KR102009420B1

KR102009420B1 - 글루코즈를 이용한 락테이트-4-하이드록시부티레이트 중합체의 제조 방법

Info

Publication number: KR102009420B1
Application number: KR1020150124381A
Authority: KR
Inventors: 조영현; 강동균; 강혜옥; 박혜권
Original assignee: 주식회사 엘지화학
Priority date: 2015-09-02
Filing date: 2015-09-02
Publication date: 2019-08-12
Also published as: KR20170027578A

Abstract

글루코즈를 단일 탄소원으로 하여 락테이트-4-하이드록시부티레이트를 생산할 수 있는 미생물 및 이를 이용한 락테이트-4-하이드록시부티레이트의 생산 방법이 제공된다.

Description

글루코즈를 이용한 락테이트-4-하이드록시부티레이트 중합체의 제조 방법{Method for preparing copolymer comprising 4-hydroxybutyrate and lactate as repeating unit using glucose}

폴리하이드록시알카노에트(polyhydroxyalkanoate: PHA)는 미생물이 질소, 산소, 인, 마그네슘 등의 성장에 필요한 원소가 부족한 상태에서 탄소원이 풍부하게 존재할 때 에너지 및 환원능의 저장을 위하여 미생물 내부에 축적하는 천연 폴리에스터 물질이다. PHA는 종래 석유로부터 유래된 합성 고분자와 비슷한 물성을 가지면서 생분해성 및 생체적합성을 보이기 때문에, 기존의 합성 플라스틱을 대체할 물질로 인식되고 있다.

PHA 의 모노머로 알려진 것은 약 150종 이상으로, 이 중 대부분의 모노머들이 3-, 4-, 5- 또는 6-하이드록시알카노에트(hydroxyalkanoate: HA)이고, 활발히 연구되고 있는 대표적인 PHA 모노머로는 3-하이드록시부티레이트(3-hydroxybutyrate: 3HB), 4-하이드록시부티레이트(4-hydroxybutyrate: 4HB), 3-하이드록시프로피오네이트(3-hydroxypropionate: 3HP), 및 탄소수가 6~12개인 중간 사슬 길이(medium chain length: MCL)의 3-하이드록시알카노에트(MCL 3-hydroxyalkanoate) 등과 같이, 3번과 4번 탄소 위치에 하이드록시기(hydroxyl group)가 있는 모노머들을 들 수 있다.

한편, 종래 락테이트-4-하이드록시부티레이트 중합체를 미생물을 이용하여 제조하기 위해서는 4-하이드록시부티레이트 또는 그 전구체를 기질로 첨가해야 했다. 이는, 락테이트-4-하이드록시부티레이트 중합체 생산에 있어 기질에 대한 추가적인 비용이 발생하므로 경제적으로 불리한 문제가 있다.

국내특허등록 10-0957777호, 2010년 5월 6일

이에, 본 발명은 글루코즈를 단일 탄소원으로 하여 락테이트-4-하이드록시부티레이트를 생산할 수 있는 미생물 및 이를 이용한 락테이트-4-하이드록시부티레이트의 제조에 관한 기술을 제공한다.

일 예는, 숙시네이트 세미알데하이드 디하이드로게나제(succinate semialdehyde dehydrogenase)를 코딩하는 내생의 유전자 sad 및 gabD 가 결손 또는 약화되고, 숙시네이트 세미알데하이드 디하이드로게나제(succinate semialdehyde dehydrogenase)를 코딩하는 sucD 유전자, 4-하이드록시부티레이트 디하이드로게나제(4-hydroxybutyrate dehydrogenase) 를 코딩하는 4hbD 유전자, 락테이트를 락틸-CoA로 전환하고 4-하이드록시알카노에트를 4-하이드록시알카노일-CoA로 전환하는 효소를 코딩하는 유전자, 및 락틸-CoA 및 4-하이드록시알카노일-CoA 를 기질로 사용하는 폴리하이드록시알카노에트(polyhydroxyalkanoate: PHA) 합성효소를 코딩하는 유전자가 도입 또는 강화되어 있고, 외부에서 4-하이드록시부티레이트 또는 이의 전구체가 첨가되지 않는 환경에서 글루코즈를 탄소원으로 하여 락테이트 및 4-하이드록시부티레이트를 반복단위로 포함하는 중합체를 생산할 수 있는 미생물을 제공한다.

다른 예는, 상기 미생물을, 4-하이드록시부티레이트 또는 이의 전구체를 포함하지 않고 글루코즈를 포함하는 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 락테이트 및 4-하이드록시부티레이트를 반복단위로 포함하는 중합체를 생산하는 방법을 제공한다.

본 발명은 미생물에서 락테이트-4-하이드록시부티레이트 중합체를 생산함에 있어서, 외부로부터 4-하이드록시부티레이트 또는 이의 전구체의 공급 없이도, 글루코즈를 탄소원으로 하여 위의 중합체를 생산할 수 있는 특징이 있다. 나아가, 글루코즈 이외의 추가적인 탄소원의 공급 없이 위의 중합체를 생산할 수 있는 특징이 있다. 보다 상세하게는, 세포 내 존재하는 락테이트를 락틸-CoA 로 전환하고, TCA 사이클의 일부 대사 경로를 조절하기 위하여 숙시네이트 세미알데하이드 디하이드로게나제를 코딩하는 내생 유전자(native succinate semialdehyde dehydrogenase genes)인 sad 및 gabD 유전자를 결손시키고, 외부에서 도입된 숙시네이트 세미알데하이드 디하이드로게나제(succinate semialdehyde dehydrogenase)를 코딩하는 sucD 유전자 및 4-하이드록시부티레이트 디하이드로게나제(4-hydroxybutyrate dehydrogenase) 를 코딩하는 4hbD 유전자를 발현시켜 4-하이드록시부티레이트의 생합성을 유도하고, 락테이트를 락틸-CoA로 전환하고 4-하이드록시알카노에트를 4-하이드록시알카노일-CoA로 전환하는 효소를 이용하고, 락틸-CoA 및 4-하이드록시알카노일-CoA 를 기질로 사용하는 폴리하이드록시알카노에트 합성효소를 이용하여, 최종산물인 락테이트-4-하이드록시부티레이트를 생산할 수 있게 한다.

따라서, 일 양태로, 본 발명은,

숙시네이트 세미알데하이드 디하이드로게나제(succinate semialdehyde dehydrogenase)를 코딩하는 내생의 유전자 sad 및 gabD 가 결손 또는 약화되고,

숙시네이트 세미알데하이드 디하이드로게나제(succinate semialdehyde dehydrogenase)를 코딩하는 sucD 유전자, 4-하이드록시부티레이트 디하이드로게나제(4-hydroxybutyrate dehydrogenase) 를 코딩하는 4hbD 유전자, 락테이트를 락틸-CoA로 전환하고 4-하이드록시알카노에트를 4-하이드록시알카노일-CoA로 전환하는 효소를 코딩하는 유전자, 및 락틸-CoA 및 4-하이드록시알카노일-CoA 를 기질로 사용하는 폴리하이드록시알카노에트(polyhydroxyalkanoate: PHA) 합성효소를 코딩하는 유전자가 도입 또는 강화되어 있고,

외부에서 4-하이드록시부티레이트 또는 이의 전구체가 첨가되지 않는 환경에서 글루코즈를 탄소원으로 하여 락테이트 및 4-하이드록시부티레이트를 반복단위로 포함하는 중합체를 생산할 수 있는 미생물에 관한 것이다.

다른 양태로, 본 발명은 상기 미생물을, 4-하이드록시부티레이트 또는 이의 전구체를 포함하지 않고 글루코즈를 포함하는 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 락테이트 및 4-하이드록시부티레이트를 반복단위로 포함하는 중합체를 생산하는 방법에 관한 것이다.

이하, 본 발명의 구성을 보다 상세하게 설명한다.

용어, "락테이트 및 4-하이드록시부티레이트를 반복단위로 포함하는 중합체" 또는 "락테이트-4-하이드록시부티레이트" 란 모노머로서 락테이트 및 4-하이드록시부티레이트가 에스터 결합으로 중합된 반복단위를 포함하는 선형의 폴리에스터를 말한다.

본원에서 락테이트 및 4-하이드록시부티레이트를 반복단위로 포함하는 중합체를 생산할 수 있는 미생물은, 숙시네이트 세미알데하이드 디하이드로게나제(succinate semialdehyde dehydrogenase)를 코딩하는 내생의 유전자 sad 및 sucD 유전자가 결손 또는 약화된 것을 특징으로 한다.

본원에서, 숙시네이트 세미알데하이드 디하이드로게나제(succinate semialdehyde dehydrogenase)를 코딩하는 내생의 유전자 sad 및 gabD 유전자란, 미생물이 천연적으로 가지고 있는 sad 및 gabD 유전자를 의미한다. 상기 sad 및 gabD 유전자에 의해 코딩되는 숙시네이트 세미알데하이드 디하이드로게나제는, 숙시네이트 세미알데하이드를 숙시네이트로 전환하는데 관여하며, NAD- 또는 NADP-의존적 숙시네이트 세미알데하이드 디하이드로게나제일 수 있다.

상기 sad 및 gabD 유전자의 결손은, 예를 들어, 유전체 상에서 상기 유전자 부위를 결실시키거나 특정 유전자 서열을 삽입하여 단백질 서열을 변형시킴으로서 수행될 수 있다. 상기 특정 유전자 서열의 염색체 내로의 삽입은 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 상동 재조합에 의하여 이루어질 수 있다.

상기 sad 및 gabD 유전자의 약화는, 예를 들어, 상기 유전자의 프로모터 부위 및 5'-UTR 부위의 염기서열을 변형시킴으로써 단백질의 발현을 약화시키거나 또는 해당 유전자의 코딩 영역(open reading frame) 부위에 변이를 도입함으로서 효소의 활성을 약화시킬 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

일 구현예로, 해당 미생물의 sad 및 gabD 유전자의 서열정보는 미국생물공학정보센터(NCBI) 등 공지의 데이터베이스로부터 얻을 수 있다. 본원의 구체적인 실시예에서는, E.coli XL1-Blue 균주에서 sad 및 gabD 유전자를 결손시켜 사용하였다. E.coli XL1-Blue 균주의 sad 유전자의 염기서열은 서열번호 1에, gabD 유전자의 염기서열은 서열번호 2에 나타내었다.

또한, 본원에서 락테이트 및 4-하이드록시부티레이트를 반복단위로 포함하는 중합체를 생산할 수 있는 미생물은, 숙시네이트 세미알데하이드 디하이드로게나제(succinate semialdehyde dehydrogenase)를 코딩하는 sucD 유전자, 4-하이드록시부티레이트 디하이드로게나제(4-hydroxybutyrate dehydrogenase) 를 코딩하는 4hbD 유전자, 락테이트를 락틸-CoA로 전환하고 4-하이드록시알카노에트를 4-하이드록시알카노일-CoA로 전환하는 효소를 코딩하는 유전자, 및 락틸-CoA 및 4-하이드록시알카노일-CoA 를 기질로 사용하는 폴리하이드록시알카노에트(polyhydroxyalkanoate: PHA) 합성효소를 코딩하는 유전자가 도입 또는 강화된 것을 특징으로 한다.

