KR102005592B1 - 크로모박테리움 제제, 조성물, 대사물 및 이들의 용도 - Google Patents

Abstract

살충 활성을 가지는, 크로모박테리움(Chromobacterium) 종, 그로부터 유래하는 여과물, 상청액, 추출물 또는 살충 활성 물질을 포함하며, 물리적 균일성의 유지, 그리고 일광에 노출되었을 때의 분해에 대한 더 높은 내성에 기인하는 사용 후의 더 긴 살곤충제 활성의 유지로 인하여 향상된 보관 수명을 가지는 안정화된 생물학적 살충제가 개시된다.

Description

크로모박테리움 제제, 조성물, 대사물 및 이들의 용도 {CHROMOBACTERIUM FORMULATIONS, COMPOSTIONS, METABOLITES AND THEIR USES}

크로모박테리움(Chromobacterium) 종, 그로부터 유래하는 여과물, 상청액, 추출물, 살충 활성 화합물 또는 대사물을 포함하는 조성물 또는 제제의, 특히 응애목(Acarina), 스카라베이다에(Scarabeidae), 드로소필리다에(Drosophilidae), 트리오지다에(Triozidae), 아피다에(Aphidae), 무씨다에(Muscidae), 안토마이이다에(Anthomyiidae) 또는 테네브리오니다에(Tenebrionidae) 과에 속하는 1종 이상의 해충의 침입(infestation)에 대한 살응애제(acaricide) 및 살곤충제로서의 용도가 제공된다. 생물학적 살충제 (생물농약(biopesticide)으로도 지칭됨) 제제, 특히 크로모박테리움 종, 그로부터 유래하는 여과물, 상청액, 추출물, 대사물 또는 살충 활성 화합물을 포함하는 제제, 그의 제조 방법, 및 해충 침입을 조절할 때의 사용 방법이 추가로 제공된다. 더 구체적으로, 물리적 균일성의 유지, 그리고 일광에 노출되었을 때의 분해에 대한 더 높은 내성에 기인하는 사용 후의 더 긴 살곤충제 활성의 유지로 인하여 향상된 보관 수명을 가지는 안정화된 생물학적 살충제가 추가로 제공된다.

자연 생성물은 미생물, 식물 및 기타 생물체에 의해 생성되는 물질들이다. 미생물 자연 생성물은 화학적 다양성을 가지는 풍부한 자원을 제공하는 바, 제약 목적으로 자연 생성물을 활용해온 오랜 역사가 존재한다. 50% 이상이 자연 생성물로부터 유래하는 인간 치료제 경우에서의 자연 생성물의 중요성에도 불구하고, 살충제 중에서는 11%만이 자연 공급원으로부터 유래한다. 그럼에도 불구하고, 자연 생성물 살충제는 일반 농장 및 유기 농장 모두에서 곤충 해충을 방제함에 있어서 중요한 역할을 할 잠재력을 가지고 있다. 미생물 (박테리아, 방선균 및 진균)에 의해 생성되는 이차 대사물은 해충을 효과적으로 방제하고 저항성 발생의 위험성을 감소시키는 데에 단독 또는 공지 화합물과의 조합 중 어느 하나로써 사용될 수 있는 신규한 화합물들을 제공한다. 농업용 살곤충제로서 성공적인 미생물 자연 생성물의 몇 가지 잘 알려져 있는 예가 존재한다 (문헌 [Thompson et al., 2000]; [Arena et al., 1995]; [Krieg et al. 1983]).

미생물 살충제의 개발은 순수 배양에서의 미생물의 단리로 시작된다. 그것은 이후 시험관내, 생체내 또는 온실 및 포장에서의 파일럿 규모 시험을 사용한 효능 및 범위 스크리닝으로 진행된다. 동시에, 미생물에 의해 생성되는 활성 화합물이 단리 및 확인된다. 미생물 살충제의 상업화를 위해서는, 미생물이 산업적 규모의 발효에 의해 경제적으로 생산되어야 하며, 효능을 증가시키고 적용의 용이성은 물론 포장 조건하에서의 저장 안정성을 최대화하기 위한 생체적합성의 승인된 첨가제들을 사용하여 제제화되어야 한다.

크로모박테리움

2000년에, USDA의 마르틴(Martin) 박사 및 그녀의 공동연구자들은 매릴랜드의 산림 토양으로부터 자색으로 착색된 박테리아 (PRAA4-1)를 단리하였다 (문헌 [Martin et al., 2007a]). 최초 스크리닝에서, 그들은 이 박테리아가 콜로라도 감자 딱정벌레 및 기타 곤충 해충에 대하여 독성이라는 것을 발견하였다 (문헌 [Martin et al., 2007b]). 운동성의 그람-음성인 이 박테리아는 크로모박테리아의 새로운 종인 크로모박테리움 서브스투가에(Chromobacterium substugae) sp.nov로 확인되었다 (문헌 [Martin et al., 2007c]). 그것은 극성 편모를 가지는 통성 호기성의 운동성인 그람-음성 베타프로테오박테리움이다. 25℃의 L-한천 플레이트 상에서 2-3일차에 콜로니가 형성되는데, 처음에는 크림 색상이었다가 이후 24시간 동안 옅거나 짙은 보라색으로 점차 전환된다. PRAA4-1의 콜로니는 25℃, pH 6.5-8.0의 0-1.5% (w/v)의 NaCl을 포함하는 펩톤 기재 배지에서 최적으로 잘 자란다 (문헌 [Martin et al., 2007a]).

마르틴 및 그녀의 공동연구자들에 의한 씨. 서브스투가에(C. substugae)의 발견 이후, 3종 이상의 새로운 크로모박테리아 종이 단리 및 특성화되었는데; 영(Young) 등 (2008)이 대만의 샘물 샘플에서 신규 크로모박테리움 종인 씨. 아쿠아티쿰(C. aquaticum)을 단리하였으며, 캄퍼(Kampfer) 등 (2009)이 말레이지아에서 수집된 환경 샘플에서 2종의 종 씨. 피씨나에(C. piscinae) 및 씨. 슈도비올라세움(C . pseudoviolaceum)을 단리하였다.

완전히 알려져 있는 크로모박테리아 종으로, 토양 및 물 유래의 그람-음성 부생체인 씨. 비올라세움이 있다. 크로모박테리아에 의해 생성되는 이차 대사물에 대한 공개되어 있는 정보는 모두 씨. 비올라세움에 대한 연구에 기초하고 있다 (씨. 비올라세움의 약학적 및 산업적 전망에 대한 포괄적 고찰을 위해서는, 예를 들면 문헌 [Duran and Menck (2001)] 참조). 그것은 보통은 인간에 대하여 비병원성이지만 기회성 병원체인 것으로 간주되는데, 종종 인간 및 동물에서 패혈증 및 치명적인 감염의 원인 매개체가 된 바 있다. 씨. 비올라세움은 산소 존재하에서의 2개 L-트립토판 분자의 융합에 의해 생성되는 비스인돌 분자인 자색 색소 비올라세인을 생성하는 것으로 알려져 있다 (문헌 [Hoshino et al., 1987]; [Ryan and Drennan; 2009}. 비올라세인 생합성은 그람-음성 박테리아에서 다양한 다른 이차 대사 경로들을 조절하는 공통 기작인 쿠오럼-감지(quorum-sensing)에 의해 조절된다 (문헌 [McClean et al., 1997]).

듀란(Duran) 및 멩크(Menck) (2001)에 의해 요약된 씨. 비올라세움의 다른 알려져 있는 대사물에는 수소 시아나이드, 페리옥사민 E, B-락탐계 당펩티드인 SQ28,504 및 SQ28,546, 항생제 예컨대 에어로시아니딘, 에어로카빈, 3,6-디히드록시-인독사젠, 모노박탐(monobactam)인 SB-26.180, 및 항종양 뎁시펩티드인 FR901228이 포함된다. 듀란 및 멩크 (2001)에 의한 고찰 논문에 따르면, 씨. 비올라세움은 세포외 다당류 및 지질다당류와 같은 독특한 당 화합물도 생성한다.

US 특허 출원 공개 제US20120100236호 역시 크로모박테리움 종, 더 구체적으로는 크로모박테리움 서브스투가에로부터 수득가능하거나 유래하는 화합물에 대하여 개시하고 있다.

진드기( mite ) 및 살응애제

테트라니쿠스 우르티카에(Tetranychus urticae) (점박이 잎진드기(Two spotted spider mite))는 테트라니키다에(Tetranychidae) 과의 구성원이다. 잎진드기는 아마도 관상식물에서 가장 중용한 진드기 해충일 것이다. 그것은 또한 180 종을 초과하는 온실 및 포장 작물에서 상당한 손실을 야기한다. 이러한 진드기는 또한 방제하기가 가장 어려운 절지동물 해충에 속하며, 빠르게 화학물질에 대한 내성을 발생시킬 수 있다 (문헌 [Stamps and Osborne 2009], [Osborne, Ehler and Nechols, 1999]).

살응애제는 진드기(mite/tick)를 사멸시키는 화합물 (살진드기제(miticide/ixodicide))이다. 이와 같은 종류의 살충제는 광범위해서, 항생제, 카르바메이트, 포름아미딘 살응애제, 피레트로이드, 진드기 성장 조절제, 및 유기포스페이트 살응애제가 포함된다. 화학적 살충제 이외에도, 규조토 및 지방산이 진드기를 방제하는 데에 사용될 수 있다. 그들은 통상적으로 진드기를 건조 제거하는 큐티클의 붕괴를 통하여 작용한다. 또한, 페퍼민트 오일과 같은 일부 에센셜 오일이 진드기를 방제하는 데에 사용되고 있다. 알려져 있는 살응애제 화합물의 커다란 다양성에도 불구하고, 그들이 작물에 야기하는 손상으로 인하여, 진드기는 여전히 농업상의 심각한 문제로 남아있다. 그들은 한 시즌 동안 수 세대를 산출할 수 있는데, 이는 사용되는 살응애제 제품에 대한 빠른 내성의 발생을 촉진한다. 따라서, 새로운 표적 부위 및 신규한 작용 양식을 가지는 새로운 살충제 생성물이 절실하게 요구되고 있다.

집파리

무스카 도메스티카(Musca domestica) (집파리)는 무씨다에 과의 구성원이다. 이 과는 세계적으로 가정에서 경제적인 문제점으로 간주되고 있다. 무씨다에 과의 다른 구성원에는 얼굴 파리, 침파리 및 뿔파리가 포함된다. 그들은 성가신 것으로 간주되며, 인간 및 동물 질환의 매개체이다. 쓰레기 및 배설물, 그리고 인간 및 식품에서 걷고 섭식하는 이들의 습성은 그들을 질환 생물체 전달의 이상적인 매개체가 되게 한다. 이와 같은 종들은 동물에게도 해충이 되어, 개방된 상처를 통하여 질환을 전파할 수 있다.

식물 섭식 파리 - 점박이 날개 초파리( Spotted Wing Drosophila )

점박이 날개 초파리인 드로소필라 스즈키이(Drosophila suzukii)는 미국의 과실 및 채소 성장 지역에 대한 최근의 침입자이다. 그것은 잘 알려져 있는 관련 종인 드로소필라 멜라노가스테르(Drosophila melanogaster) 및 다른 드로소필라에 비해 훨씬 더 파괴적인데, 디. 스즈키이가 무손상 과실 및 채소를 섭식하여 손상시킬 수 있는 반면, 다른 드로소필라들은 부패중인 식물 물질만을 섭식하기 때문이다.

뿌리 고자리파리( Root Maggot )

안토마이다에(Anthomyidae) 과의 뿌리 고자리파리는 몇 가지 상이한 식물들의 뿌리를 섭식한다. 양배추 뿌리 고자리파리는 양배추, 꽃양배추, 브로콜리 및 브러쎌 스프라우츠 (이 채소 군은 '십자화과 작물(cole crop)'로도 알려져 있음)에 영향을 준다. 당근, 양파 및 기타 채소 작물에 영향을 주는 다른 유형의 뿌리 고자리파리들도 발생한다. 십자화과 작물이 저온-시즌 채소이기 때문에, 양배추 뿌리 고자리파리는 미국의 북부 지역에 훨씬 더 많다. 그들은 방제하기가 어려운데, 그들이 토양 아래에서 부화하고 섭식함으로써 성장 저해 또는 시들은 잎을 알아챈 다음에야 그들이 존재한다는 것을 알 수 있기 때문이다.

복숭아혹 진딧물( Green Peach Aphid )

미주스 페르시카에(Myzus persicae) (복숭아혹 진딧물)는 아피디다에(Aphididae) 과의 구성원이다 (US20110054022호 참조). 그의 일반명으로 드러나는 바와 같이, 복숭아혹 진딧물은 광범위한 과실, 채소 및 관상 식물의 해충으로써, 세계적인 분포를 가지고 있다. 이 곤충이 특히 유해한 것은 그들이 체관부 수액을 섭식하는 것에 의한 직접적인 손상을 야기할 뿐만 아니라, 과실 변형 및 변색을 야기하는 샤카병의 원인 매개체인 자두 곰보병 바이러스의 잠재적인 매개체이기도 하기 때문이다. 결과적으로, 침입된 나무는 뿌리를 뽑아야 한다. 다양한 살충제들을 사용하여 이 해충을 방제하기 위한 노력들이 이루어져 왔다. 그러나, 종종 내성이 발생한다.

감자 나무이( Potato Psyllid )

박테리세라 코커렐리(Bactericera cockerelli) (감자 나무이)는 트리오지다에(Triozidae) 과의 구성원으로써, 그람 음성 박테리아의 침입을 통한 제브라 칩병(zebra chip disease)의 원인이 되는 매개체이다. 그것이 북아메리카 원산이기는 하지만, 뉴질랜드에서도 그것이 발견된 바 있다 (www.biosecurity.govt.nz/files/pests/potato-tomato-psyllid/psyillid-factsheet.pdf). 감자 나무이는 일반적으로 가짓과 숙주 (예컨대 토마토 및 감자)에서 번식한다. 그러나, 고추, 칠리, 가지, 고구마, 포로포로, 타마릴로 및 아가위와 같은 다른 식물들에서도 그들이 발견된 바 있다.

부엽토 딱정벌레( Litter Beetle )

알피토비우스 디아페리누스(Alphitobius diaperinus)는 가금류 산업에서 심각한 해충으로써, 테네브리오니다에(Tenebrionidae) 과의 구성원이다. 전하는 바에 따르면, 비티(Bt) 균주 PS86B1이 알피토비우스에 대하여 활성을 가지고 있다 (히켈(Hickel) 등의 US 특허 제5,100,665호). 비티 테네브리오니스는 이 딱정벌레의 유충에 대해서도 활성을 가질 수 있다 (US 특허 제5,244,660호). 부엽토 딱정벌레 및 소수의 다른 딱정벌레류 종들은 상당한 경제적 손실을 초래하는 닭 및 칠면조의 원생동물, 박테리아 및 바이러스 질환 매개체로 작용한다. 부엽토 딱정벌레는 에스. 엔테리카(S. enterica) 혈청형 장염과 같은 더 병원성인 변종을 포함한 병원성 살모넬라 종들의 중요한 보유주로 작용한다. 문제는 살모넬라와 같은 병원성 생물체에 의해 오염된 가금류가 인간의 건강을 위협한다는 것이다. 이 딱정벌레는 닭장의 부엽토, 목재, 스티로폼, 유리섬유 및 폴리스티렌 단열 패널에 서식한다. 유충 및 성체 딱정벌레는 새의 분변 및 닭 사료로 사용된 곡물 모두에서 번성한다. 닭장 내의 이러한 커다란 딱정벌레 군집 및 그의 다양한 서식처는 그들이 보유하고 있는 살모넬라를 박멸하는 것을 더욱 어렵게 한다. 심한 부엽토 딱정벌레 침입 중간, 또는 새로운 닭 군집 확립 이전에는, 부엽토의 빈번한 교체 또는 다수의 화학적 살곤충제를 사용한 살포 어느 것도 이 해충에 대하여 완전히 효과적인 방제가 되지 않는다.

땅벌레( Grub ) 및 왕쇠똥구리( Scarab )

굼벵이 (시클로세팔라 루리다(Cyclocephala lurida)), 남부 마스키드 샤퍼(Southern Masked Chafer) (리조트로구스 마잘리스(Rhizotrogus majalis)), 일본 딱정벌레 유충 (포필리아 자포니카(Popillia japonica)), 흑색 포도 바구미 유충 (오티오린쿠스 술카투스(Otiorhynchus sulcatus)), 동양 딱정벌레 유충 (아노말라 오리엔탈리스(Anomala orientalis)), 스카라바에이다에(Scarabaeidae) 과의 구성원과 같은 땅벌레들은 잔디 및 목초를 침입시키는 것으로 밝혀졌다. 성체 왕쇠똥구리는 관상 식물 및 전 세계의 수많은 작물들을 침입시키는 것으로 밝혀졌다. 다양한 살충제들이 시도된 바 있는데, 화학적 살충제, 선충 (예를 들면 US 특허 제7,641,573호 참조) 및 바실루스 투린기엔시스(Bacillus thuringiensis) (US 특허 제5,185,158호 참조), 페로몬 및 천연 기피제 예컨대 카트닙 및 산파가 포함된다.

폴리히드록시알카노에이트 ( PHA )

생체-플라스틱(bio-plastic)은 식물 전분 및 미생물 종과 같은 재생가능 자원으로부터 합성되는 형태의 플라스틱으로 정의된다. 개발 중에 있는 일부 생분해성 플라스틱 물질에는 폴리히드록시알카노에이트 (PHA), 폴리락티드, 지방족 폴리에스테르, 다당류, 및 공중합체 및/또는 이들의 블렌드가 포함된다. PHA에는 구체적으로 수종의 중합체 에스테르 예컨대 폴리히드록시부티레이트, 폴리히드록시부티레이트 co-히드록시발러레이트 (PHBV), 폴리히드록시부티레이트 co-히드록시헥사노에이트 (PHBHx) 및 폴리히드록시부티레이트 co-히드록시옥타노에이트 (PHBO)가 포함된다. 폴리 3-히드록시부티르산 (PHB)이 가장 일반적인 천연 미생물 PHA이다. 폴리히드록시알카노에이트는 100% 생분해성인 중합체이다. 폴리프로필렌과 같은 다양한 합성 열가소성수지와 유사한 특성을 가지고 있기 때문에, PHA는 그것들을 대체하여 사용될 수 있다. 그들은 또한 토양, 호수의 물, 오수 및 해수 중의 미생물에 의해 호기성 조건하에서는 물과 이산화 탄소로, 그리고 혐기성 조건하에서는 메탄으로 완전히 분해된다. 쇄 중 탄소 원자의 수에 따라, PHA는 하기 2개의 군으로 분할되어 있다: 3-5개의 탄소 원자로 구성되는 짧은-쇄 길이 (SCL) 및 6-14개의 탄소 원자로 구성되는 중간-쇄 길이 (MCL) (문헌 [Khanna S , Srivastava AK. 2005]). 이러한 차이는 주로 소정 탄소 길이 범위의 3HA를 수용할 수 있는 PHA 신타제의 기질 특이성에 기인한다. 다른 잘 알려져 있는 PHA_SCL은 공중합체인 폴리(3-히드록시부티레이트-co-3-히드록시발러레이트) (P(3HB-co-3HV))로써, 4- 및 5-탄소 단량체 단위로 구성된다. 이러한 단량체 단위들의 비율은 가변적일 수 있으며, 이는 중합체의 물리적 특성에 영향을 주는데, 다시 말하자면, 3HV 단위의 비율이 증가할수록 덜 취성이다.

