DE69637253T2

DE69637253T2 - Verfahren zur isolierung von polyhydroxyalkanoaten aus pflanzen

Info

Publication number: DE69637253T2
Application number: DE69637253T
Authority: DE
Inventors: David P. Arlington MARTIN; Oliver P. Arlington PEOPLES; Simon F. Sherborn WILLIAMS
Original assignee: Metabolix Inc
Current assignee: Yield10 Bioscience Inc
Priority date: 1995-10-26
Filing date: 1996-10-23
Publication date: 2008-06-19
Anticipated expiration: 2016-10-24
Also published as: US6709848B1; US6083729A; JP2001517070A; JP2009112315A; ATE373722T1; JP2007277574A; EP0859858B1; EP0859858A1; AU7466396A; DE69637253D1; WO1997015681A1; AU722033B2; JP2008248258A; JP4422776B2

Description

ALLGEMEINER STAND DER TECHNIK
Die vorliegende Erfindung betrifft im Allgemeinen den Bereich der Isolierung von Polyestern aus Pflanzen.
Polyhydroxyalkanoate (PHA) sind eine Klasse natürlich vorkommende Polyester, die von zahlreichen Organismen als Reaktion auf Umweltbelastungen synthetisiert werden. Besprechungen sind Byrom, D., "Miscellaneous Biomaterials", in D. Byrom, Hrsg., "Biomaterials" MacMillan Publishers, London, 1991, S. 333–359; Hocking, P.J. und Marchessault, R.H., "Biopolyesters", in G.J.L. Griffin, Hrsg., "Chemistry and Technology of Biodegradable Polymers", Chapman und Hall, London, 1994, S. 48–96; Holmes, P.A., "Biologically Produced (R)-3-hydroxyalkanoate Polymers and Copolymers", in D.C. Bassett, Hrsg., "Developments in Crystalline Polymers", Elsevier, London, Band 2, 1988, S. 1–65; Lafferty et al., "Microbial Production of Poly-β-hydroxybutyric acid", H.J. Rehm und G. Reed Hrsg., "Biotechnology", Verlagsgesellschaft, Weinheim, Band 66, 1988, S. 135–176; Miller und Seebach, Angew. Chem. Int. Ed. Engi., 32:477–502 (1993); und Steinbuchel, A., "Polyhydroxyalkanoic Acids", Byrom, D., Hrsg., "Biomaterials", MacMillan Publishers, London, 1991, S. 123–213, zu entnehmen.
Die PHA-Biopolymere können anhand der Länge ihrer Seitenketten in zwei Gruppen unterteilt werden (1). Diejenigen mit kurzen Seitenketten (1a), wie Polyhydroxybutyrat (PHB), ein Homopolymer aus R-3-Hydroxybuttersäureeinheiten, sind kristalline Thermoplaste, wohingegen PHA mit langen Seitenketten (1b) elastomerer sind. Erstere sind seit ungefähr siebzig Jahren bekannt (Lemoigne und Roukhelman, Annales des Fennentations, 5:527–536 (1925)), wohingegen die letzteren Materialien erst in den frühen 1980er Jahren identifiziert wurden. De Smet et al., J. Bacteriol., 154:870–878 (1983).
Aufgrund der frühen Entdeckung und der wünschenswerten physikalischen Eigenschaften sind die Materialien mit kurzen Seitenketten umfassend untersucht. Die PHA-Polymere, die natürliche Thermoplaste darstellen, können unter Verwendung herkömmlicher Polymertechnologie verarbeitet werden und weisen für die Industrie nützliche Eigenschaften auf, wie biologische Abbaubarkeit im Boden und in Wasser, Biokompatibilität und gute Barriereeigenschaften. Dank dieser Eigenschaften sind diese Materialien in einem großen Bereich industrieller Anwendungen nützlich.
Die PHA-Polymere können bis zu 90% des trockenen Zellgewichts von Bakterien ausmachen und werden als diskrete Grana in bakteriellen Zellen gefunden. Diese PHA-Grana akkumulieren als Reaktion auf Nährstoffbegrenzungen und dienen als Kohlenstoff- und Energiereservematerialien. Zur Herstellung jeder Klasse diese Polymere werden von Mikroorganismen klar unterscheidbar Wege verwendet. Der Weg, der zu Polyhydroxyalkanoaten mit kurzen Seitenketten (SSCPHA) führt, umfasst drei Enzyme, Thiolase, Reductase und PHB-Synthase (gelegentlich auch Polymerase genannt). Auf diesem Weg wird das Homopolymer PHB durch Kondensation von zwei Molekülen Acetyl-Coenzym A unter Bildung von Acetacetyl-Coenzym A, gefolgt von der Reduktion dieses Zwischenprodukts zu R-3-Hydroxybutyryl-Coenzym A und anschließender Polymerisierung synthetisiert (2a). Das letzte Enzym auf diesem Weg, die Synthase, hat eine Substratspezifität, mit der auch monomere C3–C5-Einheiten, einschließlich R-4-Hydroxysäure- und R-5-Hydroxysäureeinheiten, erfasst werden. Dieser biosynthetische Weg findet sich beispielsweise in den Bakterien Zoogloea ramigera und Alcaligenes eutrophus.
Der biosynthetische Weg, der zur Herstellung der Polyhydroxyalkanoate mit langen Seitenketten (LSCPHA) führt, ist teilweise noch unbekannt, es wird derzeit jedoch angenommen, dass die monomeren Hydroxyacyleinheiten, die zu den LSCPHA führen, über die β-Oxidation von Fettsäuren und den Fettsäureweg derivatisiert werden (2b). Die auf diesen Wegen gebildeten R-3-Hydroxyacyl-Coenzym-Substrate werden anschließend von PHA-Synthasen polymerisiert, die eine Substratspezifität aufweisen, die größere monomere Einheiten im Bereich C6–C14 begünstigt: PHA mit langen Seitenketten werden beispielsweise von Pseudomonas hergestellt.
Die Biosynthese von PHA wurde in einem großen Bereich von Bakterien sowohl auf biochemischer als auch auf genetischer Ebene untersucht und von Steinbuchel et al., FEMS Microbiology Reviews, 103:217–230 (1992) in einem Überblick zusammengestellt. Seit der Identifizierung und Charakterisierung der ersten PHA-Synthase-Gene 1989 (Peoples und Sinskey, J. Biol Chem., 264:15298–15303 (1989); und US-Patent Nr. 5,229,279 , 5,245,023 und 5,250,430 an Peoples und Sinskey) wurde eine Vielzahl anderer mikrobieller PHA-Polymerasen untersucht und deren DNA und Aminosäurensequenzen veröffentlicht. Steinbuchel et al., FEMS Microbiology Reviews, 103:217–230 (1992). Kürzlich wurden zwei Untereinheiten der PHA-Synthase von Chromatium vinosum (Liebersgesell, M. und Steinbuchel, A., European J. Biochem., 209:135–150 (1992); und WO 93/02194 ) und von Thiocystis violacea (Liebersgesell, M. und Steinbuchel, A., Appl. Microbiol. Biotechnol. 38:493–501 (1993)) beschrieben.
Die Gene, die für die Enzyme kodieren, die für die Herstellung von SSCPHA in beispielsweise Z. ramigera und A. eutrophus verantwortlich sind, wurden isoliert und sequenziert. Peoples und Sinskey, Prog. Biotechnol. 3:51–56 (1987); Peoples et al., J. Biol. Chem., 262:97–102 (1987); Peoples und Sinskey (1989), J. Biol. Chem. 264:15298–15303, J. Biol. Chem. 264:15293–15297, und Molecular Microbiol. 3:349–357; Slater et al., J. Bacteriol., 170:4431–4436 (1988); und Schubert et al., J. Bacteriol., 170:5837–5847 (1988).
PHA-erzeugende Mikroorganismen produzieren PHA zu mehr als 60% der gesamten Trockenmasse und lassen sich ohne weiteres durch organische Lösungsmittel extrahieren. Lafferty et al., "Microbial Production of Poly-β-Hydroxybutyric Acid", in H.J. Rehm und G. Reed, Hrsg., "Biotechnology", Verlagsgesellschaft, Weinheim, Band 66, 1988, S. 135–176. Bei Pflanzen wird die Extraktion und Rückgewinnung von PHA durch die Gegenwart großer Mengen an Pflanzenöl sowie die geringen prozentualen Anteile an PHA wesentlich kompliziert. Diese komplizierenden Faktoren machen die erfolgreiche Extraktion, Abtrennung und Rückgewinnung von PHA aus Pflanzen schwieriger. WO 96/06179 (Zeneca) offenbart beispielsweise ein Verfahren zur Gewinnung von PHA aus Materie, die aus lebenden Organismen gewonnen wird, umfassend das Lösen des PHA in einem Lösungsmittel, das ein niederes Keton, ein Dialkylether oder ein niederer Alkohol oder ein Monocarbonsäureester davon ist, wobei das Lösungsmittel vorzugsweise auf mindestens 100°C erwärmte wird.
