CZ20131002A3

CZ20131002A3 - Způsob výroby polyhydroxyalkanoátů, karotenoidů nebo o karotenoidy obohacené biomasy z pevného odpadu po přípravě kávy

Info

Publication number: CZ20131002A3
Application number: CZ2013-1002A
Authority: CZ
Inventors: Stanislav ObruÄŤa; Petrik Siniša; Ivana Márová; Pavla Benešová
Original assignee: Vysoké Učení Technické V Brně
Priority date: 2013-12-13
Filing date: 2013-12-13
Publication date: 2015-06-24
Also published as: CZ309148B6

Abstract

Komplexní zpracování různě extrahovaných frakcí pevného odpadu po přípravě kávy k biotechnologické výrobě polyhydroxyalkanoátů a/nebo karotenoidů případně o karotenoidy obohacené krmné biomasy s využitím hydrolyzovaného pevného odpadu po přípravě kávy, případně oleje extrahovaného z pevného odpadu jako substrátu. Zbytkový podíl po extrakci je spálen a použit pro produkci energie využitelné ke krytí potřeb biotechnologických kroků.

Description

Oblast techniky

Vynález se týká využití pevného odpadu po přípravě kávy pro výrobu polyhydroxyalkanoátů a/nebo karotenoidů, kdy je z pevného odpadu extrahován kávový olej, který je následně využit jako substrát pro biotechnologickou výrobu polyhydroxyalkanoátů nebo se hydrolyzát pevného odpadu použije jako substrát pro biotechnologickou výrobu karotenoidů a/nebo polyhydroxyalkanoátů.

Dosavadní stav techniky

Káva, tedy horký nápoj připravovaný z různých plodů kávovníku (nejčastěji se jedná o odrůdy Coffea robusta a Coffea arabica), představuje, díky své senzorické kvalitě a stimulujícím vlastnostem, celosvětově jeden z nejrozšířenějších nápojů. V roce 2010 bylo celosvětově vyprodukováno a následně zpracováno přibližně 8,017,860 tun kávových zrn. Díky tomu je káva druhou nejobchodovanější komoditou světa (prvenství patří ropě) a mezi zemědělskými produkty ji tedy patří první místo [1].

Zpracování kávy proto generuje významné množství odpadu, které obvykle nenachází další uplatnění. Odpadním produktem zpracování kávy je, mimo jiné, také prášek kávových zrn vznikající po přípravě kávy (anglicky spent coffe ground, SCG), který je pro účely této patentové přihlášky dále označován jako pevný odpad po přípravě kávy. Tento odpadní materiál je ve velkých objemech produkován především při přípravě instantní kávy přímo ve zpracujících podnicích. Přibližně 50% světové produkce kávy je využito na přípravu rozpustné kávy. Obecně platí, že zpracování jedné tuny zelených kávových zrn vede k produkci přibližně 650 kg pevného odpadu, přičemž při výrobě 1 kg rozpustné (instantní kávy) vzniknou přibližně 2 kg SCG [2].

• ···· · ·· · ···· • · · ···· · · ·

V odborné i patentové literatuře je možné najít několik technologií zpracování odpadní kávy. Díky své vysoké spalné teplotě (cca 5000 kcal/kg) bylo uvažováno spalování odpadní kávy za účelem produkce energie, případně využití odpadní kávy jako hnojivá [3]. Yen et al. se zabývali využitím odpadní kávy jako zdroje antioxidantů [4], Simoes et al. testovali využití odpadní kávy jako zdroje polysacharidů stimulujících imunitní systém [5], Bylo také uvažováno využití odpadní kávy jako absorpčního činidla pro odstranění kladně nabitých barviv při čištění odpadních vod [6], případně jako zdroje polyfenolů [7, 8]. Odpadní káva byla také identifikována jako surovina pro výrobu biopaliv - ať už ethanolu [9, 10, 11] nebo bionafty (ta se připravuje transesterifíkací oleje odpadní kávy) [1, 11, 12], Navrženo bylo také několik technologií využití odpadní kávy při zpracování kávy [13, 14, 15], nicméně žádná z výše zmíněných technologií se doposud neimplementovala ve větším měřítku a kávovinový odpad není velkoobjemově žádným způsobem využíván.

Polyhydroxyalkanoáty (PHA) jsou polyestery přírodního původu, které byly objeveny již v roce 1926 francouzským mikrobiologem Lemoignem. Ten izoloval a charakterizoval poly(3-hydroxybutyrát) (PHB) z bakterie Bacillus megaterium. Od té doby byla schopnost produkce a akumulace PHA objevena u celé řady mikroorganismů a to jak u gram-pozitivních tak i gram-negativních kmenů (autotrofních, heterotrofních, fototrofních; aerobních i anerobních), ale také u některých kmenů archaebakterií. Bakterie syntetizují PHA jako zásobní zdroj uhlíku, energie a redukční síly, a to nej častěji při nadbytku uhlíkatého zdroje a současné limitaci jiným důležitým prvkem (dusíkem, fosforem, železem atd.). Po vyčerpání uhlíkatého substrátu dokáží buňky PHA rozložit a využít je jako zdroj uhlíku a energie ke svým metabolickým pochodům [16].

PHA jsou polyestery hydroxykyselin. V závislosti na délce řetězce hydoxykyseliny se PHA dělí do dvou skupin. Polyestery složené z hydroxykyselin o délce 3-5 atomů uhlíku se označují jako short-chain-lenght (scl-PHA), zatímco PHA obsahující monomery o délce 6-14 atomů uhlíku spadají do skupiny medium-chain-lenght (mcl-PHA). V současné době je známo více než 90 hydroxykyselin, které slouží jako PHA monomery. Patří mezi ně řada sloučenin obsahujících rozličné funkční skupiny - halogenový atom, hydroxyl-, epoxy-, karboxyl-, kyano- funkční skupiny, ale také esterifikované karboxyly. Navíc mastné hydroxykyseliny mcl-PHA často obsahují násobné vazby nebo rozvětvené, případně aromatické struktury. Hydroxylová skupina PHA monomerů se nejčastěji nachází v poloze 3, ale jsou známy i monomery s hydroxylovou skupinou v poloze 2 až 6. Monomery PHA mikrobiálního původu jsou vždy v R-konfiguraci, což je způsobeno stereospecifitou příslušných biosyntetických enzymů [17], • · · ·

Možnost produkce polyhydroxyalkanoátů s využitím odpadních substrátů je řešena v rámci řady patentů a publikací. Jeden z nej obecnějších postupů zpracování zřejmě většiny typů odpadů je popsán v patentu US 2009/0317879 AI, kde však jsou blíže nespecifikované odpady zpracovány methanotrofními bakteriemi na těkavé karboxylové kyseliny (propionová, octová) a na methan, a tyto organické látky jsou posléze využity jako substrát pro produkční kmen. V dalším patentu - US 2010/0190221 AI jsou pro produkci polyhydroxyalkanoátů použity potenciálně toxické substráty. Pomocí enzymu methan-monooxygenázy jsou organické sloučeniny převáděny na utilizovatelné substráty.