상기 유전자의 도입은, 예를 들어, 벡터 상에 자가 프로모터 또는 강화된 별개의 프로모터와 함께 상기 유전자들을 클로닝하여 미생물에 형질전환시키거나 상기 유전자가 염색체상에 삽입되도록 함으로써 수행될 수 있다. 상기 유전자의 강화는, 예를 들어, 상기 유전자의 프로모터를 고유 프로모터보다 강력한 프로모터로 교체하거나 5'-UTR 부위의 염기서열을 변형시킴으로써 효소의 활성을 강화시킬 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본원에서, sucD 유전자에 의해 코딩되는 숙시네이트 세미알데하이드 디하이드로게나제(succinate semialdehyde dehydrogenase)는 숙시닐-coA 를 숙시네이트 세미알데하이드로 전환하는데 관여하며, CoA-의존적 숙시네이트 세미알데하이드 디하이드로게나제일 수 있다.

예를 들어, 상기 sucD 유전자는 에스케리치아 속, 슈도모나스 속, 렙토스피라 속, 코리네박테리움 속, 사카로마이세스 속, 크로모박테리움 속, 노카디아 속, 브라디리조비움 속, 하이호모나스 속, 메틸로코커스 속, 메틸로바실러스 속, 바실러스 속, 니트로소모나스 속, 크렙시엘라 속, 쉬겔라 속, 코웰리아 속, 스트렙토마이세스 속, 어위니아 속, 세라티아 속, 프로비덴시아 속, 살모넬라 속, 브레비박테리아 속, 진균 또는 효모와 같은 주지의 진핵 및 원핵 숙주들로부터 유래할 수 있다. 일 구현예로는, 포르피로모나스 진지발리스(Porphyromonas Gingivalis)에서 유래한 것일 수 있으며, 예를 들어, 포르피로모나스 진지발리스 W83 균주에서 유래한 서열번호 3의 염기서열을 가지는 것일 수 있다. 그러나, 본 발명의 범위가 이에 제한되는 것은 아니다.

본원에서, 4hbD 유전자에 의해 코딩되는 4-하이드록시부티레이트 디하이드로게나제(4-hydroxybutyrate dehydrogenase)는, 숙시네이트 세미알데하이드를 4-하이드록시부티레이트로 전환하는데 관여할 수 있다.

예를 들어, 상기 4hbD 유전자는 에스케리치아 속, 슈도모나스 속, 렙토스피라 속, 코리네박테리움 속, 사카로마이세스 속, 크로모박테리움 속, 노카디아 속, 브라디리조비움 속, 하이호모나스 속, 메틸로코커스 속, 메틸로바실러스 속, 바실러스 속, 니트로소모나스 속, 크렙시엘라 속, 쉬겔라 속, 코웰리아 속, 스트렙토마이세스 속, 어위니아 속, 세라티아 속, 프로비덴시아 속, 살모넬라 속, 브레비박테리아 속, 진균 또는 효모와 같은 주지의 진핵 및 원핵 숙주들로부터 유래할 수 있다. 일 구현예로는, 포르피로모나스 진지발리스(Porphyromonas Gingivalis)에서 유래한 것일 수 있으며, 예를 들어, 포르피로모나스 진지발리스 W83 균주에서 유래한 서열번호 4의 염기서열을 가지는 것일 수 있다. 그러나, 본 발명의 범위가 이에 제한되는 것은 아니다.

본원에서, "락테이트를 락틸-CoA로 전환하고 4-하이드록시알카노에트를 4-하이드록시알카노일-CoA로 전환하는 효소"는, CoA 공여체로부터 CoA 를 떼어서 락테이트 및 4-하이드록시알카노에트에 각각 전달함으로써 락틸-CoA 및 4-하이드록시알카노일-CoA을 생성할 수 있는 효소를 말한다. 상기 CoA 공여체로는 아세틸-CoA 또는 아실-CoA (예를 들어, 프로피오닐-CoA 등)를 예시할 수 있다.

일 구현예로, 상기 효소는 프로피오닐-CoA 트랜스퍼라아제 유전자(pct)일 수 있다. 상기 효소의 유전자는 클로스트리디움 프로피오니쿰(Clostridium propionicum) 에서 유래한 것일 수 있다.

예를 들어, 락테이트를 락틸-CoA로 전환하고 4-하이드록시알카노에트를 4-하이드록시알카노일-CoA로 전환하는 효소의 유전자는,

(a) 서열번호 5의 염기서열;

(b) 서열번호 5의 염기서열에서 A1200G가 변이된 염기서열;

(c) 서열번호 5의 염기서열에서 T78C, T669C, A1125G 및 T1158C가 변이된 염기서열;

(d) 서열번호 5와 대응하는 아미노산 서열에서 Gly335Asp이 변이되고, 서열번호 5의 염기서열에서 A1200G가 변이된 염기서열;

(e) 서열번호 5와 대응하는 아미노산 서열에서 Ala243Thr이 변이되고, 서열번호 5의 염기서열에서 A1200G가 변이된 염기서열;

(f) 서열번호 5와 대응하는 아미노산 서열에서 Asp65Gly이 변이되고, 서열번호 5 의 염기서열에서 T669C, A1125G 및 T1158C가 변이된 염기서열;

(g) 서열번호 5와 대응하는 아미노산 서열에서 Asp257Asn이 변이되고, 서열번호 5의 염기서열에서 A1200G가 변이된 염기서열;

(h) 서열번호 5와 대응하는 아미노산 서열에서 Asp65Asn이 변이되고, 서열번호 5의 염기서열에서 T669C, A1125G 및 T1158C가 변이된 염기서열;

(i) 서열번호 5와 대응하는 아미노산 서열에서 Thr199Ile이 변이되고, 서열번호 5의 염기서열에서 T669C, A1125G 및 T1158C가 변이된 염기서열; 및

(j) 서열번호 5의 염기서열에서 T78C, T669C, A1125G 및 T1158C가 변이되고, 서열번호 5와 대응하는 아미노산 서열에서 Val193Ala이 변이된 염기서열

로 이루어진 군으로부터 선택된 염기서열을 갖는 것일 수 있다.

본원에서, "락틸-CoA 및 4-하이드록시알카노일-CoA 를 기질로 사용하는 PHA 합성효소"는, 락틸-CoA 및 4-하이드록시알카노일-CoA을 기질로 하여 락테이트 및 4-하이드록시부티레이트를 반복단위로 포함하는 중합체를 합성할 수 있는 효소를 말한다. 예를 들어, 상기 효소는 슈도모나스 속 6-19(pseudomonas sp. 6-19)에서 유래한 PHA 합성효소(phaC)일 수 있다.

예를 들어, 상기 락틸-CoA 및 4-하이드록시알카노일-CoA 를 기질로 사용하는 PHA 합성효소는,

서열번호 8의 아미노산 서열; 또는

서열번호 8의 아미노산 서열에서 L18H, V24A, K91R, M128V, E130D, N246S, S325T, S477R, S477H, S477F, S477Y, S477G, Q481M, Q481K, Q481R 및 A527S로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 변이를 포함하는 아미노산 서열에 대응하는 염기 서열로 이루어진 것일 수 있다.

다른 구체예에서, 상기 락틸-CoA 및 4-하이드록시알카노일-CoA 를 기질로 사용하는 PHA 합성효소는,

서열번호 8의 아미노산 서열에서,

(i) S325T 및 Q481M;

(ii) E130D, S325T 및 Q481M;

(iii) E130D, S325T, S477R 및 Q481M;

(iv) E130D, S477F 및 Q481K; 및

(v) L18H, V24A, K91R, M128V, E130D, N246S, S325T, S477G, Q481K 및 A527S로 이루어진 군으로부터 선택되는 변이를 포함하는 아미노산 서열에 대응하는 염기 서열로 이루어진 것일 수 있다.

상기 효소들은 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 범위 내에서 추가적인 변이를 포함할 수 있다. 예를 들어, 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 펩티드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환을 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 경우에 따라서, 상기 단백질은, 인산화(phosphorylation), 황화(sulfation), 아크릴화(acrylation), 당화(glycosylation), 메틸화(methylation), 파네실화(farnesylation) 등으로 수식(modification) 될 수도 있다. 또한, 아미노산 서열 상의 변이 또는 수식에 의해서 단백질의 열, pH 등에 대한 구조적 안정성이 증가하거나 단백질 활성이 증가한 효소 단백질을 포함할 수 있다.

또한, 상기 효소를 코딩하는 유전자는, 기능적으로 균등한 코돈 또는 (코돈의 축퇴성에 의해) 동일한 아미노산을 코딩하는 코돈, 또는 생물학적으로 균등한 아미노산을 코딩하는 코돈을 포함하는 핵산분자를 포함할 수 있다. 상기 핵산 분자는 표준 분자 생물학 기술, 예를 들어 화학적 합성 방법 또는 재조합 방법을 이용하여 분리 또는 제조하거나, 시판되는 것을 사용할 수 있다.

상기 효소들은 재조합 벡터를 통해 미생물에 형질전환하거나 상기 효소를 코딩하는 유전자가 염색체상에 삽입되도록 유전자 조작된 것일 수 있다.

유전자 재조합 방법으로 sucD 및 4hbD 유전자, 락테이트를 락틸-CoA로 전환하고 4-하이드록시알카노에트를 4-하이드록시알카노일-CoA로 전환하는 효소를 코딩하는 유전자, 및 락틸-CoA 및 4-하이드록시알카노일-CoA 를 기질로 사용하는 PHA 합성효소 유전자를 미생물에 도입시키는 과정은 다음의 단계를 포함할 수 있다.

우선, sucD 및 4hbD 유전자, 락테이트를 락틸-CoA로 전환하고 4-하이드록시알카노에트를 4-하이드록시알카노일-CoA로 전환하는 효소를 코딩하는 유전자, 및 락틸-CoA 및 4-하이드록시알카노일-CoA 를 기질로 사용하는 PHA 합성효소 유전자 중 1종 이상을 벡터에 삽입하여 재조합 벡터를 제조하는 단계이다. 위 4종의 유전자는 각각 별도의 벡터에 삽입될 수도 있고, 하나의 벡터에 삽입될 수도 있다. 일 구현예로, sucD 및 4hbD 유전자를 포함하는 벡터와, 락테이트를 락틸-CoA로 전환하고 4-하이드록시알카노에트를 4-하이드록시알카노일-CoA로 전환하는 효소를 코딩하는 유전자 및 락틸-CoA 및 4-하이드록시알카노일-CoA 를 기질로 사용하는 PHA 합성효소 유전자를 포함하는 벡터를 제조할 수 있다.

