KR102036828B1 - 2-하이드록시이소카프로에이트-CoA 전이효소를 이용한 폴리하이드록시알카노에이트의 제조방법 - Google Patents

2-하이드록시이소카프로에이트-CoA 전이효소를 이용한 폴리하이드록시알카노에이트의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 2-하이드록시이소카프로에이트-CoA 전이효소를 코딩하는 유전자 및 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소를 코딩하는 유전자가 도입되어 있으며, 방향족 단량체 또는 장사슬 2-HA를 단량체로 함유하는 폴리하이드록시알카노에이트 생성능을 가지는 재조합 미생물 및 상기 재조합 미생물을 이용한 방향족 단량체 또는 장사슬 2-HA 단량체를 함유하는 폴리하이드록시알카노에이트의 제조방법에 관한 것으로, 본 발명에 따르면, 방향족 단량체 또는 장사슬 2-HA를 단량체로 함유하는 생분해성 폴리머를 제조할 수 있다.

Description

2-하이드록시이소카프로에이트-CoA 전이효소를 이용한 폴리하이드록시알카노에이트의 제조방법{Method for Preparing Polyhydroxyalkanoates Using 2-Hydroxyisocaproate-CoA Transferase}
본 발명은 방향족 단량체 또는 장사슬 2-하이트록시알카노에이트(2-hydroxyalkanoate; 2-HA)를 단량체로 함유하는 폴리하이드록시알카노에이트의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 2-하이드록시이소카프로에이트-CoA 전이효소를 코딩하는 유전자 및 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소를 코딩하는 유전자가 도입되어 있으며, 방향족 단량체 또는 장사슬 2-HA를 단량체로 함유하는 폴리하이드록시알카노에이트 생성능을 가지는 재조합 미생물 및 상기 재조합 미생물을 이용한 방향족 단량체 또는 장사슬 2-HA를 단량체로 함유하는 폴리하이드록시알카노에이트의 제조방법에 관한 것이다.
폴리하이드록시알카노에이트(polyhydroxyalkanoates; PHAs)는 다양한 미생물에 의해 합성되는 생물학적 폴리에스테르(polyester)이다. 이들 폴리머는 생분해성과 생체적합성 특성을 갖는 열가소성 물질이며, 석유 기반 고분자와 유사한 물성을 가질 수 있기 때문에 다양한 산업적 생의학적 응용이 가능하고, 재생 자원으로부터 생성된다(Lee, S. Y. Biotechnol. Bioeng. 49:1 1996).
PHAs는 사이드 체인의 길이에 따라 짧은 탄소수를 가지는 SCL-PHA(short-chain-length PHA)와 긴 탄소수를 가지는 MCL-PHA(medium-chain-length PHA)로 구분되어진다. Ralstonia eutropha, pseudomonas, Bacillus 등의 미생물 유래의 PHA 합성 유전자를 클로닝하여 재조합 미생물을 제작하고 이를 통해 다양한 PHA가 합성된 바 있다(Qi et al., FEMS Microbiol. Lett., 157:155, 1997; Qi et al., FEMS Microbiol. Lett., 167:89, 1998; Langenbach et al., FEMS Microbiol. Lett., 150:303, 1997; WO 01/55436; US 6,143,952; WO 98/54329; WO 99/61624).
R-3-하이드록시부티르산(R-3-hydroxy butyric acid)의 호모 폴리머인 PHB와 같은 짧은 사이드 체인을 갖는 것들은 결정체의 열가소성 물질이며 잘 부러지는 저탄성의 특성을 갖고 있다. 반면에 긴 사이드 체인을 갖는 MCL-PHA는 보다 높은 탄성을 갖는다. PHB는 알려진 지 약 70년 정도 되었다(Lemoigne & Roukhelman, 1925). 반면에 MCL-PHA는 비교적 최근에 알려졌다(deSmet et al., J. Bacteriol.154:870-78 1983). 이들 공중합체는 PHB-co-HX(여기서 X는 3 하이드록시알카노에이트 또는 알카노에이트 또는 6 내지 그 이상의 탄소의 알케노에이트를 말한다)로 나타낼 수 있다. 특정 두 가지 단량체의 공중합체의 적당한 예로 폴리 PHB-co-3-하이드록시헥사노에이트가 있다(Brandl et al., Int.J. Biol. Macromol. 11:49, 1989; A mos & McInerey, Arch. Microbiol., 155:103, 1991; US 5,292,860).
PHA의 생합성은 CoA-transferase나 CoA-ligase에 의해 하이드록시산이 하이드록시아실-CoA로 전환되고, 전환된 하이드록시아실-CoA가 PHA synthase에 의해 고분자화되는 과정을 거친다. 천연 PHA synthase의 경우 2-하이드록시아실-CoA에 대한 활성이 3-하이드록시아실-CoA보다 매우 낮다. 그러나, 최근 본 발명자들은 Pseudomonas sp. 6-19의 PHA synthase (PhaC1 ps 6-19)를 유전자 조작하여 2-하이드록시아실-CoA의 한 종류인 락틸-CoA를 기질로 사용할 수 있도록 개발하였다(WO08/062996; Yang　et al.,　Biotechnol. Bioeng.,　105:150, 2010; Jung　et al., Biotechnol. Bioeng.,　105:161, 2010). PhaC1 ps 6-19는 매우 다양한 기질특이성을 가지고, 2-하이드록시아실-CoA의 한 종류인 락틸-CoA를 기질로 사용할 수 있기 때문에 다양한 종류의 2-하이드록시산을 2-하이드록시아실-CoA로 전환할 수 있는 시스템을 개발한다면 여러 종류의 2-하이드록시산을 함유한 새로운 PHA의 합성이 가능할 것이다.
