CN1886517A - 从细胞生物质回收多羟基链烷酸酯(PHAs)的方法 - Google Patents

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Abstract

从细菌的细胞生物质回收多羟基链烷酸酯(PHA)的方法，所述生物质通过发酵得到并且为水性悬浮液中的细胞生物质浆液的形式，所述方法包括步骤：将所述浆液进行注射PHA溶剂、搅拌和加热的操作，以便形成悬浮液，该悬浮液包含溶解的PHA、水和不溶性残渣以及PHA溶剂；复原富含PHA的溶剂；将PHA溶剂的溶液快速冷却以沉淀溶解的PHA；微量过滤溶剂中沉淀的PHA的悬浮液，以便分离浓缩所沉淀的PHA的糊状物，用水洗涤，加热并搅拌所浓缩的PHA糊状物，以促进溶剂的蒸发并得到含有PHA颗粒的悬浮液；搅拌和剪切PHA颗粒并耗尽残留的溶剂；并从悬浮液分离所纯化的PHA颗粒。

Description

从细胞生物质回收多羟基链烷酸酯(PHAs)的方法
发明领域
本发明涉及通过使用对环境无危害的非卤代溶剂从细菌的湿润生物质提取和回收多羟基链烷酸酯(polyhydroxyalkanoate)(PHAs)的已经证明在工业上可行的方法，该方法允许通过使用可再生的原材料和能源得到高纯度和高分子量的多羟基链烷酸酯(PHA)，所述原材料和能源通常来自使用甘蔗的糖和醇工业。
发明背景
当前在全世界工业中已知需要通过使用可再生的原材料和能源通过对环境无危害的方法产生生物可降解的和生物相容的材料。
在现代社会，尽管大规模使用塑料材料代表技术发展历史中的一个标志，但是这些材料的不断增多的应用正导致多种严重的环境问题。对于石化来源的塑料树脂工业，年产量为约2亿吨。这些材料非常耐自然降解，主要在大城市中心周围的处置区快速积累。由于这些问题，生物可降解的塑料树脂的发展已经受到全世界关注，主要是使用可再生资源通过清洁技术产生的那些塑料树脂。考虑这些事实的相关性，使用这些新材料的市场潜力是巨大的。
在市场中具有巨大成功机会的这些生物可降解的生物聚合物的应用涉及诸如一次性材料的产品，例如，包装、化装品或者毒性农药容器、医学和药学物品，等等。
生物可降解的生物聚合物的一个重要家族是多羟基链烷酸酯(PHAs)，其是许多生物天然合成的聚酯。在文献中描述了170种以上的代表物质，对PHA的商业兴趣不仅直接涉及生物可降解性，还涉及它们的热-机械性质和生产成本。从而，只有一些PHA已经发现了工业应用，最具代表性的是PHB(聚-3-羟基丁酸酯)、PHB-V(聚(羟基丁酸酯-共-羟基戊酸酯))、P4HB(聚(4-羟基丁酸酯))、P3HB4HB(聚(3-羟基丁酸酯-共-4-羟基丁酸酯))和一些PHAmcl(中等链的多羟基链烷酸酯)，该最后家族的典型的代表是PHHx(多羟基己酸酯)。
PHA的化学结构可以描述为下面的单位重复形成的聚合链：
其中R为可变长度的烷基或者链烯基，m和n为整数，在上述聚合物中，R和m具有下面的值：
PHB：R＝CH3，m＝1
PHB-V：R＝CH3或CH3-CH2-，m＝1
P4HB：R＝H，m＝2
P3HB-4HB：R＝H或CH3，m＝1或2
PHHx：R＝CH3-CH2-CH2-，m＝1
多数PHA可以以常规挤出和注射设备加工，不需要重大修改以得到良好加工。还可以在铸型和涂布膜系统中加工这些聚合物以用作例如，食品工业中的包装材料。
随着这些聚合物的发展阶段，可能使用它们生产短期使用的个人卫生产品的包装，其具有低的每平方米克重。它们还可以用于生产农药、机油、一次性尿布等等的容器和包装。此外，当需要生物可降解性的内在性质时，PHA可以根据确定的技术和商业方面应用，如：垃圾袋、高尔夫球球座、钓鱼用品和直接与在户外处理塑料材料有关的其他产品。
在农业中，PHA可以应用于植物罐、再生林管、温室和覆盖膜和主要应用于控释系统的营养物、肥料、除草剂和杀虫剂。对于生物医学应用，PHA可以用于微囊化控释药物、医学缝线和骨折固定针，这是由于它们的总的生物相容性和接受的生物对存在异物的小反应性。此外，由于体内生物降解速率非常低但是是连续并且完全的，PHA呈现出作为可再吸收的假体的基本结构应用的极好的潜力。
在过去20年里，自然科学，特别是生物技术中的巨大发展已经使得可以在PHA的商业生产中使用最不同的天然或者遗传修饰的生物。对于本发明尤其相关的是使用所确定的细菌菌株，其能够产生并在它们内部积累这些聚合物的表达量。在特定条件下培养，这些细菌菌株可以使用不同的可再生的原材料，如甘蔗、糖蜜或者水解的纤维素提取物，所述特定条件允许达到高细胞密度、细胞内聚合物的高含量，和与工业方法相容的产率。
尽管已经尝试直接(in natura)应用细菌细胞(不使用PHA溶解剂)作为可模压材料，如美国专利3107172中公开，但是多数情况下PHA的商业应用需要足够高的纯度来得到所希望的塑料性质。为了实现加工生物聚合物，特别是PHA的足够的纯度水平，存在通常需要的步骤，其中利用溶剂从残留生物质提取和回收PHA是必不可少的。在专利EPA-01455233 A2中，描述了消化含有PHA的细胞的含水悬浮液的几种可能性，其中使用酶和/或表面活性剂溶解非-PHA细胞材料。该专利提到了作为对使用溶剂的方法的可能的限制的事实，即它们需要大量溶剂并且因此具有高生产成本。然而，它提到如果希望高纯度产品，那么溶剂步骤不能除去。此外，尽管用于该方法的酶以相对低的量(相对于干细胞物质的1％)加入，但是它们非常昂贵并且不能在该方法中回收，这与使用溶剂时相反。而且，需要高度稀释细胞材料，这导致在该方法中产生大体积的流出物。
通常提出的提取方法基本上在于将含有所述生物聚合物的干燥或湿润的细胞生物质以强烈接触暴露于溶解它的溶剂，然后是分离细胞残渣的步骤。然后向含有生物聚合物的溶液加入不溶试剂，其导致生物聚合物在溶剂中沉淀(见，例如，巴西专利PI 9103116-8，其在1991年7月16日提交，1993年2月24日公布)。
在文献中通常引用的通过有机溶剂从细菌生物质提取和回收PHA的提取方法中，所用的溶剂是部分卤代的烃，如氯仿(专利US-3275610)、二氯甲烷-乙醇(US-3044942)、沸点在65到170℃的氯乙烷和氯丙烷、1，2-二氯乙烷和1，2，3-三氯丙烷(专利EP-0014490 B1和EP 2446859)。
其他卤代化合物，如二氯甲烷、二氯乙烷和二氯丙烷在美国专利4,562,245(1985)、4,310,684(1982)、4,705,604(1987)和欧洲专利036.699(1981)和德国专利239.609(1986)中引用。
使用卤代溶剂从生物质提取和纯化生物聚合物的方法在现今是完全禁止的，因为它们对环境和人的健康高度危害。因此用作从细胞生物质提取生物聚合物的潜在提取剂的溶剂将首先满足不危害环境的条件。
在该意义上，巴西专利PI 9302312-0(1993年提交并在2002年4月30日授权)给出了从细菌生物质提取生物聚合物的方法，其使用具有三个碳的长链醇或者其乙酸酯衍生物作为溶剂。该专利优选异戊醇(3-甲基-1-丁醇)、乙酸戊酯(或者戊基-乙酸酯)和杂醇油，其是作为醇发酵的副产物得到的高级醇的混合物并且含有主要成分异戊醇。该专利的特征是使用一种溶剂作为提取剂或者纯化剂，不需要使用不溶试剂或者反萃溶剂和/或边际非溶剂(marginal non-solvent)。通过冷却溶液进行PHA溶液的溶质(生物聚合物)的沉淀。
美国专利6,043,063(1998年4月14日提交，并且在2000年3月28日授权)，US 6,087,471(1998年4月14日提交，并且在2000年6月11日授权)和国际专利申请WO-98/46783(1997年4月15日提交)公开了非卤代溶剂的广泛列表，所述溶剂可以潜在的用作从生物质提取生物聚合物的溶剂，但是它们的许多具有诸如难以工业操作、毒性、以及高成本的特点。在所述广泛列表(还包括巴西专利PI9302312-0中引用的溶剂)中，由于与生物聚合物的不相容性问题，或者由于它们的毒性、可爆性和高成本，仅少数溶剂具有工业上用于从植物或者细菌生物质提取生物聚合物的潜力。此外，巴西专利PI96102256(1996年8月16日在巴西提交，1999年7月6日公布)甚至更具选择性，因为其中用于从植物或细菌生物质提取生物聚合物的可能溶剂包括除了矿物油和植物油、碳气(carbonic gas)(超临界并且昂贵的提取技术)外，还包括对人的健康具有高度毒性的化合物。同时，该专利陈述了必须避免可能对健康和环境有害的溶剂。
因为所述生物聚合物是热敏感的，即当置于高于确定值的温度时，它们不可逆地降解，减小分子量，这可以肯定影响它们表现为热塑塑料的性质，必须记住具有工业应用潜力的溶剂列表甚至更严格。