Rovněž vlastní produkce PHA na odpadních olejích nejrůznějšího druhu je součástí řady různých patentů. Autoři využívali např. skládkový odpad obsahující olej (CN101255227 (A) — 2008-09-03), dále jedlý odpadní olej k produkci PHA pomocí vodíkových bakterií (JP2004254668 (A) — 2004-09-16), různé typy rostlinných olejů - jmenovitě slunečnicový, řepkový, konopný a další bez bližšího upřesnění (WO 2009/156950 A2). Potenciálním substrátem pro produkci polyhydroxyalkanoátů je olej z Brassicacarinata konvertovaný na polyhydroxyalkanoáty pomocí bakterií rodu Pseudomonas (WO 2010/0441180A1). Problematika využití olejů k biotechnologické produkci polyhydroxyalkanoátů je rovněž obsahem mnoha publikací [22-32]. V žádném z dostupných zdrojů se však nevyskytuje možnost využití oleje získaného pomocí extrakce z odpadní kávy.

Hydrolýzou hemicelulóz na fermentovatelné produkty se zabývalo několik publikací i patentů. V rámci patentu EP0964061 A3 byla navržena hydrolýza blíže nespecifikovaného materiálu obsahujícího hemicelulózy a celulózy použitím koncentrované kyseliny. Patent CA 2418441 C pak uvažuje hydrolýzu blíže nespecifikovaného materiálu obsahujícího hemicelulózy a celulózy za současné aplikace zředěného roztoku minerální kyseliny (např. H₂SO₄, HC1, HNO₃) a soli (např. Fe₂(SO₄)₃, FeSO₄, MgSO₄).

Mechanické vlastnosti PHA významně závisí na zastoupení jednotlivých monomerů. Homopolymer PHB vykazuje poměrně vysokou krystaličnost (asi 50-80 %), což ho činí tuhým a křehkým. Teplota skelného přechodu je 5-9 °C, teplota tání 173-180 °C. PHB se rozkládá při 200 °C, což je nebezpečně blízko bodu tání. Tato skutečnost je z hlediska průmyslového zpracování materiálu nepříjemná, neboť při tavení materiálu může docházet k jeho nežádoucímu rozkladu. Pokud je však do struktury polymeru zabudován 3-hydroxyvalerát nebo jiný monomer, mechanické vlastnosti se výrazně zlepší. Bod tání kopolymeru klesá na přibližně 130 °C, mírně klesne i teplota rozkladu. Díky tomu může být kopolymer taven, aniž by došlo k jeho rozkladu [18], • · · · • · · ·

V roce 1976 britská společnost Imperiál Chemical Industrie (ICI) rozpoznala potenciál PHB nahradit syntetické polymery připravované většinou z ropy. Přestože bakteriální produkce PHB byla drahá, předpokládalo se, že prudký růst cen ropy umožní rentabilní bakteriální výrobu PHB. Protože k očekávanému růstu cen ropy nedošlo, nachází PHB uplatnění především jako biodegradabilní a biokompatibilní materiál. Kvůli vysoké ceně však PHB a P(HB-co-HV) (kopolymer 3-hydroxybutyrátu a 3-hydroxyvalerátu), které se objevují pod obchodní značkou Biopol, nacházejí spíše sporadické uplatnění na trhu. V roce 1990 německá firma Wella použila obaly z Biopolu pro nový šampón. V roce 1996 odkoupila americká firma Monsanto Biopol od firmy ZENECA BioProducts, dceřiné společnosti ICI. I v současné době jsou prezentovány patenty k produkci PHA pomocí transgenních rostlin, což by mělo snížit náklady na výrobu (př. US 2003/0017576 Al, US 2004/0101865 Al).

Klasická výroba PHA spočívá ve fermentačním postupu s monokulturou vybraného bakteriálního kmene. Přestože existuje řada bakteriálních kmenů schopná produkce PHA, k průmyslovému využití je možno aplikovat jen několik málo z nich. Použitelnost bakteriálního kmene ovlivňuje řada faktorů. Především je to stabilita vlastností a bezpečnost, růstové a akumulační schopnosti, dosažitelné množství biomasy a množství akumulovaného PHA. Důležité jsou také míra extrahovatelnosti PHA, molekulová hmotnost PHA, množství použitelných substrátů a finanční náročnost jednotlivých komponent média [16]. Právě finanční aspekt celé výroby je z hlediska masové produkce PHA klíčový. Hlavní nevýhoda polyhydroxyalkanoátů oproti syntetickým plastům vyráběným z fosilních surovin spočívá ve vysoké ceně biopolyesterů. Bakteriálně produkované PHA jsou asi 5-1 Okřát dražší než syntetické plasty polypropylen nebo polyetylén s podobnými mechanickými vlastnostmi. Hlavní náklady syntézy PHA spočívají v ceně uhlíkatého substrátu, kterým nej častěji bývá čistý mono- nebo disacharid. Jeho cena představuje více než 40 % ceny výsledného produktu [19]. Proto je trendem poslední doby využít k produkci PHA co nej levnější substráty. Pozornost se tedy obrací směrem k odpadním a vedlejším produktům především potravinových a zemědělských výrob. Tyto substráty často obsahují velké množství využitelného zdroje uhlíku, přičemž z pohledu původní výroby se jedná o odpad, který je nutné likvidovat na skládkách nebo v čistírnách odpadních vod. Doposud byla publikována nebo patentována biotechnologická produkce polyhydroxyalkanoátů na celé řadě odpadních substrátů, žádná se však nezabývá produkcí polyhydroxyalkanoátů z pevného odpadu po přípravě kávy. Karotenoidy představují jednu z nejrozšířenějších a nej početnějších tříd přirozených pigmentů s významnými biologickými účinky a řadou průmyslových aplikací. Jsou produkovány fotosyntetizujícími organismy počínaje anaerobními fotosyntetickými • · · · • · · · * ·· t ·· · I ·ί bakteriemi, cyanobakteriemi, houbami až po vyšší organismy, ale i nefotosyntetizujícími bakteriemi, kvasinkami a plísněmi [20]. U fotosyntetizujících organismů slouží jako ochrana před fotooxidativním účinkem singletového kyslíku a radikálů vznikajících za světla v přítomnosti endogenních fotosenzitivních látek. V savčím organismu vykazují řadu fyziologicky pozitivních aktivit založených hlavně na antioxidačním, antimutagenním a fotoprotektivním účinku, ovlivňují imunitní systém a účastní se v procesu vidění [20, 21].

Četné kvasinkové organismy se vyznačují produkcí karotenoidů - pigmentů nerozpustných ve vodě, a proto nikdy nedifundují do živného prostředí. Jsou lokalizovány na vnitřní straně cytoplazmatické membrány a vznikají složitým biosyntetickým mechanismem. Většina kvasinkových organismů potřebuje na tvorbu karotenoidů světlo, jehož účinným akceptorem bývá flavin nebo flavoprotein schopný fotooxidace. Oxidačním produktem této reakce je enzym účastnící se procesu karotenogeneze [21]. Karotenogenní kvasinky jsou schopny utilizovat celou řadu odpadních, zejména sacharidických substrátů obsahujících, hexózy, pentózy, cukerné alkoholy a podobné složky.