용어, "벡터"는 개체의 세포 내에서 목적 단백질을 코딩하는 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 말하며, 목적 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 숙주 세포로 도입되기 위한 수단이 된다. 상기 벡터로는 플라스미드, 바이러스 벡터, 박테리오파지 벡터, 코즈미드 벡터, YAC(Yeast Artificial Chromosome) 벡터 등 다양한 형태의 벡터를 사용할 수 있다. 재조합 벡터는 클로닝 벡터 및 발현 벡터를 포함한다. 클로닝 벡터는 복제기점, 예를 들어 플라스미드, 파지 또는 코스미드의 복제 기점을 포함하며, 다른 DNA 절편이 부착되어 부착된 절편이 복제될 수 있는 레플리콘이다. 발현 벡터는 단백질을 합성하는데 사용되도록 개발되었다.

본원에서 벡터는 원핵세포 또는 진핵세포 등 각종 숙주 세포에서 목적하는 효소 유전자를 발현하고 이를 생산하는 기능을 하면 특별히 한정되지 않지만, 벡터내로 삽입되어 전달된 유전자가 숙주세포의 게놈 내로 비가역적으로 융합되어 세포 내에서 유전자 발현이 장기간 안정적으로 지속되도록 하는 벡터가 바람직하다.

이러한 벡터는, 해당 유전자가 선택된 숙주 내에서 발현될 수 있도록 하는 전사 및 해독 발현 조절 서열을 포함한다. 발현 조절 서열로는, 전사를 실시하기 위한 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열 및/또는 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있다.　예를 들면, 원핵생물에 적합한 조절 서열은 프로모터, 임의로 오퍼레이터 서열 및/또는 리보좀 결합 부위를 포함할 수 있다. 진핵세포에 적합한 조절 서열은 프로모터, 터미네이터 및/또는 폴리아데닐화 시그날을 포함할 수 있다. 개시 코돈 및 종결 코돈은 일반적으로 목적 단백질을 코딩하는 핵산 서열의 일부로 간주되며, 유전자 작제물이 투여되었을 때 개체에서 작용을 나타내야 하며 코딩 서열과 인프레임(in frame)에 있어야 한다. 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다. 또한 복제 가능한 발현벡터인 경우 복제 기원을 포함할 수 있다. 그 외에, 인핸서, 목적하는 유전자의 5' 말단 및 3' 말단의 비해독영역, 선별 마커(예컨대, 항생제 내성 마커), 또는 복제가능단위 등을 적절하게 포함할 수도 있다. 벡터는 자가 복제하거나 숙주 게놈 DNA에 통합될 수 있다.

유용한 발현 조절 서열의 예로는, 아데노바이러스의 초기 및 후기 프로모터들, 원숭이 바이러스 40(SV40), 마우스 유방 종양 바이러스(MMTV) 프로모터, HIV의 긴 말단 반복부(LTR) 프로모터, 몰로니 바이러스, 시토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, 엡스타인 바이러스(EBV) 프로모터, 로우스 사코마 바이러스(RSV) 프로모터, RNA 폴리머라제 Ⅱ 프로모터, β-액틴 프로모터, 사람 헤로글로빈 프로모터 및 사람 근육 크레아틴 프로모터, lac 시스템, trp 시스템, TAC 또는 TRC 시스템, T3 및 T7 프로모터들, 파지 람다의 주요 오퍼레이터 및 프로모터 영역, fd 코드 단백질의 조절 영역, 포스포글리세레이트 키나아제 (phosphoglycerate kinase, PGK) 또는 다른 글리콜분해 효소에 대한 프로모터, 포스파타제의 프로모터들, 예를 들어 Pho5, 효모 알파-교배 시스템의 프로모터 및 원핵세포 또는 진핵 세포 또는 이들의 바이러스의 유전자의 발현을 조절하는 것으로 알려진 구성과 유도의 기타 다른 서열 및 이들의 여러 조합을 포함할 수 있다.

세포에서 형질전환 유전자의 발현 수준을 높이기 위해서는 목적하는 유전자와 전사 및 해독 발현 조절 서열이 서로 작동가능하도록 연결되어야 한다. 일반적으로, "작동가능하게 연결된"은 연결된 DNA 서열이 접촉하고, 또한 분비 리더의 경우 접촉하고 리딩 프레임 내에 존재하는 것을 의미한다. 예를 들면, 전서열(pre-sequence) 또는 분비 리더(leader)에 대한 DNA가 단백질의 분비에 참여하는 전단백질로서 발현되는 경우 폴리펩타이드에 대한 DNA에 작동가능하게 연결될 수 있고, 프로모터 또는 인핸서가 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩서열에 작동가능하게 연결될 수 있고, 또는 리보좀 결합 부위는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결될 수 있고, 또는 리보좀 결합 부위는 번역을 용이하게 하도록 배치되는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다. 이들 서열의 연결은 편리한 제한 효소 부위에서 라이게이션(연결)에 의해 수행될 수 있고, 그러한 부위가 존재하지 않는 경우, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터(oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용하여 수행될 수 있다.

당업자는 숙주 세포의 성질, 벡터의 복제 수, 복제 수를 조절할 수 있는 능력 및 당해 벡터에 의해 코딩되는 다른 단백질, 예를 들어 항생제 마커의 발현 등을 고려하여, 본 발명에 적합한 각종 벡터, 발현 조절 서열, 숙주 등을 선정할 수 있다.

다음은, 상기 재조합 벡터를 미생물 세포에 도입시키는 단계이다.

용어, "도입"은 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체외 인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 복제가능하게 되는 것을 의미한다.

본 발명에 따른 재조합 벡터로 형질전환될 수 있는 미생물은 원핵 세포와 진핵 세포 모두를 포함하며, DNA의 도입효율이 높고, 도입된 DNA의 발현효율이 높은 숙주가 통상 사용될 수 있다. 또한, 글루코즈를 이용한 TCA 사이클(Tricarboxylic acid cycle)을 가지고 있는 미생물이 사용될 수 있다. 구체 예로, 대장균 (예를 들어, E. coli DH5a, E. coli JM101, E. coli K12, E. coli W3110, E. coli X1776, E. coli B 및 E. coli XL1-Blue)을 포함하는 에스케리치아 속, 슈도모나스 속, 렙토스피라 속, 코리네박테리움 속, 사카로마이세스 속, 크로모박테리움 속, 노카디아 속, 브라디리조비움 속, 하이호모나스 속, 메틸로코커스 속, 메틸로바실러스 속, 바실러스 속, 니트로소모나스 속, 크렙시엘라 속, 쉬겔라 속, 코웰리아 속, 스트렙토마이세스 속, 어위니아 속, 세라티아 속, 프로비덴시아 속, 살모넬라 속, 브레비박테리아 속, 진균 또는 효모와 같은 주지의 진핵 및 원핵 숙주들, 아그로박테리움 A4와 같은 아그로박테리움 속 균주, 스포도프테라 프루기페르다(SF9)와 같은 곤충 세포, CHO, COS 1, COS 7, BSC 1, BSC40, BMT 10 등의 동물 세포, 조직배양된 인간 세포 및 식물 세포 등을 예시할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 적당한 숙주로 형질전환되면, 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다.

또한, 본 발명의 목적상, 상기 숙주 세포는 글루코즈로부터 락테이트 및 4-하이드록시부티레이트를 생합성하는 경로를 가지고 있는 세포일 수 있고, 글루코즈를 이용한 TCA 사이클(Tricarboxylic acid cycle)을 가지고 있는 미생물이 사용될 수 있다.

유전자 도입 방법으로는, 당 분야에서 공지된 바와 같이 적합한 표준 기술, 예들 들어, 전기천공법(electroporation), 전기주입법(electroinjection), 미세주입법(microinjection), 인산칼슘공동-침전법(calcium phosphate co-precipitation), 염화캄슘/염화루비듐법, 레트로바이러스 감염(retroviral infection), DEAE-덱스트란(DEAE-dextran), 양이온 리포좀(cationic liposome)법, 폴리에틸렌 글리콜 침전법(polyethylene glycol-mediated uptake), 유전자총(gene gun) 등을 이용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이 때 원형의 벡터를 적절한 제한효소로 절단하여 선형의 벡터 형태로 도입할 수 있다.

다음은, 상기 유전자들이 도입된 세포를 배양하여 락테이트-4-하이드록시부티레이트 중합체를 생산하는 단계이다.

상기 재조합 벡터가 발현되는 미생물을 배지에서 배양하여, 락테이트-4-하이드록시부티레이트 중합체를 대량으로 제조, 분리 가능하다. 배지와 배양조건은 형질전환 세포의 종류에 따라 관용되는 것을 적당히 선택하여 이용할 수 있다. 배양 시 세포의 생육과 중합체의 대량 생산에 적합하도록 온도, 배지의 pH 및 배양시간 등의 조건들을 적절하게 조절할 수 있다. 상기 배양 방법의 예에는, 회분식, 연속식 및 유가식 배양이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본원에서 제공하는 미생물은, 외부에서 4-하이드록시부티레이트가 첨가되지 않는 환경에서 글루코즈를 탄소원으로 하여 락테이트 및 4-하이드록시부티레이트를 반복단위로 포함하는 중합체를 생산할 수 있다.

따라서, 일 구현예로, 상기 미생물의 배양은 4-하이드록시부티레이트 또는 이의 전구체를 포함하지 않고, 글루코즈를 포함하는 배지에서 수행되는 것일 수 있다. 하나의 예시로, 글루코즈는 단일 탄소원으로서 배지에 포함될 수 있는데, 단일 탄소원으로서 글루코즈를 포함한다는 것은, 글루코즈 이외의 탄소원을 실질적으로 포함하지 않는 것을 의미할 수 있다. 다른 예시로, 상기 미생물의 배양은, 탄소원으로서 글루코즈 외에 추가적으로, TCA 사이클(Tricarboxylic acid cycle) 상의 중간 대사산물들, 예를 들어, 옥살로아세테이트, 알파-케토글루타레이트, 시트레이트, 숙시네이트, 또는 이들의 혼합물들을 더욱 포함하는 배지에서 수행될 수 있다.

이 외에, 배양에 사용되는 배지는 특정한 균주의 요구조건을 적절하게 만족시켜야 한다. 상기 배지는 다양한 질소원, 인원 및 미량원소 성분을 포함할 수 있다. 배지 내 질소원으로는 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 대두밀 및 요소 또는 무기 화합물, 예를 들면 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄을 예시할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 질소원 또한 개별적으로 또는 혼합물로서 사용할 수 있다. 배지 내 인원으로는 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨-함유 염을 예시할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 배양 배지는 성장에 필요한 황산마그네슘 또는 황산철과 같은 금속염을 포함하거나, 아미노산 및 비타민과 같은 필수 성장 물질을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기된 원료들은 배양 과정에서 배양물에 적절한 방식에 의해 회분식으로 또는 연속식으로 첨가될 수 있다.

또한, 필요에 따라, 수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아와 같은 기초 화합물 또는 인산 또는 황산과 같은 산 화합물을 적절한 방식으로 사용하여 배양물의 pH를 조절할 수 있다. 또한, 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 호기 상태를 유지하기 위해 배양물 내로 산소 또는 산소-함유 기체 (예, 공기)를 주입할 수 있으며, 배양물의 온도는 보통 20℃ 내지 45℃, 바람직하게는 25℃ 내지 40℃ 일 수 있다. 배양은 원하는 중합체의 생산량이 최대로 얻어질 때까지 계속될 수 있다.

