BR112014009140B1 - método para modular a infestação de uma praga - Google Patents

Abstract

resumo patente de invenção: "formulações, composições e metabólitos de chromobacterium e seus usos". a presente invenção refere-se a pesticidas biológicos estabilizados que compreendem a espécie chromobacterium, o filtrado, sobrenadante, extrato ou a substância ativa como pesticida dela derivados com atividade pesticida cuja meia-vida é melhorada pela uniformidade física mantida e cuja atividade inseticida após o uso é mais longa por ter resistência mais alta à degradação quando expostos à luz solar.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para MÉTODO PARA MODULAR A INFESTAÇÃO DE UMA PRAGA. Campo técnico da invenção [0001] A presente invenção refere-se a composições ou formulações, ou o seu uso, que compreendem a espécie Chromobacterium, o filtrado, sobrenadante, extrato, composto ativo como pesticida ou metabólito dela derivados como acaricida e inseticida, especialmente contra a infestação por uma ou mais pragas pertencentes às famílias Acarina, Scarabeidae, Drosophilidae, Triozidae Aphidae, Muscidae, Anthomyiidae ou Tenebrionidae. Adicionalmente, são providas formulações pesticidas biológicas (também designadas biopesticida), especificamente aquelas que compreendem a espécie Chromobacterium, o filtrado, o sobrenadante, o extrato, os metabólitos ou os compostos ativos como pesticida dela derivados, métodos para produzi-las e métodos de uso como moduladores de infestação por pragas. Mais especificamente, são providos pesticidas biológicos estabilizados cuja meia-vida é melhorada graças à manutenção da uniformidade física e cuja atividade inseticida após o uso é mais longa por ter resistência mais alta à degradação quando expostos à luz solar.

Antecedentes da invenção [0001] Produtos naturais são substâncias produzidas por micróbios, plantas e outros organismos. Os produtos naturais microbianos oferecem uma fonte abundante de diversidade química, havendo um longo histórico de utilização de produtos naturais para fins farmacêuticos. Apesar da ênfase sobre produtos naturais para agentes terapêuticos humanos, em que mais de 50% são derivados de produtos naturais, apenas 11% dos pesticidas são derivados de fontes naturais. Não obstante, os pesticidas à base de produtos naturais possuem potencial para desempenhar um importante papel no

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2/88 controle de pragas tanto em explorações agrícolas convencionais como nas orgânicas. Os metabólitos secundários produzidos por micróbios (bactérias, actinomicetos e fungos) representam novos compostos químicos que podem ser utilizados isoladamente ou em combinação com compostos conhecidos para controlar efetivamente insetos-pragas e para reduzir o risco do desenvolvimento de resistência. Há diversos exemplos bem conhecidos de produtos naturais microbianos que são bem sucedidos como inseticidas agrícolas (Thompson et al., 2000; Arena et al., 1995; Krieg et al. 1983). [0002] O desenvolvimento de um pesticida microbiano inicia com o isolamento de um micróbio em uma cultura pura. Em seguida, prossegue com o rastreamento da eficácia e do espectro utilizando estudos in vitro, in vivo ou em escala piloto em uma estufa e no campo. Ao mesmo tempo, compostos ativos produzidos pelo micróbio são isolados e identificados. Para a comercialização de um pesticida microbiano, o micróbio precisa ser produzido de forma rentável por fermentação em escala industrial e ser formulado com aditivos biocompatíveis e aprovados para aumentar a eficácia e maximizar a facilidade de aplicação, bem como a estabilidade durante o armazenamento em condições de campo.

Chromobacterium [0003] Em 2000, a Dra. Martin e seus colaboradores no

Departamento de Agricultura dos Estados Unidos (USDA) isolaram uma bactéria com pigmentos de cor púrpura (PRAA4-1) do solo de uma floresta em Maryland (Martin et al., 2007a). No rastreamento inicial, constataram que esta bactéria era tóxica para o besouro da batata do Colorado e outros insetos-pragas (Martin et al., 2007b). Esta bactéria móvel, Gram negativa foi identificada como uma nova espécie de Chromobacteria, Chromobacterium substsugae sp. nov (Martin et al., 2007c) do tipo beta-proteobactéria facultativamente aeróbica,

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3/88 móvel, Gram negativa com flagelos polares. As colônias formadas em

2-3 dias em placa de L-ágar a 25 ^oC são inicialmente de cor creme, que se tornam gradualmente de violeta claro a escuro durante as 24 horas seguintes. As colônias de PRAA4-1 crescem bem em meios à base de peptona com nível ótimo a 25 ^oC, pH 6,5-8,0 e com NaCl 01,5% (p/v) NaCl (Martin et al., 2007a).

[0004] Desde o achado de C. substugae pela Dra. Martin e seus colaboradores, ao menos três novas espécies de Chromobacteria foram isoladas e caracterizadas; Young et al. (2008) isolaram uma nova espécie de Chromobacterium, C. aquaticum, a partir de amostras de água de nascente no Taiwan, e Kampfer et al. (2009) isolaram duas espécies, C. piscinae e C. pseudoviolaceum, a partir de amostras ambientais coletadas na Malásia.

[0005] Entre todas as espécies conhecidas de Chromobacteria, C.

violaceum é um saprófito gram negativo do solo e da água. As informações publicadas sobre os metabólitos secundários produzidos por Chromobacteria baseiam-se em estudos apenas em C. violaceum (ver, por exemplo, Durán e Menck (2001) para uma revisão abrangente das perspectivas farmacológicas e industriais de C. violaceum). Normalmente considerada não patogênica para humanos, mas como patógeno oportunista, esta bactéria foi ocasionalmente o agente causador de septicemia e infecções fatais em humanos e animais. C. violaceum é conhecida por produzir um pigmento violeta, violaceína, que é uma molécula de bisindol gerada pela fusão de duas moléculas de L-triptofano na presença de oxigênio (Hoshino et al., 1987; Ryan e Drennan; 2009). A biossíntese da violaceína é regulada por mecanismo comum do tipo quorum sensing (sinalização dependente da densidade celular) que regula várias outras vias metabólicas secundárias em bactérias Gram negativas (McClean et al., 1997).

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4/88 [0006] Outros metabólitos conhecidos de C. violaceum, resumidos por Durán e Menck (2001), incluem cianeto de hidrogênio, ferrioxamina E, os glicopeptídeos B-lactâmicos SQ28,504 e SQ28,546, antibióticos como aerocianidina, aerocavina, 3,6-dihidroxi-indoxazeno e o monobactâmico SB-26.180, e um depsipeptídeo antitumoral FR901228. De acordo com o artigo de revisão por Durán e Menck (2001), C. violaceum também produz compostos incomuns de açúcares do tipo polissacarídeos e lipopolissacarídeos extracelulares.

[0007] A Publicação do Pedido de Patente U.S. n^o US20120100236 também descreve compostos que podem ser obtidos ou derivados da espécie Chromobacterium, mais especificamente de Chromobacterium substugae.

Ácaros e acaricidas [0008] Tetranychus urticae (Ácaro-aranha de duas manchas) faz parte da família Tetranychidae. Os ácaros-aranhas são talvez a praga de ácaros mais importante de plantas ornamentais. Podem também causar dano considerável a mais de 180 espécies de culturas criadas em estufa e no campo. Estes ácaros estão também entre as pragas mais difíceis de artrópodes de controlar e podem desenvolver rapidamente resistência a substâncias químicas (Stamps e Osborne 2009, Osborne, Ehler e Nechols, 1999).

[0009] Acaricidas são compostos que eliminam ácaros (miticidas) e carrapatos (ixodicidas). Essa classe de pesticidas é grande e inclui antibióticos, carbamatos, acaricidas do tipo formamidina, piretróides, reguladores do crescimento de ácaros e acaricidas organofosfatados. Além de pesticidas químicos, pode-se utilizar terra diatomácea e alguns ácidos graxos no controle de ácaros. O seu modo de operação é tipicamente pelo rompimento da cutícula, que desidrata o ácaro. Adicionalmente, alguns óleos essenciais, como óleo de hortelã, são usados para controlar ácaros. Apesar da grande variedade de

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5/88 compostos acaricidas conhecidos, os ácaros continuam sendo um problema sério na agricultura pelo cano que provocam às culturas. Os ácaros podem produzir diversas gerações durante uma única estação, o que facilita o rápido desenvolvimento de resistência aos produtos acaricidas usados. Consequentemente, novos produtos pesticidas com novos sítios de alvo e novos modos de ação são criticamente necessários.

Moscas domésticas [00010] Musca domestica (moscas domésticas) fazem parte da família. Esta família é considerada um problema econômico em nível doméstico e no mundo todo. Outros membros da família Muscidae incluem mosca da face, mosca do estábulo e mosca dos chifres. Além de incômodas, estas moscas vetores de doenças humanas e animais. Seus hábitos de caminhar e se alimentar no lixo e excrementos e nos seres humanos e em alimentos as torna agentes ideais para a transferência de organismos com doença. Essa espécie pode também ser uma praga para animais e transmitir doença através de feridas abertas.

Moscas que se alimentam de plantas - Drosophila da asa manchada [00011] A drosófila da asa manchada, Drosophila suzukii é um invasor recente das áreas de crescimento de frutas e vegetais nos Estados Unidos. É bem mais destrutiva do que uma espécie relacionada bem conhecida, Drosophila melanogaster, e outras Drosophila porque a D. suzukii pode alimentar-se de frutos e vegetais intactos e provocar-lhes danos, enquanto outras Drosophila alimentam-se somente de material vegetal em decomposição.

Larvas de raízes [00012] As larvas de raízes da família Anthomyidae alimentam-se das raízes de diversas plantas diferentes. As larvas de raiz de couve afetam couve, couve-flor, brócolis e couve de Bruxelas (Esse grupo de

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6/88 vegetais é também conhecido como culturas de brássicas’). Existem também tipos diferentes de larvas de raízes que afetam cenouras, cebolas e outras culturas de vegetais. Pelo fato de culturas de brássicas serem vegetais de estação fria, as larvas de raiz de couve são muito mais proeminentes nas zonas do norte dos Estados Unidos. Estas larvas são difíceis de controlar, pois chocam ovos e se alimentam debaixo do solo, de modo que a sua presença é somente sentida quando se percebe o crescimento atrofiado e a murchidão de folhagens.

Pulgões verdes do pêssego [00013] Myzus persicae (pulgões verdes do pêssego) fazem parte da família Aphididae (ver US20110054022). Conforme é evidente por seu nome comum, os pulgões verdes do pêssego são pragas de uma ampla gama de frutas, vegetais e plantas ornamentais e sua presença é constatada em todo o mundo. Esses insetos são especialmente nocivos, pois não só causam dano direto ao se alimentarem da seiva do floema, mas também por serem vetores potenciais para o vírus eruptive da ameixa, o agente causador da doença da Sharka, que provoca a deformação e descoloração do fruto. Como resultado, árvores infectadas precisam ser desenraizadas. Foram feitas tentativas para controlar essas pragas com vários pesticidas. Contudo, frequentemente, há o desenvolvimento de resistência.

Psilídeo da batata [00014] Bactericera cockerelli (psilídeo da batata) faz parte da família Triozidae e é agente causador da doença da zebra da batata frita através da infestação pela bactéria gram negativa. Embora seja nativo da América do Norte, foi também encontrado na Nova Zelândia também (www.biosecuritv.govt.nz/files/pests/potato-tomato- psvllid/psyillid-factsheet.pdf). O psilídeo da batata em geral cresce em hospedeiros da família Solanaceae (como tomates e batatas). No

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7/88 entanto, foram encontrados em outras plantas também, como as do gênero Capsicum, pimenta, berinjela, batata-doce, poro poro, tamarillo e thornapple.

Besouros da liteira [00015] Alphitobius diaperinus é uma praga séria no setor avícola e faz parte da família Tenebrionidae. A linhagem Bt PS86B1, segundo relatos, possui atividade contra Alphitobius (Patente U.S. N^o 5 100 665, concedida a Hickle et al.). Bt tenebrionis pode ter atividade contra larvas deste besouro também (Patente U.S. N^o 5 244 660). Os besouros da liteira e algumas outras espécies de coleópteros atuam como vetores para doenças causadas por protozoários, bactérias e vírus de galinhas e perus, resultando em perda econômica considerável. Os besouros da liteira atuam como reservatório significativo para espécies patogênicas de Salmonella incluindo as variedades mais patogênicas, como enterite do sorotipo S. enterica. O problema é que aves contaminadas com organismos patogênicos do tipo Salmonella ameaçam a saúde humana. Estes besouros habitam a liteira, madeiras, Styrofoam, fibra de vidro e painéis de poliestireno para isolamento de galinheiros. As larvas e os besouros adultos prosperam tanto nos excrementos de aves como nos grãos utilizados como alimento para as galinhas. Essas grandes populações de besouros e seus diversos habitats no interior de galinheiros tornam mais difícil erradicar a Salmonella que carregam. No meio de uma infestação intensa por besouros da liteira ou até serem estabelecidas novas populações de galinhas, nem trocas frequentes na liteira nem pulverizar com múltiplos inseticidas químicos são completamente eficazes para controlar essa praga.

Larvas e escaravelhos [00016] Larvas, tais como larvas brancas (Cyclocephala lurida), besouro mascarado do sul (Rhizotrogus majalis), larvas do besouro

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8/88 japonês (Popillia japonica), larvas do gorgulho preto da videira (Otiorhynchus sulcatus), larvas do besouro oriental (Anomala orientalis), membros da família Scarabaeidae, demonstraram infestar gramas e pastos. Escaravelhos adultos demonstraram infestar plantas ornamentais e inúmeras culturas ao redor do mundo. Vários pesticidas foram tentados e incluíram pesticidas químicos, nematoides (ver, por exemplo, a Patente U.S. N^o 7 641 573) e Bacillus thuringiensis (ver, por exemplo, a Patente U.S. N^o 5 185 158), feromônios e repelentes naturais como erva de gato (catnip) e cebolinha.

Poli-hidroxialcanoatos (PHAs) [00017] Bioplástico é definido como uma forma de plástico sintetizado a partir de recursos renováveis tais como amido vegetal e espécies microbianas. Alguns dos materiais plásticos biodegradáveis em desenvolvimento incluem poli-hidroxialcanoato (PHA), polilactídeo, poliésteres alifáticos, polissacarídeos e os seus copolímeros e/ou suas blendas. PHAs, em particular, incluem diversos ésteres poliméricos como poli-hidroxibutiratos, poli-hidroxibutirato-co-hidroxivaleratos (PHBV), polihidroxibutirato-co-hidroxihexanoato (PHBHx) e poli-hidroxibutirato-cohidroxioctonoato (PHBO). O ácido poli3-hidroxibutírico (PHB) é o PHA microbiano natural mais comum. Os poli-hidroxialcanoatos são polímeros 100% biodegradáveis. Por exibirem propriedades semelhantes a vários termoplásticos sintéticos do tipo polipropileno, os PHAs podem ser usados em lugar destes. Adicionalmente, são totalmente degradados para água e dióxido de carbono em condições aeróbicas e para metano em condições anaeróbicas por microrganismos no solo, na água de lagos, em sistemas de esgoto e na água do mar. Dependendo do número de átomos de carbono na cadeia, os PHAs foram divididos em dois grupos: de cadeia curta (SCL), constituída por 3-5 átomos de carbono, e de cadeia média (MCL) constituída por 6-14 átomos de carbono (Khanna S, Srivastava

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AK. 2005). Essas diferenças devem-se principalmente à especificidade pelo substrato das PHA sintases que podem aceitar 3HAs de certa faixa de extensão de carbonos. O outro PH^^, bem conhecido é o copolímero poli (3-hidroxibutirato-co-3-hidroxivalerato) P(3HB-co-3HV), que compreende de quatro a cinco unidades monoméricas de cinco carbonos. A proporção destas unidades monoméricas pode variar, e isso afeta as propriedades físicas do polímero, ou seja, menos friável à medida que a proporção de unidades 3HV aumenta.

[00018] Em algumas espécies microbianas, o acúmulo de PHA ocorre durante a presença de excesso de carbono e limitação de fontes de nitrogênio (Verlinden et al., 2007). As moléculas de PHAs produzidos em resposta a condições estressantes funcionam como depósito de energia a ser utilizada quando fontes energéticas comuns estão ausentes (Solaiman e Ashby, 2005). Os polímeros plásticos acumulam intracelularidade como grânulos depositados amorfos com refração da luz nesses organismos (Mukhopadhyay et al., 2005). O PHB é sintetizado a partir de acetil-CoA por meio de três etapas enzimáticas (Krans et al., 1997). Do ponto de vista biotecnológico, a capacidade de bioplásticos de ser biodegradável os torna um substituto desejável para o plástico à base de substâncias petroquímicas, um poluente ambiental (Lee, 1996). A produção aumentada de bioplásticos pode reduzir significativamente as emissões de dióxido de carbono, limitar a geração de resíduos de plásticos e reduzir o consumo de combustíveis fósseis.

[00019] Os PHAs podem ser obtidos pelos três métodos seguintes: biossíntese por microrganismos, fotossíntese por plantas transgênicas e biossíntese in vitro utilizando enzimas apropriadas (ver, por exemplo, a Patente U.S. N^o 7 455 999, WO9914313). Na maioria das bactérias, as células sintetizam PHA em substratos que limitam o crescimento, além da fonte de carbono, tais como nitrogênio, fósforo ou oxigênio.

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10/88 [00020] O PHA acumulado serve como fonte de carbono e de energia durante a privação. Adicionalmente, serve também como dissipador para redução de energia e poderia, portanto, ser considerado como um regulador redox dentro da célula. Os PHAs também úteis como compostos estereorregulares que podem servir de precursores quirais para a síntese química de compostos opticamente ativos. Tais compostos são especialmente usados como carreadores biodegradáveis para doses prolongadas de fármacos, medicamentos, hormônios, inseticidas e herbicidas (Reddy 2003). Adicionalmente, são também usados como materiais osteossintéticos na estimulação de crescimento ósseo graças às suas propriedades piezelétricas, em placas ósseas, suturas cirúrgicas e substituições de vasos sanguíneos (Schaefer et al., 2000). Além do mais, foram revelados métodos de produção de copolímeros por processos microbiológicos utilizando várias bactérias, por exemplo, Alcaligenes eutrophus NCIMB 40124 (EP. 0431883A2), e a Patente U.S. N^o 7 455 999. EP N^o 2236089A1 descreve usos destes polímeros em implantes de múltiplas zonas para dispositivos de reparo ortopédico e dispositivos para fixação de tecidos moles. O documento WO 91/00917A1 descreve um método para controlar e modificar um novo biopolímero de poliésteres por manipulação da genética e enzimologia da síntese de poliésteres de polihidroxibutirato (PHB) e poli-hidroxialcanoato (PHA), em nível molecular, em células procarióticas e eucarióticas, especialmente de plantas. O documento WO 2005/030482A1 descreve métodos e usos como materiais compostáveis de embalagem. O documento WO2008/110541 descreve o método de estabilização de polihidroxibutiratos contra a degradação térmica.

Lignina [00021] Lignina é um constituinte principal da estrutura lenhosa de plantas superiores. Lignina processada é obtida como subproduto de

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11/88 reações de polpação da madeira. Os produtos da lignina incluem, por exemplo, sulfonatos de lignina, lignina alcalinas e oxiligninas que podem ser obtidos a partir de licores de resíduos de sulfeto, sulfato e de álcali (Snook, 1982, Handbook for Pulp & Paper Technologists, TAPPI, Atlanta).