如果所选溶剂与允许提取生物聚合物而不导致它的分子量显著改变的适当方法结合，那么该溶剂促进生物聚合物的提取的工业应用潜力将增加。值得注意地，对于需要加热到高于70℃来溶解生物聚合物的溶剂，在处理期间该生物聚合物暴露于该温度的时间越长，其越可能分解，该事实可以不可挽救地损害它的热塑性性质。在提取过程中PHA受到的改变越小，它的可能的商业应用的范围就越宽。
如在文献中教导的，生物聚合物，特别是PHA的降解动力学遵守0级反应(见例如，硕士学位论文：Berger，E.，′Elaboration destechniques de separation pour des biopolymeres d′originebacterienne：les acides poly-β-hydroxyalcanoiques′，Departement de Genie Chimique-Ecole Polytechnique-Universitede Montreal，Canada，1990，pages 72-75)。将它的分子量降解与在温度T下暴露的时间的比考虑为dMW/dt，定义该降解的方程是：
(dMW/dt)T＝k        (1)
其中：
k：是给定温度T下给定溶剂的常数。
从而，如果方程(1)对时间间隔0-t积分，那么我们得到：
MWT＝k.t+MWo    (2)
其中：
MWT：是在溶剂S中对于给定温度T，经过提取时间t后生物聚合物的分子量；
MWo：是进行提取前在时间t＝0时，生物质中所含生物聚合物的分子量；
K：是给定温度T和溶剂S的比例常数。
作为实例，将含有干基70％PHB的干燥真养产碱菌(Alcaligeneseutrophus)的20g生物质与1500g异戊醇(技术级)在110℃混合，将混合物进行不同时间的提取并过滤从生物质除去不溶颗粒。然后将所得PHB溶液快速冷却到30℃以保证PHB的沉淀，随后将其过滤并在室温下空气流中干燥直到完全除去溶剂。然后，通过GPC技术(凝胶渗透层析法)估计PHB的分子量，通过线性回归进行数学调整后，得到下面的降解方程：
MWT＝-9753.81.t+1,000,000，R2＝0.98        (3)
其中：
MWT：是在异戊醇中110℃下提取后多羟基丁酸酯的分子量(道尔顿)；
T：是在异戊醇中多羟基丁酸酯暴露于110℃的提取温度的时间(分钟)；
R：是调整方程与实验点的相关系数。
从而，根据方程(3)，将最初分子量为1,000,000Da的多羟基丁酸酯在异戊醇中110℃下提取5分钟后所得分子量为951,230Da；暴露15分钟后分子量为853,692Da；暴露30分钟后分子量为707,410Da；暴露60分钟后分子量为414,771Da；暴露90分钟后分子量为122,230Da。
考虑到为了得到具有良好力学性质的纯产物，除了提取外，还需要进行其他操作，如蒸发和干燥溶剂，并且这些操作多次将生物聚合物暴露于该材料的临界条件，因此不难想象处理该类型材料的内在困难。除了溶剂外，还希望拥有不热降解产物的适当方法。
从而，作为例证，在下表中给出在美国专利6,043,063中提到的溶剂和它们各自的PHA提取温度(以括号中摄氏度给出)：丁酸乙酯(120℃)、丙酸丙酯(118℃)、乙酸丁酯(120℃)、丙酸丁酯(123℃)、乙酸四氢糠酯(121℃)、丙酸甲酯(75℃)、正戊酸甲酯(115℃)、1-丁醇(116℃)、2-甲基-1-丁醇(117℃)、3-甲基-1-丁醇(125℃和126℃)、1-戊醇(125℃和126℃)、3-戊醇(115℃)、戊醇(128℃)、1-己醇(134℃)、二乙酸乙二酯(137℃)、四氢糠醇(117℃)、甲基-戊基-酮(120℃)、甲基-异丁基-酮(115℃)、苯乙酮(110℃)、1，2-二氨基丙烷(115℃)、α-甲基苯乙烯(126℃)、二甲基亚砜(117℃)、丙烯碳酸酯(110℃)、1，2，3-三甲基-苯(121℃)、二甲基乙酰胺(acetamine)(90℃)和二甲基甲酰胺(90℃)。仅当这些溶剂与其中几乎不发生生物聚合物暴露于热降解的有效过程结合时，这些溶剂才将具有工业应用潜力。然而，没有提及所得物质的性质，特别是涉及产物的分子量的性质。
关于该PHA提取方式的工业可行性的其他相关事实是，因为它是高能量消耗的方法，所以我们将记住产品的可行性还与低成本的可再生能源的可用性密切相关。
考虑到上述所有因素，通常是生物可降解性的性质和PHA的可维持性，尽管它们有理由比石化工业的传统聚合物具有更高价格，但是市场吸收这些价格的可能性非常有限(Braunegg G，Lefebvre G，Genser FK(1998)Polyhydoxyalkanoates，biopolyesters fromrenewable resources：Physiological and engineering aspects.J.Biotech.65：127-161)。
从而，用于生产PHA的工业方法应该考虑：以简单有效的生产方案，高效将原材料转化成聚合物的微生物菌株；低成本和高产率的原材料；提取和纯化聚合物的方法，其允许得到高纯度产物，最大程度地保存生物聚合物的最初特征，具有高产率和效率和不危害环境。
除了这些经济方面外，因为它是环境友好的产物，所以其整个方法应该是相容的。从而，应该避免在任何生产步骤中使用环境有害的产品。此外，用于允许生产过程的能源应该来自可再生的来源。如果仅使用非可再生的能源，那么生产低环境影响的塑料将是不可能的。该问题的一个非常有趣的解决方法是将生物塑料的整个生产链整合到农业-工业，尤其整合到糖和醇工业(Nonato，R.V.，Mantelatto，P.E.，Rossell，C.E.V.，″Integrated Production of BiodegradablePlastic(PHB)，Sugar and Ethanol″，Appl.Microbiol.Biotechnol.57：1-5，2001)。
在生产替代燃料中取得的最大的世界范围成功之一是巴西的糖和醇工业，其占地球上生产的糖和醇的总量的约25％。尽管PROALCOOL巴西计划的开始表现出环境负面影响，但是该类型的工业实际上是可持续技术的一个实例。运行生产过程所需的所有能量都在现场(in loco)产生，通过在锅炉中燃烧甘蔗渣来产生热和电能。此外，过量能量可以用于其他整合的工业过程。可再生并且便宜的能量联合便宜原材料的可得性(如作为酒精发酵副产物的糖和糖蜜和天然溶剂)使得糖和醇工业是生产生物塑料的理想摇篮。
因此，本发明包括所有上面引用的特征，所述特征是使得回收多羟基链烷酸酯(PHA)，优选从湿润细菌生物质回收多羟基链烷酸酯的工业方法可行所必需的，所述方法使用对环境无危害的非卤代溶剂，通过使用来自使用甘蔗的糖和醇工业的可再生的原材料和能源，产生高纯度和高分子量的产物。
发明概述
本发明涉及已经证明是工业上可行的从细菌细胞生物质提取和回收多羟基链烷酸酯(PHA)的方法，所述生物质通过发酵得到并且为水性悬浮液中的细胞生物质浆液的形式，并且干细胞物质含量不低于悬浮液的约18wt％。在实施本发明的可能方法中，通过将发酵培养液中悬浮的细胞生物质进行生物质细胞的絮凝和浓缩作用得到浓缩的细胞生物质。
根据该方法，将浓缩的细胞生物质最初进行PHA提取步骤，其包括同时进行PHA溶剂注射、剧烈搅拌和在反应器内快速加热，以便形成悬浮液，该悬浮液包含富含溶解的PHA的PHA溶剂、来自细胞生物质的浆液的剩余水和浓缩的细胞生物质的不溶残渣。
然后将反应器中形成的悬浮液分离，以从细胞生物质的剩余不溶残渣回收富含溶解的PHA的溶剂。然后，将富含PHA的PHA溶剂溶液快速冷却到足以基本上沉淀所有溶解的PHA的温度。该方法还包括步骤：
对在含有水和其中溶解杂质的PHA溶剂中沉淀的PHA悬浮物进行冷微量过滤，以便分离所沉淀PHA的浓糊状物；
将浓PHA糊状物进行用水洗涤、加热和搅拌的同时操作，以便促进一定量溶剂的部分蒸发，这足够得到含有PHA颗粒的悬浮液，其具有高孔隙率并且是脆性的并且容易剪切，还得到剩余的溶剂和水；
将所洗涤和加热的PHA颗粒进行搅拌和剪切，以便将它们快速破裂，通过在含有剩余溶剂和水的悬浮液中注射水蒸气处理残留溶剂的提取物，以便得到悬浮液中的纯的PHA颗粒；和
从悬浮液分离纯化的PHA颗粒。
从所发现的PHA得到具有工业应用性并且用于本发明的那些PHA为：聚-3-羟基丁酸酯(PHB)、聚(羟基丁酸酯-共-羟基戊酸酯)(PHBV)、和这些聚合物和共聚物的混合物。
附图简述
下面将参考作为实施本发明的可能方法的实例给出的所公开的附图描述本发明，其中图1是所述方法的简化的流程图。
发明详述
在下面描述本发明的说明书中使用的术语的一组定义：
“链烯基”指从C1到Cn的不饱和碳链，其中n为2到约20，该碳链可以是线性的、分枝的或者环状的，并且不饱和可以是单不饱和的，即在碳链中具有一个双键或者三键；或者多不饱和的，即具有两个或多个双键，或者具有两个或多个三键，或者在碳链中仍然具有一个或多个双键和一个或多个三键。
