CZ309148B6 - Způsob výroby polyhydroxyalkanoátů z pevného odpadu po přípravě kávy - Google Patents

Abstract

Komplexní zpracování různě extrahovaných frakcí pevného odpadu po přípravě kávy k biotechnologické výrobě polyhydroxyalkanoátů s využitím hydrolyzovaného pevného odpadu po přípravě kávy. Zbytkový podíl po extrakci je spálen a použit pro produkci energie využitelné ke krytí potřeb biotechnologických kroků. Způsob výroby homopolymerů poly(3-hydroxybutyrátů) a/nebo kopolymerů poly(3-hydroxybutyrát-co-3-hydroxyvalerátů) z kávového hydrolyzátu získaného enzymatickou a/nebo kyselou hydrolýzou hemicelulóz a celulóz z pevného odpadu po přípravě kávy, při kterém se provede biotechnologická konverze kávového hydrolyzátu za pomocí bakterie Burkholderia cepacia nebo Bacillus megaterium.

Description

Způsob výroby polyhydroxyalkanoátů z pevného odpadu po přípravě kávy

Oblast techniky

Vynález se týká využití pevného odpadu po přípravě kávy pro biotechnologickou výrobu polyhydroxyalkanoátů, kdy je jako substrát pro biotechnologickou výrobu polyhydroxyalkanoátů využit hydrolyzát pevného podílu odpadu.

Dosavadní stav techniky

Káva, tedy horký nápoj připravovaný z různých plodů kávovníku (nejčastěji se jedná o odrůdy Coffea robusta a Coffea arabica), představuje, díky své senzorické kvalitě a stimulujícím vlastnostem, celosvětově jeden z nej rozšířenějších nápojů. V roce 2010 bylo celosvětově vyprodukováno a následně zpracováno přibližně 8 017 860 tun kávových zm. Díky tomu je káva druhou nej obchodovanější komoditou světa (prvenství patří ropě) a mezi zemědělskými produkty jí tedy patří první místo [1].

Zpracování kávy proto generuje významné množství odpadu, které obvykle nenachází další uplatnění. Odpadním produktem zpracování kávy je, mimo jiné, také prášek kávových zm vznikající po přípravě kávy (anglicky spent coffee ground, SCG), který je pro účely této patentové přihlášky dále označován jako pevný odpad po přípravě kávy. Tento odpadní materiál je ve velkých objemech produkován především při přípravě instantní kávy přímo ve zpracujících podnicích. Přibližně 50 % světové produkce kávy je využito na přípravu rozpustné kávy. Obecně platí, že zpracování jedné tuny zelených kávových zm vede k produkci přibližně 650 kg pevného odpadu, přičemž při výrobě 1 kg rozpustné (instantní kávy) vzniknou přibližně 2 kg SCG [2].

V odborné i patentové literatuře je možné najít několik technologií zpracování odpadní kávy. Díky své vysoké spalné teplotě (cca 5000 kcal/kg) bylo uvažováno spalování odpadní kávy za účelem produkce energie, případně využití odpadní kávy jako hnojivá [3], Yen et al. se zabývali využitím odpadní kávy jako zdroje antioxidantů [4], Simoes et al. testovali využití odpadní kávy jako zdroje póly sacharidů stimulujících imunitní systém [5], Bylo také uvažováno využití odpadní kávy jako absorpčního činidla pro odstranění kladně nabitých barviv při čištění odpadních vod [6], případně jako zdroje polyfenolů [7, 8], Odpadní káva byla také identifikována jako surovina pro výrobu biopaliv - ať už ethanolu [9, 10, 11] nebo bionafty (ta se připravuje transesterifikací oleje odpadní kávy) [1, 11, 12], Navrženo bylo také několik technologií využití odpadní kávy při zpracování kávy [13, 14, 15], nicméně žádná z výše zmíněných technologií se doposud neimplementovala ve větším měřítku a kávovinový odpad není velkoobjemově žádným způsobem využíván.

