CN110382699B - 使用2-羟基异己酸-CoA转移酶生成聚羟基链烷酸酯的方法 - Google Patents

使用2-羟基异己酸-CoA转移酶生成聚羟基链烷酸酯的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及重组微生物，所述重组微生物导入有编码2‑羟基异己酸‑CoA转移酶的基因和编码聚羟基链烷酸合酶的基因并且具有生成带有芳香族单体或长链2‑HA单体的聚羟基链烷酸酯的潜力，并且涉及使用所述重组微生物生成带有芳香族单体或长链2‑HA单体的聚羟基链烷酸酯的方法。根据本发明，可以生成带有芳香族单体或长链2‑HA单体的可生物降解的聚合物。

Description

使用2-羟基异己酸-CoA转移酶生成聚羟基链烷酸酯的方法
【技术领域】
本发明涉及生成具有芳香族单体或长链2-羟基链烷酸酯(2-HA)单体的聚羟基链烷酸酯的方法。更具体地，本发明涉及重组微生物，所述重组微生物导入了编码2-羟基异己酸-CoA转移酶的基因和编码聚羟基链烷酸酯合酶的基因并且能够生成具有芳香族单体或长链2-羟基链烷酸酯(2-HA)单体的聚羟基链烷酸酯，并且涉及使用所述重组微生物生成具有芳香族单体或长链2-HA单体的聚羟基链烷酸酯的方法。
【背景技术】
聚羟基链烷酸酯(PHA)是由各种微生物合成的生物聚酯。这些聚合物是可生物降解的和生物相容的热塑性材料，可用于各种工业生物医学应用(因为其性质类似于石油基聚合物)，并且由可再生资源生成(Lee,S.Y.Biotechnol.Bioeng.49:1 1996)。
PHA分为具有短碳数的短链长度PHA和具有长碳数的中链长度PHA，其取决于侧链的长度。通过重组微生物合成了各种PHA，所述重组微生物通过克隆来源于微生物(例如真养雷氏菌(Ralstonia eutropha)，假单胞菌属(Pseudomonas)和芽孢杆菌属(Bacillus))的PHA合成基因生成(Qi等人.,FEMS Microbiol.Lett.,157:155,1997；Qi等人.,FEMSMicrobiol.Lett.,167:89,1998；Langenbach等人.,FEMS Microbiol.Lett.,150:303,1997；WO 01/55436；US 6,143,952；WO 98/54329；WO 99/61624)。
具有短侧链的PHA(例如PHB，其是R-3-羟基丁酸的同聚物)是晶体的热塑性材料，并且由于其低弹性而容易断裂。另一方面，具有长侧链的MCL-PHA具有更高的弹性。PHB大约在70年前首次被人们所知(Lemoigne&Roukhelman,1925)。另一方面，MCL-PHA相对近期被人们所知(deSmet等人.,J.Bacteriol.154:870-78 1983)。这些共聚物可以由聚(3HB-共-3-HX)表示，其中X代表3-羟基链烷酸酯，或具有6个或更多个碳原子的链烷酸酯或链烯酸酯。两种特定单体的共聚物的特定实例是聚(3HB-共-3-羟基己酸酯)(Brandl等人.,Int.J.Biol.Macromol.11:49,1989；Amos&McInerney,Arch.Microbiol.,155:103,1991；US5,292,860)。
PHA的生物合成包括通过CoA-转移酶或CoA-连接酶将羟基酸转化为羟基酰基-CoA，并使用PHA合酶使转化的羟基酰基-CoA聚合。在天然PHA合酶的情况下，2-羟基酰基-CoA的活性远低于3-羟基酰基-CoA的活性。然而，最近，本发明人开发了基因工程改造的假单胞菌属物种(Pseudomonas sp.)6-19的PHA合酶(PhaC1ps6-19)以使用乳酰-CoA(一种2-羟基酰基-CoA)作为底物(WO 08/062996；Yang等人.,Biotechnol.Bioeng.,105:150,2010；Jung等人.,Biotechnol.Bioeng.,105:161,2010)。PhaC1ps6-19具有广泛的底物特异性，并且可以使用乳酰-CoA(一种2-羟基酰基-CoA)作为底物。因此，通过开发将各种2-羟基酸转化为2-羟基酰基-CoA的体系，将使合成含有不同类型的2-羟基酸的新PHA成为可能。
因此，本发明人已经进行了深入的努力以开发用于生物合成含有2-羟基酸的PHA的新方法。作为结果，本发明人发现，当使用乙酰-CoA筛选将2-羟基酸转化为2-羟基酰基-CoA的酶并使用所述酶时，可以在体外条件下生成各种种类的2-羟基酰基-CoA，并且使用其来生成各种PHA。基于此发现，完成本发明。
【发明内容】
【技术问题】
因此，本发明的一个目的是提供重组微生物，其能够生成具有芳香族单体或长链2-羟基链烷酸酯(2-HA)单体的聚羟基链烷酸酯。
本发明的另一个目的是提供使用所述重组微生物生成具有芳香族单体或长链2-HA单体的聚羟基链烷酸酯的方法。
【技术方案】
根据本发明的一个方面，提供了重组微生物，其通过将编码2-羟基异己酸-CoA转移酶的基因和编码聚羟基链烷酸酯合酶的基因导入能够从碳源生成乙酰-CoA的微生物获得，其中所述重组微生物能够生成具有芳香族单体或长链2-羟基链烷酸酯(2-HA)单体的聚羟基链烷酸酯。
根据本发明的另一方面，提供生成具有芳香族单体或长链2-羟基链烷酸酯(2-HA)单体的聚羟基链烷酸酯的方法，所述方法包括(a)培养所述重组微生物以生成具有芳香族单体或长链2-羟基链烷酸酯(2-HA)单体的聚羟基链烷酸酯；和(b)回收所生成的具有芳香族单体或长链2-羟基链烷酸酯(2-HA)单体的聚羟基链烷酸酯。
根据本发明的另一方面，提供了重组微生物，其通过在能够从碳源生成乙酰-CoA的微生物中扩增以下基因获得：编码2-羟基异己酸-CoA转移酶的基因、编码聚羟基链烷酸合酶的基因、编码3-脱氧-D-阿拉伯-庚酮糖酸-7-磷酸(DAHP)合酶的基因、编码分支酸变位酶/预苯酸脱氢酶的基因、和编码D-乳酸脱氢酶的基因，其中所述重组微生物能够生成具有苯基乳酸酯作为单体的聚羟基链烷酸酯。
根据本发明的另一方面，提供生成具有苯基乳酸酯作为单体的聚羟基链烷酸酯的方法，所述方法包括：(a)培养所述重组微生物以生成具有苯基乳酸酯作为单体的聚羟基链烷酸酯；和(b)回收所生成的具有苯基乳酸酯作为单体的聚羟基链烷酸酯。
根据本发明的另一方面，提供了重组微生物，其通过在能够从碳源生成乙酰-CoA的微生物中扩增以下基因获得：编码2-羟基异己酸-CoA转移酶的基因、编码聚羟基链烷酸合酶的基因、编码3-脱氧-D-阿拉伯-庚酮糖酸-7-磷酸(DAHP)合酶的基因、编码分支酸变位酶/预苯酸脱氢酶的基因、编码D-乳酸脱氢酶的基因、编码羟基扁桃酸合酶的基因、编码羟基扁桃酸氧化酶的基因、和编码D-扁桃酸脱氢酶的基因，其中所述重组微生物能够生成具有扁桃酸酯作为单体的聚羟基链烷酸酯。
根据本发明的另一个方面，提供生成具有扁桃酸酯作为单体的聚羟基链烷酸酯的方法，所述方法包括：(a)培养所述重组微生物以生成具有扁桃酸酯作为单体的聚羟基链烷酸酯；和(b)回收所生成的具有扁桃酸酯作为单体的聚羟基链烷酸酯。
【附图说明】
现在将详细参考本发明的优选实施方案，其实施例在附图中阐明。只要有可能，在整个附图中将使用相同的附图标记来指代相同或相似的部分。
图1显示根据本发明的芳香族聚酯的生物合成代谢途径，其中图1A显示当使用FldA(肉桂酰-CoA:苯基乳酸酯CoA-转移酶)时的代谢途径，以及图1B显示当使用HadA(2-羟基异己酸-CoA转移酶)时的代谢途径；
图2显示HadA和FldA之间氨基酸序列同源性的比较结果；
图3A显示使用His标签纯化HadA的结果，以及图3B显示了关于HadA是否能够使用乙酰-CoA作为CoA供体的鉴定结果；
图4显示体外测定的结果，之后通过LC-MS分析鉴定HadA是否能够使用乙酰-CoA作为CoA供体将以下物质转化为相应的CoA衍生物：扁桃酸酯、4-羟基扁桃酸酯、苯基乳酸酯、4-羟基苯基乳酸酯、2-羟基-4-苯基丁酸酯、3-羟基-3-苯基丙酸酯和4-羟基苯甲酸；
图5显示了可以使用HadA执行的各种底物的CoA转化反应的分子式；
图6显示了根据为了增加D-苯基乳酸酯生成的计算机模拟(in-silico)基因组规模代谢通量分析的代谢工程分析结果；
图7显示由大肠杆菌XB201TBAL生成的聚(3HB-共-D-苯基乳酸酯)的分析结果；
图8显示由大肠杆菌XB201TBAL生成的聚(3HB-共-D-苯基乳酸酯-共-3-羟基-3-苯基丙酸酯)和聚(3HB-共-D-苯基乳酸酯-共-D-扁桃酸酯)的分析结果；
图9显示了大肠杆菌XB201TBAL菌株中聚(3HB-共-D-苯基乳酸酯)的生成的结果，所述菌株在具有不同强度的五种启动子下表达PhaAB；和
图10A和图10B显示，通过对MR培养基(含有3HB)中大肠杆菌XB201TBAL菌株(表达AroGfbr、PheAfbr、FldH、HadA和PhaC1437)进行补料分批发酵生成聚(3HB-共-D-苯基乳酸酯)的结果，图10C和图10D显示通过对大肠杆菌XB201TBAL菌株(在启动子BBa_J23114控制下表达AroGfbr、PheAfbr、FldH、HadA、PhaC1437和PhaAB)进行补料分批发酵(不添加3HB)生成聚(3HB-共-D-苯基乳酸酯)的结果，图10E和10F显示了通过对大肠杆菌XB201TBAF菌株(在启动子PhaC1437下表达AroGfbr、PheAfbr、FldH、HadA和PhaAB)进行补料分批发酵(不外部添加3HB)生成聚(3HB-共-D-苯基乳酸酯)的结果。
【具体实施方式】
除非另外定义，本文所用的全部技术和科学术语具有与本发明所属领域的技术人员所理解的意义相同的意义。通常，本文所用的命名法在本领域中为公知的并且为通常使用的。
芳香族聚酯是必不可少的塑料，其主要由石油生成。本发明建立了一种通过代谢工程改造的大肠杆菌(表达对芳香族单体有活性的聚羟基链烷酸酯(PHA)合酶和辅酶A(CoA)转移酶)从葡萄糖一步生成具有芳香族聚酯或长链2-羟基链烷酸酯作为单体的聚合物的方法。
在本发明的一个实施方案中，为了生成含有苯基乳酸酯的PHA作为芳香族聚酯，将肉桂酰-CoA:苯基乳酸酯CoA-转移酶(FldA)和4-香豆酸酯:CoA连接酶(4CL)(通过体外分析发现具有活性)与PHA合酶在生成D-苯基乳酸酯的大肠杆菌菌株中一起表达。使用体内生成的肉桂酰-CoA作为CoA供体，所述菌株制备出聚(16.8mol％D-乳酸酯-共-80.8mol％3HB-共-1.6mol％D-苯基乳酸酯-共-0.8mol％D-4-羟基苯基乳酸酯)聚合物，其量为干细胞重量的12.8wt％。
然而，由于苯基乳酸酯CoA-转移酶(FldA)的芳香族底物的利用范围非常窄，因此鉴定、选择并使用2-异己烯酰基-CoA:2-羟基异己酸酯CoA-转移酶(HadA)用于芳香族PHA的生成，HadA可使用乙酰-CoA作为CoA供体生成各种种类的芳香族羟基酰基CoA。为了大量生成含有高摩尔分数的D-苯基乳酸酯的芳香族PHA，首先设计最佳代谢途径以过量生成D-苯基乳酸酯单体。
在本发明的一个实施方案中，为了生成具有最适合生成D-苯基乳酸酯的代谢途径的代谢工程改造的大肠杆菌，根据计算机模拟基因组规模代谢通量分析，在tyrR缺陷的大肠杆菌中过表达抗反馈的aroG、pheA和fldH基因，缺失竞争性代谢途径(pflB、poxB、adhE和frdB)，并且进一步缺失tyrB和aspC基因。所述代谢工程改造的大肠杆菌生成1.62g/L的D-苯基乳酸酯。当HadA和PHA合酶在过量生成D-苯基乳酸酯的菌株中表达时，生成聚(52.1mol％3HB-共-47.9mol％D-苯基乳酸酯)，其量为干细胞重量的15.8wt％。并且，通过生成包含4-羟基苯基乳酸酯、扁桃酸酯和3-羟基-3-苯基丙酸酯的聚酯，证实了制备各种芳香族聚酯的潜力。
因此，一方面，本发明涉及重组微生物，其通过将编码2-羟基异己酸-CoA转移酶的基因和编码聚羟基链烷酸合酶的基因导入能够从碳源生成乙酰-CoA的微生物获得，其中所述重组微生物能够生成具有芳香族单体或长链2-羟基链烷酸酯(2-HA)单体的聚羟基链烷酸酯。
在本发明中，长链2-HA表示具有6至8个碳原子的2-羟基链烷酸酯。
在本发明中，芳香族单体或长链2-HA单体选自2-羟基异己酸酯、2-羟基己酸酯、2-羟基辛酸酯、苯基乳酸酯、2-羟基-4-苯基丁酸酯、3-羟基-3-苯基丙酸酯、4-羟基苯甲酸和扁桃酸酯。
在本发明中，所述聚羟基链烷酸合酶是衍生自选自以下的菌株的PHA合酶：真养雷氏菌(Ralstonia eutropha)、假单胞菌属(Pseudomonas)、芽孢杆菌属(Bacillus)和假单胞菌属物种(Pseudomonas sp.)6-19，或是具有选自以下氨基酸序列的PHA合酶的突变酶：
在SEQ ID NO:2的氨基酸序列中具有选自E130D、S325T、L412M、S477R、S477H、S477F、S477Y、S477G、Q481M、Q481K和Q481R的至少一个突变的氨基酸序列；
在SEQ ID NO:2的氨基酸序列中具有E130D、S325T、L412M、S477G和Q481M突变的氨基酸序列(C1335)；
在SEQ ID NO:2的氨基酸序列中具有E130D、S477F和Q481K突变的氨基酸序列(C1310)；和
在SEQ ID NO:2的氨基酸序列中具有E130D、S477F和Q481R突变的氨基酸序列(C1312)。
在本发明中，所述2-羟基异己酸-CoA转移酶可以是来源于艰难梭菌630(Clostridium difficile 630)的hadA。
