JP6199872B2 - クロモバクテリウム(Chromobacterium)配合物、組成物、代謝産物、およびそれらの使用 - Google Patents
クロモバクテリウム(Chromobacterium)配合物、組成物、代謝産物、およびそれらの使用 Download PDFInfo
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Description
2000年、USDAのMartin博士と彼女の同僚は、メリーランドの森林土壌から紫着色細菌(PRAA4−1)を単離した(Martin et al.,2007a)。初期スクリーニングにおいて、彼女たちは、この細菌がコロラドハムシ(Colorado potato beetle)および他の昆虫有害生物に対して毒性であることを発見した(Martin et al.,2007b)。この運動性の、グラム陰性菌はクロモバクテリウム(Chromobacterium)の新たな種、クロモバクテリウムサブスチュガエ種nov(Chromobacterium substugae sp.nov)として同定された(Martin et al.,2007c)。それは通性好気性、運動性の、極鞭毛を有するグラム陰性ベータプロテオバクテリウムである。25℃においてL−寒天プレート上で2〜3日に形成されるコロニーは初期にはクリーム色であり、次の24時間中に徐々に薄紫色〜濃紫色に変わる。PRAA4−1のコロニーは、25℃での最適状態、pH6.5〜8.0、および0〜1.5%(w/v)NaClでペプトンベース培地において十分増殖する(Martin et al.,2007a)。
テトラニカスウルティカエ(Tetranychus urticae)(2スポットハダニ)は四翅(Tetranychidae)科のメンバーである。ハダニはおそらく、観賞植物の最も重大なコダニ有害生物である。それらはさらに、180種を超える温室および野外作物において相当なダメージを引き起こす。さらにこれらのコダニは、防除するのが最も困難な節足動物有害生物の中にあり、化学物質に対する耐性は急速に発達し得る(Stamps and Osborne 2009,Osborne,Ehler and Nechols,1999)。
ムスカドメスティカ(Musca domesitca)(イエバエ)は、イエバエ(Muscidae)科のメンバーである。この科は、国内および世界中で経済的問題であると考えられている。イエバエ(Muscidae)科の他のメンバーには、フェイスフライ、サシバエ、およびツノサシバエがある。それらは厄介者と考えられ、ヒトおよび動物疾患の媒介動物である。廃棄物および排出物、ならびにヒトおよび食物における、それらの移動および捕食の習性によって、それらは病原性生物の移動に理想的な作用因子となる。この種は動物に対する有害生物である可能性もあり、開口状態の創傷を介して疾患を伝染させる可能性がある。
スポットウイングキイロショウジョウバエ、キイロショウジョウバエスズキ(Drosophila suzukii)は、米国内で果樹および野菜栽培場への近年の侵入者である。それは、よく知られている関連種、ドロソフィラメラノガスター(Drosophila melanogaster)および他のキイロショウジョウバエ属(Drosophila)より一層破壊的である。キイロショウジョウバエスズキ(D.suzukii)は無傷な果樹および野菜を捕食し、それにダメージを与えることができ、一方で他のキイロショウジョウバエ属(Drosophila)は腐敗した植物材料のみを捕食するからである。
ハナバエ(Anthomyidae)科の根蛆虫は幾つか異なる植物の根を捕食する。キャベツ根蛆虫は、キャベツ、カリフラワー、ブロッコリー、および芽キャベツに影響を与える。(このグループの野菜は「アブラナ属作物」としても知られる)。ニンジン、タマネギ、および他の野菜作物に影響を与える、異なるタイプの根蛆虫も存在する。アブラナ属作物は寒冷期の野菜なので、キャベツ根蛆虫は米国の北部領域でより一層顕著である。それらは土壌下で孵化および捕食するため防除するのが困難であり、したがって、発育阻害または萎えた葉に気付いたとき、それらがそこに存在することを知るのみであり得る。
ミザスペルシカエ(Myzus persicae)、(モモアカアブラムシ)は、アリマキ科(Aphididae family)のメンバーである(US20110054022参照)。その一般名によって明らかなように、モモアカアブラムシは広範囲の果樹、野菜および観賞植物の有害生物であり、世界中に存在する。これらの昆虫は非常に有害である。それらは植物し部の捕食による直接ダメージを引き起こすだけでなく、プラムポックスウイルスの潜在的ベクター、果樹の変形および変色を引き起こすSharka病の原因物質でもあるからである。結果として、内寄生された樹木は根絶しなければならない。様々な殺有害生物剤でこれらの有害生物を防除するための、幾つかの試みがなされている。しかしながら、耐性は発達することが多い。
バクテリセラコッケレリ(Bactericera cockerelli)、(ジャガイモシストセンチュウ)はトガリキジラミ(Triozidae)科のメンバーであり、グラム陰性菌の外寄生を介したゼブラチップ病の原因物質である。それは北アメリカに固有であるが、それはニュージーランドでも見られている(www.biosecurity.govt.nz/files/pests/potato-tomato-psyllid/psyillid-factsheet.pdf)。ジャガイモシストセンチュウは一般に、ナス科宿主(トマトおよびジャガイモなど)において繁殖する。しかしながら、それらはトウガラシ、チリ、ナス、サツマイモ、ポロポロ(poroporo)、タマリロ(tamarillo)およびサンザシなどの他の植物においても見られている。
アルフィトビウスジアペリヌス(Alphitobius diaperinus)は家禽産業において深刻な有害生物であり、ゴミムシダマシ科(Tenebrionidae family)のメンバーである。Bt株PS86B1は、アルフィトビウス(Alphitobius)に対して活性を有することが報告されている(Hickle et al.への米国特許第5,100,665号)。Btテネブリオニス(tenebrionis)も、この甲虫の幼虫に対して活性を有し得る(米国特許第5,244,660号)。リタービートルおよび他の数種の鞘翅目は、相当な経済的損失をもたらすニワトリおよびシチメンチョウの原生動物、細菌、およびウイルス性疾患のベクターとして働く。リタービートルは、サルモネラエンテリカ(S.enterica)血清型腸炎菌などのより病原性のある品種を含めた、病原性サルモネラ種の相当な保菌者として働く。問題は、サルモネラのような病原性生物に汚染された家禽類が、ヒトの健康を脅かすことである。これらの甲虫は、鶏舎の残物、木材、スタイロフォーム(Styrofoam)、ファイバーグラス、およびポリスチレン製断熱パネルに存在する。幼虫および成虫甲虫は、鳥類排泄物とニワトリ飼料として使用する穀物の両方を食べて育つ。鶏舎内でのこれらの巨大甲虫集団およびそれらの多様な習性によって、ニワトリが保有するサルモネラを根絶するのがさらに難しくなる。重度のリタービートル外寄生の最中、または新たなニワトリ集団を確立する前に、多数の化学物質殺虫剤を用いた残物または塵のいずれの頻繁な改変も、この有害生物を防除するのに完全に有効ではない。
ジムシ(シクロセファラルリダ(Cyclocephala lurida))、ミナミメンガタカメムシ、リゾトログスマジャリス(Rhizotrogus majalis)、マメコガネ幼虫、ポピラジャポニカ(Popilla japonica)、キンケクチブトゾウムシ幼虫、オティオリンクスサルカタス(Otiorhynchus sulcatus)、セマダラコガネ幼虫、アノマラオリエンタリス(Anomala orientalis)などのジムシ科、コガネムシ科(Scarabaiedae family)のメンバーは、芝生および牧草地に外寄生することが分かっている。成虫コガネムシは、観賞植物、および多数の作物に外寄生することが世界中で分かっている。様々な殺有害生物剤が試験されており、化学物質殺有害生物剤、線虫用(例えば、米国特許第7,641,573号参照)、およびバチルスチューリンジエンシス(Bacillus thuringiensis)用(米国特許第5,185,158号参照)、ペロモン、ならびにキャットニップ(catnip)およびチベス(chives)などの天然忌避剤を含む。
バイオプラスチックは、植物デンプンおよび微生物種などの再生可能資源から合成される、プラスチックの形態として定義される。開発中の幾つかの生分解性プラスチック材料には、ポリヒドロキシアルカノエート(PHA)、ポリ乳酸、脂肪族ポリエステル、多糖、ならびにこれらのコポリマーおよび/またはブレンドがある。特にPHAは、ポリヒドロキシブチレート、ポリヒドロキシブチレートco−ヒドロキシバレレート(PHBV)、ポリヒドロキシブチレートco−ヒドロキシヘキサノエート(PHBHx)およびポリヒドロキシブチレートco−ヒドロキシオクトノエート(PHBO)などの幾つかのポリマーエステルを含む。ポリ3−ヒドロキシ酪酸(PHB)は、最も一般的な天然微生物PHAである。ポリヒドロキシアルカノエートは100%生分解性ポリマーである。それらは、ポリプロピレンのような様々な合成サーモプラスチックと類似した性質を有しているので、PHAはそれらの適所で使用することができる。さらにPHAは、土壌、湖水、下水および海水中で微生物によって、好気性条件下において水と二酸化炭素に、および嫌気性条件下においてメタンに完全に分解される。鎖中の炭素原子の数に応じて、PHAは2つの群、3〜5個の炭素原子からなる単鎖長(SCL)、および6〜14個の炭素原子からなる中鎖長(MCL)に分類されている(Khanna S,Srivastava AK.2005)。これらの差は主に、特定範囲の炭素長の3HAを許容し得るPHAシンターゼの基質特異性が原因である。他のよく知られているPHASCLは、4個および5個の炭素モノマー単位を含む、コポリマー、ポリ(3−ヒドロキシブチレート−co−3−ヒドロキシバレレート)P(3HB−co−3HV)である。これらのモノマー単位の割合は変わる可能性があり、これがポリマーの物理的性質に影響を与える。すなわち、3HV単位の割合が増大すると脆弱性が低下する。
