KR20030016161A - 곁사슬에 (메틸술파닐)페녹시 구조를 가지는 유닛을포함하는 신규한 폴리하이드록시알카노에이트 및 그제조방법 - Google Patents

곁사슬에 (메틸술파닐)페녹시 구조를 가지는 유닛을포함하는 신규한 폴리하이드록시알카노에이트 및 그제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은,
의 화학식(1)(식중, x는 폴리하이드록시알카노에이트에 임의로 존재하는 1 내지 8의 정수임)으로 표시되는 유닛을 포함하는 폴리하이드록시알카노에이트를 제공한다. 또한, 세균에 의한 제조방법을 개시하고 있다.

Description

곁사슬에 (메틸술파닐)페녹시 구조를 가지는 유닛을 포함하는 신규한 폴리하이드록시알카노에이트 및 그 제조방법{NOVEL POLYHYDROXYALKANOATE THAT COMPRISES UNIT HAVING (METHYLSULFANYL)PHENOXY STRUCTURE IN SIDE CHAIN THEREOF AND PROCESS FOR PRODUCING THE SAME}
본 발명은, 신규한 구조의 유닛을 포함하는 폴리하이드록시알카노에이트(PHA) 및 그 제조방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로 본 발명은, 곁사슬의 말단에 (메틸술파닐)페녹시기를 가지는 3-하이드록시알칸산 유닛을 포함하는 신규한 생분해성 PHA 및 PHA를 생산하고 세포내에 그것을 축적하는 능력을 가진 미생물을 사용함으로써 곁사슬의 말단에 (메틸술파닐)페녹시기를 가지는 알칸산으로부터 PHA를 제조하는 방법에 관한 것이다.
세포내에서 폴리-3-하이드록시부티르산(이하, "PHB"로 약칭함) 또는 그 외의PHA를 생산하고 축적할 수 있는 다양한 미생물에 대한 보고가 계속되고 있다(문헌「Biodegradable Plastics Handbook」, 「Biodegradable Plastics Society Ed.), NTS, pages 178-197 (1995)」). 이러한 중합체들은 종래의 플라스틱과 마찬가지로, 예를 들면, 용융 가공에 의하여 다양한 제품의 생산에 사용되어도 되지만, 종래의 많은 합성 고분자 화합물과는 달리, 이들 중합체는 생분해되고, 자연계에서 미생물에 의해 완전히 분해되기 때문에, 자연 환경에서 오염을 유발하지 않는다. 또한, 그것은 생체 적합성도 양호하고, 의료 분야에서 연질 재료로서 그것의 응용이 기대된다.
세균에 의한 PHA는 예를 들면, 미생물의 종류, 배양기의 조성 및 배양 조건에 의존하여 다른 조성 및/또는 구조를 가진다고 알려져 있다. 또한, PHA의 물질적 특성을 향상시키기 위하여 조성 및 구조를 제어하는 연구를 해왔다. 예를 들면, 알칼리게네스 유우트로퍼스 H16(Alcaligenes eutropus H16, ATCC No. 17699) 및 그 변이는 다양한 조성비(일본국 특공평 6-15604호 공보, 일본국 특공평 7-14352호 공보 및 일본국 특공평 8-19227호 공보)를 가지는 3-하이드록시부티르산 및 3-하이드록시발레르산(이하, 3HV로 약칭함)의 공중합체를 생산하는 것이 알려져 있다.
일본국 특허 제 2642937호는, 슈도모나스 올레오보란스(Pseudomonas oleovoransATCC No. 29347)에 기질로서 비고리형 지방족 탄화수소 화합물을 공급함으로써 C6내지 C123-하이드록시알카노에이트 단량체 유닛의 PHA 생산을 개시한다.
일본국 특개평 5-74492호 공보는, 메틸박테리움 속(Methylobacterium sp.), 파라코커스 속(Paracoccus sp.), 알칼리게네스 속(Alcaligenes sp.) 및 슈도모나스 속(Pseudomonas sp.) 등의 미생물을 사용함으로써, C3내지 C7제 1급 알코올에 접촉하는 3HB 및 3HV의 공중합체를 제조하는 방법을 개시한다.
일본국 특개평 5-93049호 공보 및 일본국 특개평 7-265065호 공보는, 기질로서 올레산 또는 올리브 오일에 아에로모나스 캐비에(Aeromonas caviae)를 배양함으로써 3HB 및 3-하이드록시헥사네이트의 2성분 공중합체의 생산을 개시한다.
일본국 특개평 9-191893호 공보는, 코마모나스 어시도보란스 IFO 13852(Comamonas acidovoransIFO 13852)가 기질로서 글루콘산 및 1,4-부탄디올이 존재하는 하에서 배양될 때, 단량체 유닛으로서 3HB와 4-하이드록시부티르산을 포함하는 폴리에스테르를 생산하는 것을 개시한다.
또한, 어떤 미생물은 불포화탄화수소, 에스테르기, 시아노기, 할로겐화 탄화수소 및 에폭사이드 등이 도입된 다양한 치환체를 가지는 PHA를 생산한다는 것이 이미 알려져 있다. 예를 들면, 문헌「Macromol. Chem., 191, 1957-1965 (1990)」,「Macromolecules, 24, 5256-5260 (1991)」 및 「Chirality, 3, 492-494 (1991)」에는, 슈도모나스 올레오보란스(Pseudomonas oleovoranse)가 단량체 유닛으로서 3-하이드록시-5-페닐발레스산(이하, 3HPV로 약칭함)을 포함하고, 아마도 3HPV가 존재하기 때문에 PHA의 물리적 특성에서 변화가 관찰되는 PHA를 생산하는 것이 보고되어 있다.
곁사슬에 치환체를 가지는 PHA 중에서, 최근에는 곁사슬에 페녹시기를 가지는 PHA가 활발하게 개발되고 있다.
슈도모나스 올레오보란스(Pseudomonas oleovorans)가 11-페녹시운데칸산으로부터 3-하이드록시-5-페녹시발레르산 및 3-하이드록시-9-페녹시노난산의 단량체 유닛으로 만들어진 PHA를 생산하는 것이 보고되고 있다(문헌「Macromol. Chem. Phys., 195, 1665-1672(1994)」).
문헌「Macromolecules, 29, 3432-3435 (1996)」에는, 슈도모나스 올레오보란스(Pseudomonas oleovorans)를 사용함으로써 6-페녹시헥산산으로부터 3-하이드록시-4-페녹시부티르산 및 3-하이드록시-6-페녹시헥산산의 단량체 유닛을 가지는 PHA의 생산과; 8-페녹시옥탄산으로부터 3-하이드록시-4-페녹시부티르산, 3-하이드록시-6-페녹시헥산산, 3-하이드록시-4-페녹시부티르산, 3-하이드록시-6-페녹시헥산산 및 3-하이드록시-8-페녹시옥탄산의 유닛을 가지는 PHA의 생산과; 11-하이드록시운데칸산으로부터 3-하이드록시-5-페녹시발레르산 및 3-하이드록시-7-페녹시헵탄산의 유닛으로 만들어진 PHA의 생산에 대하여 보고되어 있다.
문헌 「Can. J. Microbiol., 41, 32-43 (1995)」에는, 슈도모나스 올레오보란스(Pseudomonas olelvoransATCC 29347) 또는 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putidaKT 2422)에 의해 기질로서 옥탄산 및 6-(4-시아노페녹시)헥산산 또는 6-(p-니트로페녹시)헥산산을 사용하여 단량체 유닛으로서 3-하이드록시-6-(4-시아노페녹시)헥산산 또는 3-하이드록시-6-(4-니트로페녹시)헥산산을 포함하는 PHA의 생산에대하여 보고되어 있다.
최근에는, 곁사슬에 페녹시기를 가지는, 특히 곁사슬의 페녹시 아로마 고리에 도입된 플루오로, 시아노 및 니트로 등의 작용기를 가지는 PHA가 활발하게 개발되고 있다. 그러한 PHA에 대한 많은 보고가 있지만, 그 종류는 상기에 언급한 것들로 제한되어 있고, 신규한 작용기를 가지는 PHA에 대한 보고는 없다.
따라서 본 발명의 목적은, 곁사슬의 페녹시기의 아로마 고리에 기능성 있는(메틸술파닐)기를 가지는 신규한 단량체 유닛을 포함하는 신규한 PHA 및 그 제조방법을 제공하는 데 있다.