“烷基”指从C1到Cn的饱和碳链，其中n为2到约20，该碳链可以是线性的、分枝的或者环状的。
“细胞生物质”指来自任何微生物或者植物的生物质，所述微生物或者植物能够天然产生PHA或者通过遗传修饰而产生PHA，使得其是PHA生产者或者高PHA生产者。
“包含”指其他步骤、或者其他阶段、或者其他化合物，或者其他成分(它们不影响最终结果)可以加入或者可以存在。该术语还可以替代或者代替术语“由…构成”、“构成为”、“基本上由…构成”和“基本上构成为…”。
“Da”指道尔顿，其是测量聚合物分子量的单位。
“从生物质提取多羟基链烷酸酯”指从产生一种类型的PHA的生物质提取所产生的确定的PHA，并且它还表示对于其中产生PHA的生物质产生一种以上类型的PHA的情况下，提取生物质产生的一种以上类型的PHA。
“粗提取物”指由PHA溶剂和不溶性固体构成的悬浮液，其中所述PHA溶剂富含从PHA细胞生物质提取的PHA，含有其中溶解的水和从细胞生物质提取的杂质，所述不溶性固体是从中提取PHA的细胞生物质的残渣。
“多羟基链烷酸酯”和“PHA”指包括下面的重复单位的聚合物：
Figure A20048003509200161
其中R优选为H或者烷基或者链烯基，m为1到4。
“基本上大气压”指与大气压非常接近的压强，即，等于或者稍微高于或者稍微低于大气压。
“提取反应器”指装置，在该装置中进行从产PHA的细胞生物质提取PHA的操作。
“快速冷却”液流(溶液或者悬浮液)指：在几秒内冷却该液流(溶液或者悬浮液)，这可以通过膨胀，通过与另一冷却流的热交换和/或通过热交换器冷却。
“溶剂”指能够溶解称作溶质的其他物质，以便形成称作溶液的混合物的物质，所述溶液中溶质在分子大小或离子大小方面均匀地分散在溶剂中。
“PHA溶剂”指能够溶解多羟基链烷酸酯的物质。
“富集的PHA溶剂”或者“富集的PHA溶剂溶液”指含有从产生PHA的细胞生物质提取的PHA的PHA溶剂溶液。
“基本上无”或者“几乎无”指“具有非常小量的”或者“存在痕量的”或者“具有不显著量的”或者“具有几乎难以觉察量的”。
本发明涉及已经证明是工业上可行的提取和回收多羟基链烷酸酯(PHA)，优选从微生物的湿润生物质(用水稀释)提取和回收多羟基链烷酸酯的方法，所述方法使用不危害环境的非卤代溶剂，通过使用来自使用甘蔗的糖和醇工业的可再生的原材料和能源，得到高纯度和高分子量的多羟基链烷酸酯(PHA)。
存在相对大量的出版物描述通过非卤代溶剂从微生物或植物生物质提取PHA。然而，当希望在商业规模应用所描述的教导时，在得到保留细胞内生物聚合物的最初性质的产物方面存在巨大困难，所述特征在多数情况下对于精细的商业产品是重要的。观察到在多数所述出版物中，很少注意高温下产物的热敏感性。考虑作为PHA提取候选物的多数非卤代溶剂具有对该溶质的低溶解性并且对于PHA提取和回收需要高温，通常高于70℃。当希望用此类溶剂以商业规模处理PHA提取时，PHA回收所需的时间通常太长，以不可逆的方式使它热降解。从而所得产物(取决于在高温暴露的时间)变得局限于工业中有限种数的应用，或者局限于其他类型的应用。
本发明提供了以工业规模进行的方法，在该方法中，步骤以如此方式组合以允许：
a)使从细胞生物质提取的多数PHA在高温的暴露时间最小，使用非卤代溶剂，允许最小化其降解，以便最大的保存它的最初性质，特别是它的分子量；
b)得到高纯度，通常99％以上纯度的产物，保存生物聚合物的天然颜色并且基本上不存在剩余溶剂，在该方法中不需要包括脱色和纯化所产生的PHA的特定附加步骤；
c)从生物质回收高水平的PHA，通常超过90％的水平；
d)以整合的方式使用来自糖和醇工业的可再生的原材料和能源，从而增加生产糖和醇的工业集团的利润。
本发明的方法可以应用于通过天然或者遗传修饰的微生物或植物产生的PHA，或者合成产生的PHA。PHA是由下面单位重复构成的聚合物：
Figure A20048003509200181
其中R为可变长度的烷基或者链烯基，m和n为整数，在上述聚合物中，R和m具有下面的值：
PHB：R＝CH3，m＝1
PHB-V：R＝CH3或CH3-CH2-，m＝1
P4HB：R＝H，m＝2
P3HB-4HB：R＝H或CH3，m＝1或2
PHHx：R＝CH3-CH2-CH2-，m＝1。
本发明可应用于从微生物的生物质回收的PHA，优选应用于PHB(聚-3-羟基丁酸酯)、PHB-V(聚(羟基丁酸酯-共-羟基戊酸酯))、P4HB(聚-4-羟基丁酸酯))、P3HB4HB(聚(3-羟基丁酸酯-共-4-羟基丁酸酯))和一些PHAmcl(中等链的多羟基链烷酸酯)，该最后家族的典型的代表是PHHx(聚羟基己酸酯)。
该方法通过使用非卤代溶剂提取PHA，将所述生物聚合物短时间暴露于热降解条件。
本发明涉及图1中阐明的方法，其使用细菌细胞生物质的发酵材料，所述生物质通过发酵得到并且为水性悬浮液中的生物质浆液的形式并且干细胞含量按重量计不低于约18％。
根据本发明，从细胞生物质得到的浓缩的浆液可以直接从发酵得到，该发酵可以得到干物质的必要的最小浓度，或者通过将发酵的培养液中悬浮的细胞生物质进行生物质细胞的絮凝和浓缩得到。
在本发明的优选形式中，将为该方法提供的水性悬浮液中的细胞生物质可以进一步用水稀释，以便水/发酵材料质量比最大为约3.0∶1.0。
在实施本发明的另一方面中，将要处理的通过发酵得到的细菌细胞生物质可以事先热失活。
在实施本发明的另一优选方法中，絮凝操作包括凝结细胞生物质，这可以通过酸化所稀释的细胞生物质至约1.5到约5.5的pH，以及通过加入碱化剂直到达到约7到约12的pH来实现，通过加入絮凝剂实现含有积累的PHA的生物质细胞的絮凝操作。通过加入硫酸和磷酸的至少一种所定义的酸进行用水稀释的细胞生物质的酸化。碱化剂可以包含氢氧化钙。
在实施本发明的另一优选方法中，实现所稀释的细胞生物质的酸化以便得到约2.0到约3.0的pH，并且加入碱化剂以便调节所稀释的细胞生物质的悬浮液的pH到约7到约12的范围内。
在絮凝步骤中所述成分的顺序加入允许形成磷酸钙，其与含有PHA的微生物的细胞壁形成具有所得正电荷的桥，并且通过絮凝剂以絮片聚集，导致形成稳定的絮片，其密度高于包含它们的液体的密度。应该理解通过仅加入碱化剂，直到pH为约7到约12，也可以形成发酵的培养液中悬浮的细菌细胞生物质的凝结，如上述通过加入絮凝剂可以进行含有所积累的PHA的细胞生物质的絮凝。然后所形成的含有积累PHA的细胞的絮片可以容易地与含有来自发酵的杂质的周围发酵液体培养基分离，这可以通过重力，使用例如，静止倾析器或者离心力，在该情况中使用例如离心机或者倾析器来完成。当选择使用离心机或者倾析器时，所澄清的流出液可以再次用酸和碱处理，絮凝，进行倾析并将所得浓缩的浆液与离心机或者倾析器中得到的其他部分一起送到下一步。从而，该方法在其中发生生物质的絮凝的本发明的优选形式中，促进溶于发酵培养液中的细胞外杂质的部分除去，这可以通过从中分离絮片，除去对随后的处理步骤有害的主要有色成分和其他可溶性盐来实现。
该方法还允许形成浓缩的生物质浆液，其含有稳定的絮片(flake)并且所述絮片与包含它们的液体相比密度增加。
在本发明的另一优选形式中，将絮凝的细胞生物质进行浓缩和洗涤方法，产生浓度为8-45％(重量/重量)，更优选25-45％的浓缩的生物质浆液。
然后将浓缩的湿润生物质通过注射PHA溶剂，优选加热的液体形式和蒸汽形式的PHA溶剂，在反应器中剧烈搅拌下进行细胞内PHA的提取，以便快速引起细胞生物质加热到约90℃和溶剂的沸腾温度(在基本上大气压下)之间的温度，并形成：包含富含PHA的PHA溶剂和细胞生物质浆液的剩余的水的液相；通过剩余细胞生物质的不溶性残渣定义的固相；和含有水和PHA溶剂的蒸汽的蒸汽相。水和PHA溶剂蒸汽凝结并分离成两个液相，所述液相为：富含溶剂相，其返回到PHA提取和回收期的过程中；和少溶剂相，其在该过程中再循环以允许回收其中含有的PHA溶剂。
该步骤除了加热细胞生物质外，还促进浆液中大部分水以蒸汽形式除去，该蒸汽是由PHA溶剂和水组成的二元混合物。然后，可以从反应器引出蒸汽相留待以后凝结，剩下悬浮液，其由富含PHA的PHA溶剂和溶解在该溶剂中的小部分水，以及所提取的细胞生物质的不溶性残渣组成。
从而，作为实例，所用的PHA溶剂可以选自由如下溶剂组成的溶剂组：乙酸丁酯、乙酸异丁酯、乙酸戊酯、乙酸异戊酯、异丁醇、1-丁醇、1-戊醇(甲基醇)、2-甲基-1-丁醇、3-甲基-1-丁醇(异戊醇)、3-戊醇、1-己醇、环己醇、丙酸丙酯、丙酸丁酯、丙酸异丁酯、丁酸乙酯、异丁酸异丁酯、和它们的混合物。优选地，所述溶剂可以是异戊醇，或者异戊醇的异构体混合物，更优选地，异戊醇可以从作为乙醇发酵的副产物的杂醇油的级分得到。杂醇油主要由异戊醇及其异构体组成，还包括杂质，如乙醇、正丙醇、异丁醇、正丁醇和水。
