TW201322925A

TW201322925A - 色杆菌之配方、成分、代謝物和使用方法

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Publication number: TW201322925A
Application number: TW101139259A
Authority: TW
Inventors: Ratnakar Asolkar; James Namnath; Pamela MARRONE
Original assignee: Marrone Bio Innovations Inc
Priority date: 2011-10-25
Filing date: 2012-10-24
Publication date: 2013-06-16
Also published as: AU2012327216B2; PL2770836T3; KR20140084235A; UY34413A; CN103997895B; EP2770836A4; MX363097B; ZA201401782B; HUE041589T2; EP2770836A1; CA2852531C; JP2014532645A; MX2014004887A; WO2013062977A1; CL2014001066A1; US20160128339A1; JP6199872B2; EP2770836B1; AU2012327216A1; CA2852531A1

Abstract

此具有穩定性的生物殺蟲劑含有色桿菌（Chromobacterium）的濾液、上清液、提取物或殺蟲活性成份，可藉由日光曝曬後，提供其抗降解的能力而維持物理均勻性來改善產品的保質期。

Description

色杆菌之配方、成分、代謝物和使用方法

本發明所述為色桿菌濾液、上清液和提取物的用途、成份或配方，原本作為殺蟎劑和殺蟲劑使用，具有殺蟲活性的化合物或其代謝物，特別是用於防治下列一種或多種的害蟲，如蜱蟎目、金龜子科、果蠅科、叉木蝨科、蜜蜂科、蠅科、花蠅科和擬步甲科等。本發明所述再包括有生物性殺蟲劑(也簡稱為生物殺蟲劑)的配方，尤其是含色桿菌濾液、上清液、提取物、代謝物或其衍生物中，具有殺蟲活性的化合物及其製造方法和防治害生物入侵的方法。更具體而言，本發明提供具有高穩定性的生物殺蟲劑特性，因為其均勻的物理特性具有更長的保存期限，因為對日光曝曬的高抗降解特性，具有更耐久的使用後殺蟲活性。

使用微生物、植物和其他生物體所製成的天然產品，此微生物天然產物具有豐富多樣性的化學成份來源，並此天然產品在醫藥用途已有長久的歷史。雖然天然產品主要用於人體治療，其中超過50%的產品來自天然產品，只有11%的殺蟲劑是使用天然原料。然而，天然原料製成的殺蟲劑，在傳統和有機農場的蟲害控制上舉足輕重。微生物(細菌、放線菌和真菌)的次級代謝物提供新的化學成份，可將已知的成份進行單方或複方使用，以有效控制蟲害並降低耐藥性增強的可能風險。關於微生物天然產品在農業殺蟲劑上的成功應用，有幾個著名的例子(Thompson et al.,2000；Arena et al.,1995；Krieg et al.1983)。

微生物殺蟲劑的開發始於尾隨純培養物的析離，然後藉由體外、體內、溫室或農地的實驗，進行其療效和應用範圍的篩選，同時進行微生物製造成份的析離和鑑定，關於微生物殺蟲劑的商品化，可藉由工業發酵的方法大量而經濟地製造微生物，進行生物相容性的配方處理，添加經核可的添加物來增加藥效，將應用便利性和農地條件下的儲存穩定性最大化。

色桿菌

在2000年，Martin博士及其同事在USDA自馬里蘭州的農地土壤中，析離出某種紫色的細菌(Martin et al.,2007a)，在最初的篩選中，他們發現這種細菌對科羅拉多州的馬鈴薯甲蟲等害蟲具有毒性(Martin et al.,2007b)，此種運動型細菌屬革蘭氏染色陰性，被界定為新種的色桿菌，即色桿菌(Chromobacterium)substsugae sp.nov(Martin et al.,2007c)，它兼有嗜氧和運動性，屬革蘭陰性的beta-proteobacterium而具有極生鞭毛，使用L-瓊脂與5℃下持續培養2-3天的菌落最初呈現奶油色，在接下來的24小時逐漸被稱為暗紫色。PRAA4-1的菌落在蛋白腖培養基中，於25℃、pH值6.5~8.0和0-1.5%(w/v)氯化鈉的條件下生長情況良好(Martin et al.,2007a)。

因為Martin及其同事所發現的C.substugae中，至少析離出3個色桿菌新種，Young等人(2008)也自台灣的泉水樣本析離出新的色桿菌種C.aquaticum，Kampfer等人(2009)也自馬來西亞的環境中析離出兩個新菌種，即C.piscinae和C.pseudoviolaceum。

在所有來自土壤和水源的已知色桿菌種中，C.violaceum屬革蘭氏陰性。關於色桿菌生成次級代謝物已發佈的研究論文中，僅限於C.violaceum的菌種(參見實例如Durán和Menck(2001)關於C.violaceum菌種在藥理和工業應用上的全面性探討)。此菌種通常被認為對人類不具有致病性，但屬可能致病的病原體，在人體和動物體中，偶爾變成為敗血症的病原體，而導致敗血症和致命的感染。C.violaceum已知可生成某種紫色成份即紫色桿菌素，出現氧氣的情況下，可融合兩個L-色氨酸分子而形成1個雙吲哚分子(Hoshino et al.,1987；Ryan和Drennan；2009)。紫色桿菌素生物合成可藉由群體感應來調節，為革蘭氏陽性菌中1個調節各種次生代謝物途徑的共同機制(McClean et al.,1997)。

Durán和Menck(2001)所摘要列舉的C.violaceum代謝物包括氰化氫、FERRIOXAMINE E、B-內酰胺糖肽SQ28 504和SQ28 546、抗生素如氣花青素、aerocavin、3,6-二羥基-indoxazene、monobactam SB-26.180和抗腫瘤的縮酚酸肽FR901228。根據Durán和Menck(2001)的研究，C.violaceum也製造不尋常的糖化合物如胞外多醣和脂多醣的成份。

美國專利申請案US20120100236也揭露可得自色桿菌種的化合物成份，更具體來說為色桿菌(Chromobacterium)substugae的色桿菌種。

蟎蟲和殺蟎劑

二斑葉蟎屬葉蟎科，紅蜘蛛也許是觀賞植物中最重要的害蟲，在溫室和農地作物中，有180餘個品種造成相當大的損害，這些蟎蟲也就是最難以防治的節肢動物害蟲，可快速養成抗藥性(Stamps和Osborne 2009,Osborne,Ehler和Nechols,1999)。

殺蟎劑屬具有殺滅蟎蟲(殺蟎劑)和蜱蟲(殺蜱劑)的毒性，此類的殺蟲劑種類繁多，包括有抗生素、氨基甲酸酯類、甲脒殺蟎劑、擬除蟲菊酯類、蟎蟲生長調節劑和有機磷殺蟎劑。除了化學殺蟲劑外，矽藻土和脂肪酸也可用於防治蟎蟲，通常可破壞蟎蟲的角質層讓其乾死。此外，某些精油如薄荷油也可用於防治蟎蟲，儘管已有種類繁多的殺蟎劑化合物，因為對作物造成的損害，在農業上，蟎蟲危害仍屬嚴重的問題。在一個季節中蟎蟲可繁衍數代，快速養成對殺蟎劑產品的抗藥性，因此，急需具有新用途和新方法的殺蟲劑產品。

家蠅

舍蠅(家蠅)是蠅科成員，此科被視為國內及國外在全球各地經濟上的問題，其他蠅科的成員包括面蠅，厩螫蠅和角蠅，被認為害蟲是人類和動物的病媒蟲。此蟲習慣以垃圾、糞便和人類的食物為食，成為致病微生物的最佳傳染病媒蟲，此病媒蟲藉由開放性的傷口成為動物傳染性疾病的害蟲。

以植物為食的果蠅-斑翼果蠅

斑翼果蠅是美國地區果蔬種植區的新入侵者，其破壞性較眾所週知的黑腹果蠅和其他的果蠅危害更甚，因為D.suzukii以破壞完整的果蔬為食，而其他的果蠅只以腐爛的植物為食。

根蛆

根蛆屬花蠅科，以不同植物的根為食，大白菜的根蛆危害捲心菜、菜花、西蘭花和孢子甘藍等(此類的蔬菜也稱為「油菜作物」)，不同種類的根蛆也危害胡蘿蔔、洋蔥、蔬菜和其他作物，因為油菜作物屬冷季型蔬菜，白菜根蛆在美國北方危害更甚，而難以防治，因為其孵化和餵食行為都發生在土壤下，所以當你發現到葉子發育不良或枯萎時，才知道他們的存在。

桃蚜

Myzus persicae(桃蚜)屬常蚜科(見US20110054022)，由其俗名得知，桃蚜是各種果蔬和觀賞植物的害蟲並偏佈全球，這些害蟲危害更甚，因為不只藉由取食韌皮部而造成直接的損害，也是李痘病毒的潛在宿主，這是李樹痘病的病媒而導致果實變形和變色。因此，感染株需連根拔起，目前正藉由各種殺蟲劑來防治這些害蟲，但這些害蟲常養成抗藥性。

馬鈴薯木蝨

Bactericera cockerelli(馬鈴薯木蝨)屬叉木蝨科，是斑馬紋病的病原體，藉由革蘭氏陰性菌來感染。雖然原產於北美洲，已在紐西蘭發現到此物種(www.biosecurity.govt.nz/files/pests/potato-tomato-psyllid/psyillid-factsheet.pdf)，馬鈴薯木蝨通常生長於茄科宿主(如番茄和馬鈴薯)中，但也可在其他植物如辣椒、茄子、紅薯、波羅蜜、樹番茄和曼陀羅中發現到。

枯葉甲蟲

Alphitobius diaperinus是危害家禽業極為嚴重的害蟲屬擬步甲科，據報Bt菌株PS86B1對擬步行蟲具有防治活性(美國專利5,100,665 Hickle等)，Bt tenebrionis對此甲蟲的幼蟲可能也有防治活性(美國專利5,244,660)，枯葉甲蟲和其他某些鞘翅目為原生動物、細菌和病毒性傳染病的宿主，對雞和火雞飼養業造成重大的經濟損失。枯葉甲蟲屬致病性沙門氏菌的重要病貓，包括許多的病媒種如S.enterica serotype enteritidis。此問題就是感染有病原微生物如沙門氏菌的家禽，危害人體健康，這些甲蟲棲息於垃圾、木材、發泡塑膠、玻璃纖維、和雞舍的聚苯乙烯保溫板中，其幼蟲和成蟲也會在鳥糞和雞飼料的穀物中滋生，這些大甲蟲的族群及其不同的棲息地均在雞舍內，而難以根除其身上攜帶的沙門氏菌。在落葉甲蟲為患甚劇時，或在新雞群建立前，不頻繁翻動垃圾也不沾染化學殺蟲劑，即可提供完全有效的蟲害防治。

蠐螬和甲蟲

蠐螬如白色蠐螬(Cyclocephala lurida)、南方隱金龜子(Rhizotrogus majalis)、日本甲蟲的幼蟲(Popillia japonica)、黑色蛀象鼻蟲的幼蟲(Otiorhynchus sulcatus)、東方甲蟲的幼蟲(Anomala orientalis)、金龜科成員，已發現到會侵擾草地和牧場。也已已發現聖甲蟲的成蟲會侵擾世界各地的觀賞植物及眾多的作物，目前已嘗試使用過各種的殺蟲劑，包括化學殺蟲劑、殺線蟲劑(如參加美國專利7641573)、蘇雲金芽孢桿菌(參見美國專利5185158)、費洛蒙和天然驅蟲劑如薄荷和韭菜等。

聚羥基脂肪酸酯(PHAs)

生物塑料即定義為自再生資源所合成的塑膠，如植物澱粉和微生物等。生物塑料由一種叫做聚羥基脂肪酸酯(PHA)的成份所製成，PHA家族包括幾種聚合酯，如聚羥基丁酸鹽、聚羥基丁酸酯、聚羥基丁酸鹽、共羥基戊酸乙酯(PHBV)、聚羥基丁酸酯共羥基己酸酯(PHBHx)和聚羥基丁酸酯、共co-hydroxyoctonoate(PHBO)等，聚3-羥基丁酸(PHB)是最常見的天然微生物PHA成份，聚羥基脂肪酸酯是100%可生物降解的聚合物，含各種羥基烷酸酯(HAS)，由無數微生物所合成，作為基質失恒條件下的能量儲備物質，各種合成的熱塑性塑膠塑具有類似的特性，如聚丙烯等，也可在有氧條件下，全部降解為水和二氧化碳，並在厭氧條件下，藉由土壤、湖水、污水和海水中的微生物降解為甲烷。目前開發中的可生物降解塑膠，包括有聚羥基鏈烷酸酯(PHA)、聚乳酸、脂肪族聚酯、多醣和這些物質的共聚物和/或共混物。

根據鏈中的碳原子數，PHA可分為兩類：短鏈(SCL)含3-5個碳原子以及中鏈(MCL)含6-14個碳原子(Khanna S,Srivastava AK.2005)，這些差異主要是因為PHA合成酶的基質特性，一定範圍內可容納3HAS的碳鏈長度。其他眾所週知的PHASCL屬共聚物和聚(3-羥基丁酸酯-共-3-羥基戊酸酯)聚(3HB-共-3HV)的物質，含4和5個活性碳原子的單體單元。這些單體單元的比例各有變化，而影響到聚合物的物理特性，如如增加3HV的單位可降低脆度。

在某些微生物的物種中，在碳存量過多而氮來源有限的情況下，即會導致PHA的累積。PHA的成份用於因應壓力下的環境，作為儲存能量的分子以備不時之需(Solaiman和Ashby,2005)。塑膠聚合物塑料在這些生物體的細胞內聚積成為光折射的非晶體儲存物(Mukhopadhyay et al.,2005)，PHB藉由3個酶促步驟自乙酰-CoA進行合成步(Krans et al.,1997)，從生物技術的角度來看，可生物降解的生物塑膠特徵可讓其成為污染環境石化塑膠的替代品(Lee,1996)，大量增加生物塑膠的生產可大幅降低二氧化碳的排放量，削減塑膠廢物的產生，並減低化石燃料的消耗量。

PHA可藉由下列3種方法取得：微生物的生物合成、轉基因植物的光合作用和使用適當的酶進行體外的生物合成(如參見美國專利7455999，WO9914313)。在大多數的細菌中，細胞可在伸展有限的基質，如氮、磷或氧中來合成PHA。

累積的PHA在生物飢餓時，可作為碳源和能源使用，PHA也作為降低功耗的裝置，因此而被視為細胞內的氧化還原調節器。PHA也可作為立體調節的化合物，可作為光活性合成化合物的前體，此類的化合物特別作為可長期使用的藥劑、激素、殺蟲劑和除草劑(Reddy 2003)的可生物降解載劑成份，也可在骨板、手術縫合線和更換血管中，因為具有壓電特性而作為刺激骨骼生長的骨質合成物(Schaefer et al.,2000)，此外，已有許多公開的共聚物生成方法指出，可使用不同的菌種如鹼桿菌NCIMB 40124(EP.0431883A2)何美國專利7455999成份物，進行生物成份的製造。EP No.2236089A1中揭露這些聚合物用於植入物的整形和軟組織固定的裝置，WO 91/00917A1揭露的方法，可在特別是植物的原核和真核細胞中，藉由聚羥基丁酸酯(PHB)和聚羥基鏈烷酸酯(PHA)的遺傳學和酶學原理，來控制和修改新的聚酯生物聚合物。WO 2005/030482A1揭露的方法和用途，可用於堆肥的包裝材料上，WO2008/110541揭露的聚羥丁酸具有抗熱降解的穩定特性。