Podobně jako tomu bylo u polyhydroxyalkanoátů, i u karotenoidů je obecnou strategií redukce ceny finálního produktů využití levných/odpadních surovin. Doposud byla publikována biotechnologická produkce karotenoidů s využitím širokého spektra odpadních substrátů, nicméně žádná z dosavadních prací se nezabývala využitím karotenogenních kvasinek k výrobě karotenoidů a nebo o karotenoidy obohacené biomasy s využitím odpadní kávy jako substrátu.

Reference

1. Al-Hamamre et. al. 2012. Oil Extracted from spent coffee grounds as a renewable source forfatty acid methyl ester manufacturing. Fuel 96, 70-76.

2. Murphy and Naidu 2012. Sustainable management of coffee industry by-products and valueaddition—A review. Resources, Conservation and Recycling 66, 45-58.

3. Silva et al. 1998. The use of biomass residues in the Brazilian soluble coffee industry. Biomass and Bioenergy 14, 457-467.

• · · · • ·

4. Yen et al. 2005. Antioxidant properties of roasted coffee residues. Joumal of Agricultural and Food Chemistry 53, 2658-2663.

5. Simoeset al. 2009. Immunostimulatory properties of coffee mannans. Molecular Nutrition & Food Research, 53, 1036-1043.

6. Franca et al. 2009. Kinetics and equilibrium studies of methylene blue adsorption by spent coffee grounds. Desalination, 249, 267- 272.

7. Machado et al. 2012. Growth of fiingal strains on coffee industry residues with removal of polyphenolic compounds. Biochemical Engineering Journal 60, 87- 90.

8. Zuorro and Lavecchia 2012.Spent coffee grounds as a valuable source of phenolic compounds and bioenergy. Journal of Cleaner Production 34, 49-56.

9. Mussatto et al. 2011. A study on chemical constituents and sugars extraction from spent coffee grounds. Carbohydrate Polymers 83, 368-374.

10. Mussatto et al. 2012. Sugars metabolism and ethanol production by different yeast strains from coffee industry wastes hydrolysates. Applied Energy 92, 763-768.

11. Eilhann et al. 2013. Sequential co-production of biodiesel and bioethanol with spent coffee grounds. Bioresource Technology136, 475-480.

12. W02009/015358 - Methods, systems, and apparatus for obtaining biofuel from coffee and fitels produced therefrom.

13. EP0398464- Aroma recovery from the thermal hydrolysis of spent coffee grounds.

14. US5328708 A - Roast ground coffee with defatted spent coffee grounds.

15. US20110226602 Al - Process of Manufacturing Powdered Coffee Carbons from

Spent Coffee Grounds

16. Flickinger, Michael C.; Drew, Stephen W. Encyclopedia of Bioprocess Technology-

Fermentation, Biocatalysis, and Bioseparation, Volumes 1-5. John Wiley & Sons,

1999.2024-2133 s. ISBN 1-59124-457-9

• · · · · ·· ···· • ·· · · ··· • · * ·· • · · · · ·· • · · · I· u • · ······· r··· ·

17. Steinbuchel A, Valentin Η. E. Diversity ofbacterial polyhydroxyalkanoic acids:

minireview, FEMS Microbiology Letters, 1995, vol. 125. 219-228 s. ISSN 0378-1097.

18. Sudech K., Abe H., Doi Y. Synthesis, structure and properities of polyhydroxyalkanoates: biological polyesters, Progres in Polymeric Science, 2000, vol. 25. 1503-1555 s. ISSN 0079-6700

19. Khanna S., Srivastava A.K. Statistical media studies for growth and PHB production by Ralstonia eutropha. Process Biochemistry, 2005, vol. 40,2173-2182 s., ISSN 0032-9592

20. Slovák B., Márová I., Drdák M.: Vliv vybraných metabolických aktivátorů na produkci karotenoidů kvasinkou Rhodotorula glutinis, Chem. Listy 94 (9), str.692698, 2000.

21. Briltton G., Liaaen-Jensen S., Pfannder H.: Carotenoids, Volume 3: Biosynthesis and Metabolism, Basel, Boston, Berlin, 1998.

22. Taniguchi I., Kagotani K., Kimura Y. Microbial production of poly(hydroxyalkanoates)s fřom waste edible oils. Green Chemistry, 2003, vol. 5, 545548 p., ISSN 1463-9270.

23. ChanP.-L., Yu V., Wai L., Yu H.-F. Production of medium-chain-length polyhydroxyalkanoates by Pseudomonas aeruginosa with fatty acids and alternativě carbon sources. Applied Biochemistry and Biotechnology, 2006, vol. 129, 933-941 p. ISSN 0273-2289.

24. Bhubalan K., Lee W.-H., Loo C.-Y., Yamamoto T., Tsuge T., Doi Y., Sudesh K. Controlled biosynthesis and characterization of poly(3-hydroxybutyrate-co-3hydroxyvalerate-co-3-hydroxyhexanoate) fřom mixtures of palm kemel oil and 3HVprecursors. Polymer Degradation and Stability, 2008, vol. 93, 17-23 p. ISSN 0141 3910.

25. Kimura H., Takahashi T., Hiraka H., Iwana M., Takeishi M. Effective biosynthesis of poly(3-hydroxybutyrate) fřom planí oils by Chromobacterium sp. Polymer Joumal, 1999, vol. 31, 210-212 p. ISSN 0032-3896.

• · · ·

26. Fukui T., Doi Y. Effícient production of polyhydroxyalkanoates from plant oils by Alcaligenes eutrophus and its recombinant strain. Applied Microbiology and Biotechnology, 1998, vol. 49, 333-336 p. ISSN 1432-0614.

27. Kek Y.-K., Chang C.-W., Amirul A.-A., Sudesh K. Heterologous expression of Cupriavidus sp. USMAA2-4 PHA synthase gene in PHB-4 mutant for the production of poly(3-hydroxybutyrate) and its copolymers. World Joumal of Microbiology and Biotechnology, 2010, on-line first, DOI 10.1007/sl 1274-010-0335-5.

28. Alias Z., Tan I.K.P Isolation of palmoil- utilizing, polyhydroxyalkanoate (PHA)producing bacteria by an enrichement technique. Bioresource Technology, 2005, vol. 96, 1229-1234 p. ISSN 0960-8524.

29. Marsudi S., Unno H., Hoři K. Palm oil utilization for the simultaneous production of polyhydroxyalkanoates and rhamnolipids by Pseudomonas aeruginosa. Applied Microbiology and Biotechnology, 2008, vol. 78, 955-961 p. ISSN 1432-0614.