일부 미생물 종에서는, 과량 탄소의 존재 및 질소원 제한시 PHA의 축적이 발생한다 (문헌 [Verlinden et al., 2007]). 스트레스가 많은 조건에 반응하여 생성되는 PHA는 통상적인 에너지 공급원이 부재할 경우에 활용될 에너지 저장 분자로 기능한다 (문헌 [Solaiman and Ashby, 2005]). 이러한 생물체에서는, 광 굴절성 비정질 저장 과립으로서 플라스틱 중합체가 세포 내에 축적된다 (문헌 [Mukhopadhyay et al., 2005]). PHB는 3개의 효소 단계를 사용하여 아세틸-CoA로부터 합성된다 (문헌 [Krans et al., 1997]). 생물공학적 관점에서, 생분해성인 생체플라스틱의 능력은 그것이 환경 오염물질인 석유화학-기반 플라스틱의 바람직한 대체물이 되게 한다 (문헌 [Lee, 1996]). 생체플라스틱 생산의 증가는 이산화 탄소 방출을 상당히 감소시키고, 플라스틱 폐기물 생성을 감소시키며, 화석 연료의 소비를 감소시킬 수 있다.

PHA는 하기 3종의 방법으로부터 수득될 수 있다: 미생물에 의한 생합성, 트랜스제닉 식물에 의한 광합성, 및 적절한 효소를 사용한 시험관내 생합성 (예를 들면 US 특허 제7,455,999호, WO9914313호 참조). 대부분의 박테리아에서, 세포는 질소, 인 또는 산소와 같은 탄소 공급원이 아닌 다른 성장-제한 기질하에 PHA를 합성한다.

축적된 PHA는 기아시 탄소원 및 에너지원 모두로 기능한다. PHA는 또한 환원력의 저장소로 기능하기 때문에, 세포 내의 산화환원 조절인자로 간주될 수 있다. PHA는 또한 광학적으로 활성인 화합물의 화학적 합성을 위한 키랄 전구체로 기능할 수 있는 입체 규칙성 화합물로서 유용하다. 그와 같은 화합물은 특히 약물, 의약, 호르몬, 살곤충제 및 제초제의 장기 투약을 위한 생분해성 담체로 사용된다 (문헌 [Reddy 2003]). 그들은 또한 골판, 외과적 봉합 및 혈관 대체에서의 해당 압전 특성으로 인한 골 성장의 자극에서 골합성 물질로 사용된다 (문헌 [Schaefer et al., 2000]). 또한, 다양한 박테리아, 예컨대 알칼리젠스 유트로푸스(Alcaligenes eutrophus) NCIMB 40124 (EP. 0431883A2호 및 US 특허 제7,455,999호)를 사용한 미생물학적 과정에 의한 공중합체 제조 방법에 대한 개시들이 있어 왔다. EP 제2236089A1호는 이러한 중합체들의 정형외과 복구 장치 및 연조직 고정 장치를 위한 다구역 이식체에서의 용도에 대해 개시하고 있다. WO 91/00917A1호는 원핵 및 진핵 세포, 특히 식물의 분자 수준에서의 폴리히드록시부티레이트 (PHB) 및 폴리히드록시알카노에이트 (PHA) 폴리에스테르 합성의 유전학 및 효소학 조작에 의한 신규 폴리에스테르 생체중합체의 조절 및 변형 방법에 대해 개시하고 있다. WO 2005/030482A1호는 시비용 포장 재료로서의 방법 및 용도에 대해 개시하고 있다. WO2008/110541호는 열 분해에 대한 폴리히드록시부티레이트의 안정화 방법에 대해 개시하고 있다.

리그닌

리그닌은 고급 식물 목질 구조의 주요 구성요소이다. 가공된 리그닌은 목재 펄핑 반응의 부산물로서 수득된다. 리그닌 생성물에는 예를 들면 술파이트, 술페이트 및 알칼리 폐액으로부터 수득될 수 있는 리그닌 술포네이트, 알칼리 리그닌 및 옥시리그닌이 포함된다 (문헌 [Snook, 1982, Handbook for Pulp & Paper Technologists, TAPPI, Atlanta]).

리그닌은 다양한 상업적 용도를 가지는 것으로 밝혀져 있다. 예를 들면, 알칼리 가용성 리그닌은 분산제로서 사용되어 왔다. U.S. 특허 제3,726,850호는 유기로 결합된 황이 본질적으로 없는 알칼리 가용성 오존-처리 리그닌 생성물의 점토, 염료, 살충제, 카본 블랙 및 기타 재료용 분산제로서의 용도에 대해 개시하고 있다. U.S. 특허 제4,666,522호는 리그노술포네이트 생성물의 왁스, 오일, 지방, 아스팔트 및 이들의 혼합물의 에멀젼 제조를 위한 용도에 대해 개시하고 있다. 리그닌 아세테이트는 수-기재 인쇄 잉크 조성물에서 바인더로서 작용하는 것과 같은 적용분야에 유용한 것으로 보고되어 있다 (예를 들면 U.S. 특허 제4,612,051호 참조). U.S. 특허 제5,668,183호는 리그닌 술포네이트 생성물의 분산성 지용성 물질로서의 용도에 대해 개시하고 있다. 또한, 리그닌-살충제 복합체의 결합에 대한 개시들이 존재하고 있다 (예를 들면 U.S. 특허 제3,813,236호, Re. 제29,238호로 재공고된 U.S. 특허 제3,929,453호, U.S. 특허 제4,381,194호, US 특허 출원 공개 제20110015237호, US 특허 출원 공개 제2010136132호, US 특허 출원 공개 제20100278890호, US 특허 출원 공개 제20080113920호, US 특허 출원 공개 제2006247130호, US 특허 제7,867,507호, WO2003/005816호, US 특허 제5,994,266호 참조).

나트륨 벤조에이트

나트륨 벤조에이트는 식품 제조에 있어서의 항-미생물제로서 다양한 제제들에 사용되어 왔다. 예를 들면, US 특허 제6,599,514호는 항진균 조성물의 전체적인 항진균 활성에 대하여 상승작용적 효과를 산출하는 항진균제 및 식품 첨가제를 포함하는 상승작용적 항진균 조성물에 대해 개시하고 있다. US 특허 제6,599,514호에 개시되어 있는 식품 첨가제에는 소르브산 및 소르베이트, 벤조산 및 벤조에이트, 히드록시-벤조에이트, 이산화 황 및 술파이트, 비페닐 및 유도체들, 니트라이트, 니트레이트, 락트산, 락테이트, 시트르산 및 시트레이트, 타르타르산 및 타르트레이트, 오르소인산 및 오르소포스페이트, 말레이트, 아디프산, 숙신산, 1,4-헵토노락톤, 니코틴산, 트리암모늄 시트레이트, 암모늄 철 시트레이트, 칼슘 디나트륨 EDTA, 글리세롤, 디-, 트리- 및 폴리포스페이트, 지방산 (E470), 지방산 (E471)의 모노- 및 디글리세리드, 지방산의 모노- 및 디글리세리드의 에스테르, 카르보네이트, 글루코네이트, 염소 (E92S), 나트륨 헥사메타포스페이트, 부틸화 히드록시아니솔 (BHA), 부틸화 히드록시 톨루엔 (BHT) (E321), t-부틸히드로퀴논 (THBQ), 프로필 갈레이트, 칼슘 헵토네이트, 칼슘 피테이트, 디에틸 에테르, EDTA, 디나트륨 디수소 EDTA, 에틸 아세테이트, 글리세롤 모노-, 디- 및 트리아세테이트, 글리신, 옥시스테아린, 프로판-1,2-디올 및 프로판-2-올 및 나트륨 헵토네이트가 포함된다.

나트륨 벤조에이트는 살충제 제제에서도 사용되어 왔다. 예를 들면, SC 존슨(Johnson)의 US 특허 4,668,507호는 주 안정화 양식이 부식 억제인 가압 철제 에어로졸 전달 시스템에 함유되어 있는 살충제에서의 나트륨 벤조에이트의 용도에 대해 교시하고 있다. US 특허 제5,620,678호는 부식 억제제로서 나트륨 벤조에이트를 포함하는 살곤충제 제제에 대해 개시하고 있다. US 특허 제4,731,379호는 벼룩을 사멸시키기 위한 동물 샴푸로 사용될 경우 나트륨 벤조에이트를 함유하는 살곤충 조성물에 대해 교시하고 있다. 이 특허에서, 나트륨 벤조에이트의 사용이 살곤충제의 효과성을 증가시키거나 생성물을 안정화시키는 것으로 나타나지는 않으며, 그보다는 처리되는 동물 상처의 치유를 돕는 것으로 생각된다. US 특허 제5,017,620호는 저장 동안 생성물을 안정화하기 위한 항-미생물제로서 사용될 경우 나트륨 벤조에이트 및 다른 공지의 보존제들을 함유하는 살곤충 조성물에 대해 교시하고 있다. US 특허 제6,841,572호는 4.0 내지 6.5 사이의 pH를 가지며 본질적으로 살진균 및/또는 살박테리아 유효 농도의 소르브산, 벤조산 및 락트산; 벤조산, 소르브산, 히드록시메틸 글리신산, 락트산 및 프로피온산의 나트륨, 칼륨, 칼슘 및 암모늄염; 및 메틸, 에틸, 프로필 및 부틸 파라벤으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상 보존제 화합물, 1종 이상의 음이온성 계면활성제, 그리고 임의로 산성화제로 구성되는, 살아있는 식물, 작물, 나무, 수확-전 과실, 채소, 잎, 줄기, 뿌리 및 꽃을 처리하기 위한 수용액에 대해 개시하고 있다.

크로모박테리움 종 균주, 특히 비제한적으로 크로모박테리움 피씨나에, 씨. 슈도비올라세움, 크로모박테리움 서브스투가에를 포함한 비올라세인 생성 균주, 더욱 특히는 크로모박테리움 서브스투가에 sp.nov. 균주, 더욱 더 특히는 US 특허 제7,244,607호에 기술되어 있는 NRRL B-30655의 확인 특성을 가지는 크로모박테리움 서브스투가에 sp.nov. 균주의 상청액, 여과물 및/또는 추출물, 및/또는 상기 상청액, 여과물 및/또는 추출물로부터의 1종 이상의 대사물을 포함하거나 그를 사용하는, 1종 이상의 응애(acari) (거미류(arachnid)), 무씨다에, 드로소필리다에, 안토마이다에, 아피디다에, 트리오지다에, 테네브리오니다에 및/또는 스카라바이에다에 해충의 침입을 조절하기 위한 조성물 및 방법이 제공된다.

구체적으로, 조절이 요구되는 장소에서 거미류, 및/또는 안토마이다에, 드로소필리다에, 무씨다에, 아피디다에, 트리오지다에, 테네브리오니다에 또는 스카라바이에다에 과에 속하는 1종 이상의 곤충 해충의 침입을 조절하기에 효과적인 양의 (a) 크로모박테리움 종 균주의 상청액, 여과물 및/또는 추출물, 및/또는 상기 상청액, 여과물 및/또는 추출물로부터의 1종 이상의 대사물, 및 (b) 또 다른 살충 물질, 특히 응애, 및/또는 안토마이다에, 드로소필리다에, 무씨다에, 아피디다에, 트리오지다에, 테네브리오니다에 또는 스카라바이에다에 과에 속하는 1종 이상의 곤충 해충에 대하여 효과적일 수 있는 살응애제 및/또는 살곤충제를 적용하는 것을 포함하는, 상기 장소에서 거미류 (응애 또는 응애목), 및/또는 안토마이다에, 드로소필라에, 무씨다에, 아피디다에, 트리오지다에, 테네브리오니다에 또는 스카라바이에다에 과에 속하는 1종 이상의 곤충 해충의 침입을 조절하는 방법이 제공된다.

구체적인 실시양태에서, 진드기 침입은 테트라니키다에 (진드기) 침입이다. 더 구체적인 실시양태에서, 상기 진드기 침입은 테트라니쿠스 우르티카에 침입이다.

또 다른 구체적인 실시양태에서, 곤충 해충 침입은 무스카(Musca) 종, 미주스(Myzus) 종, 박테리세라(Bactericera) 종, 시클로세팔라(Cyclocephala) 종 또는 알피토비우스(Alphitobius) 종, 드로소필라(Drosophila) 종, 델리아(Delia) 종, 리조트로구스(Rhizotrogus) 종, 포필리아(Popillia) 종, 아노말라(Anomala) 종 또는 오티오린쿠스(Otiorhynchus) 종 침입이다. 더욱 더 구체적인 실시양태에서, 곤충 해충 침입은 무스카 도메스티카(Musca domesitcas) (집파리), 드로소필라 스즈키이(Drosophila suzukii) (점박이 날개 초파리), 델리아 라디쿰(Delia radicum) (양배추 뿌리 고자리파리), 미주스 페르시카에(Myzus persicae) (복숭아혹 진딧물), 박테리세라 코커렐리(Bactericera cockerelli) (감자 나무이), 알피토비우스 디아페리누스키(Alphitobius diaperinusxi) (부엽토 딱정벌레), 시클로세팔라 루리다(Cyclocephala lurida) (굼벵이), 리조트로구스 마잘리스(Rhizotrogus majalis) (남부 마스키드 샤퍼), 포필라 자포니카(Popilla japonica) (일본 딱정벌레), 오티오린쿠스 술카투스(Otiorhynchus sulcatus) (흑색 포도 바구미), 아노말라 오리엔탈리스(Anomala orientalis) (동양 딱정벌레)이다.

또한, (a) 크로모박테리움 종의 상청액, 여과물 및/또는 추출물, 및/또는 크로모박테리움 종의 상기 상청액, 여과물 및/또는 추출물로부터의 1종 이상의 대사물(들), 및 (b) 또 다른 살충 물질, 특히 응애, 안토마이다에, 드로소필리다에, 무씨다에, 아피디다에, 트리오지다에, 테네브리오니다에 또는 스카라바이에다에 과에 속하는 1종 이상의 곤충 해충에 대하여 효과적일 수 있는 살응애제 및/또는 살곤충제를 활성 성분으로 포함하며, 여기서 (a) 및 (b)는 임의로 상승작용적인 양으로 존재할 수 있는, 1종 이상의 거미류, 및/또는 응애, 안토마이다에, 드로소필리다에, 무씨다에, 아피디다에, 트리오지다에, 테네브리오니다에 또는 스카라바이에다에 과에 속하는 1종 이상의 곤충 해충의 침입을 조절하는 살충 조합물이 본원에 제공된다. 살충 물질은 (a) 미생물; (b) 자연 생성물 및/또는 (c) 화학적 살충제, 특히 화학적 살곤충제로부터 유래할 수 있다.

한 실시양태에서, 상기 대사물은 (a) 살충활성을 가지고; (b) 액체 크로마토그래피/질량 분광분석법 (LC/MS)에 의해 측정하였을 때 약 840-900의 분자량을 가지고; (c) 0.5 mL/분 유량의 물:아세토니트릴 (CH₃CN) 구배 용매계 (0-20분; 90-0% 수성 CH₃CN, 20-24분; 100% CH₃CN, 24-27분; 0-90% 수성 CH₃CN, 27-30분; 90% 수성 CH₃CN), 및 210 nm에서의 UV 검출을 사용하는 역상 C-18 고압 액체 크로마토그래피 (HPLC) 칼럼에서 약 7-12분의 HPLC 체류 시간을 가지고; (d) 임의로 크로모박테리움 종으로부터 수득가능한 화합물일 수 있다. 한 실시양태에서, 상기 화합물은 펩티드일 수 있다.

구체적인 실시양태에서, 상기 화합물은 ¹³C NMR에 의해 측정하였을 때 43개의 탄소, 7개의 메틸, 10개의 메틸렌 탄소, 12개의 메틴, 6개의 올레핀계 메틴, 및 8개의 4급 탄소를 가진다. 더 구체적인 실시양태에서, 상기 화합물은 각각 ##STR001#. ##STR001a##, ##STR001b##, ##STR001c##로 나타낸 화합물 "A", "B", "C", "D"를 포함한다.

구체적인 한 실시양태에서, 상기 화합물 "A"는 (a) 크로모박테리움 종으로부터 수득가능하고; (b) 해충에 대하여 독성이고; (c) 액체 크로마토그래피/질량 분광분석법 (LC/MS)에 의해 측정하였을 때 약 840-890, 더 구체적으로는 860의 분자량을 가지고; (d) δ 8.89, 8.44, 8.24, 8.23, 7.96, 7.63, 6.66, 5.42, 5.36, 5.31, 5.10, 4.13, 4.07, 4.05, 3.96, 3.95, 3.88, 3.77, 3.73, 3.51, 3.44, 3.17, 2.40, 2.27, 2.11, 2.08, 2.03, 2.01, 1.97, 1.95, 1.90, 1.81, 1.68, 1.63, 1.57, 1.53, 1.48, 1.43, 1.35, 1.24, 1.07, 1.02, 0.96, 0.89, 0.88, 0.87, 0.80의 ¹H NMR 값을 가지고, δ 173.62, 172.92, 172.25, 172.17, 171.66, 171.28, 170.45, 132.13, 130.04, 129.98, 129.69, 129.69, 125.48, 98.05, 70.11, 69.75, 68.30, 68.25, 64.34, 60.94, 54.54, 52.82, 49.72, 48.57, 45.68, 40.38, 39.90, 38.18, 36.60, 31.98, 31.62, 31.58, 29.53, 28.83, 27.78, 24.41, 23.06, 22.09, 20.56, 19.31, 18.78, 17.66, 15.80의 ¹³C NMR 값을 가지고; (e) 0.5 mL/분 유량의 물:아세토니트릴 (CH₃CN) 구배 용매계 (0-20분; 90-0% 수성 CH₃CN, 20-24분; 100% CH₃CN, 24-27분; 0-90% 수성 CH₃CN, 27-30분; 90% 수성 CH₃CN), 및 210 nm에서의 UV 검출을 사용하는 역상 C-18 고압 액체 크로마토그래피 (HPLC) (페노메넥스(Phenomenex), 루나(Luna) 5μ C18(2) 100 A, 100×4.60 mm) 칼럼에서 약 7-12분, 더 구체적으로는 약 9분, 더욱 더 구체적으로는 약 9.08분의 HPLC 체류 시간을 가진다.

또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 화합물 "B"는 하기의 특징을 가진다: (a) 크로모박테리움 종으로부터 수득가능하고; (b) 해충에 대하여 독성이고; (c) 액체 크로마토그래피/질량 분광분석법 (LC/MS)에 의해 측정하였을 때 약 850-900, 더 구체적으로는 874의 분자량을 가지고; (d) 0.5 mL/분 유량의 물:아세토니트릴 (CH₃CN) 구배 용매계 (0-20분; 90-0% 수성 CH₃CN, 20-24분; 100% CH₃CN, 24-27분; 0-90% 수성 CH₃CN, 27-30분; 90% 수성 CH₃CN), 및 210 nm에서의 UV 검출을 사용하는 역상 C-18 고압 액체 크로마토그래피 (HPLC) (페노메넥스, 루나 5μ C18(2) 100 A, 100×4.60 mm) 칼럼에서 약 7-12분, 더 구체적으로는 약 9분, 더욱 더 구체적으로는 약 9.54분의 HPLC 체류 시간을 가짐.