在本发明中，所述2-羟基异己酸-CoA转移酶可以使用乙酰-CoA作为CoA供体。
可以进一步将编码参与3-羟基丁酰-CoA生物合成的β-酮硫解酶的基因和编码乙酰乙酰-CoA还原酶的基因导入本发明的微生物，以使所述微生物即使在无外部提供3HB的情况下也能生成聚合物。
另一方面，本发明涉及生成具有芳香族单体或长链2-羟基链烷酸酯(2-HA)单体的聚羟基链烷酸酯的方法，所述方法包括：(a)培养所述重组微生物以生成具有芳香族单体或长链2-羟基链烷酸酯(2-HA)单体的聚羟基链烷酸酯；和(b)回收所生成的具有芳香族单体或长链2-羟基链烷酸酯(2-HA)单体的聚羟基链烷酸酯。
在本发明的一个实施方案中，证实了用于合成聚羟基链烷酸酯的Pct(丙酰-CoA转移酶)是否能够分别用苯基乳酰-CoA和M扁桃酰-CoA活化苯基乳酸酯和扁桃酸酯。所述Pctcp突变体(Pct540)已成功应用于聚酯的体内生成，所述聚酯包括各种羟基酸，例如乙醇酸、乳酸、2-羟基丁酸、2-羟基异戊酸和2-羟基酸。因此，可以认为Pct540对于碳的数目和羟基位置具有宽的底物谱。然而，已经证实Pct540针对苯基乳酸酯和扁桃酸酯没有催化活性。因此，在本发明中，试图找到能够活化对应于芳香族化合物的CoA衍生物以生成芳香族共聚物的新型CoA-转移酶。
据报道，生孢梭菌(Clostridium sporogenes)的肉桂酰-CoA:苯基乳酸酯CoA-转移酶(FldA)能够使用肉桂酰-CoA作为CoA供体将苯基乳酸酯转化为苯基乳酰-CoA(Dickert,S.等人.,Eur.J.Biochem.267:3874,2000)。由于肉桂酰-CoA是大肠杆菌的非天然代谢产物，所以对衍生自肉毒梭菌(Clostridium botulinum)A菌株ATCC 3502的FldA(与生孢梭菌(C.sporogenes)的FldA具有99.0％的同源性)进行检测以确认乙酰-CoA(细胞中富含的代谢物)是否用作辅酶A供体。然而，发现肉毒杆菌A菌株ATCC 3502的FldA没有使用乙酰-CoA作为CoA供体来生成苯基乳酰-CoA的催化活性。
同时，已知天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)4-香豆酸酯:CoA连接酶(4CL)在苯丙素类代谢中起关键作用，所述代谢生成植物次生代谢产物的前体，如木质素、黄酮类和植物抗毒素(Kaneko,M.等人.,J.Bacteriol.,185:20,2003)。因此，在本发明的一个实施方案中，通过导入4CL设计用于从肉桂酸酯合成肉桂酰-CoA的生物合成途径。使用4CL突变体将肉桂酸酯转化为肉桂酰-CoA，并使用肉桂酰-CoA作为FldA的CoA供体以形成苯基乳酰-CoA。结果，通过4CL和FldA的连续体外反应成功合成了苯基乳酰-CoA。这些结果表明4CL和FldA可用于生成苯基乳酰-CoA和生成芳香族聚酯。类似地，可以证实通过4CL变体与FldA的连续体外反应，另一有希望的芳香族单体4-羟基苯基乳酸酯也转化为4-羟基苯基乳酰-CoA。
在非天然聚酯的生成中，重要的是针对相应的CoA底物的聚合选择PHA合酶的突变体。因此，为了研究各种PHA合酶的性能，假单胞菌属物种MBEL 6-19 PHA合酶(PhaCPs6-19)突变体在过表达AroGfbr、PAL、4CL、FldA和Pct540的大肠杆菌XL1-Blue中进行表达。将所述制备的重组菌株在补充有20g/L葡萄糖、1g/L D-苯基乳酸酯和1g/L 3-羟基丁酸(3HB)钠的MR培养基中培养。3-羟基丁酸(3HB)钠通过Pct540转化为3HB-CoA(PhaC的优选的底物)，并且将其加入以增强聚合物的生成，因为它允许生成足够量的PHA。表达其他PHA合酶突变体的大肠杆菌XL1-Blue可生成各种量的具有不同单体组成的聚(D-乳酸-共-3HB-共-D-苯基乳酸酯)。
作为上述实验的结果，在PhaC突变体中，具有四个氨基酸取代的PhaC1437(E130D、S325T、S477G和Q481K)生成聚(18.3mol％D-乳酸酯-共-76.9mol％3HB-共-4.8mol％D-苯基乳酸酯)，其量为干细胞重量的7.8％，这意味着PhaC1437是最合适的PhaC突变体。
接下来，在体内对大肠杆菌进行工程改造以从葡萄糖生成D-苯基乳酸酯。芳香族化合物的生物合成始于3-脱氧-D-阿拉伯-庚酮糖酸-7-磷酸(DAHP)的合成，其通过用DAHP合酶在磷酸烯醇丙酮酸(PEP)和赤藓糖-4-磷酸(E4P)之间进行缩合生成。将生成的DAHP转化为苯丙酮酸酯(PPA)，然后通过D-乳酸脱氢酶(FldH)将苯丙酮酸酯转化为D-苯基乳酸酯(图1)。已知芳香族化合物生物合成的代谢途径由各种抑制的机制以复杂的方式控制。由aroG编码的DAHP合酶和由pheA编码的分支酸变位酶/预苯酸脱氢酶的表达被L-苯丙氨酸抑制(Ribe,D.E.等人.,J.Bacteriol.127:1085,1976)。
在本发明中，构建抗反馈抑制的突变体AroGfbr[AroG(D146N)]和PheAfbr[PheA(T326P)]，以释放L-苯丙氨酸的反馈抑制(Zhou,H.Y.等人.,Bioresour.Technol.101:4151,2010；Kikuchi,Y.等人.,Appl.Environ.Microbiol.63:761,1997)。表达肉毒杆菌A菌株ATCC 3502的AroGfbr、PheAfbr和FldH的大肠杆菌XL1-Blue从15.2g/L葡萄糖生成0.372g/L的D-苯基乳酸酯。所述菌株的PAL、4CL、FldA、Pct540和PhaC1437的过表达使聚(16.8mol％D-乳酸酯-共-80.8mol％3HB-共-1.6mol％D-苯基乳酸酯-共-0.8mol％D-4-羟基苯基乳酸酯)增加至干细胞重量的12.8wt％。生成含有D-苯基乳酸酯的芳香族PHA方面存在两个问题。所述第一个问题是聚合物合成的效率和芳香族单体的含量非常低。这被认为是由于使用肉桂酰-CoA作为CoA供体的情况下FldA的低效率。所述第二个问题是芳香族PHA的单体谱非常窄。体外酶分析结果表明，FldA可以将CoA转移到苯基乳酸酯和4-羟基苯基乳酸酯，但不能将其转移到以下底物例如：扁桃酸酯、2-羟基-4-苯基丁酸酯、3-羟基-3-苯基丙酸酯和4-羟基苯甲酸。
为了解决这些问题，本发明使用乙酰-CoA作为CoA供体以找到具有广芳香族底物谱的酶。进行序列相似性分析以鉴定FldA的同源酶，并且筛选出艰难梭菌的2-异己烯酰基-CoA:2-羟基异己酸酯CoA-转移酶(HadA)，其与FldA(在具有不同的来源的各种FldA中)具有48％或更高氨基酸序列同一性(图2)。在本发明中，已经研究了HadA是否可以使用乙酰-CoA作为CoA供体，因为HadA是已知使用异己烯酰基-CoA作为CoA供体将CoA转化进入2-羟基异己酸酯的酶(图3)。有趣的是，体外酶分析的结果显示，使用乙酰-CoA作为CoA供体的情况下，HadA可以将苯基乳酸酯活化成苯基乳酰-CoA(图4)。
此外，体外分析后的LC-MS分析表明，HadA可以将以下化合物转化相应的CoA衍生物：扁桃酸酯、4-羟基扁桃酸酯、苯基乳酸酯、4-羟基苯基乳酸酯、2-羟基-4-苯基丁酸酯、3-羟基-3-苯基丙酸酯和4-羟基苯甲酸(图4和图5)。因此，使用乙酰-CoA作为CoA供体的情况下，HadA具有更有效地生成各种芳香族聚酯的潜力。
接下来，为了通过代谢工程增加芳香族单体的产量，通过对表达AroGfbr、PheAfbr和FldH的大肠杆菌XL1-Blue菌株(从葡萄糖生成少量(0.372g/L)D-苯基乳酸酯)进行代谢工程改造，所述得率有所提高。构建了表达AroGfbr、PheAfbr和FldH的大肠杆菌XBT菌株，其缺失TyrR(一种双重转录调控因子，可以进行调节以抑制芳香族氨基酸的生物合成)，所述大肠杆菌XBT菌株从16.4g/L的葡萄糖生成0.5g/L的D-苯基乳酸酯，因此显示出比没有缺失TyrR的大肠杆菌XL1-Blue菌株高30％的生产力。为了去除与D-苯基乳酸酯生物合成竞争的途径，通过从大肠杆菌XBT缺失poxB(编码丙酮酸氧化酶的基因)、pflB(编码丙酮酸甲酸裂解酶的基因)、adhE(编码乙醛脱氢酶/乙醇脱氢酶的基因)和frdB(编码富马酸还原酶的基因)来构建大肠杆菌XB201T。表达AroGfbr、PheAfbr和FldH的大肠杆菌菌株XB201T从15.7g/L葡萄糖生成0.55g/L的D-苯基乳酸酯，其显示出比大肠杆菌XBT的高10％的得率。
此外，进行根据计算机模拟基因组规模代谢通量分析的代谢工程分析以进一步增加D-苯基乳酸酯的生成(图6)。从大肠杆菌菌株XB201T中去除编码酪氨酸氨基转移酶的tyrB基因和编码天冬氨酸氨基转移酶的aspC基因，以减少L-苯丙氨酸的生物合成并从而增强碳向D-苯基乳酸酯的流动。结果，表达AroGfbr、PheAfbr和FldH的大肠杆菌菌株XB201TBA从18.5g/L葡萄糖生成1.62g/L的D-苯基乳酸酯，导致得率大幅增加，这相当于大肠杆菌XL1blue菌株生成的D-苯基乳酸酯的4.35倍。
当在含有20g/L葡萄糖和1g/L 3HB钠的培养基中培养大肠杆菌XB201TBAL(表达AroGfbr、PheAfbr、FldH、PhaC1437和HadA)时，生成聚(52.1mol％3HB-共-47.9mol％D-苯基乳酸酯)，其量为干细胞重量的15.8wt％(图7)。
另一方面，本发明涉及重组微生物，其通过将以下基因导入能够从碳源生成乙酰-CoA的微生物而获得：编码2-羟基异己酸-CoA转移酶的基因、编码聚羟基链烷酸合酶的基因，编码DAHP(3-脱氧-D-阿拉伯-庚酮糖酸-7-磷酸)合酶的基因、编码分支酸变位酶/预苯酸脱氢酶的基因、和编码D-乳酸脱氢酶的基因，其中所述重组微生物能够生成具有苯基乳酸酯作为单体的聚羟基链烷酸酯。
在本发明中，所述2-羟基异己酸-CoA转移酶可以是衍生自艰难梭菌630的HadA，并且聚羟基链烷酸合酶是衍生自选自以下的菌株的PHA合酶：真养雷氏菌、假单胞菌属、芽孢杆菌属和假单胞菌属物种6-19；或是具有选自以下氨基酸序列的PHA合酶的突变酶：
在SEQ ID NO:2的氨基酸序列中具有选自E130D、S325T、L412M、S477R、S477H、S477F、S477Y、S477G、Q481M、Q481K和Q481R的至少一个突变的氨基酸序列；
在SEQ ID NO:2的氨基酸序列中具有E130D、S325T、L412M、S477G和Q481M突变的氨基酸序列(C1335)；
在SEQ ID NO:2的氨基酸序列中具有E130D、S477F和Q481K突变的氨基酸序列(C1310)；和
在SEQ ID NO:2的氨基酸序列中具有E130D、S477F和Q481R突变的氨基酸序列(C1312)。
在本发明中，编码DAHP(3-脱氧-D-阿拉伯-庚酮糖酸-7-磷酸)合酶的基因是编码SEQ ID NO:8所示氨基酸序列的基因，编码分支酸变位酶/预苯酸脱氢酶的基因可以是编码SEQ ID NO:9所示氨基酸序列的基因，编码D-乳酸脱氢酶的基因可以是编码SEQ ID NO:10所示氨基酸序列的基因。
在本发明中，所述导入的编码D-乳酸脱氢酶的基因可以是替代ldhA基因的fldH基因。
本发明的微生物可以进一步导入参与3-羟基丁酰基-CoA生物合成的编码β-酮硫解酶的基因和编码乙酰乙酰基-CoA还原酶的基因，以使所述微生物即使在无外部补充3HB钠的情况下也能生成聚合物。
当在本发明中导入的编码β-酮硫解酶的基因(phaA)和编码乙酰乙酰-CoA还原酶的基因(phaB)的表达量通过启动子的强度(密度)来调节时，可以控制PHA中含有的D-苯基乳酸酯单体的摩尔分数。
在本发明的一个实施方案中，构建五种不同的质粒(以具有不同强度的五种类型的启动子表达phaA和phaB)，并将其导入到表达AroGfbr、PheAfbr、FldH、PhaC1437和HadA的XB201TBAL菌株中。证实，随着phaA和phaB表达降低，所述苯基乳酸酯单体的摩尔分数增加(图9A和图9B和表7)。这些结果表明，通过控制代谢通量可以生成具有各种摩尔分数的芳香族单体的芳香族聚酯。
在本发明中，所述重组微生物具有选自以下的至少一种基因的缺失：tyrR基因、编码丙酮酸氧化酶的基因、编码丙酮酸甲酸裂解酶的基因、编码乙醛脱氢酶的基因、编码富马酸还原酶的基因、编码酪氨酸氨基转移酶的基因和编码天冬氨酸氨基转移酶的基因。
另一方面，本发明涉及制备具有苯基乳酸酯作为单体的聚羟基链烷酸酯的方法，所述方法包括：(a)培养所述重组微生物以生成具有苯基乳酸酯作为单体的聚羟基链烷酸酯；和(b)回收所生成的具有苯基乳酸酯作为单体的聚羟基链烷酸酯。
为了鉴定上述方法是否可用于制备各种芳香族聚合物，使用扁桃酸酯作为单体进行实验。其原因在于，聚扁桃酸酯(扁桃酸酯的同聚物)是具有100℃的相对高Tg的耐热解聚合物，并且具有与聚苯乙烯类似的性能。聚扁桃酸酯是通过在石油工业中生成的扁桃酸酯的环状二聚体的开环聚合化学合成的。当在含有1g/L 3HB钠和0.5g/L D-扁桃酸酯的培养基中培养大肠杆菌XB201TBAL(表达AroGfbr、PheAfbr、FldH、PhaC1437和HadA)时，生成聚(55.2mol％3HB-共-43mol％D-苯基乳酸酯-共-1.8mol％D-扁桃酸酯)，其量为干细胞重量的11.6wt％(图8A和图8B)。在本发明中，使用D-扁桃酸酯作为底物成功生成含有D-扁桃酸酯的芳香族共聚物，然后通过代谢工程体内生成D-扁桃酸酯。在表达AroGfbr、PheAfbr、FldH、PhaC1437和HadA的大肠杆菌XB201TBAL中表达以下基因：衍生自东方拟无枝酸菌(Amycolatopsis orientalis)的羟基扁桃酸合酶(HmaS)、天蓝色链霉菌(S.coelicolor)的羟基扁桃酸氧化酶(Hmo)、禾本红酵母(Rhodotorula graminis)的D-扁桃酸脱氢酶(Dmd)，以从葡萄糖生成含有D-扁桃酸酯的芳香族共聚物。当在含有20g/L葡萄糖和1g/L 3HB钠的培养基中培养工程改造的菌株时，生成聚(92.9mol％of 3HB-共-6.3mol％D-苯基乳酸酯-共-0.8mol％D-扁桃酸酯)，其量为干细胞重量的16.4wt％。