도 1은 실시예 1에서 얻은 폴리하이드록시알카노에이트의1H-NMR 스펙트럼을 도시한다.
한 측면에 있어서, 본 발명은,
의 화학식(1)(식중, x는 폴리하이드록시알카노에이트에 임의로 존재하는 1 내지 8의 정수임)으로 표시되는 유닛을 포함하는 폴리하이드록시알카노에이트를 제공한다.
하나의 실시예에 있어서, 폴리하이드록시알카노에이트는 3-하이드록시알카노에이트 및 3-하이드록시알케노에이트로부터 선택된 한 개 이상의 유닛을 부가하여 포함한다.
특히, 본 발명은,
의 화학식(4)으로 표시되는 3-하이드록시-5-[4-(메틸술파닐)페녹시]발레르산 유닛을 포함하는 폴리하이드록시알카노에이트를 제공한다.
또다른 측면에 있어서, 상기 언급한 폴리하이드록시알카노에이트를 생산하기 위하여, 본 발명은,
의 화학식(5)(식중, x는 1 내지 8의 정수임)으로 표시되는 ω-[(메틸술파닐)페녹시]알칸산과 대응하는 것을 함유한 배양기에서 PHA를 생산하는 미생물을 배양하는 공정을 포함하는 제조방법을 제공한다.
하나의 실시예에서, ω-[(메틸술파닐)페녹시]알칸산은,
의 화학식(6)으로 표시되는 5-[4-(메틸술파닐)페녹시]발레르산이다.
본 발명의 PHA는 장치 재료 및 의약 재료로서 잠재적인 유용성을 가지는, 기능성 있는 중합체로서 사용할 수 있다.
본 발명의 PHA 제조방법은 ω-[(메틸술파닐)페녹시]알칸산과 대응하는 것으로부터 3-하이드록시-ω-[(메틸술파닐)페녹시]알칸산 유닛을 포함하는 신규한 생분해성 PHA의 세균에 의한 효과적인 생산을 가능하게 한다.
본 발명에 있어서 신규한 폴리하이드록시알카노에이트는 하이드록시알카노에이트 유닛의 곁사슬에 (메틸술파닐)페녹시 구조를 가진다. 이 구조는 알려져 있는 세균에 의한 폴리하이드록시알카노에이트의 그것과는 확연하게 다른 물리적이고 화학적인 특성을 제공한다.
본 발명의 폴리하이드록시알카노에이트는,
의 화학식(1)(식중, x는 폴리하이드록시알카노에이트에 임의로 존재하는 1 내지 8의 정수임)으로 표시되는 유닛을 포함한다.
상기 언급한 단량체 유닛에 부가하여, 본 발명의 폴리하이드록시알카노에이트는,
의 화학식(2)(식중, y는 폴리하이드록시알카노에이트에 임의로 존재하는 0내지 8의 정수임)으로 표시되는 3-하이드록시알카노에이트와;
의 화학식(3)(식중, z는 폴리하이드록시알카노에이트에 임의로 존재하는 3 내지 5의 정수임)으로 표시되는 3-하이드록시알케노에이트 로부터 선택된 한 개 이상의 유닛을 포함해도 된다.
본 발명의 폴리하이드록시알카노에이트는 일반적으로 수평균 분자량을 5,000 내지 300,000로 가진다.
본 발명에 의한 신규한 폴리하이드록시알카노에이트는, 공급원료로서 ω-[(메틸술파닐)페녹시]알칸산 및 성장기질를 함유하는 배지에서 PHA생산용 미생물을 배양하는 공정과; 배양 공정동안 미생물에 의해 생산되고 미생물에 축적된 곁사슬의 말단에 (메틸술파닐)페녹시기를 가지는 유닛을 포함하는 폴리하이드록시알카노에이트를 회수하는 공정에 의해 생산될 수 있다.
세균에 의한 PHA에서, 화학식(1)으로 표시되는 것들을 포함한 모든 3-하이드록시알카노에이트 유닛의 3위치의 탄소는 절대 배열이 R인 비대칭 탄소이고, 그것은 생분해능을 가르킨다.
본 발명을 보다 상세하게 이하 설명한다.
<PHA를 생산하는 미생물>
본 발명에 따른 PHA 제조방법에 있어서, 곁사슬 말단에 (메틸술파닐)페녹시기를 가지는 유닛을 포함한 PHA를 생산하기 위하여 어떤 미생물이 사용될 수 있을 뿐만 아니라, 미생물은 원료 화합물로서 화학식(5)으로 표시되는 대응하는 ω-[(메틸술파닐)페녹시]알칸산을 함유하는 배지에서 배양될 때, 세포내에 해당 PHA를 생산하고 축적할 수 있다. 예를 들면, 미생물은 PHA를 생산할 수 있는 능력을 지닌 슈도모나스(Pseudomonas) 속에 속하는 것이어도 된다.
슈도모나스(Pseudomonas) 속의 적절한 미생물의 일례로 하기의: 슈도모나스 치코리이 YN2(Pseudomonas cichorii YN2; FERM BP-7375), 슈도모나스 치코리이 H45(Pseudomonas cichorii H45; FERM BP-7374) 및 슈도모나스 제세니이 P161(Pseudomonas jesenii P161; FERM BP-7376) 세 종을 들 수 있다. 이들 3종의 미생물은 출원인에 의해 국내기탁으로서 우선 기탁되었고, 다음에 부다페스트 조약에 의거하여 국제기탁으로서 일본국 이바라끼겐 305-8566 쯔구바시 히가시 1??메 1-3에 위치한 경제산업성 독립행정법인 산업기술총합연구 특허생물기탁센터(이 기탁기관의 전신은, 경제산업성 산업기술총합연구소 생명공학 공업기술연구소(NIBH))에 상기 언급한 수탁번호로 기탁되어 있다. 그것들은 또한 일본국 특허 공개 제2002-80571호 공보에 PHA를 생산하는 능력을 가진 신규한 종으로서 기재되어 있다.
YN2, H45 및 P161 종의 균학적 성질을 하기에 설명한다.
<YN2 종의 균학적 성질>
(1) 형태학적 성질
세포의 모양 및 크기: 간상, 0.8㎛×1.5~2.0㎛
세포의 다형성: 없음
운동성: 있음
포자형성: 없음
그램 염색: 음성
콜로니 형상: 원형, 전체 가장자리 매끄러움, 저볼록, 표층 매끄러움, 광택, 반투명
(2) 생리학적 성질
카탈라제: 양성
옥시다제: 양성
O/F 시험: 산화형(비발효성)
질산염 환원: 음성
인돌 생성: 양성
글루코스로부터 산의 생성: 음성
아르기닌 디하이드로라제: 음성
우레아제: 음성
에스큘린 가수분해: 음성
젤라틴 가수분해: 음성
β-갈락토시다제: 음성
King's B 한천에서의 형광색소 생성: 양성
4% NaCl 하에서의 성장: 양성(약한 성장)
폴리-β-하이드록시부티르산 축적: 음성(*)
트윈 80 가수분해: 양성
(*) 영양 한천에서 배양한 콜로니는 측정을 위하여 수단블랙에 의해 염색되었다.