Es besteht ein Bedarf an der Entwicklung von Verfahren zur Verarbeitung und Reinigung von Polyhydroxyalkanoaten aus pflanzlicher Biomasse im Großmaßstab. Eine Aufgabe der Erfindung ist somit die Bereitstellung von Verfahren zur Verarbeitung von PHA aus pflanzlicher Biomasse im Großmaßstab. Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung von Verfahren zum Isolieren von PHA aus transgenen Ölpflanzen. Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung von Verfahren zur Verarbeitung von pflanzlicher Biomasse, die aus Ölsaatpflanzen abgeleitet ist, sodass die Rückgewinnung von Nicht-PHA-Erzeugnissen, wie Pflanzenölen, ebenfalls maximiert wird.
KURZDARSTELLUNG DER ERFINDUNG
Es werden Verfahren zum Abtrennen eines Polyhydroxyalkanoats ("PHA") aus Pflanzen bereitgestellt. In einer Ausführungsform werden Verfahren zum Isolieren von PHA aus einer pflanzlichen Biomasse bereitgestellt, die von transgenen Kulturpflanzen abgeleitet ist, welche Pflanzenöle enthalten. Diese Verfahren ermöglichen vorteilhaft die Rückgewinnung sowohl des Öls als auch der PHA aus der pflanzlichen Biomasse. Zum Isolieren eines PHA wird in einer Ausführungsform eine Biomasse, die von einer Ölpflanze abgeleitet ist, durch beispielsweise Mahlen, Zerdrücken oder Walzen vorbereitet. Dann wird das Öl mit einem ersten Lösungsmittel, in dem das Öl löslich ist und das PHA nicht sehr löslich ist, aus der Biomasse extrahiert, um das Öl vom PHA zu trennen. Anschließend wird die im Wesentlichen ölfreie pflanzliche Biomasse mit einem zweiten Lösungsmittel extrahiert, in dem das PHA löslich ist, um das PHA von der Biomasse zu trennen, wobei das Abtrennen des PHA aus der im Wesentlichen ölfreien Biomasse nicht darin besteht, das PHA in einem Lösungsmittel, das Aceton, Dialkylether, Methanol, Ethanol oder ein Propanol oder ein Monocarbonsäureester davon mit oder ohne Wasser ist, zu lösen und das PHA daraus zu gewinnen. Als Alternative kann die PHA enthaltende Biomasse mit einem chemischen oder biochemischen Wirkstoff, wie einem Enzym, behandelt werden, um das PHA chemisch in ein PHA-Derivat umzuwandeln. Das derivatisierte PHA wird dann unter Verwendung von beispielsweise einem physikalischen Trennverfahren, wie Destillation, Extraktion oder Chromatographie, aus der Mischung abgetrennt. Vorteilhaft lassen sich durch die Verwendung des Verfahrens Pflanzenöle, PHA und PHA-Derivate im Großmaßstab aus Pflanzen, wie transgenen Ölpflanzen, zurückgewinnen und reinigen.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1a ist eine Darstellung der Struktur von Polyhydroxyalkanoaten mit kurzen Seitenketten.
1b ist eine Darstellung der Struktur von Polyhydroxyalkanoaten mit langen Seitenketten.
2a ist eine Darstellung eines biosynthetischen Wegs zur Synthese des Polyhydroxyalkanoats mit kurzen Seitenketten Polyhydroxybutyrat.
2b ist eine Darstellung eines biosynthetischen Wegs zur Synthese von Polyhydroxyalkanoaten mit langen Seitenketten.
3 ist ein Ablaufdiagramm zur Darstellung einer Ausführungsform eines Verfahrens zum Abtrennen von Polyhydroxyalkanoaten aus Pflanzen.
4 ist ein Ablaufdiagramm zur Darstellung einer anderen Ausführungsform eines Verfahrens zum Abtrennen von Polyhydroxyalkanoaten aus Pflanzen.
GENAUE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Es werden Verfahren zum Abtrennen eines Polyhydroxyalkanoats ("PHA") aus pflanzlicher Biomasse, die Pflanzenöl und Mehl enthält, bereitgestellt. Zu PHA, die aus pflanzlicher Biomasse isoliert werden können, gehören Zersetzungs- oder andere Produkte von PHA, wie Monomere, Dimere, Oligomere, Säuren, Ester, Amide und Lactone, die durch chemische, biochemische oder physikalische Behandlung während der Verarbeitung der Biomasse oder durch Verfahren, die innerhalb der pflanzlichen Biomasse ablaufen, gebildet werden können. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die PHA aus einer Biomasse isoliert, die von einer transgenen Ölpflanze abgeleitet ist. Neben der Maximierung der Rückgewinnung von PHA-Materialien wird auch die Rückgewinnung von kommerziell nützlichen Nicht-PHA-Erzeugnissen aus der Biomasse maximiert. Im Falle der PHA-Abtrennung aus Samen einer Ölpflanze können auch das Öl und das Mehl isoliert und anschließend kommerziell genutzt werden.
I. MATERIALIEN ZUR ISOLIERUNG VON PHA
A. PHA-Materialien, die isoliert werden können
Zu PHA-Materialien, die aus pflanzlicher Biomasse isoliert werden können, gehören Monomere, Polymere und andere Erzeugnisse, die von PHA abgeleitet sind, einschließlich chemisch und biologisch modifizierter Derivate. Die PHA-Materialien sind in einer Ausführungsform derart definiert, dass sie eine oder mehrere Einheiten, beispielsweise 10 bis 100.000 und vorzugsweise 100–30.000 Einheiten, der folgenden Formel enthalten -OCR¹R²(CR³R⁴)_nCO-; Iwobei n 0 oder eine ganze Zahl, beispielsweise 1–15 und in einer bevorzugten Ausführungsform 1–4 ist; und
worin R¹, R², R³ und R⁴ jeweils unabhängig voneinander Kohlenwasserstoffreste, einschließlich langkettiger Kohlenwasserstoffreste, mit Halogen und Hydroxyl substituierte Reste, Hydroxylreste, Halogenreste, mit Stickstoff substituierte Reste, mit Sauerstoff substituierte Resten und/oder Wasserstoffatome sein können.
Im Sinne der Erfindung ist die Formel -(CR³R⁴)_n derart definiert, dass sie, ohne darauf beschränkt zu sein, die folgenden Formeln enthalten kann:
-CR³R⁴- (worin n = 1);
-CR³ R⁴CR^3'R^4'- (worin n = 2); und
-CR³R⁴CR^3'R^4'CR³ ^''R⁴ ^''- (worin n = 3);
worin R³, R⁴, R^3', R^4', R³ ^'' und R⁴ ^'' jeweils unabhängig voneinander Kohlenwasserstoffreste, einschließlich langketti ger Kohlenwasserstoffreste, mit Halogen und Hydroxyl substituierte Reste, Hydroxylreste, Halogenreste, mit Stickstoff substituierte Reste, mit Sauerstoff substituierte Resten und/oder Wasserstoffatome sein können. Somit umfasste Formel I Einheiten, die von 3-Hydroxysäuren (n = 1), 4-Hydroxysäuren (n = 2), 5-Hydroxysäuren (n = 3) abgeleitet sind.
Diese Einheiten können wie im Falle eines Homopolymers gleich sein oder sie können wie bei einem Copolymer oder Terpolymer aus zwei oder mehr verschiedenen Einheiten ausgewählt sein. In einer Ausführungsform weisen die Polymere ein Molekulargewicht von mehr als 300, beispielsweise zwischen 300 und 1.000.000, und in einer bevorzugten Ausführungsform zwischen 10.000 und 3.000.000 Dalton auf. In einer Ausführungsform können Homopolymere isoliert werden, wie beispielsweise Polyhydroxybutyrat, Polyhydroxyvalerat oder Polymilchsäure. Ferner können PHA-Copolymere oder -Terpolymere, die mindestens zwei Monomere eines Hydroxyalkanoats enthalten, wie Hydroxybutyrat, Hydroxyvalerat, Hydroxyhexanoat, Hydroxyheptanoat, Hydroxyoctanoat, Hydroxynonanoat und Hydroxydecanoat, isoliert werden. Es können auch PHA, einschließlich Monomere und Polymere und Derivate von 3-Hydroxysäuren, 4-Hydroxysäuren und 5-Hydroxysäuren, isoliert werden.
Die PHA-Polymere können auch Nicht-Hydroxysäureeinheiten, wie langkettige Fettsäuren, Aminosäuren, Kohlenhydrate, phosphor- und schwefelhaltige Verbindungen, sowie Triole, wie Glycerol, enthalten oder entsprechend modifiziert sein. Zu PHA-Produkten, die sich isolieren lassen, gehören die Derivate, die durch physikalische, chemische oder biochemische Behandlung der Biomasse oder durch Verfahren innerhalb der Biomasse gebildet werden, einschließlich Hydroxysäuremonomere, -dimere, -trimere, lineare und cyclische Oligomers und Lactone. Zu PHA-Derivatprodukten, die sich isolieren lassen, gehören Ester, Diole, ungesättigte Verbindungen, Aldehyde, Säuren, Alkohole, Lactone, cyclische und lineare Ester, Amide und Thioester von Polyhydroxyalkanoaten oder ein Monomer, das von dem Polyhydroxyalkanoat abgeleitet ist.