另一方面，本发明涉及重组微生物，所述重组微生物通过将以下基因导入能够从碳源生成乙酰-CoA的微生物获得：编码2-羟基异己酸-CoA转移酶的基因、编码聚羟基链烷酸合酶的基因、编码DAHP(3-脱氧-D-阿拉伯-庚酮糖酸酯-7-磷酸酯)合酶的基因、编码分支酸变位酶/预苯酸脱氢酶的基因、编码D-乳酸脱氢酶的基因、编码羟基扁桃酸合酶的基因、编码羟基扁桃酸氧化酶的基因、和编码D-扁桃酸脱氢酶的基因，其中所述重组微生物能够生成具有扁桃酸酯作为单体的聚羟基链烷酸酯。
在本发明中，所述2-羟基异己酸-CoA转移酶可以是衍生自艰难梭菌630的hadA，并且聚羟基链烷酸合酶可以是衍生自选自以下的菌株的PHA合酶：真养雷氏菌、假单胞菌属、芽孢杆菌属和假单胞菌属物种6-19；或是具有选自以下氨基酸序列的PHA合酶的突变酶：
在SEQ ID NO:2的氨基酸序列中具有选自E130D、S325T、L412M、S477R、S477H、S477F、S477Y、S477G、Q481M、Q481K和Q481R的至少一个突变的氨基酸序列；
在SEQ ID NO:2的氨基酸序列中具有E130D、S325T、L412M、S477G和Q481M突变的氨基酸序列(C1335)；
在SEQ ID NO:2的氨基酸序列中具有E130D、S477F和Q481K突变的氨基酸序列(C1310)；和
在SEQ ID NO:2的氨基酸序列中具有E130D、S477F和Q481R突变的氨基酸序列(C1312)。
在本发明中，编码DAHP(3-脱氧-D-阿拉伯-庚酮糖酸-7-磷酸)合酶的基因可以是编码SEQ ID NO:8所示氨基酸序列的基因，编码分支酸变位酶/预苯酸脱氢酶的基因可以是编码SEQ ID NO:9所示氨基酸序列的基因，编码D-乳酸脱氢酶的基因可以是编码SEQ IDNO:10所示氨基酸序列的基因。
在本发明中，编码羟基扁桃酸合酶的基因可以是编码SEQ ID NO:11所示氨基酸序列的基因，编码羟基扁桃酸氧化酶的基因可以是编码SEQ ID NO:12所示氨基酸序列的基因，以及编码D-扁桃酸脱氢酶的基因可以是编码SEQ ID NO:13所示氨基酸序列的基因。
本发明的微生物可以进一步导入参与3-羟基丁酰基-CoA生物合成的编码β-酮硫解酶的基因和编码乙酰乙酰基-CoA还原酶的基因，以使所述微生物即使在无外部补充3HB钠的情况下也能生成聚合物。
另一方面，本发明涉及生成具有扁桃酸酯作为单体的聚羟基链烷酸酯的方法，所述方法包括：(a)培养所述重组微生物以生成具有扁桃酸酯作为单体的聚羟基链烷酸酯；和(b)回收所生成的具有扁桃酸酯作为单体的聚羟基链烷酸酯。
此外，在本发明中，为了证实使用本发明的重组菌株生成含有各种长链2-HA的聚羟基链烷酸酯的可能性，使用长链2-HA单体(例如2-羟基异己酸酯(2HIC)、2-羟基己酸酯(2HH)和2-羟基辛酸酯(2HO))作为单体对聚合物产率进行鉴定。结果，鉴定了以下：生成含有2-羟基异己酸酯、2-羟基己酸酯或2-羟基辛酸酯的共聚物，随着培养基中所含的2-HA浓度增加，所述共聚物中所含单体的摩尔分数增加(表4、表5和表6)。
因此，另一方面，本发明涉及生成聚羟基链烷酸酯的方法，所述聚羟基链烷酸酯具有选自2-羟基异己酸酯、2-羟基己酸酯和2-羟基辛酸酯的化合物作为单体，所述方法包括：(a)在含有选自2-羟基异己酸酯、2-羟基己酸酯和2-羟基辛酸酯的化合物的培养基中，培养能够生成具有芳香族单体或长链2-HA单体的聚羟基链烷酸酯的重组微生物；和(b)回收含有选自2-羟基异己酸酯、2-羟基己酸酯和2-羟基辛酸酯的化合物作为单体的聚羟基链烷酸酯。
在本发明中，使用3-羟基-3-苯基丙酸酯(3HPh)作为能够制备PHA的另一种芳香族单体来鉴定芳香族聚合物的生成。当在含有20g/L葡萄糖、0.5g/L 3-羟基-3-苯基丙酸和1g/L 3HB钠的培养基中培养大肠杆菌菌株XB201TBA时，生成聚(33.3mol％3HB-共-18mol％D-苯基乳酸酯-共-48.7mol％3HPh)，其量为干细胞重量的14.7wt％(图8C和图8D)。这些结果表明，本发明中开发的HadA和突变的PHA合成可广泛用于生成各种芳香族聚酯。
最后，对通过代谢工程改造的大肠杆菌生成的芳香族PHA的物理特性进行研究。所述聚(52.1mol％3HB-共-47.9mol％D-苯基乳酸酯)是无定形的，并且随着共聚物中D-苯基乳酸酯的摩尔分数增加，尽管分子量降低，但Tg显著增加至23.86℃。而且，在聚合物中含有芳香族化合物的所述共聚物具有降低的结晶度。认为所述聚合物的芳香环妨碍P(3HB)的结晶。P(3HB)由于其强结晶度而具有高脆度，而所得共聚物由于降低的结晶度和增加的Tg而具有改进的机械韧度。
在本发明中，开发了针对生成各种芳香族聚酯的细菌平台系统。本发明的芳香族聚合物生成系统鉴定了一种新的CoA-转移酶(针对将芳香族化合物活化成其CoA衍生物具有宽底物范围)，并建立了能够聚合其芳香族CoA衍生物的PHA合酶突变体，以及通过代谢的设计和优化体内过量生成芳香族单体的途径。
如在本发明的各种实施方案中使用若干种芳香族单体所证明的，所述系统可用于制备各种芳香族聚合物。例如，根据本发明，可以对HadA(或相关的酶)和PHA合酶进行工程改造以适应所述期望的芳香族单体。在本发明中开发的细菌平台系统可有助于针对由可再生非食物生物质生成芳香族聚酯的生物过程的建立。
如本文所用，所述术语“载体”是指DNA产物，其含有与能够在合适宿主中表达DNA的控制序列可操作地连接的DNA序列。所述载体可以是质粒、噬菌体颗粒或简单的潜在基因组插入物。一旦用合适的宿主转化载体，它可以独立于宿主的基因组复制和起作用，或者可以经常与所述基因组本身整合。由于质粒是最常用的载体类型，因此所述术语“质粒”和“载体”有时在本发明的说明书中可互换使用。为了本发明的目的，优选使用质粒载体。可用于此目的的典型质粒载体包括(a)有效进行复制的复制起点，以便每个宿主细胞包括若干个到数百个质粒载体，(b)用于筛选由质粒载体转化的宿主细胞的抗生素抗性基因，和(c)插入外源DNA片段的限制性酶切位点。即使不存在合适的限制性酶切位点，也可以根据常规方法使用合成的寡核苷酸衔接体或接头容易地将所述载体和外源DNA连接。
连接后，应将所述载体转化到合适的宿主细胞中。在本发明中，所述优选的宿主细胞是原核细胞。合适的原核宿主细胞包括大肠杆菌DH5α、大肠杆菌JM101、大肠杆菌K12、大肠杆菌W3110、大肠杆菌X1776、大肠杆菌XL-1Blue(Stratagene)、大肠杆菌B、大肠杆菌B21等。但是，还可以使用例如FMB101、NM522、NM538和NM539的大肠杆菌菌株，以及其他原核生物的种和属等。除了上述所说的大肠杆菌，以下菌株也可用作宿主细胞：农杆菌属(Agrobacterium)菌株例如农杆菌A4、芽孢杆菌属菌株例如枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、其他肠细菌例如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)或粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、以及各种假单胞菌属菌株。
原核细胞的转化可以使用1.82部分中(Sambrook等人，同上引文)描述的氯化钙方法容易地进行。备选地，电穿孔(Neumann等人.,EMBO J.,1:841,1982)可用于这些细胞的转化。
用于根据本发明的基因过表达的载体可以是本领域已知的任何表达载体，并且优选地是基于pET的载体(Novagen)。当使用基于pET的载体进行克隆时，组氨酸基团与所述表达的蛋白质的末端结合，从而可以有效地纯化所述蛋白质。所表达的蛋白质可以通过本领域已知的通用方法从所克隆的基因分离，并且可以使用Ni-NTA His-缀合的树脂(Novagen)使用色谱法进行特异性分离。在本发明中，所述重组载体可以是pET-SLTI66，并且所述宿主细胞可以是大肠杆菌或农杆菌。
如本文所用，所述术语“表达控制序列”是指对于特定宿主生物可操作地连接的编码序列的表达到所必需的DNA序列。这种控制序列包括用于进行转录的启动子、用于控制此类转录的任何操纵基因序列、用于编码合适的mRNA核糖体结合位点的序列、以及用于调控转录和翻译的终止的序列。例如，适用于原核生物的控制序列包括启动子，任选地包括操纵基因序列和核糖体结合位点。真核细胞包括启动子、多腺苷酸化信号和增强子。对所述质粒中基因表达水平具有最大影响的因子是启动子。优选地使用SRα启动子、巨细胞病毒衍生的启动子等作为高表达的启动子。可以将多种表达控制序列中的任何一种用于所述载体以表达本发明的DNA序列。有用的表达控制序列包括例如，SV40或腺病毒的早期和晚期启动子、lac系统、trp系统、TAC或TRC系统、T3和T7启动子、噬菌体λ的主要操纵基因和启动子区域、fd编码蛋白的控制区域，3-磷酸甘油酸激酶或其他乙二醇裂解酶的启动子、磷酸酶的启动子(例如Pho5)、酵母α-交配系统的启动子以及已知控制原核或真核细胞或病毒的基因表达的其他序列及其各种组合。所述T7启动子可用于在大肠杆菌中表达本发明的蛋白质。
当核酸序列基于功能性关系与另一核酸序列对齐时，它与其“可操作地连接”。这可以是一个或多个基因和一个或多个控制序列，其以这样的方式连接以便当合适的分子(例如，转录激活子蛋白)与所述一个或多个控制序列连接时能够进行基因表达。例如，当表达为参与多肽分泌的前蛋白时，前序列或分泌前导序列的DNA与多肽的DNA可操作地连接；以及当启动子或增强子影响序列的转录时，它与编码序列可操作地连接；或当核糖体结合位点影响序列的转录时，它与编码序列可操作地连接；或当所述核糖体结合位点定位以促进翻译时，其与编码序列可操作地连接。通常，“可操作地连接”是指所述连接的DNA序列与其接触，或指分泌前导序列与其接触并存在于阅读框中。然而，所述增强子不需要与其接触。这些序列通过在便利的限制性酶切位点处的连接(联接)进行联接。当不存在这样的位点时，使用根据常规方法的合成的寡核苷酸衔接体或接头。
如本文所用，所述术语“表达载体”通常是指重组载体(其中插入了异源DNA片段)，并且一般是指双链DNA片段。其中，所述异源DNA是指在宿主细胞中不天然存在的外源DNA。一旦表达载体存在于宿主细胞中，它就可以独立于宿主染色体DNA进行复制，并且可以生成载体和插入的(异源)DNA的若干个拷贝。
如本领域众所周知的，为了增加转基因在宿主细胞中的表达水平，所述基因应该与在选择的表达宿主中起作用的转录/翻译表达控制序列可操作地连接。优选地，表达控制序列和相应的基因被包括在一个含有细菌选择标志物和复制起点的重组载体中。当宿主细胞是真核细胞时，重组载体还应在真核表达宿主中包括有用的表达标志物。
通过上述重组载体转染或转化的宿主细胞构成了本发明的另一个方面。如本文所用，所述术语“转染”是指将DNA导入宿主并使DNA可通过染色体外因子或染色体整合进行复制。如本文所用，所述术语“转化”是指表达载体被宿主细胞容纳，而不论是否实际表达了任何编码序列。
应当理解，并非所有载体在表达本发明的DNA序列时都起相同作用。同样，并非所有宿主对同一表达系统都起相同作用。然而，本领域技术人员将能够在没有过多的实验负担和不脱离本发明的范围的情况下从各种载体、表达控制序列和宿主中进行适当的选择。例如，对载体的选择应该在考虑宿主的情况下进行，因为所述载体应该在其中复制。还应考虑载体的复制数、控制复制数的能力和由相应载体编码的其他蛋白的表达(例如抗生素标志物的表达)。在选择所述表达控制序列时，应考虑许多因素。例如，特别关于可能的二级结构，应考虑所述序列的相对强度、可控性和与本发明的DNA序列的相容性。可以鉴于以下因素选择单细胞宿主：例如所选的载体、由本发明的DNA序列编码的产物的毒性、分泌特征、准确折叠蛋白质的能力、培养和发酵因素、以及易于由根据本发明的DNA序列编码的产物的纯化。在这些因子的范围内，本领域技术人员可以选择能够在发酵或大型动物培养中表达本发明的DNA序列的各种载体/表达控制序列/宿主组合。作为克隆根据本发明的蛋白质的cDNA的筛选方法(通过表达克隆)，可以应用结合方法、淘选方法、膜乳液方法等。
在下文中，将参考以下实施例更详细地描述本发明。然而，对于本领域技术人员将显而易见的是，以下实施例仅提供用于说明本发明，并且不应理解为限制本发明的范围。
在以下实施例中，使用大肠杆菌作为重组微生物。然而，可以使用任何微生物而没有限制，只要它能够从碳源生成乙酰-CoA即可。所述微生物的实例包括产碱杆菌属(Alcaligenes)、假单胞菌属(Pseudomonas)、埃希氏菌属(Escherichia)、罗尔斯顿菌属(Ralstonia)、芽孢杆菌属(Bacillus)和棒状杆菌属(Corynebacterium)等。
在本发明中使用或生成的重组菌株、质粒和引物示于表1至表3中。
[表1]
[表2]