Polyhydroxyalkanoáty (PHA) jsou polyestery přírodního původu, které byly objeveny již v roce 1926 francouzským mikrobiologem Lemoignem. Ten izoloval a charakterizoval poly(3hydroxybutyrát) (PHB) z bakterie Bacillus megaterium. Od té doby byla schopnost produkce a akumulace PHA objevena u celé řady mikroorganismů, a to jak u gram-pozitivních tak i gramnegativních kmenů (autotrofhích, heterotrofhích, fototrofních; aerobních i anaerobních), ale také u některých kmenů archaebakterií. Bakterie syntetizují PHA jako zásobní zdroj uhlíku, energie a redukční síly, a to nej častěji při nadbytku uhlíkatého zdroje a současné limitaci jiným důležitým prvkem (dusíkem, fosforem, železem atd.). Po vyčerpání uhlíkatého substrátu dokážou buňky PHA rozložit a využít je jako zdroj uhlíku a energie ke svým metabolickým pochodům [16],

PHA jsou polyestery hydroxykyselin. V závislosti na délce řetězce hydroxykyseliny se PHA dělí do dvou skupin. Polyestery složené z hydroxykyselin o délce 3 až 5 atomů uhlíku se označují jako short-chain-lenght (scl-PHA), zatímco PHA obsahující monomery o délce 6 až 14 atomů uhlíku spadají do skupiny medium-chain-lenght (mel-PHA). V současné době je známo více než

- 1 CZ 309148 B6 hydroxykyselin, které slouží jako PHA monomery. Patří mezi ně řada sloučenin obsahujících rozličné funkční skupiny - halogenový atom, hydroxyl-, epoxy-, karboxyl-, kyano- funkční skupiny, ale také esterifikované karboxyly. Navíc mastné hydroxykyseliny mcl-PHA často obsahují násobné vazby nebo rozvětvené, případně aromatické struktury. Hydroxylová skupina PHA monomerů se nej častěji nachází v poloze 3, ale jsou známy i monomery s hydroxylovou skupinou v poloze 2 až 6. Monomery PHA mikrobiálního původu jsou vždy v R-konfiguraci, což je způsobeno stereospecifitou příslušných biosyntetických enzymů [17],

Možnost produkce polyhydroxyalkanoátů s využitím odpadních substrátů je řešena v rámci řady patentů a publikací. Jeden z nej obecnějších postupů zpracování zřejmě většiny typů odpadů je popsán v patentu US 2009/0317879 AI, kde však jsou blíže nespecifikované odpady zpracovány methanotrofními bakteriemi na těkavé karboxylové kyseliny (propionová, octová) a na methan, a tyto organické látky jsou posléze využity jako substrát pro produkční kmen. V dalším patentu US 2010/0190221AI jsou pro produkci polyhydroxyalkanoátů použity potenciálně toxické substráty. Pomocí enzymu methan-monooxygenázy jsou organické sloučeniny převáděny na utilizovatelné substráty.

Rovněž vlastní produkce PHA na odpadních olejích nej různějšího druhuje součásti řady různých patentů. Autoři využívali, např. skládkový odpad obsahující olej (CN 101255227 A - 2008-0903), dále jedlý odpadní olej k produkci PHA pomocí vodíkových bakterií (JP2004254668 A 2004-09-16), různé typy rostlinných olejů - jmenovitě slunečnicový, řepkový, konopný a další bez bližšího upřesnění (WO 2009/156950 A2). Potenciálním substrátem pro produkci polyhydroxyalkanoátů je olej z Brassica carinata konvertovaný na polyhydroxyalkanoáty pomocí bakterií rodu Pseudomonas (WO 2010/0441180 AI). Problematika využití olejů k biotechnologické produkci polyhydroxyalkanoátů je rovněž obsahem mnoha publikací [20-30], V žádném z dostupných zdrojů se však nevyskytuje možnost využití oleje získaného pomocí extrakce z odpadní kávy.

Hydrolýzou hemicelulóz na fermentovatelné produkty se zabývalo několik publikací i patentů. V rámci patentu EP 0964061 A3 byla navržena hydrolýza blíže nespecifikovaného materiálu obsahujícího hemicelulózy a celulózy použitím koncentrované kyseliny. Patent CA 2418441 C pak uvažuje hydrolýzu blíže nespecifikovaného materiálu obsahujícího hemicelulózy a celulózy za současné aplikace zředěného roztoku minerální kyseliny (např. H2SO4, HC1, HNO3) a soli (např. Fe2(SO4)3, FeSO4, MgSO4).