[00022] A lignina demonstrou ter uma variedade de usos comerciais. Por exemplo, lignina solúvel em álcali tem sido utilizada como agente dispersante. A Patente U.S. N^o 3 726 850 descreve o uso de um produto da lignina solúvel em álcali, tratado com ozônio, que está essencialmente livre de enxofre organicamente ligado, como agente dispersante para argilas, corantes, pesticidas, negro de fumo e outros materiais. A Patente U.S. N^o 4 666 522 descreve o uso de produtos do lignossulfonato para preparar emulsões de ceras, óleos, gorduras, asfaltos e suas misturas. O acetato de lignina foi relatado como útil para aplicações em que atua como aglutinante em composições de tintas à base de água para impressão (Ver, por exemplo, a Patente U.S. N^o [s’ 612 051). A Patente U.S. N^o 5 668 183 descreve o uso de produtos do sulfonato de lignina para dispersar substâncias solúveis em gorduras. Além do mais, foram reveladas ligações de complexos lignina-pesticida (ver, por exemplo, a Patente U.S. N^o 3 813 236, a Patente U.S. N^o 3 929 453, reemitida como Re. N^o 29 238, a Patente U.S. N^o 4 381 194, a Publicação do Pedido de Patente U.S. N^o 20110015237, a Publicação do Pedido de Patente U.S. N^o 2010136132, a Publicação do Pedido de Patente U.S. N^o 20100278890, a Publicação do Pedido de Patente U.S. N^o

20080113920, a Publicação do Pedido de Patente U.S. N^o

2006247130, a Patente U.S. N^o 7 867 507, WO2003/005816, a Patente U.S. N^o 5 994 266).

Benzoato de sódio [00023] Benzoato de sódio tem sido usado em várias formulações

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12/88 como antimicrobiano em preparados alimentares. Por exemplo, a Patente U.S. N^o 6 599 514 descreve composições antifúngicas sinérgicas que compreendem um agente antifúngico e um aditivo alimentar, que produz um efeito sinérgico sobre a atividade antifúngica global da composição antifúngica. Aditivos alimentares descritos na Patente U.S. N^o 6 599 514 incluíam ácido sórbico e sorbatos, ácido benzoico e benzoatos, hidroxi-benzoatos, dióxido de enxofre e sulfetos, bifenil e derivados, nitritos, nitratos, ácido láctico, lactatos, ácido cítrico e citratos, ácido tartárico e tartaratos, ácido ortofosfórico e ortofosfatos, malatos, ácido adípico, ácido succínico, 1,4heptonolactona, ácido nicotínico, citrato de triamônio, citrato férrico de amônio, EDTA cálcio dissódico, glicerol, di, tri e polifosfatos, ácidos graxos (E470), mono e diglicerídeos de ácidos graxos (E4 71), ésteres de mono e diglicerídeos de ácidos graxos, gluconatos, cloro (E92S), hexametafosfato de sódio, hidroxianisol butilado (BHA), hidroxitolueno butilado (BHT) (E321), t-butil hidroquinona (THBQ), galato de propila, heptonato de cálcio, fitato de cálcio, éter dietílico, EDTA, dihidrogênio EDTA dissódico, acetato de etila, mono, di e triacetatos de glicerol, glicina, oxiestearina, propan-1,2-diol e propan-2-01 e heptonato de sódio.

[00024] Benzoato de sódio tem também sido usado em formulações pesticidas. Por exemplo, a Patente U.S. 4 668 507 concedida a SC Johnson ensina o uso de benzoato de sódio em pesticidas contidas em sistemas pressurizados de aço para liberação de aerossóis, em que o principal modo de estabilização é inibição da corrosão. A Patente U.S. N^o 5 620 678 descreve uma formulação inseticida que inclui benzoato de sódio como inibidor da corrosão. A Patente U.S. N^o 4 731 379 ensina composições inseticidas que contêm benzoato de sódio quando utilizadas como xampu de animais para eliminar pulgas. Nesta patente, não é mostrado o uso de benzoato de sódio para

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13/88 aumentar a eficácia do inseticida ou para estabilizar o produto, mas antes, acredita-se que auxilie na cicatrização de feridas do animal tratado. A Patente U.S. N^o 5 017 620 ensina composições inseticidas que contêm benzoato de sódio e outros conservantes conhecidos, em que estes são utilizados como antimicrobiano para estabilizar o produto durante o armazenamento. A Patente U.S. N^o 6 841 572 descreve uma solução aquosa para tratar plantas vivas, culturas, árvores, frutos antes da colheita, vegetais, folhas, caules, raízes e flores, cujo pH é entre 4,0 e 6,5 e que consiste essencialmente em concentrações eficazes como fungicida e/ou bactericida de um ou mais compostos conservantes selecionados a partir do grupo constituído por ácido sórbico, benzoico e láctico; os sais de sódio, potássio, cálcio e amônio do ácido benzoico, sórbico, hidroximetil glicínico, láctico e propiônico; e metil, etil, propil e butilparabeno, ao menos um surfactante aniônico e, opcionalmente, um acidulante. Sumário da invenção [00025] São providos composições e métodos para modulação e/ou a infestação por uma ou mais pragas Acari (aracnídeo), Muscidae, Drosophilidae, Anthomyidae, Aphididae, Triozidae, Tenebrionidae e/ou Scarabaiedae, que compreendem ou usam um sobrenadante, filtrado e/ou extrato e/ou um ou mais metabólitos do referido sobrenadante, filtrado e/ou extrato de uma cepa de Chromobacterium sp., especialmente uma cepa produtora de violaceína, inclusive, entre outras, Chromobacterium piscinae, C. pseudoviolaceum, Chromobactenum substugae e, mais especialmente, uma cepa de Chromobacterium substugae sp. nov. e ainda mais especialmente uma cepa de Chromobacterium substugae sp. nov. que tenha as características identificadoras de NRRL B-30655 descritas na Patente U.S. N^o 7 244 607.

[00026] É especificamente provido um método para modular a

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14/88 infestação por aracnídeos (Acari ou Acarina) e/ou de um ou mais insetos-pragas pertencentes às famílias Anthomyidae, Drosophilidae, Muscidae, Aphididae, Triozidae, Tenebrionidae ou Scarabaiedae, em um local onde a modulação é desejada, utilizando uma quantidade de (a) um sobrenadante, filtrado e/ou extrato e/ou um ou mais metabólitos do referido sobrenadante, filtrado e/ou extrato de uma cepa de Chromobacterium sp. e (b) outra substância pesticida, especialmente, um acaricida e/ou inseticida que possa ser eficaz contra Acari e/ou um ou mais insetos-pragas pertencentes às famílias Anthomyidae, Drosophilidae, Muscidae, Aphididae, Triozidae, Tenebrionidae ou Scarabaiedae eficaz para modular a infestação por aracnídeos e/ou de um ou mais insetos-pragas pertencentes às famílias Anthomyidae, Drosophilidae, Muscidae, Aphididae, Triozidae, Tenebrionidae ou Scarabaiedae no referido local.

[00027] Em uma concretização específica, a infestação por Acari é a infecção por Tetranychidae (ácaros). Em uma concretização mais específica, a infestação por ácaros é a infestação por Tetranychus urticae.

[00028] Em outra concretização específica, a infestação por insetopraga é uma infestação por Musca sp., Myzus sp., Bactericera sp., Cyclocephala sp. ou Alphitobius sp. Drosophila sp. Delia sp., Rhizotrogus sp., Popillia sp., Anomala sp. ou por Otiorhynchus sp. Em uma concretização ainda mais específica, a infestação por insetopraga é uma infestação por Musca domesticas (mosca doméstica), Drosophila suzukii (drosófila da asa manchada), Delia radicum (larva de raiz de couve), Myzus persicae (pulgão verde do pêssego), Bactericera cockerelli (psilídeo da batata), Alphitobius diaperinusxi (besouro da liteira), Cyclocephala lurida (larva branca), Rhizotrogus majalis (besouro mascarado do sul), Popilla japonica (besouro japonês), Otiorhynchus sulcatus (gorgulho preto da videira), Anomala

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15/88 orientalis (besouro oriental).

[00029] Adicionalmente, a presente invenção provê uma combinação pesticida que modula a infestação por ao menos um aracnídeo e/ou por um ou mais insetos-pragas, pertencentes às famílias Acari, Anthomyidae, Drosophilidae, Muscidae, Aphididae, Triozidae, Tenebrionidae ou Scarabaiedae, que compreende como componentes ativos: (a) um sobrenadante, filtrado e/ou extrato de Chromobacterium sp. e/ou um ou mais metabólitos a partir do referido sobrenadante, filtrado e/ou extrato de Chromobacterium sp. e (b) outra substância pesticida, especialmente, um acaricida e/ou inseticida que possa ser eficaz contra um ou mais insetos-pragas pertencentes às famílias Acari, Anthomyidae, Drosophilidae, Muscidae, Aphididae, Triozidae, Tenebrionidae ou Scarabaiedae, em que (a) e (b) podem opcionalmente estar presentes em quantidades sinérgicas. A substância pesticida pode ser (a) derivada de um microrganismo; (b) um produto natural e/ou (c) um pesticida química e, especificamente, um inseticida químico.

[00030] Em uma concretização, o metabólito pode ser um composto que (a) possui atividade pesticida; (b) possui peso molecular de aproximadamente 840-900 conforme determinado por cromatografia líquida/espectroscopia de massa (LC/MS) e (c) possui tempo de retenção na cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) de aproximadamente 7-12 minutos em coluna C-18 de HPLC de fase reversa utilizando um sistema de solventes com gradiente de água:acetonitrila (CH3CN) (0-20 minutos, CH3CN aquoso 90-0%; 20-24 minutos, CH3CN 100%; 24-27 minutos, CH3CN aquoso 0-90%; 27-30 minutos, CH3CN aquoso 90%) à vazão de 0,5 mL/minuto e detecção UV de 210 nm e (d) pode ser opcionalmente obtido de uma espécie de Chromobacterium. O composto em uma concretização pode ser um peptídeo.

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16/88 [00031] Em uma concretização específica, o composto possui 43 carbonos, sete carbonos metílicos, dez carbonos metilênicos, doze metínicos, 6 metínicos olefínicos e oito carbonos quaternários, conforme determinado por ¹³C RMN. Em concretizações mais específicas, o composto abrange os compostos A, B, C, D, retratados como ##STR001#. ##STR001a##, ##STR001b##, ##STR001c## respectivamente.

[00032] Em uma concretização específica, o composto A: (a) pode ser obtido a partir de uma espécie de Chromobacterium; (b) é tóxico para uma praga; (c) possui peso molecular de aproximadamente 840890 e mais especialmente, 860 conforme determinado por cromatografia líquida/espectroscopia de massa (LC/MS); (d) possui valores para ¹H em RMN de δ 8,89; 8,44; 8,24; 8,23; 7,96; 7,63; 6,66; 5,42; 5,36; 5,31; 5,10; 4,13; 4,07; 4,05; 3,96; 3,95; 3,88; 3,77; 3,73;

3,51; 3,44; 3,17; 2,40; 2,27; 2,11; 2,08; 2,03; 2,01; 1,97; 1,95; 1,90;

1,81; 1,68; 1,63; 1,57; 1,53; 1,48; 1,43; 1,35; 1,24; 1,07; 1,02; 0,96;

0,89; 0,88; 0,87; 0,80 e possui valores para ¹³C em RMN de δ 173,62; 172,92; 172,25; 172,17; 171,66; 171,28; 170,45; 132,13; 130,04;

129,98; 129,69; 129,69; 125,48; 98,05; 70,11; 69,75; 68,30; 68,25;

64,34; 60,94; 54,54; 52,82; 49,72; 48,57; 45,68; 40,38; 39,90; 38,18;

36,60; 31,98; 31,62; 31,58; 29,53; 28,83; 27,78; 24,41; 23,06; 22,09;

20,56; 19,31; 18,78; 17,66; 15,80 (e) possui tempo de retenção na cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) de aproximadamente 712 minutos, mais especificamente próximo de 9 minutos e ainda mais especificamente próximo de 9,08 minutos em coluna C-18 de HPLC de fase reversa (Phenomenex, Luna 5μ C18(2) 100 A, 100 x 4,60 mm) utilizando um sistema de solventes com gradiente de água:acetonitrila (CH3CN) (0-20 minutos, CH3CN aquoso 90-0%; 20-24 minutos, CH3CN 100%; 24-27 minutos, CH3CN aquoso 0-90%; 27-30 minutos, CH3CN aquoso 90%) à vazão de 0,5 mL/min e detecção UV de 210 nm.

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17/88 [00033] Em outra concretização específica, o composto B possui as seguintes características: (a) pode ser obtido a partir de uma espécie de Chromobacterium; (b) é tóxico para uma praga; (c) possui peso molecular de aproximadamente 850-900 e mais especialmente 874, conforme determinado por cromatografia líquida/espectroscopia de massa (LC/MS); (d) possui tempo de retenção na cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) de aproximadamente 7-12 minutos, mais especificamente próximo de 9 minutos e ainda mais especificamente próximo de 9,54 minutos em uma coluna C-18 de HPLC de fase reversa (Phenomenex, Luna 5μ C18(2) 100 A, 100 x 4,60 mm), utilizando um sistema de solventes com gradiente de água:acetonitrila (CH3CN) (0-20 minutos, CH3CN aquoso 90-0%, 20-24 minutos, CH3CN 100%, 24-27 minutos, CH3CN aquoso 0-90%; 27-30 minutos, CH3CN aquoso 90%) à vazão de 0,5 mL/min e detecção UV de 210 nm.

[00034] O metabólito pode também ser um composto que inclui, entre outros:

um composto tendo a estrutura ##STR001##

ou um de seus sais ou estereoisômeros aceitáveis como pesticida, em que R é -H, alquila inferior de cadeia contendo 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou 9 radicais alquila, radical arila ou arilalquila, alquila inferior substituído; X é O, NH, NR ou S; n é 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou 9; R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R10, R11 são cada um independentemente H, são iguais ou diferentes e independentemente um radical de aminoácido com cadeia lateral ou um derivado de

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18/88 aminoácido com cadeia lateral, alquila, alquila substituído, alquenila, alquenila substituído, alquinila, alquinila substituído, arila, arila substituído, heteroarila, heteroarila substituído, heterocíclico, heterocíclico substituído, cicloalquila, cicloalquila substituído, alcóxi, alcóxi substituído, tioalquila, tioalquila substituído, hidróxi, halogênio, amino, amido, carboxila, -C(O)H, acila, oxiacila, carbamato, sulfonila, sulfonamida ou sulfurila;

(B) um composto tendo a estrutura ##STR001a##

em que R é -H, alquila inferior de cadeia contendo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou 9 radicais alquila, radical arila ou arilalquila, alquila inferior substituído; X é O, NH, NR ou S; R2a, R2b são independentemente selecionados a partir do grupo constituído por -H, alquila, alquila inferior, alquila substituído e alquila inferior substituído; Ri, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R10, R11 são cada um independentemente H, são iguais ou diferentes e independentemente um radical de aminoácido com cadeia lateral ou um derivado de aminoácido com cadeia lateral, alquila, alquila substituído, alquenila, alquenila substituída, alquinila, alquinila substituída, arila, arila substituída, heteroarila, heteroarila substituída, heterocíclico, heterocíclico substituído, cicloalquila, cicloalquila substituída, alcóxi, alcóxi substituído, tioalquila, tioalquila substituída, hidróxi, halogênio, amino, amido, carboxila, -C(O)H, acila, oxiacila, carbamato, sulfonila, sulfonamida ou sulfurila.

(C) um composto tendo a estrutura ##STR001b##

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19/88

em que R é -H, alquila inferior de cadeia contendo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou 9 radicais alquila, radical arila ou arilalquila, alquila inferior substituído; X é O, NH, NR ou S; n é 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou 9; R2a, R2b são independentemente selecionados a partir do grupo constituído por -H, alquila, alquila inferior, alquila substituída e alquila inferior substituída; Ri, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R10, R11 são cada um independentemente H, são iguais ou diferentes e independentemente um radical de aminoácido com cadeia lateral ou um derivado de aminoácido com cadeia lateral, alquila, alquila substituído, alquenila, alquenila substituída, alquinila, alquinila substituída, arila, arila substituída, heteroarila, heteroarila substituída, heterocíclico, heterocíclico substituído, cicloalquila, cicloalquila substituída, alcóxi, alcóxi substituído, tioalquila, tioalquila substituído, hidróxi, halogênio, amino, amido, carboxila, -C(O)H, acila, oxiacila, carbamato, sulfonila, sulfonamida ou sulfurila.

(D) um composto tendo a estrutura ##STR001c##

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20/88 em que R é -H, radical alquila inferior com cadeia, arila ou arilalquila, alquila inferior substituída contendo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou 9 radicais alquila; X é O, NH, NR ou S; n é 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou 9; R2a, R2b são independentemente selecionados a partir do grupo constituído por -H, alquila, alquila inferior, alquila substituída e alquila inferior substituída; Ri, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R10, R11 são cada um independentemente H, são iguais ou diferentes e independentemente um radical de aminoácido com cadeia lateral ou um derivado de aminoácido com cadeia lateral, alquila, alquila substituída, alquenila, alquenila substituída, alquinila, alquinila substituída, arila, arila substituída, heteroarila, heteroarila substituída, heterocíclico, heterocíclico substituído, cicloalquila, cicloalquila substituído, alcóxi, alcóxi substituído, tioalquila, tioalquila substituída, hidróxi, halogênio, amino, amido, carboxila, -C(O)H, acila, oxiacila, carbamato, sulfonila, sulfonamida ou sulfurila.

[00035] Em uma concretização mais em especial, o metabólito é cromamida A (1).

Chromamide A (1) [00036] Em uma concretização específica, o metabólito é o composto C e possui as seguintes características: (a) pode ser obtido a partir de uma espécie de Chromobacterium; (b) é tóxico para uma ou mais pragas; (c) possui peso molecular de aproximadamente 325-360 e mais especialmente próximo de 343, conforme determinado por cromatografia líquida/espectroscopia de massa (LC/MS); (d) possui tempo de retenção em cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC)

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21/88 de aproximadamente 8-14 minutos, mais especificamente próximo de 10 minutos e ainda mais especificamente próximo de 10,88 minutos em coluna C-18 de HPLC de fase reversa (Phenomenex, Luna 5μ C18(2) 100 A, 100 x 4,60 mm) utilizando um sistema de solventes com gradiente de água:acetonitrila (CH3CN) (0-20 minutos, CH3CN aquoso 90-0%; 20-24 minutos, CH3CN 100%; 24-27 minutos, CH3CN aquoso 0-90%; 27-30 minutos, CH3CN aquoso 90%) à vazão de 0,5 mL/min e detecção UV de 210 nm. Em uma concretização específica, o composto C pode ser violaceína (2), um composto conhecido isolado anteriormente de Chromobacterium violaceum.

[00037] Em outra concretização, outro metabólito usado nas composições e nos métodos apresentados acima é o composto D e possui as seguintes características: (a) pode ser obtido a partir de uma espécie de Chromobacterium; (b) é tóxico para uma praga; (c) possui peso molecular de aproximadamente 315-350 e mais especialmente próximo de 327, conforme determinado por cromatografia líquida/espectroscopia de massa (LC/MS); (d) possui tempo de retenção na cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) de aproximadamente 10-15 minutos, mais especificamente próximo de 12 minutos e ainda mais especificamente próximo de 12,69 minutos em coluna C-18 de HPLC de fase reversa (Phenomenex, Luna 5μ C18(2) 100 A, 100 x 4,60 mm) utilizando um sistema de solventes com gradiente de água:acetonitrila (CH3CN) (0-20 minutos, CH3CN aquoso 90-0%; 20-24 minutos, CH3CN 100%; 24-27 minutos, CH3CN aquoso 0-90%; 27-30 minutos, CH3CN aquoso 90%) à vazão de 0,5 mL/minuto e detecção UV de 210 nm. Em uma concretização específica, o composto D pode ser caracterizado como desoxiviolaceína (3), um composto conhecido isolado anteriormente de Chromobacterium violaceum.