在受控的条件下和通过搅拌系统促进了提取溶剂和PHA细胞生物质之间的接触，所述搅拌系统的尺寸允许部分之间的剧烈接触，和保证不溶性生物质残渣具有均匀颗粒大小，这方便了随后的操作。
如图1中阐明的，所得液流在本文中称作液流F，其由含有PHA的悬浮液和溶解在溶剂中的水和生物质不溶性残渣组成，在本发明的优选形式中，将液流F送到离心分离单元，例如，旋液分离器中，其中应用低强度(重力的几倍)离心力导致产生两种液流：一种液流由含有PHA的溶液中具有的低浓度残留的不溶性生物质固体的悬浮液和溶于PHA溶剂的小部分水组成，将该液流称作液流O，另一液流含有PHA的溶液中的浓缩的生物质不溶性残渣的悬浮液和小部分溶解的水，这里将该液流称作液流U。对从离心分离单元流出的两种液流进行分离，从而液流U是液流F的约15-35％(重量/重量)并且含有液流F中最初存在的固体的约55-75％(重量/重量)并且还含有待回收的细胞内PHA级分。本文描述的并且在静止的、有效并且低成本设备，如旋液分离器的离心力影响下进行的这两种液流的分离免除了高成本的机械离心机，该机械离心机将需要使用惰性气体，对PHA溶剂的可爆性和易燃性产生限制。
在此处通过残留的不溶性固体颗粒相对于包含它们的溶剂的较高密度确保了此类分离，通过最初凝结赋予了所述较高密度，在最初凝结中，重颗粒，如磷酸钙颗粒，结合到含有细胞内PHA的细胞和细胞生物质的成分。另一个重要的效果是提取系统在提取期间产生具有均匀粒度分布的颗粒，这确保当利用低强度的离心分离单元时，高效分离和浓缩含有未提取的细胞内PHA的固体。
任选地，可以将液流O进行膜微量过滤或者用预涂层滤器过滤的步骤，其中产生两种液流：一个液流P，其透过膜，和膜浓缩物的液流C。液流P是液流O的约50％-90％(重量/重量)，没有不溶性固体并且含有溶解在PHA溶剂中的PHA、水和小级分的灰和有色化合物，将液流P立即冷却到约45℃或者更低的温度。液流C是液流O的约10-50％，液流C的所提取的生物质的残留固体的浓度浓缩到液流O中这些固体的最初含量的约2-10倍并且它含有溶解在PHA溶剂中的PHA级分、水、灰和有色化合物。
液流U和液流C中浓缩了所提取生物质的不溶残渣并且有很少的PHA，任选地，可以将液流U和液流C合并并送到回收溶解在PHA溶剂中的剩余PHA的过程中，通过分离方法，例如，通过过滤进行所述回收，其中所产生的滤出液流(称作F1)含有PHA溶剂中的PHA、水、灰、有色化合物，和最终粗粉(end meal)，其在本文称作T，含有所提取的生物质的残留的不溶性固体。任选地，液流U、液流C和液体和新加入量的液体形式和蒸汽形式的PHA溶剂可以在充分搅拌条件下再次混合，从而形成新的液流，其将再次送到前面描述的过程中。
所得最终流出液浓缩了所提取的细胞生物质的不溶性残渣并且含有很少的PHA，所述最终浓缩液最后进行溶解在PHA溶剂中的剩余PHA的回收过程，然后进行分离过程，例如，通过过滤分离。所描述的提取方法包括许多步骤，从而它回收高于生物质中最初所含PHA的约95％(重量/重量)的量，滞留时间小于约10-20分钟，以便从含有分子量最小为约850,000Da的PHA的生物质浆液得到具有最小分子量为约850,000Da的PHA。
还任选地，含有在离心分离单元(例如，旋液分离器)中实现的过程剩余的不溶性固体的液流O可以送到用于分离不溶性固体的过程中，而不进行膜微量过滤过程，从而得到滤液流，其含有溶于溶剂的PHA并且没有生物质的任何不溶性固体并且留下含有所述不溶性杂质的残渣。所回收的PHA的分子量稍微低于通过膜微量过滤得到的分子量。
在本发明的优选形式中，还可以将含有所提取的生物质的不溶性残渣的粗提取液流F直接送到溶于PHA溶剂的PHA的回收过程，不用经过离心分离单元和膜微量过滤；在该情况中，与前面的方法相比，PHA具有相似的质量，但是由于从不溶性固体的分离过程得到的聚合物的更长的滞留时间，所述PHA具有稍微下降的分子量。
上述液流P和液流FI没有生物质的不溶性残渣并且含有PHA、水、灰和溶于PHA溶剂的一些有色化合物，液流P和液流FI当快速冷却到约45℃或者更低的温度时，导致PHA沉淀，形成悬浮液，其分子量最小为约750,000Da(从含有分子量最小约1,000,000Da的PHA的生物浆液开始)。可以通过导入结晶种子进一步辅助该沉淀。
通过冷却沉淀所得PHA溶剂中的PHA悬浮液含有溶于其中的水、灰和溶解的有色化合物，将所述PHA悬浮液进行分离过程，优选通过微孔聚合物膜进行分离。该过程允许得到渗过的液流PE，其为送入膜的液流质量的约60％-90％，包含PHA溶剂、水、可溶性灰和溶于PHA溶剂的有色化合物并且基本上无PHA；以及另一种液流，其为进料液流的约40％-10％，由浓缩的PHA悬浮液和溶解在PHA溶剂中的灰和有色化合物级分组成。如本发明中描述的该步骤除了允许将PHA悬浮液在非常有利于保存PHA分子量的条件下和在使用接近环境温度的温度的过程中和通过物理方法(膜)浓缩到高达3.5-8％(重量/重量)的浓度，还通过渗透进一步导致消除约70％-90％溶解的杂质，所述杂质是PHA悬浮液的成分。
前面浓缩PHA的悬浮液含有3.5％-810％(重量/重量)浓度范围的PHA(通过图1中的液流S定义)，将该悬浮液进行浓缩步骤，该步骤通过蒸发，在大气压下进行，优先在多真空效应下进行，其中同时送入PHA悬浮液和弱水流AF，该水流AF在该步骤中回收并且含有其中溶解的PHA溶剂。该弱水按比例送入蒸发器中以允许得到基本上含有PHA、PHA溶剂和水的悬浮液，形成具有高孔隙率的PHA颗粒的团块，其为脆性团块并且容易剪切。然后将该悬浮液同时蒸发下进行机械剪切单元，如循环离心泵中的粉碎过程，其中具有高孔隙率和脆性的PHA颗粒的团块被快速和充分地破碎，以便得到更细小的PHA颗粒的悬浮液，所述颗粒可以在PHA溶剂的蒸发过程中进行充分洗涤。然后将向其中加入弱水流(AF1)的该悬浮液进行最终残留溶剂的蒸发(洗提)，直到它完全从剩余液体(母液)提取出来，注射流通蒸汽并同时再循环前面步骤中所得悬浮液。通过再蒸发期间重复剪切过程，可能得到PHA的受控的粉碎，直到它变成悬浮在剩下的无溶剂的液体中的粉末。从而，在该过程结束时，得到PHA颗粒的悬浮液，其良好地分散在剩余液体(母液)中，该剩余液体又含有其中溶解的从PHA除去的杂质。将该悬浮液快速冷却到约45℃或者以下，并进行从所述液体分离固体的过程，例如，通过过滤分离，并用新鲜水洗涤含有PHA颗粒的滤饼。
这些蒸发、洗提、冷却和过滤的最后步骤允许在进行蒸发的同时实现从培养液除去PHA溶剂并最后纯化PHA颗粒而不破坏PHA分子量。此外，它允许得到具有粒度分布的颗粒，其对于干燥过程足够的，所述颗粒为40-400μm，优选约100-200μm，以便允许使用温和干燥条件，即，将PHA置于中度温度和短的滞留时间。干燥步骤后得到的PHA生物聚合物具有高纯度水平，极低水平的残留溶剂、颜色、灰和杂质，和高的总体产率，即所回收的PHA的量相对于最初生物质中所含PHA高于约90％(重量/重量)。
实施例
实施例1.1：发酵的生物质的失活
真养产碱菌的经发酵的生物质的悬浮液含有150g/l总干物质，由含有按重量计约60-75％PHB的细菌细胞形成，将10m3所述悬浮液以4m3/h的流速穿过再生的热交换器TCR1，随后接受直接蒸汽注射，以便升高温度到85℃。然后将该悬浮液导入有效体积为1m3的滞留容器并泵回到交换器TCR-1，在TCR-1中它被生物质悬浮液冷却，该生物质悬浮液进入该过程并被再次加热。在约45℃离开该过程的生物质悬浮液保持基本上不改变的干物质和PHB的浓度。然而，细菌细胞现在的酶系统失活，并且因此不能降解所积累的PHB。然后将该悬浮液进行凝结和倾析过程。
实施例1.2：所发酵的生物质的洗涤和浓缩
向真养产碱菌的前面失活的PHB发酵的生物质5m3在温和搅拌下加入5m3水，然后加入磷酸，直到达到2.8到3.5的pH，并加入石灰乳，直到达到pH7.0-8.0。然后向所凝结的生物质悬浮液加入10-20ppm阴离子聚合电解质，将其缓慢搅拌并保持静置用于倾析。然后除去上清液，留下生物质浆液，其具有约10-12％干物质。然后将所得浆液以约1200kg/h的流速送入离心机倾析器，然后其接受足够量聚合电解质的加入用于絮凝，并加入水，其比例为进料的浆液流速的约20％(重量/重量)。然后除去澄清的物质，产生具有约20-25％固体的约2400kg浆液，所述固体的70-75％对应于PHB。
实施例1.3.1：在一步提取中使用异戊醇作为溶剂提取和回收PHB