リグニンは、高等植物の木部構造の主要構成要素である。処理済リグニンは、木材パルプ反応の副産物として得られる。リグニン産物には、例えば、亜硫酸塩、硫酸塩、およびアルカリ廃液から得ることができる、リグニンスルホン酸塩、アルカリリグニン、およびオキシリグニンがある(Snook,1982,Handbook for Pulp & Paper Technologists,TAPPI,Atlanta)。
安息香酸ナトリウムは、食品調製における抗菌剤として、様々な配合物において使用されている。例えば米国特許第6,599,514号は、抗真菌組成物全体の抗真菌活性に相乗効果をもたらす、抗真菌剤と食品添加剤を含む相乗的抗真菌組成物を開示する。米国特許第6,599,514号中に開示された食品添加剤は、ソルビン酸とソルビン酸塩、安息香酸と安息香酸塩、ヒドロキシ安息香酸、二酸化硫黄と亜硫酸塩、ビフェニルと誘導体、亜硝酸塩、硝酸塩、乳酸、乳酸塩、クエン酸とクエン酸塩、酒石酸と酒石酸塩、オルトリン酸とオルトリン酸塩、リンゴ酸塩、アジピン酸、コハク酸、1,4−ヘプトノラクトン、ニコチン酸、クエン酸三アンモニウム、クエン酸鉄アンモニウム、カルシウム2ナトリウムEDTA、グリセロール、ジ−、トリ−およびポリリン酸塩、脂肪酸(E470)、脂肪酸のモノ−およびジグリセリド(E471)、脂肪酸のモノ−およびジグリセリドのエステル、炭酸塩、グルコン酸塩、塩素(E92S)、ヘキサメタリン酸ナトリウム、ブチル化ヒドロキシアニソール(BHA)、ブチル化ヒドロキシトルエン(BHT)(E321)、t−ブチルヒドロキノン(THBQ)、没食子酸プロピル、ヘプトン酸カルシウム、フィット酸カルシウム、ジエチルエーテル、EDTA、2ナトリウム2水素EDTA、酢酸エチル、グリセロールモノ−、ジ−およびトリアセテート、グリシン、オキシステアリン、プロパン−1,2−ジオールおよびプロパン−2−01およびヘプトン酸ナトリウムを含んでいた。
[1]調節が望まれる場所における、少なくとも一種のダニ有害生物(Acari pests)および/またはイエバエ科(Muscidae)、キイロショウジョウバエ科(Drosophilidae)、ハナバエ科(Anthomyidae)、アリマキ科(Aphididae)、トガリキジラミ科(Triozidae)、ゴミムシダマシ科(Tenebrionidae)、コガネムシ科(Scarabaiedae)に属する少なくとも一種の昆虫有害生物の外寄生(infestation)を調節するための方法であって、上記位置において節足動物および/またはイエバエ科(Muscidae)、キイロショウジョウバエ科(Drosophilidae)、ハナバエ科(Anthomyidae)、アリマキ科(Aphididae)、トガリキジラミ科(Triozidae)、ゴミムシダマシ科(Tenebrionidae)、コガネムシ科(Scarabaiedae)に属する1つまたは複数の昆虫有害生物の外寄生を調節するのに有効である量の、(a)クロモバクテリウム(Chromobacterium)種株の上清、濾過物および/または抽出物、および/または上記上清、濾過物および/または抽出物由来の1つもしくは複数の代謝産物、ならびに(b)殺ダニ剤および/またはイエバエ科(Muscidae)、キイロショウジョウバエ科(Drosophilidae)、ハナバエ科(Anthomyidae)、アリマキ科(Aphididae)、トガリキジラミ科(Triozidae)、ゴミムシダマシ科(Tenebrionidae)、コガネムシ科(Scarabaiedae)に属する1つもしくは複数の昆虫有害生物に対して有効である殺虫剤である別の殺有害生物剤物質を施用することを含む方法。
[2]調節が望まれる場所が植物上、植物種子または土壌中である、上記[1]に記載の方法。
[3]上記ダニの外寄生がコダニの外寄生である、上記[1]に記載の方法。
[4]上記コダニの外寄生が四翅(Tetranychus)種の外寄生である、上記[1]に記載の方法。
[5]上記昆虫有害生物の外寄生がイエバエ(Musca)種、ミザス(Myzus)種、バクテリセラ(Bactericera)種、シクロセファラ(Cyclocephala)種、またはアルフィトビウス(Alphitobius)種、キイロショウジョウバエ(Drosophila)種、デリア(Delia)種、リゾトログス(Rhizotrogus)種、ポピラ(Popilla)種、アノマラ(Anomala)種またはオティオリンクス(Otiorhynchus)種の外寄生である、上記[1]に記載の方法。
[6]上記クロモバクテリウム(Chromobacterium)種がクロモバクテリウムサブスチュガエ(Chromobacterium substugae)Nov株である、上記[1]に記載の方法。
[7]上記昆虫有害生物の外寄生がムスカドメスティカス(Musca domesitcas)、キイロショウジョウバエスズキ(Drosophila suzukii)、デリアラジカム(Delia radicum)、ミザスペルシカエ(Myzus persicae)、バクテリセラコッケレリ(Bactericera cockerelli)、アルフィトビウスジアペリヌスキシ(Alphitobius diaperinusxi)、シクロセファラルリダ(Cyclocephala lurida)、リゾトログスマジャリス(Rhizotrogus majalis)、ポピラジャポニカ(Popilla japonica)、オティオリンクスサルカタス(Otiorhynchus sulcatus)、アノマラオリエンタリス(Anomala orientalis)の外寄生である、上記[1]に記載の方法。
[8]上記代謝産物が、
(a)液体クロマトグラフィー/質量分析法(LC/MS)により決定して約840〜890の分子量を有し、(ii)約δ8.89、8.44、8.24、8.23、7.96、7.63、6.66、5.42、5.36、5.31、5.10、4.13、4.07、4.05、3.96、3.95、3.88、3.77、3.73、3.51、3.44、3.17、2.40、2.27、2.11、2.08、2.03、2.01、1.97、1.95、1.90、1.81、1.68、1.63、1.57、1.53、1.48、1.43、1.35、1.24、1.07、1.02、0.96、0.89、0.88、0.87、0.80の1HNMR値を有し、(iii)約δ173.62、172.92、172.25、172.17、171.66、171.28、170.45、132.13、130.04、129.98、129.69、129.69、125.48、98.05、70.11、69.75、68.30、68.25、64.34、60.94、54.54、52.82、49.72、48.57、45.68、40.38、39.90、38.18、36.60、31.98、31.62、31.58、29.53、28.83、27.78、24.41、23.06、22.09、20.56、19.31、18.78、17.66、15.80の13CNMR値を有する化合物、
(b)以下の(i)クロモバクテリウム(Chromobacterium)種から入手可能である、(ii)有害生物に対して毒性がある、(iii)液体クロマトグラフィー/質量分析法(LC/MS)により決定して約850〜900の分子量を有する、(iv)0.5mL/分の流量および210nmのUV検出において勾配溶媒系(0〜20分、90〜0%水性CH3CN、20〜24分、100%CH3CN、24〜27分、0〜90%水性CH3CN、27〜30分、90%水性CH3CN)で水:アセトニトリル(CH3CN)を使用し、逆相C−18HPLC(Phenomenex、Luna5μC18(2)100A、100×4.60mm)カラムにおいて約7〜12分の高圧液体クロマトグラフィー(HPLC)保持時間を有する、特性を有する化合物、
(c)構造##STR001##を有する化合物または殺有害生物剤として許容されるその塩もしくは立体異性体、
(式中、Rは−H、1、2、3、4、5、6、7、8または9つのアルキル部分、アリールまたはアリールアルキル部分を含有する低級鎖アルキル、置換低級アルキルであり、XはO、NH、NRまたはSであり、nは0、1、2、3、4、5、6、7、8または9であり、R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11は各々独立にHであり、同じであるかまたは異なっており、独立にアミノ酸側鎖部分またはアミノ酸側鎖誘導体、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環、置換複素環、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アルコキシ、置換アルコキシ、チオアルキル、置換チオアルキル、ヒドロキシ、ハロゲン、アミノ、アミド、カルボキシル、−C(O)H、アシル、オキシアシル、カルバメート、スルホニル、スルホンアミド、またはスルフリルである)
