JP6772417B2 - 液状のバイオポリマー、その用途および製造方法 - Google Patents
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Description
本出願は、2016年3月28日付の韓国特許出願第10−2016−0037218号に基づく優先権の利益を主張し、当該韓国特許出願の文献に開示されたすべての内容は本明細書の一部として含まれる。
(a)配列番号1の塩基配列;
(b)配列番号1の塩基配列においてA1200Gが変異した塩基配列;
(c)配列番号1の塩基配列においてT78C、T669C、A1125GおよびT1158Cが変異した塩基配列;
(d)配列番号1に対応するアミノ酸配列においてGly335Aspが変異し、配列番号1の塩基配列においてA1200Gが変異した塩基配列;
(e)配列番号1に対応するアミノ酸配列においてAla243Thrが変異し、配列番号1の塩基配列においてA1200Gが変異した塩基配列;
(f)配列番号1に対応するアミノ酸配列においてAsp65Glyが変異し、配列番号1の塩基配列においてT669C、A1125GおよびT1158Cが変異した塩基配列;
(g)配列番号1に対応するアミノ酸配列においてAsp257Asnが変異し、配列番号1の塩基配列においてA1200Gが変異した塩基配列;
(h)配列番号1に対応するアミノ酸配列においてAsp65Asnが変異し、配列番号1の塩基配列においてT669C、A1125GおよびT1158Cが変異した塩基配列;
(i)配列番号1に対応するアミノ酸配列においてThr199Ileが変異し、配列番号1の塩基配列においてT669C、A1125GおよびT1158Cが変異した塩基配列;および
(j)配列番号1の塩基配列においてT78C、T669C、A1125GおよびT1158Cが変異し、配列番号1に対応するアミノ酸配列においてVal193Alaが変異した塩基配列からなる群より選択された塩基配列を有するものであってもよい。
配列番号4のアミノ酸配列;または
配列番号4のアミノ酸配列においてL18H、V24A、K91R、M128V、E130D、N246S、S325T、S477R、S477H、S477F、S477Y、S477G、Q481M、Q481K、Q481RおよびA527Sから構成される群より選択される1つ以上の変異を含むアミノ酸配列に対応する塩基配列からなるものであってもよい。
配列番号4のアミノ酸配列において、
(i)S325TおよびQ481M;
(ii)E130D、S325TおよびQ481M;
(iii)E130D、S325T、S477RおよびQ481M;
(iv)E130D、S477FおよびQ481K;および
(v)L18H、V24A、K91R、M128V、E130D、N246S、S325T、S477G、Q481KおよびA527Sからなる群より選択される変異を含むアミノ酸配列に対応する塩基配列からなるものであってもよい。
1−1.pPs619C1310−CPPCT540組換えベクターの製造
プロピオニル−CoAトランスフェラーゼ遺伝子(pct)は、クロストリジウムプロピオニカム(Clostridium propionicum)由来のプロピオニル−CoAトランスフェラーゼ(CP−PCT)の変異体を使用し、PHA合成酵素遺伝子は、シュードモナス属MBEL6−19(KCTC11027BP)由来のPHA合成酵素の変異体を使用した。
前記1−1で製造したpPs619C1310−CPPCT540ベクターを鋳型とし、プライマー[5'−ATGCCCGGAGCCGGTTCGAA−3'(配列番号29)および5'−GAAATTGTTATCCGCCTGCAGG−3'(配列番号30)]を用いてerror−prone PCRを行った。
Escherichia coli XL1−Blue(Stratagene,USA)に基づいてラクテートが含まれない重合体を生産するために、大腸菌の代謝過程中、ラクテートの生産に関与するD−ラクテートデヒドロゲナーゼ(LdhA)をgenomic DNAでknouk−outさせた。
実施例1で作製された組換えベクターを、実施例2で作製されたldhAがknock−outされたE.coli XL1−BlueΔldhAに電気穿孔法(electroporation)を利用して形質転換させることによって、組換えE.coli XL1−BlueΔldhAを作製した。
実施例3に記載した方法において、本培養培地内の4−ヒドロキシブチレートおよび2−ヒドロキシブチレートの濃度を0〜3g/Lに変化させ、4−ヒドロキシブチレート−2−ヒドロキシブチレート共重合体の生産のための培養を行った。