将以25％干物质浓缩并且含有约60-75％的分子量为1.000.000Da的PHB的真养产碱菌生物质送入机械搅拌的反应器，保持在105℃，进料流速为350-450kg/h，其中该反应器接受加热到约105℃的7290kg/h异戊醇加入和足够量的135℃的异戊醇蒸汽，以蒸发浆液中含有的过多水分，产生约1250kg/h蒸汽，该蒸汽由约15％水和85％异戊醇组成，和称作粗提取物的另一种液流，其具有约8000kg/h含有PHB(分子量约900,000Da)的悬浮液和溶解在异戊醇中的水，和所提取生物质的不溶性残渣。然后将粗提取物连续送入旋液分离器，在其中液流分成两种液流：一种液流在上部中，具有约75％进料流速并且含有进料粗提取物中最初所含不溶性固体的约65％；和约25％进料流速的下面部分中的另一种液流，其含有75％的最初含有的不溶性固体。旋液分离器的上面液流含有很少的不溶性固体，将该液流以6000kg/h的流速送入膜微量过滤单元，产生约1500kg/h(1/4)的液流，其浓缩了所提取生物质的残留的不溶性固体，还产生了4500kg/h(3/4)的渗透液流，其没有所提取生物质的残留的不溶性固体并且富含分子量为800,000-880,000Da范围的PHB。该过程中滞留时间为约3-10分钟。然后将富含旋液分离器的不溶性固体的液流(下面相)和膜的液流混合并以2000kg/h的流速送到例如板式过滤器中进行过滤步骤，产生约1800kg/h的液流，其是没有悬浮的不溶性固体的PHB溶液，该溶液富含分子量为580,000到780,000Da的PHB，还产生含有约200kg/h的提取的生物质的不溶性固体的残渣。该过程的PHB回收高于所进料的生物质的PHB的95％(重量/重量)，即，50-80kg PHB/h，这取决于生物质流量和纯度。在膜和滤器提取过程中所得滤液快速冷却到等于或者低于约45℃的温度，以便保证溶剂中PHB的沉淀。异戊醇中沉淀的来自膜微量过滤的PHB具有约800,000到870,000Da的分子量，来自常规过滤的PHB分子量为580,000到780,000Da。
任选地，将含有PHB(分子量约900,000Da)的悬浮物和溶解在异戊醇中的水和经提取的生物质的不溶性残渣的粗提取物液流以约8000kg/h直接送到过滤步骤，例如，在板式过滤器中，该过滤步骤得到两种液流：约7800kg/h的滤液液流，其是无悬浮的不溶性固体的PHB溶液，富含580,000到780,000Da的分子量的PHB；和200kg/h的残渣(meal)，其含有所提取生物质的不溶性固体。将该过程中所得滤液快速冷却到等于或者低于约45℃的温度，以便保证PHB在溶剂中沉淀。在异戊醇中沉淀的PHB具有80,000-780,000Da的分子量。
该过程的PHB回收相对于生物质的进料PHB高于95％(重量/重量)，即50-80kg PHB/h，这取决于生物质流量和纯度。
实施例1.3.2：在三阶段提取中使用异戊醇作为溶剂提取和回收PHB
在成系列的三个反应器中，将浓缩到高达25％干物质并且含有约60-75％的分子量为约1,000,000Da的PHB的真养产碱菌生物质送入第一个机械搅拌的反应器中，该反应器保持在约105℃和350-450kg/h的流速。在第三个反应器中，将加热到约105℃的异戊醇以7290kg/h的流速进料。将135℃的异戊醇蒸汽以足够量送入三个提取阶段以保证蒸发浆液中所含的过量水。进行该步骤以产生约1250kg/h的水蒸汽和异戊醇的总液流，其包含约15％水和85％异戊醇，另一种液流以约8000kg/h从第一个提取阶段流出并称作粗提取物，其是含有PHB和溶解在异戊醇中的水和经提取生物质的不溶性残渣的悬浮液。然后将来自第一阶段的粗提取物连续送入旋液分离器1，在这里流体分成两个液流：顶部液流，其包含约75％进料流体并且含有进料粗提取物中最初所含的不溶性固体的约40％-45％；和底部液流(在下面部分中)，其为25％进料流体并且含有其中最初所含的约55％-60％的不溶性固体并且将该液流进行下一个阶段(2)。旋液分离器1的顶部液流含有很少的不溶性固体，将该液流以6000kg/h的流速送入膜微量过滤单位，产生约2000kg/h(1/3)的液流，其浓缩了经提取的生物质的残留的不溶性固体，和4000kg/h(2/3)的渗透液流，其没有经提取的生物质的残留的不溶性固体。对旋液分离器1的底部液流进行第二次提取阶段，其中它接受旋液分离器3的顶部液流并且该液流浓缩了在膜微量过滤中产生的不溶性固体。旋液分离器3的底部液流含有经提取的生物质的约55-65％的不溶性固体，将该底部液流以2000kg/h的流速送到过滤步骤，例如，板式过滤器中，产生约1800kg/h的液流，其是没有悬浮的不溶性固体的PHB溶液，和约200kg/h的含有经提取的生物质的不溶性固体的粗粉。该过程的PHB回收相对于生物质的进料PHB高于98％(重量/重量)，即51-82kgPHB/h。在膜中和滤器提取过程中所得滤液都快速冷却到等于或者低于约45℃的温度，以确保PHB在溶剂异戊醇中沉淀。
任选地，旋液分离器1的约6000kg/h的含有很少的不溶性固体的顶部液流直接送到过滤步骤，例如，在板式过滤器中，该过滤步骤得到两种液流：约5800kg/h的滤液液流，其是无悬浮的不溶性固体的PHB溶液，富含650,000-780,000Da的分子量的PHB；和约200kg/h的残渣(meal)，其含有所提取生物质的不溶性固体。将该过程中所得滤液快速冷却到等于或者低于约45℃的温度，以便保证PHB在溶剂中沉淀。在异戊醇中沉淀的PHB具有650,000-780,000Da的分子量。
该过程的PHB回收相对于生物质的进料PHB高于95％(重量/重量)，即50-80kg PHB/h，这取决于生物质流量和纯度。
实施例1.3.3：使用乙酸异戊酯作为溶剂提取和回收PHB
检测PHB在乙酸异戊酯中的溶解性：
向500ml圆底蒸馏烧瓶中加入31g真养产碱菌的浓缩生物质(含有28.11％干物质和16.09％分子量为1,000,000Da的PHB)，和250g乙酸异戊酯。然后通过使用连接蒸馏烧瓶的加热毯在搅拌下将该悬浮液蒸发溶剂和水分。所产生的二元蒸汽进入直管冷凝器(Liebig型)用以冷凝并将所得冷凝液收集到三角瓶中。悬浮液在搅拌下保持在蒸发过程中直到达到提取温度。用水银温度计读出温度，该温度计固定到一个烧瓶喷嘴并且保持接触烧瓶内的蒸汽相。经过约14分钟的蒸发时间后达到提取温度，混合物的沸腾温度从约104℃(最初温度)升高到约123℃(提取温度)，在该期间产生约34ml冷凝液，其由约70％(v/v)乙酸异戊酯和来自所浓缩的生物质的水组成。然后将悬浮液在冷凝液回流方案中搅拌下于123℃的温度(提取温度)下保持约10分钟，并且趁热用滤纸过滤以分离不溶性部分和溶解在过滤的溶剂中的部分。热的过滤物质含有约0.90％(w/w)溶解的PHB，将该物质冷却进行PHB沉淀，通过过滤浓缩，进行溶剂蒸发，然后干燥。所得PHB具有约495,000Da的分子量。用于测试的浓缩生物质的量比在所用的提取温度下达到溶剂中PHB饱和浓度所需的量高大约2.0-3.5倍。从而，可以确定对于所用的提取温度，溶剂(乙酸异戊酯)中溶质(PHB)饱和浓度。
测试乙酸异戊酯中的PHB提取：
向500ml圆底蒸馏烧瓶中加入10g真养产碱菌的浓缩生物质(含有28.11％干物质和16.09％分子量为约1,000,000Da的PHB)，和200g乙酸异戊酯。然后通过使用连接蒸馏烧瓶的加热毯将该悬浮液蒸发溶剂和水分。所产生的二元蒸汽进入直管冷凝器(Liebig型)用以冷凝并将所得冷凝液收集到三角瓶中。悬浮液在搅拌下保持在蒸发过程中直到达到提取温度。用水银温度计读出温度，该温度计固定到一个烧瓶喷嘴并且保持接触烧瓶内的蒸汽相。然后将悬浮液在冷凝液回流方案中在搅拌下于123℃的温度(提取温度)下保持约10分钟。所得的材料进行热倾析过程并且从提取得到的不溶性固体残渣可以与溶剂中溶解的PHB分离。将含有溶解的PHB的溶液冷却以沉淀PHB并测量该阶段提取的PHB质量。第一阶段所得固体残渣接受新加入的200g乙酸异戊酯并且再次提取10分钟。重复其他步骤直到达到三个提取阶段。在细胞生物质中最初所含的PHB的约41％在第一阶段中提取出来，第二阶段提取13％，第三阶段提取8％。如此所得的PHB保持在730,000Da-750,000Da的范围。
外推到工业规模的实施例