(d)構造##STR001a##を有する化合物、
(式中、Rは−H、1、2、3、4、5、6、7、8または9つのアルキル部分、アリールまたはアリールアルキル部分を含有する低級鎖アルキル、置換低級アルキルであり、XはO、NH、NRまたはSであり、R2a、R2bは−H、アルキル、低級アルキル、置換アルキルおよび置換低級アルキルからなる群から独立に選択され、R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11は各々独立にHであり、同じであるかまたは異なっており、独立にアミノ酸側鎖部分またはアミノ酸側鎖誘導体、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環、置換複素環、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アルコキシ、置換アルコキシ、チオアルキル、置換チオアルキル、ヒドロキシ、ハロゲン、アミノ、アミド、カルボキシル、−C(O)H、アシル、オキシアシル、カルバメート、スルホニル、スルホンアミド、またはスルフリルである)
(e)構造##STR001b##を有する化合物、
(式中、Rは−H、1、2、3、4、5、6、7、8または9つのアルキル部分、アリールまたはアリールアルキル部分を含有する低級鎖アルキル、置換低級アルキルであり、XはO、NH、NRまたはSであり、nは0、1、2、3、4、5、6、7、8または9であり、R2a、R2bは−H、アルキル、低級アルキル、置換アルキルおよび置換低級アルキルからなる群から独立に選択され、R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11は各々独立にHであり、同じであるかまたは異なっており、独立にアミノ酸側鎖部分またはアミノ酸側鎖誘導体、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環、置換複素環、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アルコキシ、置換アルコキシ、チオアルキル、置換チオアルキル、ヒドロキシ、ハロゲン、アミノ、アミド、カルボキシル、−C(O)H、アシル、オキシアシル、カルバメート、スルホニル、スルホンアミド、またはスルフリルである)
(f)構造##STR001c##を有する化合物、
(式中、Rは−H、1、2、3、4、5、6、7、8または9つのアルキル部分を含有する低級鎖アルキル、アリールまたはアリールアルキル部分、置換低級アルキルであり、XはO、NH、NRまたはSであり、nは0、1、2、3、4、5、6、7、8または9であり、R2a、R2bは−H、アルキル、低級アルキル、置換アルキルおよび置換低級アルキルからなる群から独立に選択され、R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11は各々独立にHであり、同じであるかまたは異なっており、独立にアミノ酸側鎖部分またはアミノ酸側鎖誘導体、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環、置換複素環、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アルコキシ、置換アルコキシ、チオアルキル、置換チオアルキル、ヒドロキシ、ハロゲン、アミノ、アミド、カルボキシル、−C(O)H、アシル、オキシアシル、カルバメート、スルホニル、スルホンアミド、またはスルフリルである)
(g)以下の(i)クロモバクテリウム(Chromobacterium)種から入手可能である、(ii)有害生物に対して毒性がある、(iii)液体クロマトグラフィー/質量分析法(LC/MS)により決定して約325〜360の分子量を有する、(iv)0.5mL/分の流量および210nmのUV検出において勾配溶媒系(0〜20分、90〜0%水性CH3CN、20〜24分、100%CH3CN、24〜27分、0〜90%水性CH3CN、27〜30分、90%水性CH3CN)で水:アセトニトリル(CH3CN)を使用し、逆相C−18HPLC(Phenomenex、Luna5μC18(2)100A、100×4.60mm)カラムにおいて約8〜14分の高圧液体クロマトグラフィー(HPLC)保持時間を有する、特性を有する化合物、
(h)以下の(i)クロモバクテリウム(Chromobacterium)種から入手可能である、(ii)有害生物に対して毒性がある、(iii)液体クロマトグラフィー/質量分析法(LC/MS)により決定して約315〜350の分子量を有する、(iv)0.5mL/分の流量および210nmのUV検出において勾配溶媒系(0〜20分、90〜0%水性CH3CN、20〜24分、100%CH3CN、24〜27分、0〜90%水性CH3CN、27〜30分、90%水性CH3CN)で水:アセトニトリル(CH3CN)を使用し、逆相C−18HPLC(Phenomenex、Luna5μC18(2)100A、100×4.60mm)カラムにおいて約10〜15分の高圧液体クロマトグラフィー(HPLC)保持時間を有する、特性を有する化合物からなる群から選択される化合物である、上記[1]に記載の方法。
[9]上記代謝産物が、
(式中、Rは−H、1、2、3、4、5、6、7、8または9つのアルキル部分、アリールまたはアリールアルキル部分を含有する低級鎖アルキル、置換低級アルキル、ハロゲンであり、R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9は各々独立にHであり、同じであるかまたは異なっており、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環、置換複素環、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アルコキシ、置換アルコキシ、チオアルキル、置換チオアルキル、ヒドロキシ、ハロゲン、アミノ、アミド、カルボキシル、−C(O)H、アシル、オキシアシル、カルバメート、スルホニル、スルホンアミド、またはスルフリルである)構造を有するビオラセイン(violaecin)誘導体である、上記[8]に記載の方法。
[10]上記代謝産物がビオラセイン、デオキシビオラセインおよびクロマミドAからなる群から選択される、上記[8]に記載の方法。
[11]上記位置において節足動物および/またはイエバエ科(Muscidae)、アリマキ科(Aphididae)、トガリキジラミ科(Triozidae)、コガネムシ科(Scarabaeidae)またはゴミムシダマシ科(Tenebrionidae)に属する1つまたは複数の昆虫有害生物の外寄生を調節するのに有効である、(a)クロモバクテリウム(Chromobacterium)種株の上清、濾過物および/または抽出物、および/または上記上清、濾過物および/または抽出物由来の1つもしくは複数の代謝産物、ならびに(b)殺ダニ剤および/またはイエバエ科(Muscidae)、キイロショウジョウバエ科(Drosophilidae)、ハナバエ科(Anthomyidae)、アリマキ科(Aphididae)、トガリキジラミ科(Triozidae)、ゴミムシダマシ科(Tenebrionidae)、コガネムシ科(Scarabaiedae)に属する1つもしくは複数の昆虫有害生物に対して有効である可能性がある殺虫剤である別の殺有害生物剤物質を活性成分として含む殺有害生物剤の組合せ。
[12]植物における有害生物外寄生を調節するための方法であって、上記有害生物外寄生を調節するのに有効である量の、
(I)(a)殺有害生物剤活性を有し、
(b)LTQ Orbitrap XLハイブリッド型フーリエ変換質量分析計により決定して約950〜1450の分子量を有し、
(c)5.22(sext、1H)、2.62(dd、1H)、2.53(dd、1H)、および1.31(d、3H)の1HNMRδ値を有し、(d)169.2、67.6、40.9、および19.8の13CNMRδ値を有し、
(d)構造−(−O−CHCH3−CH2−CO−)n−(式中、n=6〜50である)を含み、
(e)クロモバクテリウム(Chromobacterium)種から入手可能である化合物、および
(II)場合によっては別の殺有害生物剤物質を、植物および/またはその種子および/または上記植物の成長に使用する培養基に施用することを含む方法。
[13]化合物(I)が、
(式中、Xは独立に−O、−NR、または−Sであり、RはHまたはC1〜C10アルキルであり、Yは独立に−O、−Sであり、n=6〜50であり、R1、R2は各々独立にH、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環、置換複素環、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アルコキシ、置換アルコキシ、チオアルキル、置換チオアルキル、ヒドロキシ、ハロゲン、アミノ、アミド、カルボキシル、−C(O)H、アシル、オキシアシル、カルバメート、スルホニル、スルホンアミド、またはスルフリルである)構造を有する、上記[12]に記載の方法。