[00038] Em outra concretização específica, o composto pode ter a

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22/88 seguinte estrutura:

em que R é -H, alquila inferior de cadeia contendo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou 9 radicais alquila, radical arila ou arilalquila, alquila inferior substituída, halogênios; Ri, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9 são cada um independentemente H, são iguais ou diferentes, alquila, alquila substituída, alquenila, alquenila substituída, alquinila, alquinila substituída, arila, arila substituída, heteroarila, heteroarila substituída, heterocíclico, heterocíclico substituído, cicloalquila, cicloalquila substituída, alcóxi, alcóxi substituído, tioalquila, tioalquila substituída, hidróxi, halogênio, amino, amido, carboxila, -C(O)H, acila, oxiacila, carbamato, sulfonila, sulfonamida ou sulfurila.

[00039] Além do mais, é provido um método para (1) modular a infestação por pragas (por exemplo, nematoides, insetos, bactérias presentes no solo) em uma planta, o qual compreende aplicar às plantas e/ou às suas sementes e/ou ao substrato usado para cultivar a referida planta, ou um método para modular bactérias presentes no solo, o qual compreende aplicar à planta, sementes e/ou substrato uma quantidade de:

um composto que possui atividade pesticida e/ou antimicrobiana;

possui peso molecular de aproximadamente 950 - 1450, conforme determinado por espectrômetro de massa LTQ Orbitrap XL híbrido com transformada de Fourier.

possui valores δ para 1H em RMN de 5,22 (sext, 1H), 2,62 (dd, 1H), 2,53 (dd, 1H) e 1,31 (d, 3H) (d) possui valores δ para ¹³C em RMN de 169,2; 67,6; 40,9 e 19,8.

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23/88 compreende a estrutura -(-O-CHCH3-CH2-CO-)_n-, onde n=6-50 pode ser obtido a partir de uma espécie de Chromobacterium e (II) opcionalmente outra substância pesticida eficaz para modular a infestação na referida planta.

[00040] O composto (I) pode ter a estrutura:

em que

X é independentemente -O, -NR ou -S, em que R é H ou C1-C10 alquila; Y é independentemente -O, -S; n = 6-50; R1, R2 são cada um independentemente H, alquila, alquila substituída, alquenila, alquenila substituída, alquinila, alquinila substituída, arila, arila substituída, heteroarila, heteroarila substituída, heterocíclico, heterocíclico substituído, cicloalquila, cicloalquila substituída, alcóxi, alcóxi substituído, tioalquila, tioalquila substituída, hidróxi, halogênio, amino, amido, carboxila, -C(O)H, acila, oxiacila, carbamato, sulfonila, sulfonamida ou sulfurila.

[00041] Em particular, 0 composto (I) possui a estrutura:

em que n = 10-25.

[00042] Em uma concretização mais específica, (I) é um ácido alfabutírico.

[00043] Além do mais, é provido um método para obter os compostos apresentados acima. O método compreende cultivar uma cepa de Chromobacterium sp. em caldo de célula completa e condições suficientes para produzir 0 composto e isolar 0 composto

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24/88 produzido do caldo de célula completa.

[00044] Em um aspecto relacionado, são descritos métodos para estabilizar composições biológicas pesticidas contra a separação física e a perda de atividade causada pela exposição à luz solar, aplicandose uma quantidade de um agente estabilizante à referida composição biológica pesticida eficaz para estabilizar a composição biológica pesticida contra a separação física e a perda de atividade causada pela exposição à luz solar. Adicionalmente, são providas composições que compreendem tais agentes. Em uma concretização específica, a composição pesticida compreende o filtrado, sobrenadante ou extrato de Chromobacterium sp. ou uma substância ativa como pesticida dela derivada que pode estar presente na quantidade de ao menos aproximadamente 0,5% e especialmente entre aproximadamente 0,5% em peso com base em peso seco celular a aproximadamente 30% em peso. O agente estabilizante pode, em uma concretização específica, ser um sal de ácido benzoico e/ou sal de lignina, especialmente sal de sulfonato de lignina, inclusive, entre outros, de sódio, potássio, cálcio, magnésio, amônio e suas combinações, e pode estar presente na quantidade de ao menos aproximadamente 2,5% em peso e pode de preferência estar presente na quantidade de aproximadamente 5%15%.

Breve Descrição das figuras [00045] A Figura 1 é uma representação esquemática do esquema de purificação para obter cromamida A (1) violaceína (2) e desoxiviolaceína (3) do caldo de cultura.

[00046] A Figura 2 retrata as estruturas químicas de cromamida A (1) violaceína (2) e desoxiviolaceína (3).

[00047] A Figura 3 mostra os resultados de ensaios de MBI-203 em TSSM sobre discos de folhas. CFD representa células liofilizadas, que foram depois reconstituídas com água para representar doses de 1/2x,

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1x e 2,5x do caldo de célula completa.

[00048] A Figura 4 mostra o número médio de ovos postos por fêmeas de psilídeos da batata expostas à folha de pimenta tratada com MBI-203.

[00049] A Figura 5 mostra o número médio de ovos depositados por fêmeas de psilídeos após 5 dias da exposição a discos de folha de pimenta tratada e não tratada com MBI-203.

[00050] A Figura 6 mostra o número médio de ninfas e adultos de pulgão verde do pêssego (GPA) em discos de folha de pimenta tratada após 24 horas da exposição de adultos (P < 0,0001, LSD, α = 0,05). Médias de letras iguais não são estatisticamente diferentes uma da outra. dH2O - controle negativo, 203 10% v/v - controle positivo.

[00051] A Figura 7 mostra o número médio da progênie (ninfas) de pulgão verde do pêssego em discos de folha de pimenta tratada com MBI-203 após 3 dias da exposição de adultos (P < 0,0001, LSD, α = 0,05). Médias de letras iguais não são estatisticamente diferentes uma da outra. dH2O - controle negativo, Avid 10% v/v - controle positivo.

[00052] A Figura 8 mostra o número médio da progênie (ninfas) de pulgão verde do pêssego em discos de folha de pimenta tratada com MBI-203 e DF2 (produto formulado com MBI-203) após 3 dias da exposição de adultos (P < 0,0001, LSD, α = 0,05). Médias de letras iguais não são estatisticamente diferentes uma da outra. dH2O controle negativo, Avid 10% v/v - controle positivo.

[00053] A Figura 9 é uma representação esquemática do esquema de purificação para violaceína (2) e ácido oligo-(p-hidroxibutírico) (4) do caldo de cultura.

[00054] A Figura 10 retrata os resultados de bioensaios nematicidas de várias frações e do composto ácido oligo-hidroxibutírico (1).

[00055] As Figuras 11A e 11B mostram o número médio de pulgão verde do pêssego, Myzus persicae (ninfas e adultos) em discos de

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26/88 folha de pimenta tratada após 24 horas da exposição. Médias de letras iguais não são estatisticamente diferentes uma da outra (LSD, P < 0,0001, α = 0,05). Extrato bruto de 203 Me - MBI-203 em solvente metanol, Me - Metanol (tratamento testemunha), 203, extrato bruto de Ace - MBI-203 em solvente acetona, Ace - Acetona (tratamento testemunha), dH2O - controle negativo, Avid 10% - controle positivo. [00056] As Figuras 12A e 12B mostram o número médio de pulgão verde do pêssego, Myzus persicae (ninfas e adultos) em discos de folha de pimenta tratada após 24 horas da exposição. Médias de letras iguais não são estatisticamente diferentes uma da outra. Ace acetona somente (tratamento testemunha), DCM -, EA - , Lavagem - , MeOH -. dH2O - controle negativo, 203 10% - padrão MBI-203 (controle positivo).

[00057] A Figura 13 mostra o número médio da progênie de pulgão verde do pêssego (ninfas) em discos de folha de pimenta tratada após 3 dias da exposição de adultos (P < 0,0018, LSD, α = 0,05). Médias de letras iguais não são estatisticamente diferentes uma da outra. VL1 violaceína a 0,5 pg/mL, VL2 - violaceína a 1,0 pg/mL, Acetona tratamento testemunha, dH2O - controle negativo, Avid 10% v/v controle positivo.

[00058] A Figura 14 mostra o número médio de ninfas e adultos de pulgão verde do pêssego (GPA) em discos de folha de pimenta tratada após 24 horas da exposição de adultos (P < 0,0001, LSD, α = 0,05). Médias de letras iguais não são estatisticamente diferentes uma da outra. dH2O - controle negativo, 203 10% v/v - controle positivo.

[00059] A Figura 15 mostra o número médio de ninfas e adultos de pulgão verde do pêssego (GPA) em discos de folha de pimenta tratada após 24 horas da exposição de adultos (P < 0,0001, LSD, α = 0,05). Médias de letras iguais não são estatisticamente diferentes uma da outra. dH2O - controle negativo, 203 10% v/v - controle positivo.

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27/88 [00060] A Figura 16 mostra MBI-203 a 3% da mortalidade antes do sol em comparação a depois do sol, zerada para água.

[00061] A Figura 17 mostra MBI-203: Spray vegetal EP/EP+ NaBenz para afídeos da couve.

[00062] A Figura 18 mostra MBI-203 EP +/- Na Benz, spray vegetal para afídeos da couve, corrigido.

[00063] A Figura 19 mostra MBI-203: EP + CaCO3/NaBenz ANTES/APÓS O SOL, normalizado para controle negativo.

[00064] A Figura 20 mostra MBI-203 EP SDP após o sol, ensaios de 3 e 6 dias.

[00065] A Figura 21 mostra MBI-203 EP com Na Benz + lignina no sol, no Dia 4 do ensaio, corrigido.

[00066] A Figura 22 mostra MBI-203 EP com Na Benz + lignina no sol, porcentagem de perda de atividade, Dia 4 do ensaio.

[00067] A Figura 23 mostra MBI-203: EP + lignina + sol, Dia 4 do ensaio CL com brócolis.

Descrição detalhada das concretizações preferidas [00068] Embora as composições e os métodos acima sejam suscetíveis a várias modificações e formas alternativas, concretizações exemplares serão descritas abaixo detalhadamente. Deve ser entendido, contudo, que não há a intenção de limitar a invenção às formas específicas reveladas, mas, ao contrário, a intenção é abranger todas as modificações, os equivalentes e as alternativas que se enquadrarem no espírito e âmbito da invenção conforme definida pelas reivindicações anexadas.

[00069] Quando uma faixa de valores for fornecida, deve ser entendido que cada valor intermediário até o décimo da unidade do limite inferior, a menos que o contexto dite claramente em contrário, entre o limite superior e o inferior daquela faixa e qualquer outro valor declarado ou intermediário naquela faixa declarada, está incluído na

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28/88 mesma. Faixas menores estão também incluídas. Os limites superiores e inferiores destas faixas menores estão também incluídos nas mesmas, sujeito a qualquer limite especificamente excluído na faixa declarada.

[00070] A menos que definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos neste relatório descritivo têm o mesmo significado conforme comumente entendidos pelo técnico no assunto ao qual esta invenção pertence. Embora quaisquer métodos e materiais semelhantes ou equivalentes àqueles aqui descritos possam também ser usados na prática ou em testes da presente invenção, os métodos e os materiais preferidos são descritos abaixo.

[00071] Cabe notar que, neste relatório descritivo e nas reivindicações anexadas, as formas no singular um, uma, o e a incluem referências no plural, a menos que o contexto dite claramente em contrário.

[00072] Derivado de, conforme definido neste relatório descritivo, significa diretamente isolado ou obtido a partir de uma determinada fonte ou, alternativamente, que tenha as características identificadoras de uma substância ou organismo isolado ou obtido a partir de uma determinada fonte.

[00073] Carreador, conforme definido neste relatório descritivo, é um material inerte orgânico ou inorgânico com o qual o ingrediente ativo é misturado ou formulado para facilitar sua aplicação à planta ou outro objeto a ser tratado, ou seu armazenamento, transporte e/ou manuseio.

[00074] O termo modular, conforme definido neste relatório descritivo, significa alterar a quantidade de infestação por pragas ou a taxa de propagação da infestação por pragas.

[00075] O termo infestação por pragas, conforme definido neste relatório descritivo, é a presença de uma praga em uma quantidade

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29/88 que provoca um efeito nocivo, inclusive uma doença ou infecção, em uma população hospedeira ou a emergência de uma planta daninha indesejada em um sistema de cultivo.

[00076] Pesticida, conforme definido neste relatório descritivo, é uma substância derivada de um produto biológico ou de substância química que aumenta a mortalidade ou que inibe a taxa de crescimento de pragas de plantas e inclui, entre outros, nematicidas, inseticidas, herbicidas, fungicidas vegetais, bactericidas vegetais e viricidas vegetais.

[00077] Pesticida biológico, conforme definido neste relatório descritivo, é um microrganismo com propriedades pesticidas.

Métodos de produção [00078] Tal como notado acima, o pesticida biológico pode compreender ou ser derivado de um organismo que tenha as características identificadoras de uma espécie de Chromobacterium, mais especialmente, de um organismo que tenha as características identificadoras de uma cepa de Chromobacterium substugae, mais especialmente de uma cepa de Chromobacterium substugae sp. nov. que pode ter as características identificadoras de NRRL B-30655 ou, alternativamente de qualquer outro microrganismo. Os métodos compreendem cultivar estes organismos e obter os compostos e/ou as composições da presente invenção isolando estes compostos da cultura destes organismos.

[00079] Especificamente, os organismos são cultivados em meio nutriente usando métodos conhecidos na técnica. Os organismos podem ser cultivados por cultivo em frascos agitados, fermentação em pequena ou grande escala (inclusive entre outras, fermentações contínuas, em batelada, alimentada por batelada ou em estado sólido) em fermentadores de laboratório ou industriais, realizada em meio adequado e condições que permitam o crescimento celular. O cultivo

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30/88 pode acontecer em meio nutriente adequado que compreenda fontes de carbono e de nitrogênio e sais inorgânicos, usando procedimentos conhecidos na técnica. Meios adequados são disponibilizados por fornecedores comerciais ou preparados de acordo com composições publicadas.

[00080] Após o cultivo, os compostos e/ou as composições da presente invenção podem ser extraídos do caldo de cultura. O extrato pode ser fracionado por cromatografia.

Composições [00081] As substâncias apresentadas acima nas composições e nos métodos aqui descritos podem ser formuladas em qualquer maneira. Exemplos não limitantes de formulações incluem, entre outros, concentrados emulsionáveis (EC), pós molhantes (WP), líquidos solúveis (SL), aerossóis, soluções concentradas de ultrabaixo volume (ULV), pós solúveis (SP), microencapsulamento, grânulos dispersos em água, Suspensões líquidas (FL), microemulsões (ME), nanoemulsões (NE), etc. Em qualquer formulação aqui descrita, a porcentagem do ingrediente ativo encontra-se dentro de uma faixa de 0,01% a 99,99%.

[00082] As composições podem estar na forma de líquido, gel ou sólido. As composições líquidas compreendem compostos pesticidas derivados de uma cepa de Chromobacterium, por exemplo, uma cepa que tenha as características identificadoras de Chromobacterium substugae sp. Nov e, mais especialmente, que tenha as características identificadoras de NRRL B-30655 (ver a Patente U.S. N^o 7 244 607).

[00083] Uma composição sólida pode ser preparada suspendendo um carreador sólido em uma solução de compostos pesticidas e secando a suspensão em condições leves, como evaporação à temperatura ambiente ou evaporação no vácuo a 65 °C ou abaixo.

[00084] Uma composição pode compreender compostos encapsulados em gel derivados da cepa de Chromobacterium. Tais

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31/88 materiais encapsulados em gel podem ser preparados misturando um agente formador de gel (por exemplo, gelatina, celulose ou lignina) com uma cultura ou suspensão de Chromobacterium viva ou inativada, um filtrado livre de células ou fração celular de uma cultura ou suspensão de Chromobacterium, uma cultura, célula ou fração celular seca por aspersão ou liofilizada ou em uma solução de compostos pesticidas utilizados no método da invenção; e induzindo a formação de gel do agente.

[00085] A composição pode adicionalmente compreender um surfactante que é usado para fins de emulsificação, dispersão, hidratação, espalhamento, integração, controle da desintegração, estabilização de ingredientes ativos e de melhora da fluidez ou inibição de ferrugem. Em uma concretização específica, o surfactante é do tipo não iônico não fitotóxico e pertence de preferência à lista 4B de Inertes da EPA. Em outra concretização especial, o surfactante não iônico é monolaurato de polioxietileno (20). A concentração de surfactantes pode variar entre 0,1-35% da formulação total, em que a faixa preferida é de 5-25%. A escolha de agentes dispersantes e emulsionantes, tais como agentes dispersantes e emulsionantes não iônicos, anfotéricos e catiônicos, e a quantidade empregada é determinada pela natureza da composição e a capacidade do agente para facilitar a dispersão das composições da presente invenção.

[00086] A composição como apresentada acima também compreende um agente estabilizante, que estabiliza uma composição biológica pesticida contra a separação física e a perda de atividade causada pela exposição à luz solar. Este agente estabilizante pode ser um sal do ácido benzoico ou sal do sulfonato de lignina.

[00087] A composição apresentada acima pode ser combinada com outro microrganismo e/ou pesticida (por exemplo, nematicida, fungicida, inseticida, antibiótico ou agente antimicrobiano). O

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32/88 microrganismo pode incluir, entre outros, um agente derivado de Bacillus sp., Pseudomonas sp., Brevabacillus sp., Lecanicillium sp., diferente de Ampelomyces sp., Pseudozyma sp., Streptomyces sp, Burkholderia sp, Trichoderma sp, Gliocladium sp. Alternativamente, o agente pode ser um óleo natural ou produto de óleos que tenha atividade fungicida e/ou inseticida (por exemplo, óleo parafínico, óleo de árvore do chá, óleo de capim-limão, óleo de cravo, óleo de canela, óleo de citros, óleo de alecrim). Além do mais, o pesticida pode ser um agente antifúngico de único sítio, os quais incluem, entre outros, benzimidazol, um inibidor da desmetilação (DMI) (por exemplo, imidazol, piperazina, pirimidina, triazol), morfolina, hidroxipirimidina, anilinopirimidina, fosforotioato, inibidor de quinona externa, quinolina, dicarboximida, carboximida, fenilamida, anilinopirimidina, fenilpirrol, hidrocarboneto aromático, ácido cinâmico, hidroxianilida, antibiótico, polioxina, acilamina, ftalimida, benzenoide (xililalanina), um inibidor da desmetilação selecionado a partir do grupo constituído por imidazol, piperazina, pirimidina e triazol (por exemplo, bitertanol, miclobutanil, penconazol, propiconazol, triadimefom, bromuconazol, ciproconazol, diniconazol, fenbuconazol, hexaconazol, tebuconazol, tetraconazol), miclobutanil e um inibidor de quinona externa (por exemplo, estrobilurina). A estrobilurina pode incluir, entre outras, azoxiestrobina, cresoxim-metoíla ou trifloxiestrobina. Em ainda outra concretização específica, o agente específico é uma quinona, por exemplo, quinoxofena (éter 5,7-dicloro-4-quinolil 4-fluorofenílico). O agente antifúngico pode ser também derivado de um extrato de Reynoutria. [00088] O fungicida pode ser também um fungicida químico, não orgânico de múltiplos sítios, selecionado a partir do grupo constituído por cloronitrila, quinoxalina, sulfamida, fosfonato, fosfito, ditiocarbamato, cloralquiltios, fenilpiridin-amina, ciano-acetamina oxima.