다음은, 상기 생산된 락테이트-4-하이드록시부티레이트 중합체를 회수하는 단계이다.

미생물로부터 생산된 락테이트-4-하이드록시부티레이트 중합체는, 당업계에 널리 알려져 있는 방법으로 세포 또는 배양 배지로부터 분리해낼 수 있다. 락테이트-4-하이드록시부티레이트 중합체의 회수 방법의 예로서, 원심분리, 초음파파쇄, 여과, 이온교환 크로마토그래피, 고성능 액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatography: HPLC), 가스 크로마토그래피(gas chromatography: GC) 등의 방법이 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다.

본 발명은 락테이트 및 4-하이드록시부티레이트를 반복단위로 포함하는 중합체를 제공하며, 이는 생분해성 및 생체적합성이 있는 바이오플라스틱의 원료로서, 전자, 자동차, 식품, 농업 및 의료 분야 등에 폭넓게 활용될 수 있다.

도 1은 pPs619C1310-CpPCT540 벡터의 제작 과정 및 개열 지도를 나타낸 것이다.
도 2는 pPs619C1249.18H-CPPCT540 벡터의 개열 지도를 나타낸 것이다.
도 3은 pSTV29-sucD UTR27 4hbD 벡터의 개열 지도를 나타낸 것이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 락테이트 -4- 하이드록시부티레이트 중합체를 생산하는 미생물의 제조

1-1. sad 와 gabD 유전자 결실

Escherichia coli XL1-Blue (Stratagene, USA)를 바탕으로 하여 sad 와 gabD 유전자 결실 균주를 제조하였다. 유전자 결실 방법은 업계에 잘 알려져 있는 red-recombination 방법을 이용하였으며, pRed/ET recombination kit (Gene Bridge)를 사용하여 제조자의 지시서대로 수행하였다. sad 유전자를 결실하기 위한 DNA 절편을 만들기 위하여 프라이머[5'-CAG AAC ATG GTC CGG CAA TGC GA AGG CGG AAC CTA CGC TGG TGG AAA ATA ATT AAC CCT CAC TAA AGG GCG G-3'(서열번호 9), 5'-CCG CTC CCG CAC GAA CAC TTC CGG TCA CCG TGA CAG CAG CAA TGC GCG AGT ACG ACT CAC TAT AGG GCT CG-3'(서열번호 10)]를 이용하여 DNA 절편을 증폭하였다. 또한, gabD 유전자를 결실하기 위한 DNA 절편을 만들기 위해 프라이머[5'-CCA CTG GCC GAA GCG AAA GGC GAA ATC AGC TAC GCC CC TCC TTT ATT GAA ATT AAC CCT CAC TAA AGG GCG G-3'(서열번호 11), 5'-CCG ACC GCG CCC GCC GAA CCG GTG ACC ACG TTA AAT ACC CCA GCC GGA ACT ACG ACT CAC TAT AGG GCT CG-3'(서열번호 12)]를 이용하여 DNA 절편을 증폭하였다.

1-2. propionyl - CoA transferase 및 PHA synthase 유전자 도입

락틸-CoA 및 4-하이드록시알카노일-CoA 를 기질로 사용하는 PHA 합성효소로서, 슈도모나스 속 MBEL 6-19 (KCTC 11027BP) 유래의 PHA 합성효소의 변이체를 사용하였다. PHA 합성효소(phaC1_Ps6 _-19) 유전자를 분리하기 위하여, 슈도모나스 속 MBEL 6-19 (KCTC 11027BP)의 전체 DNA를 추출하고, phaC1_Ps6 _-19 유전자 서열(서열번호 7)에 기반하여, 프라이머[5'-GAG AGA CAA TCA AAT CAT GAG TAA CAA GAG TAA CG-3'(서열번호 13), 5'-CAC TCA TGC AAG CGT CAC CGT TCG TGC ACG TAC-3'(서열번호 14)]를 제작하고, 상기 추출한 전체 DNA를 주형으로 하여, PCR을 수행하였다. 얻어진 PCR 산물을 전기영동하여, phaC1_Ps6 _-19유전자에 해당하는 1.7 kb 크기의 유전자 절편을 확인하고, phaC1_Ps6 _-19 유전자를 수득하였다.

phaC1_Ps6 _-19 합성효소를 발현시키기 위하여, pSYL105 벡터(Lee et al ., Biotech. Bioeng., 1994, 44:1337-1347)에서 Ralstonia eutropha H16 유래의 PHB 생산 오페론이 함유된 DNA 절편을 BamHI/EcoRI으로 절단하여, pBluescript II (Stratagene Co., USA)의 BamHI/EcoRI 인식부위에 삽입함으로써 pReCAB 재조합 벡터를 제조하였다. pReCAB 벡터는 PHA 합성효소(phaC_RE)와 단량체 공급효소(phaA_RE 및 phaB_RE)가 PHB 오페론 프로모터에 의해 항시적으로 발현된다. BstBI/SbfI 인식 부위가 각각 양끝에 하나씩만 포함된 phaC1_Ps6 _-19 합성효소 유전자 절편을 만들기 위해 우선 내재하고 있는 BstBI 위치를 SDM(site directed mutagenesis) 방법으로 아미노산의 변환 없이 제거하였고, BstBI/SbfI 인식부위를 첨가하기 위해 프라이머[5'- atg ccc gga gcc ggt tcg aa - 3'(서열번호 15), 5'- CGT TAC TCT TGT TAC TCA TGA TTT GAT TGT CTC TC - 3'(서열번호 16), 5'- GAG AGA CAA TCA AAT CAT GAG TAA CAA GAG TAA CG -3' (서열번호 17), 5'- CAC TCA TGC AAG CGT CAC CGT TCG TGC ACG TAC -3'(서열번호 18), 5'- GTA CGT GCA CGA ACG GTG ACG CTT GCA TGA GTG -3'(서열번호 19), 5'- aac ggg agg gaa cct gca gg -3'(서열번호 20)]를 이용하여 오버랩핑 PCR을 수행하였다. pReCAB 벡터를 BstBI/SbfI으로 절단하여 R. eutropha H16 PHA 합성효소 (phaC_RE)를 제거한 다음, 상기에서 수득한 phaC1_Ps6 _-19유전자를 BstBI/SbfI 인식부위에 삽입함으로써 pPs619C1-ReAB 재조합 벡터를 제조하였다.

SCL(short chain length) 활성에 영향을 미치는 아미노산 위치 3 곳을 아미노산 서열 배열분석을 통해 찾았고, 프라이머[5'- CTG ACC TTG CTG GTG ACC GTG CTT GAT ACC ACC- 3'(서열번호 21), 5'- GGT GGT ATC AAG CAC GGT CAC CAG CAA GGT CAG- 3'(서열번호 22), 5'- CGA GCA GCG GGC ATA TC A TGA GCA TCC TGA ACC CGC- 3'(서열번호 23), 5'- GCG GGT TCA GGA TGC TCA TGA TAT GCC CGC TGC TCG- 3'(서열번호 24), 5'- atc aac ctc atg acc gat gcg atg gcg ccg acc- 3'(서열번호 25), 5'- ggt cgg cgc cat cgc atc ggt cat gag gtt gat- 3'(서열번호 26)]를 사용한 SDM 방법을 이용하여, E130D, S325T, Q481M 을 포함하는 phaC1_Ps6 _-19 합성효소 변이체인 phaC1_Ps6 _-19300을 함유한 pPs619C1300-ReAB 를 제조하였다.

여기에 프로피오닐-CoA 트랜스퍼라아제가 같이 발현되는 오페론 형태의 항시적 발현되는 시스템을 구축하기 위하여 클로스트리듐 프로피오니쿰(Clostridium propionicum) 유래의 프로피오닐-CoA 트랜스퍼라아제 (CP-PCT)를 사용하였다. CP-PCT는 클로스트리듐 프로피오니쿰의 염색체 DNA를 프라이머[5'-GGAATTCATGAGAAAGGTTCCCATTATTACCGCAGATGA-3'(서열번호 27), 5'-gc tctaga tta gga ctt cat ttc ctt cag acc cat taa gcc ttc tg-3'(서열번호 28)]를 이용하여 PCR하여 얻어진 단편을 사용하였다. 이 때, 원래 야생형 CP-PCT에 존재하는 NdeI site를 cloning의 용이성을 위해 SDM 방법을 이용하여 제거하였고, SbfI/NdeI 인식부위를 첨가하기 위해 프라이머[5'-agg cct gca ggc gga taa caa ttt cac aca gg- 3'(서열번호 29), 5'-gcc cat atg tct aga tta gga ctt cat ttc c- 3'(서열번호 30)]를 이용하여 오버랩핑 PCR을 수행하였다. pPs619C1300-ReAB 벡터를 SbfI/NdeI으로 절단하여 Ralstonia eutrophus H16 유래의 단량체 공급효소 (phaA_RE 및 phaB_RE)를 제거한 다음, 상기 PCR 클로닝한 CP-PCT 유전자를 SbfI/NdeI 인식 부위에 삽입함으로써 pPs619C1300-CPPCT 재조합 벡터를 제조하였다.

다음으로, CP-PCT 유전자에 무작위적 돌연변이(random mutagenesis)를 도입하기 위해 상기에서 제작된 pPs619C1300-CPPCT을 주형으로 하고, 프라이머[5'-CGCCGGCAGGCCTGCAGG-3' (서열번호 31), 5'-GGCAGGTCAGCCCATATGTC-3' (서열번호 32)]를 이용하여 Mn² ⁺이 첨가되고 dNTPs의 농도 차이가 존재하는 조건에서 Error-prone PCR을 실시하였다. 그 후, 무작위적 돌연변이가 포함된 PCR 단편을 증폭하기 위해 상기 프라이머를 이용하여 일반 조건에서 PCR하였다. pPs619C1300-CPPCT 벡터를 SbfI/NdeI으로 절단하여 야생형 CP-PCT 를 제거한 후, 상기 증폭된 돌연변이 PCR 단편을 SbfI/NdeI 인식부위에 삽입시킨 ligation mixture를 만들어 E. coli JM109에 도입하여 ~10⁵정도 규모의 CP-PCT 라이브러리를 제작하였다. 상기 제작된 CP-PCT 라이브러리는 고분자 검출배지(LB agar, glucose 20g/L, 3HB 1g/L, Nile red 0.5μg/ml)에서 3일간 생육시킨 후 고분자 생성 여부를 확인하는 스크리닝 작업을 수행하여 ~80여 개체의 후보를 1차 선정하였다. 이들 후보를 고분자가 생성되는 조건에서 4일간 액체 배양(LB agar, glucose 20g/L, 3HB 1g/L, ampicillin 100mg/L, 37℃)하였고, FACS(Florescence Activated Cell Sorting) 분석을 통하여 2 개체, 즉 CP-PCT Variant 512 (핵산치환 A1200G 포함) 및 CP-PCT Variant 522 (핵산치환 T78C, T669C, A1125G, T1158C 포함)를 선정하였다. 상기 1차 선별된 돌연변이체들(CP-PCT Variant 512, CP-PCT Variant 522)을 기본으로 다시 상기 Error-prone PCR의 방법으로 무작위적 돌연변이를 수행하여 다양한 CP-PCT 변이체들을 얻을 수 있었고, 그 중 CP-PCT Variant 540 (Val193Ala 및 침묵돌연변이 T78C, T669C, A1125G, T1158C 포함)를 2차 선별하였다. 그 후, CpPct540 돌연변이가 포함된 PCR 단편을 증폭하기 위해 상기 언급한 바 있는 프라이머[5'-agg cct gca ggc gga taa caa ttt cac aca gg- 3', 5'-gcc cat atg tct aga tta gga ctt cat ttc c- 3']를 이용하여 일반 조건에서 PCR하였다. 상기 pPs619C1300-CPPCT 벡터를 SbfI/NdeI으로 절단하여 CPPCT 부분을 제거한 후, 상기 증폭된 CpPct540 PCR 단편을 SbfI/NdeI인식부위에 삽입시킨 ligation mixture를 만들어 pPs619C1300-CPPCT540 벡터를 제조하였다.