30. Akiyama M., Taima Y., Doi Y. Production of poly(3-hydroxyalkanoates) by bacterium of the genus Alcaligenes utilizing long-chain fatty acids. Applied Microbiology and Biotechnology, 1992, vol. 37, 698-701 p. ISSN 1432-0614.

31. Obruca S., Marova I., Snajdar O., Mravcova L., Svoboda Z. Productionofpoly(3hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) by Cupriavidus necator from waste rapeseed oil using propanol as a precursor of 3-hydroxyvalerate, Biotechnology Letters, 2010, vol. 32,1925-1932 p. ISSN 0141-5492

32. Verlinden R. A. J., Hill DJ, Kenward MA, Williams CG, Piotrowska-Seget Z., Radecka IK. Production ofpolyhydroxyalkanoates from waste frying oil by Cupriavidus necator. AMB Express, 2011, vol. 1, DOI: 10.1186/2191-0855-1-11

33. Keenan T.M.K., Tanenbaum S.W., Stipanovic A.J., Nakas J.P. Production and characterization of poly-b-hydroxyalkanoates copolymers from Burkholderia cepacia utilizing xylose and levulinic acid. Biotechnology Progress, 2004, vol. 20,1697 1704.

34. Zhu C., NomuraC.T., Perrotta J.A., Stipanovic A.J., Nakas J.P. Production and characterizationof poly-3-hydroxybutyrate from biodiesel-glycerol by Burholderia cepacia ATCC 17759.Biotechnology Progress, 2010, vol. 26, 424 - 430.

• · • · · · · ·: · ι ·ϊ

I · · ·

35. Pan W., PerrottaJ.A., Stipanovic A.J, Nomura C.T., Nakas J.P. Production of polyhydroxyalkanoates by Burhoderiacepacia ATCC 17759 using detoxified sugar maple hemicellulosic hydrolysate. Joumal of Industrial Microbiology and Biotechnology, 2012, vol 39, 459-469.

36. Pan W., NomuraC.T., Nakas J.P. Estimationif inhibitory effectsofhemicellulosicwood hydrolysáte inhibitors on PHA production by Burkholderia cepacia ATCC 17759 using response surface metodology. Bioresource Technology, 2012, vol. 125, 275 282.

Podstata vynálezu

Nedostatek způsobu výroby polyhydroxyalkanoátů a karotenoidů využitelného pro výrobu v průmyslovém měřítku řeší využití pevného odpadu po přípravě kávy (spent coffee ground), tedy odpadu z přípravy instantní kávy případně prášku kávových zrn z přípravy kávy v kávovarech, jako vstupní suroviny pro biotechnologickou přípravu podle vynálezu. Výhodou technologie je možnost souběžného využití různých frakcí získaných při extrakci a zpracování odpadní kávy k biotechnologické (mikrobiální) produkci nejméně dvou různých druhů průmyslově žádaných produktů s vysokou přidanou hodnotou.

Ve způsobu podle vynálezu je k výrobě polyhydroxyalkanoátů využit jak olejový podíl kávy, tak hydrolyzát hemicelulóz a celulóz odpadní kávy, který je také využitelný pro výrobu karotenoidů.

Předmětem vynálezu je způsob výroby polyhydroxyalkanoátů a/nebo karotenoidů a/nebo o karotenoidy obohacené biomasy z pevného odpadu po přípravě kávy, kdy se provede extrakce kávového odpadu organickým rozpouštědlem za vzniku kávového oleje a pevného podílu. Vhodným organickým rozpouštědlem při extrakci kávového oleje je chloroform nebo hexan. Následně se provede biotechnologická konverze kávového oleje na polyhydroxyalkanoáty za pomocí bakterie Cupriavidus necator, přičemž pH kultivačního média jev rozmezí 6,7 až 7,3, nejlépe pH 7,0. Z kávového odpadu nebo pevného podílu z extrakce kávového odpadu nebo jejich směsi se může provést enzymatická a/nebo kyselá hydrolýza hemicelulóz a celulóz roztokem minerální kyseliny, například kyseliny sírové nebo kyseliny chlorovodíkové za vzniku kávového hydrolyzátu a následně se provede biotechnologická • ···· · ··* .· ’ί · ιί .· i . »* : .· ·:.:

··· ·· ··· ···· ··· ·· konverze kávového hydrolyzátu za vzniku polyhydroxyalkanoátů a pevného podílu za pomocí bakterie Burkholderia cepacia nebo Bacillus megaterium. pH kultivačního média je v rozmezí 6,5 až 7,5, nejlépe pH 7,0. Je možné provést také biotechnologickou konverzi kávového hydrolyzátu za vzniku karotenoidů nebo o karotenoidy obohacené krmné biomasy s využitím karotenogenních kvasinek Sporobolomyces roseus, Rhodotorula mucilaginosa, Rhodotorula glutinis a Cystofilobasidium. capitatum a pevného podílu, přičemž pH kultivačního média je v rozmezí 5,2 až 5,7; nejlépe pH 5,5.

Biotechnologická konverze kávového oleje a/nebo biotechnologická konverze kávového hydrolyzátu může probíhat ve vsádkovém režimu a/nebo v režimu přidávání kultivačních složek během kultivace („fed-batch“ režim), jako například substrátu.

Při extrakci kávového oleje v režimu přidávání kultivačních složek během kultivace se výhodně přidává kávový olej a síran amonný jako příkrm a při biotechnologické konverzi kávového hydrolyzátu v režimu přidávání kultivačních složek během kultivace se jako příkrm výhodně přidává koncentrát kávového hydrolyzátu nebo prekurzory 3-hydroxyvalerátu, propionová kyselina nebo její sůl, propanol nebo levulinová kyselina. Příkrm je možné přidat vždy, když se hodnota pH používaná při kultivaci zvýší o 0,1.

Pevný podíl po extrakci, pevný podíl po hydrolýze, jejich směs nebo případně přímo pevný odpad po přípravě kávy, které jsou zároveň vstupní suroviny nebo vedlejší produkty jednotlivých kroků přípravy substrátu, mohou být spáleny, přičemž energie vyprodukovaná při spálení těchto materiálů může částečně pokrýt energetické náklady spojené s procesy popsané výše. Tok substrátu technologií může být regulován s ohledem na momentální poptávku po jednotlivých produktech a také s ohledem na energetické požadavky jednotlivých kroků.

Objasnění výkresů

Obr. 1: Schematické znázornění způsobu výroby polyhydroxyalkanoátů, karotenoidů nebo o karotenoidy obohacené biomasy

Obr. 2: Průběh vsádkové kultivace C. necator H16 s využitím kávového oleje

Obr. 3: Průběh fed-batch kultivace C. necator H16 s využitím kávového oleje

Obr. 4: Průběh vsádkové kultivace S. roseus s využitím hydrolyzátu jako substrátu • · · ·

Obr. 5: Průběh fed-batch kultivace S. roseus s využitím hydrolyzátu jako substrátu, šipky značí přídavek příkrmu (hydrolyzát zahuštěný 5,5x pomocí odpaření).