木質素

木質素是高等植物木質結構的主要成份，加工取得的木質素為木材製漿的副產物，例如，木質素的產品包括有木質素磺酸鹽、鹼質素和氧木質素，這些成份可自亞硫酸鹽、硫酸鹽和鹼廢液中取得(Snook,1982,Handbook for Pulp & Paper Technologists,TAPPI,Atlanta)。

目前已發現到木質素有多種商業用途，如鹼可溶性的木質素可作為分散劑來使用。美國專利3726850中揭露鹼溶性臭氧處理過的木質素產品，其相關的用途，此物質基本上不含有機結合鍵結的硫，作為粘土、染料、殺蟲劑、石墨和其他材料的分散劑來使用。美國專利4666522中揭露木質素磺酸產品可用於製備蠟、油、脂肪、瀝青及其混合物的乳液產品。據報導木質素乙酸的相關應用，如作為水基油墨組合物的粘合劑(如參見美國專利4612051)，美國專利5668183中揭露木質素磺酸鹽產品可分散脂溶性物質，此外，已揭露有含木質素的殺蟲劑複合物(如參見美國專利3813236、美國專利3929453重新發佈為美國專利29,238、美國專利4381194、美國專利20110015237、美國專利申請案2010136132、美國專利申請案20100278890、美國專利申請案20080113920、美國專利申請案2006247130、美國專利申請案7867507、WO2003/005816、美國專利5994266)。

苯甲酸鈉

苯甲酸鈉可用於不同的配方中，作為食物製品的抗菌成份，例如，美國專利6,599,514中揭露抗真菌的成份含有抗菌劑和食品添加物，對抗菌成份的活性具有協同效應。在美國專利6599514中揭露的食品添加劑包括山梨酸、山梨酸鹽、苯甲酸、苯甲酸鹽、羥基苯甲酸鹽、二氧化硫和亞硫酸鹽、聯苯基及其衍生物、亞硝酸鹽、硝酸鹽、乳酸、乳酸鹽、檸檬酸和檸檬酸鹽、酒石酸酒石酸鹽、正磷酸和正磷酸鹽、蘋果酸鹽、己二酸、琥珀酸、1,4-heptonolactone、菸酸、檸檬酸三銨、檸檬酸鐵銨、乙二胺四乙酸二鈉鈣、甘油、2-、3-和多磷酸鹽、脂肪酸(E470)、單-和二甘油酯脂肪酸(E4 71)酯、單-和二甘油酯脂肪酸、碳酸鹽、葡糖酸鹽、氯(E92S)、六偏磷酸鈉、叔丁基、羥基苯甲醚(BHA)、丁基化羥基甲苯(BHT)(E321)、叔丁基對苯二酚(THBQ)、丙基沒食子兒茶素沒食子酸酯、葡庚糖酸鈣、植酸鈣、乙醚、乙二胺四乙酸二氫二鈉EDTA、乙酸乙酯、甘油單-、二-和三乙酸、甘氨酸、oxystearin、丙-1,2-二醇和丙烷-2-01和葡庚糖酸鈉。

苯甲酸鈉也用於殺蟲劑配方中，例如，SC Johnson的美國專利4668507中，將含有苯甲酸鈉的殺蟲劑放於鋼質加壓系統中，此系統主要用於抑制腐蝕。美國專利5620678中揭露某種的殺蟲劑配方，其中的苯甲酸鈉作為緩蝕劑使用。美國專利 4731379中揭露的殺蟲劑成份中，含有苯甲酸鈉作為動物殺蚤洗髮精。在該專利中，苯甲酸鈉的使用不是用於促進殺蟲劑的效果或穩定產品的化學性質，而是用於動物傷口的癒合治療。美國專利5017620中的殺蟲劑成份含苯甲酸鈉和其它已知的防腐劑成份，作為抗菌劑用於穩定儲存產品的化學性質。美國專利6841572中揭露某種水溶液，用於治療活的植物、作物、樹木和收穫前的水果、蔬菜、葉、莖、根和花，其pH值為4.0到6.5之間，基本上含有效濃度以上的殺真菌和/或殺菌，其一種或多種的防腐劑成份，而選自山梨酸、苯甲酸、乳酸、含苯甲酸的鈉、鉀、鈣和銨鹽成份，山梨酸、羥甲基氨基乙酸、乳酸和丙酸、甲基、乙基、丙基和buryl化合物，至少一種的陰離子表面活性劑和任選的酸化劑。

本發明提供的成份和方法，即用於控制和/或防治一種或多種的蜱蟎科(節肢動物)、蠅科、果蠅科、花蠅科、蚜科、叉木蝨科和擬步行蟲科(Tenebrionidae)的害蟲，含有或使用某種上清液、濾液和/或提取物，和/或一種或多種來自上述色桿菌種的上清液、濾液和/或提取物的成份，特別是含紫色桿菌素的菌株，包括但不限於色桿菌種中的色桿菌(Chromobacterium)piscinae、C.pseudoviolaceum和色桿菌(Chromobacterium)substugae，而更具體來說，為色桿菌(Chromobacterium)substugae sp.nov.新種，而更具體而言，此新種的色桿菌(Chromobacterium)substugae sp.nov.跟美國專利7,244,607中的NRRL B-30655具有相同的特性。

具體而言，本發明提供的成份和方法，即用於控制和/或防治一種或多種的蜱蟎科(節肢動物)、蠅科、果蠅科、花蠅科、蚜科、叉木蝨科和擬步行蟲科(Tenebrionidae)的害蟲，於特定部位(a)含有特定數量的上清液、濾液和/或提取物，和/或一種或多種來自上述色桿菌種的上清液、濾液和/或提取物的成份，和(b)另一種殺蟲劑物質，特別是殺蟎劑和/或殺蟲劑，可在特定位置中，有效防治蟎蟲和/或一種或多種屬於蠅科、果蠅科、花蠅科、蚜科、叉木蝨科、擬步行蟲科或金龜子科的害蟲。

在具體實例中，此種蜱蟎為葉蟎科的蟎蟲，在更為具體的實例中，此種蜱蟎為Tetranychus urticae。

在另一個具體實施例中，此害蟲是家蠅屬.、蚜屬.、洋葱线角个木虱、鞘翅類或麵包蟲屬、果蠅屬、地種蠅屬、圖棕色金龜子、豆金龜屬、金龜子屬或蛀象鼻虫。在更具體的實例中，此侵擾到蟲害為舍蠅(家蠅)、樱桃果蝇(斑翼果蠅)、甘藍地種蠅(大白菜根蛆)、桃蚜、Bactericera cockerelli(馬鈴薯木蝨)、Alphitobius diaperinusxi(甲蟲)、圓頭犀金龜屬(白色蠐螬)、歐洲切根鰓金龜(南方淫金龜子)、日本麗金龜(日本甲蟲)、蛀象鼻蟲(黑色蛀象鼻蟲)、東方異麗金龜(東方甲蟲)。

本發明提供的殺蟲劑活性成份，可防治至少一種的節肢動物和/或一種或多種屬於蜱蟎科、花蠅科、果蠅科、蠅科、蚜科、，叉木蝨科、擬步行蟲科或金龜子科的害蟲：(a)一種色桿菌種的上清液、濾液和/或提取物，和/或來自上述色桿菌種代謝物的上清液、濾液或提取物，和(b)另一種殺蟲物質，特別是殺蟎劑和/或殺蟲劑，可有效防治一種或多種屬於蜱蟎科、花蠅科、果蠅科、蠅科、蚜科、叉木蝨科、擬步行蟲科或金龜子科的害蟲，其中(a)和(b)可任選用於複合劑方中。此殺蟲物質可(a)取自微生物，(b)天然產物和/或(c)化學殺蟲劑和特定的化學殺蟲劑中。

在具體實例中，此代謝產物的化合物：(a)具有殺蟲活性；(b)液相色譜/質譜(LC/MS)測定的分子量約840-900，和(c)在反相C-18 HPLC柱析儀，使用水：乙腈(CH 3 CN)梯度溶劑系統(0-20分鐘90-0%CH₃CN水溶液、20至24分鐘100% CH₃CN、24-27分鐘0-90%CH₃CN水溶液、27-30分鐘CH₃CN水溶液)在0.5毫升/分鐘流速和UV檢測器波長210nm下，高壓液相色譜儀(HPLC)的保留時間約7-12分鐘，和(d)任選的色桿菌種，此具體實例中的成份可以是肽。

在特定的具體實例中，此化合物藉由13C NMR質譜測定下，含43個碳原子、7個甲基、10個亞甲基碳、12個甲烯、6個烯烴類甲烯和8個季碳。在更具體的實例中，此化合物分別為A、B、C和D，分別說明如圖##STR001##、##STR001a##、##STR001b##和##STR001c##。

在具體實例中，成份A：(a)取自色桿菌種色桿菌(Chromobacterium)species，(b)對害蟲具有毒性，(c)液相色譜/質譜(LC/MS)測定的分子量約840-890，更具體來說是860，(d)¹H NMR δ值為為8.89、8.44、8.24、8.23、7.96、7.63、6.66、5.42、5.36、5.31、5.10、4.13、4.07、4.05、3.96、3.95、3.88、3.77、3.73、3.51、3.44、3.17、2.40、2.27、2.11、2.08、2.03、2.01、1.97、1.95、1.90、1.81、1.68、1.63、1.57、1.53、1.48、1.43、1.35、1.24、1.07、1.02、0.96、0.89、0.88、0.87、0.80和has ¹³C NMR values of δ 173.62、172.92、172.25、172.17、171.66、171.28、170.45、132.13、130.04、129.98、129.69、129.69、125.48、98.05、70.11、69.75、68.30、68.25、64.34、60.94、54.54、52.82、49.72、48.57、45.68、40.38、39.90、38.18、36.60、31.98、31.62、31.58、29.53、28.83、27.78、24.41、23.06、22.09、20.56、19.31、18.78、17.66和15.80，(e)在反相C-18 HPLC柱析儀(Phenomenex,Luna 5μ C18(2)100 A,100 x 4.60 mm)，使用水：乙腈(CH₃CN)梯度溶劑系統(0-20分鐘90-0%CH₃CN水溶液、20至24分鐘100% CH₃CN、24-27分鐘0-90%CH₃CN水溶液、27-30分鐘90% CH₃CN水溶液)，在0.5毫升/分鐘流速和UV檢測器波長210nm下，高壓液相色譜儀(HPLC)的保留時間約7-12分鐘，更具體而言約9分鐘，更明確則是9.08分鐘。

在具體實例中，成份B具有下列特性：(a)取自色桿菌種色桿菌(Chromobacterium)species，(b)對害蟲具有毒性，(c)液相色譜/質譜(LC/MS)測定的分子量約850-900，更明確的是874，(d)在反相C-18 HPLC柱析儀(Phenomenex,Luna 5μ C18(2)100 A,100 x 4.60 mm)，使用水：乙腈(CH₃CN)梯度溶劑系統(0-20分鐘90-0%CH₃CN水溶液、20至24分鐘100% CH₃CN、24-27分鐘0-90%CH₃CN水溶液、27-30分鐘90% CH₃CN水溶液)，在0.5毫升/分鐘流速和UV檢測器波長210nm下，高壓液相色譜儀(HPLC)的保留時間約7-12分鐘，更具體而言約9分鐘，更明確則是9.54分鐘。

代謝物的成份包括但不限於：(A)含##STR001##結構的成份

或可接受的殺蟲鹽類，其中的R是-H，低鏈烷基含1、2、3、4、5、6、7、8或9個烷集團、芳基或芳基烷基團、低鏈取代烷基，X是O、NH、NR或S，n是0、1、2、3、4、5、6、7、8或9，R₁、R₂、R₃、R₄、R₅、R₆、R₇、R₈、R₉、R₁₀和R₁₁分別是獨立而相同或不同的H原子和氨基酸側鏈基團或側鏈的氨基酸衍生物、烷基、取代烷基、鏈烯基、取代鏈烯基、炔基、取代炔基、芳基、取代芳基、雜芳基、取代雜芳基、雜環基、取代雜環基、環烷基、取代環烷基、烷氧基、取代烷氧基、硫代烷基、取代硫代烷基、羥基、鹵素、氨基、酰氨基、羧基、-C(O)H、酰基、oxyacyl、氨基甲酸酯、磺酰基、磺酰胺或硫原子；(B)含##STR001a##結構的成份

其中的R是-H，低鏈烷基含1、2、3、4、5、6、7、8或9個烷集團、芳基或芳基烷基團、低鏈取代烷基，X是O、NH、NR或S，R_2a和R_2b是含-H、烷基、低鏈烷基、取代烷基和低鏈取代烷基，R₁、R₂、R₃、R₄、R₅、R₆、R₇、R₈、R₉、R₁₀、R₁₁分別是獨立而相同或不同的H原子和氨基酸側鏈基團或側鏈的氨基酸衍生物、烷基、取代烷基、鏈烯基、取代鏈烯基、炔基、取代炔基、芳基、取代芳基、雜芳基、取代雜芳基、雜環基、取代雜環基、環烷基、取代環烷基、烷氧基、取代烷氧基、硫代烷基、取代硫代烷基、羥基、鹵素、氨基、酰氨基、羧基、-C(O)H、酰基、oxyacyl、氨基甲酸酯、磺酰基、磺酰胺或硫原子；(C)含##STR001b##結構的成份

其中的R是-H，低鏈烷基含1、2、3、4、5、6、7、8或9個烷集團、芳基或芳基烷基團、低鏈取代烷基，X是O、NH、NR或S，R_2a和R_2b是含-H、烷基、低鏈烷基、取代烷基和低鏈取代烷基，R₁、R₂、R₃、R₄、R₅、R₆、R₇、R₈、R₉、R₁₀、R₁₁分別是獨立而相同或不同的H原子和氨基酸側鏈基團或側鏈的氨基酸衍生物、烷基、取代烷基、鏈烯基、取代鏈烯基、炔基、取代炔基、芳基、取代芳基、雜芳基、取代雜芳基、雜環基、取代雜環基、環烷基、取代環烷基、烷氧基、取代烷氧基、硫代烷基、取代硫代烷基、羥基、鹵素、氨基、酰氨基、羧基、-C(O)H、酰基、oxyacyl、氨基甲酸酯、磺酰基、磺酰胺或硫原子；(D)含##STR001c##結構的成份

其中的R是-H，低鏈烷基含1、2、3、4、5、6、7、8或9個烷集團、芳基或芳基烷基團、低鏈取代烷基，X是O、NH、NR或S，R_2a和R_2b是含-H、烷基、低鏈烷基、取代烷基和低鏈取代烷基，R₁、R₂、R₃、R₄、R₅、R₆、R₇、R₈、R₉、R₁₀、R₁₁分別是獨立而相同或不同的H原子和氨基酸側鏈基團或側鏈的氨基酸衍生物、烷基、取代烷基、鏈烯基、取代鏈烯基、炔基、取代炔基、芳基、取代芳基、雜芳基、取代雜芳基、雜環基、取代雜環基、環烷基、取代環烷基、烷氧基、取代烷氧基、硫代烷基、取代硫代烷基、羥基、鹵素、氨基、酰氨基、羧基、-C(O)H、酰基、oxyacyl、氨基甲酸酯、磺酰基、磺酰胺或硫原子；在更為具體的實例中，此代謝物是ChromamideA(1)。

