JPH05236973A - 共重合体の微生物学的製法 - Google Patents

共重合体の微生物学的製法

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JPH05236973A
JPH05236973A JP2400947A JP40094790A JPH05236973A JP H05236973 A JPH05236973 A JP H05236973A JP 2400947 A JP2400947 A JP 2400947A JP 40094790 A JP40094790 A JP 40094790A JP H05236973 A JPH05236973 A JP H05236973A
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bacteria
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Abstract

(57)【要約】 【目的】 ＨＢ及びＨＶモノマー成分を含む共重合体の
微生物学的製造方法及びそのための微生物の提供。 【構成】 新規な微生物を生長制限条件下で培養するこ
とによりＨＢ／ＨＶ共重合体が高効率で得られる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、３−ヒドロキシブチレ
ート（ＨＢ）モノマー単位と３−ヒドロキシバレレート
（ＨＶ）モノマー単位を含む共重合体の微生物学的製造
方法、ならびにそのような微生物学的方法における使用
のために適合された新規微生物に関する。
【０００２】
【従来の技術及び問題点】ポリヒドロキシブチレート
（ＰＨＢ）と称されるＨＢモノマー単位からなるホモポ
リマーは、種々の微生物、殊に細菌によって、微生物細
胞内に顆粒の形でエネルギー備蓄物質として蓄積され
る。そのような細胞から抽出されるＰＨＢは、比較的高
レベル、例えば７０％またはそれ以上まで結晶化する熱
可塑性ポリエステルであり、下記の繰返し構造を有す
る。 −Ｏ・ＣＨ（ＣＨ3 ）・ＣＨ2 ・ＣＯ− この結晶化挙動は、重合体が、例えば成形用材料として
使用されるときには、不利であることが多い。ＰＨＢの
結晶化は、重合体鎖中に非類似のモノマーの単位を導入
して、それにより共重合体を形成することにより改変で
きることは知られている。ＨＢモノマー単位と少割合の
非類似単位とを含む共重合体は、ある種の微生物を、あ
る種の酸及びアルコールの存在下にある種の条件下で培
養することにより製造されうる。エチレン系不飽和を指
示するといわれる赤外線バンドを示す重合体は、デービ
ス氏によって「Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏ
ｇｙ」１２（１９６４）第３０１〜３０４頁に記載され
ており、これらの重合体は、デービス氏によれば、３−
ヒドロキシ−２−ブチレート単位と、３−ヒドロキシ−
２−ブテノネート単位、すなわち式 −Ｏ・Ｃ（ＣＨ3 ）＝ＣＨ・ＣＯ− の単位と、からなると言われており、ノカルジア（Ｎｏ
ｃａｒｄｉａ）をｎ−ブタンで培養することにより製造
された。
【０００３】ウオーレン氏等は「Ｅｎｖｉｒｏｍｅｎｔ
ａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇ
ｙ」６（１９７２），１６１−１６４及び８（１９７
４），５７６−５７９において、活性汚泥から単離され
（繰返し洗浄後）に９７〜１００℃で溶融し、そして３
−ヒドロキシブチレート単位と３−ヒドロキシバレレー