Obr. 6: Průběh vsádkové kultivace B. cepacia s využitím hydrolyzátu jako substrátu

Vynález je dále vysvětlen pomocí příkladů provedení, které však žádným způsobem neomezují jiná možná provedení v rozsahu patentových nároků.

Příklady uskutečnění vynálezu

Příklad 1

Biotechnologická konverze kávového oleje na polyhydroxyalkanoáty (PHA)

Odpadní káva obsahuje cca 10 - 18 % hmotnostního podílu oleje. Olej se může vyextrahovat za zvýšené teploty (40 - 80 °C) pomocí organických rozpouštědel (nejlépe hexan, chloroform). Po extrakci se nadbytek rozpouštědla odstraní a recykluje např. destilací a kávový olej se může použít jako substrát pro výrobu PHA s využitím bakteriálního kmene Cupriavidus necator.

Tab. 1 Relativní zastoupení jednotlivých mastných kyselin v kávovém oleji a obecné charakteristiky kávového oleje

Mastná kyselina	Obsah (%)
Palmitová kyselina (C16:1)	35.7
Stearová kyselina (Cl8:0)	7.1
Olejovákyselina (C18:2n6c)	9.4
Linolová kyselina (C18:2n6c)	43.7
Arachidová kyselina (C20:0)	2.2
alfa-linolenová kyselina
(C18:3n3)	1.1

• ···» « ·· ·: .* ·( · i

i.i· í .· ·*· «· ······· • · · · f •ι .* i . :

• · · · · cis-ll-eikosenová kyselina

(C20:l)	0.3
Behenová kyselina (C22:0)	0.4
Parametr	Hodnota
Číslo zmýdelnění	166.1
Peroxidové číslo	585.0
Číslo kyselosti	7.1
Jodové číslo	70.3
Esterové číslo	158.9

K výrobě PHA se použil kmen bakterie Cupriavidus necator H16 (Czech Collection of Microorganisms, sbírkové číslo CCM 3726). Jedná se o sbírkový kmen povolený k výrobě PHA určených pro styk s potravinami, u kmene nebyla provedena žádná genetická modifikace.

Kultivace produkčního bakteriálního kmene probíhala na následujících kultivačních médiích.

Médium pro úchovu a inokulum I

Hovězí extrakt	10 g
Pepton NaCl	10g 5g
Destilovaná voda	1000 ml

Médium pro další inokulační kroky a produkční médium:

Olej (odpadní, rostlinný)	20 g
(NH₄)₂SO₄	3g
Na₂HPO₄	11,1 g
KH₂PO₄	1.02 g
MgSO₄	0.2 g
Roztok stopových prvků*	1 ml
Destilovaná voda	1000 ml

* Roztok stopových prvků

FeCl₃

CaCl₃

CuSO₄

CoCl₂

NiCl₂

CrCl₂

Destilovaná voda

9.7 g

7.8 g

0.156 g

0.119 g

0.118 g

0.062 g

000 ml

Inokulum I se připravilo z Petriho misek, které se využily k inokulaci komplexního kultivačního média popsaného výše. Po 24-48 hodinách se následně inokulum I využilo k zaočkování inokula II. Kultivace inokula II již probíhala v minerálním médiu popsaném výše, kdy se jako zdroj uhlíku využil kávový olej (20 g/1). Po 24-48 hodinách se pak inokulum II využilo k zaočkování bioreaktoru, obsahující minerální médium popsané výše a kávový olej jako zdroj uhlíku. Ve všech případech se používá inokulační poměr 5 - 15 % (obj.), nejčastěji 10 %. Počáteční koncentrace substrátu se pohybuje v rozmezí 20-50 g/1, typická je pak hodnota 30 g/1. Kultivaci lze vést ve vsádkovém režimu, případně je možné přidávat další dávky oleje a (NH₄)2SO₄. Další přídavek živin je výhodné směřovat do počáteční fáze kultivace (10 až 20 hodina kultivace).

Teplota se v průběhu kultivace udržuje na hodnotě 30 °C, pH kultivačního média se reguluje přídavkem 30% NaOH, respektive 1 mol/1 H2SO4 v rozmezí 6,7 - 7,3, přičemž optimální je hodnota 7,0. Aerací bioreaktoru a rychlostí otáček míchadla se reguluje množství rozpuštěného kyslíku vbioreaktotu tak, aby se hodnota DO (Dissolved Oxygen, udává relativní saturaci média kyslíkem) pohybovala v rozmezí 10-70 % DO, přičemž je výhodné v první fázi kultivaci udržovat spíše vyšší hodnoty DO (30-70 %) a po ukončení růstové fáze je výhodné podpořit akumulaci PHA parciální limitací bakteriální kultury kyslíkem (DO v rozmezí 5 - 15 % DO). Kultivaci v bioreaktoru je možné vést ve vsádkovém režimu, případně je možné využít příkrm oleje v průběhu kultivace. Typický příklad průběhu vsádkové kultivace a fed-batch kultivace s příkrmem s využitím kávového oleje jako substrátu je znázorněn na obrázcích 2 a 3.

Kávový olej má relativně vysoké číslo kyselosti, což komplikuje jeho využití k produkci bionafty [1], na druhou stranu se zdá, že tato skutečnost je výhodou při produkci PHA s využitím bakteriálního kmene C. necator, protože výtěžky biomasy i PHA na kávovém oleji byly vyšší než u jiných olejů s nižším číslem kyselosti. Kávový olej je možné mísit s jinými oleji v libovolném poměru.

Tab. 2 Srovnání kávového oleje s dalšími odpadními oleji ve smyslu jeho využití jako substrátu pro produkci PHA. Kultivace (C. necator H16) probíhala v Erlenmeyerových baňkách po dobu 72 h, koncentrace oleje 20 g/1.

	Biomasa [g/i]	PHA [%]	PHA [g/1]	Číslo kyselosti
Fritovací olej řepkový	10.8 ±0.2	67.9 ± 1.9	7.3 ± 0.2	3.0
Fritovací olej palmový	8.8 ±0.2	56.8 ±2.3	5.0 ±0.2	3.4
Kávový olej	14.2± 0.5	70.3 ±0.8	10.0 ±0.3	7.1

Po ukončení kultivace se buňky bakterie odseparovaly od fermentačního média pomocí centrifugace nebo filtrace a polyhydroxyalkanoáty se z buněčné hmoty vyizolovaly některým ze standardních postupů (extrakce organickými rozpouštědly, digesce buněčné hmoty pomocí NaOH, enzymů, detergentů atd.).

Příklad 2

Hydrolýza kávového odpadu nebo pevného podílu po extrakci kávového oleje

Před krokem samotné hydrolýzy je možné zařadit krok extrakce póly fenolů, které mohou představovat mikrobiální inhibitory. Extrakce polyfenolů probíhá louhováním odpadní kávy resp. pevného podílu po extrakci kávového oleje v roztoku etanolu (0 - 75 % v/v) nebo ethyl laktátu, louhování probíhá při teplotě 20-50 °C po dobu 1-5 hodin. Následně se pevný podíl oddělí (dekantací nebo centrifugací), vysuší a podrobí hydrolýze.