Zu repräsentativen PHA-Produkten, die sich aus pflanzlicher Biomasse ableiten lassen, gehören:
Ester, definiert durch die Formel: HOCR¹R²(CR³R⁴)_nCO₂R⁵;
Amide, definiert durch die Formel: HOCR¹R²(CR³R⁴)CONR⁵R⁶;
Thioester, definiert durch die Formel: HOCR¹R²(CR³R⁴)_nCOSR⁵;
Säuren, definiert durch die Formel: HOCR¹R²(CR³R⁴)_nCO₂H; Ether, definiert durch die Formel: R⁶OCR¹R²(CR³R⁴)_nCO₂R⁵;
Ester, definiert durch die Formel: R⁶CO₂CR¹R²(CR³R⁴)_nCO₂R⁵;
ungesättigte Verbindungen, definiert durch die Formeln: R¹R²C=CR³(CR⁴R⁵)_nCO₂R⁶; und R¹R²R³CC(R⁴)=C(R⁵)CO₂R⁶; Diole, definiert durch die Formel: HOCR¹R²(CR³R⁴)CH₂OH;
Lactone oder Makrolide, definiert durch die Formel:
worin x eine ganze Zahl beispielsweise von 1 bis 10 ist;
und
Ketone oder Aldehyde, definiert durch die Formel: HOCR¹R²(CR³R⁴),COR⁵; HOCR¹R²(CR³R⁴)_nCHO; R¹CO(CR^ZR³)COOR⁴; und R¹CO(CR²R³)_nCOR⁴; worin n 0 oder eine ganze Zahl ist; und
worin R¹, R², R³, R⁴, R⁵ und R⁶ jeweils unabhängig voneinander Kohlenwasserstoffreste, einschließlich langkettiger Kohlenwasserstoffreste, mit Halogen und Hydroxyl substituierte Reste, Hydroxylreste, Halogenreste, mit Stickstoff substituierte Reste, mit Sauerstoff substituierte Resten und Wasserstoffatome sind und worin -(CR²R³)_n- wie vorstehend definiert ist.
Kommerziell nützliche monomere PHA-Produkte, wie 3-Hydroxybuttersäure oder Krotonsäure, oder Alkylester davon, einschließlich Methyl-3-hydroxybutanoat, Ethyl-3-hydroxybutanoat, Propyl-3-hydroxybutanoat und Butyl-3-hydroxybutanoat, können ebenfalls isoliert werden. Die von PHA abgeleiteten Hydroxysäuremonomere sind neben den Formen mit höherem Molekulargewicht eine Quelle wertvoller Chemikalien, die kommerziell entweder mit oder ohne weitere Modifizierung verwendbar sind.
Im Sinne der Erfindung bezieht sich der Begriff "PHA-Materialien" oder "PHA" oder "Polyhydroxyalkanoate" auf Monomere, Polymere und anderer auf PHA basierenden Materialien, die vor der Verarbeitung ursprünglich in der Biomasse vorhanden waren, und auf Produkte, die während der Verarbeitung gebildet werden, wie Produkte, die durch Zersetzung oder durch Verfahren, die innerhalb der pflanzlichen Biomasse ablaufen, gebildet werden, oder Derivatprodukte, die durch Behandlung der Biomasse mit chemischen oder biologischen Wirkstoffen zur Verursachung einer chemischen Umwandlung gebildet wurden.
B. Pflanzenquellen, aus denen PHA isoliert werden können
Pflanzenarten
PHA und PHA-Produkte lassen sich aus pflanzlicher Biomasse isolieren, die von Pflanzen, wie Sojabohnen, Baumwolle, Kokosnüssen, Erdnüssen, Rapssaat, Sonnenblumenkernen, Oliven, Palmen, Sesamsaat, Leinsamen, Rizinus, Saflorsaat, Tabak und Kartoffel, abgeleitet ist. In einer bevorzugten Ausführungsform kann die Biomasse von einer Ölpflanze abgeleitet sein, insbesondere Rapssaat, Sonnenblumenkernen, Saflorsaat, Leinsamen und Sojabohnen. Zusätzlich zu den PHA-Polymeren kann während der Verarbeitung das Pflanzenöl in den Saatpflanzen isoliert und zurückgewonnen werden. Pflanzenöle machen in der Regel 10–50 Gew.-% der Saat aus. Die weltweite Nachfrage nach Pflanzenöl ist erheblich. Die Verfahren zur Verarbeitung der pflanzlichen Biomasse können an die Eigenschaften des fraglichen zu isolierenden PHA-Polymers oder -Derivats und an die Art der Kulturpflanzen und der zu extrahieren Pflanzenbestandteile angepasst werden.
Produktion von transgenen Pflanzen
Die Verwendung von transgenen Ölpflanzen bietet zahlreiche Vorteile. Transgene Kulturpflanzen zur Herstellung von PHA können unter Verwendung von Verfahren gemäß dem Stand der Technik erhalten werden. Mithilfe der Produktion von transgenen Kulturpflanzen können PHA-Polymere zu einem Preis als auch in einem Maßstab hergestellt werden, der gegenüber Kunststoffen aus der Petrochemie konkurrenzfähig ist. PHA-Polymere, die aus transgenen Pflanzen abgeleitet sind, oder deren Derivate können zu kommerziell nützlichen Formen verarbeitet und aus pflanzlicher Biomasse abgetrennt werden. Der Ursprungsort von PHA in der Kulturpflanze (z. B. Blätter, Saat, Stängel oder Kombinationen davon) kann verschieden sein, um die Ausbeute an PHA aus der Pflanze zu maximieren.
Die Gene, die für die Enzyme kodieren, die für die Herstellung von PHA mit kurzen Seitenketten in beispielsweise Z. ramigera und A. eutrophus verantwortlich sind, wurden identifiziert, isoliert und sequenziert. Peoples und Sinskey, Prog. Biotechnol. 3:51–56 (1987); Peoples et al., J. Biol. Chem., 262:97–102 (1987); Peoples und Sinskey (1989), J. Biol. Chem. 264:15298–15303, J. Biol. Chem. 264:15293–15297, und Molecular Microbiol. 3:349–357; Slater et al., J. Bacteriol., 170:4431–4436 (1988); und Schubert et al., J. Bacteriol., 170:5837–5847 (1988). Es hat sich herausgestellt, dass sie in A. eutrophus ein Operon, die Gene phbC-phbA-phbB, bilden, das für die Synthase, Thiolase bzw. Reductase von PHA mit kurzen Seitenketten kodiert. Es hat sich herausgestellt, dass die Synthase-Enzyme von Pseudomonas-Organismen vom Genort pha kodiert werden. Dieser Genort enthält zwei eng verwandte PHA-Synthasegene, phaA und phaC, sowie ein Depolymerasgen, das das Produkt des phaB-Gens ist.
Verfahren, die zur Produktion von PHA-Polymeren in transgenen Kulturpflanzenarten verwendet werden können, sind beschrieben in: US-Patent Nr. 5,245,023 und 5,250,430 ; WO 91/00917 ; WO 92/19747 ; WO 93/02187 ; WO 93/02194 ; WO 94/11519 ; WO 94/12014 ; WO 94/23027 ; WO 95/05472 ; Poirier et al., Science, 256:520–523 (1992), Poirier et al., Bio/Technol., 13:142–150 (1995), und Nawrath et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:12760–12764 (1994).
Zur Bildung einer transgenen Kulturpflanzenart wird ein Gen, das für eine PHA-Synthase kodiert, von einem Mikroorganismus zu Pflanzenzellen transferiert, um das geeignete Produktionsniveau für das PHA-Synthaseenzym zu erhalten. Das Gen kann aus einem Mikroorganismus, wie Acinetobacter, Aeromonas, Alcaligenes, Azotobacter, Bacillus, Brevibacterium, Corynebacterium, Chromatium, Flavobacterium, Halobacterium, Pseudomonas, Nocardia, Rhodococcus, Thiocystis, Streptomyces, Streptococcus oder Zoogloea, gewonnen werden.
Es können auch weitere biosynthetische PHA-Gene bereitgestellt werden, beispielsweise ein Acetacetyl-CoA-Reductasegen oder andere Gene, die für Enzyme kodieren, welche zur Synthese der Substrate für die PHA-Synthaseenzyme erforderlich sind. Die Expression in verschiedenen Pflanzengeweben oder -organellen kann mithilfe von Verfahren gesteuert werden, die dem Fachmann bekannt sind. Gasser und Fraley, Science, 244:1293–1299 (1989). PHB wird in gentechnisch veränderten Pflanzensystemen mithilfe von herkömmlichen Techniken produziert. Poirer, Y. et al., Science, 256:520–523 (1992); Poirier, Y. et al., Bio/Technol., 13:142–150 (1995); und Nawrath, C. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:12760–12764 (1994).