이에, 본 발명자들은 새로운 2-하이드록시산을 함유한 PHA를 생합성하기 위한 방법을 개발하고자 예의 노력한 결과, 아세틸-CoA를 사용하는 2-하이드록시산을 2-하이드록시아실-CoA로 전환하는 효소를 스크리닝하고, 상기 효소를 사용하는 경우, in vitro 조건에서 다양한 종류의 2-하이드록시아실-CoA를 생산할 수 있고, 이를 이용하여 다양한 PHA의 생산이 가능하다는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 방향족 단량체 또는 장사슬 2-HA를 단량체로 함유하는 폴리하이드록시알카노에이트 생성능을 가지는 재조합 미생물을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 재조합 미생물을 이용하여, 방향족 단량체 또는 장사슬 2-HA를 단량체로를 함유하는 폴리하이드록시알카노에이트를 제조하는 방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 탄소원으로부터 아세틸-CoA 생성능을 가지는 미생물에서, 2-하이드록시이소카프로에이트-CoA 전이효소를 코딩하는 유전자 및 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소를 코딩하는 유전자가 도입되어 있으며, 방향족 단량체 또는 장사슬 2-HA를 단량체로 함유하는 폴리하이드록시알카노에이트 생성능을 가지는 재조합 미생물을 제공한다.
본 발명은 또한, (a) 상기 재조합 미생물을 배양하는 단계; 및 (b) 방향족 단량체 또는 장사슬 2-HA를 단량체로 함유하는 폴리하이드록시알카노에이트를 수득하는 단계를 포함하는 방향족 단량체 또는 장사슬 2-HA를 단량체로 함유하는 폴리하이드록시알카노에이트의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 탄소원으로부터 아세틸-CoA 생성능을 가지는 미생물에서, 2-하이드록시이소카프로에이트-CoA 전이효소를 코딩하는 유전자, 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소를 코딩하는 유전자, DAHP(3-데옥시-D-아라비노-헵툴로소네이트-7-인산) 합성효소를 코딩하는 유전자, 코리스메이트 뮤타아제/프레페네이트 디하이드로게네이즈를 코딩하는 유전자 및 D-락테이트 디하이드로게네이즈를 코딩하는 유전자가 증폭되어 있고, 페닐락테이트를 단량체로 함유하는 폴리하이드록시알카노에이트 생성능을 가지는 재조합 미생물을 제공한다.
본 발명은 또한, (a) 상기 재조합 미생물을 배양하는 단계; 및 (b) 페닐락테이트를 단량체로 함유하는 폴리하이드록시알카노에이트를 수득하는 단계를 포함하는 페닐락테이트를 단량체로 함유하는 폴리하이드록시알카노에이트의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 탄소원으로부터 아세틸-CoA 생성능을 가지는 미생물에서, 2-하이드록시이소카프로에이트-CoA 전이효소를 코딩하는 유전자, 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소를 코딩하는 유전자, DAHP(3-데옥시-D-아라비노-헵툴로소네이트-7-인산) 합성효소를 코딩하는 유전자, 코리스메이트 뮤타아제/프레페네이트 디하이드로게네이즈를 코딩하는 유전자 및 D-락테이트 디하이드로게네이즈를 코딩하는 유전자, 하이드록시만델레이트 합성효소를 코딩하는 유전자, 하이드록시만델레이트 산화효소를 코딩하는 유전자 및 D-만델레이트 탈수소효소를 코딩하는 유전자가 증폭되어 있고, 만델레이트를 단량체로 함유하는 폴리하이드록시알카노에이트 생성능을 가지는 재조합 미생물을 제공한다.
본 발명은 또한, (a) 상기 재조합 미생물을 배양하는 단계; 및 (b) 만델레이트를 단량체로 함유하는 폴리하이드록시알카노에이트를 수득하는 단계를 포함하는 만델레이트를 단량체로 함유하는 폴리하이드록시알카노에이트의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 따르면, 방향족 단량체 또는 장사슬 2-HA를 단량체로 함유하는 생분해성 폴리머를 제조할 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 방향족 폴리에스테르의 생합성 대사 경로를 나타낸 것으로, A는 FldA(신나모일-CoA:페닐락테이트 CoA-전이효소)를 사용하였을 때의 대사경로이고, B는 HadA(2-하이드록시이소카프로에이트-CoA 전이효소)를 사용하였을 때의 대사경로를 나타낸 것이다.
도 2는 HadA와 FldA의 아미노산 서열 상동성을 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 3의 a는 His-tag을 이용하여 HadA를 정제한 결과를 나타낸 것이고, b는 HadA가 아세틸-CoA를 CoA 공여체로 사용할 수 있는지 여부를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 HadA가 아세틸-CoA를 CoA 공여체로 사용하여 만델레이트, 4-하이드록시만델레이트, 페닐락테이트, 4-하이드록시페닐락테이트, 2-하이드록시-4-페닐부티레이트, 3-하이드록시-3-페닐프로피오네이트 및 4-하이드록시 벤조산을 해당 CoA 유도체로 전환할 있는지를 in vitro 효소 어세이 후 LC-MS 분석으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 HadA가 전환할 수 있는 다양한 기질들의 CoA 전환 반응을 분자식으로 나타낸 것이다.
도 6은 in silico 게놈 규모 대사 플럭스 분석에 따른 대사공학 분석을 실시하여, D-페닐락테이트 생산을 증가시킨 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 대장균 XB201TBAL에 의하여 생산된 폴리(3HB-co-D-페닐락테이트)를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 8 대장균 XB201TBAL에 의하여 생산된 폴리 (3HB-co-D-페닐락테이트-co-3-하이드록시-3-페닐프로피오네이트)와 폴리(3HB-co-D-페닐락테이트-co-D-만델레이트)를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 상이한 강도의 5 가지 프로모터 하에서 PhaAB를 발현하는 대장균 XB201TBAL 균주에서 폴리(3HB-co-D-페닐락테이트) 생산 결과를 나타낸 것이다.
도 10의 a 및 b는 AroGfbr, PheAfbr, FldH, HadA 및 PhaC1437를 발현하는 대장균 XB201TBAL 균주를 3HB를 함유한 MR 배지에서 유가식 발효하여 폴리(3HB-co-D-페닐락테이트)를 생산한 결과를 나타낸 것이고, c 및 d는 AroGfbr, PheAfbr, FldH, HadA, PhaC1437 및 BBa_J23114 프로모터 하에서 PhaAB를 발현하는 대장균 XB201TBAL 균주를 3HB 첨가없이 유가식 발효하여, 폴리(3HB-co-D-페닐락테이트)를 생산한 결과를 나타낸 것이며, e 및 f는 AroGfbr, PheAfbr, FldH, HadA, PhaC1437 및 BBa_J23114 프로모터 하에서 PhaAB를 발현하는 대장균 XB201TBAF 균주를 3HB 첨가없이 유가식 발효하여, 폴리(3HB-co-D-페닐락테이트)를 생산한 결과를 나타낸 것이다.