在明確的具體實例中，此代謝物是成份C，具有下列特性：(a)取自色桿菌種色桿菌(Chromobacterium)species，(b)對一種或多種的害蟲具有毒性，(c)量測測定的分子量是325-360，更明確則約343，(d)在反相C-18 HPLC柱析儀(Phenomenex,Luna 5μ C18(2)100 A,100 x 4.60 mm)，使用水：乙腈(CH₃CN)梯度溶劑系統(0-20分鐘90-0%CH₃CN水溶液、20至24分鐘100% CH₃CN、24-27分鐘0-90%CH₃CN水溶液、27-30分鐘90% CH₃CN水溶液)，在0.5毫升/分鐘流速和UV檢測器波長210nm下，高壓液相色譜儀(HPLC)的保留時間約8-14分鐘，更具體而言約10分鐘，更明確則是10.88分鐘。在具體實例中，此成份C可為紫色桿菌素(2)為先前自色桿菌種色桿菌(Chromobacterium)violaceum析出的已知成份。

在另一個具體實例中，上述的成份和製作方法中使用有另一種代謝物D，具有下列特性：(a)取自色桿菌種色桿菌(Chromobacterium)，(b)對害蟲具有毒性，(c)液相色譜/質譜(LC/MS)測定的分子量約315-350，更具體而言約327，(d)在反相C-18 HPLC柱析儀(Phenomenex,Luna 5μ C18(2)100 A,100 x 4.60 mm)，使用水：乙腈(CH₃CN)梯度溶劑系統(0-20分鐘90-0%CH₃CN水溶液、20至24分鐘100% CH₃CN、24-27分鐘0-90%CH₃CN水溶液、27-30分鐘90% CH₃CN水溶液)，在0.5毫升/分鐘流速和UV檢測器波長210nm下，高壓液相色譜儀(HPLC)的保留時間約10-15分鐘，更具體而言約12分鐘，更明確則是12.69分鐘。在具體實例中，此成份D可為as deoxy紫色桿菌素(3)為先前自色桿菌種色桿菌(Chromobacterium)violaceum析出的已知成份。

在另一個具體實例中，此成份可具有下列的結構：

其中的R是-H，低鏈烷基含1、2、3、4、5、6、7、8或9個烷集團、芳基或芳基烷基團、低鏈取代烷基，R₁、R₂、R₃、R₄、R₅、R₆、R₇、R₈、R₉分別是獨立的H原子和相同或不同的烷基、取代烷基、鏈烯基、取代鏈烯基、炔基、取代炔基、芳基、取代芳基、雜芳基、取代雜芳基、雜環基、取代雜環基、環烷基、取代環烷基、烷氧基、取代烷氧基、硫代烷基、取代烷硫基、羥基、鹵素、氨基、酰氨基、羧基、-C(O)H、酰基，oxyacyl、氨基甲酸酯、磺酰基、磺酰胺或硫原子。

本發明再提供的方法，可用於(1)防治侵害植物害蟲(如土壤傳播的線蟲、昆蟲和細菌)，適用於植物、種子和/或用於植物栽培基質土壤，或用於防治土壤細菌的方法，適用於植物、種子和栽培用的基質土壤，

(I)其某種成份

(a)具有殺蟲和/或抗菌活性；(b)LTQ Orbitrap XL混合型傅立葉變換質譜儀測定的分子量約950-1450；(c)¹H NMR δ值為5.22(sext,1H)、2.62(dd,1H)、2.53(dd,1H)和1.31(d,3H)，(d)¹³C NMR δ值為169.2、67.6、40.9和19.8。

(d)具有-(-O-CHCH₃-CH₂-CO-)_n-的結構，其中n=6-50

(e)取自色桿菌種色桿菌(Chromobacterium)species，和(II)可任選其他對植物蟲害防治有效的殺蟲物質：

成份(I)可具有的結構：其中：X是獨立的-O、-NR或-S基團，R是H或C₁-C₁₀烷基，Y是獨立的-O和-S基團，n=6-50，R₁和R₂是各別獨立的H、烷基、取代烷基、鏈烯基、取代鏈烯基、炔基、取代炔基、芳基、取代芳基、雜芳基、取代雜芳基、雜環基、取代雜環基、環烷基、取代環烷基、烷氧基、取代烷氧基、硫代烷基、取代硫代烷基、羥基、鹵素、氨基、酰氨基、羧基、-C(O)H、酰基、oxyacyl、氨基甲酸酯、磺酰基、磺酰胺或硫原子。

尤其是成份(I)具有此類的結構：

其中n=10-25。

在最為具體的實例中，(I)為α-丁酸。

本發明再提供的方法，可用於取得上述的化合物，此方法含色桿菌種色桿菌(Chromobacterium)sp.的培養物放於全細胞液中，其條件足以生成化合物並可析離全細胞液中的化合物成份。

在本發明揭露的相關方法中，藉由可有效穩定日光曝曬物理解離和藥劑流失的成份，來控制穩定藥效成份的流失和物理解離，本發明也提供有此類的成份。在明確的具體實例中，此殺蟲劑成份含色桿菌色桿菌(Chromobacterium)sp.的濾液、培養上清液、提取物或取自上述物質而具有殺蟲活性的成份，其含量約0.5%，按照約30wt%的乾細胞重量約0.5wt%的重量，在具體實例中，此穩定劑可為苯甲酸鹽和/或木質素鹽類，特別是木素磺酸的鹽類，包括但不限於鈉、鉀、鈣、鎂、銨及其相關的成份，至少約2.5wt%(重量)，可優選約5%-15wt%的重量。

雖然以往的成份和方法容易出現有各種的修改和替代方式，本文中將詳細說明實例內容，然而，應瞭解到本文所揭露並未意圖限制任何應用形式，相反地，本文所指涵蓋所有的修改、同等或替用方法，仍無違本發明權利請求書的精神和範圍。

應瞭解到本文提供的數值，除非另有特別說明者，否則該數值位於上下單位十分之一的上下限值之間，任何其他的表示值或中間也在此範圍內，而更小的範圍也包括在內。這些更小範圍的上下限也在該範圍內，及其他以外的特定範圍內。

除非另有說明者，本文所用的所有技術和科學術語均具有相同的含義，為本技術領域中一般技術人員所能理解者。雖然尚有其他任何類似或等同本文所描述的方法和材料，也可用於本發明的實踐或測試中，本文所述為優選的方法和材料。

需注意到除非另有特別說明者，否則本文和本專利申請書所使用的單數形式也意指複數。

如本文所述，「取自」即意為直接自某個特定來源或自另一個具有相同特性的特定來源的物質或微生物所析離或取得。

本無所謂的「載劑」為某一種惰性的有機或無機物，混合或調配其活性成份而方便應用於植物或其他處理對象、或其儲存、運輸和/或處理中。

本文所謂的「防治」為改變侵擾害蟲的數量或擴散速率。

本文所謂的「害蟲侵擾」即害蟲出現的數量會導致嚴重損害，包括宿主感染疾病後，出現害蟲侵擾或生長系統中出現有不想要的雜草。

本文所謂的「殺蟲劑」為取自生物產物或化學物質的一種物質，看增加害蟲的死亡率或抑制害蟲的危害，包括但不限於殺線蟲劑、殺蟲劑、除草劑、植物殺真菌劑、植物殺菌劑和植物殺病毒劑。

本文所謂的「生物殺蟲劑」為一種具有殺蟲毒性的微生物。

製造方法

如上所述，此生物殺蟲劑可含有或取自跟色桿菌種色桿菌(Chromobacterium)具有相同特性的一種微生物，更具體地說，可取自一種具有跟色桿菌(Chromobacterium)substugae相同特性的微生物，更明確來說是取自一種色桿菌(Chromobacterium)substugae sp.nov.的菌株，nov.此菌株具有跟NRRL B-30655或任何其他微生物相同的特性，本發明提供的方法包括藉由對這些微生物培養液析離出的成份，而培養這些微生物並取得本發明中的成份。

尤其是，此微生物可在含有養分的培養基中，使用已知的工藝進行培養。這些微生物可在實驗室或使用工業用的發酵罐，放於適當的培養基在適合細胞生長的條件下，藉由搖晃培養瓶進行小規模或大規模的發酵培養(包括但不限於連續、分批、分批餵養或整體一併發酵的培養方法)。此培養過程的在適當的培養基中發生，這些培養基含碳、氮和無機鹽，藉由本領域中已知的步驟進行培養。適用的培養基可依據本文公佈的成份，市售或自行自備而取得。

經過培養後，本發明中的化合物和/或成份即可自培養液中取得，其提取物可藉由色譜法進行分餾。

成份

本文所揭露的成份和方法中，所使用的物質可藉由任何方法進行調配。配方不限的實例包括但不限於：可乳化的濃縮物(EC)、可濕性粉劑(WP)、可溶性液體(SL)、氣溶膠、超低體積的濃縮物溶液(ULV)、可溶性粉劑(SP)、微膠囊化、水分散顆粒劑(FL)、微乳劑(ME)和納米乳液(NE)等。本文所述任何的配方中，活性成份的百分比介於0.01%至99.99%範圍內。

此成份可為液體、凝膠或固體。液體成份含取自色桿菌色桿菌(Chromobacterium)的菌株中，例如此菌株具有跟新種色桿菌色桿菌(Chromobacterium)substugae nov.相同的特性，更，明確來說，是具有跟NRRL B-30655(見美國專利7,244,607)相同的特性。

此種固體成份可藉由殺蟲劑複合物溶液的固體載劑，於溫和條件下來進行懸浮的製備，如在室溫或65℃或更低的真空蒸發條件下。

此成份含取自色桿菌色桿菌(Chromobacterium)菌株中的凝膠封裝化合物，例如此凝膠包封物可藉由本發明的方法，於色桿菌的活性或非活性培養液，或色桿菌培養液、或懸浮液的無細胞濾液或細胞分餾液，或噴霧或冷凍乾燥培養液、或殺蟲劑化合物的細胞分餾液或濾液料的膠狀劑來進行製備。

此成份得再含有表面活性劑，用於乳化、分散、潤濕、擴散、整合、崩解控制、穩定活性成份和改進流動性或防銹。在特定實例中，表面活性劑屬無植物毒性的非離子型表面活性劑，優選自EPA Inerts List 4B。在另一個具體實例中，非離子型表面活性劑是聚氧乙烯(20)單月桂酸酯，表面活性劑的濃度介於配方總量的0.1-35%之間，優選範圍是5-25%。分散劑和乳化劑的選定，如非離子型、陰離子型、兩性表面活性劑和陽離子型分散劑和乳化劑，其用量依據本發明的成份特性和藥劑有助於擴散的能力而定。

如上文所述的成份也含有一種穩定劑，可穩定生物殺蟲劑的成份避免因為日光曝曬而動作物理解離和喪失活性，此穩定劑可以是苯甲酸鹽或木質素磺酸鹽。

上述的成份也可混合有另一種微生物和/或殺蟲劑(如殺線蟲劑、殺真菌劑、殺蟲劑、抗生素或抗菌劑)，此維生素包括但不限於取自芽孢桿菌、假單胞菌、短芽孢杆菌、蠟蚧輪枝菌.、非白粉寄生菌、二形性酵母菌、鍊黴菌、伯克霍爾德氏菌、木黴.和粘帚菌的微生物。或者此活性劑可以是天然油或油製產物，具有殺真菌和/或殺蟲活性(如石蠟油、茶樹油、香茅油、丁香油、肉桂油、柑橘油和迭香油)。此外，此殺蟲劑可為單點局部作用的抗真菌劑，包括但不限於苯並咪唑、脫甲基化抑製劑(DMI)(如咪唑、哌嗪、嘧啶和三唑)、嗎啉、羥基嘧啶、苯胺基嘧啶、硫代磷酸酯、醌外抑製劑、喹啉、二羧酰亞胺、甲酰亞胺、苯基酰胺、苯胺基嘧啶、苯基吡咯、芳香族烴、肉桂酸、羥基苯胺、抗生素、多氧黴素、acylamine、鄰苯二甲酰亞胺的苯環(xylylalanine)、咪唑、哌嗪、選自脫甲基化抑製劑和三唑的嘧啶(如雙苯三唑醇、腈菌唑、戊菌唑、丙環唑、三唑酮、糠菌唑、環唑醇、烯唑醇、腈苯唑、己唑醇、戊唑醇、氟醚唑、腈菌唑和抑製劑以外的醌(如甲氧基丙烯酸酯類)。甲氧基丙烯酸酯類包括但不限於嘧菌酯、甲醚菌酯或肟菌酯。在另一個具體實例中，此抗真菌劑是醌，如喹氧靈(5,7-二氯-4-喹啉基4-氟苯基醚)，此抗真菌劑也可取自虎杖的提取物。

殺真菌劑也可以是多點作用的非無機化學殺真菌劑成份，成份選自chloronitrile、喹喔啉、sulphamide、膦酸酯、亞磷酸酯、二硫代氨基甲酸鹽、chloralkythios、苯基吡啶胺、氰基-乙酰胺肟。

如上所述的此成份可再含有一種殺蟲劑，此殺蟲劑的成份包括但不限於阿維菌素、楝樹油、多殺菌素和伯克霍爾德氏菌，內容悉如美國專利2011-0207604，昆蟲病原真菌如球孢白殭菌和化學殺蟲劑的成份包括但不限於有機氯化合物、有機磷化合物、氨基甲酸酯類、擬除蟲菊酯類和新菸鹼類的殺蟲劑。

如上所述的此成份可再含有一種殺線蟲劑，此殺線蟲劑的成份包括但不限於阿維菌素和微生物產物如生物群落(堅強芽孢桿菌)、巴氏桿菌屬和如皂甙的有機物。

用途

上述的成份、培養液、上清液和殺蟲劑可作為殺蟲劑使用，尤其是上述的成份或化合物可作為殺蟲劑、殺菌劑(毒殺土壤中生長的細菌)和殺線蟲劑。尤其是其中的殺線蟲劑可藉由上述的方法進行蟲害防治，包括但不限於寄生線蟲，如導致根結、胞囊和病變的線蟲，包括但不限於根結線蟲屬。农田矮化線蟲，冠(矛)狀線蟲，螺旋線蟲，根腐菌，孢囊菌，黃金線蟲，毛刺線蟲屬，釘線蟲，劍線蟲屬和Criconema SP，尤其是根結線蟲，以及馬鈴薯胞囊線蟲、黃豆胞囊線蟲、甜菜胞囊線蟲和禾谷孢囊線蟲。

如上所述的活性成份也可應用於上述的蜱蟎亞綱(蛛形綱動物)中，如蟎蟲，包括但不限於葉蟎科如柑桔红蜘蛛和柑桔全爪蟎、葉蟎如神澤葉蟎、二斑葉蟎、太平洋紅蜘蛛、草莓葉蟎和硃砂葉蟎、枇杷全爪螨如Panonychus panicae(Avacado褐蟎)、Panonychus perseae(Persea蟎蟲)、Panonychus pratensis(Banks草蟎)和咖啡全爪蟎、蟎類如桃銀蟎、梅銹蜱和番茄赤褐色蟎、始葉蟎如瓦拉米特始葉蟎、尤馬紅蜘蛛和Eotetranychus sexmaculatis(斑蟎)、褐蟎、梨銹蜱、梨葉泡蜱、紅色漿果蟎、茶細蹣、柑橘芽蟎、柑橘平蟎、柑桔銹蜱、長腿蜘蛛、橄欖蟎、根蹣、粉蟎、胎膜梅蟎和冬季穀物蟎、牛油果紅蜘蛛、平蟎、黑色和紅色的芒果葉蟎，木瓜葉葉緣捲取蟎，德州柑橘蟎、歐洲紅蟎、，葡萄的毯蟎(泡蜱)、太平洋葉蟎、瓦拉米特蜘蛛蟎、粉紅色的柑桔銹蜱，此類的防治位置點包括但不限於受到蟎蟲或其他蛛形綱動物(如蚜蟲)侵擾的作物。