ト単位、すなわち −Ｏ・ＣＨ（Ｃ2 Ｈ5 ）・ＣＨ2 ・ＣＯ− 単位とを１：５の比で含む重合体を記載している。マー
チェスサウルト氏等は「ＩＵＰＡＣ Ｍａｃｒｏ Ｆｌ
ｏｒｅｎｃｅ １９８０ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ
Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕ
ｌｅｓ Ｐｒｅｐｒｉｎｔｓ」２（１９８０）２７２−
２７５において、この重合体の研究を報告し、それが主
として３−ヒドロキシバレレート単位を含むことを確認
している。米国特許第３２７５６１０号明細書には、あ
る種の微生物、特にノカルジア・サルモニコロル（Ｎｏ
ｃａｒｄｉａ ｓａｌｍｏｎｉｃｏｌｏｒ）を、４個の
炭素原子を含むカルボン酸で培養することによるポリエ
ステルの微生物学的製造が記載されている。欧州特許明
細書００６９４９７には、適当な基質で、ある種の微生
物、特にアルカリゲネス・ユウトロフス（Ａｌｋａｌｉ
ｇｅｎｅｓ ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ）突然変異体ＮＣＩＢ
１１５９９を培養することによりいくつかのポリエス
テルを微生物により製造することが記載されている。公
開された欧州特許出願０２０４４４２には、奇数個の炭
素原子を含む第１アルコール（ただしメタノールを除
く）でアルカリゲネス・ユウトロフス（Ａｌｋ．ｅｕｔ
ｒｏｐｈｕｓ）突然変異体ＮＣＩＢ １２０８０を培養
することによりＨＢ及びＨＶの共重合体の微生物による
製造が記載されている。共重合体を製造するためには、
共重合体が蓄積される期間の少なくとも一部にわたっ
て、非類似のモノマー単位を生じさせうる成分からなる
基質（すなわちエネルギー及び炭素の源）を供給する必
要があることが知られている。従って、例えば、ＨＢモ
ノマー単位とＨＶモノマー単位とを含む共重合体を製造
するためには、ＨＶを合成しうる成分、例えばプロピオ
ン酸からなる基質で細菌を培養することが必要である。
共重合体内にＨＶモノマー単位を与える成分を、この明
細書では、基質の「ＨＶ成分」と称することとする。公
知細菌においてＰＨＢの製造（産生）及び蓄積を誘起さ
せるには、特定培養条件が通常必要とされる。そのよう
な特定培養条件は、共重合体の製造（産生）及び蓄積を
誘起させるためにも必要とされる。ある種の公知細菌
は、ＰＨＢを本質的に（構造的に）産生する、すなわち
ＰＨＢを産生及び蓄積するために特定の条件下で培養さ
れる必要がない。それにもかかわらず、上記のような特
定培養条件が採用されないならば、ＰＨＢを本質的（構
造的）に産生することが知られている細菌であっても、
共重合体が産生及び蓄積されないようにＨＶ成分を代謝
してしまうことがある。さらには、公知細菌において共
重合体の産生及び蓄積が誘起されるように特定の培養条
件が使用されたときでさえも、ＨＶ成分のうちの少割合
のみが細菌によってＨＶモノマー単位に転化されるにす
ぎない。従ってＨＶ成分は、非モノマー物質を生じさせ
ることがあり、あるいは、ＨＶ成分が重合体蓄積段階中
の唯一の基質であったとしても、共重合体中へ導入され
るＨＢモノマー単位を合成するのに消費されてしまうこ
とがある。ＨＶ成分がＨＢモノマー単位を合成するよう
に代謝される現象は、ＨＶ成分の半分よりも著しく少な
い量が所要のＨＶモノマー単位に転化され、かくして低
い割合のＨＶモノマー単位を含む共重合体の産生がもた
らせるような程度に起こる。ＨＶ成分の少なくとも若干