(3) 기질 적합성
글루코스: 양성
L-아라비노스: 양성
D-맨노스: 음성
D-만니톨: 음성
N-아세틸-D-글루코사민: 음성
말토스: 음성
글루콘산 칼륨: 양성
n-카프르산: 양성
아디프산: 음성
dl-말산: 양성
시트르산 나트륨: 양성
아세트산 페닐: 양성
<H45 종의 균학적 성질>
(1) 형태학적 성질
세포의 모양 및 크기: 간상, 0.8㎛×1.0~1.2㎛
세포의 다형성: 없음
운동성: 있음
포자형성: 없음
그램 염색: 음성
콜로니 형상: 원형, 전체 가장자리 매끄러움, 저볼록, 표층 매끄러움, 광택, 크림색
(2) 생리학적 성질
카탈라제: 양성
옥시다제: 양성
O/F 시험: 산화형
질산염 환원: 음성
인돌 생성: 음성
글루코스로부터 산의 생성: 음성
아르기닌 디하이드로라제: 음성
우레아제: 음성
에스큘린 가수분해: 음성
젤라틴 가수분해: 음성
β-갈락토시다제: 음성
King's B 한천에서의 형광색소 생성: 양성
4% NaCl 하에서의 성장: 음성
폴리-β-하이드록시부티르산 축적: 음성
(3) 기질 적합성
글루코스: 양성
L-아라비노스: 음성
D-맨노스: 양성
D-만니톨: 양성
N-아세틸-D-글루코사민: 양성
말토스: 음성
글루콘산 칼륨: 양성
n-카프르산: 양성
아디프산: 음성
dl-말산: 양성
시트르산 나트륨: 양성
아세트산 페닐: 양성
<P161 종의 균학적 성질>
(1) 형태학적 성질
세포의 모양 및 크기: 구상, φ0.6㎛, 간상, 0.6㎛×1.5~2.0㎛
세포의 다형성: 신장형
운동성: 있음
포자형성: 없음
그램 염색: 음성
콜로니 형상: 원형, 전체 가장자리 매끄러움, 저볼록한 모양, 표층 매끄러움, 담황색
(2) 생리학적 성질
카탈라제: 양성
옥시다제: 양성
O/F 시험: 산화형
질산염 환원: 양성
인돌 생성: 음성
글루코스로부터 산의 생성: 음성
아르기닌 디하이드로라제: 양성
우레아제: 음성
에스큘린 가수분해: 음성
젤라틴 가수분해: 음성
β-갈락토시다제: 음성
King's B 한천에서의 형광색소 생성: 양성
(3) 기질 적합성
글루코스: 양성
L-아라비노스: 양성
D-맨노스: 양성
D-만니톨: 양성
N-아세틸-D-글루코사민: 양성
말토스: 음성
글루콘산 칼륨: 양성
n-카프르산: 양성
아디프산: 음성
dl-말산: 양성
시트르산 나트륨: 양성
아세트산 페닐: 양성
상기 언급한 슈도모나스 속(Pseudomonas sp.)의 종에 부가하여, 배양재로로서 ω-[(메틸술파닐)페녹시]알칸산을 사용하여 3-하이드록시-ω-[(메틸술파닐)페녹시]알칸산을 포함하는 PHA를 생산하는 능력을 가지는 아에로모나스 속(Aeromonas), 코마모나스 속(Comamonas), 버크홀데리아 속(Burkholderia)에 속하는 종을 사용할 수 있다.
<배양>
본 발명의 PHA 제조방법에 있어서, 공급원료로서 상기 화학식(5)으로 표시되는 ω-[(메틸술파닐)페녹시]알칸산을 함유하는 배지에서 PHA생산능을 지닌 상기 언급한 미생물을 배양함으로써, 곁사슬 말단에 (메틸술파닐)페녹시기를 가지는 3-하이드록시알카노에이트 유닛을 포함하는 화학식(1)으로 표시되는 PHA이 생산되고 그 세포내에 축적된다. 본 발명에 사용되는 미생물의 일반적인 배양을 위하여, 예를 들면, 저장 균주의 준비를 위하여, 또는 PHA 생산에 있어서 요구되는 세포를 획득하거나 활성을 유지하기 위하여, 이용하는 미생물의 증식에 필요한 성분을 함유하는 배지를 선택한다. 예를 들면, 배지가 미생물의 성장 및 생존에 악영향을 미치지 않은 한, 일반적인 천연 배지(예를 들면, 육즙 배지,효모 추출물) 및 영양원을 함유한 합성 배지 등의 알려진 배지 중 어느 것을 사용하여도 된다. 온도, 환기 및 교반 범위 등의 배양조건은 사용되는 미생물에 의존하여 적절하게 선택한다.
상기에 언급한 PHA를 생산할 수 있는 미생물을 사용하여 해당 PHA를 생산하기 위해, 미생물을 위한 적어도 하나의 성장기질 및 PHA생산을 위한 공급원료로서 단량체에 해당하는 화학식(5)으로 표시되는 화합물을 함유하는 무기배지를 사용하여도 된다. 상기 화학식(5)으로 표시되는 화합물이 배지당 0.01% 내지 1%(w/v)의 양으로 함유되는 것이 바람직하고, 배지당 0.02% 내지 0.2%(w/v)인 것이 더욱 바람직하다. 화학식(5)으로 표시되는 화합물이 항상 양호한 수용성을 가지지 않지만, 상기 설명한 미생물에서, 현탁은 어떤 문제를 유발하지 않는다.
배지에 첨가되는 공급원료 화합물은 화학식(5)으로 표시되는, 예를 들면, 5-[4-(메닐술파닐)페녹시]발레르산 및 6-[4-(메틸술파닐)페녹시]헥산산 등의, 한 개 이상의 화합물이어도 된다.
경우에 따라서는, 분산성을 높이기 위하여 1-헥사데칸 또는 n-헥사데칸 등의 용매에 용액 또는 현탁액으로서 화학식(5)으로 표시되는 공급원료 화합물을 배지에첨가하여도 된다. 그러한 경우, 용매의 농도는 배지의 용액과 비교하여 3%(v/v) 이하여야 한다.
미생물의 증식을 위하여 배지에 성장기질을 별도로 첨가하는 것이 바람직하다. 성장기질로서 효모 추출물, 폴리펩톤 및 고기 추출물 등의 영양소를 사용하여도 된다. 성장기질는 당류, TCA 회로에서 생기는 유기산, TCA 회로 이후의 1 또는 2단계 생화학적 반응으로부터 생기는 유기산 또는 그 염, 아미노산 또는 그 염, C4또는 C12의 곧은 사슬 알칸산 또는 그 염으로부터 기질로서의 유용성에 의거하여 선택하여도 된다.
글리세롤알데하이드, 에리트로스, 아라비노스, 크실로스, 글루코스, 갈락토스, 맨노스 및 프럭토스 등의 알도스와; 글리세롤, 에리트리톨 및 크실리톨 등의 알디톨과; 글루콘산 등의 알돈산과; 글루쿠론산 및 갈라투론산 등의 유론산과; 말토스, 수크로스 및 락토스 등의 이당류로부터 선택한 한 개 이상의 당류를 적합하게 사용하여도 된다.
유기산 또는 그 염으로서는, 한 개 이상의 화합물을 피루브산, 말산, 락트산, 시트르산, 숙신산 및 그 염으로부터 적합하게 선택하여도 된다.
아미노산 또는 그 염으로서는, 한 개 이상의 화합물을 글루탐산, 아스팔트산 및 그 염으로부터 적합하게 선택하여도 된다.
이들 중에서, 폴리펩톤 및 당류가 바람직하다. 바람직한 당류는 글루코스, 프럭토스 및 맨노스로부터 선택한 적어도 하나를 들 수 있고, 기질은 배지에 0.1%내지 5%(w/v), 보다 바람직하게는 0.2% 내지 2%(w/v)의 양으로 함유된다.
미생물이 충분히 성장한 후, 암모늄 클로라이드 등의 질소원이 제한되고 PHA를 위한 기질로서 기능하는 화합물이 첨가된 배지로 옮기면, 세균에 의한 PHA 생산능이 때때로 향상된다. 예를 들면, 다른 배양조건 하에서 두 번 이상의 공정을 성공적으로 행하는 다공정 접근을 이용해도 된다.
보다 구체적으로, 미생물을 화학식(5)으로 표시되는 화합물 및 폴리펩톤을 함유하는 배지에서 후기 대수 증식기로부터 정상기까지 성장시킨 후(공정 1-1), 예를 들면, 원심분리기를 사용함으로써 미생물을 모은다. 이어서, 공정 1-1에서 배양된 미생물을 상기 언급한 바와 같이 화학식(5)으로 표시되는 화합물 및 유기산 또는 그 염(바람직하게는 질소원을 가지지 않는)을 함유하는 배지에서 부가하여 배양한다(공정 1-2). 또는, 미생물을 상기 언급한 바와 같이 화학식(5)으로 표시되는 화합물 및 당류를 함유하는 배지에서 후기 대수증식기로부터 정상기까지 성장시키고(공정 1-3), 예를 들면, 원심분리기를 사용함으로써 미생물을 모은다. 이어서, 공정 1-3에서 성장한 미생물을 상기 언급한 바와 같은 화학식(5)으로 표시되는 화합물 및 당류(바람직하게는 질소원을 가지지 않는)를 함유하는 배지에서 부가하여 배양한다(공정 1-4).