上述方法所防治的植物病原蟲包括但不限於來自下列各綱的非蚊幼蟲類，(a)鱗翅類如長翅卷蛾屬、褐帶卷蛾屬.、Aegeria spp.、切根蟲、棉樹葉蟲、Amylois spp.、黎豆夜蛾、黃卷蛾、Argyrotaenia spp.、ㄚ紋夜蛾、玉米茎蛀褐夜蛾、粉斑螟蛾、桃蛀果蛾、Chilo spp.、棕色卷蛾屬、葡萄果蠹蛾、水稻瘤野螟、Cnephasia spp.、Cochylis spp.、鞘蛾屬、大菜螟、蘋果異形小卷蛾、Cydia spp.、杆草螟属、蘇丹棉鈴蟲、瘤蛾屬、螟属、Eucosma spp.、女貞细卷蛾、黃毒蛾屬、Euxoa spp.、果實蛾、Hedya nubiferana、棉鈴蟲屬、菜心野螟蛾、美國白蛾、蕃茄莖麥蛾、旋紋潛蛾、Lithocollethis spp.、歐洲葡萄蛾、毒蛾屬、萊氏蛾屬、Malacosoma spp.、甘藍夜蛾、天蛾、尺蛾、玉米螟、Pammene spp.、Pandemis spp.、冬夜蛾、棉紅鈴蟲、馬鈴薯蠹蛾、紋白蝶、紋白蝶屬、小菜蛾、Prays spp.、螟蛾屬、Sesamia spp.、長須卷蛾属、夜蛾屬、興透翅蛾、Thaumetopoea spp.、蛾屬、金翅夜蛾和巢蛾屬；(b)細胸屬鞘翅目如叩頭蟲、麵包蟲.、青銅金龜如Anomala orientalis；棉鈴象甲、穀類蚜蟲、蚤凹脛跳甲、Cosmopolites spp.、栗實象蟲屬、圓頭犀金龜屬如Cyclocephala lurida、鰹節蟲屬、玉米根蟲、食植瓢蟲屬種、Eremnus spp.、馬鈴薯甲蟲、稻屬、金龜屬、Orycaephilus spp.、Otiorhynchus spp.、蛀象鼻蟲、Phlyctinus spp.、Popillia spp.如日本麗金龜、蚤屬、Rhizopertha spp.如歐洲切根鰓金龜、米象蟲、Sitotroga spp.、黃粉蟲屬、擬穀盜.和小紅鰹節蟲屬；(c)直翅目如Blatta spp.、蜚蠊屬、螻蛄屬、馬得拉蜚蠊、飛蝗屬，大蠊屬和Schistocerca spp.；(d)等翅目如散白蟻；(e)齧蟲目如書蝨科；(f)蝨亞目如吸血虱、Linognathus spp.、蝨屬、癭綿蚜屬和Phylloxera spp.；(g)食毛亞目如畜蝨屬和嚙毛虱屬；(h)纓翅目如花薊馬屬、Hercinotnrips spp.、Taeniothrips spp.、南黃薊馬、蔥薊馬和非洲柑桔薊馬；(i)半翅目如臭蟲屬、可可瘤盲蝽、棉紅蝽屬、Euchistus spp.、扁盾蝽屬、稻緣椿屬、蛛緣蝽屬、Piesma spp.、紅獵蝽屬、可可褐盲蝽、稻黑蝽和錐鼻蟲；(j)同翅目如捲毛粉蝨、菜粉虱、腎圓盾介殼蟲屬、常蚜科、豆蚜、Aspidiotus spp.、Bactericera spp.、煙草粉蝨、Ceroplaster spp.、Chrysomphalus aonidium盾蚧、橙褐圓盾介殼蟲、扁堅介殼蟲、棉花小綠葉蟬、對蘋果綿蚜、Erythroneura spp.葉蟬屬、Gascardia spp.、Laodelphax spp.、Lecanium corni、榆蠣盾介殼蟲、Macrosiphus spp.、蚜虫類、黑尾葉蟬、Nilaparvata spp.、Paratoria spp.、Pemphigus spp.、Planococcus spp.、Pseudaulacaspis spp.、粉蚧、木蝨屬、柑橘綿馬蹄蓮、Quadraspidiotus spp.、縊管蚜屬、硬介殼蟲、帶葉蟬、麥二叉蚜屬、Sitobion spp.、溫室白粉蝨、Triozidae spp.、南非柑橘木蝨和柑桔矢尖盾蚧；(k)膜翅目如頂切葉蟻屬、切葉蟻、麥莖蜂、松葉蜂、膜翅目松葉蜂科、松葉蜂、Hoplocampa spp.、蟻屬、法老蟻、Neodiprion spp.、Solenopsis spp.和膜翅目胡蜂屬；(l)雙翅目昆蟲如伊蚊屬、高梁芒蠅、毛蚋、Calliphora erythrocephala、地中海實蠅屬、麗蠅屬、黃狂蝇属、寡毛實蠅屬、Delia spp.、甘藍地種蠅、果蠅屬如櫻桃實蠅；廁蠅屬、馬胃蠅蛆及成蠅、采采蠅、牛皮蠅屬、蝨蠅屬、美洲斑潛蠅屬、綠頭蒼蠅、潛蠅、家蠅屬、Oestrus spp.、Orseolia spp.、黑麥桿蠅、菠菜潛葉蠅、Phorbia spp.、蘋果實蠅、菇蚋、Stomoxys spp.、虻屬、Tannia spp.和Tipula spp.；(m)Siphonaptera如Ceratophyllus spp.und Xenopsylla cheopis；(n)來自蜉蝣綱如蠹魚；(o)半翅目如木虱如馬鈴薯木蝨。此活性成份可用於出現有金龜害蟲的區域，包括但不限於土壤、草地和不同的觀賞植物、樹木和蔬菜。

上述的活性成份也可應用於出現有蠅科害蟲的區域，包括但不限於室內環境、垃圾、動物身上、圍籬、畜欄、穀倉、擠奶棚和動物育種欄等(牛、豬、羊、馬等)。

上述的活性成份可再適用於出現有擬步行蟲科的區域，包括但不限於穀物、家畜和家禽欄棚(圍欄，圍欄，穀倉，擠奶廳，產仔筆等)含有動物(牛，豬，羊，馬等)(圍籬、畜欄、穀倉、擠奶棚和動物育種欄等)和動物欄棚等(牛、豬、羊、馬等)。

實例

上述的成份不受限於下列的應用實例中，這些實例僅提供不同的具體事例，但不僅限於本發明專利請求列舉的相關物質、條件、重量比、製程參數和類似的內容等。

實例1：自色桿菌(Chromobacterium)substugae提取Chromamide、Deoxy紫色桿菌素和紫色桿菌素

下列步驟用於純化取自色桿菌(Chromobacterium)substugae培養液的化合物：

培養液取自10-L的C.Substugae的發酵培養液中，藉由 Amberlite XAD-7樹脂僅(Asolkar et al.,2006)以225rpm的轉動速度於室溫下持續搖晃懸浮液2小時而進行提取，樹脂和細胞塊使用棉布過濾，然後再使用蒸餾水洗去鹽份。樹脂、細胞塊和棉布在浸入丙酮/甲醇(50/50)中持續2小時，然後將丙酮/甲醇溶液濾出，於真空中使用轉動式的蒸發器乾燥並析出粗提取物，此粗提取物再使用Sephadex LH 20尺寸排阻色譜儀(CH₂Cl₂/CH₃OH；50/50)進行分餾，而析出7個分餾物(圖1)，這些分餾物再使用轉動式蒸發器乾燥濃縮，乾燥後的殘留物使用甘藍尺蠖夜蛾(Trichoplusia ni)或甜菜夜蛾的生物測定進行生物活性的篩檢，活性分餾物即可使用反相HPLC(Spectra System P4000(Thermo Scientific)析出純化合物，再藉由上述的生物測定進行篩檢而找出/辨識出活性化合物。要確認化合物時，可採用其他的質譜數據資料如LC/MS和NMR的紀錄值。

Chromamide A(1)和化合物B即分別取自分餾物1和2，紫色桿菌素(2)和deoxy紫色桿菌素(3)藉由Sephadex LH 20色譜儀自分餾物5進行純化。

化合物的純化

Chromamide A(1)的純化可藉由HPLC C-18柱析儀(Phenomenex,Luna 10u C18(2)100 A,250 x 10)來進行，使用水：乙腈(CH₃CN)梯度溶劑系統(0-10分鐘80-75% CH₃CN溶液、10至45分鐘75-60% CH₃CN溶液、45-55分鐘60-50% CH₃CN溶液、55-65分鐘50-100% CH₃CN溶液、65-70分鐘100% CH₃CN溶液、55-70分鐘0-80% CH₃CN溶液)，在2.5毫升/分鐘流速和UV檢測器波長210nm下檢測，活性成份化合物Chromamide A(1)的保留時間為23.19分鐘。

本發明化合物B的純化可藉由HPLC C-18柱析儀(Phenomenex,Luna 10u C18(2)100 A,250 x 10)，使用水：乙腈(CH₃CN)梯度溶劑系統(0-10分鐘80-75% CH₃CN溶液、10至45分鐘75-60% CH₃CN溶液、45-55分鐘60-50% CH₃CN溶液、55-65分鐘50-100% CH₃CN溶液、65-70分鐘 100% CH₃CN溶液、55-70分鐘0-80% CH₃CN溶液)，在2.5毫升/分鐘流速和UV檢測器波長210nm下檢測，活性成份化合物B的保留時間為26.39分鐘。

紫色桿菌素(2)和deoxy紫色桿菌素(3)的純化可藉由HPLC C-18柱析儀(Phenomenex,Luna 10u C18(2)100 A,250 x 10)，使用水：乙腈(CH₃CN)梯度溶劑系統(0-10分鐘70-60% CH₃CN溶液、10-40分鐘60-20% CH3CN溶液、40-60分鐘20-0% CH₃CN溶液、60-65分鐘100% CH₃CN、65-75分鐘0-70% CH₃CN溶液)，在2.5毫升/分鐘流速和UV檢測器波長210nm下檢測，活性成份化合物紫色桿菌素(2)的保留時間為7.86分鐘，而活性化合物deoxy紫色桿菌素(3)的保留時間為12.45分鐘。

化合物的質譜分析

活性峰值的質譜分析藉由Thermo Finnigan LCQ Deca XP Plus電噴灑儀器(ESI)，使用陽離子化和陰離子化模式，於LCQ DECA XP^plus質譜儀(Thermo Electron Corp.,San Jose,CA)進行權掃描(m/z 100-1500 Da)。高效液相色譜儀(HPLC)加裝有Finnigan Surveyor PDA偵測器、自動採樣器、MS幫浦和一個4.6 mm x 100 mm Luna C18 5μ 100A的柱析儀(Phenomenex)，此溶劑系統使用水(溶劑A)和乙腈(溶劑B)，流動相始於10%的溶劑B，經過20分鐘溶劑B線性增加到100%，然後持續4分鐘，最後經過3分鐘後溶劑B回到10%，流速為0.5 mL/min，注射量為10μL，而自動採樣器中的樣本放於室溫中。此化合物藉由LC-MS使用LC和反相質譜儀進行分析，本化合物的質譜分析條件如下：氮氣流速固定為30，而鞘氣流速和輔助器流速固定為15 arb。電噴灑離子化使用噴灑電壓5000V和毛細管電壓35.0V來進行，毛細管溫度設定為400℃，數據資料藉由Xcalibur軟體來分析。在陽離子化模式下的Chromamide A(1)分子量為860，另一個活性化合物B的LC-MS色譜顯示在陽離子化模式下的分子量為874，紫色桿菌素(2)和deoxy紫色桿菌素(3)的分子量分則別為313和327。

化合物的NMR核磁共振光譜分析

於Bruker 600 MHz梯度場光譜儀中，進行NMR核磁共振光譜分析，參考值設定為四甲基矽烷(TMS,0.00 ppm)的內部標準值，使用Hitachi 8800氨基酸分析儀進行氨基酸的分析。

關於結構鑒定，分子量860的純化Chromamide的進一步分析，可使用600 MHz NMR核磁共振光譜分析儀，其¹H NMR δ值為8.89、8.44、8.24、8.23、7.96、7.63、6.66、5.42、5.36、5.31、5.10、4.13、4.07、4.05、3.96、3.95、3.88、3.77、3.73、3.51、3.44、3.17、2.40、2.27、2.11、2.08、2.03、2.01、1.97、1.95、1.90、1.81、1.68、1.63、1.57、1.53、1.48、1.43、1.35、1.24、1.07、1.02、0.96、0.89、0.88、0.87、0.80(見圖4)，¹³C NMR δ值為73.62、172.92、172.25、172.17、171.66、171.28、170.45、132.13、130.04、129.98、129.69、129.69、125.48、98.05、70.11、69.75、68.30、68.25、64.34、60.94、54.54、52.82、49.72、48.57、45.68、40.38、39.90、38.18、36.60、31.98、31.62、31.58、29.53、28.83、27.78、24.41、23.06、22.09、20.56、19.31、18.78、17.66、15.80。Chromamide A經析出為白色固體，藉由ESI高解析度質譜儀(obsd M⁺ m/z 861.5376,calcd M⁺ m/z 861.5343)分析得到的分子式為C₄₃H₆₈N₆O₁₂(13個不飽和度)。Chromamide A在DMSO-d₆的¹H NMR的光譜數據資料中，顯示有68個質子信號[δ_H：8.89,8.44,8.23,8.22,7.96,7.64,6.65,5.10,4.13]，因為在異核NMR(HMQC)分析中缺乏關聯性，可識別為NH或OH。¹³C NMR光譜顯示出現有7個羰基信號[δ_C：173.62,172.92,172.25,1.72.17,171.66,171.28,170.45]，在¹H NMR光譜中出現有6個氨基質子信號[δ_H：4.07,4.06,3.96,3.95,3.88,3.72]，經觀察顯示Chromamide A是一種肽類物質。

2D NMR數據解讀顯示在6個氨基酸單位中有3個是由1個亮氨酸(Leu)、1個纈氨酸(Val)和1谷氨酰胺(Gln)所組成。可藉由氨基酸分析確認這些氨基酸的存在，也顯示出現有上述3個氨基酸。DEPT和2D NMR光譜數據(COSY、HSQC和HMBC)的進一步分析中，證明3種次結構I、II和III的存在。