In einer bevorzugten Ausführungsform beträgt der PHA-Gehalt der pflanzlichen Biomasse vor der Extraktion mindestens 1 Gew.-%, bezogen auf die Trockenmasse der Biomasse, mehr bevorzugt zwischen 5 und 95 Gew.-%, bezogen auf die Trockenmasse der Biomasse, und in einer anderen bevorzugten Ausführungsform zwischen etwa 5 und 60 Gew.-%, bezogen auf die Trockenmasse der Biomasse, am meisten bevorzugt- zwischen 10 und 60%. Vorzugsweise wird mindestens 24% des PHA bei dem Verfahren zum Abtrennen von Öl zurückgewonnen.
II. VERFAHREN ZU ISOLIEREN VON PHA AUS PFLANZEN
A. Vorbereiten der pflanzlichen Biomasse
Die PHA enthaltende pflanzliche Biomasse, beispielsweise eine transgene Ölpflanze, die ein heterologes PHA-Synthasegen enthält, wird angebaut und geerntet. Die pflanzliche Biomasse kann vor der Extraktion der PHA-Polymere unter Verwendung von Verfahren gemäß dem Stand der Technik, wie Rühren, Erwärmen, Kühlen, Druck, Vakuum, Ultraschallbehandlung, Zentrifugieren und/oder der Bestrahlen, vorbereitet werden. Der Begriff "pflanzliche Biomasse" bezieht sich im Sinne der Erfindung auf Pflanzenbestandteile, einschließ lich Saat, Blätter, Stängel und Stamm. Darüber hinaus kann die pflanzliche Biomasse unter Verwendung von jeder beliebigen Kombination oder mehreren Kombinationen von Verfahren, einschließlich Trocknen, Enthülsen, Säubern, Reifen, Wiegen, Aufbrechen, Abschuppen, Pressen, Walzen, Mahlen, Kochen, Zerdrücken, Absetzen und/oder Filtern vorbereitet werden. Die Verwendung dieser Verfahren zum Trennen von Öl und Mehl bei der Verarbeitung von ölhaltigen Pflanzen ist in "Oil Crops of the World", G. Röbblen et al., Hrsg., McGraw-Rill Publishing Company, 1989, Kapitel 11, beschrieben. Ferner umfassen Verfahren, die zum Vermahlen von Getreide verwendet werden, einschließlich sowohl trockener als auch nasser Mahlansätze, das Trennen des ölhaltigen Keims von dem stärkehaltigen Nährgewebe. Dies kann durch Zentrifugieren oder Windsichten erreicht werden, wie beispielsweise in "Corn Chemistry and Technology", Ausgabe 1994, Watson, S. A. und Ramstad, P. E., Hrsg., American Association of Cereal Chemists Inc., St. Paul, Minnesota, beschrieben.
B. Extraktion der pflanzlichen Biomasse
Die PHA-Monomere, -Polymers und -Derivate können unter Verwendung von geeigneten Mitteln, einschließlich Extraktion und/oder Waschen in Lösungsmittel, Extraktion und/oder Waschen in Wasser, Zerdrücken, Wärmebehandlung, Enzymbehandlung, Zentrifugieren, Extraktion mit superkritischer Fluid, die Behandlung unter erhöhtem oder vermindertem Druck, Chromatographie, Destillation, Schmelzen oder der Behandlung mit Reagenzien zur Förderung der Abtrennung der PHA-Materialien, aus der pflanzlichen Biomasse entfernt werden.
Es können auch dem Stand der Technik entsprechende Verfahren zum Extrahieren des Öls aus dem vorbereiteten Material verwendet werden, wie das Austreiben von Öl unter Druck, wobei das Öl mechanisch aus dem ölhaltigen Material gedrückt wird, und die Lösungsmittelextraktion mit Druckvorstufe, wobei ein Teil des Öls mithilfe von Austreibmitteln und der Rest durch Extraktion mit einem organischen Lösungsmittel, wie einem Kohlenwasserstoff, beispielsweise Hexan, entfernt wird. Weiterhin können superkritische Gase, einschließlich Kohlendioxid und Propan, verwendet werden. Zu weiteren Verfahren gehören die direkte Lösungsmittelextraktion, wobei das Öl direkt mit einem organischen Lösungsmittel aus behandelter Saat entfernt wird; Propanraffinieren zum Abtrennen von Fett und Fettspalten unter Verwendung der Hydrolyse von Fett oder Öl mit Wasser zur Bildung von Glycerol und Fettsäure. "Oil Crops of the World", G. Röbblen et al., Hrsg., McGraw-Rill Publishing Company, 1989; "Liquid Extraction", R. Treybal, Ed., McGraw-Rill Book, New York, 1951; und "World Oilseeds: Chemistry, Technology, and Utilization", D. K. Salunkhe et al., Hrsg., Van Nostrand Reinhol, New York 1992.
Extraktion von Öl aus pflanzlicher Biomasse
In dem Ablaufdiagramm in 3 ist ein bevorzugtes Verfahren zum Isolieren der PHA aus einer pflanzlichen Biomasse dargestellt. In dem Verfahren wird die PHA enthaltende pflanzliche Biomasse fakultativ zuerst wie vorstehend beschrieben vorbereitet. Die vorbereitete oder nicht vorbereitete PHA enthaltende pflanzliche Biomasse wird dann in einem Lösungsmittel extrahiert, in dem das Öl löslich ist und in dem das PHA und das Mehl nicht sehr löslich sind, um den größten oder den gesamten Teil des Öls aus der PHA enthaltenden pflanzlichen Biomasse zu entfernen. Das Lösungsmittel ist derart ausgewählt, dass es ein gutes Extraktionsmittel für das Öl und ein schlechtes Extraktionsmittel mit niedriger Löslichkeit für das PHA und das Pflanzenmehl darstellt. Die Extraktion der PHA-Öl-Mehl-Mischung ergibt, wie im Ablaufdiagramm in 3 dargestellt, eine Ölfraktion, die im Wesentlichen frei von PHA ist (die beispielsweise weniger als etwa 10 Gew.-% PHA enthält), und eine im Wesentlichen ölfreie PHA-Mehl-Mischung (die beispielsweise weniger als etwa 10 Gew.-% Öl enthält). Die PHA-Mehl-Mischung wird anschließend mit einem zweiten Lösungsmittel extrahiert, in dem die PHA löslich sind, um gereinigte PHA-Materialien zu erhalten. Als Alternative kann die PHA-Mehl-Mischung chemisch oder enzymatisch behandelt werden, um PHA-Derivate zu erzeugen, die anschließend aus dem Mehl isoliert werden, wie in 3 dargestellt.
Das erste Lösungsmittel, das zur Extraktion des Öls aus der pflanzlichen Biomasse verwendet wird, wird entsprechend seines Vermögens, das Öl zu lösen, ausgewählt. Vorzugsweise wird ein Lösungsmittel verwendet, in dem das Öl löslich ist und in dem das PHA und das Pflanzenmaterial nicht sehr löslich sind. Zu geeigneten Lösungsmitteln gehören Kohlenwasserstoffe, wie Propan, Butan, Pentan, Hexan, Heptan, Octan, Nonan und Decan. Der Begriff "Lösungsmittel" umfasst im Sinne der Erfindung Lösungsmittel sowie Lösungsmittelmischungen, wie Mischungen aus Kohlenwasserstoffen. Das erste Lösungsmittel wird vorzugsweise derart gewählt, dass das PHA zu weniger als 1% mehr bevorzugt zu weniger als 0,1%, und das Öl zu mehr als 10% (Gew./Vol., Raumtemperatur) löslich ist.
Zum Isolieren des PHA und der Ölbestandteile aus der Biomasse werden Lösungsmittel zur Verwendung bei der Extraktion gewählt, die die unterschiedliche physikalische Natur und die unterschiedlichen Löslichkeitseigenschaften des PHA und der Ölbestandteile der Biomasse ausnutzen. Die Isolierschritte sind an das fragliche PHA, den Pflanzenwirt oder die Kombination PHA/Pflanzenwirt angepasst. Bei der Extraktion von PHB und LSCPHA aus PHA enthaltender Biomasse aus transgenen Pflanzen werden beispielsweise auf der Grundlage der Löslichkeit unterschiedliche Lösungsmittel oder Lösungsmittelkombinationen verwendet.