Mechanické vlastnosti PHA významně závisí na zastoupení jednotlivých monomerů. Homopolymer PHB vykazuje poměrně vysokou krystaličnost (asi 50 až 80 %), což ho činí tuhým a křehkým. Teplota skelného přechodu je 5 až 9 °C, teplota tání 173 až 180 °C. PHB se rozkládá při 200 °C, což je nebezpečně blízko bodu tání. Tato skutečnost je z hlediska průmyslového zpracování materiálu nepříjemná, neboť při tavení materiálu může docházet k jeho nežádoucímu rozkladu. Pokud je však do struktury polymeru zabudován 3-hydroxyvalerát nebo jiný monomer, mechanické vlastnosti se výrazně zlepší. Bod tání kopolymeru klesá na přibližně 130 °C, mírně klesne i teplota rozkladu. Díky tomu může být kopolymer taven, aniž by došlo k jeho rozkladu [18]·

V roce 1976 britská společnost Imperiál Chemical Industrie (IQ) rozpoznala potenciál PHB nahradit syntetické polymery připravované většinou z ropy. Přestože bakteriální produkce PHB byla drahá, předpokládalo se, že prudký růst cen ropy umožní rentabilní bakteriální výrobu PHB. Protože k očekávanému růstu cen ropy nedošlo, nachází PHB uplatnění především jako biodegradabilní a biokompatibilní materiál. Kvůli vysoké ceně však PHB a P(HB-co-HV) (kopolymer 3-hydroxybutyrátu a 3-hydroxyvalerátu), které se objevují pod obchodní značkou Biopol, nacházejí spíše sporadické uplatnění na trhu. V roce 1990 německá firma Wella použila obaly z Biopolu pro nový šampón. V roce 1996 odkoupila americká firma Monsanto Biopol od firmy ZENECA BioProducts, dceřiné společnosti ICL I v současné době jsou prezentovány

- 2 CZ 309148 B6 patenty k produkci PHA pomocí transgenních rostlin, což by mělo snížit náklady na výrobu (př. US 2003/0017576A1. US 2004/0101865 AI).

Klasická výroba PHA spočívá ve fermentačním postupu s monokulturou vybraného bakteriálního kmene. Přestože existuje řada bakteriálních kmenů schopná produkce PHA. k průmyslovému využití je možno aplikovat jen několik málo z nich. Použitelnost bakteriálního kmene ovlivňuje řada faktoru. Především je to stabilita vlastností a bezpečnost, růstové a akumulační schopnosti, dosažitelné množství biomasy a množství akumulovaného PHA. Důležité jsou také míra extrahovatelnosti PHA, molekulová hmotnost PHA, množství použitelných substrátů a finanční náročnost jednotlivých komponent média [16], Právě finanční aspekt celé výroby je z hlediska masové produkce PHA klíčový. Hlavní nevýhoda polyhydroxyalkanoátů oproti syntetickým plastům vyráběným z fosilních surovin spočívá ve vysoké ceně biopolyesterů. Bakteriálně produkované PHA jsou asi 5 až 10 krát dražší než syntetické plasty polypropylen nebo polyetylén s podobnými mechanickými vlastnostmi. Hlavní náklady syntézy PHA spočívají v ceně uhlíkatého substrátu, kterým nejčastěji bývá čistý mono- nebo disacharid. Jeho cena představuje více než 40 % ceny výsledného produktu [19], Proto je trendem poslední doby využít k produkci PHA co nej levnější substráty. Pozornost se tedy obrací směrem k odpadním a vedlejším produktům především potravinových a zemědělských výrob. Tyto substráty často obsahují velké množství využitelného zdroje uhlíku, přičemž z pohledu původní výroby se jedná o odpad, který je nutné likvidovat na skládkách nebo v čistírnách odpadních vod. Doposud byla publikována nebo patentována biotechnologická produkce polyhydroxyalkanoátů na celé řadě odpadních substrátů, žádná se však nezabývá produkcí polyhydroxyalkanoátů z pevného odpadu po přípravě kávy.

Reference

l. Al-Hamamre et. al. 2012. Oil hxtracted from spent coffee grounds as a renewable source forfatty acid methyl ester manufacturing. Fuel 96, 70-76.

2. Murphy and Naidu 2012. Sustainable management of coffee industry by-products and valueaddition—A review. Resources, Conservation and Recycling 66, 45-58.

3. Silva et al. 1998. The use of biomass residues in the Brazilian soluble coffee industry. Biomass and Bioenergy 14, 457-467.

4. Yen et al. 2005. Antioxidant properties of roasted coffee residues. Journal of Agricultural and Food Chemisiry 53, 2658-2663.

5. Simoeset al. 2009. Immunostimulatory properties of coffee mannans. Molecular Nutrition & Food Research, 53. 1036-1043.

6. Franca et al. 2009. Kinetics and equilibrium studies of methylene blue adsorption by spent coffee grounds. Desalina/ion, 249, 267 - 272.

7. Machado et al. 2012. Growth of fungal strains on coffee industry residues with removal of polyphenolic compounds. Biochemical Engineering Journal 60, 87 - 90.

