlenmeyer 용기에 수집되었다. 상기 현탁액을 교반 하에 추출 온도에 도달할 때까지 증발 공정에서 유지시켰다. 온도는, 플라스크 노즐 중 하나에 고정되고 플라스크 내부의 증기 상과 접촉이 유지되는 수은 온도계로 읽었다. 추출 온도는 약 14 분의 증발 시간이 경과 한 후에 도달하였고, 혼합물의 비등점은 약 104℃ (초기 온도)로부터 약 123℃ (추출 온도)로 변하였으며, 이 기간 동안, 아이소아밀 아세테이트 약 70% (v/v), 및 나머지 부피는 농축된 바이오매스에서 유래하는 물로 구성된 응축물 약 34 ㎖가 생성되었다. 현탁액은 이어서 응축물 환류 영역에서, 교반 하에 123℃의 온도 (추출 온도)에서 약 10 분간 유지된 후, 여과된 용매 중에 용해된 부분으로부터 불용성 부분을 분리하기 위해, 가열된 채로 필터지로 여과되었다. 가용화된 PHB를 약 0.90% (w/w)로 함유하는 고온의 여과된 물질은 이어서 PHB의 침전을 위해 냉각되고, 여과를 통해 농축되고, 용매의 증발을 거친 후에, 건조되었다. 수득 된 PHB는 분자량이 약 495,000 Da 이었다. 본 시험에서 사용된 농축된 바이오매스의 양은, 채택된 추출 온도에서 용매 중 PHB 포화 농도에 도달하는 데 필요한 양에 비해 약 2.0 내지 3.5 배 더 많았다. 이리하여, 채택된 추출 온도에 대한 용매 (아이소아밀 아세 테이트) 중 용질 (PHB) 포화 농도가 구해질 수 있었다.
아이소아밀 아세테이트에서의 PHB 추출 시험:
500 ㎖ 둥근 바닥 증류 플라스크에, 건조 물질을 28.11%, 및 분자량이 1,000,000 Da인 PHB를 16.09%로 함유하는, 알칼리제네스 유트로푸스의 농축된 바이오매스 10 g, 및 아이소아밀 아세테이트 200 g을 첨가하였다. 이어서, 상기 현탁액은, 증류 플라스크에 연결된 가열요를 사용하여 용매 및 물을 증발 처리하고, 이렇게 생성된 두 가지 증기는 응축을 위해 직선관 응축기 (Liebig 타입)로 보내지고, 수득 된 응축물은 Erlenmeyer 용기에 수집되었다. 상기 현탁액을 교반 하에 추출 온도에 도달할 때까지 증발 공정에서 유지시켰다. 온도는, 플라스크 노즐 중 하나에 고정되고 플라스크 내부의 증기 상과 접촉이 유지되는 수은 온도계로 읽었다. 현탁액은 이어서 응축물 환류 영역에서, 교반 하에 123℃의 온도 (추출 온도)에서 약 10 분간 유지되었다. 이렇게 얻어진 물질은 이어서 열 경사분리 공정을 거쳐서, 추출로 인해 생긴 불용성 고체 잔류물이 용매에 가용화 된 PHB로부터 분리될 수 있었다. 용해된 PHB를 함유하는 용액은 PHB의 침전을 위해 냉각시키고, 본 단계에서 추출된 PHB 질량을 측정하였다. 제 1 단계에서 수득한 고체 잔류물에 아이소아밀 아세테이트 200 g을 새로 첨가하고, 다시 10 분간 추출 처리하였다. 세 추출 단계를 모두 거치도록 다른 절차들도 반복하였다. 세포 바이오매스에 원래 함유된 PHB의 약 41%가 제 1 단계에서 추출되었고, 제 2 단계에서 13%, 그리고 제 3 단계에서 8% 추출되었다. 이렇게 수득 된 PHB는 730,000 Da 내지 750,000 Da 범위에 머물렀다.
공업적 규모로의 연장의 예
건조 물질 28.11%로 농축되고, 분자량이 약 1,000,000 Da인 PHB를 16.09%로 함유하는 알칼리제네스 유트로푸스 바이오매스를, 약 123℃로 유지된 기계 교반 되는 반응기에 500 ㎏/h의 유속으로 공급하고, 여기서 약 123℃로 가열된 아이소아밀 아세테이트 9,521 kg/h를 액체 및 증기 형태로, 슬러리에 함유된 과량의 물을 증발시키기에 충분한 양으로 새로 첨가하여, 물 약 30% (v/v) 및 아이소아밀 아세테이트 70% (v/v)로 구성된 증기 약 833 kg/h 의 스트림, 및 아이소아밀 아세테이트에 용해된 PHB 및 물, 그리고 추출된 바이오매스의 불용성 잔류물을 함유하는 현탁액 약 8,969 kg/h 의, 조 추출물이라 명명된 또 다른 스트림을 생성한다. 조 추출물은 이어서 수력 사이클론에 연속적으로 공급되는데, 여기서 상기 흐름은 하기 두 개의 스트림으로 분리된다: 공급된 조 추출물에 원래 함유된 불용성 고체를 약 35%로 함유하고, 공급 흐름의 약 75%에 해당하는 상부의 스트림; 및 공급된 흐름에 원래 함유된 불용성 고체를 65%로 함유하고, 공급된 흐름의 약 25%에 해당하는 하부의 또 다른 스트림. 불용성 고체가 결핍된, 수력 사이클론의 상부 스트림은 이어서 6,891 kg/h의 유속으로 막 미세여과 단위로 공급되어, 추출된 바이오매스의 잔류 불용성 고체가 농축된 스트림 약 1,149 kg/h (1/6), 및 추출된 바이오매스의 잔류 불용성 고체가 없는 투과액 스트림 5,743 kg/h (5/6)을 생성한다. 상기 공정에서의 체류 시간은 약 10 분이다. 수력 사이클론으로부터의 불용성 고체가 농후한 스트림 (하부상), 및 막으로부터의 불용성 고체가 농후한 스트림은 이어서 혼합되고, 3,446 kg/h의 유속으로, 예를 들면 판상 필터의 여과 단계로 보내져서, 현탁액 중의 불용성 고체가 없는 PHB 용액인 스트림 약 3,294 kg/h, 및 추출된 바이오매스의 불용성 고체를 함유하는 분말 약 151.5 kg/h를 생성한다. 상기 공정의 PHB 회수는, 바이오매스 흐름 및 순도에 따라, 바이오매스의 공급된 PHB에 대해 95% (중량/중량) 초과, 즉 70 내지 80 kg의 PHB/h 이다. 막 및 필터 추출 공정 모두에서 수득 된 여과액은, 용매 중의 PHB 침전을 보장하기 위해 약 45℃ 이하의 온도로 급속히 냉각된다.