ここで、本実施形態に係る発明の例を項目として記載する。
[項目1]
常温で液状で存在するポリヒドロキシアルカノエート(polyhydroxyalkanoate:PHA)バイオポリマー。
[項目2]
生分解性または疎水性を有するか、生分解性および疎水性を同時に有する、項目1に記載のバイオポリマー。
[項目3]
4−ヒドロキシブチレートおよび2−ヒドロキシブチレートを繰り返し単位として含み、ポリマー内の4−ヒドロキシブチレートおよび2−ヒドロキシブチレートがそれぞれ30%以上のモル比率で含まれている、項目1に記載のバイオポリマー。
[項目4]
4−ヒドロキシブチレートおよび2−ヒドロキシブチレートを繰り返し単位として含み、ポリマー内の4−ヒドロキシブチレートおよび2−ヒドロキシブチレートがそれぞれ40%以上のモル比率で含まれている、項目1に記載の常温で液状で存在するバイオポリマー。
[項目5]
4−ヒドロキシブチレートおよび2−ヒドロキシブチレートを繰り返し単位として含み、ポリマー内の4−ヒドロキシブチレートおよび2−ヒドロキシブチレートが1:1のモル比率で含まれている、項目1に記載の常温で液状で存在するバイオポリマー。
[項目6]
項目1〜5のいずれか1項に記載のバイオポリマーを含む、生分解性と疎水性を同時に有するバイオポリマー組成物。
[項目7]
前記バイオポリマー組成物は、ガラス、金属、高分子物質、ヒドロゲル、木材、セラミックス、細胞、組織、器官および生体分子からなる群より選択される基質に接着されるものである、項目6に記載のバイオポリマー組成物。
[項目8]
前記バイオポリマー組成物は、組織接着剤、組織縫合剤、癒着防止剤、止血剤、組織工学用支持体、創傷被覆剤、薬物伝達担体、組織充填剤、環境にやさしい塗料、環境にやさしい油性染料、黒彩添加剤または化粧品添加剤として使用されるものである、項目6に記載のバイオポリマー組成物。
[項目9]
ラクテートデヒドロゲナーゼ(lactate dehydrogenase)の活性が弱化または欠損し、2−ヒドロキシアルカノエート(2−hydroxyalkanoate)を2−ヒドロキシアルカノイル−CoA(2−hydroxyalkanoyl−CoA)に転換し、4−ヒドロキシアルカノエート(4−hydroxyalkanoate)を4−ヒドロキシアルカノイル−CoA(4−hydroxyalkanoyl−CoA)に転換する酵素をコーディングする遺伝子、および2−ヒドロキシアルカノイル−CoAおよび4−ヒドロキシアルカノイル−CoAを基質として用いるポリヒドロキシアルカノエート(polyhydroxyalkanoate:PHA)合成酵素をコーディングする遺伝子を含む微生物を培養する段階を含む、4−ヒドロキシブチレートおよび2−ヒドロキシブチレートを繰り返し単位として含む共重合体の製造方法。
[項目10]
前記細胞は、2−ヒドロキシアルカノエートを2−ヒドロキシアルカノイル−CoAに転換し、4−ヒドロキシアルカノエートを4−ヒドロキシアルカノイル−CoAに転換する酵素をコーディングする遺伝子、および2−ヒドロキシアルカノイル−CoAおよび4−ヒドロキシアルカノイル−CoAを基質として用いるPHA合成酵素をコーディングする遺伝子を形質転換して得られたものである、項目9に記載の共重合体の製造方法。
[項目11]
前記2−ヒドロキシアルカノエートを2−ヒドロキシアルカノイル−CoAに転換し、4−ヒドロキシアルカノエートを4−ヒドロキシアルカノイル−CoAに転換する酵素は、プロピオニル−CoAトランスフェラーゼである、項目9に記載の共重合体の製造方法。
[項目12]
前記2−ヒドロキシアルカノエートを2−ヒドロキシアルカノイル−CoAに転換し、4−ヒドロキシアルカノエートを4−ヒドロキシアルカノイル−CoAに転換する酵素をコーディングする遺伝子は、
(a)配列番号1の塩基配列;
(b)配列番号1の塩基配列においてA1200Gが変異した塩基配列;
(c)配列番号1の塩基配列においてT78C、T669C、A1125GおよびT1158Cが変異した塩基配列;
(d)配列番号1に対応するアミノ酸配列においてGly335Aspが変異し、配列番号1の塩基配列においてA1200Gが変異した塩基配列;
(e)配列番号1に対応するアミノ酸配列においてAla243Thrが変異し、配列番号1の塩基配列においてA1200Gが変異した塩基配列;
(f)配列番号1に対応するアミノ酸配列においてAsp65Glyが変異し、配列番号1の塩基配列においてT669C、A1125GおよびT1158Cが変異した塩基配列;