방향족 폴리에스테르는 주로 석유에서 생산되는 필수 플라스틱이다. 본 발명에서는 폴리하이드록시알카노에이트(PHA) 합성효소 및 조효소 A (CoA) 전이효소를 발현하는 대사공학적으로 조작된 대장균에 의하여, 글루코오스로부터 방향족 폴리에스테르 또는 장사슬 2-하이드록시알카노에이트를 단량체로 하는 폴리머를 원스탭으로 생산하는 방법을 확립하였다.
본 발명의 일양태에서는 방향족 폴리에스테르로 페닐락테이트를 함유하는 PHA를 생산하기 위하여, in vitro 분석에 의해 활성이 확인된 신나모일-CoA:페닐락테이트 CoA-전이효소(FldA) 및 4-쿠마레이트:CoA 리가제(4CL)를 PHA 합성효소와 함께 D-페닐락테이트 생산 대장균 균주에서 발현시켰다. 상기 균주는 in vivo에서 생성된 신나모일-CoA를 CoA 공여체로 사용하여 폴리(16.8 mol% D-락테이트-co-80.8 mol% 3HB-co-1.6mol % D-페닐락테이트-co-0.8mol % D-4-하이드록시페닐락테이트) 폴리머를 건조 세포 무게의 12.8 중량%의 함량으로 생산하였다.
그러나, 페닐락테이트 CoA-전이효소(FldA)의 방향족 기질 이용 범위는 매우 좁기 때문에 CoA 공여체로서 아세틸-CoA를 이용하여 다양한 방향족 하이드록시아실 CoA를 생성할 수 있는 2-이소카프레노일-CoA:2-하이드록시이소카프로에이트 CoA-transferase (HadA)을 확인하고 이를 선택하여 방향족 PHA 생산에 이용하였다. 높은 몰분율의 D-페닐락테이트를 포함하는 방향족 PHA를 대량 생산하기 위하여, 먼저 단량체인 D-페닐락테이트를 과잉 생성하도록 최적의 대사 경로를 설계하였다.
본 발명의 일 양태에서는, D-페닐락테이트 생산에 최적의 대사경로를 가지도록 대사공학적으로 조작된 대장균을 제조하기 위하여, tyrR 결손 대장균에서 피드백 저항 aroG, pheA와 fldH 유전자를 과발현시키고, 경쟁 대사경로(pflB, poxB, adhE 및 frdB)를 결실시켰으며, in silico 게놈 규모 대사 플럭스 분석에 따라 tyrB 및 aspC 유전자를 더 결실시켰다. 상기 대사공학적으로 조작된 대장균은 1.62g/L의 D-페닐락테이트를 생산하였다. 상기 D-페닐락테이트 과잉 생산 균주에 HadA와 PHA 합성효소를 발현시킨 경우, 건조 세포 무게의 15.8 중량%의 폴리(52.1mol % 3HB-co-47.9mol % D-페닐락테이트)이 생성되는 것을 확인하였다. 또한 4-하이드록시페닐락테이트, 만델레이트(mandelate) 및 3-하이드록시-3-페닐프로피오네이트를 포함하는 폴리에스테르를 제조함으로써 다양한 방향족 폴리에스테르를 제조할 수 있는 가능성을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 일 관점에서, 탄소원으로부터 아세틸-CoA 생성능을 가지는 미생물에서, 2-하이드록시이소카프로에이트-CoA 전이효소를 코딩하는 유전자 및 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소를 코딩하는 유전자가 도입되어 있으며, 방향족 단량체 또는 장사슬 2-HA를 단량체로 함유하는 폴리하이드록시알카노에이트 생성능을 가지는 재조합 미생물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 장사슬 2-HA는 탄소수 6~8의 2-하이드록시알카노에이트를 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 방향족 단량체 또는 장사슬 2-HA 단량체는 2-하이드록시이소카프로에이트, 2-하이드록시헥사노에이트, 2-하이드록시옥타노에이트, 페닐락테이트, 2-하이드록시-4-페닐부티레이트, 3-하이드록시-3-페닐프로피오네이트, 4-하이드록시벤조산 및 만델레이트로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소는 Ralstonia eutropha, Pseudomonas, Bacillus 및 Pseudomonas sp. 6-19으로 구성된 군에서 선택되는 균주 유래의 PHA synthase 또는 하기에서 선택되는 아미노산 서열을 가지는 PHA synthase의 변이효소인 것을 특징으로 할 수 있다:
서열번호 2의 아미노산 서열에서 E130D, S325T, L412M, S477R, S477H, S477F, S477Y, S477G, Q481M, Q481K 및 Q481R로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 변이를 포함하는 아미노산 서열;
서열번호 2의 아미노산 서열에서 E130D, S325T, L412M, S477G 및 Q481M이 변이된 아미노산 서열(C1335);
서열번호 2의 아미노산 서열에서 E130D, S477F 및 Q481K가 변이된 아미노산 서열(C1310); 및
서열번호 2의 아미노산 서열에서 E130D, S477F 및 Q481R이 변이된 아미노산 서열(C1312).
본 발명에 있어서, 상기 2-하이드록시이소카프로에이트-CoA 전이효소는 Clostridium difficile 630 유래의 hadA인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 2-하이드록시이소카프로에이트-CoA 전이효소는 아세틸-CoA를 CoA 공여체로 사용하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 미생물은 외부에서 3HB의 공급이 없이도 폴리머를 생산하기 위하여, 3-hydroxybutyryl-CoA 생합성에 관여하는 β-케토티올레이즈를 코딩하는 유전자와 아세토아세틸-CoA 리덕테이즈를 코딩하는 유전자가 추가로 도입되어 있는 것을 특징으로 할 수 있다.