が所要のＨＶモノマー単位に転化され、そして所要の割
合のＨＶモノマー単位が共重合体に存在するようにする
ためには、細菌は大過剰のＨＶ成分を供給される必要が
ある。ＨＶ成分の低転化効率ならびにその比較的高い価
格は、経費の嵩むＨＢ／ＨＶ共重合体合成ルートをもた
らす。さらには、基質中にそのような大過剰のＨＶ成分
を必要的に存在させることは、潜在的に有毒な環境が発
生し、その環境中で細菌が培養されなければならないと
いう点において、共重合体合成のための従来の微生物学
的ルートに対し重大な問題を生じさせる。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】我々は、ＨＶ成分をＨ
Ｂモノマー単位に転化する主要代謝径路を同定すること
により、そしてそのような径路が実質的に除かれた細菌
の菌株を提供することにより、ＨＶ成分がＨＶモノマー
単位へ高効率で転化されるように共重合体が合成される
方法を案出することが可能であることを発見した。
【０００５】
【課題を解決するための手段】かくして、我々は、ＨＶ
成分から主としてなる基質上で生長を制限しない条件下
で培養されたときに有意に生長しえないＰＨＢ蓄積性細
菌を用いてＨＢモノマー単位及びＨＶモノマー単位を含
む共重合体を微生物学的に製造する方法であって：該細
菌を水性培地中で細菌が共重合体を合成及び蓄積するよ
うに誘導される生長制限条件下で、培地１リットル当り
所望の乾燥細胞重量に培養し、そしてしかる後に共重合
体含有細菌を採取することからなり、その培地が基質を
含み、その基質が水溶性資化性炭素含有ＨＶ成分と水溶
性資化性炭素含有ＨＢ成分とからなる、上記方法を提供
する。細菌を培養するプロセス条件、すなわち、温度、
ｐＨ、通気、必須栄養等は、ＰＨＢ蓄積法において一般
的に使用されてきているものと同様であってよい。細菌
の生長に必要とされる必須栄養は、下記の元素を含み、
これらは通常容易に資化されうる形で、普通は水溶性塩
として存在する：窒素、リン、硫黄、カリウム、ナトリ
ウム、マグネシウム、カルシウム、及び鉄、ならびに痕
跡量のマンガン、亜鉛及び銅。培養の少なくとも一部
は、生長制限条件下、すなわち生長のために必須である
が共重合体蓄積のためには必須でない栄養を制限した条
件下で、実施される。そのような生長制限条件下では、
細菌がＰＨＢホモポリマーを産生し蓄積する傾向が抑制
され、ＨＶ含有重合体の産生及び蓄積が誘導される。細
菌に対する酸素の供給を制限することにより共重合体の
蓄積を誘導することは可能であるが、必須栄養の一つま
たはそれ以上のものの供給を制限するのが好ましい。最
も実際的な制限栄養は、窒素、リンであり、これらより
も好ましくはないがマグネシウム、硫黄またはカリウム
であってもよい。窒素は、アンモニウム塩の形で供給さ
れるのが好適であり、そしてリンはリン酸塩の形で好適
に供給されうる。窒素制限を行なう場合には、基質には
窒素を含めないのが好ましく、従ってＨＶ成分のアミド
誘導体は余り好まれない。資化性窒素の必要量は、所要
細胞重量から蓄積共重合体の重量を差引いたものの約１
０〜１５重量％である。同様な考慮は、リン制限を行な
う場合にも適用される。
【０００７】細菌の培養は、共重合体含有細胞の乾燥重
量が少なくとも３０ｇ／リットル、好ましくは少なくと
も８０ｇ／リットル、そして殊に少なくとも１２０ｇ／
リットルであるように実施されるのが好ましい。使用細
菌は、基質中に存在するＨＶ成分をＨＶモノマー単位に
効率的に転化しうる。特定的には、細菌は、モル基準で
４５％以上、殊に少なくとも６０％、特に７０〜８０
％、さらに有利には８０〜９０％の効率でＨＶ成分をＨ