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33/88 [00089] A composição pode, conforme notado acima, compreender ainda um inseticida. O inseticida pode incluir, entre outros, avermectina, Bt, óleo de nim, espinosades, Burkholderdia sp., conforme apresentada na Publicação do Pedido de Patente U.S. N^o 2011-0207604, fungos entomopatogênicos como Beauveria bassiana e inseticidas químicos incluindo, entre outros, compostos organoclorados, compostos organofosforados, carbamatos, piretroides e neonicotinoides.

[00090] Tal como notado acima, a composição pode ainda compreender um nematicida. Este nematicida pode incluir, entre outros, avermectina, produtos microbianos, tais como Biome (Bacillus firmus), Pasteuria spp e produtos orgânicos tais como saponinas.

Usos [00091] As composições, as culturas e os sobrenadantes e os compostos pesticidas apresentados acima podem ser usados como pesticidas. Especificamente, os compostos ou as composições conforme apresentados acima podem ser usados como inseticidas, bactericidas (contra bactérias presentes no solo) e nematicidas. Especificamente, os nematoides que podem ser controlados usando o método apresentado acima incluem, entre outros, nematoides parasitários tais como nematoides das galhas, dos cistos e das lesões, inclusive, entre outros, Meloidogyne sp. Tylenchorhynchus sp, Hoplolaimus sp., Helicotylenchus sp., Pratylenchus sp., Heterodera sp., Globodera sp., Trichodorus sp. Paratrichodorus sp., Xiphinema sp. e Criconema sp.; especialmente Meloidogyne incognita (nematoides das galhas), bem como Globodera rostochiensis e globodera pailida (nematoides dos cistos da batata); Heterodera glycines (nematoide dos cistos da soja); Heterodera schachtii (nematoides dos cistos da beterraba); e Heterodera avenae (nematoides dos cistos dos cereais).

[00092] Tal como notado acima, o(s) ingrediente(s) ativo(s) e as

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34/88 composições apresentados acima podem também ser aplicados a locais contendo Acari (aracnídeos), como ácaros, inclusive, entre outros, Panonychus sp. como Panonychus citri (ácaro vermelho dos citros) e Panonychus ulmi (ácaro-aranha vermelho), Tetranychus sp. como Tetranychus kanzawi (ácaro-aranha Kanzawa), Tetranychus urticae (ácaro-aranha de duas manchas), Tetranychus pacificus (ácaro-aranha do Pacífico), Tetranychus turkestanii (ácaro do morango) e Tetranychus cinnabarinus (ácaro-aranha do carmim), Oligonychus sp. como Oligonychus panicae (ácaro marrom do abacateiro), Oligonychus perseae (ácaro Persea), Oligonychus pratensis (ácaro do capim Banks) e Oligonychus coffeae, Aculus sp. como Aculus cornatus (ácaro prateado do pessegueiro), Aculus fockeni (ácaro da ferrugem da ameixeira) e Aculus lycopersici (ácaro do bronzeamento do tomateiro), Eotetranychus sp. como Eotetranychus wilametti, Eotetranychus yumensis (ácaro-aranha Yuma) e Eotetranychus sexmaculatis (ácaro de seis manchas), Bryobia rubrioculus (ácaro marrom), Epitrimerus pyri (ácaro da ferrugem da pereira), Phytoptus pyri (ácaro das bolhas em folhas da pereira), Acalitis essigi (ácaro vermelho das bagas), Polyphagotarsonemus latus (ácaro branco), Eriophyes sheldoni (ácaro de brotos de citros), Brevipalpus lewisi (ácaro plano dos citros), Phylocoptruta oleivora (ácaro da ferrugem dos citros), Petrobia lateens (ácaro marrom do trigo), Oxyenus maxwelli (ácaro da oliveira), Rhizoglyphus spp., Tyrophagus spp., Diptacus gigantorhyncus (ácaro da cabeça grande da ameixeira) e Penthaleaa major (ácaro dos grãos de inverno), ácaro-vermelho do abacateiro, ácaro plano, ácaro-aranha negro e vermelho da mangueira, ácaro enrolador de folhas do Papaia, ácaro de citros do Texas, ácaro vermelho europeu, ácaro Erineum da videira (ácaro das bolhas), ácaro-aranha do Pacífico, ácaro-aranha de Willamette; ácaro da falsa ferrugem dos citros. Tais locais podem

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35/88 incluir, entre outros, culturas que estão infestadas por tais ácaros ou outros aracnídeos (por exemplo, afenídeos). Tais locais podem incluir, entre outros, culturas que estão infestadas por tais ácaros ou outros aracnídeos (por exemplo, afenídeos).

[00093] Insetos fitopatogênicos controlados pelo método apresentado acima incluem, entre outros, larvas de insetos não pertencentes à família Culicidae da ordem (a) Lepidoptera, por exemplo, Acleris spp., Adoxophyes spp., Aegeria spp., Agrotis spp., Alabama argillaceae, Amylois spp., Anticarsia gemmatalis, Archips spp., Argyrotaenia spp., Autographa spp., Busseola fusca, Cadra cautella, Carposina nipponensis, Chilo spp., Choristoneura spp., Clysia ambiguella, Cnaphalocrocis spp., Cnephasia spp., Cochylis spp., Coleophora spp., Crocidolomia binotalis, Cryptophlebia leucotreta, Cydia spp., Diatraea spp., Diparopsis castanea, Earias spp., Ephestia spp., Eucosma spp., Eupoecilia ambiguella, Euproctis spp., Euxoa spp., Grapholita spp., Hedya nubiferana, Heliothis spp., Hellula undalis, Hyphantria cunea, Keiferia lycopersicella, Leucoptera scitella, Lithocollethis spp., Lobesia botrana, Lymantria spp., Lyonetia spp., Malacosoma spp., Mamestra brassicae, Manduca sexta, Operophtera spp., Ostrinia nubilalis, Pammene spp., Pandemis spp., Panolis flammea, Pectinophora gossypiella, Phthorimaea operculella, Pieris rapae, Pieris spp., Plutella xylostella, Prays spp., Scirpophaga spp., Sesamia spp., Sparganothis spp., Spodoptera spp., Synanthedon spp., Thaumetopoea spp., Tortrix spp., Trichoplusia ni e Yponomeuta spp.;

(b) Coleoptera, por exemplo, Agriotes spp., Alphitobius sp., Anomola spp., por exemplo, Anomala orientalis; Anthonomus spp., Atomaria linearis, Chaetocnema tibialis, Cosmopolites spp., Curculio spp., Cyclocephala spp., por exemplo, Cyclocephala lurida, Dermestes spp., Diabrotica spp., Epilachna spp., Eremnus spp., Leptinotarsa decemlineata, Lissorhoptrus spp., Melolontha spp., Orycaephilus spp.,

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Otiorhynchus spp., Otiorhynchus sulcatus, Phlyctinus spp., Popillia spp., por exemplo, Popilla japonica, Psylliodes spp., Rhizopertha spp-, por exemplo, Rhizotrogus majalis, Sitophilus spp., Sitotroga spp., Tenebrio spp., Tribolium spp. e Trogoderma spp.; (c) Orthoptera, por exemplo, Blatta spp., Blattella spp., Gryllotalpa spp., Leucophaea maderae, Locusta spp., Periplaneta spp. e Schistocerca spp.; (d) Isoptera, por exemplo, Reticulitermes spp.; (e) Psocoptera, por exemplo, Liposcelis spp.; (f) Anoplura, por exemplo, Haematopinus spp., Linognathus spp., Pediculus spp., Pemphigus spp. e Phylloxera spp.; (g) Mallophaga, por exemplo, Damalinea spp. e Trichodectes spp.; (h) Thysanoptera, por exemplo, Frankliniella spp., Hercinotnrips spp., Taeniothrips spp., Thrips palmi, Thrips tabaci e Scirtothrips aurantii; (i) Heteroptera, por exemplo, Cimex spp., Distantiella theobroma, Dysdercus spp., Euchistus spp., Eurygaster spp., Leptocorisa spp., Nezara spp., Piesma spp., Rhodnius spp., Sahlbergella singularis, Scotinophara spp. e Tniatoma spp.; (j) Homoptera, por exemplo, Aleurothrixus floccosus, Aleyrodes brassicae, Aonidiella spp., Aphididae, Aphis spp., Aspidiotus spp., Bactericera spp., Bemisia tabaci, Ceroplaster spp., Chrysomphalus aonidium, Chrysomphalus dictyospermi, Coccus hesperidum,

Empoasca spp., Eriosoma larigerum, Erythroneura spp., Gascardia spp., Laodelphax spp., Lecanium corni, Lepidosaphes spp., Macrosiphus spp., Myzus spp., Nephotettix spp., Nilaparvata spp., Paratoria spp., Pemphigus spp., Planococcus spp., Pseudaulacaspis spp., Pseudococcus spp., Psylla spp., Pulvinaria aethiopica, Quadraspidiotus spp., Rhopalosiphum spp., Saissetia spp., Scaphoideus spp., Schizaphis spp., Sitobion spp., Trialeurodes vaporariorum, Triozidae spp., Trioza erytreae e Unaspis citri; (k) Hymenoptera, por exemplo, Acromyrmex, Atta spp., Cephus spp., Diprion spp., Diprionidae, Gilpinia polytoma, Hoplocampa spp., Lasius

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37/88 spp., Monomorium pharaonis, Neodiprion spp., Solenopsis spp. e Vespa spp.; (l) Diptera, por exemplo, Aedes spp., Antherigona soccata, Bibio hortulanus, Calliphora erythrocephala, Ceratitis spp., Chrysomyia spp., Cuterebra spp., Dacus spp., Delia spp., Delia radicum, Drosophila spp., por exemplo, Drosophila suzukii; Fannia spp., Gastrophilus spp., Glossina spp., Hypoderma spp., Hyppobosca spp., Liriomyza spp., Lucilia spp., Melanagromyza spp., Musca spp., Oestrus spp., Orseolia spp., Oscinella frit, Pegomyia hyoscyami, Phorbia spp., Rhagoletis pomonella, Sciara spp., Stomoxys spp., Tabanus spp., Tannia spp. e Tipula spp.; (m) Siphonaptera, por exemplo, Ceratophyllus spp. e Xenopsylla cheopis; (n) da ordem Thysanura, por exemplo, Lepisma saccharina; (o) Hemiptera, por exemplo, Bactericera sp., por exemplo, Bactericera cockerelli.

[00094] Os ingredientes ativos podem ser aplicados a locais contendo pragas Scarabaeidae. Estes incluem, entre outros, solo, capim e várias plantas ornamentais, árvores e vegetais.

[00095] O(s) ingrediente(s) ativo(s) e as composições apresentadas acima podem ser aplicados a locais contendo uma praga Muscidae. Estes incluem, entre outros, ambientes internos, lixo, animais, cercas, currais, estábulos, locais de ordenha, gaiolas de parto, etc. contendo animais (gado, porcos, ovelhas, cavalos, etc.).

[00096] O(s) ingrediente(s) ativo(s) e as composições apresentadas acima podem ser aplicados a locais contendo o(s) ingrediente(s) ativo(s) e as composições contendo uma praga Tenebrionidae. Estes incluem, entre outros, grãos, aves, cercados para moradia de aves (cercas, currais, estábulos, locais de ordenha, gaiolas de parto, etc.) contendo animais (gado, porcos, ovelhas, cavalos, etc.).

Exemplos [00097] A composição e os métodos apresentados acima serão ilustrados mais detalhadamente nos Exemplos não limitantes abaixo.

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Os exemplos são ilustrativos de várias concretizações apenas e não restringem a invenção reivindicada no que diz respeito aos materiais, às condições, às razões do peso, aos parâmetros de processos e os semelhados recitados neste pedido de patente.

Exemplo 1: Extração de cromamida, desoxiviolaceína e violaceína a partir de Chromobacterium substugae [00098] O procedimento a seguir é usado para a purificação de compostos extraídos da cultura de Chromobacterium substugae: [00099] O caldo de cultura derivado da fermentação de 10 litros de C. substugae em caldo L é extraído com resina Amberlite XAD-7 (Asolkar et al., 2006) pela agitação da suspensão celular com a resina a 225 rpm por duas horas à temperatura ambiente. A resina e a massa celular são coletadas por filtração através de pano de queijo e lavadas com água DI para remover os sais. A resina, a massa celular e o pano de queijo são depois encharcados por 2 horas em acetona/metanol (50/50), após as quais, a acetona/metanol é filtrada e secada sob vácuo utilizando evaporador rotativo para fornecer o extrato bruto. O extrato bruto é depois fracionado utilizando cromatografia de exclusão por tamanho em coluna Sephadex LH 20 (CH2O2/CH3OH; 50/50) para fornecer 7 frações (Figura 1). Estas frações são depois concentradas até a secagem complete utilizando evaporador rotativo, e os resíduos secos resultantes são rastreados quanto à atividade biológica por meio de um ensaio de alimentação com lagarta falsa medideira da couve (Trichoplusia ni) ou lagarta do cartucho da beterraba (Spodoptera exigua). As frações ativas são depois submetidas à HPLC de fase reversa (Sistema Spectra P4000 (Thermo Scientific)) para fornecer compostos puros, os quais são depois rastreados nos ensaios citados acima para localizar/identificar os compostos ativos. Para confirmar a identidade do composto, dados espectroscópicos adicionais, tais como de LC/MS e RMN, são registrados.

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39/88 [000100] Cromamida A (1) e o composto B foram obtidos da Fração 1 e 2 respectivamente, ao passo que violaceína (2) e desoxiviolaceína (3) foram purificadas da Fração 5 obtida por cromatografia em Sephadex LH 20.

Purificação de compostos [000101] A purificação de cromamida A (1) foi realizada utilizando coluna C-18 de HPLC (Phenomenex, Luna 10u C18(2) 100 A, 250 x 10), sistema de solventes com gradiente de água:acetonitrila (0-10 minutos, CH3CN aquoso 80-75%; 10-45 minutos, CH3CN aquoso 7560%; 45-55 minutos, CH3CN aquoso 60-50%; 55-65 minutos, CH3CN aquoso 50-100%; 65-70 minutos, CH3CN 100%; 55-70 minutos, CH3CN aquoso 0-80%) à vazão de 2,5 mL/minutos e detecção UV de 210 nm. O composto ativo cromamida A (1) possui tempo de retenção de 23,19 minutos.

[000102] A purificação do composto B da invenção foi realizada usando coluna C-18 de HPLC (Phenomenex, Luna 10u C18 (2) 100 A, 250 x 10), sistema de solventes com gradiente de água:acetonitrila (010 minutos, CH3CN aquoso 80-75%; 10-45 minutos, CH3CN aquoso 75-60%; 45-55 minutos, CH3CN aquoso 60-50%; 55-65 minutos,

CH3CN aquoso 50-100; 65-70 minutos, CH3CN 100%; 55-70 minutos, CH3CN aquoso 0-80%) à vazão de 2,5 mL/minutos e detecção UV de 210 nm; tempo de retenção do composto ativo B de 26,39 minutos.

[000103] A purificação de violaceína (2) e de desoxiviolaceína (3) foi realizada utilizando coluna C-18 de HPLC (Phenomenex, Luna 10u C18(2) 100 A, 250 x 10), sistema de solventes com gradiente de água:acetonitrila (0-10 minutos, CH3CN aquoso 70-60%; 10-40 minutos, CH3CN aquoso 60-20%; 40-60 minutos, CH3CN aquoso 200%; 60-65 minutos, CH3CN 100%; 65-75 minutos, CH3CN aquoso 070%) à vazão de 2,5 mL/minutos e detecção UV de 210 nm, os compostos ativos violaceína (2) apresentou tempo de retenção de 7,86

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40/88 minutos e desoxiviolaceína (3) de 12,45 minutos.

Análise de compostos por espectroscopia de massa [000104] A análise por espectroscopia de massa de picos ativos é realizada em um instrumento Thermo Finnigan LCQ Deca XP Plus de electrospray (ESI) utilizando modos positivos e negativos de ionização em modo de varredura completa (m/z 100-1500 Da) em espectrômetro de massa LCQ DECA XP^plus (Thermo Electron Corp., San Jose, CA). Instrumento de cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC), equipado com detector Finnigan Surveyor PDA Plus, autoamostrador Plus, bomba MS e coluna Luna C18 5μ 100A de 4,6 mm x 100 mm (Phenomenex). O sistema de solventes consistiu em água (solvente A) e acetonitrila (solvente B). A fase móvel inicia com solvente a 10% e é linearmente aumentada para solvente B 100% durante 20 minutos, depois mantida por 4 minutos e finalmente retornando para solvente B 10% durante 3 minutos e mantida por 3 minutos. A vazão é de 0,5 mL/min. O volume da injeção era 10 pL e as amostras são mantidas à temperatura ambiente em um autoamostrador. Os compostos são analisados por LC-MS utilizando a LC e a cromatografia de fase reversa. A análise por espectroscopia de massa dos presentes compostos é realizadas sob as seguintes condições: A vazão do gás nitrogênio foi fixada a 30 e 15 arb para a vazão do gás de bainha e a do auxiliar/varredura. A ionização por electrospray foi realizada com voltagem do spray definida a 5000 V e voltagem no capilar a 35,0 V. V. A temperatura do capilar foi definida a 400°C. Os dados foram analisados no software Xcalibur. A cromamida A (1) possui massa molar de 860 em modo positivo de ionização. O cromatograma de LCMS para o outro composto ativo B sugere massa molar de 874 em modo positivo de ionização. Violaceína (2) e desoxiviolaceína (3) apresentaram as massas molares de 313 e 327, respectivamente, em modo positivo de ionização.

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Análise de compostos através de espectroscopia por RMN [000105] Os espectros de RMN-RMN foram medidos em um espectrômetro Bruker com gradiente de campo de 600 MHz. A referência é definida no padrão interno tetrametilsilano (TMS; 0,00 ppm). As análises de aminoácidos foram realizadas em analisador de aminoácidos Hitachi 8800.