(g)配列番号1に対応するアミノ酸配列においてAsp257Asnが変異し、配列番号1の塩基配列においてA1200Gが変異した塩基配列;
(h)配列番号1に対応するアミノ酸配列においてAsp65Asnが変異し、配列番号1の塩基配列においてT669C、A1125GおよびT1158Cが変異した塩基配列;
(i)配列番号1に対応するアミノ酸配列においてThr199Ileが変異し、配列番号1の塩基配列においてT669C、A1125GおよびT1158Cが変異した塩基配列;および
(j)配列番号1の塩基配列においてT78C、T669C、A1125GおよびT1158Cが変異し、配列番号1に対応するアミノ酸配列においてVal193Alaが変異した塩基配列からなる群より選択された塩基配列からなるものである、項目9に記載の共重合体の製造方法。
[項目13]
前記ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素は、シュードモナス属(Pseudomonas sp.)6−19由来のポリヒドロキシアルカノエート合成酵素である、項目9に記載の共重合体の製造方法。
[項目14]
前記ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素をコーディングする遺伝子は、
配列番号4のアミノ酸配列;または
配列番号4のアミノ酸配列においてL18H、V24A、K91R、M128V、E130D、N246S、S325T、S477R、S477H、S477F、S477Y、S477G、Q481M、Q481K、Q481RおよびA527Sから構成される群より選択される1つ以上の変異を含むアミノ酸配列に対応する塩基配列からなるものである、項目9に記載の共重合体の製造方法。
[項目15]
前記ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素をコーディングする遺伝子は、
配列番号4のアミノ酸配列において、
(i)S325TおよびQ481M;
(ii)E130D、S325TおよびQ481M;
(iii)E130D、S325T、S477RおよびQ481M;
(iv)E130D、S477FおよびQ481K;および
(v)L18H、V24A、K91R、M128V、E130D、N246S、S325T、S477G、Q481KおよびA527Sからなる群より選択される変異を含むアミノ酸配列に対応する塩基配列からなるものである、項目9に記載の共重合体の製造方法。
[項目16]
前記培養は、2−ヒドロキシブチレートおよび4−ヒドロキシブチレートを含む培地で行われるものである、項目9に記載の共重合体の製造方法。
[項目17]
ラクテートデヒドロゲナーゼ(lactate dehydrogenase)の活性が弱化または欠損し、
2−ヒドロキシアルカノエートを2−ヒドロキシアルカノイル−CoAに転換し、4−ヒドロキシアルカノエートを4−ヒドロキシアルカノイル−CoAに転換する酵素をコーディングする遺伝子、および2−ヒドロキシアルカノイル−CoAおよび4−ヒドロキシアルカノイル−CoAを基質として用いるPHA合成酵素をコーディングする遺伝子が導入された、4−ヒドロキシブチレートおよび2−ヒドロキシブチレートを繰り返し単位として含む共重合体を生産する微生物。
[項目18]
前記2−ヒドロキシアルカノエートを2−ヒドロキシアルカノイル−CoAに転換し、4−ヒドロキシアルカノエートを4−ヒドロキシアルカノイル−CoAに転換する酵素は、プロピオニル−CoAトランスフェラーゼである、項目17に記載の微生物。
[項目19]
前記2−ヒドロキシアルカノエートを2−ヒドロキシアルカノイル−CoAに転換し、3−ヒドロキシアルカノエートを3−ヒドロキシアルカノイル−CoAに転換し、4−ヒドロキシアルカノエートを4−ヒドロキシアルカノイル−CoAに転換する酵素をコーディングする遺伝子は、
(a)配列番号1の塩基配列;
(b)配列番号1の塩基配列においてA1200Gが変異した塩基配列;
(c)配列番号1の塩基配列においてT78C、T669C、A1125GおよびT1158Cが変異した塩基配列;
(d)配列番号1に対応するアミノ酸配列においてGly335Aspが変異し、配列番号1の塩基配列においてA1200Gが変異した塩基配列;
(e)配列番号1に対応するアミノ酸配列においてAla243Thrが変異し、配列番号1の塩基配列においてA1200Gが変異した塩基配列;
(f)配列番号1に対応するアミノ酸配列においてAsp65Glyが変異し、配列番号1の塩基配列においてT669C、A1125GおよびT1158Cが変異した塩基配列;