Ｖモノマー単位に転化しうる。好ましくは、ある特定の
細菌が培養されるこれらの条件は、転化効率を最大化す
る条件である。
【０００８】好ましくは、細菌の培養は、二段階法から
なる。その第１の段階において、好ましくは、細菌を、
炭水化物（例えばグルコース）のような容易に代謝しう
る基質で、生長非制限条件下で、ある乾燥重量（単位容
積当り；例えば１リットル当り）まで生長させる。第２
の段階においては、基質は少なくとも一部ＨＶ成分であ
り、そして少なくとも１種の成長に必要な栄養を制限し
て、成長制限条件が存在するようにする。培養はバッチ
法で実施して、成長には必要とされるが共重合体蓄積に
は必要とされない栄養の量が枯渇するにつれて、共重合
体蓄積が起こるようにすることができる。
【０００９】別法として、培養は連続法で実施すること
もでき、その際には、細菌を培養しつつある槽から、連
続または半連続ベースで、培養液の流れを取り出す。培
養槽から取り出された流れは、使用済水性培地中に細菌
細胞を含んでいる。その使用済水性培地は残留量の栄養
及び基質を含んでいる。培養槽から出る流れの流量（単
位時間当り）は、培養槽への新鮮水性培地の添加速度に
対応する。培養槽に供給される新鮮水性培地は共重合体
の蓄積を支持するに足りる量で栄養及び基質を含んでい
る。培養槽へ供給されかつ細菌の生長を制限されるのに
用いられる栄養の量は、好ましくは、該栄養が培養槽か
ら取り出される使用済水性培地中に全くまたはほとんど
存在しなくなるような量である。さらには、使用済水性
培地をバッチ式、好ましくは連続式もしくは半連続式の
少なくとも一つの別の曝気培養段階に供給し、ここでそ
の使用済水性培地に新鮮ＨＶ成分含有基質を添加するこ
とによって追加の共重合体蓄積を生じさせるのが好まし
い。その栄養及び基質の濃度は、全体のプロセスの最適
操作が維持されるように、第１培養段階から出た後の使
用済培地において調節される。
【００１０】別法として、細菌の培養は、単一段階法と
して実施することもできる。かかる培養法においては、
共重合体蓄積は、生長に必要とされるが共重合体蓄積に
は必要とされないある栄養の量を制限することにより誘
起され、そして培養槽中の水性培地の滞留時間は、制限
栄養の用尽がなされかつ共重合体の蓄積が生じるように
充分に長くされる。単一段階法または多段階法のいずれ
においても、あるいはバッチ式または半連続式もしくは
連続式方法のいずれにおいても、ＨＶ成分は、共重合体
蓄積段階の全体もしくは一部にわたって基質中に存在す
る唯一の炭素源として存在してよく、あるいはその他の
資化性炭素源と混在していてもよい。
【００１１】水培地中のＨＶ成分の濃度は、多数の因
子、例えば培養プロセスがバッチ式であるか連続式であ
るか、所望される共重合体の割合、所望される共重合体
中のＨＶモノマー単位の割合等により、左右され決定さ
れる。使用細菌は高転化効率で共重合体を合成し、蓄積
することができるので、培養プロセスに供給され、また
取り出される培地におけるＨＶ成分の濃度は、比較的に
低い。一般的に、細菌の採取の時点におけるＨＶ成分の
濃度は、好ましくは０．１〜２５ｇ／リットル、殊に５
〜１０ｇ／リットルである。
【００１２】ＨＶ成分は、プロパノール、プロピオン酸
またはその塩、エステル、無水物、アミドもしくはハロ
ゲン化物でありうる。ＨＶ成分として使用するのに適当
な化合物の混合物を使用してもよい。ＨＶモノマー単位
へのＨＶ成分の高転化率は、培養された細菌がＨＶ成分
をもはやアセチルＣｏＡへ余り代謝できないので、実現
されるものと信じられる。