실시예 1.3.4: 뷰틸 아세테이트를 용매로서 사용하는 PHB 추출 및 회수
뷰틸 아세테이트에서의 PHB 용해도의 시험:
건조 물질을 28.11%, 및 분자량이 1,000,000 Da인 PHB를 16.09%로 함유하는, 알칼리제네스 유트로푸스의 농축된 바이오매스 31 g, 및 뷰틸 아세테이트 250 g을 500 ㎖ 둥근 바닥 증류 플라스크에 첨가하였다. 이어서, 상기 현탁액은 교반 하에, 증류 플라스크에 연결된 가열요를 사용하여 용매 및 물을 증발 처리하였고, 이렇게 생성된 두 가지 증기는 응축을 위해 직선관 응축기 (Liebig 타입)로 보내지고, 수득 된 응축물은 Erlenmeyer 용기에 수집되었다. 상기 현탁액을 교반 하에 추출 온도에 도달할 때까지 증발 공정에서 유지시켰다. 온도는, 플라스크 노즐 중 하나에 고정되고 플라스크 내부의 증기 상과 접촉이 유지되는 수은 온도계로 읽었다. 추출 온도는 약 28 분의 증발 시간이 경과한 후에 도달하였고, 혼합물의 비등점은 약 91.5℃ (초기 온도)에서 약 121.5℃ (추출 온도)로 변하였으며, 이 기간 동안, 아이소아밀 아세테이트 약 83% (v/v), 및 나머지 부피는 농축된 바이오매스에서 유래하는 물로 구성된 응축물 약 131 ㎖가 생성되었다. 현탁액은 이어서 응 축물 환류 영역에서, 교반 하에 121.5℃의 온도 (추출 온도)에서 약 10 분간 유지된 후, 여과된 용매 중에 용해된 부분으로부터 불용성 부분을 분리하기 위해, 가열된 채로 필터지로 여과되었다. 가용화 된 PHB를 약 0.98% (w/w)로 함유하는 고온의 여과된 물질은 이어서 PHB의 침전을 위해 냉각되고, 여과를 통해 농축되고, 용매의 증발을 거친 후에, 건조되었다. 수득 된 PHB는 분자량이 약 502,000 Da 이었다. 본 시험에서 사용된 농축된 바이오매스의 양은, 채택된 추출 온도에서 용매 중 PHB 포화 농도에 도달하는 데 필요한 양에 비해 약 2.0 내지 3.5 배 더 많았다. 이리하여, 채택된 추출 온도에 대한 용매 (아이소아밀 아세테이트) 중 용질 (PHB) 포화 농도가 구해질 수 있었다.
뷰틸 아세테이트에서의 PHB 추출 시험:
건조 물질을 28.11%, 및 분자량이 1,000,000 Da인 PHB를 16.09%로 함유하는, 알칼리제네스 유트로푸스의 농축된 바이오매스 10 g, 및 뷰틸 아세테이트 200 g을 500 ㎖ 둥근 바닥 증류 플라스크에 첨가하였다. 이어서, 상기 현탁액은, 증류 플라스크에 연결된 가열요를 사용하여 용매 및 물을 증발 처리하고, 이렇게 생성된 두 가지 증기는 응축을 위해 직선관 응축기 (Liebig 타입)로 보내지고, 수득 된 응축물은 Erlenmeyer 용기에 수집되었다. 상기 현탁액을 교반 하에 추출 온도에 도달할 때까지 증발 공정에서 유지시켰다. 온도는, 플라스크 노즐 중 하나에 고정되고 플라스크 내부의 증기 상과 접촉이 유지되는 수은 온도계로 읽었다. 현탁액은 이어서 응축물 환류 영역에서, 교반 하에 121.5℃의 온도 (추출 온도)에서 약 10 분간 유지되었다. 이렇게 얻어진 물질은 이어서 열 경사분리 공정을 거쳐서, 추출 로 인해 생긴 불용성 고체 잔류물이 용매에 가용화 된 PHB로부터 분리되었다. 용해된 PHB를 함유하는 용액은 PHB의 침전을 위해 냉각시키고, 본 단계에서 추출된 PHB 질량을 측정하였다. 제 1 단계에서 수득한 고체 잔류물에 뷰틸 아세테이트 200 g을 새로 첨가하고, 다시 10 분간 추출 처리하였다. 세 추출 단계를 모두 거치도록 다른 절차들도 반복하였다. 세포 바이오매스에 원래 함유된 PHB의 약 62.5%가 제 1 단계에서 추출되었고, 제 2 단계에서 18.5%, 그리고 제 3 단계에서 7.0% 추출되었다. 수득 된 PHB의 분자량은 740,000 Da 내지 780,000 Da 범위에 머물렀다.