다른 관점에서, 본 발명은 (a) 상기 재조합 미생물을 배양하는 단계; 및 (b) 방향족 단량체 또는 장사슬 2-HA를 단량체로 함유하는 폴리하이드록시알카노에이트를 수득하는 단계를 포함하는 방향족 단량체 또는 장사슬 2-HA를 단량체로 함유하는 폴리하이드록시알카노에이트의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명의 일 양태에서는 폴리하이드록시알카노에이트 합성에 사용되는 Pct(Propionyl-CoA transferase)가 페닐락테이트와 만델레이트를 각각 페닐락틸-CoA와 만델릴-CoA로 활성화할 수 있는지 여부를 확인하였다. Pct cp 의 돌연변이(Pct540)는 글리콜산, 젖산, 2-하이드록시부틸산, 2-하이드록시이소발러레이트 및 각종 하이드록시산 등의 2-하이드록시산을 포함하는 폴리에스테르의 생체 내 생산에 성공적으로 사용되고 있기 때문에, Pct540은 탄소수 및 수산기 위치에 대하여, 넓은 기질 스펙트럼을 가진다고 할 수 있다. 그러나, Pct540은 페닐락테이트 및 만델레이트에 대한 촉매 활성은 가지고 있지 않는 것을 확인하였으며, 따라서, 본 발명에서는 방향족 공중합체 생산을 위하여, 방향족 화합물에 대응하는 CoA 유도체를 활성화할 수 있는 신규 CoA-전이효소를 찾고자 하였다.
Clostridium sporogenes의 신나모일-CoA : 페닐락테이트 CoA-전이효소(FldA)는 신나모일-CoA를 CoA 공여체로 사용하여 페닐락테이트를 페닐락틸-CoA로 변환할 수 있는 것으로 보고되었다(Dickert, S. et al., Eur. J. Biochem. 267:3874, 2000). 신나모일-CoA는 대장균의 비천연 대사 물질이기 때문에 세포 내에 풍부한 대사산물인 아세틸-CoA를 CoA 공여체로 사용하는지 확인하기 위하여 C. sporogenes의 FldA와 99.0 %의 상동성을 가지는 Clostridium botulinum A str. ATCC 3502 유래의 FldA를 테스트하였다. 그러나 C. botulinum A str. ATCC 3502의 FldA는 CoA 공여체로서 아세틸-CoA를 이용하여 페닐락틸-CoA를 생성하는 촉매 활성을 갖지 않는 것을 확인하였다.
한편, Streptomyces coelicolor 4-coumarate:CoA 리가아제(4CL)가 리그닌, 플라보노이드, 파이토알렉신 등 식물의 2차 대사물질의 전구체를 생산하는 페닐프로파노이드 대사에 중요한 역할을 한다는 것이 알려져 있다(Kaneko, M.et al, J. Bacteriol. 185:20,2003). 따라서, 본 발명의 일 양태에서는 4CL을 도입함으로써 신나메이트에서 신나모일-CoA를 합성하는 생합성 경로를 설계하였다. 4CL 변이체를 사용하여, 신나메이트를 신나모일-CoA로 전환하는데 사용하였으며, 신나모일-CoA는 페닐락틸-CoA 형성을 위한 FldA의 CoA 공여체로 사용하였다. 그 결과, in vitro에서 4CL과 FldA의 순차적 반응에 의해 페닐락틸-CoA를 성공적으로 합성하였다. 이러한 결과는 4CL 및 FldA를 페닐락틸-CoA의 생성에 사용할 수 있는 것과 방향족 폴리에스테르 제조에 사용될 가능성을 확인하였다. 마찬가지로 다른 유망한 방향족 단량체인 4-하이드록시페닐락테이트도 4CL 변이체와 FldA의 in vitro 순차 반응에 의해 4-하이드록시페닐락틸-CoA로 변환되는 것을 확인하였다.
비천연 폴리에스테르의 제조에 있어서는 해당 CoA 기질의 중합을 위한 PHA 합성효소의 변이체를 선택하는 것이 중요하므로, 다양한 PHA 합성효소의 성능을 알아보기 위해 Pseudomonas sp. MBEL 6-19 PHA 합성효소 (PhaC Ps6-19 ) 변이체를 AroGfbr, PAL, 4CL, FldA 및 Pct540을 과잉 발현하는 대장균 XL1-Blue 에서 발현시켰다. 제작된 재조합 균주를 20g/L 글루코오스, 1g/L D-페닐락테이트 및 1g/L 소듐 3-하이드록시부티레이트(3HB)을 첨가한 MR 배지에서 배양하였다. 소듐 3-하이드록시부티레이트(3HB)는 Pct540 의해 PhaC의 선호 기질인 3HB-CoA로 전환되고, 충분한 양의 PHA의 생산을 가능하게 하기 때문에 폴리머의 생산을 강화하기 위하여 첨가하였다. 다른 PHA 합성효소 변이체를 발현하는 대장균 XL1-Blue는 다른 모노머 조성을 갖는 다양한 양의 폴리(D-락테이트-co-3HB-co-D-페닐락테이트)를 생산할 수 있다.
상기 실험 결과, PhaC 변이체에서 4개의 아미노산 치환(E130D, S325T, S477G 및 Q481K)을 포함하는 PhaC1437이 폴리(18.3 mol% D-락테이트-co-76.9 mol% 3HB-co-4.8 mol% D-페닐락테이트)를 건조 세포 무게의 7.8중량%로 생산하여 가장 적합한 PhaC 변이체인 것으로 확인되었다.
다음으로, in vivo에서 글루코오스로부터 D-페닐락테이트를 생성하도록 대장균을 조작하였다. 방향족 화합물의 생합성은 3-데옥시-D-아라비노-헵툴로소네이트-7-인산(DAHP)의 합성에서 시작되며, 상기 DAHP는 DAHP 합성효소에 의한 포스포에놀피루베이트(PEP)와 엘리쓰로즈-4-인산(E4P)의 축합으로 생성된다. 생성된 DAHP는 페닐피루베이트(PPA)로 전환된 후, D-락테이트 디하이드로게네이즈(FldH)에 의해 D-페닐락테이트로 전환된다(도 1). 방향족 화합물 생합성을 위한 대사경로는 다양한 저해기구에 의해 복잡하게 제어되는 것으로 알려져 있다. aroG에 의해 코딩되는 DAHP 합성효소와 pheA에 의하여 코딩되는 코리스메이트 뮤타아제/프레페네이트 디하이드로게네이즈의 발현은 L-페닐알라닌에 의하여 저해된다(ribe, D. E. et al., J. Bacteriol. 127:1085, 1976).