[14]化合物(I)が、
(式中、n=10〜25である)構造を有する、上記[12]に記載の方法。
[15]有害生物が線虫または土壌媒介菌である、上記[12]に記載の方法。
[16](I)(a)殺有害生物剤活性を有し、
(b)LTQ Orbitrap XLハイブリッド型フーリエ変換質量分析計により決定して約950〜1450の分子量を有し、
(c)5.22(sext、1H)、2.62(dd、1H)、2.53(dd、1H)、および1.31(d、3H)の1HNMRδ値を有し、(d)169.2、67.6、40.9、および19.8の13CNMRδ値を有し、
(e)構造−(−O−CHCH3−CH2−CO−)n−(式中、n=6〜50である)を含み、
(f)クロモバクテリウム(Chromobacterium)種から入手可能である化合物と、
(II)場合によっては別の抗菌または殺有害生物剤物質を含む組合せ。
[17](i)殺有害生物剤活性を有し、(ii)LTQ Orbitrap XLハイブリッド型フーリエ変換質量分析計により決定して約950〜1450の分子量を有し、(iii)5.22(sext、1H)、2.62(dd、1H)、2.53(dd、1H)、および1.31(d、3H)の1HNMRδ値を有し(iv)169.2、67.6、40.9、および19.8の13CNMRδ値を有し、(iv)構造−(−O−CHCH3−CH2−CO−)n−(式中、n=6〜50である)を含み、かつ(v)クロモバクテリウム(Chromobacterium)種から入手可能である化合物を入手するための方法であって、
(A)上記化合物を生成するのに十分な条件下において全細胞培養ブロス中で、クロモバクテリウム(Chromobacterium)種株を培養すること、
(B)(A)で生成した上記化合物を上記全細胞培養ブロスから単離することを含む方法。
[18](a)クロモバクテリウム(Chromobacterium)種、濾過物、上清、抽出物、またはそれらに由来し殺有害生物剤活性を有する殺有害生物剤活性物質および
(b)リグニン塩および/または安息香酸塩である太陽光防御物質
を含む、安定状態の生物学的殺有害生物剤組成物。
[19]上記安息香酸塩がナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、およびそれらの組合せからなる群から選択され、および/または上記リグニン塩がナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、およびそれらの組合せの中和イオン由来のリグニンスルホン酸塩から選択される、上記[1]に記載の組成物。
[20]上記クロモバクテリウム(Chromobacterium)種がクロモバクテリウムサブスチュガエ(Chromobacterium substugae)である、上記[18]に記載の組成物。
[21]上記クロモバクテリウム(Chromobacterium)種が少なくとも約5%の量で存在する、および/または上記太陽光防御物質が少なくとも約5%の量で存在する、上記[18]に記載の組成物。
[22]太陽光への露出が原因の物理的分離および活性消失に対して生物殺有害生物剤を含む組成物を安定化させるための方法であって、上記生物殺有害生物剤がクロモバクテリウム(Chromobacterium)種であり、太陽光への露出が原因の物理的分離および活性消失に対して生物学的殺有害生物剤組成物を安定化するのに有効な量の安定剤を、上記生物学的殺有害生物剤組成物に施用することを含む方法。
[23]安定剤およびリグノスルホン酸塩を含む組成物を生成するための、安息香酸塩およびリゴンスルホン酸塩および生物殺有害生物剤からなる群から選択される安定剤の使用であって、得られた上記組成物を太陽光への露出が原因の物理的分離および活性消失に対して安定化させる使用。
クロモバクテリウムピスシンエア(Chromobacterium piscinae)、クロモバクテリウムシュードビオラセム(C.pseudoviolaceum)、クロモバクテリウムサブスチュガエ(Chromobacterium substugae)、およびより詳細にはクロモバクテリウムサブスチュガエ種nov(Chromobacterium substugae sp.nov)株、およびさらにより詳細には米国特許第7,244,607号中に記載されたNRRLB−30655の確認済みの特性を有するクロモバクテリウムサブスチュガエ種nov(Chromobacterium substugae sp.nov)株だけには限られないが、これらを含めた、クロモバクテリウム(Chromobacterium)種株、特にビオラセイン産生株の上清、濾過物および/または抽出物、および/または前記上清、濾過物および/または抽出物由来の1つまたは複数の代謝産物を含むかまたはそれらを使用する、1つまたは複数のダニ(Acari)(節足動物)、イエバエ科(Muscidae)、キイロショウジョウバエ科(Drosophilidae)、ハナバエ科(Anthomyidae)、アリマキ科(Aphididae)、トガリキジラミ科(Triozidae)、ゴミムシダマシ科(Tenebrionidae)、および/またはコガネムシ科(Scarabaiedae)有害生物の外寄生の調節のための組成物および方法を提供する。
(A)構造##STR001##を有する化合物または殺有害生物剤として許容されるその塩もしくは立体異性体、
(式中、Rは−H、1、2、3、4、5、6、7、8または9つのアルキル部分、アリールまたはアリールアルキル部分を含有する低級鎖アルキル、置換低級アルキルであり、XはO、NH、NRまたはSであり、nは0、1、2、3、4、5、6、7、8または9であり、R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11は各々独立にHであり、同じであるかまたは異なっており、独立にアミノ酸側鎖部分またはアミノ酸側鎖誘導体、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環、置換複素環、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アルコキシ、置換アルコキシ、チオアルキル、置換チオアルキル、ヒドロキシ、ハロゲン、アミノ、アミド、カルボキシル、−C(O)H、アシル、オキシアシル、カルバメート、スルホニル、スルホンアミド、またはスルフリルである)
(B)構造##STR001a##を有する化合物、
(式中、Rは−H、1、2、3、4、5、6、7、8または9つのアルキル部分、アリールまたはアリールアルキル部分を含有する低級鎖アルキル、置換低級アルキルであり、XはO、NH、NRまたはSであり、R2a、R2bは−H、アルキル、低級アルキル、置換アルキルおよび置換低級アルキルからなる群から独立に選択され、R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11は各々独立にHであり、同じであるかまたは異なっており、独立にアミノ酸側鎖部分またはアミノ酸側鎖誘導体、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環、置換複素環、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アルコキシ、置換アルコキシ、チオアルキル、置換チオアルキル、ヒドロキシ、ハロゲン、アミノ、アミド、カルボキシル、−C(O)H、アシル、オキシアシル、カルバメート、スルホニル、スルホンアミド、またはスルフリルである)
(C)構造##STR001b##を有する化合物、
(式中、Rは−H、1、2、3、4、5、6、7、8または9つのアルキル部分、アリールまたはアリールアルキル部分を含有する低級鎖アルキル、置換低級アルキルであり、XはO、NH、NRまたはSであり、nは0、1、2、3、4、5、6、7、8または9であり、R2a、R2bは−H、アルキル、低級アルキル、置換アルキルおよび置換低級アルキルからなる群から独立に選択され、R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11は各々独立にHであり、同じであるかまたは異なっており、独立にアミノ酸側鎖部分またはアミノ酸側鎖誘導体、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環、置換複素環、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アルコキシ、置換アルコキシ、チオアルキル、置換チオアルキル、ヒドロキシ、ハロゲン、アミノ、アミド、カルボキシル、−C(O)H、アシル、オキシアシル、カルバメート、スルホニル、スルホンアミド、またはスルフリルである)
(D)構造##STR001c##を有する化合物、