배양 온도는 상기 언급한 종이 양호하게 증식할 수 있는 온도이어야 한다. 예를 들면, 배양 온도는 15℃ 내지 40℃, 바람직하게는 20℃ 내지 35℃이고, 더욱 바람직하게는 20℃ 내지 30℃이다.
배양은 상기 언급한 미생물들이 폴리하이드록시알카노에이트를 생산하기 위하여 증식할 수 있는 액체 또는 고체 배양 등의 어떤 적합한 배양 기술로 행하여도 된다. 또한, 배양의 형태는 산소가 적절하게 공급되는 한 제한이 없다. 실례로, 배치 배양, 페드 배치 배양, 반연속 배양 및 연속 배양을 들 수 있다. 액체 배치 배양에서, 진탕 플라스크의 함유물을 진탕하는 동안 산소를 공급하여도 된다. 또한, 쟈·발효기를 사용하여 교반범위 환기 방식에 의해 산소를 공급해도 된다.
상기 언급한 배양과정에 사용되는 무기 배지로서는, 미생물이 증식하기 위해 요구되는 인원(예를 들면, 인산염) 및 질소원(예를 들면, 암모늄염, 질산) 등의 성분을 함유하고 있는 어떤 배지를 사용하여도 된다. 예를 들면, MSB 배지 및 M9 배지를 사용하여도 된다.
본 발명에 있어서 제조에 사용되는 무기 배지(M9 배지)의 조성을 하기에 제시한다.
(M9 배지)
Na2HPO46.2g
KH2PO43.0g
NaC10.5g
NH4C1 1.0g
(배지 1리터 중; pH 7.0)
양호한 증식 및 폴리하이드록시알카노에이트의 생산을 확실하게 하기 위하여, 상기 언급한 무기 배지에 미량 성분 용액을 하기에 표시한 바와 같이 약0.3%(v/v)의 양으로 첨가하여야 한다.
(미량 성분 용액)
니트릴로 3 아세트산: 1.5g
MgSO4: 3.0
MnSO4: 0.5g
NaC1: 1.0g
FeSO4: 0.1g
CaC12: 0.1g
CoC12: 0.1g
ZnSO4: 0.1g
CuSO4: 0.1g
AlK(SO4)2: 0.1g
H3BO3: 0.1g
Na2MoO4: 0.1g
NiC12: 0.1g
(용액 1리터 중; pH 7.0)
<PHA 회수>
본 발명에 사용되는 미생물은 세포내에서 해당 PHA를 생산하고 축적한다. 따라서, 본 발명의 PHA 제조방법에 있어서, 세포로부터 해당 PHA를 회수하는 공정은 배양 이후에 준비된다.
세포로부터 PHA를 회수하는 목적을 위하여, 용매 추출 기술이 사용되고, 용해된 폴리하이드록시알카노에이트는 용해되지 않는 세포 구성성분으로부터 분리된다. 일반적인 클로로포름 추출 기술은 매우 편리하고 간단하지만, 클로로포름 이외의 용매로 디클로로메탄, 다이옥산, 테트라하이드로포룬, 아세토니트릴 및 아세톤 등을 사용하여도 된다. 유기 용매를 사용하기 곤란한 환경에 있어서, 폴리하이드록시알카노에이트 이외의 균주의 성분을, 예를 들면, SDS 등의 계면활성제, 라이소자임 등의 효소 또는 EDTA로 처리함으로써 제거하고, 단지 폴리하이드록시알카노에이트 만을 회수하기 위하여, 세포성분을 제거한다. 또한, 세포내에 축적된 폴리하이드록시알카노에이트를 분리하고 회수하기 위하여, 초음파파쇄법, 호모지나이저법, 압력파쇄법, 유리비즈 충격법, 마쇄법, 파궤법 및 동결 융해법 등의 세포 파쇄 처리를 사용할 수 있다.
본 발명의 미생물의 배양, 본 발명의 미생물에 의한 폴리하이드록시알카노에이트의 생산 및 세포 내에서의 폴리하이드록시알카노에이트의 축적을 이해하여야 하고, 세포로부터 폴리하이드록시알카노에이트의 회수는 상기 언급한 기술 및 과정으로 제한되지 않는다.
본 발명의 제조방법에 있어서 미생물에 의하여 생산되는 폴리하이드록시알카노에이트는 화학식(1)으로 표시되는 유닛에 부가하여, 화학식(2)으로 표시되는 3-하이드록시알칸산 유닛 또는 배지에 첨가된 증식 기질을 사용하여 지방산 합성체계를 통해 생합성된 화학식(3)으로 표시되는 3-하이드록시알크-5-엔산을 포함한다. 모든 3-하이드록시알칸산 유닛에 포함된 3번 위치의 탄소는 절대 배열이 R인 비대칭 탄소이고, 생분해성을 나타낸다.
본 발명의 PHA는 일반적인 플라스틱으로서의 사용 이외에 장치 재료, 의약 재료 및 의학적 시트 등의 의학적 재료를 포함하는 다양한 응용분야에의 유용성을 가진다.
또한, 화학식(1)으로 표시되는 유닛에서 (메틸술파닐)페녹기의 존재와 벤젠고리 상에 위치하는 다양한 치환체의 존재는 중합체에 새로운 물리적 및 화학적 특성을 부여한다. 그러한 중합체의 물리적인 특성의 향상이 기대된다. 그 중합체들은 과거에 응용되지 않았던 분야로 확장될 수 있다.
<실시예>
본 발명을 실시예를 참조하여 하기에서 구체적으로 설명하지만, 그것으로 제한되어 있지 않다. 다음의 실시예에서, 별도로 명세되지 않은 경우에는 퍼센티지는 중량 퍼센티지이다.
(실시예 1)
슈도모나스 치코리이 YN2(Pseudomonas cichorii YN2)를 폴리펩톤(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 0.5%와, 5-[4-(메틸술파닐)페녹시]발레르산 0.1%를 함유하는 M9 배지의 200㎖에 접종하고, 30℃에서 48시간 동안, 125스트로크/분으로 진탕 배양하였다. 원심분리에 의하여 세포를 회수한 후, 피루브산 나트륨 0.5%와5-[4-(메틸술파닐)페녹시]발레르산 0.1%를 함유하지만 NH4Cl 등의 질소원은 없는 M9 배지의 200㎖에 다시 현탁하고, 30℃에서 46시간 동안 125스트로크/분으로 진탕 배양하였다. 그 후, 원심분리에 의하여 세포를 회수하고, 냉메탄올로 한번 세정하고, 동결건조하였다. 동결건조된 세포의 중량(세포 건조 중량)을 측량하였다.
동결건조된 펠렛을 클로로포름의 20㎖에 현탁하고, 폴리하이드록시알카노에이트를 추출하기 위하여 60℃에서 20시간 동안 교반하였다. 추출물은 0.45㎛ 구멍 크기의 멤브레인 필터를 통과하여 여과되고, 로터리 증발기에 의해 농축되었다. 농축된 용액은 냉메탄올에 의해 침전되었다. 침전물을 회수하고 폴리하이드록시알카노에이트를 28㎎의 수율로 진공에서 건조하였다.
폴리하이드록시알카노에이트의 분자량은 겔퍼미션크로마토그래피(GPC; 토소 HLC-8220, 칼럼; 토소 TSK-GEL SuperHM-H(상품명), 용매; 클로로포름, 폴리스티렌 등가)에 의해 측정하였다. 그 결과, 수 평균 분자량은 156,000이고, 중량 평균 분자량은 36,000이었다.
또한, 폴리하이드록시알카노에이트를 다음의 조건하에서 NMR 분석하였다.
<스펙트로미터>
FT-NMR:1H-NMR에 대하여 400㎒의 스펙트로미터 주파수를 가지는 브루커 디피엑스 400(Bruker DPX 400)
<조건>
핵 종:1H
용매: CDCl3
온도: 상온
도 1은 폴리하이드록시알카노에이트의1H-NMR 스펙트라를 도시한다. 분류 결과를 표 1에 나타낸다.