In der Ausführungsform, in der das PHA von dem PHA-Mehl-Produkt durch Behandlung mit einem zweiten Lösungsmittel abgetrennt wird, wird das zweite Lösungsmittel (Lösungsmittel 2 in 3) auf der Grundlage seiner Fähigkeit, ein gutes Extraktionsmittel für PHA und ein schlechtes Extraktionsmittel für das Mehl zu sein, ausgewählt. Zu verwendbaren Lösungsmitteln gehören Lösungsmittel oder Lösungsmittelmischungen, einschließlich chlorierter organischer Lösungsmitteln, wie Chloroform, Methylenchlorid, Dichlorethan, Trichlorethan, Tetrachlorethan und Dichloracetat. Beispielsweise kann mit Kohlenwasserstoff stabilisiertes Chloroform verwendet werden. Zu anderen verwendbaren Lösungsmitteln, die zur Extraktion von PHA aus mikrobiellen Quellen verwendet wurden, gehören Alkylcarbonate, wie Propylencarbonat und Ethylencarbonat, Trifluorethanol, Essigsäureanhydrid, Dimethylformamid, Ethylacetacetat, Triolein, Toluol, Dioxan, Tetrahydrofuran, Diethylether, Pyridin, Hydroxysäuren und Alkohole mit mehr als 3 Kohlenstoffatomen sowie Mischungen davon. Lafferty et al., "Microbial Production of Poly-β-Hydroxybutyric Acid", in H.J. Rehm und G. Reed, Hrsg., "Biotechnology", Verlagsgesellschaft, Weinheim, Band 66, 1988, S. 135–176. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das zweite Lösungsmittel ein chloriertes organisches Lösungsmittel oder ein Alkylcarbonat. Außerdem haben das erste und das zweite Lösungsmittel in einer bevorzugten Ausführungsform Siedepunkte zwischen Raumtemperatur und 400°C, mehr bevorzugt zwischen 30°C und 250°C.
Die Schritte der Lösungsmittelextraktion können auch unter Verwendung einer Extraktion mit superkritischem Fluid durchgeführt werden, wobei ein Gas, wie Ethylen, Propylen, Propylenoxid, Butan oder Kohlendioxid, verwendet wird. In einer bevorzugten Ausführungsform hat das Gas einen Siedepunkt zwischen –250°C und Raumtemperatur, vorzugsweise zwischen –150°C und –20°C. Das PHA kann auch in geschmolzenem Zustand extrahiert werden.
In einer alternativen Ausführungsform wird die PHA-Mehl-Mischung, wie im Ablaufdiagramm in 3 dargestellt, mit einem chemischen oder biochemischen Wirkstoff, wie einem Enzym, behandelt, um die PHA, wie nachstehend ausführlich beschrieben, in PHA-Derivate umzuwandeln. Dann werden die PHA-Derivate von der pflanzlichen Biomasse, sofern erforderlich, unter Verwendung von einem oder mehreren anschließenden physikalischen Trennschritten, wie Destillation, Extraktion, Zentrifugieren, Filtrierung oder Chromatographie, abgetrennt.
Extraktion von PHA und Öl
In einer anderen Ausführungsform, die in dem Ablaufdiagramm in 4 dargestellt ist, wird die PHA enthaltende pflanzliche Biomasse fakultativ zuerst wie vorstehend beschrieben vorbereitet. Die vorbereitete oder nicht vorbereitete PHA enthaltende pflanzliche Biomasse wird dann mit einem Lösungsmittel lösungsmittelextrahiert, in dem das Öl und die PHA löslich sind und in dem das Mehl eine geringe Löslichkeit aufweist, um das Öl und die PHA im Wesentlichen aus dem Pflanzenmehl zu entfernen, sodass beispielsweise weniger als etwa 10 Gew.-% an Öl und PHA in dem Pflanzenmehl zurückbleiben. Das in diesem Verfahren verwendete Lösungsmittel wird derart ausgewählt, dass es ein gutes Extraktionsmittel für die PHA und das Öl und ein schlechtes Extraktionsmittel für das Mehl ist. Anschließend werden die PHA-Materialien in dem PHA-Öl-Produkt mittels eines physikalischen Trennschritts, wie Destillation, oder durch weitere Ausnutzung der unterschiedlichen Löslichkeit PHA und Öl vom Öl abgetrennt.
Als Alternative kann das PHA-Öl-Produkt durch eine chemische oder biologische Behandlung, bei der ein PHA-Derivat(e)-Öl-Produkt wie nachstehend beschrieben bereitgestellt wird, modifiziert werden (wie in 4 darge stellt). Letzterer PHA-Derivat-Bestandteil kann anschließend mittels einer physikalischen Verarbeitung, einschließlich Destillation, Lösungsmittelextraktion, Waschen, die Ausfällung, Zentrifugieren, Extraktion mit superkritischem Fluid, Filtrierung und Chromatographie, gereinigt werden.
Zu Lösungsmitteln, die zur Extraktion des Öl-PHA-Bestandteils aus der pflanzlichen Biomasse verwendbar sind, gehören chlorierte organische Lösungsmittel, beispielsweise Chloroform, Methylenchlorid, Di-, Tri-, Tetrachlorethan und Dichloracetat, Alkylcarbonate, wie Propylencarbonat und Ethylencarbonat, Trifluorethanol, Essigsäureanhydrid, Dimethylformamid, Ethylacetacetat, Triolein, Essigsäure, Toluol, Alkohole, Hydroxysäuren, Dioxan, Tetrahydrofuran, Diethylether und/oder Pyridin. Das Lösungsmittel kann auch aus Kohlenwasserstoffen, wie Hexan, Heptan, Octan, Nonan oder Decan oder Mischungen davon bestehen oder diese enthalten. Bevorzugte Lösungsmittel sind solche mit Siedepunkten zwischen Raumtemperatur und 400°C, vorzugsweise zwischen 30°C und 250°C. Derartige Lösungsmittel haben für sowohl PHA als auch die Ölbestandteile eine Löslichkeit von mindestens 5% (Gew./Vol., Raumtemperatur) und werden in Abhängigkeit von der Struktur des in 1 definierten PHA ausgewählt. Das PHA-Material kann auch in geschmolzenem Zustand extrahiert werden. Die Wahl des Lösungsmittels hängt von der Wahl der Pflanze ab, aus der die Biomasse abgeleitet ist, und von den Löslichkeitseigenschaften der abzutrennenden PHA, Derivate und Öle.
Wie in dem Ablaufdiagramm in 4 dargestellt, kann das extrahierte PHA-Öl auch durch chemische Modifizierung mittels Behandlung mit einem chemischen oder biologischen Wirkstoff, wie einem Enzym, das, wie nachstehend ausführlich beschrieben, das PHA-Material abbaut, unter Bildung eines PHA-Derivat-Öl-Produkts abgetrennt werden. Das PHA-Derivat wird dann unter Verwendung von beispielsweise einem physikalischen Verfahren, wie Destillation, Extraktion, Zentrifugieren, Extraktion mit superkritischem Fluid, Präparatfiltrierung und/oder Chromatographie, aus der PHA-Derivat-Öl-Mischung abgetrennt.
Eine weitere Aufarbeitung des im Wesentlichen ölfreien PHA kann mit Hilfe von herkömmlichen Verfahren durchgeführt werden, die dem Fachmann bekannt sind.
III. SYNTHESE VON PHA-DERIVATEN
Wie vorstehend beschrieben, können die PHA-Materialien in der Biomasse während der Verarbeitung durch physikalische, chemische oder enzymatische Umwandlung vor deren Isolierung zu Derivaten derivatisiert werden, um die Isolierung der Materialien zu erleichtern oder um ein erwünschtes Derivatprodukt zu erzeugen. Zu Derivaten, die sich bilden lassen, gehören Säuren, Ester, Oligomere, cyclische Oligomere, Lactone, Macrolide, Amide, Amine, Thioester, Diole und ungesättigte Verbindungen, die unter Verwendung von Verfahren gemäß dem Stand der Technik gebildet werden können. Griesbeck, A. und Seebach, D., Helv. Chim. Acta 70:1320–1325 (1987); Plattner, D. A., Helv. Chim. Acta 76:2004–2033 (1993); Seebach, D. et al., "Biological-Chemical Preparation of 3-Hydroxycarboxylic Acids and Their Use in EPC-synthesis", W. Bartmann und K. B. Sharpless, Hrsg., "Stereochemistry of Organic and Bioorganic Transformations", VCH, Weinheim, 1987, S. 85–126; und Seebach, D. et al., Chimia, 44:112–116 (1990); Org. Synth., 71:39–47 (1992); Angew. Chem. Int. Ed. Eng., 434–435 (1992); und Helv. Chim. Acta, 77:1099–1123 (1994). Dem Fachmann sind weitere Verfahren zur Derivatisierung von Estern, die zur Bildung von PHA-Polyestern verwendbar sind, bekannt.
Zu chemischen Wirkstoffen, die zur Modifizierung der PHA-Materialien bei der Verarbeitung von der Biomasse verwendbar sind, gehören beispielsweise Säuren, Basen, Detergenzien, Chelatbildner, ein Oxidationsmittel oder eine Reduk tionsmittel, ein nukleophiles oder elektrophiles Reagenz, wässrige Lösungen oder organische Lösungen und freie Radikale. Zu anderen verwendbaren chemischen Wirkstoffen gehören Wasserstoffperoxid, Hypochlorit, Ozon und Alkylperoxide. Die chemische Umwandlung kann beispielsweise eine chemische Reaktion sein, wie eine Veresterung, Umesterung, Hydrolyse, Verseifung, Aminolyse, Thiolyse, Veretherung, Silylierung, Addition, Elimination, Umordnung oder Kondensation. Die chemischen Wirkstoffe können beispielsweise zur Erzeugung von Derivaten verwendet werden, deren Molekulargewicht geringer ist als das der PHA-Ausgangsmaterialien in der pflanzlichen Biomasse. Weiterhin können die PHA-Materialien durch physikalische Behandlung, wie mit Wärme, Kälte oder Rühren, modifiziert werden.