[000106] Para elucidação da estrutura, a cromamida A purificada com peso molecular de 860 é analisada mais detalhadamente utilizando um instrumento de RMN de 600 MHz, e possui valores δ de RMN para ¹H em 8,89; 8,44; 8,24; 8,23; 7,96; 7,63; 6,66; 5,42; 5,36; 5,31; 5,10; 4,13; 4,07; 4,05; 3,96; 3,95; 3,88; 3,77; 3,73; 3,51; 3,44; 3,17; 2,40; 2,27; 2,11; 2,08; 2,03; 2,01; 1,97; 1,95; 1,90; 1,81; 1,68; 1,63; 1,57; 1,53; 1,48; 1,43; 1,35; 1,24; 1,07; 1,02; 0,96; 0,89; 0,88; 0,87; 0,80 (ver a Figura 4) e valores de RMN para ¹³C de 173,62; 172,92; 172,25; 172,17; 171,66; 171,28; 170,45; 132,13; 130,04; 129,98; 129,69; 129,69; 125,48; 98,05; 70,11; 69,75; 68,30; 68,25; 64,34; 60,94; 54,54; 52,82;

49,72; 48,57; 45,68; 40,38; 39,90; 38,18; 36,60; 31,98; 31,62; 31,58;

29,53; 28,83; 27,78; 24,41; 23,06; 22,09; 20,56; 19,31; 18,78; 17,66;

15,80, A cromamida A foi isolada em forma de sólido branco, o qual foi analisado para a fórmula molecular C43H68N6O12 (13 graus de insaturação) por espectrometria de massa de alta resolução-ESI (M⁺ m/z observado de 861,5376; M+ m/z calculado de 861,5343). Os dados espectrais por ¹H RMN da cromamida A em DMSO-d6 exibiram 68 sinais de prótons, entre os quais, para nove prótons [δH: 8,89; 8,44; 8,23; 8,22; 7,96; 7,64; 6,65; 5,10; 4,13] foi atribuído NH ou OH devido à ausência de correlação com carbono em uma análise de correlação heteronuclear por RMN (HMQC). O espectro de ¹³C RMN mostrou sete sinais de carbonila [δε: 173,62; 172,92; 172,25; 172,17; 171,66;

171,28; 170,45] e no espectro de ¹H RMN, seis sinais característicos de α-amino prótons [δ^ 4,07; 4,06; 3,96; 3,95; 3,88; 3,72] foram

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42/88 observados e demonstram que a cromamida A é um peptídeo. [000107] A interpolação de dados 2D de 2D RMN levou à atribuição de três unidades de aminoácido dos seis, uma leucina (Leu), uma valina (Val) e uma glutamina (Gln). A presença destes aminoácidos foi confirmada pelos resultados da análise de aminoácidos, a qual também mostrou a presença dos três aminoácidos acima. A análise mais detalhada de dados espectrais de DEPT e 2D de RMN (COSY, HSQC e HMBC) estabeleceu a presença de três subestruturas I, II e III conforme mostradas abaixo:

H3C

[000108] As conexões das três subestruturas em 1 foram feitas pela análise rotineira no espectro HMBC por RMN usando correlações entre o próton α-amino e/ou o próton de amida secundária e as ressonâncias do carbono de carbonilas e consideração sobre o desvio químico. A ligação de C-9 da subestrutura I a C-10 da subestrutura II foi estabelecida por correlações no HMBC de CH3-40 [ôh: 1,00] e do próton α-amino de alanina [ôh: 3,42] ao carbono C-10 [ôc: 70,11]. Esse dado foi ainda confirmado pela correlação de três ligações no HMBC de hidroxila a [ôh: 5,10] para C-9 a [ôc: 49,78]. O metileno a [ôh: 3,50] da subestrutura III mostrou uma correlação de três ligações no HMBC a C-19 [ôc: 68,31] que conectavam a subestrutura I e II. O carbono quaternário em C-3 [ôc: 98,09] era conectado ao C-21 [ôc: 64.40] através de uma correlação fraca de H-21 [ôh: 3,95] juntamente com seus valores de desvio químico para formar um sistema em anel. Finalmente, a ligação de fechamento do anel era assegurada por uma

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43/88 correlação de três ligações no HMBC de H3-36 [ôh: 1,43] ao C-1 [ôc: 172,17], o que permitiu atribuir estrutura planar para a cromamida A (1).

[000109] O composto B com peso molecular de 874 exibiu dados semelhantes de RMN e UV sugerindo que este composto B também pertence à classe de peptídeo.

[000110] A estrutura para violaceína (2) e desoxiviolaceína (3) foi atribuída por comparação dos dados destes compostos com aqueles publicados na literatura. As estruturas de cromamida A, violaceína e de desoxiviolaceína são mostradas na Figura 2.

Exemplo 2: Análise de aminoácidos de cromamida A [000111] Cromamida A (0,05 mg) foi hidrolisada por meio de hidrólise em fase líquida (HCL 6N, fenol 1%, 110 °C, 24 horas, em vácuo). Depois de resfriada, a mistura de reação foi seca e o produto hidrolisado foi dissolvido em tampão de diluição Norleu para 1,0 mL de volume. Uma alíquota de 50 pL da amostra foi carregada na coluna de troca iônica para análise.

[000112] Para padrões e calibração, uma solução com padrões de aminoácidos para hidrolisado proteico no Hitachi 8800 à base de Na (Sigma, A-9906) é usada para determinar fatores de resposta e assim calibrar o analisador Hitachi 8800 para todos os aminoácidos. Cada injeção contém NorLeucina como padrão interno para permitir correção dos resultados por variações em volume de amostra e variáveis de cromatografia. O sistema utiliza tampões Pickering de Na, HCl com grau de alta pureza (Sequanal Grade) da Pierce (hidrólise), coluna de troca iônica transgenômica e um método aperfeiçoado desenvolvido pela Molecular Structure Facility (MSF), UC Davis, e cada aminoácido presente na amostra foi relatado. Os aminoácidos presentes na amostra (cromamida A) demonstraram ser Glx (Glutamina/ácido glutâmico), leu (leucina) e Val (Valina).

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Exemplo 3: Efeito de Chromobacterium substugae (MBI-203) contra ácaros-aranhas de duas manchas - Feijoeiros [000113] MBI-203 liofilizado foi misturado com água destilada para obter concentrações variadas de equivalente celular em caldo de célula completa. Feijoeiros não infestados, Phaseolus vulgaris, foram pulverizados com MBI-203. Discos de folhas foram então retirados das plantas pulverizadas e colocados em uma placa de Petri como fonte de alimento para ácaros-aranhas de duas manchas, Tetranychus urticae. 10 ácaros foram colocados em cada disco e incubados a 75 °F (12,9 °C), 12:12 (L:D). Avaliações de ácaros vivos e mortos foram registradas após 1, 3 e 7 da infestação. 1x CFD é o material liofilizado reconstituído para as concentrações celulares em caldo de célula completa (0,0103 g de liofilizado/mL de dH2O). Os resultados são mostrados na Figura 3.

Exemplo 4: Efeito de Chromobacterium substugae (MBI-203) contra ácaros-aranhas de duas manchas - Calêndulas [000114] Calêndulas, Tagetes erecta, foram infestadas com ácarosaranhas de duas manchas, Tetranychus urticae. O produto formulado (MBI-203) ou Chenopodium ambrosioides (comercializado como REQUIEM® pela AgraQuest, Inc., Davis, CA) foi aplicado à planta infestada, que foi mantida em uma estufa com variações de temperatura de aproximadamente 72-85 °F (22,22-29,44 °C). Uma amostra com superfície foliar de 6 cm² foi colhida e o número de ninfas vivas e mortas e imaturas foi contado. Os resultados são mostrados na Tabela 1.

Tabela 1: Comparação de MBI-203 com REQUIEM®

		Dia 0	Dia 3	Dia 5	Dia 7	Dia 14
T ratamento	Estágio	Vivo	Vivo	Vivo	Vivo	Vivo
Sem tratamento	ninfa	155	165	180	181	200
MBI-203 @ 1%	ninfa	146	74	144	218	216

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		Dia 0	Dia 3	Dia 5	Dia 7	Dia 14
MBI-203 @ 5%	ninfa	142	92,8	143	170	175
REQUIEM® (+)	ninfa	142	145	147	158	153
Sem tratamento	Adulto	48	60,8	75,3	77	115
MBI-203 @ 1%	Adulto	61,3	84,3	94	88,8	105
MBI-203 @ 5%	Adulto	35,5	72,3	93,8	113	111
REQUIEM® (+)	Adulto	36,5	44	68	94,5	91,5
Exemplo 5: Rasl	treamento do efeil	to de Chromobacterium su	bstugae

(MBI-203) contra ácaros-aranhas de duas manchas (TSSM) - Vagens [000115] Vagens infestadas com TSSM ou TSSM resistente à abamectina foram pulverizadas com diluições de 0,5%, 1%, 2% e 4% v/v de MBI-203 formulado a aproximadamente 100 galões/acre. A mortalidade foi avaliada 9 dias após a aplicação. Os resultados são mostrados na Tabela 2.

Tabela 2: Efeito de MBI-203 sobre a infestação de TSSM em vagens

	TSSM suscetível	TSSM resistente à abamectina
	% de redução	% de redução
Concentração	Ovos	Ninfas	Adultos	Ovos	Ninfas	Adultos
0,5%	0	0	0	n/a	n/a	n/a
1%	0	0	0	0	0	0
2%	8	15	25	0	0	0
4%	55	55	60	0	0	0

Exemplo 6: Rastreamento de MBI-203 contra ácaros-aranhas de duas manchas em morango [000116] A eficácia de cinco compostos tradicionais e de ingredientes de MBI-203 foram avaliadas para controle de TSSM em transplantes de morango em campo no Florida Gulf Coast Research and Education Center. As plântulas foram transplantadas no campo (Dia 0). Cada parcela de 12,5 pés (3,80 metros) consistia em 20

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46/88 plantas. As parcelas foram infestadas quatro vezes do Dia 55 ao Dia 71 com 10 a 20 TSSM móveis por planta. Dezessete tratamentos de várias taxas e esquemas de aplicação de acaricidas, alguns combinados com um adjuvante, e um de verificação sem tratamento foram reproduzidos quatro vezes em delineamento RCB. Os tratamentos foram aplicados por meio de pulverizador manual com vareta pulverizadora equipada com um bocal contendo um núcleo a 45 graus e disco número quatro. O pulverizador era pressurizado por CO2, para 0,28 MPa (40 psi) e calibrado para liberar 100 galões por acre. Amostras foram coletadas semanalmente a partir do Dia 90 antes da primeira pulverização até 2 semanas depois da última aplicação dos tratamentos (Dia 154). As amostras consistiam em dez folíolos selecionados aleatoriamente por parcela e foram coletadas do estrato no terço médio das plantas. TSSM móveis e ovos foram retirados dos folíolos com escova em discos adesivos rotativos e foram contados. Não observada fototoxicidade. Os resultados são mostrados nas Tabelas 3 e 4.

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TABELA 3. A eficácia de cinco derivados químicos tradicionais e de dois ingredientes ativos derivados biologicamente para controle de TSSM

Tratamento/	Taxa	Número de TSSM móveis/folíolo
Formulação3	Quantidade/4047 m2 (acre)	Dia 90	Dia 98	Dia 105	Dia 111	Dia 118	Dia 125	Dia 132	Dia 139	Dia 146	Dia 154
Sem tratamento	—	8,8 a	2,0 a	7,3 a	4,8 a	14,3 a	47,5 a	89,8 a	150,5 a	277,5 a	319,0 a
Abamectina como a.id. (comercializada como AGRIMEK® 0.15 EC, Syngenta Inc.)	473 mL (16 onças líquidas-fl. oz.)	8,5 a	4,5 a	6,3 a	5,3 a	0,5 e	0,5 h	3,0 d-f	6,3 fg	6,8 g-i	15,3 e-g
Bifenzate como a.id. (comercializada como ACRAMITE® 50WS, Chemtura) + INDUCE®6	453 g (1 libra)	3,8 a	6,0 a	6,0 d	0,8 c	8,3 b-f	20,5 c-e	3,0 i	28,0 ef	66,5 de	128,3 bf
COHERE®	473 mL (16 onças líquidas-fl. oz.)	2,8 a	5,5 a	7,0 a	5,5 a	14,3 ab	34,3 ab	72,5 ab	121,3 ab	237,8 a	270,0 a
Espiromesifina como a.id + INDUCE®6	355 mL (12 onças líquidas-fl. oz.)	2,8 a	2,3 a	2,0 a	2,3 a	0,5 e	0,8 gh	0,5 ef	2,5 gh	2,8 i	6,0 g
Fenpiroximato como a.id (comercializado como PORTAL® 5% EC, Nichino America)	946 mL (32 onças líquidas-fl. oz.)	4,5 a	3,8 a	6,5 a	2,8 a	2,0 c-e	7,3 c-f	5,3 de	10,0 e-g	34,3 d-f	145,3 a- c
Hexitiazox como a.id (comercializado como SAVEY®50DF, Gowan)	170 g (6 onças)	2,0 a	1,8a	2,8 a	6,0 a	13,8 ab	23,0 ab	57,5 ab	103,3 ab	196,0 ab	285,5 a
MBI-203 + INDUCE®6	3,79 L(1 galão)	4,3 a	-	9,5 a	7,8 a	10,3 ad	18,0 a-d	54,5 ab	97,8 a-c	196,3 ab	218,0 ab
MBI-203 + INDUCE®6	11,36 L (3 galões)	2,8 a	-	4,5 a	5,3 a	16,0 ab	8,8 b-e	22,5 bc	38,8 b-d	87,5 b-d	156,0 a- c
Fl7,51		1,35	0,75 (Fl3,39)	1,34	0,94	4,44	7,82	11,12	13,26	15,86	13,84
Valor P		0,20	0,70	0,21	0,53	<0,0001	<0,0001	<0,0001	<0,0001	<0,0001	<0,0001

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Dados transformados em logw(x+1) antes da ANOVA; são relatadas médias não transformadas. Médias dentro de uma coluna seguidas pela mesma letra não são significativamente diferentes pelo LSD protegido de Fisher (P<0,05).

^a Um sinal'+’ indica que os produtos foram combinados.

⁶ INDUCE®, (Aquatic Ecosystems, Inc.), surfactante não iônico aplicado a 32 fl. oz. (946 mL)/acre.

^c COHERE®, (Helena Chemical Company), adjuvante adesivo não iônico do espalhamento, aplicado a 16 fl. oz. (473 mL)/acre.

^d a.i. é ingrediente ativo

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TABELA 4. A eficácia de cinco derivados químicos tradicionais e de dois ingredientes ativos derivados biologicamente para controle de TSSM

Tratamento/	Taxa	Número	e ovos de TSSM/folíolo
Formulação3	quantidade/4047 m2 (acre)	Dia 90	Dia 98	Dia 105	Dia 111	Dia 118	Dia 125	Dia 132	Dia 139	Dia 146	Dia 154
Sem tratamento	-	15,5 a	10,0 a	27,5 ab	12,3a	25,3 a	122,0 a	181,5 a	587,0 a	559,0 a	423,0 a
Abamectina como a.id. (comercializado como AGRI-MEK® 0.15EC, Syngenta Inc.)	473 mL (16 onças líquidas -fl.oz.)	6,8 a	17,0a	26,5 ab	12,0 ab	1,3 ef	2,3 gh	6,5 hi	3,5 f-h	3,5 gh	41,3e-g
Bifenzate como a.id. (comercializado como ACRAMITE® 50WS, Chemtura) + INDUCE®'’	453 g(1 libra)	3,8 a	6,0 a	6,0 d	0,8 c	8,3 b-f	20,5 c-e	3,0 i	28,0 ef	66,5 de	128,3 b-f
COHERE®	473 mL (16 onças líquidas -fl.oz.)	6,8 a	15,5 a	11,8 a-d	16,8 a	31,5ab	148,3 a	114,0 ab	321,0ab	525,3 a	377,0 a
Espiromesifina como a.id+1NDUCE®0	355 mL (12 onças líquidas -fl.oz)	7,3 a	5,3 a	7,3 d	5,0 bc	1,5 d-f	2,3 f-h	2,8 hi	0,8 h	4,5 f-h	25,5 fg
Fenpiroximato como a.id (comercializado como PORTAL® 5% EC, Nichino America)	946 mL (32 onças líquidas -fl.oz.)	9,3 a	11,8a	12,3 cd	12,5 ab	1,0f	34,5 bc	20,8 de	28,5 d	97,3 cd	240,8 a-d
Hexitiazox como a.id (comercializado como SAVEY® 50DF, Gowan)	170g (6 onças-oz.)	2,0 a	8,5 a	15,0 a-d	17,0a	22,0 ab	71,5 ab	128,5 ab	281,5 ab	393,5 ab	533,0 a
MBI-203 + INDUCE®'’	3,79 L(1 galão)	8,0 a		27,3 ab	20,5 a	19,5 ab	56,3 ab	91,8a-c	187,3 bc	304,5 ab	432,3 a
MBI-203 + INDUCE®'’	11,36 L (3 galões)	5,0 a	-	11,0b-d	14,5 a	11,0a-c	30,0 bc	35,5 c-e	57,8 cd	238,3 a-c	341,5 ab
Fl7,51		0,95	0,96 (Frjss)	2,12	1,93	4,48	13,52	18,40	19,96	19,16	5,13
Valor P		0,5194	0,5042	0,0201	0,0363	<0,0001	<0,0001	<0,0001	<0,0001	<0,0001	<0,0001

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Dados transformados em logw(x+1) antes da ANOVA; são relatadas médias não transformadas. Médias dentro de uma coluna seguidas pela mesma letra não são sign ficativamente dferentes pelo LSD protegido de Fisher (P<0,05).

³ Um sinal'+’ indica que os produtos foram combinados.

^b INDUCE®, (Aquatic Ecosystems, Inc.), surfactante não iônico aplicado a 946 mL (32 onças líquidas)/ 4047 m² (acre).

^c COHERE®, (Helena Chemical Company), adjuvante adesivo não iônico do espalhamento, aplicado a 473 mL (16 onças líquidas)/ 4047 m² (acre).

^da.i. é ingrediente ativo.

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Exemplo 7: Efeito de Chromobacterium substugae (MBI-203) contra moscas domésticas [000117] A substância em teste é rastreada quanto à eficácia por contato direto contra moscas domésticas (adultos). Há três grupos de tratamento para cada composto: concentração a 1,5%, 3% e 6% concentração mais um controle sem tratamento. Cada grupo contém cinco réplicas com aproximadamente 10 insetos cada. Os artrópodes serão tratados com um pulverizador manual com bomba até que a cobertura completa seja atingida, em copos de 16 onças (483 gramas) com uma tampa de bebida. Em quatro horas, uma bola de algodão com solução de sacarose 10% é fornecida às moscas por sua inserção com perfuração na tampa. Os dados são coletados em 5, 15, 30, 45, 60 minutos e 2, 4 e 24 horas ou até o desfecho. O efeito de choque (knockdown) e a mortalidade foram determinados pela contagem do número relativo de insetos propensos. Insetos moribundos não foram incluídos nos totais de mortalidade. Os resultados são mostrados abaixo na Tabela 5.

Exemplo 8: Efeito de Chromobacterium substugae (MBI-203) contra besouros da liteira [000118] Três grupos de tratamento foram testados para cada composto: concentração a 1,5%, 3% e 6% mais um controle sem tratamento. Cada grupo continha cinco replicas com aproximadamente 10 insetos cada. Os artrópodes foram tratados com um pulverizador manual com bomba até que a cobertura completa fosse atingida, em copos Deli Squat de 8 (0,25) ou 454 g(16 onças) com tampas perfuradas e papel filtro no fundo para absorver qualquer excesso de material. O efeito de choque e a mortalidade foram observados em 5, 15, 30, 45, 60 minutos e 2, 4, 24, 48 e 72 horas após o tratamento. O efeito de choque e a mortalidade foram determinados pela contagem do número relativo de insetos propensos. Insetos moribundos não foram incluídos nos totais de mortalidade. Os resultados são mostrados abaixo na Tabela 6.