또한, 상기 제조한 phaC1_Ps6 _-19합성효소 변이체(phaC1_Ps6-19300)를 기초로 하여 프라이머[5'-gaa ttc gtg ctg tcg agc cgc ggg cat atc- 3' (서열번호 33), 5'-gat atg ccc gcg gct cga cag cac gaa ttc- 3'(서열번호 34)]를 사용한 SDM 방법을 이용하여 E130D, S477F 및 Q481K 이 변이된 아미노산 서열을 가진 슈도모나스 속 MBEL 6-19 유래 PHA 합성효소 변이체(phaC1_Ps6-19310)를 함유한 pPs619C1310-CPPCT540 벡터를 제조하였다(도 1).

다음으로, PHA 합성효소 유전자에 무작위적 돌연변이(random mutagenesis)를 도입하기 위해 상기 제조한 pPs619C1310-CPPCT540 벡터를 주형으로 하여 프라이머[5'-ATGCCCGGAGCCGGTTCGAA-3'(서열번호 35) 및 5'-GAAATTGTTATCCGCCTGCAGG-3'(서열번호 36)]를 사용하여 error-prone PCR을 수행하였다. error-prone PCR을 수행한 후 돌연변이가 포함된 PCR 단편을 증폭하기 위해 상기 프라이머를 이용하여 다시 PCR 한 후 증폭된 돌연변이들을 pPs619C1310-CPPCT540 벡터의 BstBI/SbfI 위치에 삽입하여 변이체들에 대한 라이브러리를 제작하였다. 제작된 변이체 라이브러리를 E.coli XL-1Blue에 형질전환 시키고, 이를 PHB 검출배지(LB agar, glucose 20g/L, Nile red 0.5μg/ml)에서 3일 동안 배양했다. 배양 후 스크리닝 과정을 통해 최종 선별된 변이체는 L18H, V24A, K91R, M128V, E130D, N246S, S325T, S477G, Q481K 및 A527S이 변이된 아미노산 서열을 가진 pPs619C1249.18H 이었다. 그 후 pPs619C1249.18H 가 포함된 PCR 단편을 증폭하기 위해 프라이머를 이용하여 일반 조건에서 PCR하였다. 상기 pPs619C1310-CPPCT540 벡터를 BstBI/SbfI 로 절단하여 pPs619C1310 부분을 제거한 후, 상기 증폭된 pPs619C1249.18H의 PCR 단편을 BstBI/SbfI 인식부위에 삽입시킨 ligation mixture를 만들어 pPs619C1249.18H-CPPCT540 벡터를 제조하였다(도 2).

1-3. sucD 및 4hbD 유전자 도입

4-하이드록시부티레이트의 생합성을 유도하기 위하여 pSTV29 벡터에 sucD와 4hbD 를 삽입하여 사용하였다. 포르피로모나스 진지발리스 W83 균주 유래의 sucD, 4hbD 서열을 이용하여 DNA 주형을 합성하였고, 프라이머[5'-agcttgcatgcaatggaaattaaggaaatg-3'(서열번호 37), 5'-gacactcatgcaagcgttagagctcccagatttc -3'(서열번호 38)]를 이용하여 sucD 유전자를 증폭하였고, 프라이머[5'-aggagcatcttacatgcaactgttcaaact-3'(서열번호 39), 5'-acccggggatccttaatagagccgtctgtat-3'(서열번호 40)]를 이용하여 4hbD 유전자를 증폭하였다. 또한, 두 유전자 사이에 UTR27(acagggtgtgaaaggagcatcttac, 서열번호 41) 서열을 포함하고 하나의 DNA 절편으로 만들어질 수 있도록 fusion PCR 을 하기 위하여 sucD 부분에 5'-cttgcatgagtgtctagaacagggtgtgaa-3'(서열번호 42)와 4hbD 부분에 5'-agaacagggtgtgaaaggagcatcttacat-3'(서열번호 43) 프라이머를 이용하여 하나의 DNA 절편으로 증폭하였다. 이렇게 생성된 DNA 절편을 SphI/BamHI 제한효소 부위를 이용하여 클로닝하여 pSTV29::sucD-UTR27-4hbD (또는, pSTV29(sucD and 4hbD)로 표시함) 를 제조하였다(도 3).

1-4. 락테이트 -4- 하이드록시부티레이트 중합체를 생산하는 미생물의 제조

상기 실시예 1-1에서 제조한, sad 와 gabD 유전자가 결실된 E.coli XL1-Blue 균주(Stratagene, USA)에, 상기 실시예 1-2에서 제조한 pPs619C1249.18H-CPPCT540 벡터 및 상기 실시예 1-3에서 제조한 pSTV29(sucD and 4hbD) 벡터를 전기천공법(electroporation)을 이용하여 도입함으로써 락테이트-4-하이드록시부티레이트 중합체를 생산하는 변이 미생물을 제조하였다. 비교 실험을 위하여, sad 와 gabD 유전자가 결실되지 않고 pPs619C1249.18H-CPPCT540 벡터 및 pSTV29(sucD and 4hbD) 벡터가 도입된 E.coli XL1-Blue 균주와, sad 유전자만 결실되고 pPs619C1249.18H-CPPCT540 벡터 및 pSTV29(sucD and 4hbD) 벡터가 도입된 E.coli XL1-Blue 균주를 함께 제조하였다.

실시예 2. 락테이트 -4- 하이드록시부티레이트의 제조

상기에서 제조한 변이 미생물에 대하여 플라스크 배양을 수행하였다. 구체적으로, 20g/L 글루코즈, 100mg/L 앰피실린 및 30mg/L 클로람페니콜이 함유된 MR 배지에서, 30℃, 250rpm 의 조건 하에 4일 동안 배양하였다. MR 배지의 조성은 다음과 같다: (1리터 기준으로) KH₂PO₄ 6.67g, (NH₄)2HPO₄ 4g, MgSO₄·7H₂O 0.8g, citric acid 0.8g, 및 trace metal solution 5mL. 여기에서, Trace metal solution은 1리터 기준으로 5M HCl 5mL, FeSO₄·7H₂O 10g, CaCl₂ 2g, ZnSO₄·7H₂O 2.2g, MnSO₄·4H₂O 0.5g, CuSO₄·5H₂O 1g, (NH₄)6Mo₇O₂·4H₂O 0.1g, 및 Na₂B₄O₂·10H₂O 0.02g 을 함유한다.

배양 종료 후, 상기 배양액을 원심 분리하여 세포를 회수하고, 건조 세포 펠렛 약 30mg 을 메탄 분해(methanolysis)하여 모노머 성분을 메틸 에스터로 전환하였다. 이 때 벤조산을 내부 표준물질로 사용하였고, 결과물을 가스 크로마토그래피로 분석하기 위해 Agilent 6890N GC system (Agilent Technologies, Palo Alto, CA) 를 사용하여 Braunegg et al.(Eur J Appl Microbiol. 6:29-37, 1978) 에 기재된 방법으로 수행하였다.

그 결과, 표 1에 나타난 바와 같이, 본 발명에서 도입한 sucD와 4hbD 를 발현시킴으로써 글루코즈 이외의 다른 추가 기질 없이 4-하이드록시부티레이트를 포함하는 락테이트-4-하이드록시부티레이트 중합체가 생성되었음을 확인할 수 있었다. 또한, 숙시네이트 세미알데하이드에서 숙시네이트로 전환하는 효소인 sad 유전자와 gabD 유전자의 추가 결실을 통해 락테이트-4-하이드록시부티레이트 중합체 상에서 4-하이드록시부티레이트의 비율을 좀 더 높일 수 있음을 확인하였다.

	DCW(mg)	LA(mg)	4HB(mg)	LA(mol%)	4HB (mol%)	Polymer (wt%)
XL1-Blue^a	98.1±0.6	23.93±0.07	0.23±0.03	99.1±0.2	1.0±0.2	28.6±5.7
XL1-BlueΔsad^b	111.3±0.5	26.31±1.48	0.52±0.04	98.3±0.1	1.7±0.1	24.1±1.4
XL1-BlueΔsadΔgabD^c	120.0±1.6	31.93±2.50	1.18±0.11	96.9±0.2	3.1±0.2	27.6±2.1

a : pPs619C1249.18H-CPPCT540 벡터 및 pSTV29(sucD and 4hbD) 벡터가 도입된 균주

b : sad 유전자가 결실되고, pPs619C1249.18H-CPPCT540 벡터 및 pSTV29(sucD and 4hbD) 벡터가 도입된 균주

c : sad 와 gabD 유전자가 결실되고, pPs619C1249.18H-CPPCT540 벡터 및 pSTV29(sucD and 4hbD) 벡터가 도입된 균주