공업적 규모로의 연장의 예
건조 물질 28.11%로 농축되고, 분자량이 약 1,000,000 Da인 PHB를 16.09%로 함유하는 알칼리제네스 유트로푸스 바이오매스를, 약 121.5℃로 유지된 기계 교반 되는 반응기에 500 ㎏/h의 유속으로 공급하고, 여기서 약 121.5℃로 가열된 뷰틸 아세테이트 9,577 kg/h를 액체 및 증기 형태로, 슬러리에 함유된 과량의 물을 증발시키기에 충분한 양으로 새로 첨가하여, 물 약 17% 및 뷰틸 아세테이트 83%로 구성된 증기 약 1,732 kg/h 의 스트림, 및 뷰틸 아세테이트에 용해된 PHB 및 물, 그리고 추출된 바이오매스의 불용성 잔류물을 함유하는 현탁액 약 8,175 kg/h 의, 조 추출물이라 명명된 또 다른 스트림을 생성한다. 조 추출물은 이어서 수력 사이클론에 연속적으로 공급되는데, 여기서 상기 흐름은 하기 두 개의 스트림으로 분리된다: 공급된 조 추출물에 원래 함유된 불용성 고체를 약 35%로 함유하고, 공급 흐름의 약 75%에 해당하는 상부의 스트림; 및 공급된 흐름에 원래 함유된 불용성 고체 를 65%로 함유하고, 공급된 흐름의 약 25%에 해당하는 하부의 또 다른 스트림. 불용성 고체가 결핍된, 수력 사이클론의 상부 스트림은 이어서 6,258 kg/h의 유속으로 막 미세여과 단위로 공급되어, 추출된 바이오매스의 잔류 불용성 고체가 농축된 스트림 약 1,0143 kg/h (1/6), 및 추출된 바이오매스의 잔류 불용성 고체가 없는 투과액 스트림 5,215 kg/h (5/6)을 생성한다. 상기 공정에서의 체류 시간은 약 10 분이다. 수력 사이클론으로부터의 불용성 고체가 농후한 스트림 (하부상), 및 막으로부터의 불용성 고체가 농후한 스트림은 이어서 혼합되고, 3,129 kg/h의 유속으로, 예를 들면 판상 필터의 여과 단계로 보내져서, 현탁액 중의 불용성 고체가 없는 PHB 용액인 스트림 약 2,978 kg/h, 및 추출된 바이오매스의 불용성 고체를 함유하는 분말 약 151.5 kg/h를 생성한다. 상기 공정의 PHBV 회수는, 바이오매스 흐름 및 순도에 따라, 바이오매스의 공급된 PHBV에 대해 95% (중량/중량) 초과, 즉 70 내지 80 kg의 PHBV/h 이다. 막 및 필터 추출 공정 모두에서 수득 된 여과액은, 용매 중의 PHBV 침전을 보장하기 위해 약 45℃ 이하의 온도로 급속히 냉각된다.
실시예 1.3.5: 프로필 프로피오네이트를 용매로서 사용하는 PHB 추출 및 회수
프로필 프로피오네이트에서의 PHB 용해도 시험:
500 ㎖ 둥근 바닥 증류 플라스크에, 건조 물질을 28.11%, 및 분자량이 1,000,000 Da인 PHB를 16.09%로 함유하는, 알칼리제네스 유트로푸스의 농축된 바이오매스 31 g, 및 프로필 프로피오네이트 250 g을 첨가하였다. 이어서, 상기 현탁액은 교반 하에, 증류 플라스크에 연결된 가열요를 사용하여 용매 및 물을 증발 처 리하였고, 이렇게 생성된 두 가지 증기는 응축을 위해 직선관 응축기 (Liebig 타입)로 보내지고, 수득 된 응축물은 Erlenmeyer 용기에 수집되었다. 상기 현탁액을 교반 하에 추출 온도에 도달할 때까지 증발 공정에서 유지시켰다. 온도는, 플라스크 노즐 중 하나에 고정되고 플라스크 내부의 증기 상과 접촉이 유지되는 수은 온도계로 읽었다. 추출 온도는 약 15 분의 증발 시간이 경과한 후에 도달하였고, 혼합물의 비등점은 약 92℃ (초기 온도)로부터 약 113℃ (추출 온도)로 변하였으며, 이 기간 동안, 프로필 프로피오네이트 약 80% (v/v), 및 나머지 부피는 농축된 바이오매스에서 유래하는 물로 구성된 응축물 약 100 ㎖가 생성되었다. 현탁액은 이어서 응축물 환류 영역에서, 교반 하에 113℃의 온도 (추출 온도)에서 약 10 분간 유지된 후, 여과된 용매 중에 용해된 부분으로부터 불용성 부분을 분리하기 위해, 가열된 채로 필터지로 여과되었다. 가용화 된 PHB를 약 1.24% (p/p)로 함유하는 고온의 여과된 물질은 이어서 PHB의 침전을 위해 냉각되고, 여과를 통해 농축되고, 용매의 증발을 거친 후에, 건조되었다. 수득 된 PHB는 분자량이 약 430,000 Da 이었다. 본 시험에서 사용된 농축된 바이오매스의 양은, 채택된 추출 온도에서 용매 중 PHB 포화 농도에 도달하는 데 필요한 양에 비해 약 2.0 내지 3.5 배 더 많았다. 이리하여, 채택된 추출 온도에 대한 용매 (프로필 프로피오네이트) 중 용질 (PHB) 포화 농도가 구해질 수 있었다.
프로필 프로피오네이트에서의 PHB 추출 시험:
500 ㎖ 둥근 바닥 증류 플라스크에, 건조 물질을 28.11%, 및 분자량이 1,000,000 Da인 PHB를 16.09%로 함유하는, 알칼리제네스 유트로푸스의 농축된 바이 오매스 10 g, 및 프로필 프로피오네이트 200 g을 첨가하였다. 이어서, 상기 현탁액은, 증류 플라스크에 연결된 가열요를 사용하여 용매 및 물을 증발 처리하고, 이렇게 생성된 두 가지 증기는 응축을 위해 직선관 응축기 (Liebig 타입)로 보내지고, 수득 된 응축물은 Erlenmeyer 용기에 수집되었다. 상기 현탁액을 교반 하에 추출 온도에 도달할 때까지 증발 공정에서 유지시켰다. 온도는, 플라스크 노즐 중 하나에 고정되고 플라스크 내부의 증기 상과 접촉이 유지되는 수은 온도계로 읽었다. 현탁액은 이어서 응축물 환류 영역에서, 교반 하에 113℃의 온도 (추출 온도)에서 약 10 분간 유지되었다. 이렇게 얻어진 물질은 이어서 열 경사분리 공정을 거쳐서, 추출로 인해 생긴 불용성 고체 잔류물이 용매에 가용화 된 PHB로부터 분리되었다. 용해된 PHB를 함유하는 용액은 PHB의 침전을 위해 냉각시키고, 본 단계에서 추출된 PHB 질량을 측정하였다. 제 1 단계에서 수득한 고체 잔류물에 프로필 프로피오네이트 200 g을 새로 첨가하고, 다시 10 분간 추출 처리하였다. 세 추출 단계를 모두 거치도록 다른 절차들도 반복하였다. 세포 바이오매스에 원래 함유된 PHB의 약 62.0%가 제 1 단계에서 추출되었고, 제 2 단계에서 18.5%, 그리고 제 3 단계에서 6.0% 추출되었다. 이렇게 수득 된 PHB의 분자량은 약 730,000 Da 이었다.