본 발명에서는 L-페닐알라닌에 의한 피드백 저해를 해제하기 위해 피드백 저해 내성 돌연변이 AroGfbr [AroG (D146N)] 및 PheAfbr [PheA (T326P)]를 구축하였다(Zhou, H. Y. et al., Bioresour. Technol. 101:4151, 2010; Kikuchi, Y. et al., Appl. Environ. Microbiol. 63:761, 1997). AroGfbr, PheAfbr 및 C. botulinum A str. ATCC 3502의 FldH를 발현하는 대장균 XL1-Blue는 글루코오스 15.2g/L로부터 D-페닐락테이트 0.372g/L를 생성하였다. 상기 균주의 PAL, 4CL, FldA, Pct540 및 PhaC1437의 과잉발현은 폴리(16.8 mol% D-락테이트-co-80.8 mol% 3HB-co-1.6 mol% D-페닐락테이트-co-0.8 mol% D-4-하이드록시페닐락테이트)를 건조세포 무게의 12.8 중량% 까지 증가시켰다. D-페닐락테이트를 포함하는 방향족 PHA를 제조하는 데에는 두가지의 문제가 있으며, 첫째는 고분자 합성의 효율 및 방향족 단량체의 함량이 매우 낮다는 것으로, 이는 신나모일-CoA를 CoA 공여체로 사용하는 FldA의 비효율성에 의한 것으로 생각되었다. 두번째는 방향족 PHA의 모노머 스펙트럼이 매우 좁다는 것이다. in vitro 효소 분석 결과, FldA가 CoA를 페닐락테이트 및 4-하이드록시페닐락테이트에 옮길 수 있지만, 만델레이트, 2-하이드록시-4-페닐부틸레이트, 3-하이드록시-3-페닐프로피오네이트 및 4-하이드록시 벤조산과 같은 기질로는 옮길 수 없다는 것을 확인하였다.
본 발명에서는 상기 문제를 해결하기 위하여, CoA 공여체로서 아세틸-CoA를 사용하여 방향족 기질의 스펙트럼이 넓은 효소를 찾아내었다. FldA 대한 상동 효소를 식별하기 위해 배열 유사성 분석을 실시하였으며, 다른 기원의 다양한 FldA 중 FldA와 48% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 Clostridium difficile의 2-이소카프레노일-CoA:2-하이드록시이소카프로네이트 CoA-전이효소(HadA)를 스크리닝하였다(도 2). HadA는 CoA 공여체로 isocaprenoyl-CoA를 이용하여 CoA를 2-하이드록시이소카프로에이트로 전환하는 것으로 알려져 있는 효소이기 때문에, 본 발명에서는 HadA가 아세틸-CoA를 CoA 공여체로 사용할 수 있는지 여부를 조사하였다(도 3). in vitro 효소 분석 결과, 흥미롭게도 HadA가 아세틸-CoA를 CoA 공여체로 사용하여 페닐락테이트를 페닐락틸-CoA로 활성화할 수 있는 것을 확인하였다(도 4).
또한, HadA는 만델레이트, 4-하이드록시만델레이트, 페닐락테이트, 4-하이드록시페닐락테이트, 2-하이드록시-4-페닐부티레이트, 3-하이드록시-3-페닐프로피오네이트 및 4-하이드록시 벤조산을 해당 CoA 유도체로 변환할 수 있다는 것을 in vitro 어세이 후 LC-MS 분석을 통하여 확인하였다(도 4 및 도 5). 따라서 HadA는 아세틸-CoA를 CoA 공여체로 사용하여 다양한 방향족 폴리에스테르를 보다 효율적으로 생산할 수 있는 가능성을 가지고 있다.
다음으로, 대사공학에 의해 방향족 단량체의 생성량을 증가시키기 위하여, 글루코오스로부터 D-페닐락테이트를 소량 생산(0.372g/L) 생산하는 AroGfbr, PheAfbr 및 FldH를 발현하는 대장균 XL1-Blue 균주를 대사공학적 조작을 통하여 수율을 상승시켰다. 방향족 아미노산 생합성을 억제하도록 조절하는 이중 전사조절 인자인 TyrR을 결실시킨 AroGfbr, PheAfbr 및 FldH를 발현하는 대장균 XBT 균주를 제작하였으며, 상기 대장균 XBT 균주는 16.4g/L의 글루코오스로부터 0.5g/L의 D-페닐락테이트를 생산하여, TyrR을 결실시키지 않은 상기 대장균 XL1-Blue 균주보다 30% 높은 생산성을 나타내었다. D-페닐락테이트 생합성과 충돌하는 경로를 제거하기 위하여, 대장균 XBT에서 poxB(피루브산 산화효소를 코딩하는 유전자), 피루브산 산화효소를 코딩하는 유전자), pflB(피루브산 포메이트 리아제를 코딩하는 유전자), adhE(아세트알데히드탈수소효소/ 알코올탈수소효소를 코딩하는 유전자) 및 frdB(푸마레이트 리덕테이즈를 코딩하는 유전자)를 결실시킨 대장균 XB201T를 제작하였다. AroGfbr, PheAfbr 및 FldH를 발현하는 대장균 XB201T 균주는 15.7g/L의 글루코오스로부터 0.55g/L의 D-페닐락테이트를 생산하였고, 이는 대장균 XBT보다 10% 높은 수율을 나타내는 것이다.
추가적으로, in silico 게놈 규모 대사 플럭스 분석에 따른 대사공학 분석을 실시하여, D-페닐락테이트 생산을 더욱 증가시켰다(도 6). 티로신 아미노전이효소를 코딩하는 tyrB 유전자 및 아스파라긴산 아미노전이효소를 코딩하는 aspC 유전자를 상기 대장균 XB201T 균주에 제거하고, L-페닐알라닌 생합성을 감소시켜 D-페닐락테이트로의 탄소 흐름을 강화하였다. 그 결과로 제작된 AroGfbr, PheAfbr 및 FldH를 발현하는 대장균 XB201TBA 균주는 18.5g/L의 글루코오스로부터 1.62g/L의 D-페닐락테이트를 생산하여 수율이 크게 높아졌으며, 이는 동일한 유전자를 발현하는 대장균 XL1 Blue 균주의 D-페닐락테이트 생산량보다 4.35 배 높아진 것이다.