(式中、Rは−H、1、2、3、4、5、6、7、8または9つのアルキル部分を含有する低級鎖アルキル、アリールまたはアリールアルキル部分、置換低級アルキルであり、XはO、NH、NRまたはSであり、nは0、1、2、3、4、5、6、7、8または9であり、R2a、R2bは−H、アルキル、低級アルキル、置換アルキルおよび置換低級アルキルからなる群から独立に選択され、R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11は各々独立にHであり、同じであるかまたは異なっており、独立にアミノ酸側鎖部分またはアミノ酸側鎖誘導体、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環、置換複素環、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アルコキシ、置換アルコキシ、チオアルキル、置換チオアルキル、ヒドロキシ、ハロゲン、アミノ、アミド、カルボキシル、−C(O)H、アシル、オキシアシル、カルバメート、スルホニル、スルホンアミド、またはスルフリルである)だけには限られないが、これらを含めた化合物であってもよい。
(式中、Rは−H、1、2、3、4、5、6、7、8または9つのアルキル部分、アリールまたはアリールアルキル部分を含有する低級鎖アルキル、置換低級アルキル、ハロゲンであり、R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9は各々独立にHであり、同じであるかまたは異なっており、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環、置換複素環、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アルコキシ、置換アルコキシ、チオアルキル、置換チオアルキル、ヒドロキシ、ハロゲン、アミノ、アミド、カルボキシル、−C(O)H、アシル、オキシアシル、カルバメート、スルホニル、スルホンアミド、またはスルフリルである)構造を有することができる。
前記植物における外寄生を調節するのに有効である量の、
(I)(a)殺有害生物剤および/または抗菌活性を有し、
(b)LTQ Orbitrap XLハイブリッド型フーリエ変換質量分析計により決定して約950〜1450の分子量を有し、
(c)5.22(sext、1H)、2.62(dd、1H)、2.53(dd、1H)、および1.31(d、3H)の1HNMRδ値を有し、169.2、67.6、40.9、および19.8の13CNMRδ値を有し、
(d)構造−(−O−CHCH3−CH2−CO−)n−(式中、n=6〜50である)を含み、
(e)クロモバクテリウム(Chromobacterium)種から入手可能である化合物、および
(II)場合によっては別の殺有害生物剤物質を、植物および/またはその種子および/または前記植物の成長に使用する培養基に施用することを含む方法をさらに提供する。
(式中、Xは独立に−O、−NR、または−Sであり、RはHまたはC1〜C10アルキルであり、Yは独立に−O、−Sであり、n=6〜50であり、R1、R2は各々独立にH、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環、置換複素環、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アルコキシ、置換アルコキシ、チオアルキル、置換チオアルキル、ヒドロキシ、ハロゲン、アミノ、アミド、カルボキシル、−C(O)H、アシル、オキシアシル、カルバメート、スルホニル、スルホンアミド、またはスルフリルである)構造を有することができる。
前述のように生物殺有害生物剤は、クロモバクテリウム(Chromobacterium)種の確認済みの特性を有する生物、より詳細にはクロモバクテリウムサブスチュガエ(Chromobacterium substugae)株の確認済みの特性を有する生物、より詳細にはNRRLB−30655の確認済みの特性を有し得るクロモバクテリウムサブスチュガエ種nov(Chromobacterium substugae sp.nov)株、または代替的に任意の他の微生物を含む、またはその生物に由来する可能性がある。本発明の方法は、これらの生物を培養すること、およびこれらの生物の培養物からのこれらの化合物の単離によって、本発明の化合物および/または組成物を入手することを含む。
本明細書中に開示する組成物および方法において使用する前述の物質は、任意の形式で配合することができる。非制限的な配合物の例には、エマルジョン化可能濃縮物(EC)、湿潤性粉末(WP)、可溶性液体(SL)、エアロゾル、超低量濃縮溶液(ULV)、可溶性粉末(SP)、マイクロカプセル化物質、水中分散性顆粒剤、流動性物質(FL)、マイクロエマルジョン(ME)、ナノエマルジョン(NE)などがあるが、これらだけには限られない。本明細書中に記載する任意の配合物において、活性成分の割合は0.01%〜99.99%の範囲内である。
前述の組成物、培養物および上清および殺有害生物剤化合物は、殺有害生物剤として使用することができる。特に、前述の化合物または組成物は殺虫剤、(土壌媒介菌に対する)殺菌剤および抗線虫薬として使用することができる。具体的には、前述の方法を使用して防除することができる線虫には、メロイドジン(Meloidogyne)種、チレンコルヒンチャス(Tylenchorhynchus)種、ホプロライムス(Hoplolaimus)種、ヘリコティレンクス(Helicotylenchus)種、プラティレンクス(Pratylenchus)種、ヘテロデラ(Heterodera)種、グロボデラ(Globodera)種、トリコドルス(Trichodorus)種、パラトリコドルス(Paratrichodorus)種、キシフェネア(Xiphinema)種、およびクリコネマ(Criconema)種、特にメロイドジンインコグニタ(Meloidogyne incognita)(根瘤線虫)、ならびにグロボデラロストシエンシス(Globodera rostochiensis)およびグロボデラパイリダ(globodera pailida)(ジャガイモシストセンチュウ)、ヘテロデラグリシン(Heterodera glycines)(ダイズシストセンチュウ)、ヘテロデラスチャッチ(Heterodera schachtii)(ビートシストセンチュウ)、およびヘテロデラアビーナ(Heterodera avenae)(シリアルシストセンチュウ)を非制限的に含めた、根瘤、シスト、および病変線虫などの寄生線虫だけには限られないが、これらを含む。
[実施例]
以下の手順を、クロモバクテリウムサブスチュガエ(Chromobacterium substugae)の培養物から抽出した化合物の精製に使用する。
HPLCC−18カラム(Phenomenex、Luna10uC18(2)100A、250×10)、2.5mL/分の流量および210nmのUV検出において、水:アセトニトリル勾配溶媒系(0〜10分、80〜75%水性CH3CN、10〜45分、75〜60%水性CH3CN、45〜55分、60〜50%水性CH3CN、55〜65分、50〜100%水性CH3CN、65〜70分、100%CH3CN、55〜70分、0〜80%水性CH3CN)を使用することによって、クロマミドA(1)の精製を実施した。活性化合物クロマミドA(1)は23.19分の保持時間を有する。
質量分析による活性ピークの分析を、LCQ DECA XPplus質量分析計(Thermo Electron Corp.,San Jose,CA)においてフルスキャンモード(m/z 100〜1500Da)でポジティブとネガティブイオン化モードの両方を使用して、Thermo Finnigan LCQ Deca XP Plusエレクトロスプレー(ESI)装置で実施する。Thermo高性能液体クロマトグラフィー(HPLC)装置は、Finnigan Surveyor PDAおよび検出器、オートサンプラーおよび、MSポンプおよび4.6mm×100mmのLuna C18 5μ100Aカラム(Phenomenex)を備えていた。溶媒系は水(溶媒A)とアセトニトリル(溶媒B)からなっていた。移動相は10%溶媒Bで始まり、20分かけて100%溶媒Bまで直線的に増大し、次いで4分間保ち、最後に3分かけて10%溶媒Bに戻し、3分間保つ。流量は0.5mL/分である。注射体積は10μLであり、サンプルはオートサンプラーにおいて室温で保つ。LCおよび逆相クロマトグラフィーを利用して、LC−MSによって化合物を分析する。質量分析による本発明の化合物の分析を以下の条件下で行う。窒素ガスの流量は、それぞれシースおよび補助/スイープガスの流量に関して30および15arbで固定した。エレクトロスプレーイオン化は、5000Vに設定したスプレー電圧および35.0Vのキャピラリー電圧で実施した。キャピラリー温度は400℃に設定した。データはXcaliburソフトウェアで分析した。クロマミドA(1)はポジティブイオン化モードで860の分子量を有する。別の活性化合物Bに関するLC−MSクロマトグラムは、ポジティブイオン化モードで874の分子量を示唆する。ビオラセイン(2)およびデオキシビオラセイン(3)は、ポジティブイオン化モードでそれぞれ313および327の分子量を有していた。
NMR−NMRスペクトルをBruker600MHz勾配磁場型質量分析計で測定した。参照は内部標準物質テトラメチルシラン(TMS、0.00ppm)に設定する。アミノ酸の分析はHitachi8800アミノ酸アナライザーで実施した。
液相加水分解(6NHCL、1%フェノール、110℃、24時間、真空中)を使用することにより、クロマミドA(0.05mg)を加水分解した。冷却後、反応混合物は乾燥させ、加水分解産物は1.0mL体積までNorleu希釈バッファー中に溶かした。50μlのサンプルを分析用にイオン交換カラムに充填した。