Die PHA-Materialien können auch durch die Behandlung der Biomassematerialien, wie des PHA-Mehls oder der PHA-Öl-Mischungen, mit einem biologischen Wirkstoff, wie einem Enzym, das beispielsweise die Biomasse oder das PHA-Material abbaut, während der Verarbeitung chemisch modifiziert werden. Zu verwendbaren Enzymen gehören PHA-Depolymerasen, Proteasen, Nukleasen, Lipasen, Hydratasen, Phosphorylasen, Cellulasen und/oder Glycosidasen. Die PHA-Polymere können in Oligomere, Monomere, Dimere, Trimere oder andere Derivate umgewandelt werden. Die PHA-Funktionalität kann auch in eine chemische Nicht-PHA-Funktionalität umgewandelt werden.
IV. ANWENDUNGEN
Die im Sinne der Erfindung isolierten PHA können in einer großen Vielfalt unterschiedlicher Anwendungen eingesetzt werden. In einer Ausführungsform können die isolierten PHA zur Bildung eines Latex verwendet werden. PCT WO 91/13207 offenbart die Verwendung von Polymeren oder Copolymeren β-Hydroxybutyrat und β-Hydroxyvalerat in Form eines Latex, das heißt als wässrige Suspension aus nicht kristallinen amorphen Teilchen. Der Latex kann beispielsweise zur Bildung von Folien oder beschichteten Papiersorten verwendet werden, die biologisch abbaubar und recyclingfähig sind. PCT WO 96/03468 beschreibt die Verwendung eines PHA-Latex in Architekturbeschichtungen. Verfahren zur Bildung eines PHA-Latex aus gereinigten kristallinen PHA sind in PCT WO WO 94/07940 beschrieben. Bei diesem Verfahren wird eine gereinigte Lösung aus PHA in einem organischen Lösungsmittel, die wie vorstehend beschrieben erhalten werden kann, in einer wässrigen Lösung, die ein Tensid enthält, unter Bildung eines amorphen Latex emulgiert. Somit stellen die hier offenbarten Verfahren gereinigte PHA bereit, die in einer Vielfalt von industriellen und biomedizinischen Anwendungen, wie der Bildung von PHA-Latexmaterialien, einsetzbar sind.
Die Erfindung wird anhand der nachfolgenden nicht einschränkenden Beispiele besser verstanden.
Beispiel 1: Extraktion von Polyhydroxybutyrat aus pflanzlicher Biomasse
Das in 3 dargestellte Verfahren wurde zur Isolierung von Polyhydroxybutyrat (PHB) aus pflanzlicher Biomasse mittels Extraktion mit Hexan (Lösungsmittel 1) zum Entfernen des Öls gefolgt von Extraktion mit Chloroform, das mit Kohlenwasserstoff stabilisiert war, (Lösungsmittel 2) zum Isolieren von PHB verwendet.
Eine Probe Rapssaat (32 g), die etwa 40 Gew.-% Öl enthielt, wurde unter Verwendung einer elektrischen Küchenmaschine mit 6 g PHB-Pulver (Aldrich) vermischt und vermahlen. Diese Probe entspricht einer transgenen Ölsaat mit 34 Gew.-% Öl und 16 Gew.-% PHB. Die Mischung wurde 6 Stunden lange kontinuierlich in einem Soxhlet-Apparat mit 300 ml Hexan (Lösungsmittel 1) extrahiert, wonach die Probe zum Abkühlen stehen gelassen wurde, was eine organische Lösungsmittel- Phase und ein festes Mehl ergab. Das organische Lösungsmittel wurde eingeengt, was ein gelbes Öl ergab (11,8 g, 31 Gew.-% der Mischung). Eine NMR-Analyse zeigte, dass das Öl kein PHB enthielt. Dieses Ergebnis zeigt, dass das PHB-freie Öl ohne weiteres in einer Ausbeute von mehr als 90% aus der PHA enthaltenden pflanzlichen Biomasse zurückgewonnen werden kann. Ein Teil des festen Mehls (7,7 g) wurde anschließend 22 Stunden lang weiter in einem Soxhiet-Apparat mit 120 ml mit Kohlenwasserstoff stabilisiertem Chloroform (Lösungsmittel 2) extrahiert. Das Abdampfen der Chloroformlösung führte zur Bildung einer gelbweißen Kunststofffolie mit einem Gewicht von 1,15 g. Ein Teil der unverarbeiteten PHB-Folie (227 mg) wurde mit drei Anteilen zu je 1 ml Hexan gewaschen. Nach Lufttrocknen hatte die PHB-Folie (86 mg) eine weißgraue Farbe. Eine NMR-Analyse dieser Folie zeigte, dass sie im Wesentlichen aus reinem PHB bestand. Die Rückgewinnung der PHB-Folie stellt eine 24%ige Ausbeute auf der Grundlage des ursprünglichen PHB-Gehalts der Mischung dar.
Beispiel 2: Extraktion von PHB-Derivat aus pflanzlicher Biomasse
Das in 3 dargestellte Verfahren wurde zur Isolierung von Polyhydroxybutyrat (PHB) aus pflanzlicher Biomasse mittels Extraktion der pflanzlichen Biomasse mit Hexan (Lösungsmittel 1) zum Entfernen der Ölfraktion gefolgt von einer chemischen Behandlung und dann dem physikalischen Abtrennen des PHB in derivatisiert Form verwendet.
Ein Teil des PHB enthaltenden Restmehls (2,32 g) aus Beispiel 1 wurde 15,5 Stunden lang mit n-Butanol (25 ml) und konzentrierter Schwefelsäure (0,33 ml) unter Rückflusskühlung erwärmt. Die gebildete schwarze Mischung wurde mit gesättigtem Natriumbicarbonat (20 ml), Natriumchloridlösung (20 ml) und Ethylacetat (50 ml) versetzt. Die Mischung wurde in einem Scheidetrichter ausgeschüttelt und die Phasen getrennt. Die organische Phase wurde durch ein Celite-Kissen filtriert, mit Natriumchloridlösung gewaschen, mit einer geringen Menge Aktivkohle behandelt, filtriert und zu einem dunklen Öl eingeengt. Dieses Material wurde unter vermindertem Druck destilliert. Die bei 49–53°C und 0,25 Torr abdestillierte Fraktion wurde gesammelt, was eine leicht gelb gefärbte Flüssigkeit ergab (0,47 g). Eine NMR-Analyse dieses Materials bestätigte, dass es sich um Butyl-3-hydroxybutyrat handelte. Die Menge an zurückgewonnenem Material stellt eine 46%ige Ausbeute des derivatisierten PHB auf der Grundlage der Menge an PHB, die im Restmehl enthalten war, dar.
Beispiel 3: Extraktion von PHA aus Rapssaat
PHA wurde unter Verwendung des Verfahrens aus 4 in polymerer Form aus Rapssaat extrahiert. Eine Probe Rapssaat (20 g), die etwa 40 Gew.-% Öl enthielt, wurde unter Verwendung einer elektrischen Küchenmaschine mit kleinen Stückchen PHO, einem Copolymer, dass etwa 94% 3-Hydroxyoctansäure und etwa 6% 3-Hydroxyhexansäure enthielt (5,43 g, isoliert aus Pseudomonas putida), vermischt und vermahlen. Diese Probe entspricht einer transgenen Ölsaat mit 31 Gew.-% Öl und 21 Gew.-% PHO. Die Mischung wurde 12 Stunden lange kontinuierlich in einem Soxhlet-Apparat mit 300 ml Hexan (Lösungsmittel 1) extrahiert. Die Probe wurde zum Abkühlen stehen gelassen und filtriert, was eine organische Lösungsmittelphase und ein festes Mehl (11,02 g nach Lufttrocknen) ergab. Die organische Lösungsmittelphase wurde eingeengt, was ein gelbes sehr viskoses gelähnliches Material ergab (12,92 g, 51 Gew.-% der Mischung). Nach Stehenlassen verfestigte sich das Material zu einem gelben, kunststoffartigen Feststoff. Eine NMR-Analyse zeigte, dass das Material PHO und Rapsöl enthielt. Diese Ergebnisse zeigen, dass die PHO-Öl-Mischung ohne weiteres in einer Ausbeute von mehr als 90% aus der PHA enthaltenden pflanz lichen Biomasse zurückgewonnen werden kann. Die erhaltene PHA-Öl-Mischung war für eine weitere Reinigung geeignet.