AroGfbr, PheAfbr, FldH, PhaC1437 및 HadA를 발현하는 대장균 XB201TBAL를 20g/L 글루코오스 및 1g/L 소듐 3HB를 함유하는 배지에서 배양하면 폴리(52.1 mol% 3HB-co-47.9 mol% D-페닐락테이트)를 건조 세포 무게의 15.8 중량% 함량으로 생산하였다(도 7).
따라서, 본 발명은 또다른 관점에서, 탄소원으로부터 아세틸-CoA 생성능을 가지는 미생물에서, 2-하이드록시이소카프로에이트-CoA 전이효소를 코딩하는 유전자, 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소를 코딩하는 유전자, DAHP(3-데옥시-D-아라비노-헵툴로소네이트-7-인산) 합성효소를 코딩하는 유전자, 코리스메이트 뮤타아제/프레페네이트 디하이드로게네이즈를 코딩하는 유전자 및 D-락테이트 디하이드로게네이즈를 코딩하는 유전자가 도입되어 있고, 페닐락테이트를 단량체로 함유하는 폴리하이드록시알카노에이트 생성능을 가지는 재조합 미생물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 2-하이드록시이소카프로에이트-CoA 전이효소는 Clostridium difficile 630 유래의 hadA인 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 하이드록시알카노에이트 합성효소는 Ralstonia eutropha, Pseudomonas, Bacillus 및 Pseudomonas sp. 6-19으로 구성된 군에서 선택되는 균주 유래의 PHA synthase 또는 하기에서 선택되는 아미노산 서열을 가지는 PHA synthase의 변이효소인 것을 특징으로 할 수 있다:
서열번호 2의 아미노산 서열에서 E130D, S325T, L412M, S477R, S477H, S477F, S477Y, S477G, Q481M, Q481K 및 Q481R로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 변이를 포함하는 아미노산 서열;
서열번호 2의 아미노산 서열에서 E130D, S325T, L412M, S477G 및 Q481M이 변이된 아미노산 서열(C1335);
서열번호 2의 아미노산 서열에서 E130D, S477F 및 Q481K가 변이된 아미노산 서열(C1310); 및
서열번호 2의 아미노산 서열에서 E130D, S477F 및 Q481R이 변이된 아미노산 서열(C1312).
본 발명에 있어서, 상기 DAHP(3-데옥시-D-아라비노-헵툴로소네이트-7-인산) 합성효소를 코딩하는 유전자는 서열번호 8로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하는 유전자인 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 코리스메이트 뮤타아제/프레페네이트 디하이드로게네이즈를 코딩하는 유전자는 서열번호 9로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하는 유전자인 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 D-락테이트 디하이드로게네이즈를 코딩하는 유전자는 서열번호 10으로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하는 유전자인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에서 상기 도입되는 D-락테이트 디하이드로게네이즈를 코딩하는 유전자는 ldhA 유전자를 대체하는 fldH 유전자인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 미생물은 외부에서 3HB의 공급이 없이도 폴리머를 생산하기 위하여, 3-hydroxybutyryl-CoA 생합성에 관여하는 β-케토티올레이즈를 코딩하는 유전자와 아세토아세틸-CoA 리덕테이즈를 코딩하는 유전자가 추가로 도입되어 있는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에서 도입되는 β-케토티올레이즈를 코딩하는 유전자(phaA)와 아세토아세틸-CoA 리덕테이즈를 코딩하는 유전자(phaB)의 발현량을 프로모터의 강도를 통하여 조절하는 경우, PHA에 함유되는 D-페닐락테이트 단량체 몰분율을 조절할 수 있다.
본 발명의 일양태에서는 상이한 강도의 5 가지 프로모터 하에서 PhaAB를 발현하는 5 개의 상이한 플라스미드를 제작하고 AroGfbr, PheAfbr, FldH, PhaC1437 및 HadA를 발현하는 XB201TBAL 균주에 도입하였으며, PhaAB 발현이 감소함에 따라 D-페닐락테이트 단량체 몰분율은 증가하는 것을 확인하였다(도 9a, b 및 표 7). 이러한 결과는 대사 플럭스를 조절함으로써 다양한 방향족 단량체 몰분율을 갖는 방향족 폴리에스테르가 생성될 수 있음을 시사한다.
본 발명에 있어서, 상기 재조합 미생물은 tyrR 유전자, 피루브산 산화효소를 코딩하는 유전자, 피루브산 포메이트 리아제를 코딩하는 유전자, 아세트알데히드 탈수소효소를 코딩하는 유전자, 푸마레이트 리덕테이즈를 코딩하는 유전자, 티로신 아미노전이효소를 코딩하는 유전자, 및 아스파라긴산 아미노전이효소를 코딩하는 유전자로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자가 결실되어 있는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, (a) 상기 재조합 미생물을 배양하는 단계; 및 (b) 페닐락테이트를 단량체로 함유하는 폴리하이드록시알카노에이트를 수득하는 단계를 포함하는 페닐락테이트를 단량체로 함유하는 폴리하이드록시알카노에이트의 제조방법에 관한 것이다.