将含有28.11％的干物质和含有16.09％的分子量为约1,000,000Da的PHB的浓缩的真养产碱菌生物质以500kg/h的流速送到保持在约123℃机械搅拌的反应器中，其中所述反应器接受加入9,521kg/h加热到约123℃的乙酸异戊酯，乙酸异戊酯为液体和蒸汽形式，它的量足够蒸发浆液中所含的过量水，产生约833kg/h的蒸汽流，其由约30％(v/v)水和70％(v/v)乙酸异戊酯组成，和约8,969kg/h的称作粗提取物的另一液流，其是含有溶解在乙酸异戊酯中的PHB和水和经提取的生物质的不溶性残渣的悬浮液。然后将粗提取物连续送入旋液分离器，在其中流体分成两个液流：一个液流在上面部分，为约75％进料流体并且含有进料粗提取物中最初所含的约35％的不溶性固体；另一个液流在下面部分，为25％的进料流体并且含有其中最初所含的约65％的不溶性固体。旋液分离器的上面液流含有很少的固体，将其以6,891kg/h的流速送到膜微量过滤单位，产生约1,149kg/h(1/6)的液流，其浓缩了所提取生物质的不溶性固体，和5,743kg/h(5/6)的渗透液流，其没有经提取的生物质的残留的不溶性固体。该过程的滞流时间为约10分钟。将来自旋液分离器(下面的相)的富含不溶性固体的液流和来自膜的液流混合并以3,446kg/h的流速送到过滤步骤，例如，板式过滤器中，产生约3,294kg/h的液流，其是没有悬浮的不溶性固体的PHB溶液，和约151.5kg/h的含有经提取的生物质的不溶性固体的粗粉。该过程的PHB回收相对于生物质的进料PHB高于95％(重量/重量)，即70-80kg PHB/h，这取决于生物质流速和纯度。在膜中和滤器提取过程中所得滤液都快速冷却到等于或者低于约45℃的温度，以确保PHB在溶剂中沉淀。
实施例1.3.4：使用乙酸丁酯作为溶剂提取和回收PHB
测试乙酸丁酯中PHB的溶解度：
向500ml圆底蒸馏烧瓶中加入31g真养产碱菌的浓缩生物质和250g乙酸丁酯，所述生物质含有28.11％的干物质和16.09％的分子量为约1,000,000Da的PHB。然后通过使用连接蒸馏烧瓶的加热毯在剧烈搅拌下将该悬浮液蒸发溶剂和水分，所产生的二元蒸汽进入直管冷凝器(Liebig型)用以冷凝并将所得冷凝液收集到三角瓶中。悬浮液在搅拌下保持在蒸发过程中直到达到提取温度。用水银温度计读出温度，该温度计固定到一个烧瓶喷嘴并且保持接触烧瓶内的蒸汽相。经过约28分钟的蒸发时间后达到提取温度，混合物的沸腾温度从约91.5℃(最初温度)升高到约121.5℃(提取温度)，在该期间产生约131ml冷凝液，其由约83％(v/v)乙酸异戊酯和来自所浓缩的生物质的水组成。然后将悬浮液在冷凝液回流方案中在搅拌下于121.5℃的温度(提取温度)下保持约10分钟。并且加热下用滤纸过滤以分离不溶性部分和溶解在过滤的溶剂中的部分。热的过滤物质含有约0.98％(w/w)的溶解PHB，将该物质冷却进行PHB沉淀，通过过滤浓缩，进行溶剂蒸发，然后干燥。所得PHB具有约502,000Da的分子量。用于测试的浓缩生物质的量比在所用的提取温度下达到溶剂中PHB饱和浓度所需的量高大约2.0-3.5倍。从而，可以确定对于所用的提取温度，溶剂(乙酸异戊酯)中溶质(PHB)的饱和浓度。
测试乙酸丁酯中的PHB提取：
向500ml圆底蒸馏烧瓶中加入10g真养产碱菌的浓缩生物质和200g乙酸丁酯，所述生物质含有28.11％的干物质和16.09％的分子量为约1,000,000Da的PHB。然后通过使用连接蒸馏烧瓶的加热毯将该悬浮液蒸发溶剂和水分，所产生的二元蒸汽进入直管冷凝器(Liebig型)用以冷凝并将所得冷凝液收集到三角瓶中。悬浮液在搅拌下保持在蒸发过程中直到达到提取温度。用水银温度计读出温度，该温度计固定到一个烧瓶喷嘴并且保持接触烧瓶内的蒸汽相。然后将悬浮液在冷凝液回流方案中在搅拌下于121.5℃的温度(提取温度)下保持约10分钟。所得的物质进行热倾析过程并且将提取得到的不溶性固体残渣与溶剂中溶解的PHB分离。将含有溶解的PHB的溶液冷却以沉淀PHB并测量该阶段提取的PHB质量。第一阶段所得固体残渣接受新加入的200g乙酸丁酯并且再次提取10分钟。重复其他步骤直到总计三个提取阶段。在细胞生物质中最初所含的PHB的约62.5％在第一阶段中提取出来，第二阶段提取18.5％，第三阶段提取7.0％。所得的PHB的分子量保持在740,000Da-780,000Da的范围。
外推到工业规模的实施例
将含有28.11％的干物质和含有16.09％的分子量为约1,000,000Da的PHB的浓缩的真养产碱菌生物质以500kg/h的流速送到保持在约121.5℃的机械搅拌的反应器中，其中所述反应器接受加入9,577kg/h加热到约121.5℃的乙酸丁酯，乙酸丁酯为液体和蒸汽形式，它的量足够蒸发浆液中所含的过量水，产生约1732kg/h的蒸汽流，其由约17％水和83％乙酸丁酯组成，和约8,175kg/h的称作粗提取物的另一液流，其是含有溶解在乙酸丁酯中的PHB和水和经提取的生物质的不溶性残渣的悬浮液。然后将粗提取物连续送入旋液分离器，在其中流体分成两个液流：一个液流在上面部分，为约75％进料流体并且含有进料粗提取物中最初所含的约35％的不溶性固体；另一个液流在下面部分，为25％的进料流体并且含有其中最初所含的约65％的不溶性固体。旋液分离器的上面液流含有很少的不溶固体，将其以6,258kg/h的流速送到膜微量过滤单位，产生约1,043kg/h(1/6)的液流，其浓缩了所提取生物质的残留不溶性固体，和5,215kg/h(5/6)的渗透液流，其没有经提取的生物质的残留的不溶性固体。该过程的滞流时间为约10分钟。将来自旋液分离器(下面的相)的富含不溶性固体的液流和来自膜的液流混合并以3,129kg/h的流速送到过滤步骤，例如，板式过滤器中，产生约2,978kg/h的液流，其是没有悬浮的不溶性固体的PHA溶液，和约151.5kg/h的含有经提取的生物质的不溶性固体的粗粉。该过程的PHBV回收相对于生物质的进料PHBV高于95％(重量/重量)，即70-80kg PHBV/h，这取决于生物质流速和纯度。在膜中和滤器提取过程中所得滤液都快速冷却到等于或者低于约45℃的温度，以确保PHBV在溶剂中沉淀。
实施例1.3.5：使用丙酸丙酯作为溶剂提取和回收PHB
测试丙酸丙酯中PHB的溶解度：
向500ml圆底蒸馏烧瓶中加入31g真养产碱菌的浓缩生物质和250g丙酸丙酯，所述生物质含有28.11％的干物质和16.09％的分子量为1,000,000Da的PHB。然后通过使用连接蒸馏烧瓶的加热毯在剧烈搅拌下将该悬浮液蒸发溶剂和水分，所产生的二元蒸汽进入直管冷凝器(Liebig型)用以冷凝并将所得冷凝液收集到三角瓶中。悬浮液在剧烈搅拌下保持在蒸发过程中直到达到提取温度。用水银温度计读出温度，该温度计固定到一个烧瓶喷嘴并且保持接触烧瓶内的蒸汽相。经过约15分钟的蒸发时间后达到提取温度，混合物的沸腾温度从约92℃(最初温度)升高到约113℃(提取温度)，在该期间产生约100ml冷凝液，其由约80％(v/v)丙酸丙酯和来自所浓缩的生物质的水组成。然后将悬浮液在冷凝液回流方案中在搅拌下于113℃的温度(提取温度)下保持约10分钟。并且加热下用滤纸过滤以分离不溶性部分和溶解在过滤的溶剂中的部分。热的过滤物质含有约1.24％(p/p)的溶解PHB，将该物质冷却进行PHB沉淀，通过过滤浓缩，进行溶剂蒸发，然后干燥。所得PHB具有约430,000Da的分子量。用于测试的浓缩生物质的量比在所用的提取温度下达到溶剂中PHB饱和浓度所需的量高大约2.0-3.5倍。从而，可以确定对于所用的提取温度，溶剂(丙酸丙酯)中溶质(PHB)的饱和浓度。
测试丙酸丙酯中的PHB提取：
向500ml圆底蒸馏烧瓶中加入10g真养产碱菌的浓缩生物质和200g丙酸丙酯，所述生物质含有28.11％的干物质和16.09％的分子量为1,000,000Da的PHB。然后通过使用连接蒸馏烧瓶的加热毯将该悬浮液蒸发溶剂和水分，所产生的二元蒸汽进入直管冷凝器(Liebig型)用以冷凝并将所得冷凝液收集到三角瓶中。悬浮液在搅拌下保持在蒸发过程中直到达到提取温度。用水银温度计读出温度，该温度计固定到一个烧瓶喷嘴并且保持接触烧瓶内的蒸汽相。然后将悬浮液在冷凝液回流方案中在搅拌下于113℃的温度(提取温度)下保持约10分钟。所得的物质进行热倾析过程并且将提取得到的不溶性固体残渣与溶剂中溶解的PHB分离。将含有溶解的PHB的溶液冷却以沉淀PHB并测量该阶段提取的PHB质量。第一阶段所得固体残渣接受新加入的200g丙酸丙酯并且再次提取10分钟。重复其他步骤直到总计三个提取阶段。在细胞生物质中最初所含的PHB的约62.0％在第一阶段中提取出来，第二阶段提取18.5％，第三阶段提取6.0％。所得的PHB的分子量为约730,000Da。
外推到工业规模的实施例