(g)配列番号1に対応するアミノ酸配列においてAsp257Asnが変異し、配列番号1の塩基配列においてA1200Gが変異した塩基配列;
(h)配列番号1に対応するアミノ酸配列においてAsp65Asnが変異し、配列番号1の塩基配列においてT669C、A1125GおよびT1158Cが変異した塩基配列;
(i)配列番号1に対応するアミノ酸配列においてThr199Ileが変異し、配列番号1の塩基配列においてT669C、A1125GおよびT1158Cが変異した塩基配列;および
(j)配列番号1の塩基配列においてT78C、T669C、A1125GおよびT1158Cが変異し、配列番号1に対応するアミノ酸配列においてVal193Alaが変異した塩基配列からなる群より選択された塩基配列からなるものである、項目17に記載の微生物。
[項目20]
前記ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素は、シュードモナス属(Pseudomonas sp.)6−19由来のポリヒドロキシアルカノエート合成酵素である、項目17に記載の微生物。
[項目21]
前記ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素をコーディングする遺伝子は、
配列番号4のアミノ酸配列;または
配列番号4のアミノ酸配列においてL18H、V24A、K91R、M128V、E130D、N246S、S325T、S477R、S477H、S477F、S477Y、S477G、Q481M、Q481K、Q481RおよびA527Sから構成される群より選択される1つ以上の変異を含むアミノ酸配列に対応する塩基配列からなるものである、項目17に記載の微生物。
[項目22]
前記ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素をコーディングする遺伝子は、
配列番号4のアミノ酸配列において、
(i)S325TおよびQ481M;
(ii)E130D、S325TおよびQ481M;
(iii)E130D、S325T、S477RおよびQ481M;
(iv)E130D、S477FおよびQ481K;および
(v)L18H、V24A、K91R、M128V、E130D、N246S、S325T、S477G、Q481KおよびA527Sからなる群より選択される変異を含むアミノ酸配列に対応する塩基配列からなるものである、項目17に記載の微生物。
Claims (13)
- 接着剤として使用するための、接着性組成物であって、
ポリヒドロキシアルカノエートのバイオポリマーを有し、
前記バイオポリマーは、常温で液状で存在して、
前記バイオポリマーは、4−ヒドロキシブチレートおよび2−ヒドロキシブチレートを繰り返し単位として含み、
4−ヒドロキシブチレートおよび2−ヒドロキシブチレートのそれぞれが、前記バイオポリマー内に、30%以上のモル比率で含まれ、
前記バイオポリマーは、生分解性と、疎水性と、接着性とを有する、
接着性組成物。 - 前記バイオポリマーは、4−ヒドロキシブチレートおよび2−ヒドロキシブチレートを、それぞれ40%以上のモル比率で含む、
請求項1に記載の接着性組成物。 - 前記バイオポリマーは、4−ヒドロキシブチレートおよび2−ヒドロキシブチレートを1:1のモル比率で含む、
請求項1または2に記載の接着性組成物。 - 前記接着性組成物は、ガラス、金属、高分子物質、ヒドロゲル、木材、セラミックス、細胞、組織、器官および生体分子からなる群より選択される基質に接着されるものである、
請求項1から3のいずれか1項に記載の接着性組成物。 - 組織接着剤として使用されるものである、
請求項1から4のいずれか1項に記載の接着性組成物。 - 請求項1から5のいずれか1項に記載の接着性組成物を製造するための方法であって、
ラクテートデヒドロゲナーゼ(lactate dehydrogenase)の活性が弱化または欠損し、
2−ヒドロキシアルカノエート(2−hydroxyalkanoate)を2−ヒドロキシアルカノイル−CoA(2−hydroxyalkanoyl−CoA)に転換し、
4−ヒドロキシアルカノエート(4−hydroxyalkanoate)を4−ヒドロキシアルカノイル−CoA(4−hydroxyalkanoyl−CoA)に転換する酵素をコーディングする遺伝子と、および
2−ヒドロキシアルカノイル−CoAおよび4−ヒドロキシアルカノイル−CoAを基質として用いるポリヒドロキシアルカノエート合成酵素をコーディングする遺伝子と
を含む
微生物を培養する段階と、