8. Zuorro and Lavecchia 2012. Spent coffee grounds as a valuable source of phenolic compounds and bioenergy. Journal ofCleaner Production 34,49-56.

9. Mussatto et al. 2011. A study on chemical constituents and sugars extraction from spent coffee grounds. Carhohydrale Polymers 83, 368-374.

10. Mussatto et al. 2012. Sugars metabolism and ethanol production by different yeast strains from coffee industry wastes hydrolysates. Applied Energy 92, 763-768.

- 3 CZ 309148 B6

11. Eilhann et al. 2013. Sequential co-production of biodiesel and bioethanol with spent coffee grounds. Bioresource Technology 136, 475-480.

12. WO 2009/015358 - Methods, systems, and apparatus for obtaining biofuel from coffee and fuels produced therefrom.

13. EP 0398464 - Aroma recovery from the thermal hydrolysis of spent coffee grounds.

14. US 5328708 A - Roast ground coffee with defatted spent coffee grounds.

15. US 20110226602A1 - Process of Manufacturing Powdered Coffee Carbons from Spent Coffee Grounds.

16. Flickinger, Michael C; Drew, Stephen W. Encyclopedia of Bioprocess Technology Fermentation, Biocatalysis, and Bioseparation, Volumes 1-5. John Wiley & Sons, 1999.20242133 s. ISBN 1-59124-457-9.

17. Steinbuchel A, Valentin Η. E. Diversity of bacterial polyhydroxyalkanoic acids: minireview, FEMS Microbiology Letters, 1995, vol. 125. 219-228 s. ISSN 0378-1097.

18. Sudech K., Abe H., Doi Y. Synthesis, structure and properities of polyhydroxyalkanoates: biological polyesters. Progres in Polymeric Science, 2000, vol. 25. 1503-1555 s. ISSN 00796700.

19. Khanna S., Srivastava A.K. Statistical media studies for growth and PHB production by Ralshmia eutropha. Process Biochemistry, 2005, vol. 40, 2173-2182 s. ISSN 0032-9592.

20. Taniguchi I., Kagotani K., Kimura Y. Microbial production of poly(hydroxyalkanoates)s from waste edible oils. Green Chemistry, 2003, vol. 5, 545-548 p., ISSN 1463-9270.

21. Chan P.-L., Yu V., Wai L., Yu H.-F. Production of medium-chain-length polyhydroxyalkanoates by Pseudomonas aeruginosa with fatty acids and alternativě carbon sources. Applied Biochemistry and Biotechnology, 2006, vol. 129, 933-941 p. ISSN 0273-2289.

22. Bhubalan K., Lee W.-H., Loo C.-Y. Yamamoto T., Tsuge T., Doi Y., Sudesh K. Controlled biosynthesis and characterization of poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate-co-3hydroxyhexanoate) from mixtures of palm kernel oil and 3 HV-precursors. Polymer Degradation and Stability, 2008, vol. 93, 17-23 p. ISSN 0141-3910.

23. Kimura H., Takahashi T., Hiraka H., Iwana M., Takeishi M. Effective biosynthesis of poly(3hydroxybutyrate) from plant oils by Chromobacterium sp. Polymer Journal, 1999, vol. 31, 210212 p. ISSN 0032-3896.

24. Fukui T., Doi Y. Efficient production of polyhydroxyalkanoates from plant oils by Alcaligenes eutrophus and its recombinant strain. Applied Microbiology and Biotechnology, 1998, vol. 49, 333-316 p. ISSN 1432-0614.

25. Kek Y.-K., Chang C.-W., Amirul A.-A., Sudesh K. Heterologous expression of Cupriavidus sp. USMAA2-4 PHA synthase gene in PHB-4 mutant for the production of poly(3hydroxybutyrate) and its copolymers. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 2010, on-line first, DOI 10.1007/sl 1274-010-0335-5.

- 4 CZ 309148 B6

26. Alias Z., Tan I.K.P Isolation of palmoil-utilizing, polyhydroxyalkanoate (PHA)-producing bacteria by an enrichement technique. Bioresource Technology, 2005, vol. 96, 1229-1234 p. ISSN 0960-8524.

27. Marsudi S., Linno H. Hori K. Palm oil utilization for the simultaneous production of polyhydroxyalkanoates and rhamnolipids by Pseudomonas aeruginosa. Applied Microbiology and Biotechnology, 2008, vol. 78, 955-961 p. ISSN 1432-0614.

28. Akiyama M., Taima Y., Doi Y. Production of poly(3-hydroxyalkanoates) by bacterium of the genus Alcaligenes utilizing long-chain fatty acids. Applied Microbiology and Biotechnology, 1992, vol. 37, 698-701 p. ISSN 1432-0614.