화학적 시프트(ppm) 적분비 스플리팅 패턴 분류
2.02 2H br d1
2.40 3H s l1
2.43-2.63 2H m b1
3.94 2H br e1
5.27 1H br c1
6.79 2H br g1, k1
7.25 2H br h1, j1
표 1에 의해 명확하게 나타남으로서, 폴리하이드록시알카노에이트가 단량체로서 3-하이드록시-5-[4-(메틸술파닐)페녹시]발레르산과, 3-하이드록시부티르산 및 3-하이드록시발레르산 등의 4 내지 12개의 탄소원자를 가지는 3-하이드록시알카노에이트 및 3-하이드록시알케노에이트를 포함하는,
의 화학식(7)으로 표시되는 것 중의 하나인 것이 확인되었다.
1H-NMR 스펙트라의 적분비는 폴리하이드록시알카노에이트가 3-하이드록시-5-[4-(메틸술파닐)페녹시]발레르산을 23.0㏖% 포함한다는 것을 나타낸다.
(실시예 2)
슈도모나스 치코리이 H45(Pseudomonas cichorii H45)를 폴리펩톤(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 0.5%와, 5-[4-(메틸술파닐)페녹시]발레르산 0.1%를 함유하는 M9 배지의 200㎖에 접종하고, 30℃에서 48시간 동안, 125스트로크/분으로 진탕 배양하였다. 원심분리에 의하여 세포를 회수한 후, 피루브산 나트륨 0.5%와 5-[4-(메틸술파닐)페녹시]발레르산 0.1%를 함유하지만 NH4Cl 등의 질소원은 없는 M9 배지의 200㎖에 다시 현탁하고, 30℃에서 46시간 동안 125스트로크/분으로 진탕 배양하였다. 그 후, 원심분리에 의하여 세포를 회수하고, 냉메탄올로 한번 세정하고, 동결건조하였다. 동결건조된 세포의 중량(세포 건조 중량)을 측량하였다.
동결건조된 펠렛을 클로로포름의 20㎖에 현탁하고, 폴리하이드록시알카노에이트를 추출하기 위하여 60℃에서 20시간 동안 교반하였다. 추출물은 0.45㎛ 구멍 크기의 멤브레인 필터를 통과하여 여과되고, 로터리 증발기에 의해 농축되었다. 농축된 용액은 냉메탄올에 의해 침전되었다. 침전물을 회수하고 폴리하이드록시알카노에이트를 11㎎의 수율로 진공에서 건조하였다.
얻어진 폴리하이드록시알카노에이트는 분자량을 측정하고 실시예 1에서와 같이 동일한 조건하에서 NMR 분석하였다. 그 결과, 이 폴리하이드록시알카노에이트는 단량체로서 3-하이드록시-5-[4-(메틸술파닐)페녹시]발레르산과, 3-하이드록시부티르산 및 3-하이드록시발레르산 등의 4 내지 12개의 탄소원자를 가지는 3-하이드록시알카노에이트 및 3-하이드록시알케노에이트를 포함하는 화학식(7)으로 표시되는 것 중의 하나인 것이 밝혀졌다.1H-NMR 스펙트라의 적분비는 폴리하이드록시알카노에이트가 3-하이드록시-5-[4-(메틸술파닐)페녹시]발레르산을 21.4㏖% 포함한다는 것을 나타낸다.
(실시예 3)
슈도모나스 제세니이 P161(Pseudomonas jessenii P161)를 폴리펩톤(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 0.5%와, 5-[4-(메틸술파닐)페녹시]발레르산 0.1%를 함유하는 M9 배지의 200㎖에 접종하고, 30℃에서 48시간 동안, 125스트로크/분으로 진탕 배양하였다. 원심분리에 의하여 세포를 회수한 후, 피루브산 나트륨 0.5%와 5-[4-(메틸술파닐)페녹시]발레르산 0.1%를 함유하지만 NH4Cl 등의 질소원은 없는 M9 배지의 200㎖에 다시 현탁하고, 30℃에서 46시간 동안 125스트로크/분으로 진탕 배양하였다. 그 후, 원심분리에 의하여 세포를 회수하고, 냉메탄올로 한번 세정하고, 동결건조하였다. 동결건조된 세포의 중량(세포 건조 중량)을 측량하였다.
동결건조된 펠렛을 클로로포름의 20㎖에 현탁하고, 폴리하이드록시알카노에이트를 추출하기 위하여 60℃에서 20시간 동안 교반하였다. 추출물은 0.45㎛ 구멍 크기의 멤브레인 필터를 통과하여 여과되고, 로터리 증발기에 의해 농축되었다. 농축된 용액은 냉메탄올에 의해 침전되었다. 침전물을 회수하고 폴리하이드록시알카노에이트를 9㎎의 수율로 진공에서 건조하였다.
얻어진 폴리하이드록시알카노에이트는 분자량을 측정하고 실시예 1에서와 같이 동일한 조건하에서 NMR 분석하였다. 그 결과, 이 폴리하이드록시알카노에이트는 단량체로서 3-하이드록시-5-[4-(메틸술파닐)페녹시]발레르산과, 3-하이드록시부티르산 및 3-하이드록시발레르산 등의 4 내지 12개의 탄소원자를 가지는 3-하이드록시알카노에이트 및 3-하이드록시알케노에이트를 포함하는 화학식(7)으로 표시되는 것 중의 하나인 것이 밝혀졌다.1H-NMR 스펙트라의 적분비는 폴리하이드록시알카노에이트가 3-하이드록시-5-[4-(메틸술파닐)페녹시]발레르산을 18.4㏖% 포함한다는 것을 나타낸다.
(실시예 4)
슈도모나스 치코리이 YN2(Pseudomonas cichorii YN2)를 D-글루코스 0.5%와, 5-[4-(메틸술파닐)페녹시]발레르산 0.1%를 함유하는 M9 배지의 200㎖에 접종하고, 30℃에서 48시간 동안, 125스트로크/분으로 진탕 배양하였다. 원심분리에 의하여 세포를 회수한 후, D-글루코스 0.5%와 5-[4-(메틸술파닐)페녹시]발레르산 0.1%를 함유하지만 NH4Cl 등의 질소원은 없는 M9 배지의 200㎖에 다시 현탁하고, 30℃에서 46시간 동안 125스트로크/분으로 진탕 배양하였다. 그 후, 원심분리에 의하여 세포를 회수하고, 냉메탄올로 한번 세정하고, 동결건조하였다. 동결건조된 세포의 중량(세포 건조 중량)을 측량하였다.
동결건조된 펠렛을 클로로포름의 20㎖에 현탁하고, 폴리하이드록시알카노에이트를 추출하기 위하여 60℃에서 20시간 동안 교반하였다. 추출물은 0.45㎛ 구멍 크기의 멤브레인 필터를 통과하여 여과되고, 로터리 증발기에 의해 농축되었다. 농축된 용액은 냉메탄올에 의해 침전되었다. 침전물을 회수하고 폴리하이드록시알카노에이트를 18㎎의 수율로 진공에서 건조하였다.
얻어진 폴리하이드록시알카노에이트는 분자량을 측정하고 실시예 1에서와 같이 동일한 조건하에서 NMR 분석하였다. 그 결과, 이 폴리하이드록시알카노에이트는 단량체로서 3-하이드록시-5-[4-(메틸술파닐)페녹시]발레르산과, 3-하이드록시부티르산 및 3-하이드록시발레르산 등의 4 내지 12개의 탄소원자를 가지는 3-하이드록시알카노에이트 및 3-하이드록시알케노에이트를 포함하는 화학식(7)으로 표시되는 것 중의 하나인 것이 밝혀졌다.1H-NMR 스펙트라의 적분비는 폴리하이드록시알카노에이트가 3-하이드록시-5-[4-(메틸술파닐)페녹시]발레르산을 29.6㏖% 포함한다는 것을 나타낸다.
(실시예 5)
슈도모나스 치코리이 H45(Pseudomonas cichorii H45)를 D-글루코스 0.5%와, 5-[4-(메틸술파닐)페녹시]발레르산 0.1%를 함유하는 M9 배지의 200㎖에 접종하고, 30℃에서 48시간 동안, 125스트로크/분으로 진탕 배양하였다. 원심분리에 의하여 세포를 회수한 후, D-글루코스 0.5%와 5-[4-(메틸술파닐)페녹시]발레르산 0.1%를 함유하지만 NH4Cl 등의 질소원은 없는 M9 배지의 200㎖에 다시 현탁하고, 30℃에서 46시간 동안 125스트로크/분으로 진탕 배양하였다. 그 후, 원심분리에 의하여 세포를 회수하고, 냉메탄올로 한번 세정하고, 동결건조하였다. 동결건조된 세포의 중량(세포 건조 중량)을 측량하였다.