1 Datsenko,K.A.&Wanner,B.P Natl Acad Sci USA 97:6640,2000.
2 Lee,K.H.等人.,Molecular Systems Biology 3,doi:ARTN 149 10.1038/msb4100196,2007.
3 Palmeros,B.等人.Gene 247:255,2000.
4 Park,S.J.等人.,Metab Eng 20,20,2013.
5 Yang,T.H.等人.Biotechnol Bioeng 105:150,2010.
6 Yang,T.H.等人.,Appl Microbiol Biotechnol 90:603,2011.
7 Choi,S.Y.等人.,Nat Biotechnol 34:435,2016.
8 Knobloch,K.H.&Hahlbrock,K.,Archives of Biochemistry and Biophysics184:237,1977.
9 Kaneko,M.等人.,J Bacteriol 185:20,2003.
[表3]
实施例1：重组2-羟基异己酸酯CoA-转移酶的制备
发现了使用乙酰-CoA作为CoA供体并具有广芳香族底物谱的酶。进行序列相似性分析以鉴定FldA的同源酶，并且从具有不同来源的各种FldA中筛选出艰难梭菌的2-异己烯酰基-CoA:2-羟基异己酸酯CoA转移酶(HadA，SEQ ID NO:1)，其与FldA的氨基酸序列同一性为48％或更高(图2)。
为了生成含有编码HadA的基因的重组载体，使用艰难梭菌630菌株的染色体DNA作为模板，以HadA-hisF和HadA-hisR作为引物进行PCR，来生成编码2-羟基异己酸-CoA转移酶的his_HadA基因片段，所述片段在其C末端具有his标签。
接下来，用限制性酶(NdeI和NotI)处理由此生成的his_HadA片段以及pET22b质粒(对T7启动子进行强的基因表达)，然后使用T4 DNA连接酶将限制性酶切割的his_HadA片段与pET22b质粒连接，以生成pET22b_hisHadA作为重组质粒(图2)。
将所述pET22b_hisHadA导入大肠杆菌XL1-Blue(Stratagene Cloning Systems，USA)、培养并加入IPTG以诱导HadA表达。然后，在Ni-NTA离心试剂盒(Quiagen，Germany)中使用His标签在培养基中纯化HadA(图3A)。
实施例2：鉴定2-羟基异己酸酯CoA-转移酶的底物多样性
为了鉴定HadA是否能够使用乙酰-CoA作为供体，使用实施例1中制备的HadA进行体外测定。
将10μg HadA加入到含有0.1mM乙酰-CoA和10mM底物的50mM磷酸盐缓冲液(pH7.5)中，并且反应在30℃下进行10分钟。反应后，加入0.1mM草酰乙酸、5μg柠檬酸合酶和0.5mM 5.5'-二硫代双-(2-硝基苯甲酸)(DTNB)。然后，通过测量412nm处的吸光度(图3B)来分析所释放的CoA的量。
在配备有Eclipse XDB-C18柱(5μm,4.6x 150mm,Agilent)的LC-MS(Agilent 1100系列和LC/MSD VL,Agilent)上进行所得的脂肪族和芳香族酰基-CoA的分析。
结果，从图4中可以看出，HadA能够使用乙酰-CoA作为供体，并能够使用扁桃酸酯、4-羟基扁桃酸酯、苯基乳酸酯、4-羟基苯基乳酸酯、2-羟基-4-苯基丁酸酯、3-羟基-3-苯基丙酸酯和4-羟基苯甲酸作为底物用于转换为相应的CoA衍生物。
图5显示了可通过HadA转化的各种底物的CoA转化反应的分子式。
实施例3：制备具有增加的芳香族单体产量的重组菌株
将大肠杆菌工程改造以在体内从葡萄糖生成D-苯基乳酸酯。芳香族化合物的生物合成始于3-脱氧-D-阿拉伯-庚酮糖酸-7-磷酸(DAHP)的合成，其通过磷酸烯醇丙酮酸(PEP)和赤藓糖-4-磷酸(E4P)的缩合合成。将生成的DAHP转化为苯丙酮酸酯(PPA)，然后通过D-乳酸脱氢酶(FldH)将苯丙酮酸酯转化为D-苯基乳酸酯(图1)。已知针对芳香族化合物生物合成的代谢途径被各种抑制机制以复杂的方式控制。由aroG编码的DAHP合酶和由pheA编码的分支酸变位酶/预苯酸脱氢酶的表达被L-苯丙氨酸抑制(Ribe,D.E.等人.,J.Bacteriol.127:1085,1976)。
在本发明中，构建抗反馈抑制的突变体AroGfbr[AroG(D146N)]和PheAfbr[PheA(T326P)]，以释放L-苯丙氨酸的反馈抑制(Zhou,H.Y.等人.,Bioresour.Technol.101:4151,2010；Kikuchi,Y.等人.,Appl.Environ.Microbiol.63:761,1997)。生成表达肉毒杆菌A菌株ATCC 3502的AroGfbr、PheAfbr和FldH的大肠杆菌XL1-Blue。
为了构建pKM212-AroGfbr，使用AroG-F和AroG-R作为引物并使用pTyr-a质粒作为模板(Na,D.等人.,Nature Biotechnol.31:170,2013)，从3-脱氧-D-阿拉伯-庚酮糖酸-7-磷酸合酶基因(aroG)(抗反馈抑制的突变体)获得PCR产物，并通过限制性酶切位点(EcoRI/HidIII)将PCR产物连接到pKM212-MCS(Park,SJ等人.,Metab.Eng.20:20,2013)以生成pKM212-AroGfbr。
所述pKM212-AroGfbrPheAfbr质粒构建如下。首先，使用PheA-F和PheAmut-R作为单突变核苷酸(T976G)的引物，通过PCR从大肠杆菌的基因组DNA扩增出991bp的DNA片段。其次，使用PheA-R和PheAmut-F作为单突变核苷酸(A976C)的引物，从大肠杆菌的基因组DNA中扩增出200bp的DNA片段。
然后，使用PheA-F和PheA-R作为引物以及两个混合的片段作为模板，通过重叠PCR扩增出1161bp的DNA片段。使用限制性酶(HindIII)将PCR产物连接到以上生成的pKM212-AroGfbr。
肉毒杆菌A菌株ATCC 3502的D-乳酸脱氢酶(fldH)用于构建pACYC-FldH。fldH基因的密码子用法针对大肠杆菌进行了优化，使用FldH-F和FldH-R作为引物并以pUC57-FldHopt(GenScript，Piscataway，NJ，USA)作为模板扩增针对大肠杆菌优化的fldH基因。
使用限制性酶(BamHI/HindIII)将PCR产物与pTrc99A(Pharmacia，Biotech，Sweden)连接以构建pTrc-FldH。接下来，使用Trc-F和Ter-R作为引物并以pTrc-FldH作为模板，通过PCR扩增与trc启动子和rrnB终止子结合的fldH基因。使用限制性酶(XhoI/SacI)将扩增的PCR产物与pACYC184KS(韩国专利公开号2015-0142304)连接以获得pACYC-FldH。
将由此生成的pKM212-AroGfbrPheAfbr和pACYC-FldH导入大肠杆菌XL1-Blue以生成表达AroGfbr、PheAfbr和FldH的重组大肠杆菌。
当在含有15.2g/L葡萄糖的MR培养基中培养大肠杆菌时，其生成0.372g/L的D-苯基乳酸酯。
MR培养基每升含有6.67g KH2PO4、4g(NH4)2HPO4、0.8g MgSO4·7H2O、0.8g柠檬酸盐和5ml痕量金属溶液，并且所述痕量金属溶液含有0.5M HCl：10g FeSO4·7H2O、2g CaCl2、2.2g ZnSO4·7H2O、0.5g MnSO4·4H2O、1g CuSO4·5H2O、0.1g(NH4)6Mo7O24·4H2O和0.02gNa2B4O7·10H2O。
为了通过代谢工程增加芳香族单体的产量，通过代谢工程增加表达AroGfbr、PheAfbr和FldH的大肠杆菌XL1-Blue菌株的得率，所述菌株从葡萄糖生成少量D-苯基乳酸酯(0.372g/L)。通过缺失TyrR生成表达AroGfbr、PheAfbr和FldH的大肠杆菌XBT菌株，TyrR是一种双转录调节剂，其执行调节以抑制芳香族氨基酸生物合成。
使用一步灭活方法(Datsenko,K.A.等人.,Proc.Natl Acad Sci.USA 97:6640,2000)对表达AroGfbr、PheAfbr和FldH的大肠杆菌中的tyrR基因进行删除。
在含有16.4g/L葡萄糖的MR培养基中培养大肠杆菌XBT菌株。结果，所述菌株生成0.5g/L D-苯基乳酸酯，这相当于产率比tyrR未被缺失的大肠杆菌XL1-blue菌株高30％。
为了消除与D-苯基乳酸酯合成竞争的途径，通过从大肠杆菌XBT缺失poxB(编码丙酮酸氧化酶的基因)、pflB(编码丙酮酸甲酸裂解酶的基因)、adhE(编码乙醛脱氢酶/乙醇脱氢酶的基因)和frdB(编码富马酸还原酶的基因)来构建大肠杆菌XB201T。
大肠杆菌XB201T菌株从15.7g/L葡萄糖生成0.55g/L的D-苯基乳酸酯，这相当于得率比大肠杆菌XBT的高10％。
此外，进行根据计算机模拟基因组规模代谢通量分析的代谢工程分析以进一步增加D-苯基乳酸酯的生成。
针对计算机模拟通量响应分析，使用大肠杆菌iJO1366基因组规模模型(由2251个代谢反应和1135个代谢产物组成)，并且研究了中心和芳香族氨基酸生物合成对D-苯基乳酸酯的生成的影响。为了在本发明的XB201T菌株中反映相同的情况，进一步向模型中加入D-苯基乳酸酯生物合成(fldH基因)的异源代谢反应，并将通量固定为零以反映模型中的基因敲除。使D-苯基乳酸酯生成的速率最大化至目标函数，而中心氨基酸和芳香族氨基酸生物合成反应通量值从最小值逐渐增加至最大值。在模拟期间，以一个小时为基础将葡萄糖反应速率设定为10mmol/1g干细胞重量。使用Gurobi Optimizer 6.0和GurobiPy软件包(Gurobi Optimization,Inc.Houston,Tex.)在Python环境中运行所有模拟。使用COBRApy32进行COBRA兼容SBML文件的读取、写入和执行。
结果，如图6所示，从大肠杆菌菌株XB201T中去除编码酪氨酸氨基转移酶的tyrB基因和编码天冬氨酸氨基转移酶的aspC基因，以减少L-苯丙氨酸的生物合成并从而增强碳向D-苯基乳酸酯的流动。
作为计算机模拟通量响应分析的结果，发现制备的大肠杆菌菌株XB201TBA从18.5g/L葡萄糖生成1.62g/L D-苯基乳酸酯，导致得率大幅增加，即比表达AroGfbr、PheAfbr和FldH的大肠杆菌XL1-blue菌株的D-苯基乳酸酯产量高4.35倍。
实施例4：用重组菌株制备含有芳香族单体的聚羟基链烷酸酯
为了防止在XB201TBA中形成D-乳酸，进一步缺失ldhA基因以制备XB201TBAL菌株。为了制备含有芳香族单体的聚羟基链烷酸酯，将PhaC1437和HadA在大肠杆菌XB201TBAL菌株中表达。
为了制备含有编码PhaC1437和HadA的基因的重组载体，使用HadA-sbF和HadA-ndR作为引物并以艰难梭菌菌株630的染色体DNA作为模板进行PCR，以生成编码羟基异己酸-CoA转移酶的hadA基因片段。使用限制性酶(SbfI/NdeI)将所述扩增的PCR产物与p619C1437-pct540连接(Yang,T.H.等人.Biotechnol.Bioeng.105:150,2010)以获得p619C1437-HadA。将获得的p619C1437-HadA导入大肠杆菌XB201TBAL以制备表达AroGfbr、PheAfbr、FldH、PhaC1437和HadA的重组大肠杆菌。在含有20g/L葡萄糖和1g/L 3HB钠的MR培养基中培养大肠杆菌，获得聚(52.1mol％3HB-共-47.9mol％D-苯基乳酸酯)，其量为干细胞重量的15.8wt％(图7)。此外，通过补料分批发酵制备聚(52.3mol％3HB-共-47.7mol％D-苯基乳酸酯)，其量为干细胞重量的24.3％(图10A和10B)。
实施例5：使用重组菌株制备含有各种芳香族单体的聚羟基链烷酸酯
为了鉴定使用大肠杆菌XB201TBAL的系统是否可用于制备各种芳香族共聚物，使用扁桃酸酯作为单体进行实验。
将表达AroGfbr、PheAfbr、FldH、PhaC1437和HadA的大肠杆菌XB201TBAL在含有1g/L 3HB钠和0.5g/L D-扁桃酸酯的MR培养基中培养。结果，生成聚(55.2mol％3HB-共-43.0mol％D-苯基乳酸酯-共-1.8mol％D-扁桃酸酯)，其量为干细胞重量的11.6wt％(图8A和图8B)，因此，使用D-扁桃酸酯作为底物成功地制备了含有D-扁桃酸酯的芳香族聚合物。
接下来，通过代谢工程在体内制备D-扁桃酸酯。在表达AroGfbr、PheAfbr、FldH、PhaC1437和HadA的大肠杆菌XB201TBAL中表达以下基因：衍生自东方拟无枝酸菌(Amycolatopsis orientalis)的羟基扁桃酸合酶(HmaS)、天蓝色链霉菌(S.coelicolor)的羟基扁桃酸氧化酶(Hmo)、禾本红酵母(Rhodotorula graminis)的D-扁桃酸脱氢酶(Dmd)，以从葡萄糖生成D-扁桃酸酯。
为了构建pKM212-HmaS，使用东方拟无枝酸菌的羟基扁桃酸合酶基因(hmaS)并将密码子克隆到大肠杆菌中的合成载体(GenScript，Piscataway，NJ，USA)中，来制备质粒pUC57-HmaSopt。
使用限制性酶(EcoRI/KpnI)将所述pUC57-HmaSopt连接到pKM212-MCS。为了构建pKM212-HmaSHmo，使用天蓝色链霉菌的羟基扁桃酸氧化酶基因(hmo)合成密码子优化的hmo基因(GenScript，Piscataway，NJ，USA)，并使用Hmo-F和Hmo-R作为引物通过PCR对其进行扩增。使用限制性酶(KpnI/BamHI)将所述PCR产物与pKM212-HmaS连接以构建pKM212-HmaSHmo。
为了构建pKM212-HmaSHmoDmd，合成含有大肠杆菌密码子优化的dmd基因的pUC57-Dmd(GenScript，Piscataway，NJ，USA)，并且使用Dmd-F和Dmd-R作为引物通过PCR对大肠杆菌密码子优化的禾本红酵母D-扁桃酸脱氢酶基因(dmd)进行扩增。使用限制性酶(BamHI/SbfI)将所述PCR产物与pKM212-HmaSHmo连接以制备pKM212-HmaSHmoDmd。
将制备的pKM212-HmaSHmoDmd导入表达AroGfbr、PheAfbr、FldH、PhaC1437和HadA的大肠杆菌XB201TBAL，以构建具有生成扁桃酸酯的潜力的重组菌株。
在含有20g/L葡萄糖和1g/L 3HB钠的培养基中培养构建的具有生成扁桃酸酯的潜力的重组菌株。结果，生成聚(92.9mol％3HB-共-6.3mol％D-苯基乳酸酯-共-0.8mol％D-扁桃酸酯)，其量为干细胞重量的16.4wt％。
鉴定了使用3-羟基-3-苯基丙酸酯(3HPh)作为另一种芳香族单体的芳香族聚合物的生成。当在含有20g/L葡萄糖、0.5g/L 3-羟基-3-苯基丙酸和1g/L3HB钠的培养基中培养大肠杆菌菌株XB201TBAL时，生成聚(33.3mol％3HB-共-18mol％D-苯基乳酸酯-共-48.7mol％3HPh)，其量为按重量计干细胞重量的14.7wt％(图8C和图8D)。这些结果表明，使用本发明开发的2-羟基异己酸-CoA转移酶的系统可广泛用于制备各种芳香族聚酯。
实施例6：使用重组菌株制备含有各种长链2-HA的聚羟基链烷酸酯
为了鉴定使用本发明的2-羟基异己酸-CoA转移酶的系统是否可用于生成含有各种长链2-HA的聚羟基链烷酸酯，使用各种长链2-HA单体[2-羟基异己酸酯(2HIC)，2-羟基己酸酯(2HH)和2-羟基辛酸酯(2HO)]对聚合物产率进行确认。在含有1g/L 3HB、20g/L葡萄糖和不同浓度(0.25g/L、0.5g/L和1g/L)的长链2-HA的MR培养基中对表达PhaC1437和HadA的大肠杆菌XL1-Blue进行培养。结果，制备了含有羟基异己酸酯、2-羟基己酸酯或2-羟基辛酸酯的共聚物。另外，证实了随着培养基中所含的2-HA浓度增加，所述共聚物中所含单体的摩尔分数增加(表4、表5和表6)。
[表4]
[表5]
[表6]
实施例7：通过基于合成的启动子的通量控制制备含有各种摩尔分数的芳香族单体的聚羟基链烷酸酯
为了在无外部供应3HB的情况下制备生成芳香族PHA的菌株，进一步在XB201TBAL菌株中表达真养雷氏菌β-酮硫解酶(PhaA)和乙酰乙酰-CoA还原酶(PhaB)，并且鉴定了在无外部补充3HB的情况下是否由葡萄糖生成芳香族PHA。
结果，如所预期的，表达AroGfbr、PheAfbr、FldH、PhaC1437和HadA的XB201TBAL菌株由20g/L葡萄糖生成聚(86.2mol％3HB-共-13.8mol％D-苯基乳酸酯)，其量为干细胞重量的18.0wt％。此外，通过使用合成的Anderson启动子(http://parts.igem.org/)控制由PhaAB催化的代谢通量，尝试生成具有对工业应用重要的各种单体摩尔分数的芳香族PHA。制备用不同强度的五种不同启动子(SEQ ID NOS:89-93)表达PhaAB的五种不同质粒，并将其导入表达AroGfbr、PheAfbr、FldH、PhaC1437和HadA的XB201TBAL菌株中。
随着PhaAB表达的降低，D-苯基乳酸酯单体的摩尔分数增加；可以制备出具有11.0mol％、15.8mol％、20.0mol％、70.8mol％和84.5mol％的D-苯基乳酸酯的共聚物(图9A和图9B和表7)；通过用BBa_J23103启动子表达PhaAB，生成聚(15.5mol％3HB-共-84.5mol％D-苯基乳酸酯)，其量为干细胞重量的4.3wt％(图9B)。这些结果表明，通过控制代谢通量可以生成具有各种芳香族单体摩尔分数的芳香族聚酯。
[表7]
实施例8：通过补料分批发酵制备芳香族聚羟基链烷酸酯
在本实施例中，在不提供3HB的情况下进行由启动子BBa_J23114控制的大肠杆菌菌株XB201TBAL(表达AroGfbr、PheAfbr、FldH、HadA、PhaC1437和PhaAB)的pH稳态培养。培养96小时后，生成2.5g/L的聚(67.6mol％3HB-共-32.4mol％D-苯基乳酸酯)，其聚合物含量为干细胞重量的43.8wt％(图10C和图10D)。
此外，为了进一步改进芳香族聚羟基链烷酸酯的生成，通过用fldH基因替代大肠杆菌XB201TBA染色体的ldhA基因来对基因表达系统进行优化。另外，通过用强trc启动子替代ldhA基因的天然启动子，fldH基因的表达增加。进行补料分批发酵，包括使用脉冲进料方法进料葡萄糖。通过补料分批发酵，在启动子BBa_J23114下的大肠杆菌菌株XB201TBAF(表达AroGfbr、PheAfbr、FldH、HadA、PhaC1437和PhaAB)生成13.9g/L聚(69.1mol％3HB-共-38.1mol％D-苯基乳酸酯)，其聚合物含量为干细胞重量的55.0wt％(图10E和图10F)，并且13.9g/L的产量比2.5g/L(在启动子BBa_J23114下的大肠杆菌XB201TBAL菌株(表达AroGfbr，PheAfbr，FldH，HadA，PhaC1437和PhaAB)生成的量)高5.56倍，并且远高于通过大肠杆菌XB201TBAL菌株(表达AroGfbr、PheAfbr、FldH、HadA和PhaC1437)在补充有葡萄糖和3HB的培养基中的补料分批培养获得的量。这些结果表明，通过工程改造的菌株(在BBa_J23114启动子下表达AroGfbr、PheAfbr、FldH、HadA，PhaC1437和PhaAB的大肠杆菌XB201TBAF菌株)的补料分批发酵，可以成功地以高浓度生成芳香族聚羟基链烷酸酯。
实施例9：含有芳香族单体的聚羟基链烷酸酯的物理特性分析
最后，对通过代谢工程改造的大肠杆菌生成的芳香族PHA的物理特性进行研究。