상기 대사물은 비제한적으로 하기를 포함한 화합물일 수도 있다:

(A) 하기 화학식 ##STR001##의 구조를 가지는 화합물, 또는 그의 살충용으로 허용되는 염 또는 입체이성질체:

<화학식 ##STR001##>

(상기 식에서, R은 -H, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9개의 알킬 모이어티를 함유하는 저급 쇄 알킬, 아릴 또는 아릴알킬 모이어티, 치환된 저급 알킬이고; X는 O, NH, NR 또는 S이고; n은 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9이고; R₁, R₂, R₃, R₄, R₅, R₆, R₇, R₈, R₉, R₁₀, R₁₁은 각각 독립적으로 H이거나, 동일하거나 상이하며, 독립적으로 아미노산 측쇄 모이어티 또는 아미노산 측쇄 유도체, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 헤테로시클릭, 치환된 헤테로시클릭, 시클로알킬, 치환된 시클로알킬, 알콕시, 치환된 알콕시, 티오알킬, 치환된 티오알킬, 히드록시, 할로겐, 아미노, 아미도, 카르복실, -C(O)H, 아실, 옥시아실, 카르바메이트, 술포닐, 술폰아미드 또는 술푸릴임);

(B) 하기 화학식 ##STR001a##의 구조를 가지는 화합물:

<화학식 ##STR001a##>

(상기 식에서, R은 -H, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9개의 알킬 모이어티를 함유하는 저급 쇄 알킬, 아릴 또는 아릴알킬 모이어티, 치환된 저급 알킬이고; X는 O, NH, NR 또는 S이고; R_2a, R_2b는 -H, 알킬, 저급 알킬, 치환된 알킬 및 치환된 저급 알킬로 이루어진 군에서 독립적으로 선택되고; R₁, R₂, R₃, R₄, R₅, R₆, R₇, R₈, R₉, R₁₀, R₁₁은 각각 독립적으로 H이거나, 동일하거나 상이하며, 독립적으로 아미노산 측쇄 모이어티 또는 아미노산 측쇄 유도체, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 헤테로시클릭, 치환된 헤테로시클릭, 시클로알킬, 치환된 시클로알킬, 알콕시, 치환된 알콕시, 티오알킬, 치환된 티오알킬, 히드록시, 할로겐, 아미노, 아미도, 카르복실, -C(O)H, 아실, 옥시아실, 카르바메이트, 술포닐, 술폰아미드 또는 술푸릴임);

(C) 하기 화학식 ##STR001b##의 구조를 가지는 화합물:

<화학식 ##STR001b##>

(상기 식에서, R은 -H, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9개의 알킬 모이어티를 함유하는 저급 쇄 알킬, 아릴 또는 아릴알킬 모이어티, 치환된 저급 알킬이고; X는 O, NH, NR 또는 S이고; n은 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9이고; R_2a, R_2b는 -H, 알킬, 저급 알킬, 치환된 알킬 및 치환된 저급 알킬로 이루어진 군에서 독립적으로 선택되고; R₁, R₂, R₃, R₄, R₅, R₆, R₇, R₈, R₉, R₁₀, R₁₁은 각각 독립적으로 H이거나, 동일하거나 상이하며, 독립적으로 아미노산 측쇄 모이어티 또는 아미노산 측쇄 유도체, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 헤테로시클릭, 치환된 헤테로시클릭, 시클로알킬, 치환된 시클로알킬, 알콕시, 치환된 알콕시, 티오알킬, 치환된 티오알킬, 히드록시, 할로겐, 아미노, 아미도, 카르복실, -C(O)H, 아실, 옥시아실, 카르바메이트, 술포닐, 술폰아미드 또는 술푸릴임);

(D) 하기 화학식 ##STR001c##의 구조를 가지는 화합물:

<화학식 ##STR001c##>

(상기 식에서, R은 -H, 저급 쇄 알킬, 아릴 또는 아릴알킬 모이어티, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9개의 알킬 모이어티를 함유하는 치환된 저급 알킬이고; X는 O, NH, NR 또는 S이고; n은 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9이고; R_2a, R_2b는 -H, 알킬, 저급 알킬, 치환된 알킬 및 치환된 저급 알킬로 이루어진 군에서 독립적으로 선택되고; R₁, R₂, R₃, R₄, R₅, R₆, R₇, R₈, R₉, R₁₀, R₁₁은 각각 독립적으로 H이거나, 동일하거나 상이하며, 독립적으로 아미노산 측쇄 모이어티 또는 아미노산 측쇄 유도체, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 헤테로시클릭, 치환된 헤테로시클릭, 시클로알킬, 치환된 시클로알킬, 알콕시, 치환된 알콕시, 티오알킬, 치환된 티오알킬, 히드록시, 할로겐, 아미노, 아미도, 카르복실, -C(O)H, 아실, 옥시아실, 카르바메이트, 술포닐, 술폰아미드 또는 술푸릴임).

더 구체적인 실시양태에서, 대사물은 하기 크롬아미드 A (1)이다:

<크롬아미드 A (1)>

구체적인 실시양태에서, 대사물은 화합물 "C"이며, 하기의 특징을 가진다: (a) 크로모박테리움 종으로부터 수득가능하고; (b) 1종 이상의 해충에 대하여 독성이고; (c) 액체 크로마토그래피/질량 분광분석법 (LC/MS)에 의해 측정하였을 때 약 325-360, 더 구체적으로는 약 343의 분자량을 가지고; (d) 0.5 mL/분 유량의 물:아세토니트릴 (CH₃CN) 구배 용매계 (0-20분; 90-0% 수성 CH₃CN, 20-24분; 100% CH₃CN, 24-27분; 0-90% 수성 CH₃CN, 27-30분; 90% 수성 CH₃CN), 및 210 nm에서의 UV 검출을 사용하는 역상 C-18 고압 액체 크로마토그래피 (HPLC) (페노메넥스, 루나 5μ C18(2) 100 A, 100×4.60 mm) 칼럼에서 약 8-14분, 더 구체적으로는 약 10분, 더욱 더 구체적으로는 약 10.88분의 HPLC 체류 시간을 가짐. 구체적인 실시양태에서, 화합물 "C"는 크로모박테리움 비올라세움으로부터 이전에 단리된 공지의 화합물인 비올라세인 (2)일 수 있다.

또 다른 실시양태에서, 상기에 제시된 조성물 및 방법에 사용되는 또 다른 대사물은 화합물 "D"로써, 하기의 특징을 가진다: (a) 크로모박테리움 종으로부터 수득가능하고; (b) 해충에 대하여 독성이고; (c) 액체 크로마토그래피/질량 분광분석법 (LC/MS)에 의해 측정하였을 때 약 315-350, 더 구체적으로는 약 327의 분자량을 가지고; (d) 0.5 mL/분 유량의 물:아세토니트릴 (CH₃CN) 구배 용매계 (0-20분; 90-0% 수성 CH₃CN, 20-24분; 100% CH₃CN, 24-27분; 0-90% 수성 CH₃CN, 27-30분; 90% 수성 CH₃CN), 및 210 nm에서의 UV 검출을 사용하는 역상 C-18 고압 액체 크로마토그래피 (HPLC) (페노메넥스, 루나 5μ C18(2) 100 A, 100×4.60 mm) 칼럼에서 약 10-15분, 더 구체적으로는 약 12분, 더욱 더 구체적으로는 약 12.69분의 HPLC 체류 시간을 가짐. 구체적인 실시양태에서, 화합물 "D"는 크로모박테리움 비올라세움으로부터 이전에 단리된 공지의 화합물인 데옥시비올라세인 (3)을 특징으로 할 수 있다.

또 다른 구체적인 실시양태에서, 화합물은 하기 화학식의 구조를 가질 수 있다:

<화학식>

(상기 식에서, R은 -H, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9개의 알킬 모이어티를 함유하는 저급 쇄 알킬, 아릴 또는 아릴알킬 모이어티, 치환된 저급 알킬, 할로겐이고; R₁, R₂, R₃, R₄, R₅, R₆, R₇, R₈, R₉는 각각 독립적으로 H, 동일하거나 상이한 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 헤테로시클릭, 치환된 헤테로시클릭, 시클로알킬, 치환된 시클로알킬, 알콕시, 치환된 알콕시, 티오알킬, 치환된 티오알킬, 히드록시, 할로겐, 아미노, 아미도, 카르복실, -C(O)H, 아실, 옥시아실, 카르바메이트, 술포닐, 술폰아미드 또는 술푸릴임).

식물에서 침입을 조절하는 데에 효과적인 양의

(I) (a) 살충 및/또는 항미생물 활성을 가지고;

(b) LTQ 오비트랩 XL 하이브리드 푸리에 변환 질량 분광계(LTQ Orbitrap XL hybrid Fourier Transform Mass Spectrometer)에 의해 측정하였을 때 약 950-1450의 분자량을 가지고;

(c) 5.22 (육중선, 1H), 2.62 (dd, 1H), 2.53 (dd, 1H) 및 1.31 (d, 3H)의 ¹H NMR δ 값을 가지고;

(d) 169.2, 67.6, 40.9 및 19.8의 ¹³C NMR δ 값을 가지고;

(d) -(-O-CHCH₃-CH₂-CO-)_n-의 구조를 포함하며, 여기서 n=6-50이고;

(e) 크로모박테리움 종으로부터 수득가능한 화합물, 및

(II) 임의로 또 다른 살충 물질을,

(1) 식물 및/또는 그의 종자, 및/또는 상기 식물을 성장시키는 데에 사용되는 기재에 적용하는 것을 포함하는, 식물에서 해충 (예컨대 선충, 곤충, 토양 매개 박테리아) 침입을 조절하는 방법, 또는 식물, 종자 및/또는 기재에 적용하는 것을 포함하는, 토양에서 토양 매개 박테리아를 조절하는 방법이 추가로 제공된다.

화합물 (I)은 하기 화학식의 구조를 가질 수 있다:

<화학식>

(상기 식에서, X는 독립적으로 -O, -NR 또는 -S이며, 여기서 R은 H 또는 C₁-C₁₀ 알킬이고; Y는 독립적으로 -O, -S이고; n = 6-50이고; R₁, R₂는 각각 독립적으로 H, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 헤테로시클릭, 치환된 헤테로시클릭, 시클로알킬, 치환된 시클로알킬, 알콕시, 치환된 알콕시, 티오알킬, 치환된 티오알킬, 히드록시, 할로겐, 아미노, 아미도, 카르복실, -C(O)H, 아실, 옥시아실, 카르바메이트, 술포닐, 술폰아미드 또는 술푸릴임).

구체적으로, 화합물 (I)은 하기 화학식의 구조를 가진다:

<화학식>

(상기 식에서, n = 10-25임).

가장 구체적인 실시양태에서, 화합물 (I)은 알파-부티르산이다.

상기에서 제시된 화합물들의 수득 방법이 추가로 제공된다. 상기 방법은 화합물을 생성시키기에 충분한 조건하에 전세포 브로쓰(whole cell broth) 중에서 크로모박테리움 종 균주를 배양하고, 전세포 브로쓰로부터 생성된 화합물을 단리하는 것을 포함한다.

관련 측면에서, 일광에의 노출로 인한 물리적 분리 및 활성의 상실로부터 생물학적 살충제 조성물을 안정화하는 데에 효과적인 양의 안정화제를 상기 생물학적 살충제 조성물에 적용하는 것에 의한, 일광에의 노출로 인한 물리적 분리 및 활성의 상실로부터의 생물학적 살충제 조성물을 안정화시키는 방법이 개시된다. 그와 같은 작용제를 포함하는 조성물이 또한 제공된다. 구체적인 실시양태에서, 살충제 조성물은 크로모박테리움 종, 그로부터 유래하는 여과물, 상청액, 추출물 또는 살충 활성 물질을 포함하는데, 이들은 건조 세포 중량 기준 약 0.5% 이상, 구체적으로는 약 0.5 wt% 내지 약 30 wt%의 양으로 존재할 수 있다. 구체적인 실시양태에서, 상기 안정화제는 비제한적으로 나트륨, 칼륨, 칼슘, 마그네슘, 암모늄 및 이들의 조합을 포함하는 벤조산염 및/또는 리그닌염, 특히 리그닌 술포네이트염일 수 있으며, 약 2.5 wt% 이상의 양으로 존재할 수 있고, 바람직하게는 약 5%-15%의 양으로 존재할 수 있다.

도 1은 배양 브로쓰로부터 크롬아미드 A (1), 비올라세인 (2) 및 데옥시비올라세인 (3)을 수득하기 위한 정제 체계의 개략도이다.
도 2는 크롬아미드 A (1), 비올라세인 (2) 및 데옥시비올라세인 (3)의 화학 구조를 도시한다.
도 3은 MBI-203 TSSM 잎 디스크 검정의 결과를 나타낸다. CFD는 냉동 건조된 세포를 나타내는데, 차후 수중에서 재구성되어 원래 전세포 브로쓰의 1/2×, 1× 및 2.5× 용량을 나타낸다.
도 4는 MBI-203 처리된 후추 잎에 노출된 감자 나무이 암컷에 의해 산란되는 평균 난 수를 나타낸다.
도 5는 MBI-203 처리 및 비처리 후추 잎 디스크에 대한 노출 5일 후 나무이 암컷에 의해 산란되는 평균 난 수를 나타낸다.
도 6은 성체 노출 24시간 후 처리된 후추 잎 디스크에서의 복숭아혹 진딧물 (GPA) 유충 및 성체의 평균 수를 나타낸다 (P<0.0001, LSD, α=0.05). 동일 문자의 평균들은 서로 통계적으로 다르지 않다. dH₂O - 음성 대조군, 203 10% v/v - 양성 대조군.
도 7은 성체 노출 3일 후 MBI-203 처리된 후추 잎 디스크에서의 복숭아혹 진딧물 자손 (유충)의 평균 수를 나타낸다 (P<0.0001, LSD, α=0.05). 동일 문자의 평균들은 서로 통계적으로 다르지 않다. dH₂O - 음성 대조군, 아비드(avid) 10% v/v - 양성 대조군.
도 8은 성체 노출 3일 후 MBI-203 및 DF2 (MBI-203 제제화 생성물) 처리된 후추 잎 디스크에서의 복숭아혹 진딧물 자손 (유충)의 평균 수를 나타낸다 (P<0.0001, LSD, α=0.05). 동일 문자의 평균들은 서로 통계적으로 다르지 않다. dH₂O - 음성 대조군, 아비드 10% v/v - 양성 대조군.
도 9는 배양 브로쓰로부터의 비올라세인 (2) 및 올리고-(β-히드록시부티르산) (4)의 정제 체계의 개략도이다.
도 10은 다양한 분획들 및 화합물 올리고-히드록시부티르산 (1)의 살선충 생물검정 결과를 도시한다.
도 11A 및 11B는 노출 24시간 후 처리된 후추 잎 디스크 상에서의 복숭아혹 진딧물 미주스 페르시카에 (유충 및 성체)의 평균 수를 나타낸다. 동일 문자의 평균들은 서로 유의하게 다르지 않다 (LSD, P<0.0001, α=0.05). 203 Me - 메탄올 용매 중 MBI-203 조 추출물, Me - 메탄올 (블랭크 처리), 203, Ace - 아세톤 용매 중 MBI-203 조 추출물, Ace - 아세톤 (블랭크 처리), dH₂O - 음성 대조군, 아비드 10% - 양성 대조군.
도 12A 및 12B는 노출 24시간 후 처리된 후추 잎 디스크 상에서의 복숭아혹 진딧물 미주스 페르시카에 (유충 및 성체)의 평균 수를 나타낸다. 동일 문자의 평균들은 서로 통계적으로 다르지 않다. Ace - 아세톤 단독 (블랭크 처리), DCM -, EA -, 워시 -, MeOH -, dH₂O - 음성 대조군, 203 10% - MBI-203 std (양성 대조군).
도 13은 성체 노출 3일 후 처리된 후추 잎 디스크 상에서의 복숭아혹 진딧물 자손 (유충)의 평균 수를 나타낸다 (P<0.0018, LSD, α=0.05). 동일 문자의 평균들은 서로 통계적으로 다르지 않다. VL1 - 0.5 ㎍/mL의 비올라세인, VL2 - 1.0 ㎍/mL의 비올라세인, 아세톤 - 블랭크 처리, dH₂O - 음성 대조군, 아비드 10% v/v - 양성 대조군.
도 14는 성체 노출 24시간 후 처리된 후추 잎 디스크 상에서의 복숭아혹 진딧물 (GPA) 유충 및 성체의 평균 수를 나타낸다 (P<0.0001, LSD, α=0.05). 동일 문자의 평균들은 서로 통계적으로 다르지 않다. dH₂O - 음성 대조군, 203 10% v/v - 양성 대조군.
도 15는 성체 노출 24시간 후 처리된 후추 잎 디스크 상에서의 복숭아혹 진딧물 (GPA) 유충 및 성체의 평균 수를 나타낸다 (P<0.0001, LSD, α=0.05). 동일 문자의 평균들은 서로 통계적으로 다르지 않다. dH₂O - 음성 대조군, 203 10% v/v - 양성 대조군.
도 16은 물을 0으로 한 3% MBI-203의 일광전 대 일광후 치사율을 나타낸다.
도 17은 MBI-203: 양배추 진딧물 식물 분무 EP/EP+NaBenz를 나타낸다.
도 18은 보정된 MBI-203 EP +/- NaBenz, 양배추 진딧물 식물 분무를 나타낸다.
도 19는 음성 대조군에 대하여 표준화된 MBI-203: EP + CaCO3/NaBenz 일광 전/후를 나타낸다.
도 20은 일광 후 MBI-203 EP SDP, 3 및 6일 검정을 나타낸다.
도 21은 보정된 일광 중 MBI-203 EP w/Na Benz + 리그닌, 4일차 검정을 나타낸다.
도 22는 일광 중 MBI-203 EP w/Na Benz + 리그닌, % 활성 상실, 4일차 검정을 나타낸다.
도 23은 MBI-203: EP + 리그닌 + 일광, 브로콜리 CL 3일차 검정을 나타낸다.

상기한 조성물 및 방법들이 다양한 변형 및 대안적인 형태들을 허용하기는 하지만, 여기에서는 대표적인 실시양태들이 상세하게 기술될 것이다. 그러나, 본 발명을 개시되는 구체적인 형태로 제한하려는 의도는 없으며, 오히려 그 반대로 첨부된 청구범위에 의해 정의되는 바와 같은 본 발명의 기술사상 및 영역 내에 속하는 모든 변형, 등가물 및 대안들을 포괄하고자 한다는 것이 이해되어야 한다.

값의 범위가 제공되는 경우, 문맥상 분명하게 다르게 언급되지 않는 한, 그 범위의 상위 한계와 하위 한계 사이의 하위 한계의 10분의 1 단위까지의 각 개재 값, 및 그 언급 범위 내의 임의의 기타 언급되거나 개재되는 값이 거기에 포함되는 것으로 양해된다. 더 작은 범위 역시 포함된다. 이러한 더 작은 범위의 상위 및 하위 한계 역시 거기에 포함되며, 언급된 범위 내의 소정의 구체적으로 배제되는 한계도 마찬가지이다.

다르게 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어들은 본 발명이 속하는 업계 일반의 숙련자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 본 발명의 실시 또는 시험에서는 본원에서 기술되는 것들과 유사하거나 등가인 소정의 방법 및 물질들이 사용될 수도 있지만, 지금부터는 바람직한 방법 및 물질들을 기술한다.

본원 및 첨부된 청구범위에서 사용될 때, 단수 형태 "a", "and" 및 "the"는 문맥상 분명하게 다르게 언급되지 않는 한 복수의 언급을 포함한다는 것을 알아야 한다.

본원에서 정의될 때, "~로부터 유래하는"은 특정 공급원으로부터 직접 단리되거나 수득되는 것, 또는 다르게는 특정 공급원으로부터 단리 또는 수득되는 물질 또는 생물체의 확인 특성을 가지는 것을 의미한다.

본원에서 정의될 때의 "담체"는 처리될 식물 또는 기타 대상체에 대한 그의 적용, 또는 그의 저장, 수송 및/또는 취급을 용이하게 하기 위하여 활성 성분이 그와 함께 혼합 또는 제제화되는 불활성의 유기 또는 무기 재료이다.

본원에서 사용될 때의 "조절하다"라는 용어는 해충 침입의 양 또는 해충 침입의 확산 속도를 변경시키는 것을 의미하는 데에 사용된다.

본원에서 사용될 때의 "해충 침입"이라는 용어는 숙주 군집에서의 질환 또는 감염, 또는 성장 시스템에서의 원치 않는 잡초의 출현을 포함한 유해 효과를 야기하는 양의 해충의 존재이다.