동결건조된 펠렛을 클로로포름의 20㎖에 현탁하고, 폴리하이드록시알카노에이트를 추출하기 위하여 60℃에서 20시간 동안 교반하였다. 추출물은 0.45㎛ 구멍 크기의 멤브레인 필터를 통과하여 여과되고, 로터리 증발기에 의해 농축되었다. 농축된 용액은 냉메탄올에 의해 침전되었다. 침전물을 회수하고 폴리하이드록시알카노에이트를 18㎎의 수율로 진공에서 건조하였다.
얻어진 폴리하이드록시알카노에이트는 분자량을 측정하고 실시예 1에서와 같이 동일한 조건하에서 NMR 분석하였다. NMR의 결과, 이 폴리하이드록시알카노에이트는 단량체로서 3-하이드록시-5-[4-(메틸술파닐)페녹시]발레르산과, 3-하이드록시부티르산 및 3-하이드록시발레르산 등의 4 내지 12개의 탄소원자를 가지는 3-하이드록시알카노에이트 및 3-하이드록시알케노에이트를 포함하는 화학식(7)으로 표시되는 것 중의 하나인 것이 밝혀졌다.1H-NMR 스펙트라의 적분비는 폴리하이드록시알카노에이트가 3-하이드록시-5-[4-(메틸술파닐)페녹시]발레르산을 35.6㏖% 함유한다는 것을 나타낸다.
(실시예 6)
슈도모나스 치코리이 YN2(Pseudomonas cichorii YN2)를 효모 추출물(DIFCO) 0.5%와, 5-[4-(메틸술파닐)페녹시]발레르산 0.1%를 함유하는 M9 배지의 200㎖에 접종하고, 30℃에서 48시간 동안, 125스트로크/분으로 진탕 배양하였다. 원심분리에 의하여 세포를 회수한 후, 피루브산 나트륨 0.5%와 5-[4-(메틸술파닐)페녹시]발레르산 0.1%를 함유하지만 NH4Cl 등의 질소원은 없는 M9 배지의 200㎖에 다시 현탁하고, 30℃에서 46시간 동안 125스트로크/분으로 진탕 배양하였다. 그 후, 원심분리에 의하여 세포를 회수하고, 냉메탄올로 한번 세정하고, 동결건조하였다. 동결건조된 세포의 중량(세포 건조 중량)을 측량하였다.
동결건조된 펠렛을 클로로포름의 20㎖에 현탁하고, 폴리하이드록시알카노에이트를 추출하기 위하여 60℃에서 20시간 동안 교반하였다. 추출물은 0.45㎛ 구멍 크기의 멤브레인 필터를 통과하여 여과되고, 로터리 증발기에 의해 농축되었다. 농축된 용액은 냉메탄올에 의해 침전되었다. 침전물을 회수하고 폴리하이드록시알카노에이트를 15㎎의 수율로 진공에서 건조하였다.
얻어진 폴리하이드록시알카노에이트는 분자량을 측정하고 실시예 1에서와 같이 동일한 조건하에서 NMR 분석하였다. NMR의 결과, 이 폴리하이드록시알카노에이트는 단량체로서 3-하이드록시-5-[4-(메틸술파닐)페녹시]발레르산과, 3-하이드록시부티르산 및 3-하이드록시발레르산 등의 4 내지 12개의 탄소원자를 가지는 3-하이드록시알카노에이트 및 3-하이드록시알케노에이트를 포함하는 화학식(7)으로 표시되는 것 중의 하나인 것이 밝혀졌다.1H-NMR 스펙트라의 적분비는 폴리하이드록시알카노에이트가 3-하이드록시-5-[4-(메틸술파닐)페녹시]발레르산을 15.1㏖% 함유한다는 것을 나타낸다.
(실시예 7)
슈도모나스 치코리이 YN2(Pseudomonas cichorii YN2)를 글루탐산 나트륨 0.5%와, 5-[4-(메틸술파닐)페녹시]발레르산 0.1%를 함유하는 M9 배지의 200㎖에 접종하고, 30℃에서 48시간 동안, 125스트로크/분으로 진탕 배양하였다. 원심분리에 의하여 세포를 회수한 후, 피루브산 나트륨 0.5%와 5-[4-(메틸술파닐)페녹시]발레르산 0.1%를 함유하지만 NH4Cl 등의 질소원은 없는 M9 배지의 200㎖에 다시 현탁하고, 30℃에서 46시간 동안 125스트로크/분으로 진탕 배양하였다. 그 후, 원심분리에 의하여 세포를 회수하고, 냉메탄올로 한번 세정하고, 동결건조하였다. 동결건조된 세포의 중량(세포 건조 중량)을 측량하였다.
동결건조된 펠렛을 클로로포름의 20㎖에 현탁하고, 폴리하이드록시알카노에이트를 추출하기 위하여 60℃에서 20시간 동안 교반하였다. 추출물은 0.45㎛ 구멍 크기의 멤브레인 필터를 통과하여 여과되고, 로터리 증발기에 의해 농축되었다. 농축된 용액은 냉메탄올에 의해 침전되었다. 침전물을 회수하고 폴리하이드록시알카노에이트를 25㎎의 수율로 진공에서 건조하였다.
얻어진 폴리하이드록시알카노에이트는 분자량을 측정하고 실시예 1에서와 같이 동일한 조건하에서 NMR 분석하였다. NMR의 결과, 이 폴리하이드록시알카노에이트는 단량체로서 3-하이드록시-5-[4-(메틸술파닐)페녹시]발레르산과, 3-하이드록시부티르산 및 3-하이드록시발레르산 등의 4 내지 12개의 탄소원자를 가지는 3-하이드록시알카노에이트 및 3-하이드록시알케노에이트를 포함하는 화학식(7)으로 표시되는 것 중의 하나인 것이 밝혀졌다.1H-NMR 스펙트라의 적분비는 폴리하이드록시알카노에이트가 3-하이드록시-5-[4-(메틸술파닐)페녹시]발레르산을 12.2㏖% 함유한다는 것을 나타낸다.
(실시예 8)
슈도모나스 치코리이 YN2(Pseudomonas cichorii YN2)를 폴리펩톤(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 0.5%와 5-[4-(메틸술파닐)페녹시]발레르산 0.1%를 함유하는 M9 배지의 200㎖에 접종하고, 30℃에서 48시간 동안, 125스트로크/분으로 진탕 배양하였다. 원심분리에 의하여 세포를 회수한 후, 노난산 0.1%와 5-[4-(메틸술파닐)페녹시]발레르산 0.1%를 함유하지만 NH4Cl 등의 질소원은 없는 M9 배지의 200㎖에 다시 현탁하고, 30℃에서 46시간 동안 125스트로크/분으로 진탕 배양하였다. 그 후, 원심분리에 의하여 세포를 회수하고, 냉메탄올로 한번 세정하고, 동결건조하였다. 동결건조된 세포의 중량(세포 건조 중량)을 측량하였다.
동결건조된 펠렛을 클로로포름의 20㎖에 현탁하고, 폴리하이드록시알카노에이트를 추출하기 위하여 60℃에서 20시간 동안 교반하였다. 추출물은 0.45㎛ 구멍 크기의 멤브레인 필터를 통과하여 여과되고, 로터리 증발기에 의해 농축되었다. 농축된 용액은 냉메탄올에 의해 침전되었다. 침전물을 회수하고 폴리하이드록시알카노에이트를 30㎎의 수율로 진공에서 건조하였다.
얻어진 폴리하이드록시알카노에이트는 분자량을 측정하고 실시예 1에서와 같이 동일한 조건하에서 NMR 분석하였다. NMR의 결과, 이 폴리하이드록시알카노에이트는 단량체로서 3-하이드록시-5-[4-(메틸술파닐)페녹시]발레르산과, 3-하이드록시부티르산 및 3-하이드록시발레르산 등의 4 내지 12개의 탄소원자를 가지는 3-하이드록시알카노에이트 및 3-하이드록시알케노에이트를 포함하는 화학식(7)으로 표시되는 것 중의 하나인 것이 밝혀졌다.1H-NMR 스펙트라의 적분비는 폴리하이드록시알카노에이트가 3-하이드록시-5-[4-(메틸술파닐)페녹시]발레르산을 3.1㏖% 함유한다는 것을 나타낸다.