通过GC或GC-MS测定聚羟基链烷酸酯(PHA)含量和单体组成。将收集的细胞用蒸馏水洗涤三次并冻干24小时，并通过酸催化的甲醇分解将冻干细胞的PHA转化为相应的羟甲基酯。使用配备有Agilent 7683自动注射器、框架电离检测器和熔融石英毛细管柱(ATTM-Wax，30m，ID 0.53mm，厚度1.20μm，Agilent，USA)的GC装置(Agilent 6890N，Agilent，USA)对得到的甲酯进行纯化。通过氯仿提取对聚合物进行提取，并使用溶剂提取在细胞中对其进行纯化。使用核磁共振(NMR)，凝胶渗透色谱(GPC)和差示扫描量热法(DSC)测量所述聚合物的结构、分子量和热性特性能。
作为结果，图7显示由大肠杆菌XB201TBAL生成的聚(3HB-共-D-苯基乳酸酯)的分析结果，以及图8显示由大肠杆菌XB201TBAL生成的聚(3HB-共-D-苯基乳酸酯-共-D-扁桃酸酯)的分析结果。
聚(52.1mol％3HB-共-47.9mol％D-苯基乳酸酯)是无定形的，并且随着共聚物中D-苯基乳酸酯的摩尔分数增加，Tg显著增加至23.86℃(尽管其分子量降低)。而且，在聚合物中含有芳香族化合物的所述共聚物具有降低的结晶度。认为聚合物的芳香环妨碍P(3HB)的结晶(由立体化学诱导)。P(3HB)由于强结晶度而表现出高脆度，而所得共聚物由于降低的结晶度和增加的Tg而引起改进的机械韧性。
尽管已经参考具体配置详细描述了本发明，但是本领域技术人员将理解，该描述涉及优选实施方案，并且不应解释为限制本发明的范围。因此，本发明的实质范围由所附提交的权利要求及其等同物限定。
【实用性】
根据本发明，可以制备含有芳香族单体或长链2-HA单体的可生物降解的聚合物。
尽管已经详细描述了本发明的具体配置，但本领域技术人员应理解，本详细描述是作为优选实施方案提供的，并不应被解释为限制本发明的范围。因此，本发明的实质范围由所附提交的权利要求及其等同物限定。
【序列表自由文本】
附有电子文件。
序列表
<110> 韩国科学技术院(KOREA ADVANCED INSTITUTE OF SCIENCE AND TECHNOLOGY)
<120> 使用2-羟基异己酸-CoA转移酶生成聚羟基链烷酸酯的方法
<130> PF-B2226
<140> PCT/KR2018/002305
<141> 2018-02-26
<150> KR 10-2017-0026266
<151> 2017-02-28
<150> KR 10-2017-0172899
<151> 2017-12-15
<160> 93
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 399
<212> PRT
<213> HadA-艰难梭菌
<400> 1
Met Leu Leu Glu Gly Val Lys Val Val Glu Leu Ser Ser Phe Ile Ala
1 5 10 15
Ala Pro Cys Cys Ala Lys Met Leu Gly Asp Trp Gly Ala Glu Val Ile
20 25 30
Lys Ile Glu Pro Ile Glu Gly Asp Gly Ile Arg Val Met Gly Gly Thr
35 40 45
Phe Lys Ser Pro Ala Ser Asp Asp Glu Asn Pro Met Phe Glu Leu Glu
50 55 60
Asn Gly Asn Lys Lys Gly Val Ser Ile Asn Val Lys Ser Lys Glu Gly
65 70 75 80
Val Glu Ile Leu His Lys Leu Leu Ser Glu Ala Asp Ile Phe Val Thr
85 90 95
Asn Val Arg Val Gln Ala Leu Glu Lys Met Gly Ile Ala Tyr Asp Gln
100 105 110
Ile Lys Asp Lys Tyr Pro Gly Leu Ile Phe Ser Gln Ile Leu Gly Tyr
115 120 125
Gly Glu Lys Gly Pro Leu Lys Asp Lys Pro Gly Phe Asp Tyr Thr Ala
130 135 140
Tyr Phe Ala Arg Gly Gly Val Ser Gln Ser Val Met Glu Lys Gly Thr
145 150 155 160
Ser Pro Ala Asn Thr Ala Ala Gly Phe Gly Asp His Tyr Ala Gly Leu
165 170 175
Ala Leu Ala Ala Gly Ser Leu Ala Ala Leu His Lys Lys Ala Gln Thr
180 185 190
Gly Lys Gly Glu Arg Val Thr Val Ser Leu Phe His Thr Ala Ile Tyr
195 200 205
Gly Met Gly Thr Met Ile Thr Thr Ala Gln Tyr Gly Asn Glu Met Pro
210 215 220
Leu Ser Arg Glu Asn Pro Asn Ser Pro Leu Met Thr Thr Tyr Lys Cys
225 230 235 240
Lys Asp Gly Arg Trp Ile Gln Leu Ala Leu Ile Gln Tyr Asn Lys Trp
245 250 255
Leu Gly Lys Phe Cys Lys Val Ile Asn Arg Glu Tyr Ile Leu Glu Asp
260 265 270
Asp Arg Tyr Asn Asn Ile Asp Ser Met Val Asn His Val Glu Asp Leu
275 280 285
Val Lys Ile Val Gly Glu Ala Met Leu Glu Lys Thr Leu Asp Glu Trp
290 295 300
Ser Ala Leu Leu Glu Glu Ala Asp Leu Pro Phe Glu Lys Ile Gln Ser
305 310 315 320
Cys Glu Asp Leu Leu Asp Asp Glu Gln Ala Trp Ala Asn Asp Phe Leu
325 330 335
Phe Lys Lys Thr Tyr Asp Ser Gly Asn Thr Gly Val Leu Val Asn Thr
340 345 350
Pro Val Met Phe Arg Asn Glu Gly Ile Lys Glu Tyr Thr Pro Ala Pro
355 360 365
Lys Val Gly Gln His Thr Val Glu Val Leu Lys Ser Leu Gly Tyr Asp
370 375 380
Glu Glu Lys Ile Asn Asn Phe Lys Asp Ser Lys Val Val Arg Tyr
385 390 395
<210> 2
<211> 559
<212> PRT
<213> PHA 合酶-假单胞菌属物种6-19
<400> 2
Met Ser Asn Lys Ser Asn Asp Glu Leu Lys Tyr Gln Ala Ser Glu Asn
1 5 10 15
Thr Leu Gly Leu Asn Pro Val Val Gly Leu Arg Gly Lys Asp Leu Leu
20 25 30
Ala Ser Ala Arg Met Val Leu Arg Gln Ala Ile Lys Gln Pro Val His
35 40 45
Ser Val Lys His Val Ala His Phe Gly Leu Glu Leu Lys Asn Val Leu
50 55 60
Leu Gly Lys Ser Gly Leu Gln Pro Thr Ser Asp Asp Arg Arg Phe Ala
65 70 75 80
Asp Pro Ala Trp Ser Gln Asn Pro Leu Tyr Lys Arg Tyr Leu Gln Thr
85 90 95
Tyr Leu Ala Trp Arg Lys Glu Leu His Asp Trp Ile Asp Glu Ser Asn
100 105 110
Leu Ala Pro Lys Asp Val Ala Arg Gly His Phe Val Ile Asn Leu Met
115 120 125
Thr Glu Ala Met Ala Pro Thr Asn Thr Ala Ala Asn Pro Ala Ala Val
130 135 140
Lys Arg Phe Phe Glu Thr Gly Gly Lys Ser Leu Leu Asp Gly Leu Ser
145 150 155 160
His Leu Ala Lys Asp Leu Val His Asn Gly Gly Met Pro Ser Gln Val
165 170 175
Asn Met Gly Ala Phe Glu Val Gly Lys Ser Leu Gly Val Thr Glu Gly
180 185 190
Ala Val Val Phe Arg Asn Asp Val Leu Glu Leu Ile Gln Tyr Lys Pro
195 200 205
Thr Thr Glu Gln Val Tyr Glu Arg Pro Leu Leu Val Val Pro Pro Gln
210 215 220
Ile Asn Lys Phe Tyr Val Phe Asp Leu Ser Pro Asp Lys Ser Leu Ala
225 230 235 240
Arg Phe Cys Leu Arg Asn Asn Val Gln Thr Phe Ile Val Ser Trp Arg
245 250 255
Asn Pro Thr Lys Glu Gln Arg Glu Trp Gly Leu Ser Thr Tyr Ile Glu
260 265 270
Ala Leu Lys Glu Ala Val Asp Val Val Thr Ala Ile Thr Gly Ser Lys
275 280 285
Asp Val Asn Met Leu Gly Ala Cys Ser Gly Gly Ile Thr Cys Thr Ala
290 295 300
Leu Leu Gly His Tyr Ala Ala Ile Gly Glu Asn Lys Val Asn Ala Leu
305 310 315 320
Thr Leu Leu Val Ser Val Leu Asp Thr Thr Leu Asp Ser Asp Val Ala
325 330 335
Leu Phe Val Asn Glu Gln Thr Leu Glu Ala Ala Lys Arg His Ser Tyr
340 345 350
Gln Ala Gly Val Leu Glu Gly Arg Asp Met Ala Lys Val Phe Ala Trp
355 360 365
Met Arg Pro Asn Asp Leu Ile Trp Asn Tyr Trp Val Asn Asn Tyr Leu
370 375 380
Leu Gly Asn Glu Pro Pro Val Phe Asp Ile Leu Phe Trp Asn Asn Asp
385 390 395 400
Thr Thr Arg Leu Pro Ala Ala Phe His Gly Asp Leu Ile Glu Leu Phe
405 410 415
Lys Asn Asn Pro Leu Ile Arg Pro Asn Ala Leu Glu Val Cys Gly Thr
420 425 430
Pro Ile Asp Leu Lys Gln Val Thr Ala Asp Ile Phe Ser Leu Ala Gly
435 440 445
Thr Asn Asp His Ile Thr Pro Trp Lys Ser Cys Tyr Lys Ser Ala Gln
450 455 460
Leu Phe Gly Gly Asn Val Glu Phe Val Leu Ser Ser Ser Gly His Ile
465 470 475 480
Gln Ser Ile Leu Asn Pro Pro Gly Asn Pro Lys Ser Arg Tyr Met Thr
485 490 495
Ser Thr Glu Val Ala Glu Asn Ala Asp Glu Trp Gln Ala Asn Ala Thr
500 505 510
Lys His Thr Asp Ser Trp Trp Leu His Trp Gln Ala Trp Gln Ala Gln
515 520 525
Arg Ser Gly Glu Leu Lys Lys Ser Pro Thr Lys Leu Gly Ser Lys Ala
530 535 540
Tyr Pro Ala Gly Glu Ala Ala Pro Gly Thr Tyr Val His Glu Arg
545 550 555
<210> 3
<211> 1065
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> AroGfbr
<400> 3
atgaattatc agaacgacga tttacgcatc aaagaaatca aagagttact tcctcctgtc 60
gcattgctgg aaaaattccc cgctactgaa aatgccgcga atacggttgc ccatgcccga 120
aaagcgatcc ataagatcct gaaaggtaat gatgatcgcc tgttggttgt gattggccca 180
tgctcaattc atgatcctgt cgcggcaaaa gagtatgcca ctcgcttgct ggcgctgcgt 240
gaagagctga aagatgagct ggaaatcgta atgcgcgtct attttgaaaa gccgcgtacc 300
acggtgggct ggaaagggct gattaacgat ccgcatatgg ataatagctt ccagatcaac 360
gacggtctgc gtatagcccg taaattgctg cttgatatta acgacagcgg tctgccagcg 420
gcaggtgagt ttctcaatat gatcacccca caatatctcg ctgacctgat gagctggggc 480
gcaattggcg cacgtaccac cgaatcgcag gtgcaccgcg aactggcatc agggctttct 540
tgtccggtcg gcttcaaaaa tggcaccgac ggtacgatta aagtggctat cgatgccatt 600
aatgccgccg gtgcgccgca ctgcttcctg tccgtaacga aatgggggca ttcggcgatt 660
gtgaatacca gcggtaacgg cgattgccat atcattctgc gcggcggtaa agagcctaac 720
tacagcgcga agcacgttgc tgaagtgaaa gaagggctga acaaagcagg cctgccagca 780
caggtgatga tcgatttcag ccatgctaac tcgtccaaac aattcaaaaa gcagatggat 840
gtttgtgctg acgtttgcca gcagattgcc ggtggcgaaa aggccattat tggcgtgatg 900
gtggaaagcc atctggtgga aggcaatcag agcctcgaga gcggggagcc gctggcctac 960
ggtaagagca tcaccgatgc ctgcatcggc tgggaagata ccgatgctct gttacgtcaa 1020
ctggcgaatg cagtaaaagc gcgtcgcggg taactgcagg catgc 1065
<210> 4
<211> 1161
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pheAfbr
<400> 4
atgacatcgg aaaacccgtt actggcgctg cgagagaaaa tcagcgcgct ggatgaaaaa 60
ttattagcgt tactggcaga acggcgcgaa ctggccgtcg aggtgggaaa agccaaactg 120
ctctcgcatc gcccggtacg tgatattgat cgtgaacgcg atttgctgga aagattaatt 180
acgctcggta aagcgcacca tctggacgcc cattacatta ctcgcctgtt ccagctcatc 240
attgaagatt ccgtattaac tcagcaggct ttgctccaac aacatctcaa taaaattaat 300
ccgcactcag cacgcatcgc ttttctcggc cccaaaggtt cttattccca tcttgcggcg 360
cgccagtatg ctgcccgtca ctttgagcaa ttcattgaaa gtggctgcgc caaatttgcc 420
gatattttta atcaggtgga aaccggccag gccgactatg ccgtcgtacc gattgaaaat 480
accagctccg gtgccataaa cgacgtttac gatctgctgc aacataccag cttgtcgatt 540
gttggcgaga tgacgttaac tatcgaccat tgtttgttgg tctccggcac tactgattta 600
tccaccatca atacggtcta cagccatccg cagccattcc agcaatgcag caaattcctt 660
aatcgttatc cgcactggaa gattgaatat accgaaagta cgtctgcggc aatggaaaag 720
gttgcacagg caaaatcacc gcatgttgct gcgttgggaa gcgaagctgg cggcactttg 780
tacggtttgc aggtactgga gcgtattgaa gcaaatcagc gacaaaactt cacccgattt 840
gtggtgttgg cgcgtaaagc cattaacgtg tctgatcagg ttccggcgaa aaccacgttg 900
ttaatggcga ccgggcaaca agccggtgcg ctggttgaag cgttgctggt actgcgcaac 960
cacaatctga ttatgccccg tctggaatca cgcccgattc acggtaatcc atgggaagag 1020
atgttctatc tggatattca ggccaatctt gaatcagcgg aaatgcaaaa agcattgaaa 1080
gagttagggg aaatcacccg ttcaatgaag gtattgggct gttacccaag tgagaacgta 1140
gtgcctgttg atccaacctg a 1161
<210> 5
<211> 1074
<212> DNA
<213> Hams-东方拟无枝酸菌
<400> 5
atgcagaatt ttgagataga ctatgtagaa atgtatgtgg aaaatcttga agtggctgca 60
tttagttggg tcgataagta tgcattcgcc gttgccggta caagccgtag tgcggaccat 120
cgttcgattg cgctacgcca gggtcaagtg acgttggtgt tgacagaacc aacgtcggat 180