공업적 규모로의 연장의 예
건조 물질 28.11%로 농축되고, 분자량이 약 1,000,000 Da인 PHB를 16.09%로 함유하는 알칼리제네스 유트로푸스 바이오매스를, 약 113℃로 유지된 기계 교반 되는 반응기에 500 ㎏/h의 유속으로 공급하고, 여기서 약 113℃로 가열된 뷰틸 아세 테이트 7,406 kg/h를 액체 및 증기 형태로, 슬러리에 함유된 과량의 물을 증발시키기에 충분한 양으로 새로 첨가하여, 물 약 20% 및 프로필 프로피오네이트 80% (v/v)로 구성된 증기 약 1,156 kg/h 의 스트림, 및 뷰틸 아세테이트에 용해된 PHB 및 물, 그리고 추출된 바이오매스의 불용성 잔류물을 함유하는 현탁액 약 7,406 kg/h 의, 조 추출물이라 명명된 또 다른 스트림을 생성한다. 조 추출물은 이어서 수력 사이클론에 연속적으로 공급되는데, 여기서 상기 흐름은 하기 두 개의 스트림으로 분리된다: 공급된 조 추출물에 원래 함유된 불용성 고체를 약 35%로 함유하고, 공급 흐름의 약 75%에 해당하는 상부의 스트림; 및 공급된 흐름에 원래 함유된 불용성 고체를 65%로 함유하고, 공급된 흐름의 약 25%에 해당하는 하부의 또 다른 스트림. 불용성 고체가 결핍된, 수력 사이클론의 상부 스트림은 이어서 5,063 kg/h의 유속으로 막 미세여과 단위로 공급되어, 추출된 바이오매스의 잔류 불용성 고체가 농축된 스트림 약 844 kg/h (1/6), 및 추출된 바이오매스의 잔류 불용성 고체가 없는 투과액 스트림 4,219 kg/h (5/6)을 생성한다. 상기 공정에서의 체류 시간은 약 10 분이다. 수력 사이클론의 불용성 고체가 농후한 스트림 (하부상), 및 막의 불용성 고체가 농후한 스트림은 이어서 혼합되고, 2,531 kg/h의 유속으로, 예를 들면 판상 필터의 여과 단계로 보내져서, 현탁액 중의 불용성 고체가 없는 PHB 용액인 스트림 약 2,380 kg/h, 및 추출된 바이오매스의 불용성 고체를 함유하는 분말 약 151.5 kg/h를 생성한다. 상기 공정의 PHB 회수는, 바이오매스 흐름 및 순도에 따라, 바이오매스의 공급된 PHBV에 대해 95% (중량/중량) 초과, 즉 70 내지 80 kg의 PHBV/h 이다. 막 및 필터 추출 공정 모두에서 수득 된 여과액은, 용매 중의 PHBV 침전을 보장하기 위해 약 45℃ 이하의 온도로 급속히 냉각된다.
건조 물질 25%로 농축되고, 분자량이 약 1,000,000 Da인 PHB를 약 60 내지 75%로 함유하는 알칼리제네스 유트로푸스 바이오매스를, 약 95 내지 105℃로 유지된 기계 교반 되는 반응기에 500 ㎏/h의 유속으로 공급하고, 여기서 슬러리에 함유된 과량의 물을 증발시키기에 충분한 양인, 약 130℃로 가열된 프로필 프로피오네이트 및 130℃의 프로필 프로피오네이트 증기 8000 kg/h를 첨가하여, 물 약 24% 및 프로필 프로피오네이트 76%로 구성된 증기 약 1,230 kg/h 의 스트림, 및 프로필 프로피오네이트에 용해된 PHB 및 물, 그리고 추출된 바이오매스의 불용성 잔류물을 함유하는 현탁액 약 8268 kg/h 의, 조 추출물이라 명명된 또 다른 스트림을 생성한다. 조 추출물은 이어서 수력 사이클론에 연속적으로 공급되는데, 여기서 상기 흐름은 하기 두 개의 스트림으로 분리된다: 공급된 조 추출물에 원래 함유된 불용성 고체를 약 35%로 함유하고, 공급 흐름의 약 75%에 해당하는 상부의 스트림; 및 공급된 흐름에 원래 함유된 불용성 고체를 65%로 함유하고, 공급된 흐름의 약 25%에 해당하는 하부의 또 다른 스트림. 불용성 고체가 결핍된, 수력 사이클론의 상부 스트림은 이어서 6,201 kg/h의 유속으로 막 미세여과 단위로 공급되어, 추출된 바이오매스의 잔류 불용성 고체가 농축된 스트림 약 1,034 kg/h (1/6), 및 추출된 바이오매스의 잔류 불용성 고체가 없는 투과액 스트림 5,167 kg/h (5/6)을 생성한다. 상기 공정에서의 체류 시간은 약 3 내지 10 분이다. 수력 사이클론의 불용성 고체가 농후한 스트림 (하부상), 및 막의 불용성 고체가 농후한 스트림은 이어서 혼합되고, 3,100 kg/h의 유속으로, 예를 들면 판상 필터의 여과 단계로 보내져서, 현탁 액 중의 불용성 고체가 없는 PHB 용액인 스트림 약 2,850 kg/h, 및 추출된 바이오매스의 불용성 고체를 함유하는 분말 약 250 kg/h를 생성한다. 상기 공정의 PHB 회수는, 바이오매스 흐름 및 순도에 따라, 바이오매스의 공급된 PHB에 대해 95% (중량/중량) 초과, 즉 70 내지 90 kg의 PHB/h 이다. 막 및 필터 추출 공정 모두에서 수득 된 여과액은, 용매 중의 PHB 침전을 보장하기 위해 약 45℃ 이하의 온도로 급속히 냉각된다.