前記微生物から、前記接着性組成物を回収する段階と
を含む、
方法。 - 前記微生物は、
2−ヒドロキシアルカノエートを2−ヒドロキシアルカノイル−CoAに転換し、
4−ヒドロキシアルカノエートを4−ヒドロキシアルカノイル−CoAに転換する酵素をコーディングする遺伝子、および
2−ヒドロキシアルカノイル−CoAおよび4−ヒドロキシアルカノイル−CoAを基質として用いるポリヒドロキシアルカノエート合成酵素をコーディングする遺伝子を
形質転換して得られたものである、
請求項6に記載の方法。 - 前記2−ヒドロキシアルカノエートを2−ヒドロキシアルカノイル−CoAに転換し、
4−ヒドロキシアルカノエートを4−ヒドロキシアルカノイル−CoAに転換する酵素は、
プロピオニル−CoAトランスフェラーゼである、
請求項6または7に記載の方法。 - 前記2−ヒドロキシアルカノエートを2−ヒドロキシアルカノイル−CoAに転換し、
4−ヒドロキシアルカノエートを4−ヒドロキシアルカノイル−CoAに転換する酵素をコーディングする遺伝子は、
(a)配列番号1の塩基配列;
(b)配列番号1の塩基配列においてA1200Gが変異した塩基配列;
(c)配列番号1の塩基配列においてT78C、T669C、A1125GおよびT1158Cが変異した塩基配列;
(d)配列番号1に対応するアミノ酸配列においてGly335Aspが変異し、配列番号1の塩基配列においてA1200Gが変異した塩基配列;
(e)配列番号1に対応するアミノ酸配列においてAla243Thrが変異し、配列番号1の塩基配列においてA1200Gが変異した塩基配列;
(f)配列番号1に対応するアミノ酸配列においてAsp65Glyが変異し、配列番号1の塩基配列においてT669C、A1125GおよびT1158Cが変異した塩基配列;
(g)配列番号1に対応するアミノ酸配列においてAsp257Asnが変異し、配列番号1の塩基配列においてA1200Gが変異した塩基配列;
(h)配列番号1に対応するアミノ酸配列においてAsp65Asnが変異し、配列番号1の塩基配列においてT669C、A1125GおよびT1158Cが変異した塩基配列;
(i)配列番号1に対応するアミノ酸配列においてThr199Ileが変異し、配列番号1の塩基配列においてT669C、A1125GおよびT1158Cが変異した塩基配列;および
(j)配列番号1の塩基配列においてT78C、T669C、A1125GおよびT1158Cが変異し、配列番号1に対応するアミノ酸配列においてVal193Alaが変異した塩基配列からなる群より選択された塩基配列からなるものである、
請求項6から8のいずれか1項に記載の方法。 - 前記ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素は、シュードモナス属(Pseudomonas sp.)6−19由来のポリヒドロキシアルカノエート合成酵素である、
請求項6から9のいずれか1項に記載の方法。 - 前記ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素をコーディングする遺伝子は、
配列番号4のアミノ酸配列;または
配列番号4のアミノ酸配列においてL18H、V24A、K91R、M128V、E130D、N246S、S325T、S477R、S477H、S477F、S477Y、S477G、Q481M、Q481K、Q481RおよびA527Sから構成される群より選択される1つ以上の変異を含むアミノ酸配列に対応する塩基配列からなるものである、
請求項6から10のいずれか1項に記載の方法。 - 前記ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素をコーディングする遺伝子は、
配列番号4のアミノ酸配列において、
(i)S325TおよびQ481M;
(ii)E130D、S325TおよびQ481M;
(iii)E130D、S325T、S477RおよびQ481M;
(iv)E130D、S477FおよびQ481K;および
(v)L18H、V24A、K91R、M128V、E130D、N246S、S325T、S477G、Q481KおよびA527Sからなる群より選択される変異を含むアミノ酸配列に対応する塩基配列からなるものである、
請求項6から11のいずれか1項に記載の方法。 - 前記培養は、2−ヒドロキシブチレートおよび4−ヒドロキシブチレートを含む培地で行われるものである、
請求項6から12のいずれか1項に記載の方法。
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