将含有28.11％的干物质和含有16.09％的分子量为约1,000,000Da的PHB的浓缩的真养产碱菌生物质以500kg/h的流速送到保持在约113℃的机械搅拌的反应器中，其中所述反应器接受加入7,406kg/h加热到约113℃的乙酸丁酯，乙酸丁酯为液体和蒸汽形式，它的量足够蒸发浆液中所含的过量水，产生约1156kg/h的蒸汽流，其由约20％(v/v)水和80％(v/v)乙酸丁酯组成，和约7,406kg/h的称作粗提取物的另一液流，其是含有溶解在乙酸丁酯中的PHB和水和经提取的生物质的不溶性残渣的悬浮液。然后将粗提取物连续送入旋液分离器，在其中流体分成两个液流：一个液流在上面部分，为约75％进料流体并且含有进料粗提取物中最初所含的约35％的不溶性固体；另一个液流在下面部分，为约25％的进料流体并且含有其中最初所含的约65％的不溶性固体。旋液分离器的上面液流含有很少的不溶性固体，将其以5,063kg/h的流速送到膜微量过滤单位，产生约844kg/h(1/6)的液流，其浓缩了所提取生物质的残余不溶性固体，和4,219kg/h(5/6)的渗透液流，其没有经提取的生物质的残留的不溶性固体。该过程的滞流时间为约10分钟。将来自旋液分离器(下面的相)的富含不溶性固体的液流和来自膜的液流混合并以2,531kg/h的流速送到过滤步骤，例如，板式过滤器中，产生约2,380kg/h的液流，其是没有悬浮的不溶性固体的PHB溶液，和约151.5kg/h的含有经提取的生物质的不溶性固体的粗粉。该过程的PHB回收相对于生物质的进料PHBV高于95％(重量/重量)，即70-80kg PHBV/h，这取决于生物质流速和纯度。在膜中和滤器提取过程中所得滤液都快速冷却到等于或者低于约45℃的温度，以确保PHBV在溶剂中沉淀。
将含有25％的干物质并且含有约60％-75％的分子量为约1,000,000Da的PHB的浓缩的真养产碱菌生物质以500kg/h的流速送到保持在约95-105℃的机械搅拌的反应器中，其中所述反应器接受加入8000kg/h加热到约130℃的丙酸丙酯和130℃的丙酸丙酯蒸汽，它的量足够蒸发浆液中所含的过量水，产生约1,230kg/h的蒸汽流，其由约24％水和76％丙酸丙酯组成，和约8268kg/h的称作粗提取物的另一液流，其是含有溶解在丙酸丙酯中的PHB和水和经提取的生物质的不溶性残渣的悬浮液。然后将粗提取物连续送入旋液分离器，在其中流体分成两个液流：一个液流在上面部分，为约75％进料流体并且含有进料粗提取物中最初所含的约35％的不溶性固体；另一个液流在下面部分，为25％的进料流体并且含有其中最初所含的约65％的不溶性固体。旋液分离器的上面液流含有很少的不溶性固体，将其以6,201kg/h的流速送到膜微量过滤单位，产生约1,034kg/h(1/6)的液流，其浓缩了所提取生物质的残余不溶性固体，和5,167kg/h(5/6)的渗透液流，其没有经提取的生物质的残留的不溶性固体。该过程的滞流时间为约3-10分钟。将来自旋液分离器(下面的相)的富含不溶性固体的液流和来自膜的液流混合并以3,100kg/h的流速送到过滤步骤，例如，板式过滤器中，产生约2,850kg/h的液流，其是没有悬浮的不溶性固体的PHB溶液，和约250kg/h的含有经提取的生物质的不溶性固体的粗粉。该过程的PHB回收相对于生物质的进料PHB高于95％(重量/重量)，即70-90kg PHB/h，这取决于生物质流速和纯度。在膜中和滤器提取过程中所得滤液都快速冷却到等于或者低于约45℃的温度，以确保PHB在溶剂中沉淀。
实施例1.3.6：在一阶段提取中使用1-己醇作为溶剂提取和回收PHB
测试己醇中PHB的溶解度：
向500ml圆底蒸馏烧瓶中加入31g真养产碱菌的浓缩生物质和250g己醇，所述生物质含有28.11％的干物质和16.09％的分子量为1,000,000Da的PHB。然后通过使用连接蒸馏烧瓶的加热毯在搅拌下将该悬浮液蒸发溶剂和水分，所产生的二元蒸汽进入直管冷凝器(Liebig型)用以冷凝并将所得冷凝液收集到三角瓶中。悬浮液在剧烈搅拌下保持在蒸发过程中直到达到提取温度。用水银温度计读出温度，该温度计固定到一个烧瓶喷嘴并且保持接触烧瓶内的蒸汽相。经过约15分钟的蒸发时间后达到提取温度，混合物的沸腾温度从约104℃(最初温度)升高到约133℃(提取温度)，在该期间产生约34ml冷凝液，其由约44％(v/v)己醇和来自所浓缩的生物质的水组成。然后将悬浮液在冷凝液回流方案中在搅拌下于133℃的温度(提取温度)下保持约10分钟。接着加热下用滤纸过滤以分离不溶性部分和溶解在过滤的溶剂中的部分。热的过滤物质含有约0.83％(p/p)溶解的PHB，将该物质冷却进行PHB沉淀，通过过滤浓缩，进行溶剂蒸发，然后干燥。所得PHB具有约430,000Da的分子量。用于测试的浓缩生物质的量比在所用的提取温度下达到溶剂中PHB饱和浓度所需的量高大约2.0-3.5倍。从而，可以确定对于所用的提取温度，溶剂(己醇)中溶质(PHB)的饱和浓度。
测试己醇中PHB提取：
向500ml圆底蒸馏烧瓶中加入10g真养产碱菌的浓缩生物质和200g己醇，所述生物质含有28.11％的干物质和16.09％的分子量为1,000,000Da的PHB。然后通过使用连接蒸馏烧瓶的加热毯将该悬浮液蒸发溶剂和水分，所产生的二元蒸汽进入直管冷凝器(Liebig型)用以冷凝并将所得冷凝液收集到三角瓶中。悬浮液在搅拌下保持在蒸发过程中直到达到提取温度。用水银温度计读出温度，该温度计固定到一个烧瓶喷嘴并且保持接触烧瓶内的蒸汽相。然后将悬浮液在冷凝液回流方案中在搅拌下于133℃的温度(提取温度)下保持约10分钟。所得的物质进行热倾析过程并且将提取得到的不溶性固体残渣与溶剂中溶解的PHB分离。将含有溶解的PHB的溶液冷却以沉淀PHB并测量该阶段提取的PHB质量。第一阶段所得固体残渣接受新加入的200g己醇并且再次提取10分钟。重复其他步骤直到总计三个提取阶段。在细胞生物质中最初所含的PHB的约64.5％在第一阶段中提取出来，第二阶段提取19.0％，第三阶段提取8.0％。所得的PHB的分子量为530,000Da到680,000Da。
外推到工业规模的实施例
将含有28.11％的干物质和含有16.09％的分子量为约1,000,000Da的PHB的浓缩的真养产碱菌生物质以500kg/h的流速送到保持在约133℃的机械搅拌的反应器中，其中所述反应器接受加入10,019kg/h加热到约133℃的己醇，己醇为液体和蒸汽形式，它的量足够蒸发浆液中所含的过量水，产生约542.6kg/h的蒸汽流，其由约20％水和60％(w/w)己醇组成，和约9,997kg/h的称作粗提取物的另一液流，其是含有溶解在己醇中的PHB和水和经提取的生物质的不溶性残渣的悬浮液。然后将粗提取物连续送入旋液分离器，在其中流体分成两个液流：一个液流在上面部分，为约75％进料流体并且含有进料粗提取物中最初所含的约35％的不溶性固体；另一个液流在下面部分，为约25％的进料流体并且含有其中最初所含的约65％的不溶性固体。旋液分离器的上面液流含有很少的不溶性固体，将其以7,482kg/h的流速送到膜微量过滤单位，产生约1,247kg/h(1/6)的液流，其浓缩了所提取生物质的残余不溶性固体，和6,235kg/h(5/6)的渗透液流，其没有经提取的生物质的残留的不溶性固体。该过程的滞流时间为约10分钟。将来自旋液分离器(下面的相)的富含不溶性固体的液流和来自膜的液流混合并以3,741kg/h的流速送到过滤步骤，例如，板式过滤器中，产生约3,90kg/h的液流，其是没有悬浮的不溶性固体的PHB溶液，和约151.5kg/h的含有经提取的生物质的不溶性固体的粗粉。该过程的PHBV回收相对于生物质的进料PHBV高于95％(重量/重量)，即70-80kg PHBV/h，这取决于生物质流速和纯度。在膜中和滤器提取过程中所得滤液都快速冷却到等于或者低于约45℃的温度，以确保PHBV在溶剂中沉淀。
实施例1.5：部分溶剂蒸发和用异戊醇洗涤PHB悬浮物以得到高孔隙率的脆性并且容易剪切的颗粒团快
将异戊醇和水中含有4-10％PHB的溶液中的PHB悬浮液以1,000kg/h的流速送入真空蒸发器中，并将从提取和纯化过程回收的含有溶解的异戊醇的水流以500-1000kg/h送入所述蒸发器中。然后将混合物通过直接蒸汽注射连续进行蒸发，以便在通过蒸发除去溶剂的同时，得到含有溶剂、水和PHB颗粒团块的悬浮液，将所述团块通过安装在系统的循环泵中的机械装置连续剪切。从该过程所得物质是PHB颗粒的悬浮液，所述PHB颗粒良好地分散在水和其中溶解的异戊醇中，将所述悬浮液从系统连续除去并送到下一阶段的溶剂提取，其中悬浮的PHB颗粒的浓度为4-20％(重量/重量)。
实施例1.6：从细分的PHB颗粒悬浮液提取异戊醇(溶剂)并同时洗涤和粉碎产物
将如实施例1.5中得到的细分的PHB颗粒的悬浮液(含有2-20％固体)以1000kg/h的流速送到溶剂提取(洗提)的搅拌的反应器中，在反应器中允许蒸汽以及水直接接触，直到除去溶解在水中的异戊醇，以及一些水，其将形成该系统的流出液蒸汽相。同时蒸发残留的异戊醇并将PHB颗粒在水中的悬浮液连续地进行额外的剪切过程，该过程使用实施例1.5中描述的类似装置。当完成溶剂提取过程时，得到PHB在水中的悬浮液，其是细分的，基本上纯并且没有溶剂，浓度为悬浮液中5-20％固体。然后冷却该悬浮液并进行过滤步骤，得到约50-80％湿度的PHB粗粉，将其随后干燥。

Claims (44)

1.从细菌的细胞生物质回收多羟基链烷酸酯(PHA)的方法，所述生物质通过发酵得到并且为水性悬浮液中的细胞生物质浆液的形式并且干细胞含量按重量计不低于约18％，所述方法的特征是它包括步骤：