Die weitere Reinigung wurde wie folgt durchgeführt. Ein Teil des gelben, kunststoffähnlichen Materials (0,136 g, etwa 41 Gew.-% PHO, 1,1 × 0,2 cm) wurde mit 2 ml n-Propanol gewaschen. Nach 3 Tage langem langsamem Schwenken bei Raumtemperatur wurde der Überstand entfernt und der zurückbleibende Feststoff über Nacht mit 2 ml Methanol gewaschen. Die Methanolwaschflüssigkeit wurde mit der Propanolwaschflüssigkeit vereinigt und eingeengt, was ein gelbes Öl ergab (0,0876 g). Nach Trocknen unter Vakuum war das zurückgebliebene feste Polymer (0,048 g) halb transparent und praktisch farblos. Dies stellt eine 84%ige Ausbeute an PRO aus der ursprünglichen Rapssaat-PHO-Mischung dar. Eine NMR-Analyse des gereinigten Polymers als zeigte, dass es sich um PHO (Reinheit ungefähr 95%) handelte, das eine geringe Menge an Rapsöl enthielt. Eine Gaschromatographieanalyse zeigte einen 10-fachen Rückgang der wichtigsten Verunreinigungen verglichen mit dem gelben, kunststoffähnlichen Material, das ursprünglich durch Hexanextraktion isoliert worden war.
Beispiel 4: Isolierung eines PHA-Derivats aus pflanzlicher Biomasse
Das gelbe PRO enthaltende Kunststoffähnliche Material, das vor der weiteren Reinigung, wie in Beispiel 3 beschrieben, erhalten wurde, wurde in derivatisierter Form durch chemische Behandlung und physikalische Trennung weiter gereinigt: Ein Teil des teilweise gereinigten PHO enthaltenden Kunststoffmaterials (2,75 g, enthaltend etwa 40 Gew.-% PHO), das durch die Hexanextraktion in Beispiel 3 isoliert worden war, wurde unter Erwärmen in n-Butanol (50 ml) gelöst. Es wurde konzentrierte Schwefelsäure (0,7 ml) zugesetzt und die Mischung wurde unter Rückflusskühlung 20 Stunden lang erwärmt. Nach dem Abkühlen auf Raumtempera tur wurde gesättigtes Natriumcarbonat (4 ml) zugegeben, um die Mischung für Lackmuspapier alkalisch zu machen. Die Reaktionsmischung wurde filtriert, die Phasen wurden getrennt und die organische Schicht wurde mit Natriumchloridlösung (2 × 30 ml) gewaschen. Die organische Phase wurde auf 10 ml eingeengt, in Chloroform (50 ml) gelöst, über Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und unter Vakuum zu einem gelben Öl eingeengt (2,75 g). Dieses Material wurde unter vermindertem Druck destilliert. Die bei 93–97°C und 0,45 Torr abdestillierte Fraktion wurde gesammelt, was eine klare, farblose Flüssigkeit ergab (0,41 g). Die Menge an zurückgewonnenem Material stellt eine 25%ige Ausbeute des derivatisierten PHO auf der Grundlage der Menge an PHO, die im kunststoffartigen Ausgangsmaterial enthalten war, dar. Eine NMR-Analyse dieses Materials zeigte, dass es sich um Butyl-3-hydroxyoctanoat mit einer Reinheit von ungefähr 95% handelt und dass es eine sehr geringe Menge an ungesättigtem Material enthält.

Claims

Verfahren zum Abtrennen eines Polyhydroxyalkanoats ("PHA") aus pflanzlicher Biomasse, umfassend Pflanzenöl und Mehl, wobei das Verfahren das Extrahieren der pflanzlichen Biomasse mit einem ersten Lösungsmittel, um das Öl im Wesentlichen aus der Biomasse zu entfernen, und anschließend das Abtrennen des PHA aus der im Wesentlichen ölfreien pflanzlichen Biomasse umfasst, wobei das Abtrennen des PHA aus der im Wesentlichen ölfreien Biomasse nicht darin besteht, das PHA in einem Lösungsmittel, das Aceton, Dialkylether, Methanol, Ethanol oder ein Propanol oder ein Monocarbonsäureester davon mit oder ohne Wasser ist, zu lösen und das PHA daraus zu gewinnen.
Verfahren zum Abtrennen eines Polyhydroxyalkanoats ("PHA") aus pflanzlicher Biomasse, umfassend Pflanzenöl und Mehl, wobei das Verfahren das Extrahieren der pflanzlichen Biomasse mit einem ersten Lösungsmittel, um das Öl im Wesentlichen aus der Biomasse zu entfernen, und anschließend das Abtrennen des PHA aus der im Wesentlichen ölfreien pflanzlichen Biomasse umfasst, und zwar mittels: (a) Extraktion in einem gechlorten organischen Lösungsmittel, Alkylcarbonat, Trifluorethanol, Essigsäureanhydrid, Dimethylformamid, Ethylacetacetat, Triolein, Toluol, Dioxan, Tetrahydrofuran, Pyridin, Hydroxysäure oder einer Mischung davon; oder (b) Lösungsmittelextraktion unter Verwendung einer superkritischen Fluidextraktion.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei das Alkylcarbonat ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Propylencarbonat und Ethylencarbonat.
Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, wobei die pflanzliche Biomasse von einer transgenen Pflanze abgeleitet ist.
Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, ferner umfassend das Derivatisieren des PHA vor dem Abtrennen des PHA aus der Biomasse.
Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, wobei das abgetrennte PHA eine oder mehrere Einheiten mit folgender Formel umfasst: -OCR¹R²(CR³R⁴)_nCO- worin n 0 oder eine ganze Zahl ist; und worin R¹, R², R³ und R⁴ jeweils unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus Kohlenwasserstoffresten, mit Halogen und Hydroxyl substituierten Resten, Hydroxylresten, Halogenresten, mit Stickstoff substituierten Resten, mit Sauerstoff substituierten Resten und Wasserstoffatomen.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei das abgetrennte PHA ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Monomeren, Dimeren, linearen und cyclischen Oligomeren und Lactonen der Einheiten.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei das abgetrennte PHA ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus: Estern, definiert durch die Formel: HOCR¹R²(CR³R⁴)_nCO₂R⁵; Amiden, definiert durch die Formel: HOCR¹R²(CR³R⁴)_nCONR⁵R⁶; Thioestern, definiert durch die Formel: HOCR¹R²(CR³R⁴)_nCOSR⁵; Säuren, definiert durch die Formel: HOCR¹R²(CR³R⁴)_nCO₂H; Ethern, definiert durch die Formel: R⁶OCR¹R²(CR³R⁴)_nCO₂R⁵; Estern, definiert durch die Formel: R⁶CO₂CR¹R²(CR³R⁴)_nCO₂R⁵; ungesättigten Verbindungen, definiert durch die Formeln: R¹R²C=CR³(CR⁴R⁵)_nCO₂R⁶; und R¹R²R³CC(R⁴)=C(R⁵)CO₂R⁶; Diolen, definiert durch die Formel: HOCR¹R²(CR³R⁴)_nCH₂OH; Lactonen oder Makroliden, definiert durch die Formel:
worin x eine ganze Zahl ist; und Ketonen oder Aldehyden, definiert durch die Formeln: HOCR¹R²(CR³R⁴)_nCOR⁵; HOCR¹R²(CR³R⁴)_nCHO; R¹CO(CR²R³)_nCOOR⁴; und R¹CO(CR²R³)_nCOR⁴ worin n 0 oder eine ganze Zahl ist; und worin R¹, R², R³, R⁴, R⁵ und R⁶ jeweils unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus Kohlenwasserstoffresten, mit Halogen und Hydroxyl substituierten Resten, Hydroxylresten, Halogenresten, mit Stickstoff substituierten Resten, mit Sauerstoff substituierten Resten und Wasserstoffatomen.
Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, umfassend: a) Bereitstellen einer pflanzlichen Biomasse, die PHA enthält; b) Vorbereiten der pflanzlichen Biomasse, um eine Mischung zu erhalten, die PHA, Öl und Pflanzenmehl enthält; c) Extrahieren von Öl aus der Mischung mit einem ersten Lösungsmittel bei einer Temperatur, bei der das Öl löslich und das PHA nicht sehr löslich ist, um einen Rückstand aus Mehlmischung, umfassend PHA, zu erhalten; und d) Extrahieren des in Schritt c) erhaltenen Rückstands aus Mehlmischung mit einem zweiten Lösungsmittel, in dem das PHA löslich ist, um PHA aus der Biomasse abzutrennen.
Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, umfassend: a) Bereitstellen einer pflanzlichen Biomasse, die PHA enthält; b) Vorbereiten der pflanzlichen Biomasse, um eine Mischung zu erzeugen, die PHA, Öl und Pflanzenmehl enthält; c) Extrahieren von Öl aus der Mischung mit einem ersten Lösungsmittel bei einer Temperatur, bei der das Öl löslich und PHA nicht sehr löslich ist, um einen Rückstand aus Mehlmischung, umfassend PHA, zu erhalten; d) Behandeln des in Schritt c) erhaltenen Rückstands aus Mehlmischung, umfassend PHA, mit mindestens einem chemischen oder biochemischen Wirkstoff, um das PHA chemisch zu derivatisieren; und e) Abtrennen von derivatisiertem PHA aus dem in Schritt d) erhaltenen Rückstand aus Mehlmischung.