실시예 1.3.6: 단일 단계 추출에서의, 1-헥산올을 용매로 사용하는 PHB 추출 및 회수
헥산올에서의 PHB 용해도 시험:
500 ㎖ 둥근 바닥 증류 플라스크에, 건조 물질을 28.11%, 및 분자량이 1,000,000 Da인 PHB를 16.09%로 함유하는, 알칼리제네스 유트로푸스의 농축된 바이오매스 31 g, 및 헥산올 250 g을 첨가하였다. 이어서, 상기 현탁액은 교반 하에, 증류 플라스크에 연결된 가열요를 사용하여 용매 및 물을 증발 처리하였고, 이렇게 생성된 두 가지 증기는 응축을 위해 직선관 응축기 (Liebig 타입)로 보내지고, 수득 된 응축물은 Erlenmeyer 용기에 수집되었다. 상기 현탁액을 교반 하에 추출 온도에 도달할 때까지 증발 공정에서 유지시켰다. 온도는, 플라스크 노즐 중 하나에 고정되고 플라스크 내부의 증기 상과 접촉이 유지되는 수은 온도계로 읽었다. 추출 온도는 약 15 분의 증발 시간이 경과한 후에 도달하였고, 혼합물의 비등점은 약 104℃ (초기 온도)로부터 약 133℃ (추출 온도)로 변하였으며, 이 기간 동안, 헥산올 약 44% (v/v), 및 나머지 부피는 농축된 바이오매스에서 유래하는 물로 구성된 응축물 약 34 ㎖가 생성되었다. 현탁액은 이어서 응축물 환류 영역에서, 교반 하에 133℃의 온도 (추출 온도)에서 약 10 분간 유지된 후, 여과된 용매 중에 용해된 부분으로부터 불용성 부분을 분리하기 위해, 가열된 채로 필터지로 여과되었다. 가용화된 PHB를 약 0.83% (p/p)로 함유하는 고온의 여과된 물질은 이어서 PHB의 침전을 위해 냉각되고, 여과를 통해 농축되고, 용매의 증발을 거친 후에, 건조되었다. 수득 된 PHB는 분자량이 약 430,000 Da 이었다. 본 시험에서 사용된 농축된 바이오매스의 양은, 채택된 추출 온도에서 용매 중 PHB 포화 농도에 도달하는 데 필요한 양에 비해 약 2.0 내지 3.5 배 더 많았다. 이리하여, 채택된 추출 온도에 대한 용매 (헥산올) 중 용질 (PHB) 포화 농도가 구해질 수 있었다.
헥산올에서의 PHB 추출 시험:
500 ㎖ 둥근 바닥 증류 플라스크에, 건조 물질을 28.11%, 및 분자량이 1,000,000 Da인 PHB를 16.09%로 함유하는, 알칼리제네스 유트로푸스의 농축된 바이오매스 10 g, 및 헥산올 200 g을 첨가하였다. 이어서, 상기 현탁액은, 증류 플라스크에 연결된 가열요를 사용하여 용매 및 물을 증발 처리하고, 이렇게 생성된 두 가지 증기는 응축을 위해 직선관 응축기 (Liebig 타입)로 보내지고, 수득 된 응축물은 Erlenmeyer 용기에 수집되었다. 상기 현탁액을 교반 하에 추출 온도에 도달할 때까지 증발 공정에서 유지시켰다. 온도는, 플라스크 노즐 중 하나에 고정되고 플라스크 내부의 증기 상과 접촉이 유지되는 수은 온도계로 읽었다. 현탁액은 이어서 응축물 환류 영역에서, 교반 하에 133℃의 온도 (추출 온도)에서 약 10 분간 유지되었다. 이렇게 얻어진 물질은 이어서 열 경사분리 공정을 거쳐서, 추출로 인 해 생긴 불용성 고체 잔류물이 용매에 가용화된 PHB로부터 분리될 수 있었다. 용해된 PHB를 함유하는 용액은 PHB의 침전을 위해 냉각시키고, 본 단계에서 추출된 PHB 질량을 측정하였다. 제 1 단계에서 수득한 고체 잔류물에 헥산올 200 g을 새로 첨가하고, 다시 10 분간 추출 처리하였다. 세 추출 단계를 모두 거치도록 다른 절차들도 반복하였다. 세포 바이오매스에 원래 함유된 PHB의 약 64.5%가 제 1 단계에서 추출되었고, 제 2 단계에서 19.0%, 그리고 제 3 단계에서 8.0% 추출되었다. 이렇게 수득 된 PHB의 분자량은 530,000 Da 내지 680,000 Da 범위 이내였다.