【００１３】以下の理論によって拘束されるものではな
いが、ＨＢモノマー単位及びＨＶモノマー単位を含む共
重合体に向かう代謝径路は以下の通りであると考えられ
る：ここにＣｏＡ・ＳＨは未エステル化補酵素Ａであ
り；ＣＨ3 ・ＣＯ・Ｓ・ＣｏＡは、補酵素Ａのアセチル
チオエステルであり、一般にはアセチルＣｏＡと称され
ている；ＮＡＤＰは、酸化状態にあるニコチンアミドア
デニンジヌクレオチドホスフェートであり；そしてＮＡ
ＤＰＨ2 は、還元されたＮＡＤＰである。微生物による
生合成において、第１工程はアセチルＣｏＡの合成であ
ると信じられる。これは、例えばＣｏＡとアセテートか
ら、あるいはピバレート（このものは炭水化物のグリコ
リシスの生成物であるか、またはオキサロアセテートの
脱カルボニル化によって生成されうるものてある。後者
はトリカルボン酸；ＴＣＡサイクル、あるいはクレブス
・サイクルの一要員である。）の脱カルボニル化によっ
て生成されうる。従って、アセチルＣｏＡの源としてア
セテートが用いられると、ＰＨＢは下記の諸反応を伴な
う代謝経路によって生成される： １．ＣＨ3 ・ＣＯ・Ｏ- ＋ＣｏＡ・ＳＨ−チオキナーゼ→ ＣＨ3 ・ＣＯ・Ｓ＋ＣｏＡ＋ＯＨ- ２．２ＣＨ3 ・ＣＯ・Ｓ・ＣｏＡ−βケトチオラーゼ→ ＣＨ3 ・ＣＯ・ＣＨ2 ・ＣＯ・Ｓ・ＣｏＡ＋ＣｏＡ・ＳＨ ３．ＣＨ3 ・ＣＯ・ＣＨ2 ・ＣＯ・Ｓ・ＣｏＡ＋ＮＡＤＰＨ2 −リダクターゼ→ ＣＨ3 ・ＣＨＯＨ・ＣＨ2 ・ＣＯ・Ｓ・ＣｏＡ＋ＮＡＤＰ ４．ＣＨ3 ・ＣＨＯＨ・ＣＨ2 ・ＣＯ・Ｓ・ＣｏＡ−ポリメラーゼ→ −Ｏ・ＣＨ（ＣＨ3 ）・ＣＨ2 ・ＣＯ−＋ＣｏＡ・ＳＨ ここに、ＣＨ3 ・ＣＯ・ＣＨ2 ・ＣＯ・Ｓ・ＣｏＡはア
セトアセチルＣｏＡであり；ＣＨ3 ・ＣＨＯＨ・ＣＨ2
・ＣＯ・Ｓ・ＣｏＡは３ヒドロキシブチリルＣｏＡであ
り；そして−Ｏ・ＣＨ（ＣＨ3 ）・ＣＨ2 ・ＣＯ−はポ
リマー中の繰返し単位である。従って、反応４は生長中
の重合体鎖に対して−Ｏ・ＣＨ（ＣＨ3 ）・ＣＨ2 ・Ｃ
Ｏ−を付加する。関与する酵素類の特異性の欠如のため
に、例えばプロピオン酸での、対応する経路は、下記の
通りであると考えらる。 １ａ．ＣＨ3 ・ＣＨ2 ・ＣＯ・Ｏ- ＋ＣｏＡ・ＳＨ−チオキナーゼ→ ＣＨ3 ・ＣＨ2 ・ＣＯ・Ｓ＋ＣｏＡ＋ＯＨ- ２ａ．ＣＨ3 ・ＣＨ2 ・ＣＯ・Ｓ・ＣｏＡ＋ＣＨ3 ・ＣＯ・Ｓ・ＣｏＡ−βケト チオラーゼ→ＣＨ3 ・ＣＨ2 ・ＣＯ・ＣＨ2 ・ＣＯ・Ｓ・ＣｏＡ＋ＣｏＡ ・ＳＨ ３ａ．ＮＡＤＰＨ2 ＋ＣＨ3 ・ＣＨ2 ・ＣＯ・ＣＨ2 ・ＣＯ・Ｓ・ＣｏＡ−リダ クターゼ→ＮＡＤＰ＋ＣＨ3 ・ＣＨ2 ・ＣＨＯＨ・ＣＨ2 ・ＣＯ・Ｓ・Ｃ ｏＡ ４ａ．ＣＨ3 ・ＣＨ2 ・ＣＨＯＨ・ＣＨ2 ・ＣＯ・Ｓ・ＣｏＡ−ポリメラーゼ→ −Ｏ・ＣＨ（Ｃ2 Ｈ5 ）・ＣＨ2 ・ＣＯ−＋ＣｏＡ・ＳＨ ここに、ＣＨ3 ・ＣＨ2 ・ＣＯ・Ｓ・ＣｏＡはプロピオ
ニルＣｏＡであり；ＣＨ3 ・ＣＨ2 ・ＣＯ・ＣＨ2 ・Ｃ
Ｏ・Ｓ・ＣｏＡは３ケトバレリルＣｏＡであり；ＣＨ3
・ＣＨ2 ・ＣＨＯＨ・ＣＨ2 ・ＣＯ・Ｓ・ＣｏＡは、３
ヒドロキシバレリルＣｏＡであり；そして−Ｏ・ＣＨ
（Ｃ2 Ｈ5 ）・ＣＨ2 ・ＣＯ−は、重合体中の繰返し単
位である。従って反応４ａは、生長中の重合体鎖に−Ｏ
・ＣＨ（Ｃ2 Ｈ5 ）・ＣＨ2 ・ＣＯ−を付加する。上記
に仮定されたように、ＨＢモノマー単位の合成における
中間体の一つは、それ自体がＨＶモノマー単位の合成に
おける中間体であるから、基質がＨＶ成分のみならず、
所要のＨＢモノマー中間体、すなわちＨＢ成分へ代謝さ
れうる炭素源をも含むのが好ましい。従って、基質中の