본원에서 정의될 때의 "살충제"는 식물 해충의 치사율을 증가시키거나 성장 속도를 억제하는 생물학적 생성물 또는 화학 물질로부터 유래하는 물질로써, 살선충제, 살곤충제, 제초제, 식물 살진균제, 식물 살박테리아제 및 식물 살바이러스제가 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본원에서 사용될 때의 "생물학적 살충제"는 살충 특성을 가지는 미생물이다.

제조 방법

상기에서 언급한 바와 같이, 생물학적 살충제는 크로모박테리움 종의 확인 특성을 가지는 생물체, 더 구체적으로는 크로모박테리움 서브스투가에 균주의 확인 특성을 가지는 생물체, 더 구체적으로는 NRRL B-30655의 확인 특성을 가질 수 있는 크로모박테리움 서브스투가에 sp.nov. 균주, 또는 다르게는 임의의 다른 미생물을 포함하거나 그로부터 유래할 수 있다. 방법은 이러한 생물체를 배양하는 것, 및 이러한 생물체의 배양물로부터 해당 화합물을 단리함으로써 본 발명의 화합물 및/또는 조성물을 수득하는 것을 포함한다.

구체적으로, 상기 생물체는 업계에 알려져 있는 방법을 사용하여 영양 배지 중에서 배양된다. 생물체는 적합한 배지에서 세포 성장을 허용하는 조건하에 수행되는 진탕 플라스크 배양, 실험실용 또는 산업용 발효기에서의 소규모 또는 대규모 발효 (비제한적으로 연속, 배치, 공급-배치 또는 고체 상태 발효 포함)에 의해 배양될 수 있다. 배양은 탄소 및 질소 공급원, 및 무기염을 포함하는 적합한 영양 배지 중에서 업계에 알려져 있는 절차를 사용하여 이루어질 수 있다. 적합한 배지는 시중의 공급처로부터 구입될 수 있거나, 또는 공개되어 있는 조성에 따라 제조될 수 있다.

배양 후에는, 배양 브로쓰로부터 본 발명의 화합물 및/또는 조성물이 추출될 수 있다. 상기 추출물은 크로마토그래피에 의해 분별될 수 있다.

조성물

본원에서 개시되는 조성물 및 방법에 사용되는 상기에서 제시된 물질들은 어떠한 방식으로도 제제화될 수 있다. 비-제한적인 제제의 예에는 에멀젼화가능 농축물 (EC), 침윤성 분말 (WP), 가용성 액체 (SL), 에어로졸, 초저부피 농축 용액 (ULV), 가용성 분말 (SP), 미세캡슐화, 수분산 과립, 유동가능제 (FL), 미세에멀젼 (ME), 나노-에멀젼 (NE) 등이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본원에서 기술되는 어떠한 제제에서도, 활성 성분의 백분율은 0.01% 내지 99.99%의 범위 이내이다.

조성물은 액체, 겔 또는 고체의 형태일 수 있다. 액체 조성물은 크로모박테리움 균주, 예를 들면 크로모박테리움 서브스투가에 sp.nov.의 확인 특성, 더 구체적으로는 NRRL B-30655 (US 특허 제7,244,607호 참조)의 확인 특성을 가지는 균주로부터 유래하는 살충제 화합물을 포함한다.

고체 조성물은 살충제 화합물의 용액에 고체 담체를 현탁시키는 것, 및 실온에서의 증발 또는 65℃ 이하에서의 진공 증발과 같은 온건 조건하에서 현탁액을 건조하는 것에 의해 제조될 수 있다.

조성물은 크로모박테리움 균주로부터 유래하는 겔-캡슐화 화합물을 포함할 수 있다. 그와 같은 겔-캡슐화 물질은 겔-형성제 (예컨대 젤라틴, 셀룰로스 또는 리그닌)를 살아있거나 불활성화된 크로모박테리움의 배양물 또는 현탁액, 또는 크로모박테리움 배양물 또는 현탁액의 무-세포 여과물 또는 세포 분획, 또는 분무- 또는 냉동-건조 배양물, 세포 또는 세포 분획, 또는 본 발명의 방법에서 사용되는 살충제 화합물의 용액과 혼합하는 것; 및 작용제의 겔 형성을 유도하는 것에 의해 제조될 수 있다.

조성물은 추가로 에멀젼화, 분산, 침윤, 확산, 통합, 분해 조절, 활성 성분의 안정화, 및 유동성의 향상 또는 부식 억제를 목적으로 사용되는 계면활성제를 포함할 수 있다. 구체적인 실시양태에서, 상기 계면활성제는 바람직하게는 EPA 불활성물질 목록 4B에 속하는 비-식물독성의 비이온성 계면활성제이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 비이온성 계면활성제는 폴리옥시에틸렌 (20) 모노라우레이트이다. 계면활성제의 농도는 전체 제제의 0.1-35% 사이 범위일 수 있으며, 바람직한 범위는 5-25%이다. 비이온성, 음이온성, 양쪽성 및 양이온성 분산제 및 에멀젼화제와 같은 분산제 및 에멀젼화제의 선택, 그리고 사용되는 양은 조성물의 특성, 및 본 발명 조성물의 분산을 촉진하는 작용제의 능력에 의해 결정된다.

상기에 제시되어 있는 바와 같은 조성물은 또한 일광에의 노출로 인한 물리적 분리 및 활성의 상실로부터 생물학적 살충제 조성물을 안정화하는 안정화제를 포함한다. 이와 같은 안정화제는 벤조산염 또는 리그닌 술포네이트염일 수 있다.

상기에서 제시된 조성물은 또 다른 미생물 및/또는 살충제 (예컨대 살선충제, 살진균제, 살곤충제, 항생제 또는 항-미생물제)와 조합될 수 있다. 미생물에는 바실루스(Bacillus) 종, 슈도모나스(Pseudomonas) 종, 브레바바실루스(Brevabacillus) 종, 레카니실리움(Lecanicillium) 종, 비-암펠로마이세스(non-Ampelomyces) 종, 슈도지마(Pseudozyma) 종, 스트렙토마이세스(Streptomyces) 종, 부르콜데리아(Burkholderia) 종, 트리코데르마(Trichoderma) 종, 글리오클라디움(Gliocladium) 종으로부터 유래하는 작용제가 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 다르게는, 작용제는 살진균 및/또는 살곤충 활성을 가지는 천연 오일 또는 오일-생성물 (예컨대 파라핀계 오일, 차나무 오일, 레몬그래스 오일, 정향나무 오일, 신나몬 오일, 감귤 오일, 로즈마리 오일)일 수 있다. 또한, 살충제는 비제한적으로 벤즈이미다졸, 탈메틸화 억제제 (DMI) (예컨대 이미다졸, 피페라진, 피리미딘, 트리아졸), 모르폴린, 히드록시피리미딘, 아닐리노피리미딘, 포스포로티올레이트, 퀴논 외부 억제제, 퀴놀린, 디카르복스이미드, 카르복스이미드, 페닐아미드, 아닐리노피리미딘, 페닐피롤, 방향족 탄화수소, 신남산, 히드록시아닐리드, 항생제, 폴리옥신, 아실아민, 프탈이미드, 벤제노이드 (크실릴알라닌), 이미다졸, 피페라진, 피리미딘 및 트리아졸로 이루어진 군에서 선택되는 탈메틸화 억제제 (예컨대 비테르타놀, 미클로부타닐, 펜코나졸, 프로피코나졸, 트리아디메폰, 브로무코나졸, 시프로코나졸, 디니코나졸, 펜부코나졸, 헥사코나졸, 테부코나졸, 테트라코나졸), 미코부타닐, 및 퀴논 외부 억제제 (예컨대 스트로빌루린)이 포함될 수 있는 단일 부위 항-진균 작용제일 수 있다. 상기 스트로빌루린에는 아족시스트로빈, 크레속심-메토일 또는 트리플록시스트로빈이 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 항-진균제는 퀴논, 예컨대 퀴녹시펜 (5,7-디클로로-4-퀴놀릴 4-플루오로페닐 에테르)이다. 항-진균제는 레이노우트리아(Reynoutria) 추출물로부터 유래할 수도 있다.

살진균제는 또한 클로로니트릴, 퀴녹살린, 술파미드, 포스포네이트, 포스파이트, 디티오카르바메이트, 클로르알킬티오, 페닐피리딘-아민, 시아노-아세트아미드 옥심으로 이루어진 군에서 선택되는 다중-부위 비-무기의 화학적 살진균제일 수 있다.

상기에서 언급한 바와 같이, 조성물은 추가로 살곤충제를 포함할 수 있다. 상기 살곤충제에는 아베르멕틴, 비티, 님 오일, 스피노사드, US 특허 출원 공개 제2011-0207604호에 제시되어 있는 바와 같은 부르콜데르디아(Burkholderdia) 종, 곤충병원성 진균 예컨대 뷰베리아 바씨아나(Beauveria bassiana), 그리고 비제한적으로 유기염소 화합물, 유기인 화합물, 카르바메이트, 피레트로이드 및 네오니코티노이드를 포함한 화학적 살곤충제가 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기에서 언급한 바와 같이, 조성물은 추가로 살선충제를 포함할 수 있다. 이와 같은 살선충제에는 아베르멕틴, 미생물 생성물 예컨대 비오메(Biome) (바실루스 피르무스(Bacillus firmus)), 파스튜리아(Pasteuria) 속 및 유기 생성물 예컨대 사포닌이 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

용도

상기에서 제시된 조성물, 배양물 및 상청액, 그리고 살충제 화합물은 살충제로 사용될 수 있다. 구체적으로, 상기에서 제시된 화합물 또는 조성물은 살곤충제, 살박테리아제 (토양 매개 박테리아 퇴치) 및 살선충제로 사용될 수 있다. 구체적으로, 상기에서 제시된 방법을 사용하여 방제될 수 있는 선충에는 비제한적으로 멜로이도기네(Meloidogyne) 종, 틸렌코린쿠스(Tylenchorhynchus) 종, 호플로라이무스(Hoplolaimus) 종, 헬리코틸렌쿠스(Helicotylenchus) 종, 프라틸렌쿠스(Pratylenchus) 종, 헤테로데라(Heterodera) 종, 글로보데라(Globodera) 종, 트리코도루스(Trichodorus) 종, 파라트리코도루스(Paratrichodorus) 종, 시피네마(Xiphinema) 종, 및 크리코네마(Criconema) 종; 구체적으로는 멜로이도기네 인코그니타(Meloidogyne incognita) (뿌리혹 선충)은 물론, 글로보데라 로스토치엔시스(Globodera rostochiensis) 및 글로보데라 팔리다(globodera pallida) (감자 씨스트 선충); 헤테로데라 글리시네스(Heterodera glycines) (대두 씨스트 선충); 헤테로데라 샤크티이(Heterodera schachtii) (비트 씨스트 선충); 및 헤테로데라 아베나에(Heterodera avenae) (곡물 씨스트 선충)를 포함한 뿌리혹, 씨스트(cyst) 및 썩이(lesion) 선충과 같은 기생성 선충들이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기에서 언급한 바와 같이, 상기에서 제시된 활성 성분(들) 및 조성물은 비제한적으로 파노니쿠스(Panonychus) 종 예컨대 파노니쿠스 시트리(Panonychus citri) (감귤 레드 진드기) 및 파노니쿠스 울미(Panonychus ulmi) (레드 잎진드기), 테트라니쿠스(Tetranychus) 종 예컨대 테트라니쿠스 칸자위(Tetranychus kanzawi) (칸자와 잎진드기), 테트라니쿠스 우르티카에(Tetranychus urticae) (점박이 잎진드기), 테트라니쿠스 파시피쿠스(Tetranychus pacificus) (퍼시픽 잎진드기), 테트라니쿠스 투르케스타니이(Tetranychus turkestanii) (딸기 진드기) 및 테트라니쿠스 신나바리누스(Tetranychus cinnabarinus) (카마인 잎진드기), 올리고니쿠스(Oligonychus) 종 예컨대 올리고니쿠스 파니카에(Oligonychus panicae) (아보카도 브라운 진드기), 올리고니쿠스 페르세아에(Oligonychus perseae) (퍼셔 진드기), 올리고니쿠스 프라텐시스(Oligonychus pratensis) (뱅크스 그래스 진드기) 및 올리고니쿠스 코페아에(Oligonychus coffeae), 아쿨루스(Aculus) 종 예컨대 아쿨루스 코르나투스(Aculus cornatus) (복숭아 실버 진드기), 아쿨루스 포케니(Aculus fockeni) (자두 녹진드기) 및 아쿨루스 리코페르시씨(Aculus lycopersici) (토마토 러셋 진드기), 에오테트라니쿠스(Eotetranychus) 종 예컨대 에오테트라니쿠스 윌라메티(Eotetranychus wilametti), 에오테트라니쿠스 유멘시스(Eotetranychus yumensis) (유마 잎진드기) 및 에오테트라니쿠스 섹스마쿨라티스(Eotetranychus sexmaculatis) (6-점박이 진드기), 브리요비아 루브리오쿨루스(Bryobia rubrioculus) (브라운 진드기), 에피트리메루스 피리(Epitrimerus pyri) (배 녹진드기), 피토프투스 피리(Phytoptus pyri) (배 잎 블리스터 진드기), 아칼리티스 에씨기(Acalitis essigi) (레드 베리 진드기), 폴리파고타르소네무스 라투스(Polyphagotarsonemus latus) (브로드 진드기), 에리오피에스 셸도니(Eriophyes sheldoni) (감귤 버드 진드기), 브레비팔푸스 레위시(Brevipalpus lewisi) (감귤 플랫 진드기), 필로콥트루타 올레이보라(Phylocoptruta oleivora) (감귤 녹진드기), 페트로비아 라틴스(Petrobia lateens) (브라운 밀 진드기), 옥시에누스 막스웰리(Oxyenus maxwelli) (올리브 진드기), 리조글리푸스(Rhizoglyphus) 속, 티로파구스(Tyrophagus) 속, 딥타쿠스 기간토린쿠스(Diptacus gigantorhyncus) (빅헤디드 자두 진드기) 및 펜탈레아아 마조르(Penthaleaa major) (겨울 곡물 진드기), 아보카도 레드 진드기, 플랫 진드기, 블랙 및 레드 망고 잎진드기, 파파야 잎 에드게롤러 진드기, 텍사스 감귤 진드기, 유럽 레드 진드기, 포도 에리늄 진드기 (블리스터 진드기), 퍼시픽 잎진드기, 윌라메트 잎진드기; 핑크 감귤 녹진드기를 포함한 진드기와 같은 응애 (거미류)를 포함하는 장소에도 적용될 수 있다. 그와 같은 장소에는 해당 진드기 또는 다른 거미류 (예컨대 아페니드(aphenid))에 의해 침입된 작물이 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 그와 같은 장소에는 해당 진드기 또는 다른 거미류 (예컨대 아페니드)에 의해 침입된 작물이 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기에서 제시된 방법에 의해 방제되는 식물병원성 곤충에는 (a) 나비목 예를 들면 아클레리스(Acleris) 속, 아독소피에스(Adoxophyes) 속, 아에게리아(Aegeria) 속, 아그로티스(Agrotis) 속, 알라바마 아르길라세아에(Alabama argillaceae), 아밀로이스(Amylois) 속, 안티카르시아 겜마탈리스(Anticarsia gemmatalis), 아르칩스(Archips) 속, 아르기로타에니아(Argyrotaenia) 속, 오토그라파(Autographa) 속, 부쎄올라푸스카(Busseolafusca), 카드라 카우텔라(Cadra cautella), 카르포시나 니뽀넨시스(Carposina nipponensis), 칠로(Chilo) 속, 코리스토네우라(Choristoneura) 속, 클리시아 암비구엘라(Clysia ambiguella), 크나팔로크로시스(Cnaphalocrocis) 속, 크네파시아(Cnephasia) 속, 코킬리스(Cochylis) 속, 콜레오포라(Coleophora) 속, 크로시돌로미아 비노탈리스(Crocidolomia binotalis), 크립토플레비아 류코트레타(Cryptophlebia leucotreta), 시디아(Cydia) 속, 디아트라에아(Diatraea) 속, 디파롭시스 카스타네아(Diparopsis castanea), 에아리아스(Earias) 속, 에페스티아(Ephestia) 속, 유코스마(Eucosma) 속, 유포에실리아 암비구엘라(Eupoecilia ambiguella), 유프록티스(Euproctis) 속, 유크소아(Euxoa) 속, 그라폴리타(Grapholita) 속, 헤디아 누비페라나(Hedya nubiferana), 헬리오티스(Heliothis) 속, 헬룰라 운달리스(Hellula undalis), 히판트리아 쿠네아(Hyphantria cunea), 케이페리아 리코페르시셀라(Keiferia lycopersicella), 류코프테라 씨텔라(Leucoptera scitella), 리토콜레티스(LithocoUethis) 속, 로베시아 보트라나(Lobesia botrana), 리만트리아(Lymantria) 속, 리오네티아(Lyonetia) 속, 말라코소마(Malacosoma) 속, 마메스트라 브라씨카에(Mamestra brassicae), 만두카 섹스타(Manduca 육중선a), 오페로프테라(Operophtera) 속, 오스트리니아 누빌랄리스(Ostrinia nubilalis), 팜메네(Pammene) 속, 판데미스(Pandemis) 속, 파놀리스 플람메아(Panolis flammea), 펙티노포라 고씨피엘라(Pectinophora gossypiella), 프토리마에아 오페르쿨렐라(Phthorimaea operculella), 피에리스 라파에(Pieris rapae), 피에리스(Pieris) 속, 플루텔라 크실로스텔라(Plutella xylostella), 프라이스(Prays) 속, 씨르포파가(Scirpophaga) 속, 세사미아(Sesamia) 속, 스파르가노티스(Sparganothis) 속, 스포돕테라(Spodoptera) 속, 시난테돈(Synanthedon) 속, 타우메토포에아(Thaumetopoea) 속, 토르트릭스(Tortrix) 속, 트리코플루시아 니(Trichoplusia ni) 및 이포노메우타(Yponomeuta) 속; (b) 딱정벌레목 예를 들면 아그리오테스(Agriotes) 속, 알피토비우스(Alphitobius) 종, 아노몰라(Anomola) 속, 예컨대 아노말라 오리엔탈리스(Anomala orientalis); 안토노무스(Anthonomus) 속, 아토마리아 리네아리스(Atomaria linearis), 샤에토크네마 티비알리스(Chaetocnema tibialis), 코스모폴리테스(Cosmopolites) 속, 쿠르쿨리오(Curculio) 속, 시클로세팔라(Cyclocephala) 속, 예컨대 시클로세팔라 루리다(Cyclocephala lurida), 데르메스테스(Dermestes) 속, 디아브로티카(Diabrotica) 속, 에필라크나(Epilachna) 속, 에렘누스(Eremnus) 속, 렙티노타르사 데셈리네아타(Leptinotarsa decemlineata), 리쏘르홉트루스(Lissorhoptrus) 속, 멜로론타(Melolontha) 속, 오리카에필루스(Orycaephilus) 속, 오티오린쿠스(Otiorhynchus) 속, 오티오린쿠스 술카투스(Otiorhynchus sulcatus), 플리크티누스(Phlyctinus) 속, 포필리아(Popillia) 속, 예컨대 포필라 자포니카(Popilla japonica), 프실리오데스(Psylliodes) 속, 리조페르타(Rhizopertha) 속, 예컨대 리조트로구스 마잘리스(Rhizotrogus majalis), 시토필루스(Sitophilus) 속, 시토트로가(Sitotroga) 속, 테네브리오(Tenebrio) 속, 트리볼리움(Tribolium) 속 및 트로고데르마(Trogoderma) 속; (c) 직시목 예를 들면 블라타(Blatta) 속, 블라텔라(Blattella) 속, 그릴로탈파(Gryllotalpa) 속, 류코파에아 마데라에(Leucophaea maderae), 로쿠스타(Locusta) 속, 페리플라네타(Periplaneta) 속 및 시스토세르카(Schistocerca) 속; (d) 흰개미목 예를 들면 레티쿨리테르메스(Reticulitermes) 속; (e) 다듬이벌레목 예를 들면 리포쎌리스(Liposcelis) 속; (f) 이아목 예를 들면 하에마토피누스(Haematopinus) 속, 리노그나투스(Linognathus) 속, 페디쿨루스(Pediculus) 속, 펨피구스(Pemphigus) 속 및 필록세라(Phylloxera) 속; (g) 새털이목 예를 들면 다말리네아(Damalinea) 속 및 트리코덱테스(Trichodectes) 속; (h) 총채벌레목 예를 들면 프랑크리니엘라(Frankliniella) 속, 헤르시노튼리프스(Hercinotnrips) 속, 타에니오트리프스(Taeniothrips) 속, 트리프스 팔미(Thrips palmi), 트리프스 타바시(Thrips tabaci) 및 씨르토트리프스 아우란티이(Scirtothrips aurantii); (i) 노린재목(Heteroptera) 예를 들면 시멕스(Cimex) 속, 디스탄티엘라 테오브로마(Distantiella theobroma), 디스데르쿠스(Dysdercus) 속, 유키스투스(Euchistus) 속, 유리가스테르(Eurygaster) 속, 렙토코리사(Leptocorisa) 속, 네자라(Nezara) 속, 피에스마(Piesma) 속, 로드니우스(Rhodnius) 속, 살베르겔라 싱굴라리스(Sahlbergella singularis), 스코티노파라(Scotinophara) 속 및 트니아토마(Tniatoma) 속; (j) 매미목 예를 들면 알레우로트릭수스 플로코수스(Aleurothrixus floccosus), 알레이로데스 브라씨카에(Aleyrodes brassicae), 아오니디엘라(Aonidiella) 속, 아피디다에(Aphididae), 아피스(Aphis) 속, 아스피디오투스(Aspidiotus) 속, 박테리세라(Bactericera) 속, 베미시아 타바시(Bemisia tabaci), 세로플라스테르(Ceroplaster) 속, 크리솜팔루스 아오니디움(Chrysomphalus aonidium), 크리솜팔루스 딕티오스페르미(Chrysomphalus dictyospermi), 코쿠스 헤스페리둠(Coccus hesperidum), 엠포아스카(Empoasca) 속, 에리오소마 라리게룸(Eriosoma larigerum), 에리트로네우라(Erythroneura) 속, 가스카르디아(Gascardia) 속, 라오델팍스(Laodelphax) 속, 레카니움 코르니(Lecanium corni), 레피도사페스(Lepidosaphes) 속, 마크로시푸스(Macrosiphus) 속, 미주스(Myzus) 속, 네포테틱스(Nephotettix) 속, 닐라파르바타(Nilaparvata) 속, 파라토리아(Paratoria) 속, 펨피구스(Pemphigus) 속, 플라노코쿠스(Planococcus) 속, 슈다울라카스피스(Pseudaulacaspis) 속, 슈도코쿠스(Pseudococcus) 속, 프실라(Psylla) 속, 풀비나리아 아에티오피카(Pulvinaria aethiopica), 쿠아드라스피디오투스(Quadraspidiotus) 속, 로팔로시품(Rhopalosiphum) 속, 사이쎄티아(Saissetia) 속, 스카포이데우스(Scaphoideus) 속, 시자피스(Schizaphis) 속, 시토비온(Sitobion) 속, 트리아류로데스 바포라리오룸(Trialeurodes vaporariorum), 트리오지다에(Triozidae) 속, 트리오자 에리트레아에(Trioza erytreae) 및 우나스피스 시트리(Unaspis citri); (k) 벌목 예를 들면 아크로미르멕스(Acromyrmex), 아타(Atta) 속, 세푸스(Cephus) 속, 디프리온(Diprion) 속, 디프리오니다에(Diprionidae), 길피니아 폴리토마(Gilpinia polytoma), 호플로캄파(Hoplocampa) 속, 라시우스(Lasius) 속, 모노모리움 파라오니스(Monomorium pharaonis), 네오디프리온(Neodiprion) 속, 솔레노프시스(Solenopsis) 속 및 베스파(Vespa) 속; (l) 파리목 예를 들면 아에데스(Aedes) 속, 안테리고나 소카타(Antherigona soccata), 비비오 호르툴라누스(Bibio hortulanus), 칼리포라 에리트로세팔라(Calliphora erythrocephala), 세라티티스(Ceratitis) 속, 크리소미이아(Chrysomyia) 속, 쿠테레브라(Cuterebra) 속, 다쿠스(Dacus) 속, 델리아(Delia) 속, 델리아 라디쿰(Delia radicum), 드로소필라(Drosophila) 속, 예컨대 드로소필라 스즈키이(Drosophila suzukii); 판니아(Fannia) 속, 가스트로필루스(Gastrophilus) 속, 글로씨나(Glossina) 속, 히포데르마(Hypoderma) 속, 히포보스카(Hyppobosca) 속, 리리오미자(Liriomyza) 속, 루실리아(Lucilia) 속, 멜라나그로미자(Melanagromyza) 속, 무스카(Musca) 속, 오에스트루스(Oestrus) 속, 오르세올리아(Orseolia) 속, 오씨넬라프리트(Oscinellafrit), 페고미아 효씨아미(Pegomyia hyoscyami), 포르비아(Phorbia) 속, 라골레티스 포모넬라(Rhagoletis pomonella), 씨아라(Sciara) 속, 스토목시스(Stomoxys) 속, 타바누스(Tabanus) 속, 탄니아(Tannia) 속 및 티풀라(Tipula) 속; (m) 벼룩목 예를 들면 세라토필루스(Ceratophyllus) 속 및 제노프실라 제노프실라 체오피스(Xenopsylla cheopis); (n) 좀목 예를 들면 레피스마 사카리나; (o) 노린재목(Hemiptera), 예를 들면 박테리세라 종, 예컨대 박테리세라 코커렐리(Bactericera cockerelli)에 속하는 비-쿨리시다에(Culicidae) 유충 곤충이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.