표 2는 실시예 1 내지 8의 결과물인 중합체에서 세포의 건조 중량과, 중합체의 건조 중량과, 건조 중량에 의한 세포 대비 중합체의 비율 및 3-하이드록시-5-[(페닐메틸)술파닐]발레르산("3HMSPxV"로서 약칭함) 유닛의 양(㏖%)을 나타낸다.
세포 건조 중량(㎎/ℓ) 고분자 건조 중량(㎎/ℓ) 고분자 중량/세포 중량(%) 3HMSPxV유닛㏖%
실시예 1 800 140 17.5 23.0
실시예 2 505 55 10.9 21.4
실시예 3 455 45 9.9 18.4
실시예 4 630 135 21.4 29.6
실시예 5 520 90 17.3 35.6
실시예 6 615 75 12.2 17.5
실시예 7 585 125 21.4 12.2
실시예 8 500 150 30.0 3.1
표 3은 실시예 1 내지 8에서 결과물인 중합체의 분자량을 나타낸다.
수 평균 분자량(Mn) 중량 평균 분자량(Mw)
실시예 1 15,600 36,000
실시예 2 16,400 37,500
실시예 3 16,200 37,100
실시예 4 15,100 34,700
실시예 5 15,400 35,200
실시예 6 16,200 36,600
실시예 7 14,800 34,500
실시예 8 18,000 39,000
(실시예 9)
슈도모나스 치코리이 YN2(Pseudomonas cichorii YN2)를 폴리펩톤(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 0.5%와;
의 화학식(8)으로 표시되는 6-[4-(메틸술파닐)페녹시]헥산산 0.1%를 함유하는 M9 배지의 200㎖에 접종하고, 30℃에서 48시간 동안, 125스트로크/분으로 진탕 배양하였다. 원심분리에 의하여 세포를 회수한 후, 피루브산 0.5%와 6-[4-(메틸술파닐)페녹시]헥산산 0.1%를 함유하지만 NH4Cl 등의 질소원은 없는 M9 배지의 200㎖에 다시 현탁하고, 30℃에서 46시간 동안 125스트로크/분으로 진탕 배양하였다. 그 후, 원심분리에 의하여 세포를 회수하고, 냉메탄올로 한번 세정하고, 동결건조하였다. 동결건조된 세포의 중량(세포 건조 중량)을 측량하였다.
동결건조된 펠렛을 클로로포름의 20㎖에 현탁하고, 폴리하이드록시알카노에이트를 추출하기 위하여 60℃에서 20시간 동안 교반하였다. 추출물은 0.45㎛ 구멍 크기의 멤브레인 필터를 통과하여 여과되고, 로터리 증발기에 의해 농축되었다. 농축된 용액은 냉메탄올에 의해 침전되었다. 침전물을 회수하고 폴리하이드록시알카노에이트를 22㎎의 수율로 진공에서 건조하였다.
폴리하이드록시알카노에이트의 분자량은 겔퍼미션크로마토그래피(GPC; 토소 HLC-8220, 칼럼; 토소 TSK-GEL SuperHM-H(상품명), 용매; 클로로포름, 폴리스티렌등가)에 의해 측정하였다. 그 결과, 수 평균 분자량은 14,500이고, 중량 평균 분자량은 33,000이었다.
얻어진 폴리하이드록시알카노에이트는 분자량을 측정하고 실시예 1에서와 같이 동일한 조건하에서 NMR 분석하였다. NMR의 결과, 이 폴리하이드록시알카노에이트는 단량체로서,
의 화학식(9)으로 표시되는 3-하이드록시-6-[4-(메틸술파닐)페녹시]헥산산과;
의 화학식(10)으로 표시되는 3-하이드록시-4-[4-(메틸술파닐)페녹시]부티르산과, 3-하이드록시부티르산 및 3-하이드록시발레르산 등의 4 내지 12개의 탄소원자를 가지는 3-하이드록시알카노에이트 및 3-하이드록시알케노에이트를 포함하는 것 중의 하나인 것이 밝혀졌다.1H-NMR 스펙트라의 적분비는 폴리하이드록시알카노에이트가 3-하이드록시-6-[4-(메틸술파닐)페녹시]헥산산 유닛을 8.1㏖%, 3-하이드록시-4-[4-(메틸술파닐)페녹시]부티르산 유닛을 9.2㏖% 함유한다는 것을 나타낸다.
(실시예 10)
슈도모나스 치코리이 H45(Pseudomonas cichorii H45)를 D-글루코스 0.5%와 6-[4-(메틸술파닐)페녹시]헥산산 0.1%를 함유하는 M9 배지의 200㎖에 접종하고, 30℃에서 48시간 동안, 125스트로크/분으로 진탕 배양하였다. 원심분리에 의하여 세포를 회수한 후, D-글루코스 0.5%와 6-[4-(메틸술파닐)페녹시]헥산산 0.1%를 함유하지만 NH4Cl 등의 질소원은 없는 M9 배지의 200㎖에 다시 현탁하고, 30℃에서 46시간 동안 125스트로크/분으로 진탕 배양하였다. 그 후, 원심분리에 의하여 세포를 회수하고, 냉메탄올로 한번 세정하고, 동결건조하였다. 동결건조된 세포의 중량(세포 건조 중량)을 측량하였다.
동결건조된 펠렛을 클로로포름의 20㎖에 현탁하고, 폴리하이드록시알카노에이트를 추출하기 위하여 60℃에서 20시간 동안 교반하였다. 추출물은 0.45㎛ 구멍 크기의 멤브레인 필터를 통과하여 여과되고, 로터리 증발기에 의해 농축되었다.농축된 용액은 냉메탄올에 의해 침전되었다. 침전물을 회수하고 폴리하이드록시알카노에이트를 16㎎의 수율로 진공에서 건조하였다.
얻어진 폴리하이드록시알카노에이트는 분자량을 측정하고 실시예 1에서와 같이 동일한 조건하에서 NMR 분석하였다. NMR의 결과, 이 폴리하이드록시알카노에이트는 단량체로서 3-하이드록시-6-[4-(메틸술파닐)페녹시]헥산산과, 3-하이드록시-4-[4-(메틸술파닐)페녹시]부티르산과, 3-하이드록시부티르산 및 3-하이드록시발레르산 등의 4 내지 12개의 탄소원자를 가지는 3-하이드록시알카노에이트 및 3-하이드록시알케노에이트를 포함하는 것 중의 하나인 것이 밝혀졌다.1H-NMR 스펙트라의 적분비는 폴리하이드록시알카노에이트가 3-하이드록시-6-[4-(메틸술파닐)페녹시]헥산산 유닛을 12.4㏖%, 3-하이드록시-4-[4-(메틸술파닐)페녹시]부티르산을 15.1㏖% 함유한다는 것을 나타낸다.
표 4는 실시예 9 내지 10의 결과물인 중합체에서 세포의 건조 중량과, 중합체의 건조 중량과, 건조 중량에 의한 세포 대비 중합체의 비율 및 3-하이드록시-6-[(메틸술파닐)페녹시]헥산산(3HMSPxHx) 유닛과 3-하이드록시-4-[4-(메틸술파닐)페녹시]부티르산(3HMSPxB) 유닛의 양(㏖%)을 나타낸다.
세포 건조중량(㎎/ℓ) 고분자 건조 중량(㎎/ℓ) 고분자 중량/세포 중량(%) 3HMSPxHx유닛㏖% 3HMSPxB유닛㏖%
실시예 9 605 110 18.2 8.1 9.2
실시예 10 485 80 16.5 12.4 15.1
표 5는 실시예 9 내지 10에서 결과물인 중합체의 분자량을 나타낸다.
수 평균 분자량(Mn) 중량 평균 분자량(Mw)
실시예 9 14,500 33,000
실시예 10 15,200 34,100
본 발명은 바람직한 실시예에 관하여 상세하게 설명하였고, 본 발명의 넓은 측면에서 본 발명으로부터 일탈함이 없이 변경과 변형할 수 있으므로, 본 발명의 진실한 정신에 포함되는 모든 그러한 변경과 변형을 포함하도록 첨부된 청구항에 의도되어 있다.