ＨＢ及びＨＶ合成のための成分の相対量を制御すること
により、種々の割合のＨＢ及びＨＶモノマー単位を含む
共重合体を得ることができる。
【００１４】本発明の方法での使用のために適切に適合
される細菌は、アルカリゲネス・ユウトロフスのＰＨＢ
蓄積性菌株の突然変異により、及び得られる突然変異体
のスクリーニング及び選択により創出しうる。従って、
我々はＮＣＩＭＢ ４０１２４と指定されたアルカリゲ
ネス・ユウトロフスの菌株（殊にその純粋培養物の
形）、及びそれから誘導された突然変異体及び変種をも
提供する。菌株アルカリゲネス・ユウトロフスＮＣＩＭ
Ｂ ４０１２４、ブタペスト条約の条件の下に連合王国
（英国）アバディーンＡ８９ ８ＤＧ、１３５アビイ・
ロド、ＰＯ ＢＯＸ ３１のザ・ナショナル・コレクシ
ョンズ・オブ・インダストリアル・アンド・マリーン・
バクテリア Ｌｔｄ（ＮＣＩＭＢ）に、１９８９年３月
２４日寄託された。この菌株アルカリゲネス・ユウトロ
フスＮＣＩＭＢ ４０１２４及びそれから誘導された有
用な突然変異株及び変種は、下記の記載事項によって特
徴付けられる。この菌株及びそれから誘導された突然変
異株及び変種は元の菌株ＮＣＩＢ１２０８０と同様な様
式でＰＨＢを産生し蓄積することができ、ＨＶ成分のＨ
Ｖモノマーへの高転化効率においてＨＢ／ＨＶモノマー
単位含有共重合体を産生及び蓄積し、アセテートからな
る基質で生長を示すが、プロピオネートからなる基質で
は生長を示さない。これらの生長、不生長及び重合体蓄
積特性の組合せは、この新規アルカリゲネス・ユウトロ
フス菌株を従前のアルカリゲネス・ユウトロフス菌株か
ら区別するものである。上記の生長／不生長特性の評価
は、被験物質、すなわちアセテートまたはプロピオネー
トにより実質的に与えられる炭素分を有する基質を用い
て、生長非制限条件下で実施された。
【００１５】アルカリゲネス・ユウトロフスＮＣＩＭＢ
４０１２４の性質形態 グラム陰性、概略寸法０．８μｍ×６．０μｍの動桿。 細胞内顆粒を示す。 胞子形成せず。 位相差顕微鏡下で場合により近極べん毛が認められる。 コロニイ形態（Ｌａｂ８栄養寒天）−組織体は丸く、規
則的、不透明、平滑、白色凸状コロニイの形である。３
日後直径は約２ｍｍであった。 経過時間の増加に伴なって淡褐色の着色が発現した。温度 ５℃で生長せず。 ３７℃で生長。 ４５℃で生長せず。特性 カタラーゼ ＋ Ｋｏｖａｃｓ オキシダーゼ ＋ Ｏ−Ｆグルコース 極めて弱い酸化性 ピオシアニン − フルオルエッセン − Ｌ−アルギニン ＣＳＵ − ベタイン ＣＳＵ − グルコース ＣＳＵ ＋ ラクテート ＣＳＵ ＋ アセテート ＣＳＵ ＋ ＣＳＵ アラビノース − メソ−イノシトール − キシロース − ガス・グルコース − ＯＮＰＧ − アルギニン Ｍｏｌｌｅｒ − リシン Ｍｏｌｌｅｒ − オルニチン Ｍｏｌｌｅｒ − ＮＯ3 - → ＮＯ2 - − ＮＯ3 → Ｎ2 ＋（３７℃にて） ＤＮＡ ａｓｅ − ゲル ｓｔａｂ． − ゲル 平板 − カゼイン − デンプン − レシチン卵 − リパーゼ卵 − ＮＨ3 弱陽性 インドール − Ｈ2 Ｓ − Ｔｗｅｅｎ ８０ ＋ ウレアーゼ ＋ メタノールで５日または１４日で生長示さない。 プロトン−１−オールで５日または１４日で生長示さな
い。 アセテートで３日で生長を示した。 ペニシリンＧ及びストレプトマイシンに耐性。 クロラムフェニコール、テトラサイクリン、ポリミキシ
ンＢ及びノボビオシン（弱く）に感受性。 本発明によるアルカリゲネス・ユウトロフスの菌株は、
種々の方法で、例えばトランスポソン突然変異発生（削