cgtcatccgg cggcggcata tcttcagact catggcgatg gtgttgccga catagcgatg 240
gcgacaagcg atgtcgccgc cgcttacgaa gctgcagtac gggcgggggc ggaagccgtt 300
cgcgcgccgg gccagcactc agaggcggct gttactacgg ccactatcgg tggttttggc 360
gatgtggtac ataccctgat tcagcgcgac ggaacatccg ctgagttgcc tccgggtttt 420
acaggctcta tggatgtcac taaccacgga aaaggtgatg tcgatttatt gggcattgac 480
catttcgcga tttgtctgaa tgctggcgat cttggtccca ccgtggagta ctacgaaaga 540
gcattaggtt ttagacagat ctttgatgaa cacatagtcg tcggtgcaca ggcgatgaat 600
agtaccgtag tgcaaagtgc gtctggagct gttaccctga ccctgattga acctgaccgc 660
aatgccgacc caggccagat cgacgagttt ctcaaagatc atcaaggggc aggagttcag 720
cacatcgcct ttaatagcaa cgatgcagtc cgtgcagtaa aggctttatc agaaaggggg 780
gtggagttct taaaaacacc gggggcgtat tatgatctgc tcggagagcg tatcacgctg 840
cagacgcatt cgttagatga tctgcgggca actaacgttc tcgcagatga agatcacggc 900
ggccaactgt ttcagatttt cactgcatcc actcatccac gtcatacgat ttttttcgag 960
gtcatagaga ggcaaggcgc tggcactttc ggatcatcca atatcaaagc cctgtatgag 1020
gccgttgaac tggaacgcac cgggcaatct gaatttggag ccgctcggcg ataa 1074
<210> 6
<211> 1134
<212> DNA
<213> hmo-天蓝色链霉菌
<400> 6
atgcgggaac cactcacgct cgatgatttc gctcgattag cacgcggaca attacctgca 60
gctacttggg atttcattgc agggggcgcg gggcgggaac ggaccctcgc tgctaacgaa 120
gccgtgtttg gagctgttag acttagaccc agggcacttc ctggcatcga agaaccggac 180
acctctgtag aagtgctcgg ctcccggtgg ccggcgccgg ttggtattgc gccggtagct 240
taccacgggc tcgcgcatcc agacggcgaa cccgcgactg ccgcggcggc cggagcgcta 300
ggtctcccgt tggtagttag cacctttgcg gggcgcagct tagaagaggt agcacgtgca 360
gctagcgcac cgctgtggct ccagctgtat tgtttccgag atcatgagac aacacttggg 420
ctagcccgca gagctcgcga cagcggctat caggctctgg tgttaaccgt cgacacaccg 480
tttactggac gccggttacg tgatctgcgt aacggcttcg cagtccctgc tcacatcacc 540
ccagccaatc tgactggtac agcagcagca ggctcagcca ccccaggcgc ccatagccgt 600
ctggcgtttg atcgccgcct tgattggtct tttgttgccc gcttaggagc agcgagcgga 660
ctgccagtgc tggccaaagg cgtgctgacg gcgcctgatg ccgaggctgc ggtcgcggcg 720
ggcgtagccg gcatagttgt aagtaatcat gggggccgcc agctcgacgg cgcaccagca 780
acactggagg cgttgcccga agtggtgtcg gccgtgcgcg gaagatgccc cgtcctcttg 840
gatggtggtg tcagaactgg ggccgatgtc ttagctgcat tagctctcgg tgcccgtgcc 900
gtcctggtcg gccgccctgc actgtatgca ctggctgttg ggggcgccag tggagtgcgc 960
agaatgctca cactgcttac agaggacttt gctgatacga tggtcttaac cggccatgca 1020
gcaactggta cgattggccc ggacaccctg gccccacccc accatgcccc tccgcaccat 1080
ggtccgccta ccgcgccacg cccggcgccg caccgagata ggagccatgg ataa 1134
<210> 7
<211> 1047
<212> DNA
<213> Dmd-禾本红酵母
<400> 7
atgcctcgtc cgcgcgtcct tctcttaggc gaccccgctc gccatctcga cgacctctgg 60
agcgattttc agcaaaaatt tgaagtcatc cctgccaatc tgaccacaca cgatgggttt 120
aaacaagccc tgcgtgaaaa acgctatggc gattttgaag ccatcattaa acttgccgtt 180
gaaaacggca cagagagcta tccctggaat gccgatttaa taagtcatct cccaagttcc 240
cttaaagttt ttgcagctgc cggcgcaggc ttcgactggc tcgaccttga tgcactcaac 300
gagagaggag tagctttcgc caattctcgc ggggctggcg atactgctac atcagatctc 360
gcactgtact tgattctttc cgtattccgc ttagcgtcat actctgagcg agccgcgcgt 420
acgggcgatc cagaaacttt taatcgtgtt catctcgaaa ttggtaaatc agcacacaat 480
ccgcgcgggc acgtgctcgg cgctgtcgga ttgggcgcaa ttcagaaaga gatagcgagg 540
aaagcggtgc atggcctggg gatgaagtta gtctattatg atgtggcgcc tgcagatgca 600
gaaacggaaa aggcgctagg tgctgagcgg gttgactcgc tcgaagagct ggctagacgt 660
agcgattgtg tcagcgtgtc ggttccgtat atgaaattga cgcaccatct cattgatgaa 720
gccttctttg ccgcgatgaa accgggaagt cgcattgtta atactgcgcg tggtccagtg 780
atttcacagg atgcattgat agcagcgctc aaatctggaa aactgctcag tgccggctta 840
gacgtgcatg agttcgagcc acaggtgtcc aaagaactca ttgaaatgaa gcatgttaca 900
ctgactacac atatcggagg cgtagcgatt gaaaccttcc atgaatttga gcggttaacc 960
atgaccaaca tagatcgatt tcttctacag ggcaaaccgt tgctgacccc tgcgggtaaa 1020
gtatttgcgc cgtcatctgc tgcataa 1047
<210> 8
<211> 350
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DAHP 合酶
<400> 8
Met Asn Tyr Gln Asn Asp Asp Leu Arg Ile Lys Glu Ile Lys Glu Leu
1 5 10 15
Leu Pro Pro Val Ala Leu Leu Glu Lys Phe Pro Ala Thr Glu Asn Ala
20 25 30
Ala Asn Thr Val Ala His Ala Arg Lys Ala Ile His Lys Ile Leu Lys
35 40 45
Gly Asn Asp Asp Arg Leu Leu Val Val Ile Gly Pro Cys Ser Ile His
50 55 60
Asp Pro Val Ala Ala Lys Glu Tyr Ala Thr Arg Leu Leu Ala Leu Arg
65 70 75 80
Glu Glu Leu Lys Asp Glu Leu Glu Ile Val Met Arg Val Tyr Phe Glu
85 90 95
Lys Pro Arg Thr Thr Val Gly Trp Lys Gly Leu Ile Asn Asp Pro His
100 105 110
Met Asp Asn Ser Phe Gln Ile Asn Asp Gly Leu Arg Ile Ala Arg Lys
115 120 125
Leu Leu Leu Asp Ile Asn Asp Ser Gly Leu Pro Ala Ala Gly Glu Phe
130 135 140
Leu Asn Met Ile Thr Pro Gln Tyr Leu Ala Asp Leu Met Ser Trp Gly
145 150 155 160
Ala Ile Gly Ala Arg Thr Thr Glu Ser Gln Val His Arg Glu Leu Ala
165 170 175
Ser Gly Leu Ser Cys Pro Val Gly Phe Lys Asn Gly Thr Asp Gly Thr
180 185 190
Ile Lys Val Ala Ile Asp Ala Ile Asn Ala Ala Gly Ala Pro His Cys
195 200 205
Phe Leu Ser Val Thr Lys Trp Gly His Ser Ala Ile Val Asn Thr Ser
210 215 220
Gly Asn Gly Asp Cys His Ile Ile Leu Arg Gly Gly Lys Glu Pro Asn
225 230 235 240
Tyr Ser Ala Lys His Val Ala Glu Val Lys Glu Gly Leu Asn Lys Ala
245 250 255
Gly Leu Pro Ala Gln Val Met Ile Asp Phe Ser His Ala Asn Ser Ser
260 265 270
Lys Gln Phe Lys Lys Gln Met Asp Val Cys Ala Asp Val Cys Gln Gln
275 280 285
Ile Ala Gly Gly Glu Lys Ala Ile Ile Gly Val Met Val Glu Ser His
290 295 300
Leu Val Glu Gly Asn Gln Ser Leu Glu Ser Gly Glu Pro Leu Ala Tyr
305 310 315 320
Gly Lys Ser Ile Thr Asp Ala Cys Ile Gly Trp Glu Asp Thr Asp Ala
325 330 335
Leu Leu Arg Gln Leu Ala Asn Ala Val Lys Ala Arg Arg Gly
340 345 350
<210> 9
<211> 386
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 分支酸变位酶/预苯酸脱氢酶
<400> 9
Met Thr Ser Glu Asn Pro Leu Leu Ala Leu Arg Glu Lys Ile Ser Ala
1 5 10 15
Leu Asp Glu Lys Leu Leu Ala Leu Leu Ala Glu Arg Arg Glu Leu Ala
20 25 30
Val Glu Val Gly Lys Ala Lys Leu Leu Ser His Arg Pro Val Arg Asp
35 40 45
Ile Asp Arg Glu Arg Asp Leu Leu Glu Arg Leu Ile Thr Leu Gly Lys
50 55 60
Ala His His Leu Asp Ala His Tyr Ile Thr Arg Leu Phe Gln Leu Ile
65 70 75 80
Ile Glu Asp Ser Val Leu Thr Gln Gln Ala Leu Leu Gln Gln His Leu
85 90 95
Asn Lys Ile Asn Pro His Ser Ala Arg Ile Ala Phe Leu Gly Pro Lys
100 105 110
Gly Ser Tyr Ser His Leu Ala Ala Arg Gln Tyr Ala Ala Arg His Phe
115 120 125
Glu Gln Phe Ile Glu Ser Gly Cys Ala Lys Phe Ala Asp Ile Phe Asn
130 135 140
Gln Val Glu Thr Gly Gln Ala Asp Tyr Ala Val Val Pro Ile Glu Asn
145 150 155 160
Thr Ser Ser Gly Ala Ile Asn Asp Val Tyr Asp Leu Leu Gln His Thr
165 170 175
Ser Leu Ser Ile Val Gly Glu Met Thr Leu Thr Ile Asp His Cys Leu
180 185 190
Leu Val Ser Gly Thr Thr Asp Leu Ser Thr Ile Asn Thr Val Tyr Ser
195 200 205
His Pro Gln Pro Phe Gln Gln Cys Ser Lys Phe Leu Asn Arg Tyr Pro
210 215 220
His Trp Lys Ile Glu Tyr Thr Glu Ser Thr Ser Ala Ala Met Glu Lys
225 230 235 240
Val Ala Gln Ala Lys Ser Pro His Val Ala Ala Leu Gly Ser Glu Ala
245 250 255
Gly Gly Thr Leu Tyr Gly Leu Gln Val Leu Glu Arg Ile Glu Ala Asn
260 265 270
Gln Arg Gln Asn Phe Thr Arg Phe Val Val Leu Ala Arg Lys Ala Ile
275 280 285
Asn Val Ser Asp Gln Val Pro Ala Lys Thr Thr Leu Leu Met Ala Thr
290 295 300
Gly Gln Gln Ala Gly Ala Leu Val Glu Ala Leu Leu Val Leu Arg Asn
305 310 315 320
His Asn Leu Ile Met Pro Arg Leu Glu Ser Arg Pro Ile His Gly Asn
325 330 335
Pro Trp Glu Glu Met Phe Tyr Leu Asp Ile Gln Ala Asn Leu Glu Ser
340 345 350
Ala Glu Met Gln Lys Ala Leu Lys Glu Leu Gly Glu Ile Thr Arg Ser
355 360 365
Met Lys Val Leu Gly Cys Tyr Pro Ser Glu Asn Val Val Pro Val Asp
370 375 380
Pro Thr
385
<210> 10
<211> 331
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 羟基扁桃酸合酶
<400> 10
Met Lys Ile Leu Ala Tyr Cys Val Arg Pro Asp Glu Val Asp Ser Phe
1 5 10 15
Lys Lys Phe Ser Glu Lys Tyr Gly His Thr Val Asp Leu Ile Pro Asp
20 25 30
Ser Phe Gly Pro Asn Val Ala His Leu Ala Lys Gly Tyr Asp Gly Ile
35 40 45
Ser Ile Leu Gly Asn Asp Thr Cys Asn Arg Glu Ala Leu Glu Lys Ile
50 55 60
Lys Asp Cys Gly Ile Lys Tyr Leu Ala Thr Arg Thr Ala Gly Val Asn
65 70 75 80
Asn Ile Asp Phe Asp Ala Ala Lys Glu Phe Gly Ile Asn Val Ala Asn
85 90 95
Val Pro Ala Tyr Ser Pro Asn Ser Val Ser Glu Phe Thr Ile Gly Leu
100 105 110
Ala Leu Ser Leu Thr Arg Lys Ile Pro Phe Ala Leu Lys Arg Val Glu
115 120 125
Leu Asn Asn Phe Ala Leu Gly Gly Leu Ile Gly Val Glu Leu Arg Asn
130 135 140
Leu Thr Leu Gly Val Ile Gly Thr Gly Arg Ile Gly Leu Lys Val Ile
145 150 155 160
Glu Gly Phe Ser Gly Phe Gly Met Lys Lys Met Ile Gly Tyr Asp Ile
165 170 175
Phe Glu Asn Glu Glu Ala Lys Lys Tyr Ile Glu Tyr Lys Ser Leu Asp
180 185 190
Glu Val Phe Lys Glu Ala Asp Ile Ile Thr Leu His Ala Pro Leu Thr
195 200 205
Asp Asp Asn Tyr His Met Ile Gly Lys Glu Ser Ile Ala Lys Met Lys
210 215 220
Asp Gly Val Phe Ile Ile Asn Ala Ala Arg Gly Ala Leu Ile Asp Ser
225 230 235 240
Glu Ala Leu Ile Glu Gly Leu Lys Ser Gly Lys Ile Ala Gly Ala Ala
245 250 255
Leu Asp Ser Tyr Glu Tyr Glu Gln Gly Val Phe His Asn Asn Lys Met