29. Obruca S., Marova I., Snajdar O., Mravcova L., Svoboda Z. Productionofpoly(3hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) by Cupriavidus necator from waste rapeseed oil using propanol as a precursor of 3-hydroxyvalerate, Biotechnology Letters, 2010, vol. 32, 1925-1932 p. ISSN 0141-5492.

30. Verlinden R. A. J., Hill DJ, Kenward MA, Williams CG, Piotrowska-Seget Z., Radecka IK. Production ofpolyhydroxyalkanoates from waste frying oil by Cupriavidus necator. AMB Express. 2011, vol. 1, DOI: 10.1186/2191-0855-1-11.

31. Keenan T.M.K., Tanenbaum S.W., Stipanovic A.J., Nakas J.P. Production and characterization of poly-b-hydroxyalkanoates copolymers from Burkholderia cepacia utilizing xylose and levulinic acid. Biotechnology Progress, 2004, vol. 20, 1697-1704.

32. Zhu C, NomuraC.T., Perrotta J.A. Stipanovic A.J., Nakas J.P. Production and characterizationof poly-3-hydroxybutyrate from biodiesel-glycerol by Burholderia cepacia ATCC 17759.Biotechnology Progress, 2010, vol. 26, 424-430.

33. Pan W., Perrotta!A., Stipanovic A.J, Nomura C.T. Nakas J.P. Production of polyhydroxyalkanoates by Bitrhoderiacepacia ATCC 17759 using detoxified sugar maple hemicellulosic hydrolysate. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology, 2012, vol 39, 459-469.

34. Pan W., Nomura C.T., Nakas J.P. Estimationif inhibitory effectsofhemieellulosicwood hydrolysate inhibitors on PHA production by Burkholderia cepacia ATCC 17759 using response surface metodology. Bioresource Technology, 2012, vol. 125, 275-282.

Podstata vynálezu

Nedostatek způsobu výroby polyhydroxyalkanoátů využitelného pro výrobu v průmyslovém měřítku řeší využití pevného odpadu po přípravě kávy (spent coffee ground), tedy odpadu z přípravy instantní kávy případně prášku kávových zrn z přípravy kávy v kávovarech, jako vstupní suroviny pro biotechnologickou přípravu podle vynálezu. Výhodou technologie je možnost souběžného využití různých frakcí získaných při extrakci a zpracování odpadní kávy k biotechnologické (mikrobiální) produkci nejméně dvou různých druhů průmyslově žádaných produktů s vysokou přidanou hodnotou.

Ve způsobu podle vynálezu je k výrobě polyhydroxyalkanoátů využit hydrolyzát hemicelulóz a celulóz odpadní kávy.

Předmětem vynálezu je způsob výroby polyhydroxyalkanoátů z pevného odpadu po přípravě kávy, kdy se provede extrakce kávového odpadu organickým rozpouštědlem za vzniku kávového oleje a pevného podílu.

- 5 CZ 309148 B6

Z kávového odpadu nebo pevného podílu / extrakce kávového odpadu nebo jejich směsi se může provést enzymatická a/nebo kyselá hydrolýza hemicelulóz a celulóz roztokem minerální kyseliny, například kyseliny sírové nebo kyseliny chlorovodíkové za vzniku kávového hydrolyzátu a následně se provede biotechnologická konverze kávového hydrolyzátu za vzniku polyhydroxyalkanoátů a pevného podílu za pomocí bakterie Burkholderia cepacia nebo Bacillus megaterium. pH kultivačního média je v rozmezí 6,5 až 7,5, nejlépe pH 7,0.

Biotechnologická konverze kávového hydrolyzátu může probíhat ve vsádkovém režimu anebo v režimu přidávání kultivačních složek během kultivace („fed-batch režim), jako například substrátu.

Pevný podíl po extrakci, pevný podíl po hydrolýze, jejich směs nebo případně přímo pevný odpad po přípravě kávy, které jsou zároveň vstupní suroviny nebo vedlejší produkty jednotlivých kroků přípravy substrátu, mohou být spáleny, přičemž energie vyprodukovaná při spálení těchto materiálů může částečně pokrýt energetické náklady spojené s procesy popsané výše. Tok substrátu technologií může být regulován s ohledem na momentální poptávku po jednotlivých produktech a také s ohledem na energetické požadavky jednotlivých kroků.

Objasnění výkresů

Obr. 1: Schematické znázornění způsobu výroby polyhydroxyalkanoátů.