상기 방법이 다양한 방향족 중합체의 제조에 사용할 수 있는지를 확인하기 위하여, 만델레이트를 모노머로 사용하여 시험하였다. 만델레이트의 단일 폴리머 인 폴리만델레이트가 100℃의 비교적 높은 Tg를 갖는 열분해 저항성 폴리머이면서, 물질 특성은 폴리스티렌과 유사하기 때문이다. 폴리만델레이트는 석유산업에서 생산되는 만델레이트의 환상 이량체의 개환 중합에 의하여 화학적으로 합성되고 있다. AroGfbr, PheAfbr, FldH, PhaC1437 및 HadA를 발현하는 대장균 XB201TBAL을 1g/L 소듐 3HB 및 0.5g/L D-만델레이트을 함유하는 배지에서 배양하면 폴리(55.2 mol% 3HB-co-43 mol% D-페닐락테이트-co-1.8 mol% D-만델레이트)를 건조세포 무게의 11.6 중량% 함량으로 제조하였다(도 8a, b). 본 발명에서는 D-만델레이트를 기질로 하여 D-만델레이트를 포함하는 방향족 공중합체를 성공적으로 제조하였으며, 다음으로, 대사공학에 의해 D-만델레이트를 in vivo에서 생산하고자 하였다. 글루코오스로부터 D-만델레이트를 포함하는 방향족 공중합체를 생산하기 위해 AroGfbr, PheAfbr, FldH, PhaC1437 및 HadA를 발현하는 대장균 XB201TBAL에서 Amycolatopsis orientalis 유래 하이드록시만델레이트 합성효소(HmaS), S. coelicolor의 하이드록시만델레이트 산화효소(Hmo) 및 Rhodotorula graminis의 D-만델레이트 탈수소효소(Dmd)를 발현시켰다. 상기 조작된 균주를 20g/L의 글루코오스와 1g/L의 소듐 3HB를 함유하는 배지에서 배양하는 경우, 건조 세포 무게의 16.4 중량%의 폴리(92.9 mol%의 3HB-co-6.3 mol% D-페닐락테이트-co-0.8 mol% D-만델레이트)를 생산하였다.
따라서, 본 발명은 또다른 관점에서, 탄소원으로부터 아세틸-CoA 생성능을 가지는 미생물에서, 2-하이드록시이소카프로에이트-CoA 전이효소를 코딩하는 유전자, 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소를 코딩하는 유전자, DAHP(3-데옥시-D-아라비노-헵툴로소네이트-7-인산) 합성효소를 코딩하는 유전자, 코리스메이트 뮤타아제/프레페네이트 디하이드로게네이즈를 코딩하는 유전자 및 D-락테이트 디하이드로게네이즈를 코딩하는 유전자, 하이드록시만델레이트합성효소를 코딩하는 유전자, 하이드록시만델레이트 산화효소를 코딩하는 유전자 및 D-만델레이트 탈수소효소를 코딩하는 유전자가 도입되어 있고, 만델레이트를 단량체로 함유하는 폴리하이드록시알카노에이트 생성능을 가지는 재조합 미생물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 2-하이드록시이소카프로에이트-CoA 전이효소는 Clostridium difficile 630 유래의 hadA인 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 하이드록시알카노에이트 합성효소는 Ralstonia eutropha, Pseudomonas, Bacillus 및 Pseudomonas sp. 6-19으로 구성된 군에서 선택되는 균주 유래의 PHA synthase 또는 하기에서 선택되는 아미노산 서열을 가지는 PHA synthase의 변이효소인 것을 특징으로 할 수 있다:
서열번호 2의 아미노산 서열에서 E130D, S325T, L412M, S477R, S477H, S477F, S477Y, S477G, Q481M, Q481K 및 Q481R로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 변이를 포함하는 아미노산 서열;
서열번호 2의 아미노산 서열에서 E130D, S325T, L412M, S477G 및 Q481M이 변이된 아미노산 서열(C1335);
서열번호 2의 아미노산 서열에서 E130D, S477F 및 Q481K가 변이된 아미노산 서열(C1310); 및
서열번호 2의 아미노산 서열에서 E130D, S477F 및 Q481R이 변이된 아미노산 서열(C1312).
본 발명에 있어서, 상기 DAHP(3-데옥시-D-아라비노-헵툴로소네이트-7-인산) 합성효소를 코딩하는 유전자는 서열번호 8로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하는 유전자인 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 코리스메이트 뮤타아제/프레페네이트 디하이드로게네이즈를 코딩하는 유전자는 서열번호 9로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하는 유전자인 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 D-락테이트 디하이드로게네이즈를 코딩하는 유전자는 서열번호 10으로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하는 유전자인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 하이드록시만델레이트합성효소를 코딩하는 유전자는 서열번호 11로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하는 유전자인 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 하이드록시만델레이트 산화효소를 코딩하는 유전자는 서열번호 12로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하는 유전자인 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 D-만델레이트 탈수소효소를 코딩하는 유전자는 서열번호 13으로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하는 유전자인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 미생물은 외부에서 3HB의 공급이 없이도 폴리머를 생산하기 위하여, 3-hydroxybutyryl-CoA 생합성에 관여하는 β-케토티올레이즈를 코딩하는 유전자와 아세토아세틸-CoA 리덕테이즈를 코딩하는 유전자가 추가로 도입되어 있는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 또다른 관점에서, (a) 상기 재조합 미생물을 배양하는 단계; 및 (b) 만델레이트를 단량체로 함유하는 폴리하이드록시알카노에이트를 수득하는 단계를 포함하는 만델레이트를 단량체로 함유하는 폴리하이드록시알카노에이트의 제조방법에 관한 것이다.
아울러, 본 발명에서는 본 발명의 재조합 균주를 이용하여, 다양한 장사슬 2-HA를 함유하는 폴리하이드록시알카노에이트의 제조가 가능한지 확인하기 위하여, 장사슬 2-HA 모노머인 2-하이드록시이소카프로에이트(2HIC), 2-하이드록시헥사노에이트(2HH) 및 2-하이드록시옥타노에이트(2HO)를 단량체로 사용하여, 폴리머 생산능을 확인하였으며, 그 결과, 2-하이드록시이소카프로에이트, 2-하이드록시헥사노에이트 혹은 2-하이드록시옥타노에이트를 함유하는 공중합체를 생성하는 것을 확인하였으며, 배지 내에 함유된 2-HA의 농도가 증가할수록 공중합체 내에 함유하는 단량체의 몰분율이 증가하는 것을 확인하였다 (표 4, 표 5 및 표 6).