Verfahren nach Anspruch 9 oder 10, wobei Schritt b) das Vorbereiten der pflanzlichen Biomasse unter Ver wendung eines oder mehrerer Verfahren, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Trocknen, Enthülsen, Säubern, Reifen, Wiegen, Aufbrechen, Abschuppen, Pressen, Walzen, Mahlen, Kochen, Zerdrücken, Absetzen, Filtern, Waschen, Zentrifugenfraktionieren und Windsichten, umfasst.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei das zweite Lösungsmittel ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus einem gechlorten organischen Lösungsmittel, einem Alkylcarbonat, einer Hydroxysäure und Mischungen davon.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei das zweite Lösungsmittel ein gechlortes organisches Lösungsmittel, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Chloroform, Methylenchlorid, Dichlorethan, Trichlorethan, Tetrachlorethan und Dichloracetat, umfasst.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei das zweite Lösungsmittel eine Zusammensetzung, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einem Propylencarbonat, Ethylencarbonat, Trifluorethanol, Essigsäureanhydrid, Dimethylformamid, Ethylacetacetat, Triolein, Toluol, Dioxan, Tetrahydrofuran und Pyridin, umfasst.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei der Rückstand aus Mehlmischung, umfassend PHA, in Schritt d) mit mindestens einem chemischen Wirkstoff, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Säuren, Basen, Detergenzien, Oxidationsmitteln, Chelatbildnern, Reduktionsmitteln, nukleophilen Reagenzien, elektrophilen Reagenzien, Metallionen und freien Radikalen, behandelt wird.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei das PHA mittels einer chemischen Umwandlung, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Veresterung, Umesterung, Hydrolyse, Verseifung, Aminolyse, Thiolyse, Veretherung, Silylierung, Addition, Elimination, Umordnung, Reduzierung und Kondensation, derivatisiert wird.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei der biochemische Wirkstoff ein Enzym ist.
Verfahren nach Anspruch 17, wobei das Enzym ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus einer Depolymerase, einer Protease, einer Nuklease, einer Lipase, einer Phosphorylase und einer Glycosidase.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei das derivatisierte PHA in Schritt e) durch ein physikalisches Verfahren, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Destillation, Extraktion, Zentrifugierung, Filtrierung, Verdampfung und Chromatographie, abgetrennt wird.
Verfahren nach Anspruch 9 oder 10, wobei das erste und das zweite Lösungsmittel jeweils einen Siedepunkt zwischen 30°C und 250°C aufweisen.
Verfahren nach Anspruch 9 oder 10, ferner umfassend das Ausfällen des abgetrennten PHA-Derivats.
Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, wobei die Biomasse von einer Pflanzenquelle, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Sojabohnen, Baumwolle, Kokosnüssen, Erdnüssen, Rapssaat, Sonnenblumenkerne, Oliven, Palmen, Sesamsaat, Leinsamen, Rizinus, Saflorsaat, Tabak, Mais, Senf und Kartoffel, abgeleitet ist.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei das abgetrennte PHA eine oder mehrere derselben oder unterschiedlicher Einheiten, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Hydroxybutyrat, Hydroxyvalerat, Hydroxyhexanoat, Hydroxyheptanoat, Hydroxyoctanoat, Hydroxynonanoat und Hydroxydecanoat, enthält.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei das abgetrennte PHA ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus 3-Hydroxybuttersäure, 4-Hydroxybuttersäure, Krotonsäure und Alkylestern davon.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei die pflanzliche Biomasse von einer Pflanze abgeleitet ist, die ein heterologes PHA-Synthasegen enthält, welches abgeleitet ist von einem Mikroorganismus, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Acinetobacter, Aeromonas, Alcaligenes, Azotobacter, Bacillus, Brevibacterium, Corynebacterium, Chromatium, Flavobacterium, Halobacterium, Pseudomonad, Nocardia, Rhodococcus, Thiocystis, Streptomyces, Streptococcus und Zoogloea.
Verfahren zum Abtrennen eines Polyhydroxyalkanoats ("PHA") aus pflanzlicher Biomasse, umfassend Pflanzenöl, wobei das Verfahren das Extrahieren pflanzlicher Biomasse bei einer Temperatur, bei der das Öl und PHA löslich sind, mit einem Lösungsmittel, um Öl und PHA im Wesentlichen aus der Biomasse zu entfernen, und anschließend das Abtrennen des PHA aus dem Öl umfasst, wobei das Entfernen des Öls und PHA aus der Biomasse nicht darin besteht, das Öl und PHA in einem Lösungsmittel, das Aceton, Dialkylether, Methanol, Ethanol oder ein Propanol oder ein Monocarbonsäureester davon mit oder ohne Wasser ist, zu lösen.
Verfahren zum Abtrennen eines Polyhydroxyalkanoats ("PHA") aus pflanzlicher Biomasse, umfassend Pflanzenöl, wobei das Verfahren das Extrahieren pflanzlicher Biomasse bei einer Temperatur, bei der das Öl und PHA löslich sind, mit einem Lösungsmittel, um Öl und PHA im Wesentlichen aus der Biomasse zu entfernen, und anschließend das Abtrennen des PHA aus dem Öl umfasst, wobei das erste Lösungsmittel ein gechlortes organisches Lösungsmittel, Alkylcarbonat, Trifluorethanol, Essigsäureanhydrid, Dimethylformamid, Ethylacetacetat, Triolein, Essigsäure, Toluol, Hydroxysäure, Dioxan, Tetrahydrofuran, Pyridin, Hexan, Heptan, Octan, Nonan oder Decan oder eine Mischung davon ist.
Verfahren nach Anspruch 27, wobei das Alkylcarbonat ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Propylencarbonat und Ethylencarbonat.
Verfahren nach Anspruch 26, 27 oder 28, wobei die pflanzliche Biomasse von einer transgenen Ölpflanze abgeleitet ist.
Verfahren nach Anspruch 29, wobei das Verfahren umfasst a) Bereitstellen einer pflanzlichen Biomasse, die PHA enthält; b) Vorbereiten der pflanzlichen Biomasse, um eine Mischung aus PHA, Öl und Pflanzenmehl zu erhalten; c) Extrahieren des Öls und PHA aus der Mischung mit einem ersten Lösungsmittel, in dem das Öl und das PHA löslich und in dem das Mehl nicht sehr löslich ist; und d) Abtrennen des PHA aus dem Öl.
Verfahren nach Anspruch 30, wobei das PHA von dem Öl in Schritt d) durch Behandeln der PHA-Öl-Mischung mit einem chemischen oder biochemischen Wirkstoff, wodurch das PHA chemisch derivatisiert wird, und Abtrennen des derivatisierten PHA aus dem Öl abgetrennt wird.
Verfahren nach Anspruch 30, wobei das Lösungsmittel ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus einem gechlorten organischen Lösungsmittel, einem Alkylcarbonat, einem Alkohol, einer Hydroxysäure und einem Kohlenwasserstoff und Mischungen davon.
Verfahren nach Anspruch 30, wobei das Lösungsmittel ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Hexan, Trifluorethanol, Essigsäureanhydrid, Dimethylformamid, Ethylacetacetat, Triolein, Essigsäure, Toluol, Dioxan, Tetrahydrofuran und Pyridin.
Verfahren nach Anspruch 31, wobei der biochemische Wirkstoff ein Enzym ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus PHA-Depolymerasen, Proteasen, Nukleasen, Lipasen, Hydratasen, Phosphorylasen, Cellulose und Glycosidasen.
Verfahren nach Anspruch 9, 10, 30 oder 31, wobei das abgetrennte PHA eine funktionelle Gruppe, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Amiden, Thioestern, Säuren, Ethern, Estern, ungesättigten Verbindungen, Diolen, Ketonen und Aldehyden, enthält.
Verfahren nach Anspruch 9, 10, 30 oder 31, wobei das abgetrennte PHA eine oder mehrere Einheiten, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einer 3-Hydroxysäure, einer 4-Hydroxysäure und einer 5-Hydroxysäure, enthält.
Verfahren nach Anspruch 9 oder 30, wobei das abgetrennte PHA mit einem organischen Lösungsmittel abgetrennt wird und wobei das Verfahren ferner Folgendes umfasst: Emulgieren des PHA in dem organischen Lösungsmittel in einer wässrigen Lösung, enthaltend ein Tensid, um dadurch einen PHA-Latex zu bilden.
Verfahren nach Anspruch 9 oder 30, wobei das abgetrennte PHA mit einem organischen Lösungsmittel abgetrennt wird und wobei das Verfahren ferner das Emulgieren des PHA in dem organischen Lösungsmittel in einer wässrigen Lösung und das Entfernen des Lösungsmittel umfasst, um dadurch einen PHA-Latex zu bilden.