활성 성분은 스카라바에이다에 해충을 포함하는 장소에 적용될 수 있다. 여기에는 토양, 초지 및 다양한 관상 식물, 나무 및 채소가 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기에서 제시된 활성 성분(들) 및 조성물은 무씨다에 해충을 포함하는 장소에 적용될 수도 있다. 여기에는 동물 (소, 돼지, 양, 말 등)을 포함하는 실내 환경, 쓰레기, 동물, 담장, 울타리, 헛간, 착유장, 분만 펜스(farrowing pens) 등이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기에서 제시된 활성 성분(들) 및 조성물은 추가로 테네브리오니다에 해충을 포함하는 활성 성분(들) 및 조성물을 포함하는 장소에 적용될 수 있다. 여기에는 동물 (소, 돼지, 양, 말 등)을 포함하는 곡물, 가금류 및 가금류 서식 공간 (담장, 울타리, 헛간, 착유장, 분만 펜스 등)이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.

실시예

하기의 비-제한적인 실시예로써, 상기에서 제시된 조성물 및 방법을 추가 설명할 것이다. 실시예는 단지 다양한 실시양태들의 예시로써, 본원에서 언급되는 물질, 조건, 중량비, 공정 파라미터 등과 관련하여 청구되는 본 발명을 제한하는 것은 아니다.

실시예 1: 크로모박테리움 서브스투가에로부터의 크롬아미드 , 데옥시비올라세인 및 비올라세인의 추출

크로모박테리움 서브스투가에 배양물로부터 추출된 화합물의 정제에는 하기의 절차가 사용된다:

앰버라이트(Amberlite) XAD-7 수지를 사용하여, 세포 현탁액을 수지와 함께 실온에서 2시간 동안 225 rpm으로 진탕함으로써, L-브로쓰 중 씨. 서브스투가에의 10-L 발효로부터 유래하는 배양 브로쓰를 추출한다 (문헌 [Asolkar et al., 2006]). 치즈천(cheesecloth)을 통한 여과에 의해 수지 및 세포 집합체를 수집하고, DI수로 세척하여 염을 제거한다. 다음에, 수지, 세포 집합체 및 치즈천을 아세톤/메탄올 (50/50)에 2시간 동안 침지한 후, 아세톤/메탄올을 여과하고, 회전 증발기를 사용하여 진공하에서 건조함으로써 조 추출물을 산출한다. 다음에, 세파덱스(Sephadex) LH 20 크기 배제 크로마토그래피 (CH₂Cl₂/CH₃OH; 50/50)를 사용하여 조 추출물을 분별함으로써, 7개의 분획을 산출한다 (도 1). 다음에, 회전 증발기를 사용하여 이 분획들을 농축 건조하고, 양배추 자벌레 (트리코플루시아 니) 또는 비트 멸강나방 (스포돕테라 엑시구아)을 사용한 섭식 검정을 사용하여, 생성되는 건조 잔류물을 생물학적 활성에 대하여 스크리닝한다. 다음에, 활성 분획을 역상 HPLC (스펙트라 시스템(Spectra System) P4000 (써모 사이언티픽(Thermo Scientific)))에 적용하여 순수 화합물을 산출한 다음, 상기에서 언급된 생물검정에서 스크리닝함으로써 활성 화합물을 탐색/확인한다. 화합물의 정체성을 확인하기 위하여, LC/MS 및 NMR과 같은 추가적인 분광분석법 데이터를 기록한다.

분획 1 및 2로부터 각각 크롬아미드 A (1) 및 화합물 B가 수득된 반면, 세파덱스 LH20 크로마토그래피로부터 수득된 분획 5로부터는 비올라세인 (2) & 데옥시비올라세인 (3)이 정제되었다.

화합물의 정제

HPLC C-18 칼럼 (페노메넥스, 루나 10μ C18(2) 100 A, 250×10), 2.5 mL/분 유량의 물:아세토니트릴 구배 용매계 (0-10분, 80-75% 수성 CH₃CN; 10-45분, 75-60% 수성 CH₃CN; 45-55분, 60-50% 수성 CH₃CN; 55-65분, 50-100% 수성 CH₃CN; 65-70분, 100% CH₃CN; 55-70분, 0-80% 수성 CH₃CN), 및 210 nm에서의 UV 검출을 사용하여, 크롬아미드 A (1)의 정제를 수행하였다. 활성 화합물 크롬아미드 A (1)은 23.19분의 체류 시간을 가졌다.

HPLC C-18 칼럼 (페노메넥스, 루나 10μ C18(2) 100 A, 250×10), 2.5 mL/분 유량의 물:아세토니트릴 구배 용매계 (0-10분, 80-75% 수성 CH₃CN; 10-45분, 75-60% 수성 CH₃CN; 45-55분, 60-50% 수성 CH₃CN; 55-65분, 50-100% 수성 CH₃CN; 65-70분, 100% CH₃CN; 55-70분, 0-80% 수성 CH₃CN), 및 210 nm에서의 UV 검출을 사용하여, 본 발명 화합물 B의 정제를 수행하였는데, 활성 화합물 B는 26.39분의 체류 시간을 가졌다.

HPLC C-18 칼럼 (페노메넥스, 루나 10μ C18(2) 100 A, 250×10), 2.5 mL/분 유량의 물:아세토니트릴 구배 용매계 (0-10분, 70-60% 수성 CH₃CN; 10-40분, 60-20% 수성 CH₃CN; 40-60분, 20-0% 수성 CH₃CN; 60-65분, 100% CH₃CN; 65-75분, 0-70% 수성 CH₃CN), 및 210 nm에서의 UV 검출을 사용하여, 비올라세인 (2) 및 데옥시비올라세인 (3)의 정제를 수행하였는데, 활성 화합물 비올라세인 (2)는 7.86분의 체류시간, 데옥시비올라세인 (3)은 12.45분의 체류 시간을 가졌다.

화합물의 질량 분광분석법 분석

LCQ 데카(DECA) XP^plus 질량 분광계 (써모 일렉트론 코포레이션(Thermo Electron Corp.), 캘리포니아 산호세 소재) 상에서, 풀 스캔 모드 (m/z 100-1500 Da)로 양이온화 및 음이온화 모드 모두를 사용하여 써모 피니간(Thermo Finnigan) LCQ 데카 XP 플러스 전기분무 (ESI) 기기에서 활성 피크의 질량 분광분석법 분석을 수행한다. 써모 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 기기에는 피니간 서베이어(Finnigan Surveyor) PDA 플러스 검출기, 오토샘플러 플러스, MS 펌프 및 4.6 mm×100 mm 루나 C18 5μ 100 A 칼럼 (페노메넥스)이 장착된다. 용매계는 물 (용매 A) 및 아세토니트릴 (용매 B)로 구성된다. 이동 상은 10%의 용매 B로 시작되어, 20분에 걸쳐 100% 용매 B까지 선형으로 증가된 다음, 4분 동안 유지되고, 최종적으로 3분에 걸쳐 10% 용매 B까지 복귀된 후, 3분 동안 유지된다. 유량은 0.5 mL/분이다. 주사 부피는 10 μL이며, 샘플은 오토 샘플러에서 실온으로 유지된다. 화합물은 LC 및 역상 크로마토그래피를 이용하는 LC-MS에 의해 분석된다. 본 발명 화합물의 질량 분광분석법 분석은 하기의 조건하에서 수행된다: 질소 기체의 유량은 외장 및 aux/스윕 기체 유량으로 각각 30 및 15 arb로 고정되었다. 전기분무 이온화는 5000 V으로 설정된 분무 전압 및 35.0 V의 모세관 전압을 사용하여 수행되었다. 모세관 온도는 400℃로 설정되었다. 데이터는 엑스칼리버(Xcalibur) 소프트웨어에서 분석하였다. 크롬아미드 A (1)은 양이온화 모드에서 860의 분자량을 가진다. 또 다른 활성 화합물 B의 LC-MS 크로마토그램은 양이온화 모드에서 874의 분자량을 나타낸다. 비올라세인 (2) 및 데옥시비올라세인 (3)은 양이온화 모드에서 각각 313 및 327의 분자량을 가졌다.

화합물의 NMR 분광분석법 분석

NMR-NMR 스펙트럼은 브루커(Bruker) 600 MHz 구배 전계 분광계에서 측정되었다. 참조는 내부 표준인 테트라메틸실란 (TMS, 0.00 ppm) 상에 설정된다. 아미노산 분석은 히타치(Hitachi) 8800 아미노산 분석기에서 수행되었다.

구조 해명을 위하여, 600 MHz NMR 기기를 사용하여 860의 분자량을 가지는 정제된 크롬아미드 A를 추가 분석한 바, 8.89, 8.44, 8.24, 8.23, 7.96, 7.63, 6.66, 5.42, 5.36, 5.31, 5.10, 4.13, 4.07, 4.05, 3.96, 3.95, 3.88, 3.77, 3.73, 3.51, 3.44, 3.17, 2.40, 2.27, 2.11, 2.08, 2.03, 2.01, 1.97, 1.95, 1.90, 1.81, 1.68, 1.63, 1.57, 1.53, 1.48, 1.43, 1.35, 1.24, 1.07, 1.02, 0.96, 0.89, 0.88, 0.87, 0.80에서 ¹H NMR δ 값을 가지며 (도 4 참조), 173.62, 172.92, 172.25, 172.17, 171.66, 171.28, 170.45, 132.13, 130.04, 129.98, 129.69, 129.69, 125.48, 98.05, 70.11, 69.75, 68.30, 68.25, 64.34, 60.94, 54.54, 52.82, 49.72, 48.57, 45.68, 40.38, 39.90, 38.18, 36.60, 31.98, 31.62, 31.58, 29.53, 28.83, 27.78, 24.41, 23.06, 22.09, 20.56, 19.31, 18.78, 17.66, 15.80의 ¹³C NMR 값을 가진다. 크롬아미드 A는 백색의 고체로서 단리되었으며, ESI 고-해상도 질량 분광계에 의해 C₄₃H₆₈N₆O₁₂ (불포화도 13)의 분자 화학식으로 분석되었다 (관측치 M⁺ m/z 861.5376, 계산치 M⁺ m/z 861.5343). DMSO-d₆에서의 크롬아미드 A의 ¹H NMR 스펙트럼 데이터는 68개의 양성자 신호를 나타내었는데, 그 중 9개의 양성자 [δ_H: 8.89, 8.44, 8.23, 8.22, 7.96, 7.64, 6.65, 5.10, 4.13]는 이종핵 상관 NMR (HMQC) 분석에서의 탄소 상관 부재로 인하여 NH 또는 OH 중 어느 하나로 할당되었다. ¹³C NMR 스펙트럼은 7개의 카르보닐 신호 [δ_C: 173.62, 172.92, 172.25, 1.72.17, 171.66, 171.28, 170.45]를 나타내었으며, ¹H NMR 스펙트럼에서는 6개의 특징적인 α-아미노 양성자 신호 [δ_H: 4.07, 4.06, 3.96, 3.95, 3.88, 3.72]가 관찰됨으로써, 크롬아미드 A가 펩티드임을 나타내었다.

2D NMR 데이터의 해석은 하나는 류신 (Leu), 하나는 발린 (Val), 하나는 글루타민 (Gln)인 6개 중 3개의 아미노산 단위 할당으로 이어졌다. 이러한 아미노산들의 존재는 아미노산 분석의 결과에 의해 확인되었으며, 상기 3개 아미노산의 존재 역시 밝혀졌다. DEPT 및 2D NMR 스펙트럼 데이터 (COSY, HSQC 및 HMBC)의 추가적인 분석은 하기에 나타낸 바와 같은 3개의 하위-구조 I, II 및 III의 존재를 확립하였다.

1에서의 3개 하위-구조들의 연결은 일상적인 HMBC NMR 분석에 의해 α-아미노 양성자 및/또는 이차 아미드 양성자와 카르보닐 탄소 공명 사이의 상관관계를 사용하고 화학 이동을 고려하여 수행되었다. 하위-구조 II의 C-10에 대한 하위-구조 I의 C-9의 연결은 C-10 탄소 [δ_C: 70.11]에 대한 CH₃-40 [δ_H: 1.00] 및 알라닌의 α-아미노 양성자 [δ_H: 3.42]로부터의 HMBC 상관에 의해 확립되었다. 이는 [δ_C: 49.78]에서의 C-9에 대한 [δ_H: 5.10]에서의 히드록실로부터의 3개 결합 HMBC 상관에 의해 추가 확인되었다. 하위-구조 III으로부터의 [δ_H: 3.50]에서의 메틸렌은 하위-구조 I과 II를 연결시키는 C-19 [δ_C: 68.31]에 대한 3개 결합 HMBC 상관을 나타내었다. C-3 [δ_C: 98.09]에서의 4급 탄소는 1개 고리 시스템을 형성하는 그의 화학 이동 값과 함께 H-21 [δ_H: 3.95]로부터의 약한 상관을 통하여 C-21 [δ_C: 64.40]에 연결되었다. 마지막으로, 고리 폐쇄 연결은 C-1 [δ_C: 172.17]에 대한 H₃-36 [δ_H: 1.43]으로부터의 3개-결합 HMBC 상관에 의해 확보되어, 크롬아미드 A (1)의 평면 구조가 할당되는 것을 가능케 하였다.

874의 분자량을 가지는 화합물 B는 유사한 NMR 및 UV 데이터를 나타냄으로써, 이와 같은 화합물 B 역시 펩티드 종류에 속함을 암시하였다.

비올라세인 (2) 및 데옥시비올라세인 (3)의 구조는 문헌에 공개되어 있는 것들과의 이러한 화합물들의 데이터의 비교에 의해 할당되었다. 크롬아미드 A, 비올라세인 및 데옥시비올라세인의 구조는 도 2에 나타내었다.

실시예 2: 크롬아미드 A의 아미노산 분석

액체 상 가수분해 (6N HCL, 1% 페놀, 110℃, 24시간, 진공)를 사용하여 크롬아미드 A (0.05 mg)을 가수분해하였다. 냉각 후, 반응 혼합물을 건조하고, 가수분해된 생성물을 노르류신(Norleu) 희석 완충제 중에 1.0 mL 부피로 용해시켰다. 분석을 위하여, 50 μl의 샘플을 이온-교환 칼럼 상에 적재하였다.