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Tabela 5

	Taxa	Efeito d	e choque	Mortalidade
5 min	15 min	30 min	45 min	1h	2h	4h	24h	48h	72h
Mosca doméstica (ZCS) Musca domestica	1,5%	10,0%	28,0%	54,0%	58,0%	64,0%	70,0%	76,0%	80,0%	80,0%	80,0%
3%	14,9%	36,2%	59,6%	74,5%	80,9%	80,9%	80,9%	85,1%	89,4%	95,7%
6%	47,7%	68,2%	97,7%	97,7%	97,7%	97,7%	97,7%	97,7%	100,0%	100,0%

Tabela 6

Besouro da liteira - larvas Alphitobius diaperinus		Knockd	own	Mortalidade
Taxa	5 min	15 min	30 min	45 min	1h	2h	4h	24h	48h	72h
3%	33,3%	47,9%	50,0%	58,3%	68,8%	75,0%	77,1%	85,4%	93,8%	85,4%
6%	45,1%	64,7%	72,5%	76,5%	76,5%	82,4%	76,5%	86,3%	88,2%	86,3%
1,5%	40,0%	58,0%	62,0%	64,0%	74,0%	78,0%	78,0%	72,0%	90,0%	86,0%
3%	70,0%	82,0%	92,0%	86,0%	88,0%	92,0%	88,0%	94,0%	98,0%	100,0%
6%	84,3%	96,1%	98,0%	98,0%	100,0%	100,0%	100,0%	98,0%	100,0%	96,1%
	1,5%	0,0%	12,0%	20,0%	22,0%	34,0%	42,0%	50,0%	68,0%	70,0%	70,0%
Besouro da liteira - adulto Alphitobius diaperinus	3%	2,0%	2,0%	12,0%	14,0%	24,0%	28,0%	28,0%	54,0%	54,0%	56,0%
6%	0,0%	8,0%	12,0%	22,0%	36,0%	40,0%	40,0%	76,0%	80,0%	78,0%
1,5%	4,0%	6,0%	10,0%	12,0%	14,0%	18,0%	22,0%	24,0%	30,0%	32,0%
3%	6,0%	24,0%	28,0%	32,0%	42,0%	64,0%	72,0%	94,0%	94,0%	94,0%
6%	10,0%	22,0%	30,0%	38,0%	62,0%	78,0%	86,0%	86,0%	94,0%	90,0%

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Exemplo 9: Efeito de MBI-203 sobre a capacidade de postura de ovos de psilídeos da batata, Bactericera cockerelli

Métodos [000119] A capacidade de postura de ovos de fêmeas de psilídeos da batata expostas a folhas de pimenta tratadas com MBI-203 foi determinada. As folhas de pimenta foram retiradas no pecíolo e tratadas com MBI-203 por imersão durante 1 minuto. Os tratamentos no experimento foram como segue: MBI-203 a 10% v/v em dH2O, dH2O como controle negativo e Avid a 10% v/v como controle positivo. As folhas tratadas foram mantidas em placas de Petri de plástico com as bordas para fora, recobertas com espuma craft com o diâmetro central cortado para expor a folha tratada.

[000120] Quatro fêmeas de 1 dia de idade foram colocadas no centro da placa onde a folha tratada estava exposta (parte cortada da espuma craft), debaixo da cobertura da placa de Petri e o arranjo foi preso com 2 clipes prendedores. A postura de ovos pelas fêmeas adultas foi permitida e a contagem dos ovos foi realizada 3 a 10 dias após a exposição.

[000121] Um bioensaio de acompanhamento de disco de folha em folhas tratadas com MBI-203 e sem tratamento foi conduzido para verificar o efeito de MBI-203 sobre a capacidade de postura de ovos de fêmeas de psilídeos da batata. O tratamento de MBI-203 a 3% v/v em água e um controle sem tratamento, dH2O apenas (controle negativo) foram usados no ensaio. Os discos de folhas de pimenta (pimenteiras de 3-4 semanas de idade) foram cortados em círculos com um cortador de biscoitos de 23 mm, selecionando uma parte plana da folha para assegurar que o disco pudesse ser pousado uniformemente plano sobre a placa de ágar depois do tratamento com o composto. O fundo das placas foi recoberto com 30 pL de solução de ágar 1%, suficientes apenas para recobri-la de modo a sustentar os

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52/88 discos de folhas e manter a umidade. Foi deixado que o ágar solidificasse pelo resfriamento à temperatura ambiente. O tratamento do disco de folha foi realizado despejando a solução de tratamento em uma placa de Petri de vidro. Com a solução na placa, os discos de folhas foram tratados por imersão, girando a placa gentilmente para encharcar e recobrir completamente os discos de folhas. O tratamento foi executado durante 1 minuto e os discos de folhas tratadas foram depois deixados para que secassem por 10-15 minutos em uma capela de laboratório ou até que a solução tivesse secado completamente. Em cada placa de ágar solidificada, foram adicionados 20-30 pL de dH2O com uma pipeta ao ágar. Cada disco de folha tratada foi pousado individualmente sobre a placa de ágar, com a face abaxial da folha do disco para baixo sobre o ágar molhado, e pressionado gentilmente para ficar completamente plano no ágar. Em cada placa tratada com o disco de folha (tratamento), 4 psilídeos fêmeas foram introduzidos. As placas de Petri com fêmeas prenhas foram depois recobertas com a cobertura da placa de Petri, perfurada com orifícios mínimos para aeração e evitar a condensação. As placas foram fechadas com parafilme e mantidas à temperatura ambiente. O número de ovos postos foi contado diariamente, iniciando um dia após a introdução das fêmeas. O experimento foi realizado em 3 réplicas e repetido duas vezes.

Resultados [000122] Uma redução significativa de ovos colocados por fêmeas expostas ao tratamento com MBI-203 foi observada. Um ligeiro atraso em oviposição de ovos era evidente em fêmeas nos discos de folhas tratadas com MBI-203. As fêmeas de psilídeos expostas aos discos de folhas tratadas com MBI-203 iniciaram a oviposição de ovos 3 dias após a exposição (Figura 4). A postura de ovos pelas fêmeas atingiu o pico no Dia 7 e declinou no Dia 10. No Dia 10, a contagem média de

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53/88 ovos diminuiu à medida que as fêmeas começaram a chocar. As fêmeas expostas ao tratamento com controle positivo (Avid 10% v/v) estavam todas mortas no Dia 3 sem nenhum ovo depositado sobre os discos de folhas tratadas com Avid.

[000123] Os bioensaios de verificação em discos de folhas confirmaram um resultado compatível com uma redução significativa de ovos ovidepositados por fêmeas no disco de folhas tratadas com MBI-203 a 3% v/v (Figura 5). Uma redução de 65% em ovos foi exibida por fêmeas expostas a discos de folhas tratadas com MBI-203 quando comparadas a fêmeas expostas a discos de folhas sem tratamento (dH2O apenas). Estes resultados dos bioensaios indicam que o MBI203 afeta a fisiologia e compromete a capacidade de postura de ovos de fêmeas de psilídeos.

Exemplo 10: Efeito de MBI-203 sobre larvas e escaravelhos

Controle de larvas brancas em gramados [000124] Inseticidas foram avaliados quanto ao controle de larvas brancas (Besouro mascarado do sul, Cyclocephala lurida Bland) em gramas Kentucky Bluegrass (Poa pratensis L.) e avezem perene áspero (Lolium perenne L.) no campo de golfe North Bend em North Bend, Nebraska. Os Inseticidas foram aplicados a parcelas de 1,5 x 1,5 metros(5 x 5 pés), dispostas com delineamento em blocos completos aleatórios (RCB) e em 5 réplicas. Os produtos líquidos foram aplicados um pulverizador com CO2 a 0,28 MPa(40 psi) e pulverizações finais aplicadas de 174 gpa. Dentro de 24 horas após a aplicação, todos os tratamentos foram irrigados com 2,54 cm(0,25 polegadas) de água. As formulações foram avaliadas 24 dias e 48 dias após o tratamento (DAT), removendo de cada parcela 3 centros de solo gramado com 20,32 cm(8 polegadas) de diâmetro (área total de 975,48 cm²(1,05 pés quadrados) ) até uma profundidade de 91,44 cm(3 polegadas) e contando o número de larvas sobreviventes e

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54/88 moribundas. As parcelas foram periodicamente avaliadas quanto à fitotoxicidade. Os resultados são mostrados nas Tabelas 7 e 8.

[000125] Parece haver uma correlação entre taxa de aplicação e a porcentagem de controle para os tratamentos com MBI-203 DF1. Todos os tratamentos, exceto MBI-203 DF1 (59 mL (2 onças líquidas)/9,29 m²(100 pés quadrados) ), superaram o desempenho de triclorfom 6% (comercializado como DYLOX® 420 SL ( 204 mL (6,9 onças líquidas)/92,9 m2(1000 pés quadrados) ) pela Bayer CropScience, Inc., uma inseticida padrão do setor para o controle de larvas brancas). Curiosamente, foram encontradas larvas moribundas em todos os tratamentos de MBI-203 AF1 e MBI-203 DF1. Esses números (em parântese) não foram usados na análise estatística, mas foram incluídos para fins comparativos. Não foi observada fototoxicidade. AF1 é uma formulação em suspensão líquida aquosa e DF1 é em pó molhável de Chromobacterium substugae.

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Tabela 7: Eficácia de MBI-203 no controle de larvas brancas 24 dias após o tratamento (24 DAT)

Tratamento/ formulação	Taxa mL (onças líquidas)/92,9cm2 (1000 pés quadrados)	No de larvas br (1,05 pés quad	ancas/975,48 cm2 rados)	Média ± SE de larvas brancas/975,48 cm2 (1,05 pés quadrados)	% de controle
Rep 1	Rep 2	Rep 3	Rep 4	Rep 5
MBI-203 AF1	473 (16)	5 (2)	4 (2)	1	2	0	2,4 ± 0,9	76,0
MBI-203 DF1	237 (8)	8 (1)	4 (1)	2	3	2	3,8 ± 1,1	62,0
MBI-203 AF1	237 (8)	3 (3)	9 (3)	7 (1)	5 (3)	0	4,8 ± 1,6	52,0
MBI-203 AF1	946 (32)	9 (3)	5	7	4	0	5,0 ± 1,5	50,0
MBI-203 DF1	118 (4)	5	6 (1)	10	2 (1)	2 (2)	5,0 ± 3,2	50,0
Dylox 420 SL	204 (6,9)	0	6	9	9	4	5,6 ± 1,7	44,0
MBI-203 DF1	59 (2)	2 (1)	8 (2)	8	9	6	6,6 ± 1,2	34,0
UTC		9	8	15	8	10	10,0 ± 1,3	—

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Tabela 8 Eficácia de MBI-203 no controle de larvas brancas 24 dias após o tratamento (43 DAT)

T ratamento/ Formulação	Taxa mL (onças líquidas)/92,9 m2 (1000 pés quadrados)	No de larvas brancas/975,48 cm2 (1,05 pés quadrados)	Média de larvas brancas/975,48 cm2 (1,05 pés quadrados)	% de controle
Rep 1	Rep 2	Rep 3	Rep 4
MBI-203 DF2	118 (4,0)	2	0	0	0	0,5 a	95,0
Dylox 6.2 G	1,36 Kg(3 libras)	3	3	0	0	1,5 a	85,0
MBI-203 DF2	59 (2,0)	0	0	6	4	2,5 a	75,0
MBI-203 DF2	237 (8,0)	10	2	6	1	4,75 a	52,5
UTC	---	15	8	10	7	10,0 b	---

Médias seguidas pela mesma letra não são significativamente diferentes (P>0,05, LSD=4,4).

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Estudo de alimentação do efeito de MBI-203 sobre outros escaravelhos que se alimentam de raízes [000126] Solo Groton não esterilizado, pH 4,25, matéria orgânica 14%, foi infestado com larvas do escaravelho, besouro oriental (Anomala orientalis) e classificado com base no número de larvas que morreram. O solo foi tratado com a formulação em suspensão líquida aquosa de MBI-203 e a porcentagem de mortalidade foi computada:

Tabela 9: Efeito de MBI-203 sobre larvas do besouro oriental

	Estudo 1	Estudo 2
	% de mortalidade 7 DAT (dias após o tratamento)
1,5 mL de produto/5 g de solo (mistura do solo 30%)	100	100
1 mL de produto/5 g de solo (mistura do solo 20%)	100	100
0,5 mL de produto + 0,5 mL de água deionizada/5 g de solo	87	100
0,25 mL de produto + 0,75 mL de água deionizada/5 g de solo	93	100
0,1 mL de produto + 0,9 mL de água deionizada/5 g de solo	40	13
0,05 mL de produto + 0,95 mL de água deionizada/5 g de solo	27	27
Controle sem tratamento (30% de umidade)	0	7
Controle sem tratamento (20% de umidade)	0	0
[000127] Um estudo semelhante foi rea	lizado com	larvas do

escaravelho Rhizotrogus majalis, (besouro mascarado europeu) utilizando 1,5 mL e 1 mL de produto em 5 g de solo. 100/100 larvas foram eliminadas em 7 DAT e nenhuma foi morta no Controle.

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58/88 [000128] Os estudos foram também conduzidos com larvas do gorgulho preto da videira, Otiorhynchus sulcatus (Curculionidae) com meio de cultura (sem fonte de alimento), cenouras e raízes de Taxus. Os resultados são mostrados nas Tabelas 10, 11, 12 e 13.

Tabela 10: Efeito de MBI-203 com solo de cultivo

	% de mortalidade 7 DAT	% de mortalidade 14 DAT
0,9 mL de produto/3 g de meio (mistura de solo 30%)	0	0
0,6 mL de produto/3 g de meio (mistura de solo 20%)	0	0
Controle (30% de umidade)	0	0
Controle (20% de umidade)	0	0

Tabela 11: Efeito de MBI-203 com cenouras imersas no produto

	% de mortalidade 3 DAT
Fatia de cenoura imersa no produto	100
Fatia de cenoura imersa em água deionizada (controle)	0

Tabela 12: Efeito de MBI-203 com raízes de Taxus

	% de mortalidade 3 DAT
Raízes de Taxus imersas no produto e secas	90
Raízes de Taxus imersas em água deionizada e secas	0

Tabela 13: Efeito de MBI-203 com fatia de cenoura (seca)

	% de mortalidade 3 DAT
Fatia de cenoura imersa no produto e seca	60
Fatia de cenoura imersa em água deionizada e seca (controle)	0

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59/88 [000129] O MBI-203 aparenta ser muito ativo contra escaravelhos, besouros e gorgulhos que se alimentam de raízes, especialmente quando alimentados com uma fonte de alimento tratado.

Exemplo 11: Efeito de MBI-203 contra larva de raiz de couve [000130] Este estudo foi conduzido para determinar a eficácia de formulações de MBI-203 para o controle de larvas de couve (Delia radicum) em plantas dos brócolis em um estudo realizado em estufa cercada. Os tratamentos experimentais de MBI-203 DF-1 (formulação de pó molhável de MBI-203) a taxas de 57g (2 onças) /92,9 m² (1000 pés quadrados) e 227 g (8 onças) /92,9 m2 (1000 pés quadrados) e MBI-203 DF-2 (uma segunda formulação em pó molhável de MBI-203) a taxas de 57 g (2 onças) / 92,9 m2 (1000 pés quadrados) e 227 g (8 onças) / 92,9 m2 (1000 pés quadrados) . Os tratamentos experimentais foram comparados ao padrão comercial, RADIANT® (comercializado pela DowAgro Sciences e contendo espineforam como ingrediente ativo) a uma taxa de 119,83 g/l (1 libra/galão) [000131] O número de insetos adultos vivos foi registrado semanalmente até 14 dias após a Terceira aplicação (14DA-C) e o número de larvas vivas foi registrado semanalmente até 21 DA-C. Os resultados mostraram que MBI 203 DF-1 apresentava um número significativamente menor de adultos surgidos na última data de avaliação, e foi comparável ao RADIANT®. MBI-203 DF-1 apresentou um número significativamente mais baixo de adultos surgidos do que o UTC na última data de avaliação, e foi comparável em controle ao RADIANT®·

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Tabela 14. Contagem de larvas. Número médio de insetos larvais de insetos Delia radicum por tratamento, listado por data de avaliação

No de tratamento	Nome do tratamento	Taxa	Unidade da taxa	Código de aplicação	7 DA-C	14 DA- C	21 DA- C
1	Sem tratamento			ABC	5,75 a	6,25 a	6,50 a
2	MBI 203 DF -1	57 (2)	g (onça)/92,9 m2 (1000 pés quadrados)	ABC	5,00 ab	5,00 ab	4,25 b
3	MBI 203 DF -1	227 (8)	g (onça)/92,9 m2 (1000 pés quadrados)	ABC	4,75 ab	3,00 c	3,50 bc
4	MBI 203 DF -2	57 (2)	g (onça)/92,9 m2 (1000 pés quadrados)	ABC	6,50 a	5,50 ab	4,25 b
5	MBI 203 DF -2	227 (8)	g (onça)/92,9 m2 (1000 pés quadrados)	ABC	5,25 ab	3,00 c	1,50 cd
8	Radiant	296 (10)	mL (onça líquida)/100 m2 (a - are)	AC	1,50 c	1,00 d	1,00 d

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Tabela 15. Porcentagem de controle. Porcentagem média de controle de insetos larvais de Delia radicum por tratamento, listado por data de avaliação

No de tratamento	Nome do tratamento	Taxa	Unidade da taxa	Código de aplicação	7 DA-C	14 DA-C	21 DA-C
1	Sem tratamento			ABC	0,00 c	0,00 d	0,00 d
2	MBI 203 DF -1	57 (2)	g (onça)/92,9 m2 (1000 pés quadrados)	ABC	13,04 bc	20,00 cd	34,62 c
3	MBI 203 DF -1	227 (8)	g(onça)/92,9 m2 (1000 pés quadrados)	ABC	17,39 bc	52,00 b	46,15 bc
4	MBI 203 DF -2	57 (2)	g (onça)/92,9 m2 (1000 pés quadrados)	ABC	0,00 c	12,00 cd	34,62 c
5	MBI 203 DF -2	227 (8)	g (onça)/92,9 m2 (1000 pés quadrados)	ABC	8,70 bc	52,00 b	76,92 ab
8	Radiant	296 (10)	mL (onça líquida)/100 m2 (a - are)	AC	73,91 a	84,00 a	84,62 a

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Exemplo 12: Eficácia de MBI-203 DF1 e MBI-203 DF2 para o controle de Drosophila suzukii (Drosophila de asa manchada (SWD)) em morango na estufa [000132] Este estudo foi conduzido para determinar a eficácia de MBI-203 DF1 e de MBI-203 DF2 para o controle de drosófila de asa manchada (SWD) em culturas de morango na estufa. Os tratamentos experimentais de MBI-203 DF1 e MBI-203 DF2 foram aplicados a taxas de 454 g (1 libra) /100 m² (a - are) e 1493 g (4 libras) /100 m² (a

- are) em parcelas replicadas. Os tratamentos foram comparados ao padrão comercial, Entrust® a uma taxa de 43 g (1,5 onças) /100 m² (a

- are). Todos os tratamentos foram combinados com o surfactante SILWET® L77 (Chemtura AgroSolutions, Inc.) a uma taxa de 0,05% v/v. Cada réplica de parcela continha um morangueiro que foi cercado para evitar a migração de populações de insetos.

[000133] Adultos alados SWD da terceira geração criada em laboratório foram soltos em cada transplante de morango cercado. As contagens de SWD adultos foi registrada antes da aplicação (contagem prévia), 4 dias depois da aplicação (DAA), 7 DAA e 11 DAA. O número de larvas de SWD por fruto foi registrado em 14 DAA, 21 DAA, 28 DAA e 35 DAA. A estatística foi analisada usando comparação das médias por ANOVA com teste LSD e α=0,05.