除をなしうる挿入トランスポソンの切削）、エタンメタ
ンスルホネートのような突然変異誘導物質を使用する化
学的突然変異発生、及びインビトロ操作及びそれに続く
再結合により起こされる突然変異により創出できる。
【００１６】菌株アルカリゲネス・ユウトロフスＮＣＩ
ＭＢ ４０１２４は下記のようにして調製された。元の
培養物は、ブタペスト条約の規定条件の下にＮＣＩＭＢ
から入手できるアルカリゲネス・ユウトロフスＮＣＩＢ
１２０８０であった。この元の培養物は、無機塩培地
に１％グルコース添加したもので、０．９の光学密度
（６００ｎｍで測定）まで増殖させた。この増殖したば
かりの培養液の試料（１０ｍｌ）を、直径９ｃｍのガラ
ス製ペトリ皿に移し、次いで９９．９％の殺生率を達成
するのに足りる線量でＵＶ光線を照射した。この照射培
養液を、１％グルコース添加無機塩培地を含むフラスコ
に移し、暗所で約１６時間３０℃でインキュベートし
た。このインキュベート済培養液の１０ｍｌを、リン酸
ナトリウム（０．０７５％）及びＤ−サイクロセリン
（８００μｇ／ｍｌ）添加無機塩培地を含むフラスコに
移した。次いでフラスコの内容物を、約１６時間３０℃
でインキュベートした。次いでこの培養液を遠心分離
し、得られたペレットを滅菌蒸留水に再懸濁した。この
懸濁液から一連の稀釈物を作り、それらの稀釈物の０．
１ｍｌの部分を、グルコース１％含有無機塩寒天平板に
塗布した。それらの平板をインキュベートし、生じたコ
ロニイを、プロピオネート０．０７５％含有無機塩寒天
平板で再び培養した。コロニイは、グルコース寒天平板
では増殖しうるが、プロピオネート寒天平板では増殖し
えないことが同定された。これらのコロニイをさらに検
討するため選定した。突然変異株と推定されるものの選
定コロニイを、炭素源としてグルコースまたはアセテー
トを用いて生長しうる能力、プロピオネートでの生長不
能性、そして窒素制限条件下でグルコース及びプロピオ
ネートを供給されたときの、ＨＢモノマー単位及びＨＶ
モノマー単位を含む共重合体を産生、蓄積する能力、に
ついてスクリーンした。かかる操作によって創出された
一つの菌株がアルカリゲネス・ユウトロフスＮＣＩＭＢ
４０１２４である。
【００１７】本発明の方法を下記の実施例により説明す
る。
【実施例１】下記の物質を含み（ｇ／リットル）、約７
のｐＨ（アンモニアの添加で調節）を有する水性培地を
作った。 ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ２．２ Ｋ2 ＳＯ4 ３．０ Ｎａ2 ＳＯ4 ０．１８ ＦｅＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ０．１８ グルコース １３．０ 微量元素 ３．０（ｍｌ） リン酸（１．１Ｍ） ６．５（ｍｌ） 上記培地３リットルを含む培養槽に、アルカリゲネス・
ユウトロフス ＮＣＩＭＢ ４０１２４の出発培養液を
接種し、この培地のリン酸塩含量が生長制限状態に低減
するまで、この培地２４時間３０℃でインキュベートし
た。次いでグルコース及びプロピオン酸を培養槽に対し
て、さらに４８時間にわたりそれぞれ１０ｇ／時及び
３．３ｇ／時の流量で供給した。共重合体を含む細胞を
採取し、凍結乾燥し、そして重合体含量及び組成につい
て分析した。
【００１８】
【実施例２】実施例１の操作を繰り返したが、本例では
グルコース及びプロピオン酸の供給流量をそれぞれ６．
４ｇ／時及び０．７ｇ／時とした。
【比較実施例３】菌株アルカリゲネス・ユウトロフス
ＮＣＩＭＢ ４０１２４の代りに菌株アルカリゲネス・
ユウトロフス ＮＣＩＢ １２０８０を用いて実施例１