<110> LG CHEM, LTD. <120> Method for preparing copolymer comprising 4-hydroxybutyrate and lactate as repeating unit using glucose <130> DPP20151062KR <160> 43 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1389 <212> DNA <213> Escherichia coli XL1-Blue <220> <221> gene <222> (1)..(1389) <223> sad gene <400> 1 atgaccatta ctccggcaac tcatgcaatt tcgataaatc ctgccacggg tgaacaactt 60 tctgtgctgc cgtgggctgg cgctgacgat atcgaaaacg cacttcagct ggcggcagca 120 ggctttcgcg actggcgcga gacaaatata gattatcgtg ctgaaaaact gcgtgatatc 180 ggtaaggctc tgcgcgctcg tagcgaagaa atggcgcaaa tgatcacccg cgaaatgggc 240 aaaccaatca accaggcgcg cgctgaagtg gcgaaatcgg cgaatttgtg tgactggtat 300 gcagaacatg gtccggcaat gctgaaggcg gaacctacgc tggtggaaaa tcagcaggcg 360 gttattgagt atcgaccgtt ggggacgatt ctggcgatta tgccgtggaa ttttccgtta 420 tggcaggtga tgcgtggcgc tgttcccatc attcttgcag gtaacggcta cttacttaaa 480 catgcgccga atgtgatggg ctgtgcacag ctcattgccc aggtgtttaa agatgcgggt 540 atcccacaag gcgtatatgg ctggctgaat gccgacaacg acggtgtcag tcagatgatt 600 aaagactcgc gcattgctgc tgtcacggtg accggaagtg ttcgtgcggg agcggctatt 660 ggcgcacagg ctggagcggc actgaaaaaa tgcgtactgg aactgggcgg ttcggatccg 720 tttattgtgc ttaacgatgc cgatctggaa ctggcggtga aagcggcggt agccggacgt 780 tatcagaata ccggacaggt atgtgcagcg gcaaaacgct ttattatcga agagggaatt 840 gcttcggcat ttaccgaacg ttttgtggca gctgcggcag ccttgaaaat gggcgatccc 900 cgtgacgaag agaacgctct cggaccaatg gctcgttttg atttacgtga tgagctgcat 960 catcaggtgg agaaaaccct ggcgcagggt gcgcgtttgt tactgggcgg ggaaaagatg 1020 gctggggcag gtaactacta tccgccaacg gttctggcga atgttacccc agaaatgacc 1080 gcgtttcggg aagaaatgtt tggccccgtt gcggcaatca ccattgcgaa agatgcagaa 1140 catgcactgg aactggctaa tgatagtgag ttcggccttt cagcgaccat ttttaccact 1200 gacgaaacac aggccagaca gatggcggca cgtctggaat gcggtggggt gtttatcaat 1260 ggttattgtg ccagcgacgc gcgagtggcc tttggtggcg tgaaaaagag tggctttggt 1320 cgtgagcttt cccatttcgg cttacacgaa ttctgtaata tccagacggt gtggaaagac 1380 cggatctga 1389 <210> 2 <211> 1449 <212> DNA <213> Escherichia coli XL1-Blue <220> <221> gene <222> (1)..(1449) <223> gabD gene <400> 2 atgaaactta acgacagtaa cttattccgc cagcaggcgt tgattaacgg ggaatggctg 60 gacgccaaca atggtgaagc catcgacgtc accaatccgg cgaacggcga caagctgggt 120 agcgtgccga aaatgggcgc ggatgaaacc cgcgccgcta tcgacgccgc caaccgcgcc 180 ctgcccgcct ggcgcgcgct caccgccaaa gaacgcgcca ccattctgcg caactggttc 240 aatttgatga tggagcatca ggacgattta gcgcgcctga tgaccctcga acagggtaaa 300 ccactggccg aagcgaaagg cgaaatcagc tacgccgcct cctttattga gtggtttgcc 360 gaagaaggca aacgcattta tggcgacacc attcctggtc atcaggccga taaacgcctg 420 attgttatca agcagccgat tggcgtcacc gcggctatca cgccgtggaa cttcccggcg 480 gcgatgatta cccgcaaagc cggtccggcg ctggcagcag gctgcaccat ggtgctgaag 540 cccgccagtc agacgccgtt ctctgcgctg gcgctggcgg agctggcgat ccgcgcgggc 600 gttccggctg gggtatttaa cgtggtcacc ggttcggcgg gcgcggtcgg taacgaactg 660 accagtaacc cgctggtgcg caaactgtcg tttaccggtt cgaccgaaat tggccgccag 720 ttaatggaac agtgcgcgaa agacatcaag aaagtgtcgc tggagctggg cggtaacgcg 780 ccgtttatcg tctttgacga tgccgacctc gacaaagccg tggaaggcgc gctggcctcg 840 aaattccgca acgccgggca aacctgcgtc tgcgccaacc gcctgtatgt gcaggacggc 900 gtgtatgacc gttttgccga aaaattgcag caggcagtga gcaaactgca catcggcgac 960 gggctggata acggcgtcac catcgggccg ctgatcgatg aaaaagcggt agcaaaagtg 1020 gaagagcata ttgccgatgc gctggagaaa ggcgcgcgcg tggtttgcgg cggtaaagcg 1080 cacgaacgcg gcggcaactt cttccagccg accattctgg tggacgttcc ggccaacgcc 1140 aaagtgtcga aagaagagac gttcggcccc ctcgccccgc tgttccgctt taaagatgaa 1200 gctgatgtga ttgcgcaagc caatgacacc gagtttggcc ttgccgccta tttctacgcc 1260 cgtgatttaa gccgcgtctt ccgcgtgggc gaagcgctgg agtacggcat cgtcggcatc 1320 aataccggca ttatttccaa tgaagtggcc ccgttcggcg gcatcaaagc ctcgggtctg 1380 ggtcgtgaag gttcgaagta tggcatcgaa gattacttag aaatcaaata tatgtgcatc 1440 ggtctttaa 1449 <210> 3 <211> 1356 <212> DNA <213> Porphyromonas gingivalis <220> <221> gene <222> (1)..(1356) <223> sucD gene <400> 3 atggaaatta aggaaatggt gagccttgcg cgcaaagctc agaaggaata tcaagcgacc 60 cataaccaag aggcagtcga caatatatgc cgagctgcag caaaggtaat ttatgaaaac 120 gcagctattc tggctcgcga agctgtcgat gaaaccggca tgggcgttta cgaacacaaa 180 gtggccaaaa accaaggcaa atcgaaaggt gtgtggtaca acctgcacaa taaaaaatcg 240 attggtatat taaacataga cgagaggacc ggtatgatcg agattgcaaa accaatcggc 300 gtggttgggg cggtaacgcc gaccacgaat ccaatcgtta ctccgatgag caatatcatc 360 tttgctctta aaacatgcaa tgccatcatt attgccccac atccgagatc caaaaaatgt 420 tctgcgcacg cagtgcgtct gatcaaagag gctattgcac cgtttaacgt acctgagggt 480 atggttcaga ttatagaaga acctagcatc gagaaaacac aggaactcat gggcgccgtt 540 gacgtcgtcg tagcgacagg tggtatgggc atggtgaaat ctgcgtatag ttcaggaaaa 600 ccttctttcg gggttggagc cggtaatgtt caggtgatag tggatagtaa tatcgatttt 660 gaagcggcag ccgaaaagat cataaccggg cgtgcgtttg ataatggcat aatctgctca 720 ggggagcaga gcatcatcta caatgaggct gataaggaag cagttttcac agcatttcgc 780 aatcatgggg cctatttctg tgatgaggcc gaaggagatc gggcacgtgc tgctatcttc 840 gagaatgggg ccattgcgaa agacgttgtt ggtcagagcg tggcctttat tgccaagaaa 900 gcgaatatca atatcccgga gggtacacgg attctcgttg tggaagctcg cggtgtagga 960 gcagaagacg ttatctgtaa agagaagatg tgtcccgtaa tgtgcgccct ctcgtataag 1020 cattttgaag aaggagtaga aattgcacgt acgaacctcg cgaacgaagg taacggccac 1080 acctgtgcta tacattccaa taatcaggca catatcatct tggccgggtc agagctgacg 1140 gtctctcgta tcgtcgtgaa tgccccgagt gccactactg caggcggtca tatccaaaac 1200 ggattagccg ttaccaatac gctcgggtgc ggctcatggg gcaataactc tataagtgag 1260 aactttactt ataaacactt gctcaacatt agtagaattg cgcctctaaa ttccagcatt 1320 catattcccg atgataaaga aatctgggag ctctaa 1356 <210> 4 <211> 1116 <212> DNA <213> Porphyromonas gingivalis <220> <221> gene <222> (1)..(1116) <223> 4hbD gene <400> 4 atgcaactgt tcaaactgaa gtccgtcaca caccattttg atacttttgc ggagtttgca 60 aaagaatttt gtcttggaga acgcgatctg gttattacca acgagtttat ctatgagccc 120 tatatgaaag cttgtcagct cccatgtcat tttgttatgc aggagaaata tgggcaaggc 180 gagccgtcgg atgaaatgat gaacaacatc ctggcagata tccgtaatat tcagttcgac 240 cgcgtgattg gtattggagg gggtactgta attgatatct caaaattatt tgttctgaaa 300 ggtttaaatg atgtgttaga tgcgttcgac cgcaaaatac cgctaatcaa agagaaagaa 360 ctgatcattg tgcccacaac gtgtggcacg ggtagtgagg ttacgaatat ttctatcgca 420 gaaataaaaa gccgtcacac caaaatgggt ttggctgacg atgctattgt ggcggaccac 480 gccattatca tccctgaact tctgaaaagc ctgcctttcc atttctacgc gtgcagtgca 540 atagatgctc tgatccatgc cattgagtca tacgtgtcgc caaaagctag tccatatagc 600 cgtctgttct ctgaggccgc ttgggacatt atcctggaag tttttaaaaa aatcgccgag 660 catggccctg agtatcgctt tgaaaagctg ggagaaatga tcatggcgag caattatgcg 720 ggtatagcct ttggcaatgc aggagtaggc gccgtccacg cactatccta cccgttggga 780 ggcaattatc atgttccgca tggtgaagca aactatcagt ttttcaccga ggtgttcaag 840 gtgtaccaga agaaaaatcc gtttgggtac attgtcgaac tcaactggaa attatctaaa 900 atactgaact gccagccaga atatgtctat ccgaagctgg atgaattact gggctgcctg 960 cttaccaaga agcctttgca cgaatatggc atgaaggacg aggaggtacg agggtttgcg 1020 gaatcagtcc ttaaaacaca gcaacggttg ctcgccaata attacgttga gcttactgta 1080 gatgagatcg agggtatata cagacggctc tattaa 1116 <210> 5 <211> 1575 <212> DNA <213> Clostridium propionicum <220> <221> gene <222> (1)..(1575) <223> popionyl-CoA transferase <400> 5 atgagaaagg ttcccattat taccgcagat gaggctgcaa agcttattaa agacggtgat 60 acagttacaa caagtggttt cgttggaaat gcaatccctg aggctcttga tagagctgta 120 gaaaaaagat tcttagaaac aggcgaaccc aaaaacatta cctatgttta ttgtggttct 180 caaggtaaca gagacggaag aggtgctgag cactttgctc atgaaggcct tttaaaacgt 240 tacatcgctg gtcactgggc tacagttcct gctttgggta aaatggctat ggaaaataaa 300 atggaagcat ataatgtatc tcagggtgca ttgtgtcatt tgttccgtga tatagcttct 360 cataagccag gcgtatttac aaaggtaggt atcggtactt tcattgaccc cagaaatggc 420 ggcggtaaag taaatgatat taccaaagaa gatattgttg aattggtaga gattaagggt 480 caggaatatt tattctaccc tgcttttcct attcatgtag ctcttattcg tggtacttac 540 gctgatgaaa gcggaaatat cacatttgag aaagaagttg ctcctctgga aggaacttca 600 gtatgccagg ctgttaaaaa cagtggcggt atcgttgtag ttcaggttga aagagtagta 660 aaagctggta ctcttgaccc tcgtcatgta aaagttccag gaatttatgt tgactatgtt 720 gttgttgctg acccagaaga tcatcagcaa tctttagatt gtgaatatga tcctgcatta 780 tcaggcgagc atagaagacc tgaagttgtt ggagaaccac ttcctttgag tgcaaagaaa 840 gttattggtc gtcgtggtgc cattgaatta gaaaaagatg ttgctgtaaa tttaggtgtt 900 ggtgcgcctg aatatgtagc aagtgttgct gatgaagaag gtatcgttga ttttatgact 960 ttaactgctg aaagtggtgc tattggtggt gttcctgctg gtggcgttcg ctttggtgct 1020 tcttataatg cggatgcatt gatcgatcaa ggttatcaat tcgattacta tgatggcggc 1080 ggcttagacc tttgctattt aggcttagct gaatgcgatg aaaaaggcaa tatcaacgtt 1140 tcaagatttg gccctcgtat cgctggttgt ggtggtttca tcaacattac acagaataca 1200 cctaaggtat tcttctgtgg tactttcaca gcaggtggct taaaggttaa aattgaagat 1260 ggcaaggtta ttattgttca agaaggcaag cagaaaaaat tcttgaaagc tgttgagcag 1320 attacattca atggtgacgt tgcacttgct aataagcaac aagtaactta tattacagaa 1380 agatgcgtat tccttttgaa ggaagatggt ttgcacttat ctgaaattgc acctggtatt 1440 gatttgcaga cacagattct tgacgttatg gattttgcac ctattattga cagagatgca 1500 aacggccaaa tcaaattgat ggacgctgct ttgtttgcag aaggcttaat gggtctgaag 1560 gaaatgaagt cctaa 1575 <210> 6 <211> 524 <212> PRT <213> Clostridium propionicum <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(524) <223> propionyl-CoA transferase <400> 6 Met Arg Lys Val Pro Ile Ile Thr Ala Asp Glu Ala Ala Lys Leu Ile 1 5 10 15 Lys Asp Gly Asp Thr Val Thr Thr Ser Gly Phe Val Gly Asn Ala Ile 20 25 30 Pro Glu Ala Leu Asp Arg Ala Val Glu Lys Arg Phe Leu Glu Thr Gly 35 40 45 Glu Pro Lys Asn Ile Thr Tyr Val Tyr Cys Gly Ser Gln Gly Asn Arg 50 55 60 Asp Gly Arg Gly Ala Glu His Phe Ala His Glu Gly Leu Leu Lys Arg 65 70 75 80 Tyr Ile Ala Gly His Trp Ala Thr Val Pro Ala Leu Gly Lys Met Ala 85 90 95 Met Glu Asn Lys Met Glu Ala Tyr Asn Val Ser Gln Gly Ala Leu Cys 100 105 110 His Leu Phe Arg Asp Ile Ala Ser His Lys Pro Gly Val Phe Thr Lys 115 120 125 Val Gly Ile Gly Thr Phe Ile Asp Pro Arg Asn Gly Gly Gly Lys Val 130 135 140 Asn Asp Ile Thr Lys Glu Asp Ile Val Glu Leu Val Glu Ile Lys Gly 145 150 155 160 Gln Glu Tyr Leu Phe Tyr Pro Ala Phe Pro Ile His Val Ala Leu Ile 165 170 175 Arg Gly Thr Tyr Ala Asp Glu Ser Gly Asn Ile Thr Phe Glu Lys Glu 180 185 190 Val Ala Pro Leu Glu Gly Thr Ser Val Cys Gln Ala Val Lys Asn Ser 195 200 205 Gly Gly Ile Val Val Val Gln Val Glu Arg Val Val Lys Ala Gly Thr 210 215 220 Leu