표준 및 보정의 경우, Na-기반 히타치(Hitachi) 8800 (시그마(Sigma), A-9906) 상의 단백질 가수분해물용 아미노산 표준 용액을 사용하여 반응 계수를 측정함으로써, 모든 아미노산에 대하여 히타치 8800 분석기를 보정한다. 각 주사는 샘플 부피 및 크로마토그래피 변수에서의 변이에 대한 결과의 보정을 가능케 하기 위한 내부 표준으로서 노르류신을 포함한다. 시스템은 피커링(Pickering) Na 완충제, 피어스 순차 등급(Pierce Sequanal grade) HCl (가수분해), 트랜스게놈 이온-교환 칼럼, 및 UC 데이비스(Davis)의 몰레큘라 스트럭쳐 퍼실러티(Molecular Structure Facility) (MSF)에 의해 개발된 최적화된 방법을 이용하는데, 샘플에 존재하는 개별 아미노산이 기록된다. 샘플 (크롬아미드 A)에 존재하는 아미노산은 Glx (글루타민/글루탐산), leu (류신) 및 Val (발린)인 것으로 밝혀졌다.

실시예 3: 점박이 잎진드기에 대한 크로모박테리움 서브스투가에 ( MBI -203)의 효과-콩과 식물

냉동 건조된 MBI-203을 증류수와 혼합함으로써, 전세포 브로쓰 세포 등가물의 농도를 변화시켰다. 비침입 콩과 식물인 파세올루스 불가리스(Phaseolus vulgaris)에 MBI-203를 분무하였다. 다음에, 분무된 식물로부터 잎 디스크를 채취하여, 점박이 잎진드기인 테트라니쿠스 우르티카에를 위한 먹이원으로서 페트리 접시에 위치시켰다. 각 접시에 10마리의 진드기를 위치시키고, 75℉, 12:12 (L:D)로 인큐베이션하였다. 침입 1, 3 및 7일 후에, 살아있거나 사멸된 진드기의 평가를 기록하였다. 1×CFD는 전세포 브로쓰 세포 농도 (0.0103 g 냉동 건조물/mL dH₂O)로 재구성된 냉동 건조 물질이다. 결과를 도 3에 나타내었다.

실시예 4: 점박이 잎진드기에 대한 크로모박테리움 서브스투가에 ( MBI -203)의 효과-금잔화

금잔화인 타게테스 에렉타(Tagetes erecta)를 점박이 잎진드기인 테트라니쿠스 우르티카에로 침입시켰다. 제제화된 생성물 (MBI-203) 또는 체노포디움 암브로시오이데스(Chenopodium ambrosioides) (캘리포니아 데이비스 소재 아그라퀘스트, 인크.(AgraQuest, Inc.)에 의해 레퀴엠(REQUIEM)®으로 판매)를 침입된 식물에 적용하고, 대략 72-85℉ 온도 범위의 온실에서 유지하였다. 샘플링을 위하여 6 cm²의 잎 표면을 수확하고, 살아있거나 사멸된 유충 및 미성숙체의 수를 계수하였다. 결과를 표 1에 나타내었다.

실시예 5: 점박이 잎진드기 ( TSSM )에 대한 크로모박테리움 서브스투가에 ( MBI -203) 스크리닝의 효과-강낭콩

TSSM 또는 아바멕틴-내성 TSSM으로 침입된 강낭콩에 대략 100 gal/에이커로 제제화된 MBI-203의 0.5%, 1%, 2% 및 4% v/v 희석액을 분무하였다. 적용 9일 후, 치사율을 평가하였다. 결과를 표 2에 나타내었다.

실시예 6: 딸기에서의 점박이 잎진드기에 대한 MBI -203의 스크리닝

플로리다 걸프 코스트 연구 및 교육 센터의 포장 딸기 이식체에서, TSSM 방제에 대한 5종의 통상적인 화합물 및 MBI-203 성분의 효능을 평가하였다. 묘를 포장에 이식하였다 (0일차). 각각 12.5-ft인 구획은 20개의 식물로 구성되었다. 식물 당 10 내지 20마리의 운동성 TSSM을 사용하여 55일차부터 71일차까지 4회 구획을 침입시켰다. 일부는 아주반트와 조합된 다양한 살응애제 적용 비율 및 일정의 17개 처리, 그리고 미-처리 대조군을 RCB 설계로 4회 반복하였다. 처리는 45도 코어 및 4번 디스크를 포함하는 노즐이 구비된 분무기 원드(wand)가 있는 휴대용 분무기를 사용하여 적용하였다. 분무기는 CO₂에 의해 40 psi까지 가압되었는데, 에이커 당 100 gal을 전달하도록 보정하였다. 일차 분무 전 90일차부터 최종 처리 적용 후 2주까지 (154일차) 매주 샘플을 수집하였다. 샘플은 구획 당 10개의 무작위로 선택된 잎으로 구성되었으며, 식물의 중간 3분의 1 층에서 수집하였다. 브러시를 사용하여 운동성 및 난 TSSM을 잎으로부터 회전하는 점착성 디스크 상으로 옮기고, 계수하였다. 세포독성은 관찰되지 않았다. 결과를 표 3 및 4에 나타내었다.

실시예 7: 집파리에 대한 크로모박테리움 서브스투가에 ( MBI -203)의 효과

집파리 (성체)에 대한 직접 접촉 효능에 대하여 시험 물질을 스크리닝한다. 각 화합물에 대하여 하기 3개의 처리 군을 둔다: 1.5%, 3% 및 6% 농도 더하기 비처리 대조군. 각 군은 각각 대략 10마리 곤충의 5반복을 포함한다. 용액 뚜껑이 구비된 16 oz. 음료 컵에서, 수동 펌프 분무기를 사용하여 "완전 피복"이 달성될 때까지 절지동물을 처리하게 된다. 4시간차에, 뚜껑의 구멍에 그것을 삽입함으로써, 10% 수크로스 용액을 포함하는 면 볼을 파리에 제공한다. 5, 15, 30, 45, 60분 및 2, 4 및 24시간 또는 종료점까지 데이터를 수집한다. 녹다운(knockdown) 및 치사율은 엎어진 곤충의 상대적인 수를 계수함으로써 측정하였다. 빈사 상태의 곤충은 치사율 합계에 포함시키지 않았다. 결과를 하기 표 5에 나타내었다.

실시예 8: 부엽토 딱정벌레에 대한 크로모박테리움 서브스투가에 ( MBI -203)의 효과

각 화합물에 대하여 하기 3개의 처리 군을 시험하였다: 1.5%, 3% 및 6% 농도 더하기 비처리 대조군. 각 군은 각각 대략 10마리 곤충의 5반복을 포함하였다. 임의의 과량 물질을 흡수하기 위하여 저부에 여과지를 포함하는 천공된 뚜껑이 구비된 8 또는 16 oz. 델리 스?(deli squat) 컵에서, 수동 펌프 분무기를 사용하여 "완전 피복"이 달성될 때까지 절지동물을 처리하였다. 처리 5, 15, 30, 45, 60분 및 2, 4, 24, 48 및 72시간 후에, 녹다운 및 치사율을 관찰하였다. 녹다운 및 치사율은 엎어진 곤충의 상대적인 수를 계수함으로써 측정하였다. 빈사 상태의 곤충은 치사율 합계에 포함시키지 않았다. 결과를 하기 표 6에 나타내었다.

실시예 9: 감자 나무이 박테리세라 코커렐리의 산란 능력에 대한 MBI -203의 효능

방법

MBI-203 처리된 후추(pepper) 잎에 노출된 감자 나무이 암컷의 산란 능력을 측정하였다. 후추 잎을 잎자루에서 절개한 후, 1분 동안 침지함으로써 MBI-203으로 처리하였다. 실험에서의 처리는 하기와 같았다: dH₂O 중 10% v/v의 MBI-203, 음성 대조군으로서의 dH₂O 및 양성 대조군으로서의 10% v/v의 아비드. 처리된 잎은 가장자리가 웰드 오프(welled off)되고 크래프트 발포체(craft foam)로 라이닝되어 있으며 중심 직경을 절제하여 처리된 잎을 노출시킨 플라스틱 페트리 접시에서 유지하였다.

4마리의 1-일령 암컷을 처리된 잎이 노출되어 있는 접시의 중심 (크래프트 발포체의 절제된 부분)에 위치시키고, 페트리 플레이트 덮개로 덮은 후, 2개의 바인더 클립을 사용하여 기구를 폐쇄하였다. 암컷 성체를 산란시키고, 노출 3 내지 10일 후에 난 계수를 수행하였다.

감자 나무이 암컷의 산란 능력에 대한 MBI-203의 효과를 확인하기 위하여, MBI-203 처리 및 비처리 잎에서의 후속 잎 디스크 생물검정을 수행하였다. 수중 3% v/v의 MBI-203 처리 및 비처리 대조군, dH₂O 단독 (음성 대조군)을 검정에 사용하였다. 23 mm 쿠키 커터를 사용하여 후추 잎 디스크 (3-4주령 후추 식물 유래)를 원형을 절단하고, 잎의 편평한 부분을 선택함으로써, 화합물 처리 후 디스크가 한천 플레이트 상에 균일하고 편평하게 놓일 수 있도록 하였다. 30 μL의 1% 한천 용액을 사용하여 겨우 플레이트의 저부를 피복할 정도로 플레이트의 저부를 피복함으로써, 잎 디스크를 받치고 습도를 유지하였다. 실온으로 냉각함으로써 한천을 고체화시켰다. 처리 용액을 유리 페트리 접시에 부어, 잎 디스크의 처리를 수행하였다. 접시 내의 용액을 사용하여, 잎 디스크를 침지한 후 약하게 접시를 흔들어 완전히 침지시켜 코팅하는 것에 의해, 잎 디스크를 처리하였다. 1분 동안 처리를 수행한 다음, 처리된 잎 디스크를 퓸 후드에서 10-15분 동안, 또는 용액이 완전히 건조 제거될 때까지 건조시켰다. 각 고체화된 한천 플레이트에서, 20-30 μL의 dH₂O를 한천 상에 피펫팅하였다. 각 처리된 잎 디스크를 개별적으로 한천 플레이트 상에 놓고, 잎 디스크 배축 측을 아래로 하여 침윤된 한천 상에 위치시킨 후, 약하게 아래로 눌러 디스크를 완전히 한천에 편평화하였다. 처리된 잎 디스크를 포함하는 각 플레이트 (처리)에, 4마리의 암컷 나무이를 도입하였다. 다음에, 알을 밴 암컷을 포함하는 페트리 플레이트를 페트리 플레이트 덮개로 덮고, 환기 및 응축 방지를 위한 작은 구멍을 찔러 만들었다. 파라필름(parafilm)을 사용하여 접시를 밀봉하고, 실온에서 유지하였다. 암컷 도입 다음날부터 산란된 난 수를 매일 계수하였다. 실험은 3반복으로 2회 수행되었다.

결과

MBI-203 처리에 노출된 암컷에서의 유의성 있는 난 감소가 관찰되었다. MBI-203 처리된 잎 디스크에서는 암컷에서 약간의 산란 지연이 보였다. MBI-203 처리된 잎 디스크에 노출된 나무이 암컷은 노출 3일 후에 산란을 시작하였다 (도 4). 암컷이 산란하는 난은 7일차에 최대였으며, 10일차에 감소하였다. 10일차에, 평균 난 계수는 감소하였으며, 암컷이 산란한 난들이 부화하기 시작하였다. 양성 대조군 처리 (아비드 10% v/v)에 노출된 암컷은 3일차에 모두 사멸되었으며, 아비드 처리 잎 디스크에서 산란된 난은 없었다.

확인을 위한 잎 디스크 생물검정은 3% v/v로 MBI-203 처리된 잎 디스크에서의 암컷에 의해 산란된 난의 유의성 있는 감소와 일치하는 결과를 확인해 주었다 (도 5). 비처리 잎 디스크 (dH₂O 단독)에 노출된 암컷에 비해, MBI-203 처리된 잎 디스크에 노출된 암컷은 65%의 난 감소를 나타내었다. 이러한 생물검정 결과는 MBI-203이 나무이 암컷의 생리에 영향을 주어 그의 산란 능력에 영향을 준다는 것을 나타낸다.

실시예 10: 땅벌레 및 왕쇠똥구리에 대한 MBI -203의 효과

잔디에서의 굼벵이의 방제

네브라스카 노스 벤드 소재 노스 벤드 골프 코스의 켄터키 블루그래스 (포아 프라텐시스(Poa pratensis) L.) 및 페레니알 라이그래스 러프(perennial ryegrass rough) (롤리움 페렌네(Lolium perenne) L.)에서, 굼벵이 (남부 마스키드 샤퍼, 시클로세팔라 루리다 블랜드(Cyclocephala lurida Bland))의 방제에 대하여 살곤충제를 평가하였다. 5반복의 무작위화된 완전 블록 (RCB) 설계로 배열된 5×5 ft 구획에 살곤충제를 적용하였다. CO₂ 분무기를 사용하여 40 psi로 액체 생성물을 적용하고, 174 gpa 최종 분무를 적용하였다. 적용 후 24시간 이내에, 모든 처리를 0.25 in의 물을 사용하여 관개하였다. 처리 24일 및 48일 후 (DAT)에, 각 구획으로부터 3개의 8-인치 직경 잔디-토양 코어 (총 면적 1.05 ft²)를 3 인치의 깊이로 제거하여, 살아있거나 빈사상태인 땅벌레의 수를 계수함으로써, 제제를 평가하였다. 구획을 주기적으로 식물독성에 대하여 평가하였다. 결과를 표 7 및 8에 나타내었다.

MBI-203 DF1 처리에 있어서의 적용 비율과 % 방제 사이에는 상관관계가 있는 것으로 보인다. MBI-203 DF1 (2 fl oz/100 ft²) 이외의 모든 처리는 트리클로르폰 6% (바이엘 크롭사이언스, 인크.(Bayer CropScience, Inc.)에서 딜록스(DYLOX)® 420 SL (6.9 fl.oz/1000 ft²)로 판매, 굼벵이 방제용 업계 표준 살곤충제)를 능가하였다. 흥미롭게도, MBI-203 AF1 및 MBI-203 DF1의 모든 처리에서 빈사상태인 개체들이 발견되었다. 이러한 숫자들 (괄호 내)은 통계 분석에는 사용되지 않았으나, 비교 목적으로 포함시켰다. 식물독성은 관찰되지 않았다. AF1은 크로모박테리움 서브스투가에의 수성 유동성제이며, DF1은 침윤성 분말 제제이다.

기타 뿌리 섭식 왕쇠똥구리에 대한 MBI -203의 효과에 대한 섭식 연구

비멸균 그로튼(Groton) 토양 (pH 4.25, 유기 물질 14%)을 왕쇠똥구리인 동양 딱정벌레 유충 (아노말라 오리엔탈리스)로 침입시키고, 사멸된 유충의 수를 평가하였다. 토양에 MBI-203의 수성 유동성 제제를 투여하고, % 치사율을 계산하였다.

5 g 토양 중 생성물 1.5 ml 및 1 ml를 사용하여, 왕쇠똥구리인 리조트로구스 마잘리스 (유럽 샤퍼) 땅벌레에서 유사한 시험을 설정하였다. 7 DAT에 100/100 유충이 사멸되었으며, 대조군에서는 어느 것도 사멸되지 않았다.

포팅(potting) 배지 (먹이원 없음), 당근 및 탁수스(Taxus) 뿌리를 사용하여, 흑색 포도 바구미 유충인 오티오린쿠스 술카투스 (쿠르쿨리오니다에)에서도 시험을 수행하였다. 결과를 표 10, 11, 12 및 13에 나타내었다.

MBI-203은 특히 처리된 먹이원을 섭식하였을 때, 뿌리 섭식 왕쇠똥구리 딱정벌레 및 바구미에 대하여 매우 활성인 것으로 보인다.

실시예 11: 양배추 뿌리 고자리파리에 대한 MBI -203의 효과

케이지형 온실 연구에서, 브로콜리 식물에서의 양배추 고자리파리 (델리아 라디쿰)의 방제에 있어서의 MBI-203 제제의 효능을 확인하기 위하여, 본 연구를 수행하였다. 실험 처리: 2 oz/1000 ft² 및 8 oz/1000 ft² 비율에서의 MBI-203 DF-1 (MBI-203의 침윤성 분말 제제); 2 oz/1000 ft² 및 8 oz/1000 ft² 비율에서의 MBI-203 DF-2 (MBI-203의 제2 침윤성 분말 제제). 실험 처리를 1 lb/gal 비율의 시중 표준인 라디안트(RADIANT)^® (다우아그로 사이언시스(DowAgro Sciences)에 의해 판매되며, 활성 성분으로서 스피네포람(spineforam)을 함유함)과 비교하였다.

3차 적용 14일 후 (14 DA-C)까지 매주 살아 있는 성체 곤충의 수를 기록하고, 21 DA-C까지 매주 살아 있는 유충의 수를 기록하였다. 결과는 MBI-203 DF-1이 최종 평가일까지 상당히 적은 수의 성체를 우화시킴으로써, 라디안트^®와 유사하다는 것을 보여주었다. MBI-203 DF-1은 최종 평가일까지 UTC보다 상당히 더 적은 수의 성체를 우화시킴으로써, 방제에 있어서 라디안트와 유사하였다.

실시예 12: 온실 내 딸기에서의 드로소필라 스즈키이 (점박이 날개 초파리 (SWD))의 방제에 있어서의 MBI -203 DF1 및 MBI -203 DF2 의 효능

온실의 딸기 작물에서, 점박이 날개 초파리 (SWD)의 방제에 있어서의 MBI-203 DF1 및 MBI-203 DF2의 효능을 확인하기 위하여 본 연구를 수행하였다. MBI-203 DF1 및 MBI-203 DF2의 실험 처리는 반복 구획에 대하여 1 lb/a 및 4 lb/a의 비율로 적용하였다. 처리는 시중의 표준인 1.5 oz/a 비율의 엔트러스트(Entrust)^®과 비교하였다. 모든 처리는 0.05% v/v 비율의 계면활성제 실?(SILWET)^® L77 (켐투라 아그로솔루션즈, 인크.(Chemtura AgroSolutions, Inc.))와 조합하였다. 1개의 딸기 식물을 포함하는 각 반복 구획은 곤충 군집의 이동을 방지하기 위하여 케이지화하였다.

3세대 실험실 성장 SWD 날개보유 성체를 케이지화된 각 딸기 이식체에 방출하였다. 적용 전 (사전-계수), 적용 4일 후 (DAA), 7 DAA 및 11 DAA에, 성체 SWD 계수를 기록하였다. 14 DAA, 21 DAA, 28 DAA 및 35 DAA에는, 딸기 당 SWD 유충의 수를 기록하였다. 통계는 LSD 검정 및 α=0.05를 사용하는 ANOVA 평균 비교를 사용하여 분석하였다.

일차 적용 후, MBI-203 처리는 점박이 날개 초파리 성체의 점진적인 감소를 나타내었으며, DF1 및 DF2 생성물 모두에서 비율 반응(rate response)이 관찰되었다. 활성 성분으로서 스피노사드를 함유하는 엔트러스트® (다우 아그로바이오사이언시스(Dow AgroBioSciences))와 유의하게 유사하지는 않았지만, 4 lb/a에서의 MBI-203 DF2는 일차 적용 7일 후 (DAA)에 UTC에 비해 25%까지 성체 군집을 유의하게 감소시켰다. UTC와 통계적으로 다르지는 않았지만, 11 DAA까지, 4 lb/a에서의 DF1 및 DF2 모두는 성체 계수를 44%까지 감소시켰다. 양 MBI-203 생성물들은 SWD 유충 계수의 감소에서는 유의성 있는 결과를 나타내었다. 모든 평가에서, 4 lb/a에서의 DF2는 활성 성분으로서 스피노사드를 함유하는 엔트러스트® (다우 아그로바이오사이언시스)의 78%와 유사하게 71%까지 딸기 당 유충의 수를 유의하게 감소시켰으며; 또한 21 DAA까지, 모든 MBI-203 처리에서 72%까지 유충 계수가 조절되었는데, 모두 엔트러스트® (다우 아그로바이오사이언시스)와 유사하였다. 유충 계수와 관련하여서는, MBI-203 DF1 및 MBI-203 DF2 모두에서 비율 반응이 관찰되었다.