在1中，3中次結構的關聯性可使用α-氨基質子和/或仲酰胺質子和羰基碳的共振和化學位移進行一般的HMBC NMR分析，次結構I中C-9跟次結構C-10的連結，可藉由HMBC自CH₃-40[δ_H：1.00]和丙氨酸α-氨基質子[δ_H：3.42]對C-10碳[δ_C：70.11]的關聯性而得到證明，此結果可再藉由t小時ee bond HMBC correlation from羥基[δ_H：5.10]跟C-9[δ_C：49.78]的3個鍵結HMBC的關聯性得證，次結構II中的亞甲基[δ_H：3.50]顯示對連結次結構I和II的C-19[δ_C：68.31]具有3個HMBC鍵結的關聯性。C-3[δ_C：98.09]的季碳藉由H-21[δ_H：3.95]及其化學位移的弱鍵結跟C-21[δ_C：64.40]連接而形成一個環狀系統。最後，此封閉環由H₃-36[δ_H：1.43]連結C-1[δ_C：172.17]的3個HMBC鍵結來固定，即可識別為Chromamide A(1)的平面結構。

化合物B的分子量為874，具有類似的NMR和UV數據，即表示此化合物B屬肽類物質。

紫色桿菌素(2)和deoxy紫色桿菌素(3)的結構可比較文獻的數據得出，Chromamide A、紫色桿菌素和deoxy紫色桿菌素的結構如圖2所示。

實例2：Chromamide A的氨基酸分析

Chromamide A(0.05mg)藉由液相水解(6N HCL，1%苯酚，110℃，真空處理24小時)進行水解，冷卻後，將反應混合物乾燥，並將水解產物稀釋於緩衝液中達1.0 mL的體積，將50μl的樣本溶放於離子交換柱上進行分析。

為能夠進行標準化的校準，將氨基酸標準液放於Hitachi 8800(Sigma,A-9906)的Na-基分析儀進行蛋白質水解物的分析，用於測定響應因子，藉此進行Hitachi 8800分析儀對所有氨基酸的校準。各個注射物含有正亮氨酸作為內部標準物，可進行樣本體積和層析變數的結果校正。系統採用Pickering鈉緩衝液、Pierce Sequanal級鹽酸(水解)、一個Transgenomic離子交換柱和加州大學戴維斯分校分子結構基金會(MSF)開發的優化方法，並記錄出現於樣本中的各別氨基酸成份。樣本中的氨基酸(Chromamide A)經發現是Glx(谷氨酰胺/谷氨酸)、亮氨酸(亮氨酸)和Val(纈氨酸)。

實例3：色桿菌(Chromobacterium)substugae(MBI-203)對豆科植物二斑葉螨的防治效果

冷凍乾燥的MBI-203混合有蒸餾水，讓全細胞培養液的當量達到不同的濃度，未侵染的豆可植物菜豆(Phaseolus vulgaris)使用MBI-203進行噴灑。然後自經過噴灑的植物取出葉片，放置在裝有二斑葉螨的培養皿中作為其食物來源，將10隻蟎蟲放在每個培養皿中，在75℉下保溫12：12(L：D)。在第1、3、7天後記錄蟎蟲的死活數量，將1個份量的CFD凍乾物放入濃縮的全細胞培養液中(0.0103克冷凍乾燥/毫升的蒸餾水)，其結果如圖3。

實例4：色桿菌(Chromobacterium)substugae(MBI-203)對金盞花二斑葉螨的防治效果

金盞花和萬壽菊受到二斑葉蟎的侵擾，使用配方產品(MBI-203)或土荊芥(市售產品名稱為REQUIEM®屬加州戴維斯AgraQuest公司出品)用於害蟲侵擾的植物中，溫室溫度的範圍約72-85℉，取樣時，即採取6平方厘米的葉面，並算出存活和死亡的幼蟲數，其結果如表1。

表1：MBI-203和REQUIEM®的比較

實例5：色桿菌(Chromobacterium)substugae(MBI-203)篩檢對四季豆(MBI-203)二斑葉螨(TSSM)的防治效果

受到TSSM的四季豆或對阿維菌素具有抗藥性的TSSM，噴灑0.5%、1%、2%和4% v/v的MBI-203稀釋配方，噴灑面積約100加侖/英畝，使用9天後觀察其死亡率，結果如表2。

實例6：篩檢MBI-203對草莓二斑葉螨的防治效果

有5種化合物和MBI-203的成份於佛羅里達州墨西哥灣研究教育中心進行草莓田TSSM的防治效果研究，將種苗移植到農田(第0天)中，各個12.5英尺的培養盆種有20株，培養盆自第55天到第77天中，各株受到10到20隻蟎蟲的侵擾共4次，使用殺蟎劑進行不同速率和排程的防治處理，某些混合有增效劑，並於RCB的設計中進行未經處理的檢測4次，防治處理使用手提式噴灑器以4碟式的噴嘴進行45度的噴灑，噴灑器使用CO₂加壓到40 psi，每英畝噴灑100加侖後進行校準。自第90天到最後的防治處理2週後第1天(第154天)前的期間中進行採樣，進行每個培養盆葉片的10次隨機採樣，自植株中央1/3表層處進行採樣，使用轉動的粘碟自葉片刷下蟎蟲和TSSM卵並進行計數，未觀察到植物毒性，結果如表3和表4。

進行ANOVA分析前，數據轉換為log₁₀(x+1)，記錄為轉換的平均值，欄位中的平均值以相同字母標示者，經最小顯著差異性測試LSD無統計顯著性(P0.05)。

^aA‘+’的符號即表示混合劑方的產品。

^bINDUCE^®,(Aquatic Ecosystems,Inc.)、非離子型表面活性劑，用量32盎司液量/英畝。

^cCOHERE^®,(Helena Chemical Company)、非離子型展固增效劑，用量16盎司液量/英畝。

^da.i為活性成份。

^aA‘+’的符號即表示混合劑方的產品。

^da.i為活性成份。

實例7：Effect of色桿菌(Chromobacterium)substugae(MBI-203)Against House flies

篩檢測試物而用於測試對家蠅(成蟲)直接接觸的防治效果，各種化合物建立3個測試群組：1.5%、3%和6%的濃度添加未處理的對照組，各個群組含5個相同的樣本約有10隻家蠅，節肢動物使用手提式的噴灑器進行防治處理，直到所有區域噴灑完成為止，使用加蓋的16盎司裝飲料杯裝填。在4小時的期間中，使用棉花球沾有10%的蔗糖溶液放入杯蓋中提供家蠅食用，於第5、15、30、45和60分鐘和第2、4和24小時或直到時間終了而記錄相關數據，算出家蠅的死活數量，瀕死的家蠅不列入計算中，結果如表5。

實例8：色桿菌(Chromobacterium)substugae(MBI-203)對枯葉甲蟲的防治效果

有3個防治處理群組進行各個化合物的測試：1.5%、3%和6%的濃度添加未處理的對照組，各個群組含5個相同的樣本約有10隻家蠅。節肢動物使用手提式的噴灑器進行防治處理，直到所有區域噴灑完成為止，使用加蓋的8或16盎司裝飲料杯裝填，杯子底部有濾紙用於吸收任何過量的物質。於防治處理後的於第5、15、30、45和60分鐘和第2、4、24、48和72小時，算出家蠅的死活數量，瀕死的家蠅不列入計算中，結果如表6。

實例9：MBI-203對馬鈴薯木蝨Bactericera cockerelli產卵能力的影響 方法

馬鈴薯木蝨曝露於經過MBI-203處理掉辣椒葉用於測定其產卵能力，將辣椒葉的莖和葉切下，浸泡MBI-203持續約1分鐘，處理方法如下：MBI-203放入10% v/v的蒸餾水中，蒸餾水作為陰性對照組，Avid的10% v/v溶液作為陽性對照組，經處理過的葉子放入塑膠培養皿中，將葉緣外露內部放有泡綿，將圓心部位切割讓經處理過的葉子外露。

1天齡的母蟲放於培養皿中央曝露於經處理過的葉子中(泡綿經切割外露的部份)再蓋上蓋子，然後使用兩個夾子固定，母成蟲即可產卵，於曝露後的第3到10天計算產卵數。

進行經MBI-203處理過和未處理過葉子的生物測定，以驗證MBI-203對馬鈴薯木蝨產卵能力的影響效果，將MBI-203處理液放入3% v/v的水中，而未處理過的對照組僅加入蒸餾水(陰性對照組)用於進行生物測定，辣椒葉的培養皿(3-4週齡的辣椒株)使用23mm的餅乾切割器切成圓形，選定葉子扁平的部位確保培養皿可平放於處理過後的瓊脂培養皿上，培養皿底部蓋有30μL的1%瓊脂溶液，其數量僅足以覆蓋培養皿底部讓培養皿突出維持適當的濕度。瓊脂在室溫下固化，將處理液倒入玻璃培養皿中，讓其完成浸泡整個培養皿，持續處理1分鐘，經處理過的葉片再使用通風櫃乾燥10-15分鐘，或直到葉片表面的溶液完全乾燥為止。在各個固化的瓊脂培養皿中，將30μL蒸餾水滴於瓊脂上，各個經處理過的葉片即可各別放於瓊脂培養皿上，將葉片背面朝向濕瓊脂上，將葉片輕輕壓入瓊脂中。在每個處理過的葉片(經處理過)放入4隻木蝨，將放有產卵母蟲的培養皿蓋子使用封口膜密封蓋上，戳出一個小孔讓其通氣和防止結露。培養皿使用石蠟膜密封放於室溫下，放入母蟲後的第1天，即開始計算每天的產卵數，使用3組進行實驗並各重複兩次。

結果

曝露於MBI-203的母蟲，其產卵數明顯下降，經MBI-203處理過的葉片母蟲的產卵時間受到些許的延遲，曝露於MBI-203葉片的木蝨母蟲於曝露後的第3天開始產卵(圖4)，在第7天產卵數達到高峰，在第10天產卵數下降，因為母蟲開始進行孵化，讓第10天的產卵平均數下降，曝露於陽性對照組的母蟲(Avid 10% v/v)於第3天死亡並未在經處理過的葉片中產卵。

葉片的生物測定證實母蟲經過MBI-20的33% v/v溶液處理，母蟲產卵數明顯下降的一致結果(圖5)，相較於曝露在未經處理的葉片(僅放有蒸餾水)中，曝露於經過處理的葉片讓母蟲的產卵數減少65%，這些生物測定結果顯示MBI-203會影響降低木蝨母蟲的產卵能力。

實例10：MBI-203對蠐螬和甲蟲的影響 對草坪草白色蠐螬的防治效果

殺蟲劑用於評估在肯塔基藍草(Poa pratensis L.)和內布拉斯加州North Bend高爾夫球場草地中，對白色蠐螬的防治效果(Southern Masked Chafer,Cyclocephala lurida Bland)，殺蟲劑施用於隨機的5 x 5英尺的培養盆農地(RCB)中，重複試驗5次，液態產品採用40 psi壓力的CO₂噴灑器噴灑174 gpa。使用後的24小時期間，使用經處理過的培養盆加水灌溉，於處理(DAT)後的第24天和第48天，將培養盆的植株移除，以8英吋直徑的土壤(總面積1.05 ft²)3英吋深的部位，算出存活和垂死的蠐螬數量，定期進行培養盆的藥害檢測，結果如表7和8。

在用量和MBI-203 DF1的防治效果上似乎有其相關性，在所有的處理樣本中，MBI-203 DF1(2 fl oz/100 ft2)的效果優於Bayer CropScience製造即一般業界普遍使用的蠐螬殺蟲劑產品trichlorfon 6%(市售產品名稱為DYLOX® 420 SL(6.9 fl.oz/1000 ft²)。有趣的是，所有垂死的蠐螬都出現於MBI-203 AF1和MBI-203 DF1的處理樣本中，這些數字(括號中的數字)並未用於統計中但用於比較，未發現到藥害，在色桿菌(Chromobacterium)substugae的配方中，AF1具有水溶性而DF1是可濕性的粉劑。

相同字母標示的平均數並無明顯的統計顯著性(P>0.05,LSD=4.4)

MBI-203對根飼養甲蟲防治效果的餵養研究

未經殺菌的Groton土壤4.25 pH有14%的有機物受到金龜子幼蟲(Anomala orientalis)的侵擾，算出死亡的幼蟲數，次土壤加有MBI-203的水溶性配方，並算出害蟲的死亡率：

聖甲蟲Rhizotrogus majalis(歐洲金龜子)蠐螬也使用1.5 ml和1 ml產品放入5g的土壤中，進行類似的實驗，在處理後的第7天有100/100的幼蟲死亡，對照組則無任何死亡的案例。

次實驗也同樣用於黑蛀象鼻蟲的幼蟲Otiorhynchus sulcatus(象蟲科)，實驗採用盆栽土壤(無食物來源)和胡蘿蔔和紅豆杉根等培養媒介物，結果如表10、11、12和13。

顯示MBI-203對於根飼養聖甲蟲和象鼻蟲具有非常好的防治效果，尤其是以根為食物的害蟲。

實例11：MBI-203對大白菜根蛆的防治效果

本研究用於測定MBI-203配方對溫室培養西蘭花植物害蟲的白菜蛆蟲(Delia radicum)防治效果，MBI 203 DF-1(MBI-203的可濕性粉劑配方)的實驗用量為2盎司/1000 ft²和8盎司/1000 ft²；MBI 203 DF-2(MBI-203的第2種可濕性粉劑配方)，其用量為2盎司/1000 ft²和8盎司/1000 ft²，實驗處理結果用於跟市售產品Radiant^®(DowAgro Sciences製造的市售產品含spineforam作為活性成份)用量為1磅/加侖來進行比較。

第3次施用(14DA-C)14天後，每週記錄成蟲和幼蟲的存活數量，直到21 DA-C為止。結果顯示相較於Radiant，MBI 203 DF-1於最後評估日明顯減低成蟲的存活數量。於最後評估日計算下，相較於Radiant對照組，MBI 203 DF-1可明顯減低成蟲的存活數量。

實例12：MBI-203 DF1和MBI-203 DF2對溫室培養草莓Drosophila suzukii(斑翼果蠅(SWD))的防治效果

本研究用於測定MBI-203 DF1和MBI-203 DF2對溫室培養草莓斑翼果蠅(SWD)的防治效果，MBI-203 DF1和MBI-203 DF2的培養盆用量為1 lb/a和4 lb/a，本實驗用於跟市售產品Entrust^®用量為1.5 oz/a進行比較，所有的處理樣本加有表面活性劑SILWET® L77(Chemtura AgroSolutions,Inc.)其用量為0.05% v/v，各個培養盆栽有草莓植株用於測定害蟲的變化數量。

實驗室所培養第3代的SWD成蟲放入各個草莓移植的植株中，施用前(實際計數前)先記錄SWD成蟲的數量，再於施用後的第4天、第7天和第11天記錄成蟲數量，也分別於14 DAA、21 DAA、28 DAA和35 DAA記錄每個草莓的SWD幼蟲數量，進行ANOVA的LSD統計分析而α=0.05。

在第1次施用後，MBI-203處理樣本顯示使用DF1和DF2產品後，斑翼果蠅Drosophila的成蟲數量逐漸減少。雖然相較於ENTRUST®(Dow AgroBioSciences)含spinosad的活性成份並無顯著的效果，但MBI-203 DF2的用量為4 lb/a時，於施用後(DAA)第7天，相較於UTC可明顯減少成蟲數量達25%。到了11 DAA，DF1和DF2的用量4 lb/a可降低成蟲數量達44%，雖然跟UTC並無顯著的差異，但MBI-203產品顯示可協助減少SWD幼蟲的數量。在所有的評估中，DF2的用量為4 lb/a可明顯減少各個草莓的幼蟲數量達71%，而ENTRUST®(Dow AgroBioSciences)含spinosad作為活性成份於21 DAA達78%，相較於ENTRUST®(Dow AgroBioSciences)，所有的MBI-203對幼蟲的防治數量可達72%，也對MBI-203 DF1和DF2用量對幼蟲數量的防治效果進行觀察。