260 265 270
Asn Glu Ile Met Gln Asp Asp Thr Leu Glu Arg Leu Lys Ser Phe Pro
275 280 285
Asn Val Val Ile Thr Pro His Leu Gly Phe Tyr Thr Asp Glu Ala Val
290 295 300
Ser Asn Met Val Glu Ile Thr Leu Met Asn Leu Gln Glu Phe Glu Leu
305 310 315 320
Lys Gly Thr Cys Lys Asn Gln Arg Val Cys Lys
325 330
<210> 11
<211> 357
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 羟基扁桃酸合酶
<400> 11
Met Gln Asn Phe Glu Ile Asp Tyr Val Glu Met Tyr Val Glu Asn Leu
1 5 10 15
Glu Val Ala Ala Phe Ser Trp Val Asp Lys Tyr Ala Phe Ala Val Ala
20 25 30
Gly Thr Ser Arg Ser Ala Asp His Arg Ser Ile Ala Leu Arg Gln Gly
35 40 45
Gln Val Thr Leu Val Leu Thr Glu Pro Thr Ser Asp Arg His Pro Ala
50 55 60
Ala Ala Tyr Leu Gln Thr His Gly Asp Gly Val Ala Asp Ile Ala Met
65 70 75 80
Ala Thr Ser Asp Val Ala Ala Ala Tyr Glu Ala Ala Val Arg Ala Gly
85 90 95
Ala Glu Ala Val Arg Ala Pro Gly Gln His Ser Glu Ala Ala Val Thr
100 105 110
Thr Ala Thr Ile Gly Gly Phe Gly Asp Val Val His Thr Leu Ile Gln
115 120 125
Arg Asp Gly Thr Ser Ala Glu Leu Pro Pro Gly Phe Thr Gly Ser Met
130 135 140
Asp Val Thr Asn His Gly Lys Gly Asp Val Asp Leu Leu Gly Ile Asp
145 150 155 160
His Phe Ala Ile Cys Leu Asn Ala Gly Asp Leu Gly Pro Thr Val Glu
165 170 175
Tyr Tyr Glu Arg Ala Leu Gly Phe Arg Gln Ile Phe Asp Glu His Ile
180 185 190
Val Val Gly Ala Gln Ala Met Asn Ser Thr Val Val Gln Ser Ala Ser
195 200 205
Gly Ala Val Thr Leu Thr Leu Ile Glu Pro Asp Arg Asn Ala Asp Pro
210 215 220
Gly Gln Ile Asp Glu Phe Leu Lys Asp His Gln Gly Ala Gly Val Gln
225 230 235 240
His Ile Ala Phe Asn Ser Asn Asp Ala Val Arg Ala Val Lys Ala Leu
245 250 255
Ser Glu Arg Gly Val Glu Phe Leu Lys Thr Pro Gly Ala Tyr Tyr Asp
260 265 270
Leu Leu Gly Glu Arg Ile Thr Leu Gln Thr His Ser Leu Asp Asp Leu
275 280 285
Arg Ala Thr Asn Val Leu Ala Asp Glu Asp His Gly Gly Gln Leu Phe
290 295 300
Gln Ile Phe Thr Ala Ser Thr His Pro Arg His Thr Ile Phe Phe Glu
305 310 315 320
Val Ile Glu Arg Gln Gly Ala Gly Thr Phe Gly Ser Ser Asn Ile Lys
325 330 335
Ala Leu Tyr Glu Ala Val Glu Leu Glu Arg Thr Gly Gln Ser Glu Phe
340 345 350
Gly Ala Ala Arg Arg
355
<210> 12
<211> 377
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 羟基扁桃酸氧化酶
<400> 12
Met Arg Glu Pro Leu Thr Leu Asp Asp Phe Ala Arg Leu Ala Arg Gly
1 5 10 15
Gln Leu Pro Ala Ala Thr Trp Asp Phe Ile Ala Gly Gly Ala Gly Arg
20 25 30
Glu Arg Thr Leu Ala Ala Asn Glu Ala Val Phe Gly Ala Val Arg Leu
35 40 45
Arg Pro Arg Ala Leu Pro Gly Ile Glu Glu Pro Asp Thr Ser Val Glu
50 55 60
Val Leu Gly Ser Arg Trp Pro Ala Pro Val Gly Ile Ala Pro Val Ala
65 70 75 80
Tyr His Gly Leu Ala His Pro Asp Gly Glu Pro Ala Thr Ala Ala Ala
85 90 95
Ala Gly Ala Leu Gly Leu Pro Leu Val Val Ser Thr Phe Ala Gly Arg
100 105 110
Ser Leu Glu Glu Val Ala Arg Ala Ala Ser Ala Pro Leu Trp Leu Gln
115 120 125
Leu Tyr Cys Phe Arg Asp His Glu Thr Thr Leu Gly Leu Ala Arg Arg
130 135 140
Ala Arg Asp Ser Gly Tyr Gln Ala Leu Val Leu Thr Val Asp Thr Pro
145 150 155 160
Phe Thr Gly Arg Arg Leu Arg Asp Leu Arg Asn Gly Phe Ala Val Pro
165 170 175
Ala His Ile Thr Pro Ala Asn Leu Thr Gly Thr Ala Ala Ala Gly Ser
180 185 190
Ala Thr Pro Gly Ala His Ser Arg Leu Ala Phe Asp Arg Arg Leu Asp
195 200 205
Trp Ser Phe Val Ala Arg Leu Gly Ala Ala Ser Gly Leu Pro Val Leu
210 215 220
Ala Lys Gly Val Leu Thr Ala Pro Asp Ala Glu Ala Ala Val Ala Ala
225 230 235 240
Gly Val Ala Gly Ile Val Val Ser Asn His Gly Gly Arg Gln Leu Asp
245 250 255
Gly Ala Pro Ala Thr Leu Glu Ala Leu Pro Glu Val Val Ser Ala Val
260 265 270
Arg Gly Arg Cys Pro Val Leu Leu Asp Gly Gly Val Arg Thr Gly Ala
275 280 285
Asp Val Leu Ala Ala Leu Ala Leu Gly Ala Arg Ala Val Leu Val Gly
290 295 300
Arg Pro Ala Leu Tyr Ala Leu Ala Val Gly Gly Ala Ser Gly Val Arg
305 310 315 320
Arg Met Leu Thr Leu Leu Thr Glu Asp Phe Ala Asp Thr Met Val Leu
325 330 335
Thr Gly His Ala Ala Thr Gly Thr Ile Gly Pro Asp Thr Leu Ala Pro
340 345 350
Pro His His Ala Pro Pro His His Gly Pro Pro Thr Ala Pro Arg Pro
355 360 365
Ala Pro His Arg Asp Arg Ser His Gly
370 375
<210> 13
<211> 348
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> D-扁桃酸脱氢酶
<400> 13
Met Pro Arg Pro Arg Val Leu Leu Leu Gly Asp Pro Ala Arg His Leu
1 5 10 15
Asp Asp Leu Trp Ser Asp Phe Gln Gln Lys Phe Glu Val Ile Pro Ala
20 25 30
Asn Leu Thr Thr His Asp Gly Phe Lys Gln Ala Leu Arg Glu Lys Arg
35 40 45
Tyr Gly Asp Phe Glu Ala Ile Ile Lys Leu Ala Val Glu Asn Gly Thr
50 55 60
Glu Ser Tyr Pro Trp Asn Ala Asp Leu Ile Ser His Leu Pro Ser Ser
65 70 75 80
Leu Lys Val Phe Ala Ala Ala Gly Ala Gly Phe Asp Trp Leu Asp Leu
85 90 95
Asp Ala Leu Asn Glu Arg Gly Val Ala Phe Ala Asn Ser Arg Gly Ala
100 105 110
Gly Asp Thr Ala Thr Ser Asp Leu Ala Leu Tyr Leu Ile Leu Ser Val
115 120 125
Phe Arg Leu Ala Ser Tyr Ser Glu Arg Ala Ala Arg Thr Gly Asp Pro
130 135 140
Glu Thr Phe Asn Arg Val His Leu Glu Ile Gly Lys Ser Ala His Asn
145 150 155 160
Pro Arg Gly His Val Leu Gly Ala Val Gly Leu Gly Ala Ile Gln Lys
165 170 175
Glu Ile Ala Arg Lys Ala Val His Gly Leu Gly Met Lys Leu Val Tyr
180 185 190
Tyr Asp Val Ala Pro Ala Asp Ala Glu Thr Glu Lys Ala Leu Gly Ala
195 200 205
Glu Arg Val Asp Ser Leu Glu Glu Leu Ala Arg Arg Ser Asp Cys Val
210 215 220
Ser Val Ser Val Pro Tyr Met Lys Leu Thr His His Leu Ile Asp Glu
225 230 235 240
Ala Phe Phe Ala Ala Met Lys Pro Gly Ser Arg Ile Val Asn Thr Ala
245 250 255
Arg Gly Pro Val Ile Ser Gln Asp Ala Leu Ile Ala Ala Leu Lys Ser
260 265 270
Gly Lys Leu Leu Ser Ala Gly Leu Asp Val His Glu Phe Glu Pro Gln
275 280 285
Val Ser Lys Glu Leu Ile Glu Met Lys His Val Thr Leu Thr Thr His
290 295 300
Ile Gly Gly Val Ala Ile Glu Thr Phe His Glu Phe Glu Arg Leu Thr
305 310 315 320
Met Thr Asn Ile Asp Arg Phe Leu Leu Gln Gly Lys Pro Leu Leu Thr
325 330 335
Pro Ala Gly Lys Val Phe Ala Pro Ser Ser Ala Ala
340 345
<210> 14
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 14
cgcgcatatg agaaaggttc ccattattac 30
<210> 15
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 15
cgcgggatcc ttagtgatgg tgatggtggt gggacttcat ttccttcaga c 51
<210> 16
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 16
tacagaattc atgttccgca gcgagtacgc 30
<210> 17
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 17
tattcctgca ggttagtgat ggtgatggtg gtgtcgcggc tccctgagct gtc 53
<210> 18
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 18
tacatcgtca gcggcgcc 18
<210> 19
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 19
ggcgccgctg acgatgta 18
<210> 20
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 20
cgcgcatatg gaaaacaatg caaacatgtt 30
<210> 21
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 21
cgcgaagctt ttagtgatgg tgatggtggt gtttttcttt gcgaaccatg ata 53
<210> 22
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 22
cgcggaattc atgaattatc agaacgacga 30
<210> 23
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 23
tattaagctt ttacccgcga cgcgctttta 30
<210> 24
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 24
tatcaagctt acacaggaaa cagaaatgac atcggaaaac ccgtt 45
<210> 25
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 25
cgcgaagctt tcaggttgga tcaacaggca 30
<210> 26
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 26
acaatctgat tatgccccgt ctggaatcac 30
<210> 27
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 27
gtgattccag acggggcata atcagattgt 30
<210> 28
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 28
tataggtacc acacaggaaa cagaaatggg gaccttcgtt attga 45
<210> 29
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 29
cgctgtcgac ttatcacttg tcatcgtcat 30
<210> 30
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 30
tataggatcc atgaaaatcc tggcgtattg cg 32
<210> 31
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 31
cgcgaagctt ttatttacaa acgcgctggt 30
<210> 32
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 32
cgcgctcgag gctgttgaca attaatcatc 30
<210> 33
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 33
cgcggagctc tgtagaaacg caaaaaggcc 30
<210> 34
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 34
tatacctgca ggacacagga aacagaaatg gaaaacaatg caaacat 47
<210> 35
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 35
tatgcctgca ggttagtgat ggtgatggtg gt 32
<210> 36
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 36
tatacctgca ggacacagga aacagaaatg aaaatcctgg cgtattgcg 49
<210> 37
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 37
cgcgaagctt ttatttacaa acgcgctggt 30
<210> 38
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 38
cggccatatg cttttagaag gagttaaagt 30
<210> 39
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 39
tattgcggcc gcttagtgat ggtgatggtg gtgatatctt acaactttac tat 53
<210> 40
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 40
tattcctgca ggcggataac aatttcacac aggaaacaga attcatgctt ttagaaggag 60
ttaa 64
<210> 41
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 41