Asp Pro Arg His Val Lys Val Pro Gly Ile Tyr Val Asp Tyr Val 225 230 235 240 Val Val Ala Asp Pro Glu Asp His Gln Gln Ser Leu Asp Cys Glu Tyr 245 250 255 Asp Pro Ala Leu Ser Gly Glu His Arg Arg Pro Glu Val Val Gly Glu 260 265 270 Pro Leu Pro Leu Ser Ala Lys Lys Val Ile Gly Arg Arg Gly Ala Ile 275 280 285 Glu Leu Glu Lys Asp Val Ala Val Asn Leu Gly Val Gly Ala Pro Glu 290 295 300 Tyr Val Ala Ser Val Ala Asp Glu Glu Gly Ile Val Asp Phe Met Thr 305 310 315 320 Leu Thr Ala Glu Ser Gly Ala Ile Gly Gly Val Pro Ala Gly Gly Val 325 330 335 Arg Phe Gly Ala Ser Tyr Asn Ala Asp Ala Leu Ile Asp Gln Gly Tyr 340 345 350 Gln Phe Asp Tyr Tyr Asp Gly Gly Gly Leu Asp Leu Cys Tyr Leu Gly 355 360 365 Leu Ala Glu Cys Asp Glu Lys Gly Asn Ile Asn Val Ser Arg Phe Gly 370 375 380 Pro Arg Ile Ala Gly Cys Gly Gly Phe Ile Asn Ile Thr Gln Asn Thr 385 390 395 400 Pro Lys Val Phe Phe Cys Gly Thr Phe Thr Ala Gly Gly Leu Lys Val 405 410 415 Lys Ile Glu Asp Gly Lys Val Ile Ile Val Gln Glu Gly Lys Gln Lys 420 425 430 Lys Phe Leu Lys Ala Val Glu Gln Ile Thr Phe Asn Gly Asp Val Ala 435 440 445 Leu Ala Asn Lys Gln Gln Val Thr Tyr Ile Thr Glu Arg Cys Val Phe 450 455 460 Leu Leu Lys Glu Asp Gly Leu His Leu Ser Glu Ile Ala Pro Gly Ile 465 470 475 480 Asp Leu Gln Thr Gln Ile Leu Asp Val Met Asp Phe Ala Pro Ile Ile 485 490 495 Asp Arg Asp Ala Asn Gly Gln Ile Lys Leu Met Asp Ala Ala Leu Phe 500 505 510 Ala Glu Gly Leu Met Gly Leu Lys Glu Met Lys Ser 515 520 <210> 7 <211> 1677 <212> DNA <213> Pseudomonas sp. 6-19 <220> <221> gene <222> (1)..(1677) <223> PHA synthase <400> 7 atgagtaaca agagtaacga tgagttgaag tatcaagcct ctgaaaacac cttggggctt 60 aatcctgtcg ttgggctgcg tggaaaggat ctactggctt ctgctcgaat ggtgcttagg 120 caggccatca agcaaccggt gcacagcgtc aaacatgtcg cgcactttgg tcttgaactc 180 aagaacgtac tgctgggtaa atccgggctg caaccgacca gcgatgaccg tcgcttcgcc 240 gatccggcct ggagccagaa cccgctctat aaacgttatt tgcaaaccta cctggcgtgg 300 cgcaaggaac tccacgactg gatcgatgaa agtaacctcg cccccaagga tgtggcgcgt 360 gggcacttcg tgatcaacct catgaccgaa gcgatggcgc cgaccaacac cgcggccaac 420 ccggcggcag tcaaacgctt ttttgaaacc ggtggcaaaa gcctgctcga cggcctctcg 480 cacctggcca aggatctggt acacaacggc ggcatgccga gccaggtcaa catgggtgca 540 ttcgaggtcg gcaagagcct gggcgtgacc gaaggcgcgg tggtgtttcg caacgatgtg 600 ctggaactga tccagtacaa gccgaccacc gagcaggtat acgaacgccc gctgctggtg 660 gtgccgccgc agatcaacaa gttctacgtt ttcgacctga gcccggacaa gagcctggcg 720 cggttctgcc tgcgcaacaa cgtgcaaacg ttcatcgtca gctggcgaaa tcccaccaag 780 gaacagcgag agtggggcct gtcgacctac atcgaagccc tcaaggaagc ggttgacgtc 840 gttaccgcga tcaccggcag caaagacgtg aacatgctcg gggcctgctc cggcggcatc 900 acttgcactg cgctgctggg ccattacgcg gcgattggcg aaaacaaggt caacgccctg 960 accttgctgg tgagcgtgct tgataccacc ctcgacagcg acgtcgccct gttcgtcaat 1020 gaacagaccc ttgaagccgc caagcgccac tcgtaccagg ccggcgtact ggaaggccgc 1080 gacatggcga aggtcttcgc ctggatgcgc cccaacgatc tgatctggaa ctactgggtc 1140 aacaattacc tgctaggcaa cgaaccgccg gtgttcgaca tcctgttctg gaacaacgac 1200 accacacggt tgcccgcggc gttccacggc gacctgatcg aactgttcaa aaataaccca 1260 ctgattcgcc cgaatgcact ggaagtgtgc ggcaccccca tcgacctcaa gcaggtgacg 1320 gccgacatct tttccctggc cggcaccaac gaccacatca ccccgtggaa gtcctgctac 1380 aagtcggcgc aactgtttgg cggcaacgtt gaattcgtgc tgtcgagcag cgggcatatc 1440 cagagcatcc tgaacccgcc gggcaatccg aaatcgcgct acatgaccag caccgaagtg 1500 gcggaaaatg ccgatgaatg gcaagcgaat gccaccaagc atacagattc ctggtggctg 1560 cactggcagg cctggcaggc ccaacgctcg ggcgagctga aaaagtcccc gacaaaactg 1620 ggcagcaagg cgtatccggc aggtgaagcg gcgccaggca cgtacgtgca cgaacgg 1677 <210> 8 <211> 559 <212> PRT <213> Pseudomonas sp. 6-19 <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(559) <223> PHA synthase <400> 8 Met Ser Asn Lys Ser Asn Asp Glu Leu Lys Tyr Gln Ala Ser Glu Asn 1 5 10 15 Thr Leu Gly Leu Asn Pro Val Val Gly Leu Arg Gly Lys Asp Leu Leu 20 25 30 Ala Ser Ala Arg Met Val Leu Arg Gln Ala Ile Lys Gln Pro Val His 35 40 45 Ser Val Lys His Val Ala His Phe Gly Leu Glu Leu Lys Asn Val Leu 50 55 60 Leu Gly Lys Ser Gly Leu Gln Pro Thr Ser Asp Asp Arg Arg Phe Ala 65 70 75 80 Asp Pro Ala Trp Ser Gln Asn Pro Leu Tyr Lys Arg Tyr Leu Gln Thr 85 90 95 Tyr Leu Ala Trp Arg Lys Glu Leu His Asp Trp Ile Asp Glu Ser Asn 100 105 110 Leu Ala Pro Lys Asp Val Ala Arg Gly His Phe Val Ile Asn Leu Met 115 120 125 Thr Glu Ala Met Ala Pro Thr Asn Thr Ala Ala Asn Pro Ala Ala Val 130 135 140 Lys Arg Phe Phe Glu Thr Gly Gly Lys Ser Leu Leu Asp Gly Leu Ser 145 150 155 160 His Leu Ala Lys Asp Leu Val His Asn Gly Gly Met Pro Ser Gln Val 165 170 175 Asn Met Gly Ala Phe Glu Val Gly Lys Ser Leu Gly Val Thr Glu Gly 180 185 190 Ala Val Val Phe Arg Asn Asp Val Leu Glu Leu Ile Gln Tyr Lys Pro 195 200 205 Thr Thr Glu Gln Val Tyr Glu Arg Pro Leu Leu Val Val Pro Pro Gln 210 215 220 Ile Asn Lys Phe Tyr Val Phe Asp Leu Ser Pro Asp Lys Ser Leu Ala 225 230 235 240 Arg Phe Cys Leu Arg Asn Asn Val Gln Thr Phe Ile Val Ser Trp Arg 245 250 255 Asn Pro Thr Lys Glu Gln Arg Glu Trp Gly Leu Ser Thr Tyr Ile Glu 260 265 270 Ala Leu Lys Glu Ala Val Asp Val Val Thr Ala Ile Thr Gly Ser Lys 275 280 285 Asp Val Asn Met Leu Gly Ala Cys Ser Gly Gly Ile Thr Cys Thr Ala 290 295 300 Leu Leu Gly His Tyr Ala Ala Ile Gly Glu Asn Lys Val Asn Ala Leu 305 310 315 320 Thr Leu Leu Val Ser Val Leu Asp Thr Thr Leu Asp Ser Asp Val Ala 325 330 335 Leu Phe Val Asn Glu Gln Thr Leu Glu Ala Ala Lys Arg His Ser Tyr 340 345 350 Gln Ala Gly Val Leu Glu Gly Arg Asp Met Ala Lys Val Phe Ala Trp 355 360 365 Met Arg Pro Asn Asp Leu Ile Trp Asn Tyr Trp Val Asn Asn Tyr Leu 370 375 380 Leu Gly Asn Glu Pro Pro Val Phe Asp Ile Leu Phe Trp Asn Asn Asp 385 390 395 400 Thr Thr Arg Leu Pro Ala Ala Phe His Gly Asp Leu Ile Glu Leu Phe 405 410 415 Lys Asn Asn Pro Leu Ile Arg Pro Asn Ala Leu Glu Val Cys Gly Thr 420 425 430 Pro Ile Asp Leu Lys Gln Val Thr Ala Asp Ile Phe Ser Leu Ala Gly 435 440 445 Thr Asn Asp His Ile Thr Pro Trp Lys Ser Cys Tyr Lys Ser Ala Gln 450 455 460 Leu Phe Gly Gly Asn Val Glu Phe Val Leu Ser Ser Ser Gly His Ile 465 470 475 480 Gln Ser Ile Leu Asn Pro Pro Gly Asn Pro Lys Ser Arg Tyr Met Thr 485 490 495 Ser Thr Glu Val Ala Glu Asn Ala Asp Glu Trp Gln Ala Asn Ala Thr 500 505 510 Lys His Thr Asp Ser Trp Trp Leu His Trp Gln Ala Trp Gln Ala Gln 515 520 525 Arg Ser Gly Glu Leu Lys Lys Ser Pro Thr Lys Leu Gly Ser Lys Ala 530 535 540 Tyr Pro Ala Gly Glu Ala Ala Pro Gly Thr Tyr Val His Glu Arg 545 550 555 <210> 9 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 cagaacatgg tccggcaatg cgaaggcgga acctacgctg gtggaaaata attaaccctc 60 actaaagggc gg 72 <210> 10 <211> 71 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 ccgctcccgc acgaacactt ccggtcaccg tgacagcagc aatgcgcgag tacgactcac 60 tatagggctc g 71 <210> 11 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 ccactggccg aagcgaaagg cgaaatcagc tacgcccctc ctttattgaa attaaccctc 60 actaaagggc gg 72 <210> 12 <211> 71 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 ccgaccgcgc ccgccgaacc ggtgaccacg ttaaataccc cagccggaac tacgactcac 60 tatagggctc g 71 <210> 13 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 gagagacaat caaatcatga gtaacaagag taacg 35 <210> 14 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 cactcatgca agcgtcaccg ttcgtgcacg tac 33 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 15 atgcccggag ccggttcgaa 20 <210> 16 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 16 cgttactctt gttactcatg atttgattgt ctctc 35 <210> 17 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 17 gagagacaat caaatcatga gtaacaagag taacg 35 <210> 18 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 18 cactcatgca agcgtcaccg ttcgtgcacg tac 33 <210> 19 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 19 gtacgtgcac gaacggtgac gcttgcatga gtg 33 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 20 aacgggaggg aacctgcagg 20 <210> 21 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 21 ctgaccttgc tggtgaccgt gcttgatacc acc 33 <210> 22 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 22 ggtggtatca agcacggtca ccagcaaggt cag 33 <210> 23 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 23 cgagcagcgg gcatatcatg agcatcctga acccgc 36 <210> 24 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 24 gcgggttcag gatgctcatg atatgcccgc tgctcg 36 <210> 25 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 25 atcaacctca tgaccgatgc gatggcgccg acc 33 <210> 26 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 26 ggtcggcgcc atcgcatcgg tcatgaggtt gat 33 <210> 27 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 27 ggaattcatg agaaaggttc ccattattac cgcagatga 39 <210> 28 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 28 gctctagatt aggacttcat ttccttcaga cccattaagc cttctg 46 <210> 29 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 29 aggcctgcag gcggataaca atttcacaca gg 32 <210> 30 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 30 gcccatatgt ctagattagg acttcatttc c 31 <210> 31 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 31 cgccggcagg cctgcagg 18 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 32 ggcaggtcag cccatatgtc 20 <210> 33 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 33 gaattcgtgc tgtcgagccg cgggcatatc 30 <210> 34 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 34 gatatgcccg cggctcgaca gcacgaattc 30 <210> 35 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 35 atgcccggag ccggttcgaa 20 <210> 36 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 36 gaaattgtta tccgcctgca gg 22 <210> 37 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 37 agcttgcatg caatggaaat taaggaaatg 30 <210> 38 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 38 gacactcatg caagcgttag agctcccaga tttc 34 <210> 39 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 39 aggagcatct tacatgcaac tgttcaaact 30 <210> 40 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 40 acccggggat ccttaataga gccgtctgta t 31 <210> 41 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UTR27 <400> 41 acagggtgtg aaaggagcat cttac 25 <210> 42 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 42 cttgcatgag tgtctagaac agggtgtgaa 30 <210> 43 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 43 agaacagggt gtgaaaggag catcttacat 30