結果：

發現結果摘要如下：

觀察到MBI-203DF1和DF2用量對SWD成蟲和幼蟲數量的影響。

MBI-203 DF2用量為4 lb/a於7 DAA可明顯降低成蟲的數量達25%。

在整個實驗進行中，相較於Entrust，DF2用量為4 lb/a可明顯降低各個草莓的幼蟲數量。

雖然兩種產品的使用對成蟲的數量並無明顯的影響，但可顯著降低下一代的幼蟲數量。

實例13：MBI-203對蚜蟲的驅除效果

本實驗進行不同濃度的MBI-203對桃蚜的驅除效果，藉由MBI-203水溶液(1% v/v,3% v/v和10% v/v)處理下進行相關的評估。MBI-203 10% v/v的濃度作為陽性對照組和裝有蒸餾水者作為陰性對照組，各種防治處理溶液添加有0.01% TWEEN 20。

辣椒葉片經過上述濃度的MBI-203處理後，再進行生物測定，辣椒葉片(3-4週龄的植株葉片)使用23mm的切割器進行切割，選定扁平的葉片部位確保經過藥劑處理後可平方於瓊脂培養皿上。加入融化1%的瓊脂溶液，倒入145 mm X 20 mm的培養皿，讓數量足以覆蓋培養皿底部表面可讓葉片突出而保持其濕度，瓊脂即可藉由室溫冷卻來固化。

將處理液放入玻璃培養皿中進行葉片的處理，葉片中放入溶液，輕輕轉動並完全浸泡葉片，持續1分鐘即可完成，經過處理的葉片使用夾子值溶液中取出，放於通風櫃15分鐘以進行乾燥，或直到葉片表面完全乾燥為止。葉片乾燥後，加入40L的水於放有葉片的瓊脂中，經過處理的葉片以相同的間距擺放於浸濕的瓊脂上，將各個葉片背面朝下，輕壓各個葉片浸入瓊脂中，再使用刷子放入20隻3-4天齡的GPA成蟲於葉片中央，培養皿即蓋上蓋子加以密封，培養皿的蓋子戳有小孔讓其通氣和防止結露。

在各個植株進行測試，於成蟲放於經處理過葉片的培養皿24小時後，測定成蟲和蛹的驅除數量，各個葉片出現的蚜蟲(成蟲和蛹的數量)加以計算並記錄相關的數據。

結果

不同濃度的MBI-203對GPA成蟲和蛹有97-99%的驅除效果(表18)，圖6顯示不同處理濃度的統計差異性，MBI-203的濃度為3%和1% v/v時，其驅除效果的平均百分比達97%和99%。

實例14：MBI-203 application reduces蚜蟲progeny

MBI-203的濃度為3% v/v可用於測定對桃蚜(GPA)成蟲產卵的防治效果，生物測定則採用含MBI-203其濃度為3% v/v而經過處理的辣椒葉片，將辣椒葉片(取自3-4週齡的植株)使用23mm的切割器切割成圓形，選定葉片扁平的部位，確保葉片可平方於瓊脂培養皿上，加熱軟化1%瓊脂溶液，倒入30μL於培養皿(16mm X 35mm通風的聚苯乙烯培養皿)上，其數量僅足以覆蓋培養皿底部讓培養皿突出維持適當的濕度。瓊脂在室溫下固化，將處理液倒入玻璃培養皿中，讓其完成浸泡整個培養皿，持續處理1分鐘，經處理過的葉片再使用通風櫃乾燥10-15分鐘，或直到葉片表面的溶液完全乾燥為止。在各個固化的瓊脂培養皿中，將30μL蒸餾水滴於瓊脂上，各個經處理過的葉片即可各別放於瓊脂培養皿上，將葉片背面朝向濕瓊脂上，將葉片輕輕壓入瓊脂中。在每個處理過的葉片(經處理過)放入6隻GPA成蟲(3-4天齡)，將放有產卵母蟲的培養皿蓋子使用封口膜密封蓋上，戳出一個小孔讓其曝氣和防止結露。培養皿放於室溫下保溫，放入母蟲後的第3天，即開始計算每天的產卵數，使用3組進行實驗並各重複5 次。

圖7顯示接觸過處理葉片後的第3天，MBI-203即明顯影響到GPA成蟲的產卵數，圖5內容為5次實驗中，相對於陰性對照組(僅含有蒸餾水)和陽性對照組(10% Avid)，可觀察到GPA成蟲的產卵數減少可達50%，顯示對產卵數具有相同的統計差異性。帶產卵數比對配方產品DF2的防治效果時，MBI-203標準液和DF2濃度為3% v/v時，並無統計上的差異性(圖8)。相較於陰性對照組，MBI-203和DF2的防治處理可降低產卵數(蛹)超過90%，顯示相關較Avid 10% v/v的濃度(陰性對照組)更佳。

實例15：來自色桿菌(Chromobacterium)substugae的紫色桿菌素和寡-(β-羥基丁酸)提取物

下列步驟用於色桿菌(Chromobacterium)substugae培養液提取物純化：

全細胞培養液(WCB)藉由液-液提取法使用乙酸乙酯值L-培養液中提取20-L的發酵C.Substugae成份，乙酸乙酯層於真空下使用旋轉蒸發器乾燥分離而取得粗提取物，此粗提取物再使用不同的溶劑如二氯甲烷(DCM)、乙酸乙酯(EA)和甲醇(MeOH)進行分餾，再使用WASH溶劑洗滌，這些餾分物使用旋轉蒸發器進行濃縮乾燥，其乾燥的殘留物使用不同的害蟲(昆蟲和線蟲)進行生物活性的篩檢，其活性餾分物再進行Sephadex LH 20色譜儀(CH₂Cl₂/CH₃OH；50/50)的分析而提供有10各餾分物(圖9)，這些餾分物再使用旋轉蒸發器濃縮乾燥，其乾燥殘留物(餾分物)再使用桃蚜、桃蚜(GPA)和線蟲(M.incognita and/or M.hapla)的產卵數，進行其生物驅除效果相關的生物活性測定，次活性成份再使用反相HPLC(Spectra System P4000(Thermo Scientific)析出純化合物，再藉由上述的生物測定進行篩檢來找出/識別其活性化合物。為能夠確認識別此化合物，應記錄有其他的光譜數據如LC/MS和NMR。

將可能具有驅蟲效果的化合物自餾分物F8、F9和F10析出，經識別為紫色桿菌素(2)，此具有線蟲驅除活性的化合物主要來自DCM的餾分物，次化合物也經識別為寡-(β-羥基丁酸)(4)。

化合物的質譜分析

活性峰值的質譜分析於Thermo Finnigan LCQ Deca XP Plus電噴灑(ESI)測量儀，使用陽性和陰性離子化模式的全掃描模式(m/z 100-1500 Da)在LCQ DECA XP^plus質譜儀(Thermo Electron Corp.,San Jose,CA)上進行測定，高效液相層析儀(HPLC)加裝有Finnigan Surveyor PDA偵測器、自動採樣器、MS幫浦和1個4.6 mm x 100 mm Luna C18 5μ 100A的柱析儀(Phenomenex)，溶劑相同含水(溶劑A)和乙腈(溶劑B)，流動相始於10%的溶劑B，經過20分鐘溶劑B線性增加到100%，然後持續4分鐘，最後經過3分鐘後溶劑B回到10%，流速為0.5 mL/min，注射量為10μL，而自動採樣器中的樣本放於室溫中。此化合物藉由LC-MS使用LC和反相質譜儀進行分析，本化合物的質譜分析條件如下：氮氣流速固定為30，而鞘氣流速和輔助器流速固定為15 arb。電噴灑離子化使用噴灑電壓5000V和毛細管電壓35.0V來進行，毛細管溫度設定為400℃，數據資料藉由Xcalibur軟體來分析。寡-(β-羥基丁酸)(1)的分析使用在陽離子化模式下的Chromamide A(1)分子量為860，另一個活性化合物B的LC-MS色譜顯示在陽離子化模式下的分子量為874，紫色桿菌素(2)和deoxy紫色桿菌素(3)的分子量分則別為313和327。

寡-(β-羥基丁酸)(1)加州大學戴維斯分校的LTQ Orbitrap XL混合型傅立葉變換質譜儀進行分析。

化合物的NMR核磁共振質譜分析

NMR核磁共振質譜分析於Bruker 600 MHz的梯度場光譜儀進行量測，參考值設定為四甲基矽烷(TMS,0.00 ppm)的內部標準值。

化合物的純化

二氯甲烷(DCM)的餾分物可使用甲醇餾分，而析出寡-(β-羥基丁酸)(1)的白色固體物。

化合物的識別

寡-(β-羥基丁酸)(1)

成份4的¹H NMR質譜信號顯示的δ值為5.22(sext)、2.62(dd)和2.53(dd)各個相對強度為1個質子，除了這些甲基信號的δ值為1.31，也觀察到其兩倍值。¹³C NMR質譜顯示只有4個碳信號，其δ值為169.2、67.6、40.9和19.8。詳細的1D & 2D NMR分析結果顯示-(-O-CHCH₃-CH₂-CO-)-的部份表面其片段質量為86。次化合物的MALDI-TOF-ESI MS(圖2)顯示典型的信號形態含低聚物的混合物，其分子量為[(n x 86)+Na]，對應的產品為寡-(β-羥基丁酸)1的混合物n=10-25，此化合物據報可自多種的細菌提取(Singh et al.,2011；Maskey et al.,2002；Hahn et al.,1995)，在體外化驗中，可使用M.Hapla.值DCM餾分物提取次化合物，顯示具有75%不動率(圖10)。

色桿菌(Chromobacterium)substugae餾分物和純化物的體外測試

餾分物和純化物溶解於二甲基亞碸(DMSO)中，使用96孔的塑膠培養皿進行體外化驗，約有15-20隻的線蟲放入50μL的水溶液中，曝露於100μL的4mg/ml樣本於24℃下存續放置24小時，培育期結束後，按照目視的各孔經樣本處理掉線蟲幼蟲(J2)不動率，記錄其相關的結果，各孔經處理後各測試4次，結果如圖5，即表示C.Substugae餾分物和化合物在96孔培養皿生物測定下的結果，每個實驗各有3個對照組，即1個陽性對照組(1% Avid)和2個陰性對照組(DMSO和水)，兩個實驗(T1)和(T2)均採用M.Hapla線蟲進行測試。

具有驅蟲的化合物提取和識別

主要的餾分物如DCM、EA、MeOH和WASH使用桃蚜(GPA)進行驅蟲活性的測試，將詳細說明如下，觀察EA和 MEOH餾分物的驅蟲能力，這些餾分物的LCMS分析顯示類似的化學特性，因為MeOH餾分物的產量高於EA餾分物，即採用MeOH餾分物進行詳細的化學處理。MeOH餾分物可使用Sephadex LH 20色譜儀(CH₂Cl₂/CH₃OH；50/50)再餾分而取得10個餾分物(圖9)，餾分物F9和F0觀察到具有最高的驅蟲活性，這些餾分物可藉由HPLC和Sephadex LH 20進行生物測定的純化而生成具有驅蟲活性的紫色桿菌素成份，紫色桿菌素也用於測試對蚜蟲產卵的防治效果。

實例16：MBI-203餾分物對桃蚜的驅蟲效果 方法

桃蚜成蟲(GPA)的生物測定使用MBI-203餾分物和取自C.substugae(MBI-203)細胞提取物的純化物(紫色桿菌素)來進行，用於測定驅蟲能力。辣椒葉的培養皿(3-4週齡的辣椒株)使用23mm的餅乾切割器切成圓形，選定葉子扁平的部位確保培養皿可平放於處理過後的瓊脂培養皿上，製備號所需的瓊脂百分比(%)後，加熱軟化1%的瓊脂溶液，倒入145mm X 20mm的培養皿中，其數量僅足以覆蓋培養皿底部讓培養皿突出維持適當的濕度，瓊脂再藉由室溫冷卻固化。

輕輕將100μL的MBI-203的提取物滴入葉片處理樣本中，經處理過的葉片即可平放於標示有12孔的培養皿蓋進行乾燥，葉片乾燥後，將40uL的水滴入放有葉片的瓊脂上。經處理過的葉片即彼此等距擺放於瓊脂的浸表面上，將各個葉片背面朝下而處理面朝上，輕壓各個葉片而完全平放浸入瓊脂中，擺放好處理過的葉片後，使用細毛刷放入20 3-4天齡的GPA成蟲於葉片中央，然後使用封口膜密封，培養皿的蓋子戳有小孔用於通氣和防止結露。

所有的測試進行3次，要選用粗提取物最粗測試的溶劑時，可採用甲醇和丙酮作為溶劑，此測試顯示丙酮是較佳的溶劑，後續的樣本測試包括有餾分物和純化物(紫色桿菌素)，使用丙酮為溶劑來進行測試。成蟲和蛹的驅蟲效果的相關數據，於成蟲曝露於處理過的葉片24小時後進行測試，算出蚜蟲數量(成蟲和蛹)，記錄並分析數據，驅除效果的百分比計算如下：%驅蟲效果百分比=100-{([N+A]「放於處理過的葉片上」)/[N+A]「放於培養皿上」X100}，其中A表示成蟲數量，而N表示蛹的數量。

結果

先使用粗提取物開始進行MBI-203餾分物的驅蟲效果測試，將粗提取物浸入甲醇和丙酮中，測試分析結果顯示有顯著的差異如圖11，含MBI-203粗提取物的葉片浸入甲醇和丙酮中，相較於陰性對照組，對蚜蟲的蛹和成蟲數量的影響具有明顯的差異。圖11A和B顯示MBI-203對蚜蟲的驅蟲效果，但甲醇溶劑顯示對蚜蟲具有驅蟲效果(圖11A)，但更MBI-203提取物和陽性對照組(avid 10%)並無顯著的統計差異性。丙酮上，良好的餾分物溶劑，對GPA的蛹和成蟲並無驅蟲效果，葉片中的蛹和成蟲平均數相同於陰性對照組(圖11B)。

MBI-203餾分物顯示對GPA蛹和成蟲具有驅蟲效果，也觀察到各平均數的統計差異性(圖12A和B)，經餾分的物質EA和MeOH對蛹s和成蟲具有100%的驅蟲效果，而WASH物質具有94%的驅蟲效果，跟陽性對照組(MBI-203 10% v/v)並無顯著的統計差異性(表19)。

此外，在10個取自MeOH的餾分物使用丙酮溶劑進行測試，含純紫色桿菌素化合物(F9,F10)的樣本，顯示對桃蚜的成蟲和蛹具有高驅蟲效果(表20)，僅有2個非紫色桿菌素餾分物顯示具有高驅蟲效果(F2和F3)，餾分物F9和F10再進行純化可得到具有100%驅蟲效果的紫色桿菌素，數據資料顯示紫色桿菌素對吸允覓食的昆蟲具有驅蟲效果，即表示餾分物F6-F10含紫色桿菌素，其中F9和F10含有純紫色桿菌素化合物。