を繰り返した。
【比較実施例４】菌株アルカリゲネス・ユウトロフス
ＮＣＩＭＢ ４０１２４の代りに菌株アルカリゲネス・
ユウトロフス ＮＣＩＢ １２０８０を用いて実施例２
を繰り返した。これらの実施例１〜４の結果を下記に示
す。
【効果】本発明による細菌を用いる本発明の方法は、Ｈ
Ｖ成分のＨＶモノマー単位への転化効率の大巾な増大を
もたらすことが判る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:05）

Claims (10)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ＨＶ成分から主としてなる基質上で生長
    を制限しない条件下で培養されたときに有意に生長しえ
    ないＰＨＢ蓄積性細菌を用いてＨＢモノマー単位及びＨ
    Ｖモノマー単位を含む共重合体を微生物学的に製造する
    方法であって：該細菌を水性培地中で、細菌が共重合体
    を合成及び蓄積するように誘導される生長制限条件下
    で、培地１リットル当り所望の乾燥細胞重量に培養し、
    そしてしかる後に共重合体含有細菌を採取することから
    なり、その培地が基質を含み、その基質が水溶性資化性
    炭素含有ＨＶ成分と水溶性資化性炭素含有ＨＢ成分とか
    らなる、上記方法。
  2. 【請求項２】 細菌が、基質中に存在するＨＶ成分の４
    ５％以上をＨＶモノマー単位に転化しうる請求項１の方
    法。
  3. 【請求項３】 水性培地中のＨＶ成分の濃度が、共重合
    体中に所望のＨＶモノマー単位の百分率を達成するよう
    に調節される請求項１または２の方法。
  4. 【請求項４】 採取細菌と合せた培地中のＨＶ成分の濃
    度が０．１〜２５ｇ／リットルである請求項１〜３のい
    ずれかの方法。
  5. 【請求項５】 ＨＶ成分がプロパノール、プロピオン
    酸、またはそれらの資化性誘導体である請求項１〜４の
    いずれかの方法。
  6. 【請求項６】 細菌の培養は、共重合体含有細胞乾燥重
    量が少なくとも３０ｇ／リットルであるように実施され
    る請求項１〜５のいずれかの方法。
  7. 【請求項７】 細菌の培養は二段階法からなり、その第
    １段階においては細菌は容易に代謝しうる基質上で生長
    非制限条件下で所望の１リットル当り乾燥重量となるま
    で生長させ、そして第２段階においては、基質は少なく
    とも一部ＨＶ成分であり、そして生長に要求される少な
    くとも１つの栄養を制限して生長制限条件が存在するよ
    うにする、請求項１〜６のいずれかの方法。
  8. 【請求項８】 生長制限条件は、利用可能な資化性の窒
    素及び／またはリンの量を制限することにより達成され
    る請求項１〜７のいずれかの方法。
  9. 【請求項９】 利用可能な資化性窒素の量は所望の細胞
    重量から蓄積共重合体の重量を差引いたものの約１０〜
    １５重量％である請求項８の方法。
  10. 【請求項１０】 アルカリゲネス・ユウトロフス菌株Ｎ
    ＣＩＭＢ ４０１２４または、その突然変異体もしくは
    変種であって、その突然変異体もしくは変種が、水溶性
    炭素分を有する基質上で生長非制限条件下で培養された
    ときに有意に生長できず、そして上記水溶性炭素分は主
    としてＨＶ成分によって供給される上記微生物。
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