결과:

상기 발견들은 하기와 같이 요약될 수 있다:

* SWD 성체 및 유충 계수의 감소에 있어서, MBI-203 DF1 및 DF2에서 비율 반응이 관찰되었음.

* 4 lb/a의 MBI-203 DF2는 7 DAA에 성체 군집을 25%까지 유의하게 감소시켰음.

* 시험 내내, 4 lb/a의 DF2는 딸기 당 유충의 수를 유의하게 감소시켰는데, 엔트러스트와 유사하였음.

양 생성물의 적용이 성체 군집에 대해서는 커다란 효과를 나타내지 않았지만, 다음 세대에서의 유충 군집은 유의하게 감소시켰다.

실시예 13: 진딧물에 대한 MBI -203의 기피 효과

복숭아혹 진딧물에 대한 다양한 농도의 MBI-203의 기피 효과 평가를 수행하였다. 구체적으로, 수중 3개 처리 농도의 MBI-203 (1% v/v, 3% v/v 및 10% v/v)을 평가하였다. MBI-203 10% v/v 농도는 양성 대조군으로 사용되었으며, dH₂O 단독 처리가 음성 대조군으로 사용되었다. 각 처리 용액에는 0.01%의 트윈(TWEEN) 20을 첨가하였다.

상기에 언급한 바와 같은 각 MBI-203 농도를 사용하여 후추 잎 디스크를 처리함으로써 생물검정을 수행하였다. 23 mm 쿠키 커터를 사용하여 후추 잎 디스크 (3-4주령 후추 식물 유래)를 원형을 절단하고, 잎의 편평한 부분을 선택함으로써, 화합물 처리 후 잎 디스크가 한천 플레이트에 균일하고 편평하게 놓일 수 있도록 하였다. 1% 한천 용액을 가열에 의해 용융시킨 후, 플레이트의 저부 표면을 피복하기에 충분하도록 145 mm×20 mm 페트리 플레이트에 부어, 잎 디스크를 받치고 습도를 유지하였다. 실온으로 냉각함으로써 한천을 고체화시켰다.

처리 용액을 유리 페트리 접시에 부어, 잎 디스크 처리를 수행하였다. 접시 내의 용액을 사용하여, 잎 디스크를 침지한 후 약하게 접시를 흔들어 완전히 침지시켜 코팅하는 것에 의해, 잎 디스크를 처리하였다. 침지시키는 것에 의한 잎 디스크의 처리는 1분 동안 수행하였다. 다음에, 처리된 잎 디스크를 핀셋을 사용하여 용액으로부터 꺼내어 10-15분 동안 또는 용액이 잎 표면에서 완전히 건조 제거될 때까지 퓸 후드에 위치시키는 것에 의해 건조시켰다. 일단 잎 디스크가 건조되고 나면, 40 μL의 물을 잎 디스크가 놓이게 될 한천 상에 피펫팅하였다. 다음에, 처리된 잎 디스크를 각 디스크 배축 측을 아래로 위치시켜, 침윤된 한천 표면 상에 서로 등거리로 놓았다. 각 디스크를 약하게 아래로 눌러 완전히 한천에 편평화하고, 미세 페인트 브러시를 사용하여 접시 중심에 20마리의 3-4일령 GPA 성체를 도입하였다. 다음에, 플레이트를 덮고, 파라필름으로 밀봉하였다. 페트리 플레이트 덮개에 환기 및 응축 방지를 위한 작은 구멍을 찔러 만들었다.

시험은 3반복으로 수행하였다. 성체 및 유충의 기피율 데이터는 처리된 잎 디스크를 사용한 플레이트에서의 성체의 노출 24시간 후에 측정하였다. 각 잎에 존재하는 진딧물 (성체 및 유충)의 수를 계수하여, 데이터를 기록하고 분석하였다.

결과:

상이한 MBI-203 농도에서 97-99%의 기피율을 가지므로, MBI-203은 GPA 성체 및 유충에 대하여 기피성이다 (표 18). 도 6은 처리 농도들 간의 통계적 차이를 나타낸다. 3% 및 1% v/v 농도에서의 MBI-203은 각각 97% 및 99% 기피율의 평균 % 기피율을 산출하였다.

실시예 14: MBI -203 적용은 진딧물 자손을 감소시킴

복숭아혹 진딧물 (GPA) 성체의 자손 생산에 대한 화합물의 효과를 확인하기 위하여, 3% v/v 농도의 MBI-203을 시험하였다. 3% v/v의 MBI-203을 사용하여 후추 잎 디스크를 처리함으로써, 생물검정을 수행하였다. 23 mm 쿠키 커터를 사용하여 후추 잎 디스크 (3-4주령 후추 식물 유래)를 원형을 절단하고, 잎의 편평한 부분을 선택함으로써, 디스크가 한천 플레이트 상에 균일하고 편평하게 놓일 수 있도록 하였다. 1% 한천 용액을 가열에 의해 용융시킨 후, 겨우 플레이트의 저부를 피복할 정도로 30 μL를 각 페트리 플레이트 (16 mm×35 mm 배기형, 폴리스티렌 페트리 플레이트)에 부어, 잎 디스크를 받치고 습도를 유지하였다. 실온으로 냉각함으로써 한천을 고체화시켰다. 처리 용액을 유리 페트리 접시에 부어, 잎 디스크 처리를 수행하였다. 접시 내의 용액을 사용하여, 잎 디스크를 침지한 후 약하게 접시를 흔들어 완전히 침지시켜 코팅하는 것에 의해, 잎 디스크를 처리하였다. 침지시키는 것에 의한 잎 디스크의 처리는 1분 동안 수행하였다. 처리된 잎 디스크를 퓸 후드에서 10-15분 동안 또는 용액이 잎 표면에서 완전히 건조 제거될 때까지 건조시켰다. 각 처리된 잎 디스크를 개별적으로 한천 플레이트 상에 놓고, 잎 디스크 배축 측을 아래로 하여 침윤된 한천 상에 위치시킨 후, 약하게 아래로 눌러 디스크를 완전히 한천에 편평화하였다. 처리된 잎 디스크를 포함하는 각 플레이트 (처리)에, 6마리의 GPA 성체 (3-4일령)를 도입하였다. 다음에, 성체 진딧물을 포함하는 플레이트를 파라필름으로 덮었다. 파라필름 덮개에 환기 및 응축 방지를 위한 작은 구멍을 찔러 만들었다. 플레이트를 실온에서 인큐베이션하였다. 처리된 잎 디스크에 대한 성체 노출 3일 후에, 자손 (초기 유충령)을 계수하였다. 실험은 3반복으로 수행하였으며, 전체 실험을 5회 반복하였다.

도 7은 처리된 잎 디스크에의 노출 3일 후 MBI-203이 GPA 성체의 자손 생산에 유의하게 영향을 준다는 것을 보여준다. 도 5의 그래프는 수행된 5회 시험의 결과인데, GPA 성체의 자손 감소가 음성 대조군 (수 단독 처리)에 비해 50%를 초과하는 것으로 관찰되었으며, 그 성능이 양성 대조군 (10% 아비드)에 필적함으로써, 자손 생산에 있어서 통계적으로 동일함을 보여주었다. 제제화된 생성물 DF2와 비교하여 자손 생산 수를 시험하였을 경우, 3% v/v 농도에서 MBI-203 표준과 DF2 사이에 통계적 차이는 없었다 (도 8). 음성 대조군과 비교하였을 때에는 MBI-203 및 DF2 처리에서 90%를 초과하는 자손 (유충) 감소가 나타났는데, 이는 10% v/v 농도 (양성 대조군)에서는 아비드보다 상당히 더 우수하다는 것을 보여준다.

실시예 15: 크로모박테리움 서브스투가에로부터의 비올라세인 및 올리고-(β- 히드록시부티르산 )의 추출

크로모박테리움 서브스투가에 배양물로부터 추출된 화합물의 정제에는 하기의 절차를 사용하였다:

L-브로쓰에서의 씨. 서브스투가에 20-L 발효에서 유래하는 전체 배양 브로쓰 (WCB)를 에틸 아세테이트를 사용한 액체-액체 추출법에 의해 추출하였다. 에틸 아세테이트 층을 분리하고, 회전 증발기를 사용하여 진공하에서 건조함으로써, 조 추출물을 산출하였다. 다음에, 조 추출물을 디클로로메탄 (DCM), 에틸 아세테이트 (EA), 메탄올 (MeOH)과 같은 상이한 용매들을 사용하여 분별한 후, 용매 혼합물을 사용하여 세척하였다 (워시(WASH)). 다음에, 해당 분획들을 회전 증발기를 사용하여 농축 건조하고, 생성되는 건조 잔류물을 상이한 해충들 (곤충, 선충)을 사용하여 생물학적 활성에 대하여 스크리닝하였다. 다음에, 활성 분획을 세파덱스 LH 20 크기 배제 크로마토그래피 (CH₂Cl₂/CH₃OH; 50/50)에 적용하여 10개 분획을 산출하였다 (도 9). 다음에, 이 분획들을 회전 증발기를 사용하여 농축 건조하고, 생성되는 건조 잔류물 (분획)을 복숭아혹 진딧물을 사용하는 곤충 기피 검정, 복숭아혹 진딧물 (GPA)의 자손 생산 및 살선충 생물검정 (엠. 인코그니타 및/또는 엠. 하플라)을 사용하여 생물학적 활성에 대하여 스크리닝하였다. 다음에, 활성 분획을 역상 HPLC (스펙트라 시스템(Spectra System) P4000 (써모 퍼시픽))에 적용함으로써 순수 화합물을 산출한 다음, 활성 화합물을 탐색/확인하기 위하여 상기 언급된 생물검정에서 그것을 스크리닝하였다. 화합물의 정체성을 확인하기 위하여, LC/MS 및 NMR과 같은 추가적인 분광분석법 데이터를 기록하였다.

분획 F8, F9 & F10으로부터 강력한 살곤충 기피 화합물을 단리하여, 비올라세인 (2)으로 확인하였다. 주 DCM 분획으로부터의 살선충 활성 화합물은 올리고-(β-히드록시부티르산) (4)으로 확인되었다.

화합물의 질량 분광분석법 분석

LCQ 데카 XP^plus 질량 분광계 (써모 일렉트론 코포레이션, 캘리포니아 산호세 소재) 상에서, 풀 스캔 모드 (m/z 100-1500 Da)로 양이온화 및 음이온화 모드 모두를 사용하여 써모 피니간 LCQ 데카 XP 플러스 전기분무 (ESI) 기기에서 활성 피크의 질량 분광분석법 분석을 수행하였다. 써모 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 기기에는 피니간 서베이어 PDA 플러스 검출기, 오토샘플러 플러스, MS 펌프 및 4.6 mm×100 mm 루나 C18 5μ 100 A 칼럼 (페노메넥스)이 장착되었다. 용매계는 물 (용매 A) 및 아세토니트릴 (용매 B)로 구성되었다. 이동 상은 10%의 용매 B로 시작되어, 20분에 걸쳐 100% 용매 B까지 선형으로 증가된 다음, 4분 동안 유지되고, 최종적으로 3분에 걸쳐 10% 용매 B까지 복귀된 후, 3분 동안 유지된다. 유량은 0.5 mL/분이다. 주사 부피는 10 μL이었으며, 샘플은 오토 샘플러에서 실온으로 유지된다. 화합물은 LC 및 역상 크로마토그래피를 이용하는 LC-MS에 의해 분석된다. 본 발명 화합물의 질량 분광분석법 분석은 하기의 조건하에서 수행된다: 질소 기체의 유량은 외장 및 aux/스윕 기체 유량으로 각각 30 및 15 arb로 고정되었다. 전기분무 이온화는 5000 V으로 설정된 분무 전압 및 35.0 V의 모세관 전압을 사용하여 수행되었다. 모세관 온도는 400℃로 설정되었다. 데이터는 엑스칼리버 소프트웨어에서 분석하였다. 올리고-(β-히드록시부티르산) (1)의 분석은 UC 데이비스 질량 분광측정법 설비에서 LTQ 오비트랩 XL 하이브리드 푸리에 변환 질량 분광계를 사용하여 수행하였다.

화합물의 NMR 분광분석법 분석

NMR-NMR 스펙트럼은 브루커 600 MHz 구배 전계 분광계에서 측정하였다. 참조는 내부 표준인 테트라메틸실란 (TMS, 0.00 ppm) 상에 설정된다.

화합물의 정제

디클로로메탄 (DCM) 분획을 메탄올과 혼합한 후, 수득되는 백색의 고체를 여과 분리함으로써, 올리고-(β-히드록시부티르산) (1)을 산출하였다.

화합물의 확인

올리고-(β-히드록시부티르산) (1)

화합물 4의 ¹H NMR 스펙트럼은 δ 5.22 (육중선), 2.62 (dd) 및 2.53 (dd)에서 각각 1개 양성자의 상대적 강도로 신호를 나타내었다. δ에서의 이러한 메틸 신호 이외에, 이중선으로서의 1.31도 관찰되었다. ¹³C NMR 스펙트럼은 δ 169.2, 67.6, 40.9 및 19.8에서 4개의 탄소 신호만을 나타내었다. 상세한 1D & 2D NMR 분석은 단편 질량 86의 부분 구조 -(-O-CHCH₃-CH₂-CO-)-로 이어졌다. 이와 같은 화합물의 MALDI-TOF-ESI MS (도 2)는 분자 질량 [(n×86) + Na]의 올리고머 혼합물과 관련한 통상적인 신호 패턴을 나타내었는데, 해당 생성물은 n=10-25의 올리고-(β-히드록시부티르산) 1 혼합물이었다. 이와 같은 화합물은 수종의 박테리아에서 단리된 것으로 보고된 바 있다 (문헌 [Singh et al., 2011]; [Maskey et al., 2002]; [Hahn et al., 1995]). 엠. 하플라를 사용한 시험관내 검정으로 DCM 분획으로부터 수득된 이와 같은 화합물의 효능을 확인한 바, 75%의 고정률(immobility)을 나타내었다 (도 10).

크로모박테리움 서브스투가에의 분획들 및 순수 화합물의 시험관내 시험

분획들 및 순수 화합물을 디메틸술폭시드 (DMSO)에 용해시키고, 시험관내 96-웰 플라스틱 세포-배양 플레이트 생물검정으로 시험하였다. 수용액 50 μl 중 약 15-20마리의 선충을 25℃에서 24시간의 기간 동안 4 mg/ml 샘플 100 μl에 노출시켰다. 인큐베이션 기간이 완료되고 나서, 샘플을 사용하여 처리된 각 웰에서의 선충 유충 (J2's)의 고정률의 가시적인 등급을 기준으로 결과를 기록하고; 각 웰에서 4반복으로 각 처리를 시험하였다. 결과를 씨. 서브스투가에 분획 및 화합물 4의 2회의 상이한 96-웰 플레이트 생물검정 결과를 보여주는 도 5에 나타내었다. 1개의 양성 (1% 아비드) & 2개의 음성 (DMSO & 수)로써; 각 시험마다 3개의 대조군을 포함시켰다. 양 시험 (T1) 및 (T2)는 엠. 하플라 선충을 사용하여 수행하였다.

기피의 원인이 되는 화합물의 단리 및 확인

하기에서 상세하게 기술되는 바와 같은 복숭아혹 진딧물 (GPA) 생물검정을 사용하여, DCM, EA, MeOH 및 워시와 같은 주 분획들을 기피 활성에 대하여 시험하였다. 가장 강력한 기피율은 EA 및 MEOH 분획에서 관찰되었다. 이들 분획의 LCMS 분석이 유사한 화학적 프로필을 나타내었고, MeOH 분획의 산출이 EA 분획에 비해 더 높았으므로, 상세한 화학적 작업은 MeOH 분획을 사용하여 수행하였다. MeOH 분획을 세파덱스 LH 20 크기 배제 크로마토그래피 (CH₂Cl₂/CH₃OH; 50/50)를 사용하여 추가 분별함으로써, 10개 분획을 산출하였다 (도 9). 가장 강력한 활성은 분획 F9 및 F10에서 관찰되었다. HPLC와 세파덱스 LH 20의 조합에 의한 이들 분획의 생물검정 유도 정제는 기피 활성의 원인이 되는 화합물로 비올라세인을 산출하였다. 비올라세인을 진딧물 자손 시험에서도 시험하였다.

실시예 16: 복숭아혹 진딧물에서의 MBI -203 분획들의 기피 효과

방법

MBI-203 분획들 및 순수 화합물을 사용하여 복숭아혹 진딧물 성체 (GPA)에서의 선택 생물검정을 수행하였다. 씨. 서브스투가에 (MBI-203) 세포 페이스트의 추출로부터 수득된 분획들 및 순수 화합물 (비올라세인)을 기피 생물검정을 통해 곤충 효능에 대하여 시험하였다. 23 mm 쿠키 커터를 사용하여 후추 잎 디스크 (3-4주령 후추 식물 유래)를 원형을 절단하고, 잎의 편평한 부분을 선택함으로써, 화합물 처리 후 잎 디스크가 한천 플레이트에 균일하고 편평하게 놓일 수 있도록 하였다. 수중 1 퍼센트 (%)의 한천을 제조하였다. 1% 한천 용액을 가열에 의해 용융시킨 후, 플레이트의 저부 표면을 피복하기에 충분하도록 145 mm×20 mm 페트리 플레이트에 부어, 잎 디스크를 받치고 습도를 유지하였다. 실온으로 냉각함으로써 한천을 고체화시켰다.

잎 디스크의 저면 상에 100 μL의 MBI-203 추출물을 조심스럽게 피펫팅함으로써, 잎 디스크 처리를 수행하였다. 다음에, 디스크를 표지된 12-웰 플레이트 덮개 상에 편평하게 놓음으로써, 처리된 잎 디스크를 건조시켰다. 일단 잎 디스크가 건조되고 나면, 40 μL의 물을 잎 디스크가 놓이게 될 한천 상에 피펫팅하였다. 다음에, 처리된 잎 디스크를 각 디스크 배축 측을 아래로 하고 처리된 표면을 위로 위치시켜, 침윤된 한천 표면 상에 서로 등거리로 놓았다. 각 디스크를 약하게 아래로 눌러 완전히 한천에 편평화하였다. 처리된 잎 디스크를 놓은 후, 미세 페인트 브러시를 사용하여 접시 중심에 20마리의 3-4일령 GPA 성체를 도입하였다. 다음에, 플레이트를 덮고, 파라필름으로 밀봉하였다. 페트리 플레이트 덮개에 환기 및 응축 방지를 위한 작은 구멍을 찔러 만들었다.

모든 시험은 3반복으로 수행하였다. 시험용 용매를 선택하기 위하여, 용매로서 메탄올 및 아세톤을 사용하여 조 추출물의 최초 시험을 수행하였다. 이 시험은 아세톤이 용매로서 더 우수함을 보여주었다. 이어서, 용매로서 아세톤을 사용하여, 분획들 및 순수 화합물 (비올라세인)을 포함한 샘플 시험을 수행하였다. 처리된 잎 디스크에 대한 성체의 노출 24시간 후에, 성체 및 유충의 기피에 대한 데이터를 측정하였다. 진딧물 (성체 및 유충)의 수를 계수하여, 데이터를 기록하고 분석하였다. 하기 수학식과 같이 % 기피율을 계산하였다: % 기피율 = 100-{("처리된 잎에서의" [N+A])/"페트리 접시에서의" [N+A] ×100} (상기 식에서, A는 성체를 나타내며, N은 유충을 나타냄).