cgcgcatatg ttaatatctt acaactttac 30
<210> 42
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 42
tattcctgca ggacacagga aacagaaatg cttttagaag gagttaa 47
<210> 43
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 43
tatacctgca ggttaatatc ttacaacttt ac 32
<210> 44
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 44
tataggtacc acacaggaaa cagaaatgcg ggaaccactc acgct 45
<210> 45
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 45
tataggatcc ttatccatgg ctcctatctc ggt 33
<210> 46
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 46
tataggatcc acacaggaaa cagaaatgcc tcgtccgcgc gtcct 45
<210> 47
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 47
tatgcctgca ggttatgcag cagatgacgg cgcaaa 36
<210> 48
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 48
tataggatcc acacaggaaa cagaaatgag aattacaatt gccgg 45
<210> 49
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 49
cgcgcctgca ggttattttg cttttaataa ctcttc 36
<210> 50
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 50
tattggtacc tcaggttgga tcaacaggca 30
<210> 51
<211> 71
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 51
atagtgtcat atcatcatat taattgttct tttttcaggt gaaggttccc taggtgacac 60
tatagaacgc g 71
<210> 52
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 52
cggctggtga tttcgtccag cgaaccttcc atcgcatctt cgcccacggc tagtggatct 60
gatgggtacc 70
<210> 53
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 53
tttccgtctt tgtgtcaatg attgttgaca gaaaccttcc tgctatccaa atagtgtcat 60
atcatcatat 70
<210> 54
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 54
gcgtgctggg ataattgcga taaagctggg ttaataccga gcgttcaaaa cggctggtga 60
tttcgtccag 70
<210> 55
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 55
tttctctccc atcccttccc cctccgtcag atgaactaaa cttgttaccg gacactatag 60
aacgcggccg 70
<210> 56
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 56
gcgcagcata tacaggctga aacctttggc ctgttcgagt ttgatctgcg ccgcataggc 60
cactagtgga 70
<210> 57
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 57
tatgcccgat gatattcctt tcatcgggct atttaaccgt tagtgcctcc tttctctccc 60
atcccttccc 70
<210> 58
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 58
tttgttttcg ccagttcgat cacttcatca ccgcgtccgc tgatgattgc gcgcagcata 60
tacaggctga 70
<210> 59
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 59
taccaaaggt gactggcaga atgaagtaaa cgtccgtgac ttcattcaga gacactatag 60
aacgcggccg 70
<210> 60
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 60
gcgagttgaa acgtactgcg tagccagata cacggatggt cagctgcgga ccgcataggc 60
cactagtgga 70
<210> 61
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 61
tgttacatgt ccgagcttaa tgaaaagtta gccacagcct gggaaggttt taccaaaggt 60
gactggcaga 70
<210> 62
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 62
agattgagtg aaggtacgag taataacgtc ctgctgctgt tctttagtca gcgagttgaa 60
acgtactgcg 70
<210> 63
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 63
tgaacttaac gcactcgtag agcgtgtaaa aaaagcccag cgtgaatatg gacactatag 60
aacgcggccg 70
<210> 64
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 64
gcttttttct cagctttagc cggagcagct tctttcttcg ctgcagtttc ccgcataggc 60
cactagtgga 70
<210> 65
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 65
aaaaaagttt aacattatca ggagagcatt atggctgtta ctaatgtcgc tgaacttaac 60
gcactcgtag ag 72
<210> 66
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 66
aggggccgtt tatgttgcca gacagcgcta ctgattaagc ggattttttc gcttttttct 60
cagctttagc cg 72
<210> 67
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 67
gcggaagcag ccaataagaa ggagaaggcg aatggctgag atgaaaaacc gacactatag 60
aacgcggccg 70
<210> 68
<211> 71
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 68
gtgtttcaaa aagttgacgc ctacgctggc gacccgattc ttacgcttat taggtgacac 60
tatagaacgc g 71
<210> 69
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 69
tggcaatggc gcgaatagcg taggcatcct cttccatacc ggcaccaaat tagtggatct 60
gatgggtacc 70
<210> 70
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 70
ccggtttatt gtgttttaac cacctgcccg taaacctgga gaaccatcgc gtgtttcaaa 60
aagttgacgc 70
<210> 71
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 71
ggagaaaatt ttcgagaacg aattgctcac cagagcgggt aatccagcgc tggcaatggc 60
gcgaatagcg 70
<210> 72
<211> 71
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 72
atgtttgaga acattaccgc cgctcctgcc gacccgattc tgggcctggc taggtgacac 60
tatagaacgc g 71
<210> 73
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 73
tagccgcgaa agcgcgcagt ccttcagcat cttcttccag accacgggca tagtggatct 60
gatgggtacc 70
<210> 74
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 74
cgttaccctg atagcggact tcccttctgt aaccataatg gaacctcgtc atgtttgaga 60
acattaccgc 70
<210> 75
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 75
caggccaaag tttttagagt aggaactggc aacaatcagc tctttatgca tagccgcgaa 60
agcgcgcagt 70
<210> 76
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 76
tataggatcc cgggcaagta ccttgccgac 30
<210> 77
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 77
tatcaagctt tcagcccata tgcaggccgc 30
<210> 78
<211> 85
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 78
tattggtacc ttgacggcta gctcagtcct aggtacagtg ctagcgaatt cacaggaaac 60
agaccatgac tgacgttgtc atcgt 85
<210> 79
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 79
tattggatcc tcagcccata tgcaggccgc 30
<210> 80
<211> 85
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 80
tattggtacc tttacggcta gctcagtcct aggtactatg ctagcgaatt cacaggaaac 60
agaccatgac tgacgttgtc atcgt 85
<210> 81
<211> 85
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 81
tattggtacc tttatggcta gctcagtcct aggtacaatg ctagcgaatt cacaggaaac 60
agaccatgac tgacgttgtc atcgt 85
<210> 82
<211> 85
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 82
tattggtacc tttacagcta gctcagtcct agggactgtg ctagcgaatt cacaggaaac 60
agaccatgac tgacgttgtc atcgt 85
<210> 83
<211> 85
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 83
tattggtacc ctgatagcta gctcagtcct agggattatg ctagcgaatt cacaggaaac 60
agaccatgac tgacgttgtc atcgt 85
<210> 84
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 84
acaggtgaac gagtcctttg gctttgagct ggaatttttt gactttctgc gacactatag 60
aacgcggccg 70
<210> 85
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 85
ttgcttaagt tttgcagcgt agtctgagaa atactggtca gagcttctgc ccgcataggc 60
cactagtgga 70
<210> 86
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 86
atgaaactcg ccgtttatag cacaaaacag tacgacaaga agtacctgca acaggtgaac 60
gagtcctttg 70
<210> 87
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 87
agcggcaaga ttaaaccagt tcgttcgggc aggtttcgcc tttttccaga ttgcttaagt 60
tttgcagcgt 70
<210> 88
<211> 77
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 88
ttgcttaagt tttgcagcgt agtctgagaa atactggtca gagcttctgc tgagcggata 60
catatttgaa tgtattt 77
<210> 89
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pJ23100 启动子
<400> 89
ttgacggcta gctcagtcct aggtacagtg ctagc 35
<210> 90
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pJ23105 启动子
<400> 90
tttacggcta gctcagtcct aggtactatg ctagc 35
<210> 91
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pJ23114 启动子
<400> 91
tttatggcta gctcagtcct aggtacaatg ctagc 35
<210> 92
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pJ23109 启动子
<400> 92
tttacagcta gctcagtcct agggactgtg ctagc 35
<210> 93
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pJ23103 启动子
<400> 93
ctgatagcta gctcagtcct agggattatg ctagc 35

Claims (10)

1.一种大肠杆菌(E.coli)的重组微生物，在该重组微生物中编码具有SEQNO ID:1的氨基酸序列的2-羟基异己酸-CoA转移酶HadA的基因、编码聚羟基链烷酸(PHA)合酶的突变体酶的基因、编码具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的3-脱氧-D-阿拉伯-庚酮糖酸-7-磷酸(DAHP)合酶的基因、编码具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的分支酸变位酶/预苯酸脱氢酶的基因和编码具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的D-乳酸脱氢酶的基因被导入能够从碳源生成乙酰-CoA的微生物中，在所述PHA的突变体酶中在SEQID NO:2的氨基酸序列中E130D、S325T、S477G和Q481K发生突变，其中所述重组微生物能够生成具有芳香族单体或长链2-羟基链烷酸酯(2-HA)单体的聚羟基链烷酸酯，并且
其中所述芳香族单体或长链2-羟基链烷酸酯(2-HA)单体选自2-羟基异己酸酯、2-羟基己酸酯、2-羟基辛酸酯、扁桃酸酯、4-羟基扁桃酸酯、苯基乳酸酯、4-羟基苯基乳酸酯、2-羟基-4-苯基丁酸酯、3-羟基-3-苯基丙酸酯和4-羟基苯甲酸。
2.根据权利要求1的重组微生物，其中所述2-羟基异己酸-CoA转移酶使用乙酰-CoA作为CoA供体。
3.根据权利要求1的重组微生物，其中所述重组微生物被进一步导入有编码β-酮硫解酶的基因和编码乙酰乙酰-CoA还原酶的基因。
4.根据权利要求1的重组微生物，其中所述重组微生物具有选自以下的至少一种基因的缺失：tyrR基因、编码丙酮酸氧化酶的基因、编码丙酮酸甲酸裂解酶的基因、编码乙醛脱氢酶的基因、编码富马酸还原酶的基因、编码酪氨酸氨基转移酶的基因和编码天冬氨酸氨基转移酶的基因。
5.根据权利要求1的重组微生物，其中所述微生物被进一步导入编码羟基扁桃酸合酶的基因、编码羟基扁桃酸氧化酶的基因和编码D-扁桃酸脱氢酶的基因。
6.根据权利要求5的重组微生物，其中所述编码羟基扁桃酸合酶的基因是编码由SEQID NO:11表示的氨基酸序列的基因。
7.根据权利要求5的重组微生物，其中所述编码羟基扁桃酸氧化酶的基因是编码由SEQID NO:12表示的氨基酸序列的基因。
8.根据权利要求5的重组微生物，其中所述编码D-扁桃酸脱氢酶的基因是编码由SEQID NO:13表示的氨基酸序列的基因。
9.一种生成具有芳香族单体或长链2-羟基链烷酸酯(2-HA)单体的聚羟基链烷酸酯的方法，所述方法包括：
(a)培养根据权利要求1至8中任一项的重组微生物，以生成具有芳香族单体或长链2-HA单体的聚羟基链烷酸酯，以及
(b)回收所生成的具有芳香族单体或长链2-HA单体的聚羟基链烷酸酯。
10.根据权利要求9的方法，其中在含有芳香族单体或长链2-HA单体的培养基中培养所述重组微生物。
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