공업적 규모로의 연장의 예
건조 물질 28.11%로 농축되고, 분자량이 약 1,000,000 Da인 PHB를 16.09%로 함유하는 알칼리제네스 유트로푸스 바이오매스를, 약 133℃로 유지된 기계 교반 되는 반응기에 500 ㎏/h의 유속으로 공급하고, 여기서 약 133℃로 가열된 헥산올 10,019 kg/h를 액체 및 증기 형태로, 그리고 슬러리에 함유된 과량의 물을 증발시키기에 충분한 양으로 새로 첨가하여, 물 약 20% 및 헥산올 60% (w/w)로 구성된 증기 약 542.6 kg/h 의 스트림, 및 헥산올에 용해된 PHB 및 물, 그리고 추출된 바이오매스의 불용성 잔류물을 함유하는 현탁액 약 9,997 kg/h 의, 조 추출물이라 명명된 또 다른 스트림을 생성한다. 조 추출물은 이어서 수력 사이클론에 연속적으로 공급되는데, 여기서 상기 흐름은 하기 두 개의 스트림으로 분리된다: 공급된 조 추출물에 원래 함유된 불용성 고체를 약 35%로 함유하고, 공급 흐름의 약 75%에 해당하는 상부의 스트림; 및 공급된 흐름에 원래 함유된 불용성 고체를 65%로 함유하고, 공급된 흐름의 약 25%에 해당하는 하부의 또 다른 스트림. 불용성 고체가 결 핍된, 수력 사이클론의 상부 스트림은 이어서 7,482 kg/h의 유속으로 막 미세여과 단위로 공급되어, 추출된 바이오매스의 잔류 불용성 고체가 농축된 스트림 약 1,247 kg/h (1/6), 및 추출된 바이오매스의 잔류 불용성 고체가 없는 투과액 스트림 6,235 kg/h (5/6)을 생성한다. 상기 공정에서의 체류 시간은 약 10 분이다. 수력 사이클론으로부터의 불용성 고체가 농후한 스트림 (하부상), 및 막으로부터의 불용성 고체가 농후한 스트림은 이어서 혼합되고, 3,741 kg/h의 유속으로, 예를 들면 판상 필터의 여과 단계로 보내져서, 현탁액 중의 불용성 고체가 없는 PHB 용액인 스트림 약 3,90 kg/h, 및 추출된 바이오매스의 불용성 고체를 함유하는 분말 약 151.5 kg/h를 생성한다. 상기 공정의 PHB 회수는, 바이오매스 흐름 및 순도에 따라, 바이오매스의 공급된 PHBV에 대해 95% (중량/중량) 초과, 즉 70 내지 80 kg의 PHBV/h 이다. 막 및 필터 추출 공정 모두에서 수득 된 여과액은, 용매 중의 PHBV 침전을 보장하기 위해 약 45℃ 이하의 온도로 급속히 냉각된다.
실시예 1.5: 취성이고 용이하게 전단 가능한 다공도의 과립 결집체를 수득하기 위한, 아이소아밀 알코올 중 PHB 현탁액의 부분적 용매 증발 및 세척
PHB를 4 내지 10% 함유하는 아이소아밀 알코올 및 물의 용액 중 PHB 현탁액을, 용해된 아이소아밀 알코올을 함유하고 추출 및 정제 공정에서 회수된, 유속 500 내지 1000 kg/h의 물 스트림과 함께, 유속 1,000 kg/h으로 진공 증발기에 공급한다. 상기 혼합물은 이어서 연속적으로 직접 증기 주입을 통한 증발 처리하여, 증발에 의한 용매의 제거와 동시에, 용매, 물 및 PHB 과립의 결집체를 함유하는 현탁액을 수득하는데, 상기 결집체는 시스템의 순환 펌프에 설치된 기계장치를 통해 연속적으로 전단 된다. 상기 공정에서 얻어지는 물질은, 물 및 거기에 용해된 아이소아밀 알코올에 미세하게 분산된 PHB 입자의 현탁액으로서, 이는 현탁액 중 PHB 입자의 농도 4 내지 20% (중량/중량)으로써 시스템으로부터 연속적으로 제거되고 용매 추출의 다음 단계로 보내진다.
실시예 1.6: 미세하게 분산된 PHB 입자의 현탁액으로부터의 아이소아밀 알코올 (용매)의 추출, 및 동시적인 생성물의 세척 및 세분화
실시예 1.5에서 예시된 바와 같이 수득 된, 고체를 2 내지 20%로 함유하는, 미세하게 분산된 PHB 입자의 현탁액을 교반 되는 용매 추출 (탈거) 반응기에 1000 kg/h의 유속으로 공급하는데, 여기서는 증기 및 물이, 일부의 물과 함께 물에 용해된 아이소아밀 알코올이 제거될 때까지 직접적인 접촉에 의해 유입되며, 상기 제거 물은 시스템의 용출 증기 상을 형성한다. 잔류 아이소아밀 알코올의 증발과 동시에 그리고 연속적으로, PHB 입자의 수중 현탁액은, 실시예 1.5에 기재한 것과 유사한 장치를 통해 부가적 전단 공정을 거친다. 용매 추출 공정의 완료 시, 실질적으로 순수하고 용매가 없는, 미세하게 분산된 PHB 수중 현탁액이, 현탁액 중 고체 5 내지 20%의 농도로 얻어진다. 이 현탁액은 이어서 냉각되고 여과 단계로 보내지며, 여기서 실질적으로 건조된, 습도 약 50 내지 80%의 PHB 분말이 얻어진다.

Claims (44)

  1. 박테리아의 세포 바이오매스로부터 폴리하이드록시알카노에이트(PHA)를 회수하는 방법으로서, 상기 바이오매스는 발효에 의해, 그리고 수성 현탁액 중 세포 바이오매스 슬러리의 형태로 얻어지고 건조 세포 함량이 18 중량% 이상이며, 상기 방법은 하기 단계를 포함하는 것인 방법:
    i) 농축된 세포 바이오매스 슬러리를, PHA를 용해시킬 수 있는 용매 주입, 격렬한 교반, 및 반응기 내부에서의 신속한 가열의 동시적 조작으로 처리하여서, 세포 바이오매스의 벽의 파괴 및 세포 바이오매스에 함유된 PHA의 용해를 유발하되, 여기서 발효된 세포 바이오매스의 가열 단계, 세포 바이오매스의 벽의 파괴 단계 및 세포 바이오매스에 함유된 PHA의 용해 단계를 분자량 최소 1,000,000 Da의 PHA를 함유하는 바이오매스로부터 분자량 최소 850,000 Da의 PHA를 수득하기에 충분하게 짧은 전체 시간 내에 실시하며, 용해된 PHA가 농후한 PHA를 용해시킬 수 있는 용매, 세포 바이오매스 슬러리로부터 잔존하는 물, 및 농축된 세포 바이오매스의 불용성 잔류물을 포함하는 현탁액을 형성하는 단계;
    ii) 반응기에서 형성된 현탁액을 분리 단계로 처리하여, 잔존하는 세포 바이오매스의 불용성 잔류물로부터, 용해된 PHA가 농후한 용매를 회수하는 단계;
    iii) PHA가 농후한 PHA를 용해시킬 수 있는 용매의 용액을, 팽창에 의해, 또 다른 냉각기 스트림과의 열교환을 통해, 및/또는 열교환기에 의한 냉각에 의해 수 초 안에 용해된 PHA를 모두 침전시키기에 충분한 온도로 급속히 냉각시키는 단계;
    iv) 물 및 이에 용해된 불순물을 함유하는, PHA를 용해시킬 수 있는 용매 중에 침전된 PHA 현탁액을 45℃ 이하에서 미세여과하여서, 침전된 PHA의 농축된 페이스트를 분리하는 단계;
    v) PHA가 농축된 페이스트를, 물로 세척, 가열 및 교반의 동시적 조작으로 처리하여, 취성이고 용이하게 전단 가능한 다공도의 PHA 과립, 잔존하는 용매 및 물을 함유하는 현탁액을 수득하기에 적당한, 일정량의 용매의 증발을 촉진하는 단계;
    vi) 잔존하는 용매 및 물을 함유하는 현탁액 중으로 수증기를 주입하여 잔류 용매 추출을 진행하면서, 세척 및 가열된 PHA 과립을 교반 및 전단 처리하여 급속히 파쇄하여, 현탁액 중의 정제된 PHA 입자를 수득하는 단계; 및
    vii) 현탁액으로부터 정제된 PHA 입자를 분리하는 단계.