Claims

숙시네이트 세미알데하이드 디하이드로게나제(succinate semialdehyde dehydrogenase)를 코딩하는 내생의 유전자 sad 및 gabD 가 결손 또는 약화되고,
숙시네이트 세미알데하이드 디하이드로게나제(succinate semialdehyde dehydrogenase)를 코딩하는 sucD 유전자, 4-하이드록시부티레이트 디하이드로게나제(4-hydroxybutyrate dehydrogenase) 를 코딩하는 4hbD 유전자, 락테이트를 락틸-CoA로 전환하고 4-하이드록시알카노에트를 4-하이드록시알카노일-CoA로 전환하는 효소를 코딩하는 유전자, 및 락틸-CoA 및 4-하이드록시알카노일-CoA 를 기질로 사용하는 폴리하이드록시알카노에트(polyhydroxyalkanoate: PHA) 합성효소를 코딩하는 유전자가 도입 또는 강화되어 있고,
외부에서 4-하이드록시부티레이트 또는 이의 전구체가 첨가되지 않는 환경에서 글루코즈를 탄소원으로 하여 락테이트 및 4-하이드록시부티레이트를 반복단위로 포함하는 중합체를 생산할 수 있는 미생물.
제1항에 있어서, 상기 락테이트를 락틸-CoA로 전환하고 4-하이드록시알카노에트를 4-하이드록시알카노일-CoA로 전환하는 효소는, 프로피오닐-CoA 트랜스퍼라아제인 미생물.
제1항에 있어서, 상기 락테이트를 락틸-CoA로 전환하고 4-하이드록시알카노에트를 4-하이드록시알카노일-CoA로 전환하는 효소를 코딩하는 유전자는,
(a) 서열번호 5의 염기서열;
(b) 서열번호 5의 염기서열에서 A1200G가 변이된 염기서열;
(c) 서열번호 5의 염기서열에서 T78C, T669C, A1125G 및 T1158C가 변이된 염기서열;
(d) 서열번호 5와 대응하는 아미노산 서열에서 Gly335Asp이 변이되고, 서열번호 5의 염기서열에서 A1200G가 변이된 염기서열;
(e) 서열번호 5와 대응하는 아미노산 서열에서 Ala243Thr이 변이되고, 서열번호 5의 염기서열에서 A1200G가 변이된 염기서열;
(f) 서열번호 5와 대응하는 아미노산 서열에서 Asp65Gly이 변이되고, 서열번호 5 의 염기서열에서 T669C, A1125G 및 T1158C가 변이된 염기서열;
(g) 서열번호 5와 대응하는 아미노산 서열에서 Asp257Asn이 변이되고, 서열번호 5의 염기서열에서 A1200G가 변이된 염기서열;
(h) 서열번호 5와 대응하는 아미노산 서열에서 Asp65Asn이 변이되고, 서열번호 5의 염기서열에서 T669C, A1125G 및 T1158C가 변이된 염기서열;
(i) 서열번호 5와 대응하는 아미노산 서열에서 Thr199Ile이 변이되고, 서열번호 5의 염기서열에서 T669C, A1125G 및 T1158C가 변이된 염기서열; 및
(j) 서열번호 5의 염기서열에서 T78C, T669C, A1125G 및 T1158C가 변이되고, 서열번호 5와 대응하는 아미노산 서열에서 Val193Ala이 변이된 염기서열
로 이루어진 군으로부터 선택된 염기서열로 이루어진 것인 미생물.
제1항에 있어서, 상기 폴리하이드록시알카노에트 합성효소는, 슈도모나스 속 (Pseudomonas sp.) 6-19 유래의 폴리하이드록시알카노에트 합성효소인 미생물.
제1항에 있어서, 상기 폴리하이드록시알카노에트 합성효소를 코딩하는 유전자는,
서열번호 8의 아미노산 서열; 또는
서열번호 8의 아미노산 서열에서 L18H, V24A, K91R, M128V, E130D, N246S, S325T, S477R, S477H, S477F, S477Y, S477G, Q481M, Q481K, Q481R 및 A527S로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 변이를 포함하는 아미노산 서열에 대응하는 염기 서열로 이루어진 것인 미생물.
제1항에 있어서, 상기 폴리하이드록시알카노에트 합성효소를 코딩하는 유전자는,
서열번호 8의 아미노산 서열에서,
(i) S325T 및 Q481M;
(ii) E130D, S325T 및 Q481M;
(iii) E130D, S325T, S477R 및 Q481M;
(iv) E130D, S477F 및 Q481K; 및
(v) L18H, V24A, K91R, M128V, E130D, N246S, S325T, S477G, Q481K 및 A527S로 이루어진 군으로부터 선택되는 변이를 포함하는 아미노산 서열에 대응하는 염기 서열로 이루어진 것인 미생물.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 미생물을, 4-하이드록시부티레이트 또는 이의 전구체를 포함하지 않고 글루코즈를 포함하는 배지에서 배양하는 단계를 포함하는,
락테이트 및 4-하이드록시부티레이트를 반복단위로 포함하는 중합체를 생산하는 방법.