본 발명의 PHA는 장치 재료 및 의약 재료로서 잠재적인 유용성을 가지는, 기능성 있는 중합체로서 사용할 수 있다.
본 발명에 의한 신규한 폴리하이드록시알카노에이트는, 공급원료로서 ω-[(메틸술파닐)페녹시]알칸산 및 성장기질를 함유하는 배지에서 PHA생산용 미생물을 배양하는 공정과; 배양 공정동안 미생물에 의해 생산되고 미생물에 축적된 곁사슬의 말단에 (메틸술파닐)페녹시기를 가지는 유닛을 포함하는 폴리하이드록시알카노에이트를 회수하는 공정에 의해 생산될 수 있다.

Claims (29)

  1. 의 화학식(1)(식중, x는 폴리하이드록시알카노에이트에 임의로 존재하는 1 내지 8의 정수임)
    으로 표시되는 유닛을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트.
  2. 제 1항에 있어서,
    의 화학식(2)(식중, y는 폴리하이드록시알카노에이트에 임의로 존재하는 0내지 8의 정수임)
    으로 표시되는 3-하이드록시알카노에이트와;
    의 화학식(3)(식중, z는 폴리하이드록시알카노에이트에 임의로 존재하는 3 또는 5의 정수임)으로 표시되는 3-하이드록시알케노에이트 로부터 선택된 한 개 이상의 유닛을 부가하여 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트.
  3. 제 1항 있어서, 폴리하이드록시알카노에이트가 5,000 내지 300,000의 수평균 분자량을 가지는 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트.
  4. 제 1항에 있어서,
    의 화학식(4)으로 표시되는 3-하이드록시-5-[4-(메틸술파닐)페녹시]발레르산 유닛을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트.
  5. 의 화학식(5)(식중, x는 1 내지 8의 정수임)으로 표시되는 화합물을 포함하는 배지 속에서 미생물을 배양하는 공정을 포함하는 폴리하이드록시알카노에이트를 제조하는 방법에 있어서,
    상기 폴리하이드록시알카노에이트는,
    의 화학식(1)(식중, x는 폴리하이드록시알카노에이트에 임의로 존재하는 1 내지 8의 정수임)으로 표시되는 유닛을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트의 제조방법.
  6. 제 5항에 있어서, 상기 폴리하이드록시알카노에이트는,
    의 화학식(2)(식중, y는 폴리하이드록시알카노에이트에 임의로 존재하는 0내지 8의 정수임)으로 표시되는 3-하이드록시알카노에이트와;
    의 화학식(3)(식중, z는 폴리하이드록시알카노에이트에 임의로 존재하는 3 또는 5의 정수임)으로 표시되는 3-하이드록시알케노에이트로 구성된 군으로부터 선택한 한 개 이상의 유닛을 부가하여 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트의 제조방법.
  7. 제 5항에 있어서, 배지는 폴리펩톤을 함유하는 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트의 제조방법.
  8. 제 5항에 있어서, 배지는 효모 추출물을 함유하는 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트의 제조방법.
  9. 제 5항에 있어서, 배지는 당류를 함유하는 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트의 제조방법.
  10. 제 9항에 있어서, 배지는 글리세롤알데하이드, 에리트로스, 아라비노스, 크실로스, 글루코스, 갈락토스, 맨노스, 프럭토스, 글리세롤, 에리트리톨, 크실리톨, 글루콘산, 글루쿠론산, 갈락투론산, 말토스, 수크로스 및 락토스로 구성된 군으로부터 선택한 한 개 이상의 당류를 함유하는 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트의 제조방법.
  11. 제 5항에 있어서, 배지는 유기산 또는 그 염을 함유하고 있는 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트의 제조방법.
  12. 제 11항에 있어서, 배지는 피루브산, 말산, 락트산, 시트르산, 숙신산 또는 그 염으로 구성된 군으로부터 선택한 유기산 또는 그 염을 한 개 이상 함유하는 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트의 제조방법.
  13. 제 5항에 있어서, 배지는 아미노산 또는 그 염을 함유하는 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트의 제조방법.
  14. 제 13항에 있어서, 배지는 글루탐산, 아스팔트산 및 그 염으로 구성된 군으로부터 선택한 아미노산 또는 그 염을 한 개 이상 함유하는 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트의 제조방법.
  15. 제 5항에 있어서, 배지는 4 내지 12개의 탄소 또는 그 염으로 구성된 곧은 사슬 알칸산을 함유하는 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트의 제조방법.
  16. 제 5항에 있어서, 배양 공정이 두 개 이상의 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트의 제조방법.
  17. 제 16항에 있어서, 제 1공정 이후의 공정에서 배지가 질소원을 함유하지 않는 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트의 제조방법.
  18. 제 16항에 있어서, 상기 배양 공정은,
    (1-1) 폴리펩톤 및 화학식(5)으로 표시되는 적어도 한 개의 화합물을 함유하는 배지에서 미생물을 배양하는 공정과;
    (1-2) 화학식(5)으로 표시되는 화합물 및 유기산 또는 그 염을 함유하는 배지에서 공정(1-1)으로부터의 미생물을 다시 배양하는 공정
    을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트의 제조방법.
  19. 제 18항에 있어서, 유기산 또는 그 염은 피루브산, 말산, 락트산, 시트르산, 숙신산 및 그 염으로 구성된 군으로부터 선택한 한 개 이상의 화합물인 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트의 제조방법.
  20. 제 16항에 있어서, 상기 배양 공정은,
    (1-3) 당류 및 화학식(5)으로 표시되는 적어도 한 개의 화합물을 함유하는 배지에서 미생물을 배양하는 공정과;
    (1-4) 화학식(5)으로 표시되는 화합물 및 당류를 함유하는 배지에서 공정(1-3)으로부터의 미생물을 다시 배양하는 공정
    을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트의 제조방법.
  21. 제 20항에 있어서, 당류가 글리세롤알데하이드, 에리트로스, 아라비노스, 크실로스, 글루코스, 갈락토스, 맨노스, 프럭토스, 글리세롤, 에리트리톨, 크실리톨, 글루콘산, 글루쿠론산, 갈락투론산, 말토스, 수크로스 및 락토스로 구성된 군으로부터 선택한 한 개 이상의 화합물인 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트의 제조방법.
  22. 제 5항에 있어서, 화학식(5)으로 표시되는 화합물은,
    의 화학식(6)으로 표시되는 5-[4-(메틸술파닐)페녹시]발레르산이고;
    또한, 상기 유닛은,
    의 화학식(4)으로 표시되는 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트의 제조방법.
  23. 제 5항에 있어서, 배양 공정에서 배양한 미생물의 세포로부터 폴리하이드록시알카노에이트를 분리하는 공정을 부가하여 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트의 제조방법.
  24. 제 23항에 있어서, 폴리하이드록시알카노에이트의 분리공정은, 배양 공정에서 배양된 미생물의 세포에 축적된 폴리하이드록시알카노에이트를 용해하고 추출하기 위하여 용매에 의해 처리하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트의 제조방법.
  25. 제 24항에 있어서, 용매는 클로로포름, 디클로로메탄, 다이옥산, 테트라하이드로푸론, 아세토니트릴 및 아세톤으로 구성된 군으로부터 선택한 한 개 이상의 용매인 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트의 제조방법.
  26. 제 23항에 있어서, 폴리하이드록시알카노에이트의 분리공정은, 미생물의 세포를 파쇄하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트의 제조방법.
  27. 제 26항에 있어서, 초음파파쇄법(ultrasonic disruption), 호모지나이저법(homogenization), 압력파쇄법(pressure disruption), 유리비즈 충격법(disruption with glass beads), 마쇄법(trituration), 연궤법(grinding) 또는 동결 융해법(freeze-thawing)에 의하여 세포를 파쇄하는 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트의 제조방법.
  28. 제 5항에 있어서, 미생물은 슈도모나스(Pseudomonas) 속에 속하는 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트의 제조방법.
  29. 제 28항에 있어서 슈도모나스(Pseudomonas) 속에 속하는 미생물은 슈도모나스 치코리이 YN2(Pseudomonas cichorii YN2; FERM BP-7375), 슈도모나스 치코리이 H45(Pseudomonas cichorii H45; FERM BP-7374), 슈도모나스 제세니이P161(Pseudomonas jessenii P161; FERM BP-7376)으로 구성된 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트의 제조방법.
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