凍結乾燥MBI−203を蒸留水と混合して、様々な濃度の全細胞ブロスの細胞を均等にした。非外寄生状態のマメ科植物、ファセオラスブルガリス(Phaseolus vulgaris)にはMBI−203を噴霧した。次いで噴霧した植物からリーフディスクを採取し、2スポットハダニ、テトラニカスウルティカエ(Tetranychus urticae)の食料源としてペトリ皿に置いた。10匹のコダニを各々の皿に置き、75°F、12:12(L:D)でインキュベートした。生存状態および死亡状態のコダニの評価は外寄生後1、3、および7日で記録した。1×CFDは、全細胞ブロスの細胞濃度に戻した凍結乾燥物質である(0.0103g凍結乾燥/mLdH2O)。結果は図3中に示す。
マリゴールド、センジュギク(Tagetes erecta)に2スポットハダニ、テトラニカスウルティカエ(Tetranychus urticae)を外寄生させた。配合製品(MBI−203)またはケノポジウムアンブロシオイデス(Chenopodium ambrosioides)(AgraQuest、Inc.,Davis、CAによりREQUIEM(登録商標)として販売)を外寄生状態の植物に施し、温度範囲約72〜85°Fで温室内に保った。サンプルを得るため、6cm2の葉表面を採取し、生存状態および死亡状態の若虫と未成熟虫の数を数えた。結果は表1中に示す。
TSSMまたはアバメクチン耐性TSSMを外寄生させたサヤインゲンに、約100gal/エーカーで0.5%、1%、2%、および4%v/v希釈の配合MBI−203を噴霧した。施用後9日で死亡率を評価した。結果は表2中に示す。
5つの従来化合物およびMBI−203成分の効力を、Florida Gulf Coast Research and Education Centerで野生イチゴ苗におけるTSSM防除に関して評価した。苗木は原野に移した(0日目)。各々の12.5−ft.プロットは20植物からなっていた。55日目から71日目まで、植物当たり10〜20匹の運動性TSSMを4回プロットに外寄生させた。様々な割合の17の処理、および幾つかはアジュバントと組合せたダニ殺傷剤の施用スケジュール、および未処理調査をRCB設計で4回繰り返した。45度コアおよびナンバーフォーディスクを含有するノズルを備える、スプレー棒を有する手動噴霧器を使用して、処理を施した。噴霧器は40psiまでCO2により加圧し、較正して100gal/エーカーを送達した。初回噴霧前の90日目から処理剤の最後の施用後2週(154日目)まで、週1回サンプルを回収した。サンプルはプロット当たり10個のランダムに選択した小葉からなっており、植物の中央3分の1の層から回収した。運動性TSSMおよびTSSMの卵を、小葉から回転接着ディスクに払い落とし計数した。植物毒性は観察されなかった。結果は表3および4中に示す。
イエバエ(成虫)に対する直接接触効率に関して試験物質をスクリーニングする。各化合物:1.5%、3%および6%濃度に関する3つの処理群、ならびに未処理対照が存在する。各々の群は、各々昆虫約10匹で5回の反復を含有する。飲み口蓋を有する16ozのドリンクカップ内で「完全遮蔽状態」に達するまで、手動噴霧器で節足動物を処理する。4時間で、10%スクロース溶液を含む綿塊を、蓋中の穴にそれを挿入することによりハエに与える。データは5、15、30、45、60分、ならびに2、4、および24時間で、または終点まで得る。ノックダウンおよび死亡率は、好ましくない傾向がある昆虫の相対数を数えることにより決定した。瀕死状態の昆虫は死亡率の合計に含めなかった。結果は以下の表5中に示す。
3つの処理群を、各化合物:1.5%、3%および6%濃度、ならびに未処理対照に関して試験した。各々の群は、各々昆虫約10匹で5回の反復を含有した。穴付きの蓋、および任意の過剰な物質を吸収する濾過紙を底部に有する8または16ozのデリスクワットカップ内で「完全遮蔽状態」に達するまで、手動噴霧器で節足動物を処理する。ノックダウンおよび死亡率は、処理後5、15、30、45、60分、ならびに2、4、24、48、および72時間で観察した。ノックダウンおよび死亡率は、好ましくない傾向がある昆虫の相対数を数えることにより決定した。瀕死状態の昆虫は死亡率の合計に含めなかった。結果は以下の表6中に示す。
方法
MBI−203処理済みのコショウの葉に曝したジャガイモシストセンチュウのメスの産卵能力を決定した。コショウの葉は葉柄で切除し、1分間の浸漬によりMBI−203で処理した。実験中の処理は、以下のようにdH2O中に10%v/vでMBI−203、陰性対照としてdH2O、および陽性対照として10%v/vのAvidであった。処理した葉は、縁が十分深く、遮断して処理済み葉を露出させる中心径でクラフトフォーム裏打ち構造のプラスチック製ペトリ皿中に保持した。
MBI−203処理に曝したメスによる有意な産卵の低下を観察した。産卵の若干の遅れが、MBI−203で処理したリーフディスクにおけるメスにおいて明らかであった。MBI−203処理したリーフディスクに曝したジャガイモシストセンチュウのメスは露出後3日で産卵し始めた(図4)。メスが産んだ卵の数は7日目にピークに達し、10日目に減少した。10日目に、メスが産んだ卵が孵化し始めたので、平均卵数は減少した。陽性対照処理(Avid10%v/v)に曝したメスは3日目に全て死に至り、avid処理リーフディスクにおいて卵は産まれなかった。
ターフグラスにおけるジムシの防除
North Bend、NebraskaのNorth Bendゴルフコースでケンタッキーブルーグラス(ポアプラテンシスエル(Poa pratensis L.))およびペレニアルライグラス(ホソムギ(Lolium perenne L.))におけるジムシ(ミナミメンガタカメムシ、シクロセファラルリダブランド(Cyclocephala lurida Bland))の防除に関して殺虫剤を評価した。5反復でランダムコンプリートブロック(RCB)設計において配置した5×5ftプロットに、殺虫剤を施した。液体製品は40psiでCO2噴霧器を使用して施し、174gpaの最終噴霧を施した。施用後24時間以内に、全ての処理剤を0.25inの水で洗浄した。各プロットから3インチの深さまで3つの8インチ径芝生土壌コアを除去し(1.05ft2全表面積)、生存状態および瀕死状態のジムシの数を数えることにより、(DAT)処理後24日と48日で配合物を評価した。植物毒性に関してプロットを定期的に評価した。結果は表7および8中に示す。
非滅菌Groton土壌、4.25pH、14%有機体にジムシ、セマダラコガネの幼虫アノマラオリエンタリス(Anomala orientalis)を外寄生させ、死亡した幼虫の数を見積もった。土壌にMBI−203の水性流動性配合物を施し、死亡率を計算した。
この試験は、ケージ付き温室内試験でのブロッコリー植物におけるキャベツ根蛆虫、デリアラジカム(Delia radicum)の防除に関する、MBI−203配合物の効力を決定するために実施した。2oz/1000ft2および8oz/1000ft2の割合でのMBI−203DF−1(MBI−203の湿潤性粉末配合物)、2oz/1000ft2および8oz/1000ft2の割合でのMBI−203DF−2(MBI−203の第2の湿潤性粉末配合物)の実験処理。実験処理は、1lb/galの割合で、市販の標準、RADIANT(登録商標)(DowAgro Sciencesによって販売、活性成分としてスピネフォラム(spineforam)を含有)と比較した。
この試験は、温室内のイチゴ作物におけるスポットウイングキイロショウジョウバエ(SWD)の防除に関する、MBI−203DF1およびMBI−203DF2の効力を決定するために実施した。MBI−203DF1およびMBI−203DF2の実験処理は、反復プロットに1lb/aおよび4lb/aの割合で施した。処理は1.5oz/aの割合で市販の標準、Entrust(登録商標)と比較した。全ての処理剤は0.05%v/vの割合で界面活性剤SILWET(登録商標)L77(Chemtura AgroSolutions、Inc)と組合せた。1種のイチゴ科植物を含有する各反復プロットをケージに入れて、昆虫集団の移動を妨げた。
結果
●SWD成虫および幼虫数の減少に関して、MBI−203DF1とDF2の一定の応答を観察した。
●4lb/aでのMBI−203DF2は、7DAAで成虫集団を25%有意に減少させた。
●試験を通じて、4lb/aでのDF2はイチゴ当たりの幼虫数を有意に減少させ、ENTRUSTに匹敵した。
モモアカアブラムシに関する、様々な濃度のMBI−203の忌避効果の評価を実施した。具体的には、3つのMBI−203水中処理濃度(1%v/v、3%v/vおよび10%v/v)を評価した。10%v/v濃度のMBI−203を陽性対照として、およびdH2O単独処理を陰性対照として使用した。各々の処理溶液は0.01%TWEEN20と共に加えた。
MBI−203はGPA成虫および若虫に対して忌避性があり、異なるMBI−203濃度で97〜99%の忌避率である(表18)。図6は、処理濃度間の統計差異を示す。3%および1%v/v濃度でのMBI−203には、それぞれ97%および99%忌避率の計算上の平均忌避率があった。