[000134] Após a primeira aplicação, os tratamentos com MBI-203 mostraram redução progressiva de adultos de drosófilas de asa manchada e uma resposta à taxa foi observada para os produtos DF1 e DF2. Embora não significativamente comparável ao ENTRUST®, (Dow AgroBioSciences) contendo espinosade como ingrediente ativo, MBI-203 DF2 a 1814 g (4 libras) /100 m² (a) reduziu significativamente as populações adultas em 25%, quando comparado ao UTC 7 dias após a primeira aplicação (DAA). Em 11 DAA, DF1 e DF2 a 1814 g (4 libras)/100 m² (a) reduziram as contagens de adultos em 44%, embora

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63/88 não significativamente diferente do UTC. Os dois produtos de MBI-203 exibiram resultados significativos para redução de contagens de larvas de SWD. Em todas as avaliações, DF2 a 1814 g (4 libras) /100 m² (a) reduziu significativamente o número de larvas por fruto em 71%, comparável ao ENTRUST® (Dow AgroBioSciences) contendo espinosade como ingrediente ativo, a 78%; além disso, em 21 DAA, as contagens de larvas foram controladas por todos os tratamentos com MBI-203 até 72%, e todos foram comparáveis ao ENTRUST® (Dow AgroBioSciences). Uma resposta à taxa foi observada para MBI-203 DF1 e para DF2 com respeito a contagens de larvas.

Resultados:

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Tabela 16. Número de moscas por tenda. Contagem média de adultos alados de Drosophila suzukii após serem soltos sobre plantas e aplicações por tratamento, listada por data de avaliação

No de tratamento	Nome do tratamento	Taxa	Unidade da taxa	Código de aplicação	Recontagem	4 DAA	7 DAA	11 DAA
1	Sem tratamento			ABC	25,00 a	23,25 a	16,00 ab	4,00 a
2	MBI-203 DF 1	4,54(1)	g/m2 (libra/a)	ABC	25,00 a	21,25 a	14,75 ab	2,75 a
	Silwet L77	0,05	% v/v	ABC
3	MBI-203 DF 1	18,14 (4)	g/m2 (libra/a)	ABC	25,00 a	19,75 a	13,50 ab	2,25 a
	Silwet L77	0,05	% v/v	ABC
4	MBI-203 DF 2	4,54 (1)	g/m2 (libra/a)	ABC	25,00 a	21,00 a	18,00 a	3,00 a
	Silwet L77	0,05	% v/v	ABC
5	MBI-203 DF 2	18,14 (4)	g/m2 (libra/a)	ABC	25,00 a	19,75 a	12,00 b	2,25 a
	Silwet L77	0,05	% v/v	ABC
6	Entrust	0,43 (1,5)	g/m2 (onça/a)	ABC	25,00 a	8,25 b	0,00 c	0,00 b
	Silwet L77	0,05	% v/v	ABC

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Tabela 17. Porcentagem de controle. Porcentagem média de controle de larvas de Drosophila suzukii por réplica de parcela, listado por data de avaliação

No de tratamento	Nome do tratamento	Taxa	Unidade da taxa	Código de aplicação	14 DAA	21 DAA	28 DAA	35 DAA
1	Sem tratamento			ABC	0,00 d	0,00 b	0,00 b	0,00 c
2	MBI-203 DF 1	4,54 (1)	g/m2 (libra/a)	ABC	41,52 c	54,22 a	42,83 ab	44,44 b
	Silwet L77	0,05	% v/v	ABC
3	MBI-203 DF 1	18,14 (4)	g/m2 (libra/a)	ABC	54,78 bc	67,85 a	88,11 a	100,00 a
	Silwet L77	0,05	% v/v	ABC
4	MBI-203 DF 2	4,54 (1)	g/m2 (libra/a)	ABC	52,97 bc	60,58 a	64,33 a	88,89 a
	Silwet L77	0,05	% v/v	ABC
5	MBI-203 DF 2	18,14 (4)	g/m2 (libra/a)	ABC	71,36 ab	72,16 a	88,11 a	100,00 a
	Silwet L77	0,05	% v/v	ABC
6	Entrust	0,43 (1,5)	g/m2 (onça/a)	ABC	78,12 a	69,19 a	100,00 a	100,00 a
	Silwet L77	0,05	% v/v	ABC

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66/88 [000135] Os achados podem ser resumidos como segue:

• Uma resposta à taxa foi observada para MBI-203 DF1 e DF2 quanto à redução de contagens de adultos e larvas de SWD • MBI-203 DF2 a 1814 g (4 libras) /100 m² (a - are) reduziu significativamente as populações adultas em 25% em 7 DAA • Por todo o estudo, DF2 a 1814 g (4 libras) /100 m² (a are) reduziu significativamente o número de larvas por fruto e foi comparável ao Entrust [000136] Embora não mostrasse muito efeito sobre a população adulta, a aplicação de ambos os produtos reduziu significativamente a população larval na geração seguinte.

Exemplo 13: Efeito repelente de MBI-203 contra afídeos [000137] A avaliação do efeito repelente de várias concentrações de MBI-203 para pulgões verdes do pêssego (GPA) foi realizada. Especificamente, três concentrações do tratamento de MBI-203 em água (1% v/v, 3% v/v e 10% v/v) foram avaliadas. A concentração de MBI-203 a 10% v/v foi usada como controle positivo e o tratamento apenas com dH2O como controle negativo. A cada solução de tratamento, foi adicionado TWEEN 20 0,01%.

[000138] Os bioensaios foram realizados tratando discos de folhas de pimenta com as respectivas concentrações de MBI-203 citadas acima. Os discos de folhas de pimenta (de pimenteiras de 3-4 semanas de idade) foram cortados em círculos com um cortador de biscoitos de 23 mm, selecionado uma parte planta da folha para assegurar que o disco de folhas pudesse ser pousado uniformemente plano na placa de ágar depois do tratamento com o composto. Uma solução de ágar 1% foi derretida por aquecimento e foi despejada na placa de Petri de 145 mm X 20 mm, suficientemente para cobrir a superfície inferior da placa para sustentar os discos de folha e manter a umidade. Foi permitido que o ágar solidificasse por resfriamento à

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67/88 temperatura ambiente.

[000139] O tratamento dos discos de folhas foi realizado despejando a solução de tratamento em uma placa de Petri de vidro. Com a solução na placa, os discos de folhas foram tratados por imersão, girando o disco suavemente para encharcar e recobrir completamente os discos de folha. O tratamento de discos de folhas por imersão foi executado durante 1 minuto. Os discos de folhas tratadas foram depois deixados secar, retirados da solução com fórceps e colocados na capela de laboratório por 10-15 minutos ou até que solução secasse completamente na superfície da folha. Uma vez secos os discos de folhas, 40 pL de água foram adicionados com pipeta ao ágar onde o disco de folhas será pousado. Os discos de folhas tratadas foram depois dispostos em posição equidistante um do outro, sobre a superfície molhada do ágar, colocando a face abaxial de cada disco para baixo. Cada disco foi pressionado gentilmente para ficar completamente plano no ágar, e 20 GPA adultos de 3-4 dias foram introduzidos ao centro do disco utilizando um pincel fino de pintura. As placas foram depois recobertas e fechadas com parafilme. A cobertura da placa de Petri foi perfurada com orifícios mínimos para aeração e evitar a condensação.

[000140] O teste foi realizado em três repetições. Os dados de repelência de adultos e ninfas foram determinados 24 horas após a exposição de adultos nas placas com os discos de folhas tratadas. O número de afídeos (adultos e ninfas) presentes em cada folha foi contado e os dados foram registrados e analisados.

Resultados [000141] MBI-203 é repelente para adultos e ninfas de GPA com 97 99% de repelência em diferentes concentrações de MBI-203 (Tabela 18). A Figura 6 mostra uma diferença estatística entre as concentrações do tratamento. MBI-203 em concentrações de 3% e 1%

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68/88 v/v obteve uma % média computada de repelência de 97% e 99%, respectivamente.

Tabela 18. Porcentagem (%) média de repelência de adultos e ninfas do pulgão verde do pêssego (GPA) em discos de folhas de pimenta tratadas com diferentes concentrações de MBI-203

T ratamento	% média de repelência
MBI-203 padrão 3% v/v	97
MBI-203 padrão 1% v/v	99
MBI-203 padrão 10% v/v	97

Exemplo 14: Aplicação de MBI-203 reduz a progênie de afídeos [000142] MBI-203 à concentração de 3% v/v foi testado para determinar o efeito do composto sobre a produção de progênie de pulgões verdes do pêssego (GPA) adultos. Os bioensaios foram realizados tratando discos de folhas de pimenta com MBI-203 a 3% v/v. Discos de folhas de pimenta (de pimenteiros de 3-4 semanas de idade) foram cortados em círculos com um cortador de biscoitos de 23 mm, selecionando uma parte plana da folha para assegurar que o disco pudesse ser pousado uniformemente plano sobre a placa de ágar. Uma solução de ágar 1% foi derretida por aquecimento e 30 pL foram despejados em cada placa de Petri (Placas de Petri de poliestireno de 16 mm X 35 mm ventilada), suficiente apenas para cobrir o fundo da placa para sustentar os discos de folhas e manter a umidade. O ágar foi deixado que solidificasse por resfriamento à temperatura ambiente. O tratamento de discos de folhas foi realizado despejando a solução de tratamento em uma placa de Petri de vidro. Com a solução na placa, os discos de folhas foram tratados por imersão, girando suavemente o disco para encharcar e recobrir completamente os discos de folhas. O tratamento de discos de folhas por imersão foi executado durante 1 minuto. Os discos de folhas

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69/88 tratadas foram deixados secar por 10-15 minutos em capela de laboratório ou até que a solução tivesse secado completamente na superfície da folha. Cada disco de folha tratada foi pousado individualmente sobre a placa de ágar, colocando a face abaxial do disco de folha para baixo sobre o ágar molhado, e pressionado gentilmente para ficar plano no ágar. Em cada placa com o disco de folha tratada (tratamento), 6 GPA adultos (3 - 4 dias de idade) foram introduzidos. As placas com afídeos adultos foram depois cobertas com parafilme. As coberturas de parafilme foram perfuradas com orifícios mínimos para aeração e evitar a condensação. As placas foram incubadas à temperatura ambiente. A progênie (ninfas de instar inicial) foram contadas 3 dias após a exposição de adultos aos discos de folhas tratadas. O experimento foi realizado em 3 réplicas, e o experimento completo foi repetido 5 vezes.

[000143] A Figura 7 mostra que o MBI-203 afetou significativamente a produção de progênie de GPA adultos 3 dias após a exposição a discos de folhas tratadas. O gráfico na figura representa o resultado dos cinco estudos conduzidos, e a redução observada em progênie de GPA adultos foi acima de 50% quando comparada ao controle negativo (tratamento somente com água) e o seu desempenho é comparável ao controle positivo (Avid 10%), mostrando-se estatisticamente igual em produção de progênie. Quando o número de produção de progênie foi testado em comparação com o produto formulado DF2, não houve diferença estatística entre MBI-203 padrão e DF2 à concentração de 3% v/v (Figura 8). Uma redução de progênie (ninfas) de mais de 90% foi exibida em tratamentos com MBI-203 e DF2 em comparação ao controle negativo, que mostraram ser significativamente melhores do que Avid à concentração de 10% v/v (controle positivo).

Exemplo 15: Extração de violaceína e ácido oligo-(p-hidroxibutírico) de

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70/88

Chromobacterium substugae [000144] O procedimento seguinte foi usado para a purificação de compostos extraídos da cultura de Chromobacterium substugae: [000145] O caldo de cultura completo (WCB) derivado de 20 litros de fermentação de C. substugae em caldo L foi extraído pelo método de extração líquido-líquido utilizando acetato de etila. A camada de acetato de etila foi separada e seca a vácuo utilizando evaporador rotativo para fornecer o extrato bruto. O extrato bruto foi depois fracionado utilizando um solvente diferente como diclorometano (DCM), acetato de etila (EA), metanol (MeOH) e lavando com uma mistura de solvente (WASH). Essas frações foram depois concentradas até a secagem complete utilizando evaporador rotativo, e os resíduos secos resultantes foram rastreados quanto à atividade biológica utilizando pragas diferentes (insetos, nematoides). As frações ativas foram em seguida submetidas à cromatografia de exclusão por tamanho em Sephadex LH 20 (CH2WCH3OH; 50/50) para fornecer 10 frações (Figura 9). Estas frações foram então concentradas até a secagem completa utilizando evaporador rotativo, e os resíduos secos resultantes (frações) foram rastreados quanto à atividade biológica utilizando um ensaio de repelência de insetos com pulgões verdes do pêssego, de produção de progênie de pulgão verde do pêssego (GPA) e um bioensaio nematicida (M. incognita e/ou M. hapla). As frações ativas foram então submetidas à HPLC de fase reversa (Sistema Apectra P4000 (Thermo Scientific)) para fornecer compostos puros, os quais foram depois rastreados nos bioensaios citados acima para localizar/identificar os compostos ativos. Para confirmar a identidade do composto, dados espectroscópicos adicionais, tais como por LC/MS e RMN, foram registrados.

[000146] O potente composto repelente inseticida foi isolado das frações F8, F9 e F10 e foi identificado como violaceína (2). O

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71/88 composto ativo nematicida da principal fração DCM foi identificado como ácido oligo-(p-hidroxibutírico) (4).

Análise de compostos por espectroscopia de massa [000147] A análise por espectroscopia de massa de pico ativo foi realizada em um instrumento Thermo Finnigan LCQ Deca XP Plus de electrospray (ESI) utilizando modos positivos e negativos de ionização em modo de varredura completa (m/z 100-1500 Da) em um espectrômetro de massa LCQ DECA XP^plus (Thermo Electron Corp., San Jose, CA). Instrumento Thermo de cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC), equipado com detector Finnigan Surveyor PDA plus, autoamostrador plus, bomba MS e coluna Luna C18 5μ 100A de 4,6 mm x 100 mm (Phenomenex). O sistema de solventes consistia em água (solvente A) e acetonitrila (solvente B). A fase móvel inicia com solvente B a 10% e é linearmente aumentada para solvente B 100% durante 20 minutos e então mantida por 4 minutos e finalmente retornada para solvente B 10% durante 3 minutos e mantida por 3 minutos. A vazão é de 0,5 mL/minuto. O volume de injeção foi de 10 μL, e as amostras são mantidas à temperatura ambiente em um autoamostrador. Os compostos são analisados por LC-MS utilizando LC e cromatografia de fase reversa. A análise por espectroscopia de massa dos presentes compostos é realizada sob as seguintes condições: A vazão do gás nitrogênio foi fixada em 30 e 15 arb para a vazão do gás de bainha e a do auxiliar/varredura, respectivamente. A ionização por electrospray foi realizada com voltagem do spray definida a 5000 V e voltagem no capilar a 35,0 V. A temperatura no capilar foi definida em 400 °C. Os dados foram analisados no software Xcalibur. A análise do ácido oligo-(p-hidroxibutírico) (1) foi realizada utilizando o espectrômetro de massa LTQ Orbitrap XL híbrido com transformada de Fourier nas instalações de espectrometria de massa de UC Davis.

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72/88

Análise de compostos através de espectrometria por RMN [000148] Os espectros RMN-RMN foram medidos em um espectrômetro Bruker 600 MHz com gradiente de campo. A referência é definida no padrão interno tetrametilsilano (TMS; 0,00 ppm).

Purificação de compostos [000149] A fração de diclorometano (DCM) foi triturada com metanol e o sólido branco obtido foi separado por filtração para fornecer ácido oligo-(p-hidroxibutírico) (1).

Identificação de compostos

Ácido oligo-(e-hidroxibutírico) (1) [000150] O espectro de ¹H RMN do composto 4 exibiu sinais em δ 5,22 (sext), 2,62 (dd) e 2,53 (dd) com intensidades relativas de 1 próton cada. Além destes, um sinal metílico a δ 1,31 em dupleto foi também observado. O espectro de ¹³C RMN mostrou somente quarto sinais de carbono em δ 169,2; 67,6; 40,9 e 19,8. A análise detalhada de NRM em 1D e 2D resultou pra estrutura parcial de -(-O-CHCH3CH2-CO-)- com massa de fragmentos de 86. A análise por MALDITOF-ESI MS (Figura 2) deste composto exibiu padrão de sinais típicos como para uma mistura de oligômeros com massas molares de [(n x 86) + Na], correspondente ao produto que era uma mistura de ácido oligo-(p-hidroxibutírico) 1 com n = 10-25. Foi relatado que este composto era isolado de diversas bactérias (Singh et al., 2011;

Maskey et al., 2002; Hahn et al., 1995). A potência deste composto obtido da fração DCM foi confirmada em um ensaio in vitro utilizando

M. hapla que mostrou 75% de imobilidade (Figura 10).

Testes in vitro de frações e composto puro de Chromobacterium substugae [000151] As frações e compostos puros foram dissolvidos em dimetil sulfóxido (DMSO) e foram testadas em um bioensaio in vitro de placa de cultura celular plástica com 96 poços. Em torno de 15-20

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73/88 nematoides em 50 pL de uma solução com água foram expostos a 100 pL de uma amostra a 4 mg/mL durante um período de 24 horas a 25 °C. Uma vez concluído o período de incubação, os resultados foram registrados com base em classificação visual da imobilidade de nematoides juvenis (J2) em cada placa tratada com amostras; cada tratamento foi testado com quatro repetições em poço. Os resultados são mostrados na Figura 5 que apresenta os resultados de dois diferentes bioensaios em placas de 96 poços de frações de C. substugae e do composto 4. Três controles foram incluídos em cada estudo; 1 positivo (Avid 1%) e 2 negativos (DMSO e água). Os dois estudos (T1) e (T2) foram realizados utilizando nematoides M. hapla. Isolamento e identificação de compostos responsáveis por repelência [000152] As principais frações, tais como DCM, EA, MeOH e WASH, foram testadas quanto à atividade de repelência utilizando o bioensaio com o pulgão verde do pêssego (GPA) descrito detalhadamente abaixo. A repelência mais potente foi observada para as frações EA e MEOH. A análise por LCMS destas frações mostraram perfil químico semelhante, assim, considerando que o rendimento da fração MeOH foi mais alto do que na fração EA, o trabalho químico detalhado foi conduzido com a fração MeOH. A fração MeOH foi ainda separada por cromatografia de exclusão por tamanho em Sephadex LH 20 (CH2WCH3OH; 50/50) para fornecer 10 frações (Figura 9). A atividade mais potente foi observada nas frações F9 e F10. A purificação orientada pelo bioensaio destas frações, pela combinação de HPLC e Sephadex LH 20, forneceu violaceína como o composto responsável pela atividade de repelente. A violaceína foi também estudada em testes da progênie de afídeos.

Exemplo 16: Efeito repelente de frações de MBI-203 em pulgão verde do pêssego

Métodos

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74/88 [000153] Bioensaios de escolha em adultos do pulgão verde do pêssego (GPA) foram realizados com frações de MBI-203 e o composto puro. As frações e o composto puro (violaceína) obtidos da extração da pasta celular de C. substugae (MBI-203) foram testados quanto à eficácia contra insetos através de bioensaios de repelência. Discos de folhas de pimenta (de pimenteiros de 3-4 semanas de idade) foram cortados com um cortador de biscoitos de 23 mm, selecionando uma parte plana da folha para assegurar que o disco de folha pudesse ser pousado uniformemente plano na placa de ágar após o tratamento do composto. Ágar um porcento (%) em água foi preparado. A solução de ágar 1% foi derretida por aquecimento e despejada na placa de Petri de 145 mm X 20 mm, suficientemente para recobrir a superfície inferior da placa para sustentar os discos de folhas e manter a umidade. O ágar foi deixado que solidificasse por resfriamento à temperatura ambiente.