Obr. 2: Průběh vsádkové kultivace B. cepacia s využitím hydrolyzátu jako substrátu.

Vynález je dále vysvětlen pomocí příkladů provedení, které však žádným způsobem neomezují jiná možná provedení v rozsahu patentových nároků.

Příklady uskutečnění vynálezu

Příklad 1

Hydrolýza kávového odpadu nebo pevného podílu po extrakci kávového oleje

Před krokem samotné hydrolýzy je možné zařadit krok extrakce polyfenolů, které mohou představovat mikrobiální inhibitory. Extrakce polyfenolů probíhá louhováním odpadní kávy, resp. pevného podílu po extrakci kávového oleje v roztoku etanolu (0 až 75 % v/v) nebo ethyl laktátu, louhování probíhá při teplotě 20 až 50 °C po dobu 1 až 5 hodin. Následně se pevný podíl oddělí (dekantací nebo centrifugací). vysuší a podrobí hydrolýze.

Tab. 3: Porovnání vybraných rozpouštědel vzhledem k účinnosti extrakce polyfenolů z odpadní kávy. Účinnost extrakce byla stanovena porovnáním koncentrace polyfenolů v hydrolyzátech odpadní kávy louhovaných vybranými rozpouštěly s kontrolním vzorkem, který nebyl před hydrolýzou nijak ošetřován.

Použité rozpouštědlo Účinnost extrakce polyfenolů %

Etyl acetát Etyl laktát Etanol 50% Etanol 75%

0,8

18,6

41,1

22,3

- 6 CZ 309148 B6

Odpadní káva obsahuje relativně vysoký obsah hemicelulóz (cca 40 %) s majoritním obsahem galaktózy a manózy, kromě hemicelulóz je odpadní káva bohatá také na celulózu (cca 9 %) a proteiny (cca 14,0 %) [2],

Hydrolýza hemicelulóz odpadní kávy se provedla zředěným roztokem minerální kyseliny. Ta spočívá v aplikaci roztoku minerální kyseliny (H2SO4, HC1) o koncentraci 0,5 až 2 % v/v. Navážka odpadní kávy, respektive pevného podílu po extrakci kávového oleje se pak vzhledem k zředěnému roztoku minerální kyseliny pohybuje v rozmezí 0,5 až 2,5 % (w/v). Samotná hydrolýza probíhá za teploty 100 až 130 °C po dobu 30 až 90 minut. Suspenze může být dále 10 podrobena enzymatické hydrolýze (viz, dále), případně je přímo možné oddělit pevný podíl (filtrace, dekantace, případně centrifugace) a kapalný podíl využít jako základ fermentačního média.

Enzymatické hydrolýze celulóz může být podrobena suspenze odpadní kávy, pevného podílu po 15 extrakci kávového oleje, případně (nejlépe) suspenze po kyselé hydrolýze hemicelulóz. pH suspenze se upraví na hodnotu odpovídající optimální teplotě použitého celulytického enzymu (obvykle v rozmezí 3,5 až 5), následně se aplikuje komerčně dostupný celulytický enzym (např. Celluclast®) v množství odpovídajícím 0,2 až 1 % nejčastěji pak 0,4 % obj. suspenze. Směs se inkubuje po dobu 12 až 24 h za teploty optimální pro aktivitu daného enzymu (nejčastěji v 20 rozmezí 40 až 60 °C).

V dalším kroku se pak může provést hydrolýza proteinů přítomných v suspenzi pomocí proteolytických enzymů, kde produktem hydrolýzy jsou volné aminokyseliny, případně oligopeptidy, které mohou při fermentaci představovat snadno dostupný zdroj dusíku a uhlíku pro 25 mikrobiální buňky. Nejprve se pH suspenze upraví na hodnotu optimální pro aktivitu použitého proteolytického enzymu např. při použití enzymu Alcalase® se pH upraví na hodnotu 7 až 8. Hydrolýza proteinů probíhá za teploty optimální pro aktivitu použitého proteolytického enzymu (obvykle v rozmezí 40 až 60 °C) po dobu 12 až 24 h.

Po enzymatické hydrolýze se pevný podíl odstraní dekantací, filtrací, případně centrifugací a kapalný podíl (dále jen hydrolyzát) se použije jako základ fermentačního média pro následující biotechnologické výroby.

Jednotlivé hydrolytické kroky (kyselá, resp. enzymatická hydrolýza) je možné kombinovat podle 35 potřeby technologie a podle aktuálních ekonomických aspektů (cena enzymu, cena produktu).