實例17：紫色桿菌素降低蚜蟲的產卵數

將兩種濃度的純紫色桿菌素化合物放入的丙酮中，以0.5 μg/mL和1.0 μg/mL的用量測定化合物對桃蚜(GPA)產卵數的防治效果。使用經處理過的辣椒葉片以不同紫色桿菌素濃度的丙酮溶劑進行生物測定。將辣椒葉片(取自3-4週齡植株)切成23mm直徑的葉片，選定扁平部位確保以化合物處理過的葉片可均勻平放，製備1%的瓊脂溶液，加熱融化後將30μL放入培養皿(16mm X 35mm通風的聚苯乙烯培養皿)，其數量剛好足以覆蓋培養皿底部，以支撐葉片並保持濕度。瓊脂可在室溫下冷卻固化，將100μL的樣本溶液使用2000μL的移液管輕輕塗佈於處理過的紫色桿菌素樣本上，處理樣本分成3份，處理過的葉片可在通風櫃中乾燥5-10分鐘，陽性對照組為10% v/v Avid而陰性對照組是使用蒸餾水和丙酮作為空白對照組。在各個固化的瓊脂培養皿中，將20-30μL的蒸餾水滴入瓊脂以維持濕度，各個處理過的葉片各自擺放在瓊脂培養皿中，讓葉片背面朝向濕瓊脂，輕輕完全壓平於瓊脂上。各個裝有葉片(處理過)的培養皿中放入6隻GPA成蟲(3-4天齡)，裝有成蟲的培養皿再使用封口膜密封，封口膜的蓋子戳有小孔可通氣和防止結露，放於室溫下，成蟲曝露於處理過葉片3天後，算出產卵數(初蛹壽齡)，實驗分成3組各進行2次的實驗。

如圖13，紫色桿菌素的濃度為1.0 μg/mL時，可明顯降低蚜蟲的產卵數，相較於陰性對照組(僅經過水溶液的處理)約減少50%，陽性對照組(10% Avid)的產卵數最少，成蟲曝露3天後即使死亡，本實驗進行2次的測試，各個實驗重複3次，每個測試均跟紫色桿菌素有相同的結果，而明顯降低產卵數。

實例18：其他生成紫色桿菌素的藥劑對蚜蟲的驅蟲效果

也評估色桿菌(Chromobacterium)對桃蚜的驅蟲效果：色桿菌(Chromobacterium)piscinae DSM 23278、C.pseudoviolaceum DSM 23279、C.haemolyticum DSM 19808和C.aquaticum DSM 19852中，有兩個菌種可生成紫色桿菌素(C.piscinae和C.pseudoviol)，另有兩個菌種據報不會生成紫色桿菌素。微生物於LB培養液在26℃和100 rpm的要換轉速下存續培養5天，在培養結束時，將培養液分裝進行生物測定，水溶液的處理濃度為5% v/v對GPA成蟲進行測試，MBI-203 10% v/v濃度的溶液作為陽性對照組，僅含蒸餾水的溶液作為陰性對照組，各個處理樣本的溶液添加有0.01% TWEEN 20。

如上所述，進行處理過辣椒葉片的生物測定，將各個葉片輕輕壓平於瓊脂上，擺放好處理過的葉片後，使用細毛刷放入20隻3-4天齡的GPA成蟲於葉片中央，再蓋上葉片使用封口膜密封，培養皿戳有小孔可通風和防止結露。

測試樣本分成3組，讓成蟲曝露於處理過的葉片24小時後，測定對成蟲和蛹的驅蟲效果，算出葉片上的蚜蟲(成蟲和蛹)的數量，並就數據資料進行記錄和分析，驅蟲效果百分比計算如下：

其中，N是蛹的數量，A是成蟲的數量。

結果顯示如表21和22和圖14和15，顯示多種生成紫色桿菌素的色桿菌(色桿菌(Chromobacterium))菌種對GPA成蟲和蛹具有驅蟲效果，具有顯著的統計差異性，可生成紫色桿菌素的色桿菌種(色桿菌(Chromobacterium))具有75%(C.piscinae)和86%(C.pseudoviolaceum)的驅蟲效果，不生成紫色桿菌素的菌種(C.aquaticum和C.haemolyticum)跟未處理的的對照組(水)並無統計差異性，)，不生成紫色桿菌素的菌種僅有些微的驅蟲效果。

實例19：色桿菌配方有無苯甲酸鈉的穩定性比較

含Chrombacterium細胞配方1濃縮分為32份，Chrombacterium發酵上清液分為62.5份，n-Hexanol分為1份，海藻酸鈉0.5份、脫水山梨糖醇酯聚氧乙烯醚2份和d-檸檬烯2份。這些配方依據其功能而選用，按照US EPA list 4的清單固定，確保配方均勻提供最佳的含水量。根據EPA list 4列舉的成份，有最低的環境毒性影響。配方2含有Chrombacterium細胞的濃縮液分成32份、Chrombacterium發酵培養上清液54.5份、n-Hexanol 1份、海藻酸鈉0.5份、脫水山梨糖醇酯乙氧基化物2份和苯甲酸鈉10份。

表23：配方1和2長期存放的影響效果

配方2較配方1更穩定，顯示苯甲酸的水溶液鹽類可穩定生物殺蟲劑的成份，而避免因為日光曝曬的物理解離和活性喪失，苯甲酸離子提供可溶性和電解質平衡性，可讓生物基質保持均勻，延長殺蟲劑成份的產品保質期。在延長保質期的農藥組合物。苯甲酸酯離子在產品應用於農地作物時，讓產品具有吸收紫外線輻射的功能，對紫外線燈保護可延長殺蟲劑活性至少數天之久。

實例20：苯甲酸鈉對害蟲死亡率的影響

MBI-203產品含色桿菌(Chromobacterium)substugae、d-苧烯、己醇、丙二醇和對羥基苯甲酸酯配方(MBI-203 EP)，再混合有碳酸鈣、苯甲酸鈉或鈦的氧化物，放入塑膠培養皿中，再使用封口膜密封，培養皿放於室溫日光下存續7小時，經過日光曝曬後，將樣本帶入實驗室中，使用蒸壓微孔水稀釋為1.5%和3% v/v的濃度，樣本材料再放於添加食物上，進行乾燥再餵養給和甘藍尺蠖(甘藍尺蠖)和夜蛾(Trichoplusia ni) 的新生幼蟲，於餵養後的第3和4天測定器死亡率，結果顯示如表24和圖16。

關於西蘭花的研究

4-5週齡的Packman西蘭花噴灑3% v/v濃度有或無苯甲酸鈉的MBI-203產品稀釋液(d-檸檬烯配方)(MBI-203 EP)，各植株栽種於9平方英吋的培養盆，添加有500uL的處理液，所有的樣本中，Tween-20的最終濃度為0.01%，將5隻甘藍蚜蟲的成蟲Brevicoryne brassicae放於各植株上，植株和害蟲於日光曝曬下培育(75-85℉,16小時光/8小時暗)，於害蟲侵擾後的第3、5、7天算出活蚜蟲的數量，顯示苯甲酸鈉配方較單一成份的最終產品具有更佳的防治效果(圖17)。

關於紫甘藍的研究

有或無苯甲酸鈉濃度為10% v/v的MBI-203稀釋液最終產品(d-檸檬烯配方)(MBI-203 EP)，用於噴灑紫甘藍其用量為30加侖/英畝，配方對照組(批號2403-83-3)濃度為10% v/v也放入化驗樣本中，進行植株的乾燥後，放入10隻甘藍蚜蟲侵擾，於第3、6、8天進行化驗樣本的計數，防治效果的百分比可使用Henderson-Tilton校正來判定，其結果如圖18，最終產品+苯甲酸鈉配方，相較於單方的最終產品或僅含對照組配方的產品，對蚜蟲有更佳的防治效果。

實例21：苯甲酸鈉和碳酸鈣的比較

未稀釋MBI-203最終產品(MBI-203 EP)具有不同濃度的苯甲酸鈉或碳酸鈣，於密封墊培養皿中，進行日光曝曬存續1天的期間。經過日光曝曬或未曝曬的樣本材料稀釋成3% v/v的稀釋液，作為日常的人為餵養食物，將甘藍尺蠖的幼蟲放於人為餵養食物上，於第4天計算死亡率，其結果如圖19，苯甲酸鈉的濃度為10%和15%時，具有最經濟實惠的價格其活性降解程度最低。

實例22：木質素磺酸鹽的影響效果

將未經處理不含添加物的乾細胞倒入塑膠瓶中，於40-65℉的晴天中存續培育4天。經過曝曬和未曝曬的樣本稀釋成6% v/v的濃度，噴灑於Packman西蘭花植株上。經乾燥的植株放入5隻甘藍蚜蟲的幼蟲，於第3和6天算出蚜蟲的數量，再使用Henderson-Tilton校正法測定防治效果，乾燥的細胞噴灑有苯甲酸鈉，於第3天有最高點殺蟲率，化驗樣本中此殺蟲活性持續到第6天(見圖20)。

MBI-203最終產品(d-檸檬烯配方)(MBI-203 EP)混合有不同濃度的苯甲酸鈉和木質素磺酸鹽，處理樣本稀釋到10% v/v的濃度，滴入塑膠培養皿中，進行日光曝曬存續4天。樣本藉由人工食物進行甘藍尺蠖的測試，木質素磺酸鹽的處理樣本容易在形成人工食物上形成1道表層，僅含有苯甲酸鈉的最終產品產品，於日光曝曬前後似乎具有最佳的殺蟲效果(見圖21和22)。

在另一個研究中，10% v/v的MBI-203最終產品(d-檸檬烯配方)稀釋液中含有10%的苯甲酸鈉和不同濃度的木質素磺酸鹽，於密封的塑膠培養皿中持續日光曝曬4天。於日光曝曬後，將4週齡的Packman西蘭花噴灑有處理液，用量約為30加侖/英畝，將3隻甘藍尺蠖的晚齡幼蟲放於各個經處理過的植株上，於第3和4天計算害蟲數量。日光曝曬的植株中，僅含有苯甲酸鈉的樣本具有最佳的防治效果(見圖圖23)。

雖然本發明已藉由具體實例的參考內容加以說明，仍然未盡詳細，任何人可借用不同的同等事項、變化和修改內容加以應用，但仍無違本發明的精神及其範圍。

本文引用不同的參考內容，即屬本文完整內容的一部份。

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圖1是取自ChromamideA(1)、紫色桿菌素(2)和deoxy紫色桿菌素(3)純化物的示意圖。

圖2說明Chromamide A(1)、紫色桿菌素(2)和deoxy紫色桿菌素(3)的學結構。

圖3顯示MBI-203 TSSM葉片的檢測結果，CFD表示將細胞冷凍乾燥處理，然後重新溶解於水中，即1/2倍、1倍和2.5倍的全細胞液中。

圖4顯示曝露於MBI-203處理過的辣椒葉，木蝨的平均產卵數。

圖5顯示出曝露於經MB-203處理過和未處理過辣椒葉片的木蝨產卵數平均值。

圖6顯示桃蚜幼蟲和成蟲(GPA)曝露於處理過的辣椒葉片24小時後(P<0.0001，LSD，α=0.05)的平均數，相同字母的統計平均數並無差異，蒸餾水-陰性對照組，203 10% V/V-陽性對照組。

圖7顯示在曝露於MBI-203處理過辣椒葉片3天後，桃蚜後代(幼蟲)的平均數(P<0.0001、LSD、α=0.05)。相同字母的統計平均數並無差異，蒸餾水-陰性對照組，10% V/V-陽性對照組。

圖8顯示桃蚜成蟲曝露於經處理過MBI-203和DF2(MBI-203配方產品)的辣椒葉3天後的桃蚜後代(幼蟲)平均數(P<0.0001、LSD、α=0.05)，相同字母的統計平均數並無差異，蒸餾水-陰性對照組，10% v/v-陽性對照組。

圖9是將培養液中的紫色桿菌素(2)和寡核苷酸(β-羥基丁酸)(4)純化的示意圖。

圖10顯示桃蚜成蟲曝露於經處理過辣椒葉片3天後的後代(幼蟲)平均數(P<0.0001、LSD、α=0.05)，相同字母的統計平均數並無差異，VL1-紫色桿菌素於0.5 μg/mL、VL2-紫色桿菌素於1.0μg/mL、丙酮-無添加物處理、蒸餾水-陰性對照組、 Avid10%v/v-陽性對照組。

圖11A和11B顯示煙蚜(幼蟲和成蟲)曝露於處理過辣椒葉片24小時後，桃蚜的平均數。相同字母的統計平均數並無顯著的差異(P<0.0001、LSD、α=0.05)。203 Me-MBI-203屬甲醇溶劑的粗提取物(無添加物處理)、203，Ace-MBI-203丙酮溶劑粗提取物、Ace-丙酮(無添加物處理)、蒸餾水-陰性對照組、Avid 10%-陽性對照組。

圖12A和12B顯示煙蚜(幼蟲和成蟲)曝露於處理過辣椒葉片24小時後，桃蚜的平均數。相同字母的統計平均數並無顯著的差異。Ace-只含有丙酮(無添加物處理，DCM-EA-清洗-甲醇-蒸餾水-陰性對照組，203 10%-MBI-203 STD(陽性對照組)。

圖13顯示桃蚜曝露於處理過辣椒葉片3天後的平均數(P<0.0018、LSD、α=0.05)。相同字母的統計平均數並無顯著的差異。VL1-於0.5μg/mL的紫色桿菌素中，VL2-於1.0μg/mL的紫色桿菌素中，丙酮-無添加物處理、蒸餾水-陰性對照組、Avid 10%(v/v)-陽性對照組。

圖14顯示桃蚜(GPA)成蟲曝露於處理過辣椒葉片24小時後，其幼蟲和成蟲的平均數(P<0.0001、LSD、α=0.05)。相同字母的統計平均數並無差異，蒸餾水203-陰性對照組、10% v/v-陽性對照組。

圖15顯示桃蚜成蟲曝露於處理過辣椒葉片24小時後，其幼蟲和成蟲的平均數(P<0.0001、LSD、α=0.05)。相同字母的統計平均數並無差異，蒸餾水203-陰性對照組、10% v/v-陽性對照組。