[000154] O tratamento de discos de folhas foi executado pela introdução gentilmente com pipeta de 100 pL de extrato de MBI-203 na face inferior do disco de folha. Os discos de folhas tratadas foram depois deixados secar completamente, pousando o disco plano sobre a cobertura marcada de uma placa de 12 poços. Uma vez secos os discos de folha, 40 pL de água foram adicionados com pipeta ao ágar onde o disco será pousado. Os discos de folhas tratadas foram depois dispostos em posição equidistante um do outro, sobre a superfície molhada, colocando a face abaxial de cada disco para baixo com a superfície tratada para cima. Cada disco foi pressionado gentilmente para ficar completamente plano no ágar. Após a colocação dos discos de folhas tratadas, 20 GPA adultos de 3-4 dias de idade foram introduzidos no centro do disco utilizando um pincel fino de pintura. As placas foram depois recobertas e fechadas com parafilme. As coberturas das placas de Petri foram perfuradas com orifícios mínimos

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75/88 para aeração e evitar a condensação.

[000155] Todos os testes foram executados em três réplicas. Para selecionar o solvente para os testes, o extrato bruto foi testado inicialmente com metanol e acetona como solvente. Esse teste mostrou que a acetona era melhor como solvente. Os testes subsequentes de amostras incluindo frações e composto puro (violaceína) foram conduzidos com acetona como solvente. Os dados para repelência de adultos e ninfas foram determinados 24 horas após a exposição de adultos em discos de folhas tratadas. O número de afídeos (adultos e ninfas) foi contado e os dados foram registrados e analisados. A porcentagem de repelência foi computada como:

% de repelência = 100-{([N+A] em folha tratada )/[N+A] em placa de Petri X100}, onde A representa adultos e N representa ninfas.

Resultados [000156] Os testes de repelência para frações de MBI-203 iniciaram com os extratos brutos. Os extratos brutos nos solventes metanol e acetona foram testados e a análise de resultados mostrou diferenças significativas conforme apresentadas na Figura 11. Discos de folhas tratadas com o extrato bruto de MBI-203 em caldo contendo os solventes, metanol e acetona, resultaram em uma diferença estatisticamente significante em resposta de decantação de ninfas e adultos do pulgão verde do pêssego do que aquelas do controle negativo. A Figura 11A e B mostraram um efeito repelente de MBI-203 sobre os afídeos. O solvente metanol, contudo, exibiu um efeito repelente sobre afídeos (Figura 11A), não mostrando diferença estatística com o extrato de MBI-203 e o controle positivo (Avid 10%). O solvente acetona demonstrou ser um bom solvente para o uso em frações, pois não exibiu repelência em ninfas e adultos de GPA, tendo o número médio de decantação de ninfas e adultos no disco de folha

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76/88 igual ao do controle negativo (Figura 11B).

[000157] As frações de MBI-203 exibiram uma forte repelência em ninfas e adultos de GPA. Foi observada diferença estatística entre médias de tratamento (Figura 12A e B). Materiais das frações EA e MeOH provocaram 100% de repelência em ninfas e adultos, enquanto o material Wash exibiu 94% de repelência, valor que não é estatisticamente diferente do controle positivo (MBI-203 10% v/v) (Tabela 19).

Tabela 19. Porcentagem média de repelência de amostras fracionadas de MBI-203

Material fracionado	% média de repelência
DCM	77,2
EA	100
203 10% (+ C)	98,9
Wash	94
MeOH	100
203 10% (+ C)	100

[000158] Além do mais, as 10 frações obtidas da fração MeOH foram testadas utilizando acetona como solvente; as amostras com o composto puro violaceína (F9, F10) mostraram alto efeito de repelência em adultos e ninfas de pulgão verde do pêssego (Tabela 20). Apenas 2 frações que não continham violaceína mostraram alto efeito de repelência (F2 e F3). As frações F9 e F10 foram purificadas mais e forneceram violaceína que apresentou 100% de repelência. Os dados revelaram que violaceína é o composto responsável por causar repelência a insetos sugadores. Parece que os materiais fracionados F6 - F10 continham violaceína, sendo que as frações F9 e F10 continham o composto puro violaceína.

Tabela 20. Porcentagem média de repelência de frações obtidas do

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77/88 fracionamento da fração MeOH (F1 - F10)

Material fracionado	% média de repelência
F1	81,5
F2	92,9
F3	95,6
F4	76,8
F5	84,3
F6	90,1
F7	96
F8	91,5
F9	100
F10	100

Exemplo 17: Violaceína reduz a progênie de afídeos [000159] Duas concentrações do composto puro violaceína em acetona, 0,5 pg/mL e 1,0 pg/mL, foram usadas no teste para determinar o efeito do composto sobre a produção de progênie de adultos de pulgão verde do pêssego (GPA). Os bioensaios foram realizados tratando discos de folhas de pimenta com as diferentes concentrações de violaceína em acetona. Discos de folhas de pimenta (de pimenteiros de 3-4 semanas de idade) foram cortados em discos com 23 mm de diâmetro, selecionando uma parte plana da folha para assegurar que o disco pudesse ser pousado uniformemente plano sobre a placa de ágar após o tratamento com o composto. Uma solução de ágar 1% foi preparada, derretida por aquecimento, e 30 pL foram despejados em placas de Petri (Placas de Petri de poliestireno de 16 mm X 35 mm ventiladas), apenas o suficiente para recobrir o fundo da placa para apoiar os discos de folhas e manter a umidade. O ágar foi deixado que solidificasse por resfriamento à temperatura ambiente. O tratamento com violaceína foi executado espalhando

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78/88 gentilmente 100 pL da solução de amostra sobre o disco de folha utilizando uma Pipetman de 200 pL. Os tratamentos foram configurados em triplicata. Os discos de folhas tratadas foram deixados secar na capela por 5-10 minutos. O controle positivo era Avid 10% v/v e o controle negativo era dH2O, acetona como o branco. Em placa de ágar solidificada, 20-30 pL de dH2O foram adicionados com pipeta ao ágar para manter a umidade. Cada disco de folha foi pousado individualmente sobre a placa de ágar, colocando a face abaxial do disco de folha para baixo sobre o ágar molhado, e pressionado gentilmente para ficar completamente plano no ágar. Em cada placa com disco de folha tratada (tratamento), 6 GPA adultos (3 4 dias de idade) foram introduzidos. As placas com afídeos adultos foram depois cobertas com parafilme. O parafilme de cobertura foi perfurado com orifícios para aeração e evitar a condensação, e foi mantido à temperatura ambiente. A progênie (ninfas de instar inicial) foi contada 3 dias depois da exposição de adultos aos discos de folhas tratadas. O experimento foi realizado em 3 réplicas, e o experimento complete foi repetido duas vezes.

[000160] Como mostrado na Figura 13, violaceína a 1,0 pg/mL reduziu significativamente a produção de progênie de afídeos adultos. Uma redução de aproximadamente 50% foi observada, quando comparado ao controle negativo (tratamento somente com água). O controle positivo (Avid 10%) apresentou o menor número de progênie, pois a maior parte dos adultos expostos morreu 3 dias após a exposição. Dois estudos foram realizados neste experimento, cada tratamento reproduzido três vezes. Os dois estudos forneceram resultados condizentes com a violaceína afetando significativamente a progênie.

Exemplo 18: Outros produtores de violaceína exibem repelência contra afídeos

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79/88 [000161] O efeito repelente de outras espécies de Chromobacterium sobre pulgões verdes do pêssego foi também avaliado. As espécies avaliadas de Chromobacterium são: Chromobacterium piscinae DSM 23278, C. pseudoviolaceum DSM 23279, C. haemolyticum DSM 19808 e C. aquaticum DSM 19852. Duas das espécies são produtoras de violaceína (C. piscinae e C. pseudoviol), enquanto para as outras duas, é documentado que não produzem violaceína. Os microrganismos foram cultivados em caldo LB a 26 °C e 100 rpm por 5 dias. No final da fermentação, os caldos foram colhidos e divididos em alíquotas para bioensaio. Concentrações do tratamento a 5% v/v em água foram testadas em GPA adultos. A concentração de MBI-203 a 10% v/v foi usada como controle positivo e o tratamento somente com dH2O como controle negativo. A cada solução de tratamento, foi adicionado TWEEN 20 0,01%.

[000162] Os bioensaios foram realizados tratando discos de folha de pimenta conforme previamente descrito. Cada disco tratado foi pressionado gentilmente para que ficassem completamente planos no ágar. Depois que os discos de folhas tratadas foram pousados, 20 adultos de GPA de 3-4 dias de vida foram introduzidos no centro do disco utilizando um pincel fino de pintura. As placas foram então cobertas e fechadas com parafilme. As coberturas das placas de Petri foram perfuradas com orifícios mínimos para aeração e evitar a condensação.

[000163] O teste foi realizado em três replicas. Os dados de repelência de adultos e ninfas foram determinados 24 horas após a exposição de adultos nas placas com discos de folhas tratadas. O número de afídeos (adultos e ninfas) estabelecidos em cada disco de folha foi contado e os dados foram registrados e analisados. A porcentagem de repelência foi calculada como segue:

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80/88 % de repelência =

100 ΓΛΗΑΊ, ^em folha tratada

7-^-----. bV+Λ] em placa de Petri em que N = número de ninfas e A = número de afídeos adultos [000164] Os resultados são mostrados nas Tabelas 21 e 22 e nas Figuras 14 e 15. Diversas espécies de Chromobacterium produtoras de violaceína mostraram repelência para adultos e ninfas de GPA com diferenças estatísticas entre os meios de tratamento. As espécies de Chromobacterium que produziam violaceína apresentaram % média de repelência de 75% (C. piscinae), 86% (C. pseudoviolaceum), enquanto as que não produziam violaceína (C. aquaticum and C. haemolyticum) não foram estatisticamente diferentes do controle sem tratamento (água). Uma leve tendência de repelência foi observada para as que não eram produtoras de violaceína.

Tabela 21. Porcentagem (%) média de repelência de adultos e ninfas do pulgão verde do pêssego (GPA), expostos a discos de folhas de pimenta que foram tratadas com diferentes espécies de Chromobacterium

T ratamento	% média de repelência
C. piscinae	75
C. pseudoviolaceum	86
MBI-203 padrão 10%	100

Tabela 22. Porcentagem (%) média de repelência de adultos e ninfas do pulgão verde do pêssego (GPA), expostos a discos de folhas de pimenta que foram tratadas com diferentes espécies de Chromobacterium

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81/88

T ratamento	% média de repelência
C. aquaticum	91,4
C. haemolyticum	67,3
MBI-203 padrão 10%	99
Exemplo 19: Comparação d	e estabilidade da formulação de

Chromobacterium com ou sem benzoato de sódio [000165] A Formulação 1 contém 32 partes de colheita celular concentrada de Chrombacterium, 62,5 partes de sobrenadante do caldo de fermentação de Chrombacterium, 1 parte de n-Hexanol, 0,5 partes de alginato de sódio, 2 partes de éster de sorbitano etoxilado e 3 partes de d-limoneno. Esses ingredientes da formulação foram escolhidos por sua funcionalidade em assegurar misturas uniformes e estáveis e são também preferidos por sua listagem na lista 4 da EPA dos Estados Unidos. Para um ingrediente estar presente na lista 4 da EPA, considera-se que seja de preocupação mínima em termos de efeito sobre o meio-ambiente e de toxicologia. A Formulação 2 contém 32 partes de colheita celular concentrada de Chrombacterium, 54,5 partes de de sobrenadante do caldo de fermentação de Chrombacterium, 1 parte de n-Hexanol, 0,5 partes de alginato de sódio, 2 partes de éster de sorbitano etoxilado e 10 partes de benzoato de sódio.

[000166] A Tabela 23 ilustra os resultados do armazenamento das Formulações 1 e 2 durante um período prolongado de tempo.

Tabela 23: Armazenamento das Formulações 1 e 2

Formulação	Observação visual Um dia	30 dias	120 dias
Formulação 1	Líquido de cor púrpura uniforme	Separação de camadas de cor marrom	Líquido marrom não uniforme acinzentado com

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		esbranquiçada na parte superior. Cor púrpura reduzida	crostas brancas no espaço vazio
Formulação 2	Líquido de cor púrpura uniforme	Líquido de cor púrpura uniforme	Líquido de cor púrpura uniforme

[000167] A Formulação 2 é mais estável do que a Formulação 1. Parece que sais solúveis em água do ácido benzoico estabilizam as composições biológicas pesticidas contra a separação física e a perda de atividade causada pela exposição à luz solar. Os íons de benzoato proporcionam propriedades de solvência e de equilíbrio dos eletrólitos de tal modo que a matriz biológica permanece uniforme, resultando em prazo de validade ampliado para a composição pesticida. Os íons de benzoato também permitem que o produto absorva a radiação UV quando este é aplicado a culturas no campo. A proteção UV prolonga a atividade inseticida por pelo menos diversos dias mais.

Exemplo 20: Efeito de benzoato de sódio sobre a mortalidade de pragas [000168] O produto final MBI-203 contendo a formulação com Chromobacterium substugae, d-limoneno, hexanol, propilenoglicol e parabeno (MBI-203 EP) combinado com carbonato de cálcio, benzoato de sódio ou com óxido de titânio foi colocado em placas de Petri de plástico e fechado com parafilme. As placas foram colocadas em área externa durante 7 horas na luz solar. Após exposição ao sol, o material foi trazido para dentro e diluído para concentrações de 1,5% e 3% v/v concentrações com água Millipore submetida à autoclavagem. O material foi colocado depois em dieta artificial, secado e alimentado a neonatos de lagarta falsa medideira da couve, Trichoplusia ni. A

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83/88 mortalidade foi classificada 3 e 4 dias após a infestação da dieta. Os resultados são mostrados na Tabela 24 and Figura 16.

Tabela 24: Efeito de benzoato de sódio sobre a mortalidade de pragas

Composição	Mortalidade (% de perda)
EP + CaCOs	~30% de perda
EP+ TiO2	~60% de perda
EP + Purshade	~25% de perda
EP + benzoato de Na	~10% de perda
EP somente	~30% de perda

Estudo nos brócolis [000169] Brócolis Packman de 4-5 semanas de idade foram pulverizados com diluições 3% v/v do produto final MBI-203 (formulação com d-limoneno) (MBI-203 EP) com e sem benzoato de sódio. Cada planta em um vaso de 9 polegadas quadradas (58 cm2) recebeu 500 pL de tratamento. Tween-20 a uma concentração final de 0,01% foi incluído em todas as amostras. Cinco afídeos adultos da couve, Brevicoryne brassicae, foram colocados em cada planta. As plantas e os insetos foram incubados em iluminação para o crescimento (75-85 °F (23,89-29,44 °C), 16h no claro/8h no escuro). Os afídeos vivos foram pontuados 3, 5 e 7 dias após a infestação. Pareceu que a formulação com benzoato de sódio proporcionou controle melhor do que o produto final isoladamente (Figura 17). Estudo no repolho roxo [000170] Diluições de 10% v/v do produto final MBI-203 (formulação com d-limoneno) (MBI-203 EP) com e sem benzoato de sódio foram pulverizadas sobre repolho roxo a taxas de tratamento de aproximadamente 30 galões/acre. Uma formulação testemunha (lote 2403-83-3) a 10% v/v foi também incluída no ensaio. Depois de secarem, as plantas foram infestadas com 10 afídeos da couve. O ensaio foi pontuado nos Dias 3, 6 e 8. A porcentagem de controle foi

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84/88 determinada aplicando a correção de Henderson-Tilton. Os resultados são mostrados na Figura 18. A formulação do produto final + benzoato de sódio obteve controle melhor de afídeos do que o produto final apenas ou a formulação testemunha apenas.

Exemplo 21: Comparação de benzoato de sódio e carbonato de cálcio [000171] O produto final MBI-203 não diluído (MBI-203 EP) com várias concentrações de benzoato de cálcio ou de carbonato de cálcio foi exposto à luz solar por 1 dia em placas de Petri de plástico fechadas. O material exposto ao sol e o não exposto foram depois diluídos para 3% v/v e aplicados à dieta artificial. Neonatos de lagarta falsa medideira da couve foram expostos à dieta e a mortalidade foi pontuada 4 dias após a infestação da dieta. Os resultados são mostrados na Figura 19. Concentrações de benzoato de sódio a 10% e 15% pareceram propiciar a menor degradação em atividade no preço mais econômico.

Exemplo 22: Efeito de sulfonato de lignina [000172] Células secas não diluídas em spray com vários aditivos foram despejadas em um frasco de plástico e expostas ao meioambiente por 4 dias, 4,44-18,33 °C (40-65 °F) , ensolarados com alguns dias de respingos. Amostras expostas e não expostas foram diluídas para 6% v/v e pulverizadas sobre plantas de brócolis Packman. As plantas secas foram infestadas com 5 afídeos imaturos de couve. Os afídeos foram pontuados 3 e 6 após a infestação. O controle foi determinado aplicando a correção de Henderson-Tilton. Células secas em spray com benzoato de cálcio apresentaram uma das mais altas eliminações no Dia 3 e mantiveram controle enquanto o ensaio prosseguiu até o Dia 6 (ver a Figura 20).

[000173] O produto final MBI-203 (formulação com d-limoneno) (MBI203 EP) foi misturado com várias concentrações de benzoato de sódio e sulfonato de lignina. Os tratamentos foram diluídos para

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85/88 concentrações de 10% v/v, adicionados com pipeta em placas de Petri de plástico e expostos à luz solar por 4 dias contínuos. As amostras foram depois testadas quanto à atividade da lagarta falsa medideira da couve pelo tratamento com dieta artificial. Os tratamentos com sulfonato de lignina tenderam a formar uma crosta em cima da dieta artificial. O produto final com somente benzoato de sódio pareceu ter a eliminação mais promissora antes e depois da exposição ao sol (ver as Figuras 21 e 22).

[000174] Em outro estudo, diluições de 10% v/v do produto final MBI203 (formulação com d-limoneno) com benzoato de sódio 10% e várias concentrações de sulfonato de lignina foi exposto à luz solar por 4 dias consecutivos em placas de Petri de plástico fechadas. Depois da exposição, brócolis Packman de 4 semanas de idade foram pulverizados com tratamentos a uma taxa de 30 galões/acre. Três larvas de lagarta falsa medideira da couve do segundo instar tardio foram colocadas em cada planta tratada e a mortalidade foi pontuada nos Dias 3 e 4 do ensaio. Das plantas no sol, a amostra com benzoato de sódio apenas apresentou o controle mais alto (ver a Figura 23).

[000175] Embora esta invenção tenha sido descrita com referência a concretizações específicas, os detalhes destas não deverão ser interpretados como limitações, pois é evidente que é possível utilizar vários equivalentes, alterações e modificações e ainda assim serem abrangidos pelo âmbito da presente invenção.

[000176] Várias referências são citadas por todo este relatório descritivo, cujos conteúdos são aqui incorporados, em sua totalidade, por referência neste pedido de patente.

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Claims (5)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Método para modular a infestação de uma praga, caracterizado pelo fato de que a praga é Acari em um local, que compreende a aplicação de uma quantidade de todo caldo celular, filtrado ou extrato coletado da fermentação de Chromobacterium subtsugae Nov (NRRL B-30655).
2. 2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o local é em uma planta, semente de planta ou no solo.
3. 3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a referida praga Acari é um ácaro.
4. 4. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido ácaro é um Tetranychus sp.
5. 5. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a Tetranychus sp é Tetranychus urticae.