결과

조 추출물을 사용하여 MBI-203 분획들에 대한 기피 시험을 시작하였다. 메탄올 및 아세톤 용매 중 조 추출물을 시험하였는데, 결과의 분석은 도 11에 나타낸 바와 같은 유의성 있는 차이를 보여주었다. 메탄올 및 아세톤 용매 모두에서, MBI-203의 조 추출물을 사용하여 처리된 잎 디스크는 복숭아혹 진딧물 유충 및 성체의 정착 반응에 있어서 음성 대조군의 것과 통계적으로 유의성 있는 차이를 초래하였다. 도 11A 및 B는 진딧물에 대한 MBI-203의 기피 효과를 보여준다. 그러나, 메탄올 용매가 진딧물에 대한 기피 효과를 나타냄으로써 (도 11A), MBI-203 추출물 및 양성 대조군 (아비드 10%)과의 통계적 차이를 나타내지 않았다. 용매 아세톤은 분획에서 사용하기에 우수한 용매인 것으로 나타났는데, 음성 대조군과 통계적으로 동일한 잎 디스크에서의 평균 유충 및 성체 정착 수를 가짐으로써 그것이 GPA 유충 및 성체에 대하여 기피를 나타내지 않았기 때문이다 (도 11B).

MBI-203의 분획은 GPA 유충 및 성체에 대하여 강한 기피를 나타내었다. 처리 평균들 간에는 통계적인 차이가 관찰되었다 (도 12A 및 B). 분별된 물질 EA 및 MeOH는 유충 및 성체에서 100% 기피율을 야기한 반면, 워시 물질은 양성 대조군 (MBI-203 10% v/v)과 통계적으로 다르지 않은 94% 기피율을 야기하였다 (표 19).

또한, 용매로서 아세톤을 사용하여, MeOH 분획으로부터 수득된 10개 분획을 시험하였는데; 순수 비올라세인 화합물을 포함하는 샘플 (F9, F10)이 복숭아혹 진딧물의 성체 및 유충에 대한 높은 기피 효과를 나타내었다 (표 20). 2개의 비-비올라세인 분획만이 높은 기피 효과를 나타내었다 (F2 및 F3). 분획 F9 및 F10을 추가로 정제하자, 100% 기피율을 가지는 비올라세인이 산출되었다. 데이터는 비올라세인이 흡즙성 곤충에 대하여 기피를 야기함에 있어서 원인이 되는 화합물임을 밝혔다. 분별 물질 F6-F10이 비올라세인을 함유하되, F9 및 F10이 순수 비올라세인 화합물을 함유하는 것으로 보인다.

실시예 17: 비올라세인은 진딧물 자손을 감소시킴

복숭아혹 진딧물 (GPA) 성체의 자손 생산에 대한 화합물의 효과를 측정하기 위하여, 2종 농도의 아세톤 중 순수 비올라세인 화합물 0.5 ㎍/mL 및 1.0 ㎍/mL를 시험에 사용하였다. 상이한 아세톤 중 비올라세인 농도를 사용하여 후추 잎 디스크를 처리함으로써, 생물검정을 수행하였다. 후추 잎 디스크 (3-4주령 후추 식물 유래)를 23 mm 직경의 디스크로 절단하고, 잎의 편평한 부분을 선택함으로써, 화합물 처리 후 디스크가 한천 플레이트 상에 균일하고 편평하게 놓일 수 있도록 하였다. 1% 한천 용액을 제조하고, 가열에 의해 용융시킨 후, 겨우 플레이트의 저부를 피복할 정도로 30 μL를 페트리 접시 (16 mm×35 mm 배기형, 폴리스티렌 페트리플레이트)에 부어, 잎 디스크를 지지하고 습도를 유지하였다. 실온으로 냉각함으로써 한천을 고체화시켰다. 200 μL 피펫맨(pipetman)을 사용하여 잎 디스크 상에 100 μL의 샘플 용액을 조심스럽게 확산시킴으로써, 비올라세인을 사용한 처리를 수행하였다. 처리는 3반복으로 설정하였다. 처리된 잎 디스크를 후드에서 5-10분 동안 건조시켰다. 양성 대조군은 10% v/v 아비드이었으며, 음성 대조군은 dH₂O이었고, 아세톤이 블랭크으로 사용되었다. 각 고체화된 한천 플레이트에서, 습도를 유지하기 위하여, 20-30 μL의 dH₂O를 한천 상에 피펫팅하였다. 각 처리된 잎 디스크를 개별적으로 한천 플레이트 상에 놓고, 잎 디스크 배축 측을 아래로 하여 침윤된 한천 상에 위치시킨 후, 약하게 아래로 눌러 디스크를 완전히 한천 상에 편평화하였다. 처리된 잎 디스크를 포함하는 각 플레이트 (처리)에, 6마리의 GPA 성체 (3-4일령)를 도입하였다. 다음에, 성체 진딧물을 포함하는 플레이트를 파라필름으로 덮었다. 덮개 파라필름에 응축 방지 환기용 구멍을 찔러 만들고, 실온에서 유지하였다. 처리된 잎 디스크에 대한 성체 노출 3일 후에, 자손 (초기 유충령)을 계수하였다. 실험은 3반복으로 수행하였으며, 전체 실험을 2회 반복하였다.

도 13에 나타낸 바와 같이, 1.0 ㎍/mL의 비올라세인은 성체 진딧물의 자손 생산을 유의하게 감소시켰다. 음성 대조군 (수 단독 처리)에 비해 약 50%의 감소가 관찰되었다. 양성 대조군 (10% 아비드)이 가장 적은 수의 자손을 가졌는데, 대부분의 노출된 성체가 노출 3일 후에는 사멸하였기 때문이다. 본 실험에서는 2회의 시험을 수행하였으며, 각 처리는 3회 반복하였다. 양 시험은 비올라세인이 자손에 대하여 유의하게 영향을 준다는 일관된 결과를 제공하였다.

실시예 18: 기타 비올라세인 생성자들이 진딧물에 대하여 기피를 나타냄

복숭아혹 진딧물에 대한 다른 크로모박테리움 종의 기피 효과도 평가하였다. 평가된 크로모박테리움 종은 하기이다: 크로모박테리움 피씨나에 DSM 23278, 씨. 슈도비올라세움 DSM 23279, 씨. 하에몰리티쿰 DSM 19808 및 씨. 아쿠아티쿰 DSM 19852. 상기 종들 중 2종은 비올라세인 생성 종 (씨. 피씨나에 및 씨. 슈도비올)인 반면, 다른 2종의 종은 비올라세인을 생성하지 않는 것으로 보고되어 있다. 26℃ 및 100 rpm으로 5일 동안, LB 브로쓰에서 미생물을 성장시켰다. 발효 종료시에, 브로쓰를 수확하여, 생물검정용으로 분취하였다. GPA 성체 상에서, 수 중 5% v/v의 처리 농도를 시험하였다. MBI-203 10% v/v 농도를 양성 대조군으로 사용하였으며, dH₂O 단독 처리를 음성 대조군으로 사용하였다. 각 처리 용액은 0.01%의 트윈 20과 함께 첨가되었다.

전기에서 기술된 바와 같이 후추 잎 디스크를 처리함으로써, 생물검정을 수행하였다. 각 처리된 디스크를 약하게 아래로 눌러, 완전히 한천 상에 편평화하였다. 처리된 잎 디스크를 놓은 후, 미세 페인트 브러시를 사용하여, 20마리의 3-4일령 GPA 성체를 접시 중심에 도입하였다. 다음에, 파라필름을 사용하여, 플레이트를 피복 및 밀봉하였다. 페트리 플레이트 덮개에 환기 및 응축 방지를 위한 작은 구멍을 찔러 만들었다.

시험은 3반복으로 수행하였다. 처리된 잎 디스크를 포함하는 플레이트에 대한 성체의 노출 24시간 후, 성체 및 유충의 기피율 데이터를 측정하였다. 각 잎 디스크 상에 정착된 진딧물 (성체 및 유충)의 수를 계수하여, 데이터를 기록하고 분석하였다. % 기피율은 하기 수학식과 같이 계산하였다:

<수학식>

(상기 식에서, N = 유충의 수이며, A = 성체 진딧물의 수임).

결과를 표 21 및 22, 그리고 도 14 및 15에 나타내었다. 수종의 비올라세인-생성 크로모박테리움 종들이 처리 평균들간 통계적 차이를 동반하여 GPA 성체 및 유충에 대한 기피를 나타내었다. 비올라세인을 생성하는 크로모박테리움 종들은 75% (씨. 피씨나에), 86% (씨. 슈도비올라세움)의 평균 % 기피율을 가진 반면, 비-비올라세인 생성자 (씨. 아쿠아티쿰 및 씨. 하에몰리티쿰)는 비처리 대조군 (수)과 통계적으로 다르지 않았다. 비-비올라세인 생성자의 경우, 약간의 기피 경향은 관찰되었다.

실시예 19: 나트륨 벤조에이트가 있거나 없는 크로모박테리움 제제의 안정성 비교

제제 1은 크로모박테리움 세포 농축 수확물 32 부, 크로모박테리움 발효 브로쓰 상청액 62.5 부, n-헥산올 1 부, 나트륨 알기네이트 0.5 부, 소르비탄 에스테르 에톡실레이트 2 부, 및 d-리모넨 2 부를 함유한다. 이러한 제제 성분들은 균일하고 안정한 혼합물을 보장하는 그의 기능성으로 선택되며, 또한 US EPA 목록 4에서의 그의 열거에 따라 선호된다. EPA 목록 4에서의 성분의 열거는 그들을 환경에 대한 효과 및 독성 면에서 최소한의 관련성을 가지고 있는 것으로 간주한다. 제제 2는 크로모박테리움 세포 농축 수확물 32 부, 크로모박테리움 발효 브로쓰 상청액 54.5 부, n-헥산올 1 부, 나트륨 알기네이트 0.5 부, 소르비탄 에스테르 에톡실레이트 2 부, 및 나트륨 벤조에이트 10 부를 함유한다.

표 23은 장기간의 연장된 시간 기간에 걸친 제제 1 & 2 저장의 결과를 나타낸다.

제제 2가 제제 1에 비해 더 안정하다. 벤조산의 수용성 염이 일광에의 노출로 인한 물리적 분리 및 활성의 상실로부터 생물학적 상충제 조성물을 안정화하는 것으로 보인다. 벤조에이트 이온이 용매성 및 전해질 균형 특성을 제공함으로써, 생물학적 매트릭스가 균일하게 유지되고, 이는 살충제 조성물의 연장된 보관 수명을 초래한다. 벤조에이트 이온은 또한 그것이 포장 작물에 적용되었을 때, 생성물에 자외 방사선 흡수를 제공한다. UV 보호는 추가적인 수일 이상 동안 살곤충제 활성을 연장한다.

실시예 20: 해충 치사율에 대한 나트륨 벤조에이트의 효과

크로모박테리움 서브스투가에, d-리모넨, 헥산올, 프로필렌 글리콜 및 파라벤 제제를 함유하며 칼슘 카르보네이트, 나트륨 벤조에이트 또는 이산화 티타늄과 조합된 최종 생성물 MBI-203 (MBI-203 EP)을 플라스틱 페트리 접시에 위치시키고, 파라필름으로 밀봉하였다. 플레이트를 7시간 동안 외부에서 일광에 위치시켰다. 일광 노출 후, 물질을 실내로 들여와, 오토클레이빙된 밀리포어수를 사용하여 1.5% 및 3% v/v 농도로 희석하였다. 다음에, 물질을 인공 먹이 상에 위치시키고, 건조하여, 신생 양배추 자벌레 트리코플루시아 니에 섭식시켰다. 먹이 침입 3 및 4일 후, 치사율을 기록하였다. 결과를 표 24 및 도 16에 나타내었다.

브로콜리 연구

4-5주령의 팩맨(Packman) 브로콜리에 나트륨 벤조에이트가 있거나 없는 MBI-203 최종 생성물 (d-리모넨 제제) (MBI-203 EP)의 3% v/v 희석액을 분무하였다. 9 in² 포트 내의 각 식물에 500 μL의 처리를 수행하였다. 모든 샘플에, 최종 농도 0.01%의 트윈-20을 포함시켰다. 5마리의 성체 양배추 진딧물 브레비코리네 브라씨카에를 각 식물에 위치시켰다. 성장광(growth light) (75-85℉, 16시간 광/8시간 암)하에서 식물과 곤충을 인큐베이션하였다. 침입 3, 5 및 7일 후에, 살아 있는 진딧물을 기록하였다. 나트륨 벤조에이트 제제가 최종 생성물 단독에 비해 더 우수한 방제를 제공한 것으로 보였다 (도 17).

적색 양배추 연구

나트륨 벤조에이트가 있거나 없는 MBI-203 최종 생성물 (d-리모넨 제제) (MBI-203 EP)의 10% v/v 희석액을 대략 30 gal/에이커 처리 비율로 적색 양배추에 분무하였다. 10% v/v의 제제 블랭크 (군 2403-83-3)도 검정에 포함시켰다. 식물을 건조한 후, 10마리의 양배추 진딧물로 그것을 침입시켰다. 3, 6 및 8일차에 검정을 기록하였다. 헨더슨-틸튼(Henderson-Tilton) 보정을 적용함으로써, % 방제를 측정하였다. 결과를 도 18에 나타내었다. 최종 생성물 + 나트륨 벤조에이트 제제가 최종 생성물 단독 또는 제제 블랭크 단독에 비해 더 우수한 진딧물 방제를 나타내었다.

실시예 21: 나트륨 벤조에이트와 칼슘 카르보네이트의 비교

다양한 농도의 나트륨 벤조에이트 또는 칼슘 카르보네이트를 포함하는 미희석 MBI-203 최종 생성물 (MBI-203 EP)을 밀봉된 플라스틱 페트리 접시에서 1일 동안 일광에 노출시켰다. 다음에, 일광-노출 및 미노출 물질을 3% v/v 희석액으로 희석하여 인공 먹이에 적용하였다. 신생 양배추 자벌레를 먹이에 노출시키고, 먹이 침입 4일 후에 치사율을 기록하였다. 결과를 도 19에 나타내었다. 10% 및 15% 농도의 나트륨 벤조에이트가 가장 경제적인 가격으로 최소한의 활성 저하를 제공하는 것으로 보였다.

실시예 22: 리그닌 술포네이트의 효과

다양한 첨가제를 포함하는 미희석 분무 건조 세포를 플라스틱 바이알에 붓고, 어떤 날에는 물을 뿌리면서 40-65℉의 일광인 4일 동안 환경에 노출시켰다. 노출 및 미노출 샘플을 6% v/v로 희석하고, 팩맨 브로콜리 식물에 분무하였다. 건조된 식물에 5 마리의 미성숙 양배추 진딧물을 침입시켰다. 침입 3 및 6일 후에 진딧물을 기록하였다. 헨더슨-틸튼 보정을 적용함으로써, 방제를 측정하였다. 나트륨 벤조에이트를 포함하는 분무 건조 세포가 3일차에 최고 사멸률 중 하나를 나타내었으며, 6일차까지 검정이 계속될 때 방제를 유지하였다 (도 20 참조).

MBI-203 최종 생성물 (d-리모넨 제제) (MBI-203 EP)을 다양한 농도의 나트륨 벤조에이트 및 리그닌 술포네이트와 혼합하였다. 10% v/v 농도로 처리를 희석하여, 플라스틱 페트리 접시에 피펫팅하고, 4 연속일 동안 일광에 노출시켰다. 다음에, 인공 먹이를 처리함으로써, 양배추 자벌레 활성에 대하여 샘플을 시험하였다. 리그닌 술포네이트 처리는 인공 먹이의 상부를 덮는 엉김을 형성하는 경향이 있었다. 나트륨 벤조에이트만을 포함하는 최종 생성물이 일광 노출 전 및 후에 가장 탁월한 사멸률을 가지는 것으로 보였다 (도 21 및 22 참조).

또 다른 연구에서는, 10% 나트륨 벤조에이트 및 다양한 농도의 리그닌 술포네이트를 포함하는 MBI-203 최종 생성물 (d-리모넨 제제)의 10% v/v 희석액을 밀봉된 플라스틱 페트리 접시에서 4연속일 동안 일광에 노출시켰다. 노출 후, 대략 30 gal/에이커 비율의 처리를 4주령의 팩맨 브로콜리에 분무하였다. 3마리의 후기 2령 양배추 자벌레 유충을 처리된 각 식물에 위치시키고, 검정 3 및 4일차에 치사율을 기록하였다. 일광하 식물 중, 나트륨 벤조에이트 단독 샘플이 최고의 방제를 나타내었다 (도 23 참조).

본 발명이 구체적인 실시양태를 참조하여 기술되기는 하였지만, 그의 세부사항이 제한하는 것으로 간주되어서는 아니 되는데, 누군가 다양한 등가물, 변화 및 변형을 사용하면서도 여전히 본 발명의 영역에 속할 수 있다는 것은 자명하기 때문이다.

본 명세서 내내 다양한 참고문헌들이 인용된 바, 그 각각은 그의 전체가 본원에 참조로써 개재된다.

Claims (23)

1. 조절이 요구되는 장소에서 해충의 침입(infestation)을 조절하는 방법으로서,
   상기 해충은 응애(Acari), 무씨다에(Muscidae), 드로소필리다에(Drosophilidae), 안토마이다에(Anthomyidae), 아피디다에(Aphididae), 트리오지다에(Triozidae), 테네브리오니다에(Tenebrionidae) 및 스카라바에이다에(Scarabaeidae)로부터 선택되며,
   크로모박테리움 서브스투가에(Chromobacterium substugae) Nov 균주(NRRL B-30655) 발효로부터 수집된 전세포 브로쓰를 포함하는 조성물을 상기 침입을 조절하기에 효과적인 양으로 적용하는 단계를 포함하는 방법.
2. 제1항에 있어서, 조절이 요구되는 장소가 식물, 식물 종자 상 또는 토양 내인 방법.
3. 제1항에 있어서, 상기 해충이 응애이며, 응애는 진드기(mite)인 방법.
4. 제3항에 있어서, 상기 진드기가 테트라니쿠스(Tetranychus) 종인 방법.
5. 제4항에 있어서, 상기 테트라니쿠스 종이 테트라니쿠스 우르티카에(Tetranychus urticae)인 방법.
6. 제1항에 있어서, 상기 해충이 무스카(Musca) 종, 미주스(Myzus) 종, 박테리세라(Bactericera) 종, 시클로세팔라(Cyclocephala) 종, 알피토비우스(Alphitobius) 종, 드로소필라(Drosophila) 종, 델리아(Delia) 종, 리조트로구스(Rhizotrogus) 종, 포필리아(Popillia) 종, 아노말라(Anomala) 종, 및 오티오린쿠스(Otiorhynchus) 종으로부터 선택된 것인 방법.
7. 제1항에 있어서, 상기 해충이 무스카 도메스티카스(Musca domesticas), 드로소필라 스즈키이(Drosophila suzukii), 델리아 라디쿰(Delia radicum), 미주스 페르시카에(Myzus persicae), 박테리세라 코커렐리(Bactericera cockerelli), 알피토비우스 디아페리누스키(Alphitobius diaperinusxi), 시클로세팔라 루리다(Cyclocephala lurida), 리조트로구스 마잘리스(Rhizotrogus majalis), 포필라 자포니카(Popilla japonica), 오티오린쿠스 술카투스(Otiorhynchus sulcatus), 또는 아노말라 오리엔탈리스(Anomala orientalis)를 포함하는 것인 방법.
8. 제1항에 있어서, 상기 해충이 스카라바에이다에 유충인 방법.
9. 제1항에 있어서, 상기 조성물이 전세포 브로쓰로부터의 상청액, 여과물, 또는 추출물을 포함하는 것인 방법.
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