Složení typického hydrolyzátu odpadní kávy připraveného hydrolýzou pevného podílu po extrakci kávového oleje (15 % w/v) nejprve kyselou hydrolýzou a následně enzymatickou hydrolýzou je uvedeno v tabulce 4.

Tab. 4: Složení typického hydrolyzátu odpadní kávy

Parametr	Koncentrace/hodnota
Sušina (g/1)	106,5 ±0,1
Popel (g/1)	27,6 ± 0,8
45 Vodivost (g/1)	23,2
PO43- (g/1)	0,32 ± 0,03
Proteiny(g/1)	10,63 ± 0,6
Polyfenoly (mg/1)	0,69 ±0,1
Celkové cukry (g/1)	67,3 ± 2,2
50 Galaktóza (g/1)	19,5 ±0,3
Manóza (g/1)	28,1 ±0,6
Arabinóza (g/1)	3,1 ±0,2
Glukóza (g/1)	8,7 ± 0,2
Celubióza (g/1)	4,8 ± 0,8
55 Rhamnóza (g/1)	3,6 ±0,1

- 7 CZ 309148 B6

Příklad 2

Využití kávového hydrolyzátu kprodukci polyhydroxyalkanoátů (PHA)

Hydrolyzát je možno využít jako kultivační médium pro výrobu s využitím bakteriálních kmenů Bacillus megaterium nebo Burkholderia cepacia.

Oba kmeny jsou známé díky své schopnosti utilizovat široké spektrum nejen cukematých substrátů za současné akumulace polyhydroxyalkanoátů. Především kmen Burkholderia cepacia je tedy uvažován jako produkční kmen pro průmyslovou výrobu polyhydroxyalkanoátů. V odborné nebo patentové literatuře je popsáno jeho využití k produkci bioplastů s využitím následujících substrátů: sacharózy (WO 1992018553A1), xylózy a levulinové kyseliny (US 20060105439A1) [33], glycerolu (US 20120135480A1) [34] a palmového oleje [28], Uvažována byla i produkce polyhydroxyalkanoátů s využitím hydrolyzátu hemicelulóz javorového dřeva [35] a byla identifikována nízká citlivost bakterie B. cepacia vůči inhibitorům přítomných v hemicelulózových hydrolyzátech [36],

Bakterie B. cepacia je přímo z hydrolyzátu schopna produkovat kopolymer obsahující 3hydroxybutyrát i 3-hydroxyvalerát, výsledný kopolymer vykazuje lepší mechanické vlastnosti než homopolymer PHB. Zároveň přídavek prekurzorů 3HV jako je například kyselina propionová, kyselina valerová. propanol nebo kyselina levulinová vede u bakterie B. cepacia k inkorporaci významných množství 3HV (až 50 % 3HV v PHA) do struktury polymeru, zatímco bakterie B. megaterium není podle experimentálních výsledků schopna inkorporovat tyto prekurzory do PHA ve formě 3HV.

Tab. 5: Růst bakteriálních kmenů Bacillus megaterium a Burkholderia cepacia a produkce polyhydroxyalkanoátů na hydrolyzátu kávy. Kultivace probíhaly v Erlenmeyerových baňkách po dobu 72 h.

	Monomerní složení
	Bi omasa ÍÚU	PHA[%]	PHA[g/l]	PHA 3HB % 3	IV %
Bacillus rnegaiÉrium	3.2 ±0.2	48.7 ± 3J	1,6 x 0.1	100	0
Burkhalderia cepacia	4,8 ± 0,3	61,9 ± 0.2	3,0 ± 0,2	96	4

Ke kultivaci bakterie Burkholedira cepacia byla použita následující kultivační média:

Médium pro úchovu a inokulum I

Hovězí extrakt Pepton NaCl Destilovaná voda

10 g 10 g 5 g 1000 ml

Produkční médium Hydrolyzát (NH4)2SO4 Na2HPO4. 7 H2O

1000 ml (ředí se vodou na koncentraci 25 až 75 %) 0,5 až 2 g 6,8 g

- 8 CZ 309148 B6

KH2PO4	1,5 g
CaCl2.2 H2O	0,1 g
NH4-Fe(III) citrát	0,06 g
MgSO4 7 H2O	0,2 g
Roztok stopových prvků*	1 ml
* Roztok stopových prvků ZnSO4. 7 H2O	0,1 g/L
MnCl2. 4 H2O	0,03 g/L
H3BO3	0,3 g/L
COCI2. 6 H2O	0,2 g/L
CuSO4.5 H2O	0,02 g/L
NÍCI2.6 H2O	0,02 g/L
Na2MoO4.2 H2O	0,03 g/L