3%v/v濃度でのMBI−203を試験して、モモアカアブラムシ(GPA)成虫の子孫生成に対する化合物の効果を決定した。3%v/vのMBI−203でペッパーリーフディスクを処理することにより、バイオアッセイを実施した。(3〜4週齢のコショウ植物由来の)ペッパーリーフディスクを、23mmクッキーカッターを使用して円形に切断し、葉の平坦部分を選択し、寒天プレート上に、ディスクを均一に平坦に置くことができることを確実にした。1%寒天溶液を加熱によって溶かし、30μLを各ペトリプレート(16mm×35mm通気孔あり、ポリスチレン製ペトリプレート)に注ぎ、リーフディスクを支え湿度を維持するほど十分にプレートの底部表面を覆った。室温で冷却することにより寒天を凝固させた。リーフディスクの処理は、ガラス製ペトリ皿に処理溶液を注ぐことにより実施した。皿中の溶液によって、皿を浸漬、軽く攪拌してリーフディスクを完全に浸漬およびコーティングすることにより、リーフディスクを処理した。浸漬によるリーフディスクの処理は1分間実施した。処理したリーフディスクは、ヒュームフード内で10〜15分、または葉表面中の溶液が完全に乾燥蒸発するまで乾燥させた。処理した各々のリーフディスクは個別に寒天プレート上に置き、湿潤寒天上では軸から離してリーフディスクを置き、軽くプレスして寒天上にディスクを完全に打ち延ばした。処理したリーフディスク(処理)を含む各プレート中に、6匹のGPA成虫(3〜4日齢)を導入した。次いで成虫アブラムシを含むプレートをパラフィンでカバーした。パラフィンカバーには通気用の小さな穴を開け凝縮を妨げた。プレートは室温でインキュベートした。処理したリーフディスクに成虫を曝した後3日で、子孫(初期若虫段階)を計数した。実験は3連で行い、全実験を5回繰り返した。
クロモバクテリウムサブスチュガエ(Chromobacterium substugae)の培養物から抽出した化合物を精製するため、以下の手順を使用した:
質量分析による活性ピークの分析を、LCQ DECA XPplus質量分析計(Thermo Electron Corp.,San Jose,CA)においてフルスキャンモード(m/z 100〜1500Da)でポジティブとネガティブイオン化モードの両方を使用して、Thermo Finnigan LCQ Deca XP Plusエレクトロスプレー(ESI)装置で実施する。Thermo高性能液体クロマトグラフィー(HPLC)装置は、Finnigan Surveyor PDAおよび検出器、オートサンプラーおよび、MSポンプおよび4.6mm×100mmのLuna C18 5μ100Aカラム(Phenomenex)を備えていた。溶媒系は水(溶媒A)とアセトニトリル(溶媒B)からなっていた。移動相は10%溶媒Bで始まり、20分かけて100%溶媒Bまで直線的に増大し、次いで4分間保ち、最後に3分かけて10%溶媒Bに戻し、3分間保つ。流量は0.5mL/分である。注射体積は10μLであり、サンプルはオートサンプラーにおいて室温で保つ。LCおよび逆相クロマトグラフィーを利用して、LC−MSによって化合物を分析する。質量分析による本発明の化合物の分析を以下の条件下で行う。窒素ガスの流量は、それぞれシースおよび補助/スイープガスの流量に関して30および15arbで固定した。エレクトロスプレーイオン化は、5000Vに設定したスプレー電圧および35.0Vのキャピラリー電圧で実施した。キャピラリー温度は400℃に設定した。データはXcaliburソフトウェアで分析した。オリゴ−(β−ヒドロキシ酪酸)(1)の分析は、UC Davis質量分析施設でLTQ Orbitrap XLハイブリッド型フーリエ変換質量分析計を使用して実施した。
NMR−NMRスペクトルをBruker600MHz勾配磁場型質量分析計で測定した。参照は内部標準物質テトラメチルシランに設定する(TMS、0.00ppm)。
ジクロロメタン(DCM)画分をメタノールで粉砕し、得られた白い固体を濾過してオリゴ−(β−ヒドロキシ酪酸)(1)を得た。
オリゴ−(β−ヒドロキシ酪酸)(1)
化合物4の1HNMRスペクトルは、各1プロトンの相対強度においてδ5.22(sext)、2.62(dd)および2.53(dd)でシグナルを示した。これらに加えて、ダブレットとしてδ1.31でのメチルシグナルも観察した。13CNMRスペクトルは、δ169.2、67.6、40.9および19.8でわずか4個の炭素シグナルを示した。詳細な1Dおよび2DNMR分析によって、86の断片質量を有する−(−O−CHCH3−CH2−CO−)−の部分構造を得る結果となった。この化合物のMALDI−TOF−ESI MS(図2)は、[(n×86)+Na]の分子質量を有するオリゴマーの混合物に関して典型的なシグナルパターンを示し、生成物がn=10〜25でオリゴ−(β−ヒドロキシ酪酸)1の混合物であったことに対応した。この化合物は、数種の細菌から単離されたことが報告されている(Singh et al.,2011;Maskey et al.,2002;Hahn et al.,1995)。DCM画分から得たこの化合物の効能は、75%固定を示しエムハプラ(M.hapla)を使用したin vitroアッセイにおいて確認した(図10)。
画分および純化合物をジメチルスルホキシド(DMSO)に溶かし、in vitro96ウエルプラスチック製細胞培養プレートバイオアッセイにおいて試験した。50μl水溶液中の約15〜20匹の線虫を、25℃で24時間、4mg/mlのサンプル100μlに曝した。インキュベーション時間が終了した後、サンプルで処理した各ウエル中の目視による若年性線虫(J2)の固定段階に基づいて結果を記録し、各処理剤はウエル中4回の反復で試験した。クロモバクテリウムサブスチュガエ(C.substugae)画分および化合物4の2つの異なる96ウエルプレートバイオアッセイの結果を示す図5中に結果を示した。3個の対照、1個の陽性(1%Avid)と2個の陰性(DMSOおよび水)を各試験中に含めた。両試験(T1)と(T2)はエムハプラ(M.hapla)線虫を使用して実施した。
DCM、EA、MeOHおよびWASHなどの主な画分を、以下で詳細に記載するようにモモアカアブラムシ(GPA)バイオアッセイを使用して忌避活性に関して試験した。EAおよびMEOH画分に関して最も強力な忌避性を観察した。これらの画分のLCMS分析は類似した化学的プロファイルを示し、さらにMeOH画分の収率はEA画分より高かったので、詳細な化学的作業はMeOH画分を使用して実施した。Sephadex LH20サイズ排除クロマトグラフィー(CH2Cl2/CH3OH;50/50)を使用しMeOH画分をさらに分画化し10画分を得た(図9)。最も強力な活性を画分F9およびF10において観察した。HPLCとSephadexLH20の組合せによる、これらの画分のバイオアッセイ支援型精製は、忌避活性を担う化合物としてビオラセインを与えた。ビオラセインはアブラムシ子孫の試験においても試験した。
方法
モモアカアブラムシ(GPA)に関する選択バイオアッセイを、MBI−203画分および純化合物を使用して行った。クロモバクテリウムサブスチュガエ(C.substugae)(MBI−203)の細胞ペーストの抽出から得た画分および純化合物(ビオラセイン)を、忌避性バイオアッセイにより殺虫効率に関して試験した。(3〜4週齢のコショウ植物由来の)ペッパーリーフディスクを、23mmクッキーカッターを使用して円形に切断し、葉の平坦部分を選択し、化合物を用いた処理後寒天プレート上に、リーフディスクを均一に平坦に置くことができることを確実にした。水中に1パーセント(%)寒天を調製した。1%寒天溶液を加熱によって溶かし、145mm×20mmペトリプレートに注ぎ、リーフディスクを支え湿度を維持するほど十分にプレートの底部表面を覆った。室温で冷却することにより寒天を凝固させた。
忌避率%=100−{処理したリーフディスク上の([N+A])/ペトリ皿上の[N+A]×X100}、
ここで、Aは成虫を表し、Nは若虫を表す。
MBI−203画分に関する忌避率試験は粗製抽出物で始めた。メタノールおよびアセトン溶媒中の粗製抽出物を試験し、結果の分析は、図11中に示すように有意な差を示した。メタノール溶媒とアセトン溶媒の両方中のMBI−203の粗製抽出物で処理したリーフディスクは、陰性対象のそれらより、モモアカアブラムシ若虫と成虫の定着応答の統計上有意な差をもたらした。図11AおよびBは、アブラムシに対するMBI−203の忌避効果を示した。メタノール溶媒はアブラムシに対する忌避効果を示したが(図11A)、MBI−203抽出物および陽性対照(avid10%)との統計差は示されなかった。溶媒アセトンは画分において使用するのに優れた溶媒であることが示された。それはGPA若虫および成虫に対する忌避性を示さず、陰性対照と統計上同じ、リーフディスクに定着した平均数の若虫および成虫を有していたからである(図11B)。
アセトン中に2つの濃度、0.5μg/mLと1.0μg/mLの純ビオラセイン化合物を試験中で使用して、モモアカアブラムシ(GPA)成虫の子孫生成に対する化合物の効果を決定した。アセトン中に異なるビオラセイン濃度でペッパーリーフディスクを処理することにより、バイオアッセイを実施した。(3〜4週齢のコショウ植物由来の)ペッパーリーフディスクを23mm径ディスクに切断し、葉の平坦部分を選択し、化合物を用いた処理後寒天プレート上にディスクを均一に平坦に置くことができることを確実にした。1%寒天溶液を調製し加熱によって溶かし、30μLをペトリ皿(16mm×35mm通気孔あり、ポリスチレン製ペトリプレート)に注ぎ、リーフディスクを支え湿度を維持するほど十分にプレートの底部表面を覆った。室温で冷却することにより寒天を凝固させた。ビオラセインによる処理は、200μLピペットマンを使用しリーフディスクに100μLサンプル溶液を軽く拡散することにより行った。処理は3連で設定した。処理したリーフディスクはフード内で5〜10分間乾燥させた。陽性対照は10%v/vAvid、陰性対照はdH2Oであり、アセトンはブランクとして使用した。各々の凝固寒天プレートにおいて、20〜30μLのdH2Oを寒天にピペットで注ぎ湿度を維持した。処理した各々のリーフディスクは個別に寒天プレート上に置き、湿潤寒天上では軸から離してリーフディスクを置き、軽くプレスして寒天上にディスクを完全に打ち延ばした。処理したリーフディスク(処理)を含む各プレート中に、6匹のGPA成虫(3〜4日齢)を導入した。次いで成虫アブラムシを含むプレートをパラフィンでカバーした。パラフィンカバーには通気用の小さな穴を開け凝縮を妨げ、室温に保った。処理したリーフディスクに成虫を曝した後3日で、子孫(初期若虫段階)を計数した。実験は3連で行い、全実験を2回繰り返した。