  2. 제1항에 있어서, 사용되는 PHA를 용해시킬 수 있는 용매가 뷰틸 아세테이트, 아이소뷰틸 아세테이트, 아밀 아세테이트, 아이소아밀 아세테이트, 아이소뷰틸 알코올, 1-뷰탄올, 1-펜탄올(아밀 알코올), 2-메틸-1-뷰탄올, 3-메틸-1-뷰탄올(아이소아밀 알코올), 3-펜탄올, 1-헥산올, 사이클로헥산올, 프로필 프로피오네이트, 뷰틸 프로피오네이트, 아이소뷰틸 프로피오네이트, 에틸 뷰티레이트, 아이소뷰틸 아이소뷰티레이트, 및 이들 용매의 혼합물로 이루어진 용매 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  3. 제2항에 있어서, 사용되는 용매가 아이소아밀 알코올, 또는 아이소아밀 알코올의 이성체 혼합물인 방법.
  4. 제3항에 있어서, 아이소아밀 알코올이 에탄올 발효의 부산물인 퓨젤유(fusel oil)의 분별증류에 의해 수득 되고, 상기 퓨젤유는 근본적으로 아이소아밀 알코올 및 그의 이성체들, 그밖에 에탄올, n-프로판올, 아이소뷰탄올, n-뷰탄올 및 물 등의 불순물로 구성되는 것인 방법.
  5. 제1항 또는 제4항에 있어서, PHA가 폴리-3-하이드록시뷰티레이트(PHB), 폴리(하이드록시뷰티레이트-코-하이드록시발레레이트)(PHBV), 및 이들 중합체 및 공중합체의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  6. 제5항에 있어서, PHA가, 사탕수수로부터 추출된 설탕을 주원료로서 사용하여 PHA를 생합성할 수 있는 미생물을 사용한 박테리아 발효에 의해 생산되고, 본 방법에 필요한 열에너지 및 전기에너지를 발생시키는 데 사용되는 주요 에너지 공급원이 사탕수수 찌꺼기인 방법.
  7. 삭제
  8. 제1항에 있어서, 발효를 통해 수득 되고 가공될 박테리아 세포 바이오매스가 미리 열적으로 불활성화되는 방법.
  9. 제1항에 있어서, 용매를 농축된 세포 바이오매스 슬러리에 주입하는 단계가, PHA를 용해시킬 수 있는 액상 용매 및 PHA를 용해시킬 수 있는 증기 형태의 용매를 주입하여, 대기압에서 90℃ 내지 용매의 비등점의 온도로의 세포 바이오매스의 가열을 유발하고, PHA가 농후한 PHA를 용해시킬 수 있는 용매 및 세포 바이오매스 슬러리로부터 잔존하는 물을 포함하는 액체상; 잔류 세포 바이오매스의 불용성 잔류물로 정의되는 고체상; 및 물의 증기 및 PHA를 용해시킬 수 있는 용매의 증기를 함유하는 증기 상을 형성하는 조작을 포함하는 방법.
  10. 제9항에 있어서, 반응기 내부로부터 증기 상을 추출하는 부가적 단계를 포함하는 방법.
  11. 제9항에 있어서, PHA 페이스트가, 세포 파괴 및 PHA 용해의 단계 중에 반응기로부터 추출된 증기 상의 응축에서 유래하는 물 스트림으로 세척되는 방법.
  12. 제1항에 있어서, 농축된 세포 바이오매스 슬러리가, 발효된 배지 중의 현탁액 상태인 세포 바이오매스를 세포 바이오매스의 응집 및 농축 조작으로 처리함으로써 수득되는 것인 방법.
  13. 제12항에 있어서, 공정에 공급되는, 발효된 배지 중의 현탁액 상태인 세포 바이오매스가, 발효 물질:물의 질량비가 3.0:1.0 이하를 나타내도록 물로 추가 희석되는 방법.
  14. 제13항에 있어서, 응집 조작이, 희석된 세포 바이오매스를 1.5 내지 5.5의 pH로 산성화시키고, pH 7 내지 12에 도달할 때까지 알칼리화제를 첨가함으로써 실행되는 세포 바이오매스의 응결 단계를 포함하며, 축적된 PHA를 함유하는 세포 바이오매스의 응집 조작은 응집제의 첨가를 통해 실시되는 방법.
  15. 제14항에 있어서, 희석된 세포 바이오매스의 산성화가, 황산 및 인산 중 하나 이상으로 정의되는 산을 첨가함으로써 이루어지는 방법.
  16. 제14항에 있어서, 알칼리화제가 수산화칼슘을 포함하는 것인 방법.
  17. 제14항에 있어서, 산성화가 2.0 내지 3.0의 pH를 수득하도록 실시되고, 알칼리화제의 첨가는 희석된 세포 바이오매스의 현탁액의 pH를 7 내지 12의 범위로 조정하기 위해 이루어지는 방법.