Při kultivaci v bioreaktoru se obvykle pracuje ve dvou inokulačních krocích, přičemž první inokulum je obvykle kultivováno na komplexní médium a očkováno z pevného média, druhé inokulum představuje minerální médium s glukózou a hydrolyzátem (obsah v médiu v rozmezí 5 až 20 %). Inokulační poměr se pohybuje v rozmezí 5 až 15 %, nejčastěji pak 10 % z objemu média. Samotná kultivace s využitím v hydrolyzátu jako zdroje uhlíku probíhá v bioreaktoru za teploty v rozmezí 28 až 32 °C, přičemž optimální růstová i produkční teplota pro oba bakteriální kmeny je 30 °C. Vzdušení, respektive míchání vsádky je regulováno tak, aby se hodnota DO pohybovala v rozmezí 5 až 50 %. pH je regulováno aplikací 30% NaOH a 2M H2SO4 v rozmezí 6,5 až 7,5, přičemž optimální pH je 7,0.

Kultivaci v bioreaktoru je možno vést ve vsádkovém nebo fed-batch módu, přičemž se jako příkrm při fed-batch kultivaci používá koncentrovaný roztok hydrolyzátu a dávka příkrmu je aplikována, když se pH vsádky začne posouvat do alkalických hodnot. V průběhu kultivace B. cepacia je možno aplikovat prekurzory 3HV (propionovou kyselinu, propanol a levulinovou kyselinu), přičemž optimální je přídavek prekurzoru směřovat do druhé poloviny (ideálně do stacionární fáze) kultivace, koncentrace prekurzoru se pohybuje v rozmezí 1 až 5 g/1.

Koncentrace buněk se pak pohybuje v rozmezí 13 až 54 g/1 s intracelulámím obsahem PHA v rozmezí 35 až 62 % PHA v závislosti na použitém bakteriálním kmeni a módu kultivace. Typický průběh fermentačního procesu (vsádková kultivace, B. cepacia) výroby PHA z hydrolyzátu představuje obrázek 2.

Po ukončení kultivace se buňky odseparují od fermentačního média pomocí centrifůgace nebo filtrace a polyhydroxyalkanoáty se z buněčné hmoty vyizolují některým ze standardních postupů (extrakce organickými rozpouštědly, digesce buněčné hmoty pomocí NaOH, enzymů, detergentů atd.).

Průmyslová využitelnost

Způsob podle vynálezu umožňuje výrobu polyhydroxyalkanoátů v průmyslovém měřítku s využitím snadno dostupného pevného odpadu po přípravě kávy (spent coffee ground). Kromě výhodného využití pevného odpadu po přípravě kávy je výhodou technologie také možnost souběžného využití různé frakce získané při extrakci a zpracování odpadní kávy k biotechnologické (mikrobiální) produkci průmyslově žádaných produktů s vysokou přidanou hodnotou. Tok substrátu technologií může být regulován s ohledem na momentální poptávku po jednotlivých produktech a také s ohledem na energetické požadavky jednotlivých kroků. Spáleni pevných podílů v průběhu procesu částečně kryje energetické nároky jednotlivých kroků technologie.

Claims (4)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Způsob výroby homopolymerů poly(3-hydroxybutyrátů) a/nebo kopolymerů poly(3hydroxybutyrát-co-3-hydroxyvalerátů) z kávového hydrolyzátu získaného enzymatickou a/nebo kyselou hydrolýzou hemicelulóz a celulóz z pevného odpadu po přípravě kávy, vyznačující se tím, že se provede biotechnologická konverze kávového hydrolyzátu za pomocí bakterie Burkholderia cepacia nebo Bacillus megaterium za vzniku polyhydroxyalkanoátů a pevného podílu, přičemž pil kultivačního média je v rozmezí 6,5 až 7,5.
2. 2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že pH kultivačního média při biotechnologické konverzi kávového hydrolyzátu na polyhydroxyalkanoáty je 7,0.
3. 3. Způsob výroby podle nároků 1 a 2, vyznačující se tím, že biotechnologická konverze kávového hydrolyzátu probíhá ve vsádkovém režimu a/nebo v režimu přidávání kultivačních složek během kultivace.
4. 4. Způsob výroby podle nároku 3, vyznačující se tím, že při biotechnologické konverzi kávového hydrolyzátu v režimu přidávání kultivačních složek během kultivace se přidává koncentrát kávového hydrolyzátu nebo prekurzory 3-hydroxyvalerátu, propionová kyselina nebo její sůl. propanol nebo levulinová kyselina.