モモアカアブラムシに対する他のクロモバクテリウム(Chromobacterium)種の忌避効果も評価した。評価したクロモバクテリウム(Chromobacterium)種は、クロモバクテリウムピスシンエア(Chromobacterium piscinae)DSM23278、クロモバクテリウムシュードビオラセム(C.pseudoviolaceum)DSM23279、クロモバクテリウムヘモリチカム(C.haemolyticum)DSM19808およびクロモバクテリウムアクアチカム(C.aquaticum)DSM19852である。2種がビオラセイン産生種であり(クロモバクテリウムピスシンエア(C.piscinae)およびクロモバクテリウムシュードビオラセム(C.pseudoviol))、一方他の2種はビオラセインを産生しないことが文書化されている。微生物はLBブロスにおいて26℃、および100rpmで5日間増殖させた。発酵の最後に、ブロスを採取しバイオアッセイ用に等分した。水中5%v/vでの処理濃度をGPA成虫に対して試験した。MBI−203、10%v/v濃度を陽性対象として、dH2O単独処理を陰性対照として使用した。各々の処理溶液は0.01%TWEEN20と共に加えた。
配合物1は、クロモバクテリウム(Chromobacterium)細胞濃縮採取物32部、クロモバクテリウム(Chromobacterium)発酵ブロス上清62.5部、n−ヘキサノール1部、アルギン酸ナトリウム0.5部、ソルビタンエステルエトキシレート2部、およびd−リモネン2部を含有する。これらの配合物成分は、均一で安定した混合物を確実にするそれらの機能性に関して選択し、USEPAリスト4上のそれらの列挙によりさらに好ましい。EPAリスト4上の成分の列挙は、環境および毒性に対する効果の点でそれは最小限の問題であるとみなす。配合物2は、クロモバクテリウム(Chromobacterium)細胞濃縮採取物32部、クロモバクテリウム(Chromobacterium)発酵ブロス上清54.5部、n−ヘキサノール1部、アルギン酸ナトリウム0.5部、ソルビタンエステルエトキシレート2部、および安息香酸ナトリウム10部を含有する。
クロモバクテリウムサブスチュガエ(Chromobacterium substugae)、d−リモネン、ヘキサノール、プロピレングリコールを含有する最終製品MBI−203、および炭酸カルシウム、安息香酸ナトリウム、または酸化チタンと組合せたパラベン配合物(MBI−203EP)をプラスチック製ペトリ皿に置き、パラフィンで密閉した。プレートは太陽光の下、7時間屋外に置いた。太陽光に曝した後、物質は屋内に持ち込み、オートクレーブ処理Millipore水で1.5%および3%v/vの濃度に希釈した。次いで物質を人工飼料上に置き、乾燥させ、新生キャベツシャクトリムシ、トリコプルシアニ(Trichoplusia ni)に与えた。死亡率は飼料外寄生後3日と4日で記録した。結果は表24および図16中に示す。
4〜5週齢のパックマンブロッコリーに、安息香酸ナトリウム有りおよび無しでの3%v/v希釈のMBI−203最終製品(d−リモネン配合物)(MBI−203EP)を噴霧した。9in2ポット中の各々の植物に500uLの処理剤を与えた。Tween−20を0.01%の最終濃度で、全サンプル中に含めた。五匹の成虫キャベツアブラムシ、ブレビコリネブラシカエ(Brevicoryne brassicae)を各々の植物に配置した。植物と昆虫は成長光下でインキュベートした(75〜85°F、16時間明/8時間暗)。生存状態のアブラムシは外寄生後3、5、および7日で記録した。安息香酸ナトリウム配合物は、最終製品単独より良い防除をもたらしたようであった(図17)。
安息香酸ナトリウム有りおよび無しでの10%v/v希釈のMBI−203最終製品(d−リモネン配合物)(MBI−203EP)を、約30gal/エーカーの処理率でレッドキャベツに噴霧した。10%v/vでの配合物対照(ロット2403−83−3)もアッセイ中に含めた。植物が乾燥した後、それらに10匹のキャベツアブラムシを外寄生させた。アッセイは3、6、および8日目に記録した。防除率%はヘンダーソン−ティルトンの補正を施すことにより決定した。結果は図18中に示す。最終製品+安息香酸ナトリウムの配合物には、最終製品単独または配合物対照単独より、良いアブラムシの防除があった。
安息香酸ナトリウムまたは炭酸カルシウムの濃度が様々な非希釈MBI−203最終製品(MBI−203EP)を、密閉プラスチック製ペトリ皿において1日太陽光に曝した。露光および非露光物質を次いで3%v/v希釈物に希釈し、人工飼料に施した。新生キャベツシャクトリムシに飼料を施し、死亡率は飼料外寄生後4日で記録した。結果は図19中に示す。10%および15%濃度での安息香酸ナトリウムが、最も経済的な価格で最小の活性劣化となるようである。
非希釈噴霧乾燥細胞および様々な添加剤をプラスチックバイアルに注ぎ、40〜65°F、日照、数日散水ありの環境に4日間曝した。光および非露光サンプルを6%v/vに希釈し、パックマンブロッコリー植物に噴霧した。乾燥植物には5匹の未熟なキャベツアブラムシを外寄生させた。アブラムシは外寄生後3日と6日で記録した。防除はヘンダーソン−ティルトンの補正を施すことにより決定した。アッセイを6日目まで続けると、噴霧乾燥細胞および安息香酸ナトリウムは、3日目で最も高い殺傷率の1つを有し防除を維持した(図20参照)。
Claims (5)
- 2スポットハダニ(two spotted spider mite)、イエバエ(Musca domestica)、スポットウイングキイロショウジョウバエ(spotted wing Drosophila)、キャベツ根蛆虫(cabbage root maggots)、モモアカアブラムシ(green peach aphid)、ジャガイモシストセンチュウ(Potato cyst nematode)、リタービートル(Litter beetle)、セマダラコガネ幼虫(Oriental beetle)、リゾトログスマジャリス(Rhizotrogus majalis)、およびコフキコガネ幼虫(cockchafer)から選択される有害生物の外寄生(infestation)を調節する方法であって、
調節が望まれる場所において、クロモバクテリウムサブスチュガエNov(Chromobacterium substugae Nov)(NRRL B-30655)発酵から回収された全細胞ブロス、濾過物、又は抽出物を前記外寄生を調節するのに効果的な量施用することを含む、方法。 - 前記調節が望まれる場所が植物上、植物種子または土壌中である、請求項1に記載の方法。
- (a)単離したクロモバクテリウムサブスチュガエNov(Chromobacterium Subtsugae Nov)(NRRL B-30655)若しくは全細胞ブロス、濾過物、上清、抽出物、又はこれらに由来する殺有害生物活性を有する殺有害生物活性物質、および
(b)リグニン塩及び安息香酸塩である太陽光防御物質
を含む、有害生物の外寄生を調節するための安定状態の生物学的殺有害生物剤組成物であって、
前記有害生物が、2スポットハダニ(two spotted spider mite)、イエバエ(Musca domestica)、スポットウイングキイロショウジョウバエ(spotted wing Drosophila)、キャベツ根蛆虫(cabbage root maggots)、モモアカアブラムシ(green peach aphid)、ジャガイモシストセンチュウ(Potato cyst nematode)、リタ-ビートル(Litter beetle)、セマダラコガネ幼虫(Oriental beetlw)、リゾトログスマジャリス(Rhizotrogus majalis)、およびコフキコガネ幼虫(cockchafer)から選択される、組成物。 - 前記安息香酸塩が、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、およびそれらの組合せから選択され、前記リグニン塩が、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、およびそれらの組合せの中和イオン由来のリグニンスルホン酸塩から選択される、請求項3に記載の組成物。
- 前記クロモバクテリウムサブスチュガエNov(NRRL B-30655)が少なくとも5%の量で存在し、前記太陽光防御物質が少なくとも5%の量で存在する、請求項3に記載の組成物。
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