• ·

Tab. 3 Porovnání vybraných rozpouštědel vzhledem k účinnosti extrakce polyfenolů z odpadní kávy. Účinnost extrakce byla stanovena porovnáním koncentrace polyfenolů v hydrolyzátech odpadní kávy louhovaných vybranými rozpouštěly s kontrolním vzorkem, který nebyl před hydrolýzou nijak ošetřován.

Použité	Účinnost extrakce
rozpouštědlo	polyfenolů [%]
Etyl acetát	0.8
Etyl laktát	18.6
Etanol 50%	41.1
Etanol 75%	22.4

Odpadní káva obsahuje relativně vysoký obsah hemicelulóz (cca 40 %) s majoritním obsahem galaktózy a manózy, kromě hemicelulóz je odpadní káva bohatá také na celulózu (cca 9 %) a proteiny (cca 14.0 %) [2],

Hydrolýza hemicelulóz odpadní kávy se provedla zředěným roztokem minerální kyseliny. Ta spočívá v aplikaci roztoku minerální kyseliny (H2SO4, HC1) o koncentraci 0,5 2 % v/v. Navážka odpadní kávy respektive pevného podílu po extrakci kávového oleje se pak vzhledem k zředěnému roztoku minerální kyseliny pohybuje v rozmezí 0,5 - 2,5 % (w/v). Samotná hydrolýza probíhá za teploty 100 - 130 °C po dobu 30 - 90 minut. Suspenze může být dále podrobena enzymatické hydrolýze (viz. dále), případně je přímo možné oddělit pevný podíl (filtrace, dekantace případně centrifugace) a kapalný podíl využít jako základ fermentačního média.

Enzymatické hydrolýze celulóz může být podrobena suspenze odpadní kávy, pevného podílu po extrakci kávového oleje, případně (nejlépe) suspenze po kyselé hydrolýze hemicelulóz. pH suspenze se upraví na hodnotu odpovídající optimální teplotě použitého celulytického enzymu (obvykle v rozmezí 3,5 - 5), následně se aplikuje komerčně dostupný celulytický enzym (např. Celluclast®) v množství odpovídajícím 0,2 - 1 % nejčastěji pak 0,4 % obj. suspenze. Směs se inkubuje po dobu 12 - 24 h za teploty optimální pro aktivitu daného enzymu (nejčastěji v rozmezí 40 - 60 °C).

V dalším kroku se pak může provést hydrolýza proteinů přítomných v suspenzi pomocí proteolytických enzymů, kde produktem hydrolýzy jsou volné aminokyseliny, případně oligopeptidy, které mohou při fermentaci představovat snadno dostupný zdroj dusíku • · · ·

a uhlíku pro mikrobiální buňky. Nejprve se pH suspenze upraví na hodnotu optimální pro aktivitu použitého proteolytického enzymu, např. při použití enzymu Alcalase® se pH upraví na hodnotu 7-8. Hydrolýza proteinů probíhá za teploty optimální pro aktivitu použitého proteolytického enzymu (obvykle v rozmezí 40-60 °C) po dobu 12-24 h.

Po enzymatické hydrolýze se pevný podíl odstraní dekantací, filtrací, případně centrifugací a kapalný podíl (dále jen hydrolyzát) se použije jako základ fermentačního média pro následující biotechnologické výroby.

Jednotlivé hydrolytické kroky (kyselá resp. enzymatická hydrolýza) je možné kombinovat podle potřeby technologie a podle aktuálních ekonomických aspektů (cena enzymu, cena produktu). Složení typického hydrolyzátu odpadní kávy připraveného hydrolýzou pevného podílu po extrakci kávového oleje (15 % w/v) nejprve kyselou hydrolýzou a následně enzymatickou hydrolýzou je uvedeno v tabulce 4.

Tab. 4 Složení typického hydrolyzátu odpadní kávy

Parametr	Koncentrace/hodnota
Sušina (g/1)	106.5 ±0.1
Popel (g/1)	27.6 ±0.8
Vodivost (mS/cm)	23.2
po₄ ³· (g/1)	0.32 ±0.03
Proteiny(g/1)	10.63 ±0.6
Polyfenoly (mg/1)	0.69 ±0.1
Celkové cukry (g/1)	67.3± 2.2
Galaktóza (g/1)	19.5 ±0.3
Manóza (g/1)	28.1 ±0.6
Arabinóza (g/1)	3.1 ±0.2
Glukóza (g/1)	8.7 ±0.2
Celubióza (g/1)	4.8 ±0.8
Rhamnóza (g/1)	3.6 ±0.1

• · · ·

Příklad 3

Využití kávového hydrolyzátu k výrobě karotenoidů

Hydrolyzát je možné využít jako základ kultivačního média pro biotechnologickou výrobu karotenoidů s využitím karotenogenních kvasinek Rhodotorula glutinis, Rhodotorula mucilaginosa, Cystofilobasidium capitatum a Spoloboromyces roseus.

Kultivace karotenogenních kvasinek probíhá za využití hydrolyzátu jako jediného zdroje uhlíku, fermentační médium se pouze doplní o několik minerálních solí, které slouží jako dodatečný zdroj dusíku, fosforu a hořčíku.

Složení kultivačního média:

Hydrolyzát (NH₄)₂SO₄

KH₂PO₄

MgSO₄

1000 ml

4.0 g

0.34

Tabulka 5. Růst testovaných kmenů karotenogenních kvasinek a produkce karotenoidů na hydrolyzátu odpadní kávy. Experiment probíhal v Erlenmeyerových baňkách. Kontrola minerální médium s glukózou (30 g/1) jako jediným zdrojem uhlíku; Série A - hydrolyzát odpadní kávy bez extrakce oleje, Série B - hydrolyzát pevného podílu po extrakci oleje, aplikována jak celuláza tak proteáza; Série C - hydrolyzát pevného podílu po extrakci oleje, aplikována jen celuláza. Ve všech případech byla navážka odpadní kávy na kyselou hydrolýzu 50gna 1,01 1%H₂SO₄.