圖16顯示MBI-203 @ 3%日曬前與postsun的死亡率，歸零到不含添加物的清水。

圖17顯示MBI-203：菜蚜植株噴霧EP/EP+NaBenz的處理狀況。

圖18顯示MBI-203 EP+/-Na Benz、白菜蚜蟲植株噴霧的修正狀況。

圖19顯示MBI-203：EP+CaCO3/NaBenz日光曝曬前後標準化為陰性對照組的處理狀況。

圖20顯示MBI-203 EP SDP日光曝曬後第3和6天的檢測狀況。

圖21顯示MBI-203 EP/Benz+木質素日光曝曬後第4天的修正狀況。

圖22顯示MBI-203 EP添加Na Benz+木質素在日光曝曬後第4天的活性損失百分比。

圖23顯示MBI-203：EP+木質素+日光曝曬，西蘭花第3天的檢測狀況。

Claims

一種用於調節至少一種蜱蟎害蟲和/或至少一種蠅科、果蠅科、花蠅科、常蚜科、木蝨科、擬步行蟲科和聖甲蟲科的害蟲於單一區域進行防治之方法，包括：(a)可採用一個數量的上清液、濾液和/或提取物和/或一種或多種來自上述色桿菌種(色桿菌(Chromobacterium)的上清液、濾液和/或提取物，和(b)另一種殺蟲物質，其中的此殺蟲物質為某種殺蟎劑和/或殺蟲劑，可有效防治一種或多種的蠅科、果蠅科、花蠅科、常蚜科、木蝨科、擬步行蟲科和聖甲蟲科的害蟲，而在某個區域中，用於防治蛛形綱動物和/或一種或多種的蠅科、果蠅科、花蠅科、常蚜科、木蝨科、擬步行蟲科和聖甲蟲科的害蟲。
根據申請專利範圍第1項所述之方法，其中的該區域為植株、植株種子或土壤中的一個區域。
根據申請專利範圍第1項所述之方法，其中的蜱蟎害蟲為蟎蟲。
根據申請專利範圍第1項所述之方法，其中所謂的蟎蟲為Tetranychus sp.種的害蟲。
根據申請專利範圍第1項所述之方法，其中所謂的害蟲為Musca sp.、Myzus sp.、Bactericera sp.、Cyclocephala sp.或Alphitobius sp.、Drosophila sp.、Delia sp.、Rhizotrogus sp.、Popillia sp.、Anomala sp.或Otiorhynchus sp.種的害蟲。
根據申請專利範圍第1項所述之方法，其中所謂的色桿菌(Chromobacterium)sp.菌種為色桿菌(Chromobacterium)substugae Nov新菌種。
根據申請專利範圍第1項所述之方法，其中所謂的害蟲為Musca domesitcas、Drosophila suzukii、Delia radicum、Myzus persicae、Bactericera cockerelli、Alphitobius diaperinusxi、Cyclocephala lurida、Rhizotrogus majalis、Popilla japonica、Otiorhynchus sulcatus和Anomala orientalis的害蟲。
根據申請專利範圍第1項所述之方法，其中所謂的代謝物選自具有下列特徵的族群：(a)為一化合物，液相色譜/質譜(LC/MS)測定的分子量約840-890；(ii)¹H NMR δ值約為8.89、8.44、8.24、8.23、7.96、7.63、6.66、5.42、5.36、5.31、5.10、4.13、4.07、4.05、3.96、3.95、3.88、3.77、3.73、3.51、3.44、3.17、2.40、2.27、2.11、2.08、2.03、2.01、1.97、1.95、1.90、1.81、1.68、1.63、1.57、1.53、1.48、1.43、1.35、1.24、1.07、1.02、0.96、0.89、0.88、0.87、0.80，和(iii)¹³C NMR δ值約為173.62、172.92、172.25、172.17、171.66、171.28、170.45、132.13、130.04、129.98、129.69、129.69、125.48、98.05、70.11、69.75、68.30、68.25、64.34、60.94、54.54、52.82、49.72、48.57、45.68、40.38、39.90、38.18、36.60、31.98、31.62、31.58、29.53、28.83、27.78、24.41、23.06、22.09、20.56、19.31、18.78、17.66、15.80；(b)一化合物而具有下列特徵：(i)可取自色桿菌(Chromobacterium)的菌種；(ii)對害蟲具有毒性；(iii)液相色譜/質譜(LC/MS)測定的分子量約850-900；(iv)在反相C-18 HPLC柱析儀(Phenomenex,Luna 5μ C18(2)100 A,100 x 4.60 mm)，使用水：乙腈(CH3CN)梯度溶劑系統(0-20分鐘90-0%CH₃CN水溶液、20至24分鐘100% CH₃CN、24-27分鐘0-90%CH₃CN水溶液、27-30分鐘90% CH₃CN水溶液)，在0.5毫升/分鐘流速和UV檢測器波長210nm下，高壓液相色譜儀(HPLC)的保留時間約7-12分鐘；(c)一具有##STR001##結構的化合物或含有可接受的殺蟲活性鹽類或立體異構物，其中的R 是-H，低鏈烷基含有1、2、3、4、5、6、7、8或9個烷基團和取代低鏈烷基團，X是O、NH、NR或S，n是1、2、3、4、5、6、7、8或9，R₂、R₃、R₄、R₅、R₆、R₇、R₈、R₉、R₁₀、R₁₁是各別獨立的H，可為相同或不同而各別獨立的氨基酸側鏈基團或氨基酸側鏈衍生物、烷基、取代的烷基、鏈烯基、取代的鏈烯基、炔基、取代的炔基、芳基、取代的芳基、雜芳基、取代的雜芳基、雜環基、取代的雜環基、環烷基、取代的環烷基、烷氧基、取代的烷氧基、硫代烷基、取代的烷硫基、羥基、鹵素、氨基、酰氨基、羧基、-C(O)H、酰基、oxyacyl、氨基甲酸酯、磺酰基、磺酰胺或硫原子；(d)一具有##STR001a##結構的化合物其中的R是-H，低鏈烷基含有1、2、3、4、5、6、7、8或9個烷基團、芳基或芳基烷基團和取代低鏈烷基，X是O、NH、NR或S，R_2a和R_2b是選自下列的獨立官能基，而含有-H、烷基、低鏈烷基、取代烷基和取代低鏈烷基；R₁、R₂、R₃、R₄、R₅、R₆、R₇、R₈、R₉、R₁₀、R₁₁是各別獨立的H，屬相同或不同而各別獨立的氨基酸側鏈基團或氨基酸側鏈衍生物、烷基、取代烷基、鏈烯基、取代的鏈烯基和炔基鏈烯基、取代的芳基、雜芳基、取代的雜芳基、雜環基、取代的雜環基、環烷基、取代的環烷基、烷氧基、取代的烷氧基、硫代烷基、取代的硫代烷基、羥基、鹵素、氨基、酰氨基、羧基、-C(O)H、酰基、oxyacyl、氨基甲酸叔丁酯、磺酰基、磺酰胺、或硫原子；(e)一具有##STR001b##結構的化合物其中的R是-H，低鏈烷基含有1、2、3、4、5、6、7、8或9個烷基團、芳基或芳基烷基團、取代低鏈烷基和取代低鏈烷基團，X是O、NH、NR或S，n是1、2、3、4、5、6、7、8或9，R_2a，和R_2b是各別獨立選自下列的官能基，含有-H、烷基、低鏈烷基、取代烷基和取代低鏈烷基，R₁、R₂、R₃、R₄、R₅、R₆、R₇、R₈、R₉、R₁₀、R₁₁是各別獨立的H，屬相同或不同而各別獨立的氨基酸側鏈基團或氨基酸側鏈衍生物、烷基、取代的烷基、鏈烯基、取代的鏈烯基、炔基鏈烯基、取代的炔基、芳基、取代芳基、雜芳基、取代的雜芳基、雜環基、取代的雜環基、環烷基、取代的環烷基、烷氧基、取代的烷氧基、硫代烷基、取代的硫代烷基、羥基、鹵素、氨基、酰氨基、羧基、-C(O)H、酰基、oxyacyl、氨基甲酸酯、磺酰基、磺酰胺、或硫原子；(f)一具有##STR001c##結構的化合物其中的R是-H，低鏈烷基、芳基或芳基烷基團、取代低鏈烷基含1、2、3、4、5、6、7、8或9個烷基團，X是O、NH、NR或S，n是1、2、3、4、5、6、7、8或9，R2a，和R2b是各別獨立選自下列的官能基，含有-H、烷基、低鏈烷基、取代烷基和取代低鏈烷基，R₁、R₂、R₃、R₄、R₅、R₆、R₇、R₈、R₉、R₁₀、R₁₁是各別獨立的H，屬相同或不同而各別獨立的氨基酸側鏈基團或氨基酸側鏈衍生物、烷基、取代的烷基、鏈烯基、取代的鏈烯基、炔基鏈烯基、取代的炔基、芳基、取代芳基、雜芳基、取代的雜芳基、雜環基、取代的雜環基、環烷基、取代的環烷基、烷氧基、取代的烷氧基、硫代烷基、取代的硫代烷基、羥基、鹵素、氨基、酰氨基、羧基、-C(O)H、酰基、oxyacyl、氨基甲酸酯、磺酰基、磺酰胺、或硫原子；(g)一化合物具有下列特性：(i)可取自色桿菌(Chromobacterium)的菌種；(ii)對害蟲具有毒性；(iii)液相色譜/質譜(LC/MS)測定的分子量約325-360)；(iv)在反相C-18 HPLC柱析儀(Phenomenex,Luna 5μ C18(2)100 A,100 x 4.60 mm)，使用水：乙腈(CH3CN)梯度溶劑系統(0-20分鐘90-0%CH3CN水溶液、20至24分鐘100% CH3CN、24-27分鐘0-90%CH3CN水溶液、27-30分鐘90% CH3CN水溶液)，在0.5毫升/分鐘流速和UV檢測器波長210nm下，高壓液相色譜儀(HPLC)的保留時間約8-14分鐘；(h)一化合物具有下列的特性：(i)可取自色桿菌(Chromobacterium)的菌種；(ii)對害蟲具有毒性；(iii)液相色譜/質譜(LC/MS)測定的分子量約315-350；(iv)在反相C-18 HPLC柱析儀(Phenomenex,Luna 5μ C18(2)100 A,100 x 4.60 mm)，使用水：乙腈(CH3CN)梯度溶劑系統(0-20分鐘90-0%CH3CN水溶液、20至24分鐘100% CH3CN、24-27分鐘0-90%CH3CN水溶液、27-30分鐘90% CH3CN水溶液)，在0.5毫升/分鐘流速和UV檢測器波長210nm下，高壓液相色譜儀(HPLC)的保留時間約10-15分鐘。
根據申請專利範圍第8項所述之方法，其中所謂的代謝物是 violaecin的衍生物具有下列的結構：其中R是-H，低鏈烷基含1、2、3、4、5、6、7、8或9個烷基團、芳基或芳基烷基團、取代低鏈烷基和鹵素，R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11是各別獨立的H，屬相同或不同而各別獨立的烷基、取代的烷基、鏈烯基、取代的鏈烯基、炔基鏈烯基、取代的炔基、芳基、取代芳基、雜芳基、取代的雜芳基、雜環基、取代的雜環基、環烷基、取代的環烷基、烷氧基、取代的烷氧基、硫代烷基、取代的硫代烷基、羥基、鹵素、氨基、酰氨基、羧基、-C(O)H、酰基、oxyacyl、氨基甲酸酯、磺酰基、磺酰胺、或硫原子。
根據申請專利範圍第8項所述之方法，其中所謂的代謝物選自含有紫色桿菌素、deoxy紫色桿菌素和Chromamide A的官能基。
一種殺蟲組合物，其活性成份包括：(a)某種上清液、濾液和/或提取物和/或一種或多種取自色桿菌(Chromobacterium)菌種其代謝物的上清液、濾液和/或提取物成份，和(b)另一種殺蟲物質，另一種殺蟲物質，其中的此殺蟲物質為某種殺蟎劑和/或殺蟲劑，可有有效防治一種或多種的蠅科、果蠅科、花蠅科、常蚜科、木蝨科、擬步行蟲科和聖甲蟲科的害蟲，而在某個區域中，用於防治蛛形綱動物和/或一種或多種的蠅科、果蠅科、花蠅科、常蚜科、木蝨科、擬步行蟲科和聖甲蟲科的害蟲。
一種應用於植株、植株種子和/或植株生長物的害蟲防治方法，該方法包括：(I)一化合物，該化合物具有下列特性(a)具有殺蟲毒性；(b)LTQ Orbitrap XL混合型傅立葉變換質譜儀測得的分子量約950-1450；(c)¹H NMR δ值為5.22(sext,1H)、2.62(dd,1H)、2.53(dd,1H)和1.31(d,3H)；(d)¹³C NMR δ值為169.2、67.6、40.9和19.8；(e)具有-(-O-CHCH₃-CH₂-CO-)_n-的結構，其中n=6-50；(f)可取自色桿菌(Chromobacterium)的菌種；及(II)也可另選其他的殺蟲物質，其用量足以防治本文所述的蟲害。
根據申請專利範圍第12項所述之方法，其中所謂的化合物(I)具有下列的結構：其中X是各別獨立的-O、-NR或-S，其中的R是H或C₁-C₁₀烷基，Y是各別獨立的-O和-S，n=6-50，R₁,R₂是各別獨立的H、烷基、取代的烷基、鏈烯基、取代的鏈烯基、炔基鏈烯基、取代的炔基、芳基、取代芳基、雜芳基、取代的雜芳基、雜環基、取代的雜環基、環烷基、取代的環烷基、烷氧基、取代的烷氧基、硫代烷基、取代的硫代烷基、羥基、鹵素、氨基、酰氨基、羧基、-C(O)H、酰基、oxyacyl、氨基甲酸酯、磺酰基、磺酰胺、或硫原子。
根據申請專利範圍第12項所述之方法，其中所謂的化合物(I)具有下列的結構：其中n=10-25。
根據申請專利範圍第12項所述之方法，其中的害蟲為線蟲或生長於土壤中的細菌。
一種組合物，包括： (I)一化合物，該化合物具有下列特性：(a)具有殺蟲活性；(b)LTQ Orbitrap XL混合型傅立葉變換質譜儀測得的分子量約950-1450；(c)¹H NMR δ值為5.22(sext,1H)、2.62(dd,1H)、2.53(dd,1H)和1.31(d,3H)；(d)¹³C NMR δ值為169.2、67.6、40.9和19.8；(e)具有-(-O-CHCH₃-CH₂-CO-)_n-的結構，其中n=6-50；(f)可取自色桿菌(Chromobacterium)的菌種；及(II)也可另選其他的殺菌和殺蟲物質。
一種方法，該方法所含的化合物(i)具有殺蟲毒性；(ii)LTQ Orbitrap XL混合型傅立葉變換質譜儀測得的分子量約950-1450；(iii)¹H NMR δ值為5.22(sext,1H)、2.62(dd,1H)、2.53(dd,1H)和1.31(d,3H)(d)¹³C NMR δ值為169.2、67.6、40.9和19.8；(iv)具有-(-O-CHCH₃-CH₂-CO-)_n-的結構，其中n=6-50，和(v)可取自色桿菌(Chromobacterium)的菌種，而含有：(A)將色桿菌(Chromobacterium)的菌株於全細胞培養液中，在足以生成下列化合物的條件下加以培養；(B)於(A)中自上述的全細胞培養液析離出此化合物。
一種具有穩定性的生物殺蟲劑成份，包括有：(a)色桿菌(Chromobacterium)菌種的濾液、上清液、提取物或來自前述物具有殺蟲活性的物質；及(b)日曬保護劑，其中所謂的日曬保護劑為木質素和/或苯甲酸的鹽類物質。
根據申請專利範圍第18項所述之成份，其中苯甲酸的鹽類物質係選自含有下列成份的物質族群，即鈉、鉀、鈣、鎂及其組合物和/或本文提及選自含鈉、鉀、鈣、鎂及其組合物中和離子等木質素磺酸鹽的木質素鹽類物質。
根據申請專利範圍第18項所述之成份，其中所謂的色桿菌為Chromobacterium substugae。
根據申請專利範圍第18項所述之成份，其中所謂的色桿菌含量至少約5%，和/或日曬保護劑的含量至少約5%。
一種具有成份穩定功能之方法，係含有生物殺蟲劑可避免物理解離和活性損失，其中所謂的生物殺蟲劑為色桿菌(Chromobacterium)，此生物殺蟲劑成份具有穩定功能的劑量，可用於避免因為日曬引發的物理解離和活性損失。
一種選自含有苯甲酸鹽類和木質素磺酸鹽的穩定劑成份，係用於生物殺蟲劑成份的製造，其中所謂的成份具有穩定性可避免因為日曬而引發物理解離和活性損失。