i)将所述浓缩的细胞生物质浆液同时进行注射PHA溶剂、剧烈搅拌和在反应器内部快速加热的操作，以便引起细胞生物质的细胞壁破裂和含于细胞生物质中的PHA的溶解，并形成悬浮液，该悬浮液包含富含溶解的PHA的PHA溶剂、来自细胞生物质浆液的剩余水和所述浓缩的细胞生物质的不溶性残渣；
ii)将在反应器中形成的悬浮液进行分离步骤，以从剩余细胞生物质的不溶性残渣回收富含溶解的PHA的溶剂；
iii)将富含PHA的PHA溶剂溶液快速冷却到足以基本上沉淀所有溶解的PHA的温度；
iv)对含有水和其中溶解的杂质的在PHA溶剂中沉淀的PHA悬浮液进行冷微量过滤以便分离所沉淀的PHA的浓缩的糊状物；
v)将浓缩PHA的糊状物同时用水洗涤、加热和搅拌，以便促进蒸发一定量的溶剂，其足以得到悬浮液和剩余的溶剂和水，所述悬浮液含有具有高孔隙率并且为脆性并且容易剪切的PHA颗粒；
vi)对经洗涤和加热的PHA颗粒进行搅拌和剪切，以便将它们快速破碎，而通过向含有剩余溶剂和水的悬浮液注射水蒸汽进行剩余溶剂的提取，以便得到悬浮液中的纯的PHA颗粒；和
vii)从所述悬浮液分离纯化的PHA颗粒。
2.权利要求1的方法，其特征是所用的PHA溶剂选自：乙酸丁酯、乙酸异丁酯、乙酸戊酯、乙酸异戊酯、异丁醇、1-丁醇、1-戊醇(戊醇)、2-甲基-1-丁醇、3-甲基-1-丁醇(异戊醇)、3-戊醇、1-己醇、环己醇、丙酸丙酯、丙酸丁酯、丙酸异丁酯、丁酸乙酯、异丁酸异丁酯、和它们的混合物。
3.权利要求2的方法，其特征是所用的溶剂为异戊醇，或者异戊醇的异构体混合物。
4.权利要求3的方法，其特征是通过分馏作为乙醇发酵的副产物的杂醇油得到异戊醇，所述杂醇油主要由异戊醇和其异构体，以及杂质，如乙醇、正丙醇、异丁醇、正丁醇和水，组成。
5.权利要求4的方法，其特征是PHA选自聚-3-羟基丁酸酯(PHB)、聚(羟基丁酸酯-共-羟基戊酸酯)(PHBV)、和这些聚合物和共聚物的混合物。
6.权利要求5的方法，其特征在于使用微生物通过细菌发酵产生PHA，所述微生物能够使用从甘蔗提取的糖作为主要原料生物合成PHA，并且特征还在于用于产生该方法所需的热能和电能的主要能量来源是甘蔗渣。
7.权利要求1的方法，其特征是PHA选自聚-3-羟基丁酸酯(PHB)、聚(羟基丁酸酯-共-羟基戊酸酯)(PHBV)、和这些聚合物和共聚物的混合物。
8.权利要求1的方法，其特征是通过发酵得到并且待处理的细菌细胞生物质事先热失活。
9.权利要求1的方法，其特征是向浓缩的细胞生物质浆液注射溶剂的步骤包括注射液态PHA溶剂和蒸汽形式的PHA溶剂的操作，以便将细胞生物质加热到约90℃和基本上在大气压下溶剂的沸腾温度之间的温度，并形成：液相，其包含富含PHA的PHA溶剂和来自细胞生物质浆液的剩余水；通过残留细胞生物质的不溶性残渣定义的固相；和含有水和PHA溶剂的蒸汽的蒸汽相。
10.权利要求9的方法，其特征是它包括从容器的内部引出蒸汽相的额外步骤。
11.权利要求10的方法，其特征是在细胞破裂和PHA溶解步骤期间用从反应器引出的蒸汽相的冷凝得到的水流洗涤PHA糊状物。
12.权利要求1的方法，其特征是通过将发酵的培养液中悬浮的细胞生物质进行细胞生物质的絮凝和浓缩的操作得到浓缩的细胞生物质浆液。
13.权利要求12的方法，其特征是将为该方法提供的发酵的培养液中悬浮的细胞生物质用水进一步稀释，以便得到发酵的物质∶水质量比高达约3.0∶1.0。
14.权利要求13的方法，其特征是絮凝操作包括通过将经稀释的细胞生物质酸化到约1.5到约5.5的pH并通过加入碱化剂直到达到7到约12的pH而实现细胞生物质的凝结的步骤，通过加入絮凝剂进行含有积累的PHA的细胞生物质的絮凝操作。
15.权利要求14的方法，其特征是通过加入硫酸和磷酸的至少一种所定义的酸得到经稀释的细胞生物质的酸化。
16.权利要求14的方法，其特征是碱化剂包含氢氧化钙。
17.权利要求14的方法，其特征是进行酸化以便得到约2.0到约3.0的pH，进行碱化剂的加入以便将经稀释的细胞生物质的悬浮液的pH调节到约7到约12。
18.权利要求13的方法，其特征是絮凝操作包括通过加入碱化剂直到达到约7到约12的pH来凝结细胞生物质的步骤，通过加入絮凝剂实现含有积累的PHA的细胞生物质的絮凝。
19.权利要求18的方法，其特征是碱化剂包含氢氧化钙。
20.权利要求12的方法，其特征是絮凝操作包括通过酸化细胞生物质到约1.5到约5.5的pH，并通过加入碱化剂直到达到约7到约12的pH来凝结细胞生物质的步骤，通过加入絮凝剂实现含有积累的PHA的细胞生物质的絮凝。
21.权利要求20的方法，其特征是通过加入硫酸和磷酸的至少一种所定义的酸得到经稀释的细胞生物质的酸化。
22.权利要求20的方法，其特征是碱化剂包含氢氧化钙。
23.权利要求20的方法，其特征是进行酸化以便得到约2.0到约3.0的pH，进行碱化剂的加入以便将经稀释的细胞生物质的悬浮液的pH调节到约7到约12。
24.权利要求12的方法，其特征是絮凝操作包括通过加入碱化剂直到达到约7到约12的pH来凝结细胞生物质的步骤，通过加入絮凝剂实现含有积累的PHA的细胞生物质的絮凝。
25.权利要求24的方法，其特征是碱化剂包含氢氧化钙。
26.权利要求12的方法，其特征是通过倾析和离心操作的至少一种实现絮凝的生物质细胞的浓缩。
27.权利要求12的方法，其特征是将经发酵的絮凝的培养液中悬浮的细胞生物质浆液进行用水洗涤并浓缩到按重量计18％-45％，优选25％-45％的干细胞生物质。
28.权利要求27的方法，其特征是细胞生物质浆液的洗涤和浓缩步骤通过同时将细胞生物质浆液接受水流和离心力的影响来实现。
29.权利要求1的方法，其特征是对注射到细胞生物质浆液的液态PHA溶剂加热。
30.权利要求1的方法，其特征是分离富含其中溶解的PHA的PHA溶剂与反应器内形成的悬浮液中所含的剩余生物质的不溶性残渣的步骤包括膜微量过滤和在预涂层滤器中过滤操作的至少一种。
31.权利要求12的方法，其特征是分离富含其中溶解的PHA的PHA溶剂与反应器内形成的悬浮液中所含的剩余生物质的不溶性残渣的步骤包括通过低强度离心力的影响分离所述悬浮液的步骤。
32.权利要求31的方法，其特征是用于分离富含其中溶解的PHA的PHA溶剂与反应器内形成的悬浮液中所含的剩余生物质的不溶性残渣的低强度离心力通过旋液分离器得到，产生低浓度的所述残渣的悬浮液和浓缩所述残渣的另一悬浮液。
33.权利要求32的方法，其特征是将离开旋液分离器的生物质不溶性残渣的低浓度悬浮液在进行冷却步骤前快速进行额外分离步骤以完全除去残渣。
34.权利要求33的方法，其特征是通过膜微量过滤实现所述额外分离步骤，以便产生没有不溶性残渣的溶解在PHA溶剂中的PHA的溶液，和悬浮液，其浓缩了生物质不溶性残渣并且含有溶解在PHA溶剂中的PHA级分、水、灰和溶解在PHA溶剂中的有色化合物。
35.权利要求34的方法，其特征是将浓缩了细胞生物质的不溶性残渣的悬浮液进行过滤步骤，以便产生含有生物质不溶性残渣的粗粉，和溶解在溶剂中的PHA的过滤的溶液，其没有不溶性残渣并且将快速进行冷却步骤。
36.权利要求34的方法，其特征是溶解在PHA溶剂中并且没有不溶性残渣的PHA溶液按重量计占微量过滤中悬浮液的约60-90％，浓缩了细胞生物质的残渣的悬浮液按重量计占微量过滤中所述悬浮液的约10-50％。
37.权利要求32的方法，其特征是将离开旋液分离器的浓缩了生物质不溶性残渣的悬浮液在进行冷却步骤前进行过滤步骤以分离生物质不溶性残渣。
38.权利要求1的方法，其特征是对在PHA溶剂中沉淀的PHA的悬浮液进行冷微量过滤以便产生PHA浓度为约3.5％到8.0％w/w的PHA糊状物。
39.权利要求1的方法，其特征是它还包括干燥从水性介质分离的PHA颗粒的最后步骤，其中所述溶剂从所述水性介质中耗尽。
40.权利要求1的方法，其特征是在该方法的一些阶段中产生的水和PHA溶剂蒸汽经冷凝并分离成两个液体相：一个富含溶剂的液体相，其返回到该过程的PHA提取和回收步骤中；另一个含有很少溶剂的液体相，其在该过程中再循环以允许回收其中含有的PHA溶剂。
41.权利要求1的方法，其特征是加热发酵的细胞生物质、破坏所述细胞生物质的细胞壁和溶解细胞生物质中含有的PHA的步骤在足够短的总时间内进行以允许从含有最小分子量为约1,000,000Da的PHA的生物质得到最小分子量为约850,000Da的PHA。
42.权利要求41的方法，其特征是分离和冷却步骤在足够短的时间内进行以允许得到最小分子量为约750,000Da的PHA。
43.权利要求1的方法，其特征是在干燥后步骤(vi)中所得PHA颗粒具有40到400μm范围，优选100到200m范围的颗粒平均大小。
44.PHB，其特征是它根据前面权利要求任一项的方法产生。
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