• ···

Karotenogenní kvasinka	Kultivační série	Biomasa [g/i]	β-karoten [mg/1]	Celkové karotenoidy [mg/1]	Y P/S
Υχ/S	Yp/x [mg/g]
[ g/g]	[mg/g]
Rhodotorula	Kontrola	11.53	1.05	4.78	0.39	0.16	0.42
glutinis	Série A	8.80	0.25	1.64	0.37	0.07	0.19
CCY 20-2-26	Série B	6.20	0.73	2.48	0.40	0.16	0.40
	Série C	7.49	0.22	0.89	0.34	0.04	0.12
Cystofilobasidium	Kontrola	12.31	0.08	6.05	0.44	0.21	0.49
capitatum	Série A	8.35	0.33	1.71	0.38	0.08	0.21
CCY 10-1-1	Série B	1.78	0.01	0.15	0.28	0.02	0.08
	Série C	7.93	0.04	0.37	0.36	0.02	0.05
Sporobolomyces	Kontrola	8.75	1.83	6.11	0.60	0.42	0.70
roseus	Série A	8.50	5.85	10.03	0.34	0.40	1.18
CCY 19-6-4	Série B	10.00	7.81	12.59	0.45	0.56	1.26
	Série C	8.43	1.38	4.60	0.36	0.20	0.55
Rhodotorula	Kontrola	10.53	4.69	18.54	0.54	0.94	1.76
mucilaginosa	Série A	9.83	0.81	1.91	0.40	0.08	0.19
CCY 20-7-31	Série B	4.13	0.98	3.68	0.26	0.23	0.89
	Série C	6.94	0.28	1.21	0.37	0.06	0.17

Všechny testované kmeny kvasinek byly schopny utilizovat hydrolyzát, růst a produkovat karotenoidy. Nicméně jako nej perspektivnější se pro produkci karotenoidů jeví karotenogenní kvasinka S. roseus, která na kávovém odpadu dosahuje neobvykle vysokou produkci biomasy doprovázenou i vysokou produkcí pigmentů.

• · · ·

Kultivace S. roseus může probíhat ve vsádkovém režimu. Inokulace probíhá obvykle dvou-krokově, kdy se první inokulum připraví inokulací tekutého média (minerální médium s glukózou) kulturou ze šikmého agaru. Po 24 h inkubace (25°C, 120 rpm) se Inokulum I využije kzaočkování inokula II, inokulační poměr se pohybuje v rozmezí 10 - 30%, nej častěji pak 20 %. Inokulum II se následně po 24 h kultivace využije k zaočkování bioreaktoru, obsahující hydrolyzát fortifikovaný o minerální soli (viz. výše), jako kultivační médium. Kultivace probíhá za teploty 25 - 30 °C, nejčastěji pak 28 °C. pH vsádky se reguluje přídavkem 1 mol/1 H2SO4 nebo NaOH na hodnotu 5,5 ± 0,3. Pro dosažení vyšších výtěžků karotenoidů je nutné kulturu v průběhu kultivace prosvětlovat. Vzdušení bioreaktoru se reguluje tak, aby se hodnota DO pohybovala v rozmezí 10-50 %. Nejvyšších výtěžků se dosahuje mezi 45- 55 h kultivace, kdy je výhodné proces ukončit.

Kultivaci je také možné vést v režimu fed-batch, kdy je jako příkrm použit hydrolyzát koncertovaný pomocí odpaření. Při aplikaci příkrmu je možné využít skutečnosti, že vyčerpání cukerného substrátu v médiu začne kultura jako zdroj uhlíku metabolizovat přítomné proteiny, což doprovází exkrece zásaditých metabolitů do fermentačního média. Dávka příkrmu je tedy přidána pokaždé, když pH vsádky vzroste např. o hodnotu 0,1 nadhodnotu, která je optimální růstovou hodnotou. Optimální produktivity systému je dosaženo v rozmezí 60 - 75 h kultivace, kdy je vhodné kultivaci ukončit.

Biomasa je po ukončení kultivace oddělena od fermentačního média centrifugací případně mikrofiltrací. O karotenoidy obohacená biomasa může být využita jako krmivo, případně karotenoidy mohou být z biomasy izolovány některým s postupů, které jsou v současnosti popsány v odborné nebo patentové literatuře.

Příklad 4

Využití kávového hydrolyzátu k produkci polyhydroxyalkanoátů (PHA)

Hydrolyzát je kromě karotenoidů možno využít jako kultivační médium pro výrobu s využitím bakteriálních kmenů Bacillus megaterium nebo Burkholderia cepacia.

Oba kmeny jsou známé díky své schopnosti utilizovat široké spektrum nejen cukematých substrátů za současné akumulace polyhydroxyalkanoátů. Především kmen Burkholderia cepacia je tedy uvažován jako produkční kmen pro průmyslovou výrobu polyhydroxyalkanoátů. V odborné nebo patentové literatuře je popsáno jeho využití • · · · k produkci bioplastů s využitím následujících substrátů: sacharózy (WO1992018553 AI), xylózy a levulinové kyseliny (US20060105439 Al)[33], glycerolu (US20120135480 AI) [34] a palmového oleje [28]. Uvažována byla i produkce polyhydroxyalkanoátů s využitím hydrolyzátu hemicelulóz javorového dřeva [35] a byla identifikována nízká citlivost bakterie B. cepacia vůči inhibitorům přítomných v hemicelulózových hydrolyzátech [36],

Bakterie B. cepacia je přímo z hydrolyzátu schopna produkovat kopolymer obsahující 3-hydroxybutyrát i 3-hydroxyvalerát, výsledný kopolymer vykazuje lepší mechanické vlastnosti než homopolymer PHB. Zároveň přídavek prekurzorů 3HV jako je například kyselina propionová, kyselina valerová, propanol nebo kyselina levulinová vede u bakterie B. cepacia k inkorporaci významných množství 3HV (až 50% 3HV v PHA) do struktury polymeru, zatímco bakterie B. megaterium není podle experimentálních výsledků schopna inkorporovat tyto prekurzory do PHA ve formě 3HV.

Tabulka 6. Růst bakteriálních kmenů Bacillus megaterium a Burkholderia cepacia a produkce polyhydroxyalkanoátů na hydrolyzátu kávy. Kultivace probíhaly v Erlenmeyerových baňkách po dobu 72 h.

	Biomasa [g/i]	PHA[%]	PHA[g/l]	Monomemí složení PHA 3HB % 3HV %
Bacillus megaterium	3.2 ± 0.2	48.7 ±3.1	1.6 ± 0.1	100	0
Burkholderia cepacia	4.8 ±0.3	61.9 ±0.2	3.0 ±0.2	96	4
Kultivace	bakterie Bacillus	megaterium	probíhala ve	stejném médiu, které bylo

použito pro kultivaci C. necator, popsaném výše. Ke kultivaci bakterie Burkholderia cepacia byla použita následující kultivační média:

• 9 ♦ v

Médium pro úchovu a inokulum I

Hovězí extrakt	10 g
Pepton	10g
NaCl	5g
Destilovanávoda	1000 ml

Produkční médium

Hydrolyzát	1 000 ml (ředí se vodou na koncentraci 25-75 %)
(NH₄)₂SO4	0-5 - 2 g
Na₂HPO₄.7 H₂O	6.8 g
kh₂po₄	1.5 g
CaCl₂.2 H₂O	o.i g
NH4-Fe(III) citrát	0.06 g
MgSO₄.7 H₂O	0.2 g
Roztok stopových prvků*	1 ml