  18. 제13항에 있어서, 응집 조작이, pH 7 내지 12에 도달할 때까지 알칼리화제를 첨가함으로써 세포 바이오매스를 응결시키는 단계를 포함하며, 축적된 PHA를 함유하는 세포 바이오매스의 응집이 응집제의 첨가를 통해 이루어지는 방법.
  19. 제18항에 있어서, 알칼리화제가 수산화칼슘을 포함하는 것인 방법.
  20. 삭제
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  26. 제12항에 있어서, 응집된 바이오매스 세포의 농축이 경사분리 및 원심분리 조작 중 하나 이상에 의해 수득되는 방법.
  27. 제12항에 있어서, 발효되고 응집된 배지 중의 현탁액 상태인 세포 바이오매스 슬러리가 물로 세척되고, 건조 세포 바이오매스 중량의 18% 내지 45%의 범위로 농축되는 방법.
  28. 제26항 또는 제27항에 있어서, 세포 바이오매스 슬러리를 세척하고 농축시키는 단계가, 세포 바이오매스 슬러리를 흐르는 물 및 원심력의 작용으로 동시에 처리함으로써 이루어지는 방법.
  29. 제1항에 있어서, 세포 바이오매스 슬러리로 주입되는 PHA를 용해시킬 수 있는 액상 용매가 가열되는 방법.
  30. 제1항에 있어서, 반응기 내부에서 형성된 현탁액 중에 함유된, 잔존하는 바이오매스의 불용성 잔류물로부터, 용해된 PHA가 농후한 PHA를 용해시킬 수 있는 용매를 분리하는 단계가, 막 미세여과(membrane micro-filtration) 및 프리코트 필터(precoat filter) 여과의 조작 중 하나 이상을 포함하는 방법.
  31. 제1항에 있어서, 반응기 내부에서 형성된 현탁액 중에 함유된, 잔존하는 바이오매스의 불용성 잔류물로부터, 용해된 PHA가 농후한 PHA를 용해시킬 수 있는 용매를 분리하는 단계가, 상기 현탁액을 낮은 강도의 원심력의 작용에 의해 분리하는 단계를 포함하는 방법.
  32. 제31항에 있어서, 용해된 PHA가 농후한 PHA 용액으로부터, 반응기 내부에서 형성된 현탁액 중에 함유된, 잔존하는 바이오매스의 불용성 잔류물을 분리하는 단계에서 사용되는 낮은 강도의 원심력이 수력 사이클론(hydrocyclone)에 의해 수득 되어, 낮은 농도의 상기 잔류물의 현탁액 및 상기 잔류물이 농축된 또 다른 현탁액을 생성하는 방법.
  33. 제32항에 있어서, 수력 사이클론에서 배출되는, 낮은 농도의 바이오매스 불용성 잔류물의 현탁액이, 냉각 단계로 가기 전에 잔류물을 완전히 제거하는 부가적 분리 단계를 신속히 거치는 방법.
  34. 제33항에 있어서, 상기 부가적 분리 단계가 막 미세여과에 의해 실행되어, 불용성 잔류물이 없는, PHA를 용해시킬 수 있는 용매에 용해된 PHA의 용액, 및 바이오매스 불용성 잔류물이 농축되고, PHA를 용해시킬 수 있는 용매에 용해된 PHA의 일부, 물, 회분 및 PHA를 용해시킬 수 있는 용매에 용해된 착색 화합물을 함유하는 현탁액을 생성하는 방법.
  35. 제34항에 있어서, 세포 바이오매스의 불용성 잔류물이 농축된 현탁액을 여과 단계로 처리하여, 바이오매스 불용성 잔류물을 함유하는 분말(meal), 및 불용성 잔류물이 없고 냉각 단계로 신속히 처리되어야 할, 용매에 용해된 PHA의 여과된 용액을 생성하는 방법.
  36. 제34항에 있어서, 불용성 잔류물이 없는, PHA를 용해시킬 수 있는 용매에 용해된 PHA의 용액이 미세여과에서의 현탁액의 60 내지 90 중량%에 해당하고, 세포 바이오매스의 잔류물이 농축된 현탁액은 미세여과에서의 상기 현탁액의 10 내지 50 중량%에 해당하는 방법.
  37. 제32항에 있어서, 수력 사이클론에서 배출되는, 바이오매스 불용성 잔류물로 농축된 현탁액이, 냉각 단계로 가기 전에 바이오매스 불용성 잔류물을 분리하기 위한 여과 단계를 거치는 방법.
  38. 제1항에 있어서, PHA를 용해시킬 수 있는 용매 중에 침전된 PHA의 현탁액을 냉각 미세여과하는 단계를 실시하여, PHA 농도가 3.5 중량% 내지 8.0 중량%인 PHA 페이스트를 생성하는 방법.
  39. 제1항에 있어서, 용매가 고갈된 수성 매질로부터 분리된 PHA 입자를 건조하는 최종 단계를 추가로 포함하는 방법.
  40. 제1항에 있어서, 공정의 몇 단계에서 발생하는 물 및 PHA를 용해시킬 수 있는 용매 증기가 응축되고 하기 두 개의 액체상으로 분리되는 방법: PHA 추출 및 회수 단계에서 공정으로 되돌아가는 하나의 용매-농후 액체상; 및 함유된 PHA를 용해시킬 수 있는 용매를 회수하도록 공정 중에 재순환되는 또 다른 용매-결핍 액체상.
  41. 삭제
  42. 제1항에 있어서, 분리 및 냉각 단계가, 분자량 최소 750,000 Da의 PHA를 수득하기에 충분히 짧은 시간 내에 실행되는 방법.
  43. 제1항에 있어서, 건조 후에 단계 (vi)에서 수득되는 PHA 과립의 평균 입자 크기가 40 내지 400 ㎛의 범위인 방법.
  44. 삭제
KR1020067012268A 2003-11-28 2004-11-25 세포 바이오매스로부터 폴리하이드록시알카노에이트(˝ｐｈａｓ˝) 를 회수하는 방법 KR101130191B1 (ko)

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