*Roztok stopových prvků

ZnSO₄.7 H₂O	o.l g/L
MnCl₂.4 H₂O	0.03 g/L
h₃bo₃	0.3 g/L
CoCl₂.6 H₂O	0.2 g/L
CuSO₄.5 H₂O	0.02 g/L
NíC1₂.6 H₂O	0.02 g/L
Na₂MoO₄.2 H₂O	0.03 g/L

Při kultivaci v bioreaktoru se obvykle pracuje ve dvou inokulačních krocích, přičemž první inokulum je obvykle kultivováno na komplexní médium a očkováno z pevného média, druhé inokulum představuje minerální médium s glukózou a hydrolyzátem (obsah v médiu v rozmezí 5-20 %). Inokulační poměr se pohybuje v rozmezí 5-15 %, nejčastěji pak 10 % • · · ·

z objemu média. Samotná kultivace s využitím v hydrolyzátu jako zdroje uhlíku probíhá v bioreaktoru za teploty v rozmezí 28 - 32 °C, přičemž optimální růstová i produkční teplota pro oba bakteriální kmeny je 30 °C. Vzdušení respektive míchání vsádky je regulováno tak, aby se hodnota DO pohybovala v rozmezí 5-50 %, pH je regulováno aplikací 30 % NaOH a 2 M H2SO4 v rozmezí 6,5 - 7,5, přičemž optimální pH je 7,0.

Kultivaci v bioreaktoru je možno vést, stejně jako u karotenogenních kvasinek kultivovaných na hydrolyzátu, ve vsádkovém nebo fed-batch módu, přičemž se jako příkrm při fed-batch kultivaci používá koncentrovaný roztok hydrolyzátu a dávka příkrmu je aplikována, když se pH vsádky začne posouvat do alkalických hodnot. V průběhu kultivace B. cepacia je možno aplikovat prekurzory 3HV (propionovou kyselinu, propanol a levulinovou kyselinu), přičemž optimální je přídavek prekurzoru směřovat do druhé poloviny (ideálně do stacionární fáze) kultivace, koncentrace prekurzoru se pohybuje v rozmezí 1 až 5 g/1.

Koncentrace buněk se pak pohybuje v rozmezí 13 - 54 g/1 s intracelulámím obsahem PHA v rozmezí 35 - 62 % PHA v závislosti na použitém bakteriálním kmeni a módu kultivace. Typický průběh fermentačního procesu (vsádková kultivace, B. cepacia) výroby PHA z hydrolyzátu představuje obrázek 6.

Po ukončení kultivace se buňky odseparují od fermentačního média pomocí centrifugace nebo filtrace a polyhydroxyalkanoáty se z buněčné hmoty vyizolují některým ze standardních postupů (extrakce organickými rozpouštědly, digesce buněčné hmoty pomocí NaOH, enzymů, detergentů atd.).

Průmyslová využitelnost

Způsob podle vynálezu umožňuje výrobu polyhydroxyalkanoátů a karotenoidů v průmyslovém měřítku s využitím snadno dostupného pevného odpadu po přípravě kávy (spent coffee ground). Kromě výhodného využití pevného odpadu po přípravě kávy je výhodou technologie také možnost souběžného využití různé frakce získané při extrakci a zpracování odpadní kávy k biotechnologické (mikrobiální) produkci nejméně dvou různých druhů průmyslově žádaných produktů s vysokou přidanou hodnotou. Tok substrátu technologií může být regulován s ohledem na momentální poptávku po jednotlivých produktech a také s ohledem na energetické požadavky jednotlivých kroků. Spálení pevných podílů v průběhu procesu částečně kryje energetické nároky jednotlivých kroků technologie.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Způsob výroby polyhydroxyalkanoátů a/nebo karotenoidů nebo o karotenoidy obohacené biomasy z pevného odpadu po přípravě kávy, vyznačující se tím, že se provede extrakce pevného odpadu po přípravě kávy organickým rozpouštědlem za vzniku kávového oleje a pevného podílu a následně biotechnologická konverze kávového oleje na polyhydroxyalkanoáty za pomocí bakterie Cupriavidus necator, přičemž pH kultivačního média je v rozmezí 6,7 až 7,3 nebo se provede enzymatická a/nebo kyselá hydrolýza hemicelulóz a celulóz z pevného odpadu po přípravě kávy nebo pevného podílu z extrakce pevného odpadu po přípravě kávy nebo jejich směsi za vzniku kávového hydrolyzátu a následně se provede biotechnologická konverze kávového hydrolyzátu za vzniku polyhydroxyalkanoátů a pevného podílu za pomocí bakterie Burkholderia cepacia nebo Bacillus megaterium, přičemž pH kultivačního média je v rozmezí 6,5 až 7,5 nebo se provede biotechnologické konverze kávového hydrolyzátu za vzniku karotenoidů nebo o karotenoidy obohacené krmné biomasy s využitím karotenogenních kvasinek Sporobolomyces roseus, Rhodotorula mucilaginosa, Rhodotorula glutinis a Cystofdobasidium capitatum a pevného podílu, přičemž pH kultivačního média je v rozmezí 5,2 až 5,7.
2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že pH kultivačního média při biotechnologické konverzi kávového oleje je 7,0.
3. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že pH kultivačního média při biotechnologické konverzi kávového hydrolyzátu na polyhydroxyalkanoáty je 7,0.
4. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že pH biotechnologické konverze kávového hydrolyzátu za vzniku karotenoidů nebo o karotenoidy obohacené krmné biomasy je 5,5.
5. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že organickým rozpouštědlem při extrakci kávového oleje je chloroform nebo hexan.
6. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že k hydrolýze hemicelulóz a celulóz se použije roztok minerální kyseliny.

····· · · · » ··9· • · · * · · · « « • · ♦ · a · • · · · ··· · • ♦ · ·· 4 · · ·· ·· ······· «*« ··
7. Způsob podle nároku 6, vyznačující se tím, že minerální kyselinou je kyselina sírová nebo kyselina chlorovodíková.
8. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že karotenogenní kvasinkou je

Sporobolomyces roseus.
9. Způsob výroby podle nároku 1, vyznačující se tím, že biotechnologická konverze kávového oleje a/nebo biotechnologická konverze kávového hydrolyzátu probíhá ve vsádkovém režimu a/nebo v režimu přidávání kultivačních složek během kultivace.
10. Způsob výroby podle nároku 9, vyznačující se tím, že při biotechnologické konverzi kávového oleje v režimu přidávání kultivačních složek se během kultivace přidává kávový olej a síran amonný.
11. Způsob výroby podle nároku 9, vyznačující se tím, že při biotechnologické konverzi kávového hydrolyzátu v režimu přidávání kultivačních složek během kultivace se přidává koncentrát kávového hydrolyzátu nebo prekurzory 3-hydroxyvalerátu, propionová kyselina nebo její sůl, propanol nebo levulinová kyselina.
12. Použití pevného podílu vzniklého po extrakci kávového oleje z pevného odpadu po přípravě kávy a/nebo po hydrolýze hemicelulóz a celulóz z pevného odpadu po přípravě kávy jako paliva.