따라서, 본 발명은 또 다른 관점에서, (a) 상기 방향족 단량체 또는 장사슬 2-HA를 단량체로 함유하는 폴리하이드록시알카노에이트 생성능을 가지는 재조합 미생물을 2-하이드록시이소카프로에이트, 2-하이드록시헥사노에이트 및 2-하이드록시옥타노에이트로 구성되는 군에서 선택되는 화합물을 함유하는 배지에서 배양하는 단계; 및 (b) 2-하이드록시이소카프로에이트, 2-하이드록시헥사노에이트 및 2-하이드록시옥타노에이트로 구성되는 군에서 선택되는 화합물을 단량체로 함유하는 폴리하이드록시알카노에이트를 수득하는 단계를 포함하는 2-하이드록시이소카프로에이트, 2-하이드록시헥사노에이트 및 2-하이드록시옥타노에이트로 구성되는 군에서 선택되는 화합물을 단량체로 함유하는 폴리하이드록시알카노에이트의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에서는 PHA 생성이 가능한 다른 방향족 단량체로서 3-하이드록시-3-페닐프로피오네이트(3HPh)를 사용하여 방향족 폴리머 생산을 확인하였다. 대장균 XB201TBA 균주를 20g/L 글루코오스, 0.5g/L 3-하이드록시-3-페닐프로피온산 및 1g/L 소듐 3HB를 함유하는 배지에서 배양하면 폴리 (33.3 mol% 3HB-co-18 mol% D-페닐락테이트-co-48.7 mol% 3HPh)를 건조세포 무게의 14.7 중량%로 생산하는 것을 확인하였다(도 8c, d). 이러한 결과는 본 발명에서 개발된 HadA와 변이된 PHA 합성 효소가 다양한 방향족 폴리에스테르의 제조에 널리 사용할 수 있음을 시사한다.
마지막으로, 대사적으로 조작된 대장균에 의해 생산되는 방향족 PHA의 물질 특성을 조사하였다. 폴리(52.1 mol% 3HB-co-47.9 mol% D-페닐락테이트)는 무정형이었으며, 공중합체 중의 D-페닐락테이트의 몰 분율이 증가함에 따라 분자량의 감소에도 불구하고 Tg는 23.86℃까지 크게 증가하였다. 또한, 폴리머 중에 방향족을 포함하는 공중합체는 결정화도가 감소하였다. 폴리머의 방향족 고리가 P(3HB)의 결정화를 방해하는 것으로 추측된다. P(3HB)의 경우, 강한 결정성으로 인해 높은 취성(brittleness)을 나타내는 것에 비해, 생성된 공중합체의 경우 결정화도의 저하 및 Tg의 향상으로 인해 기계적 인성의 향상을 초래하였다.
본 발명에서는 다양한 방향족 폴리에스테르의 제조를 위하여, 세균 플랫폼 시스템을 개발하였다. 본 발명의 방향족 고분자 생산 시스템은 방향족 화합물을 그 CoA 유도체로 활성화하기 위한 새로운 광범위한 기질 범위를 가지는 CoA-전이효소를 확인하고, 이들의 방향족 CoA 유도체를 중합할 수 있는 PHA 합성효소 변이체 및 생체 내에서 방향족 단량체를 과잉 생성하는 경로를 대사의 설계 및 최적화를 통하여 수립하였다.
본 발명의 여러 양태에서 몇가지 방향족 모노머를 사용하여, 입증한 바와 같이 이러한 시스템은 다양한 방향족 중합체의 제조에 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따르면, HadA(또는 관련 효소) 및 PHA 합성효소가 원하는 방향족 모노머를 수용하도록 조작 할 수 있다. 본 발명에서 개발된 박테리아 플랫폼 시스템은 재생 가능한 비식량 바이오매스로부터 방향족 폴리에스테르의 제조를 위한 바이오 프로세스를 확립하는데 기여할 수 있다.
본 발명에서, "벡터(vector)"는 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자, 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다. 적당한 숙주로 형질전환되면, 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 플라스미드가 현재 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이므로, 본 발명의 명세서에서 "플라스미드(plasmid)" 및 "벡터(vector)"는 때로 상호 교환적으로 사용된다. 본 발명의 목적상, 플라스미드 벡터를 이용하는게 바람직하다. 이러한 목적에 사용될 수 있는 전형적인 플라스미드 벡터는 (a) 숙주세포당 수백 개의 플라스미드 벡터를 포함하도록 복제가 효율적으로 이루어지도록 하는 복제 개시점, (b) 플라스미드 벡터로 형질전환된 숙주세포가 선발될 수 있도록 하는 항생제 내성 유전자 및 (c) 외래 DNA 절편이 삽입될 수 있는 제한효소 절단부위를 포함하는 구조를 지니고 있다. 적절한 제한효소 절단부위가 존재하지 않을지라도, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터(oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용하면 벡터와 외래 DNA를 용이하게 라이게이션(ligation)할 수 있다.
라이게이션 후에, 벡터는 적절한 숙주세포로 형질전환 되어야 한다. 본 발명에 있어서, 선호되는 숙주세포는 원핵세포이다. 적합한 원핵 숙주세포는 E. coli DH5α, E. col JM101, E. coli K12, E. coli W3110, E. coli X1776, E. coli XL-1Blue(Stratagene), E. coli B, E. coli B21 등을 포함한다. 그러나 FMB101, NM522, NM538 및 NM539와 같은 E. coli 균주 및 다른 원핵생물의 종(speices) 및 속(genera)등이 또한 사용될 수 있다. 전술한 E. coli에 덧붙여, 아그로박테리움 A4와 같은 아그로박테리움 속 균주, 바실루스 섭틸리스(Bacillus subtilis)와 같은 바실리(bacilli), 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella typhimurium) 또는 세라티아 마르게센스(Serratia marcescens)와 같은 또 다른 장내세균 및 다양한 슈도모나스(Pseudomonas) 속 균주가 숙주세포로서 이용될 수 있다.
원핵세포의 형질전환은 Sambrook et al., supra의 1.82 섹션에 기술된 칼슘 클로라이드 방법을 사용해서 용이하게 달성될 수 있다. 선택적으로, 전기천공법(electroporation)(Neumann et al., EMBO J., 1:841, 1982) 또한 이러한 세포들의 형질전환에 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 유전자의 과발현을 위하여 사용되는 벡터는 당업계에 공지된 발현 벡터가 사용될 수 있으며, pET 계열 벡터(Novagen)를 사용하는 것이 바람직하다. 상기 pET 계열 벡터를 사용하여 클로닝을 수행하면, 발현되는 단백질의 말단에 히스티딘기들이 결합되어 나오므로, 상기 단백질을 효과적으로 정제할 수 있다. 클로닝된 유전자로부터 발현된 단백질을 분리하기 위해서는 당업계에 공지된 일반적인 방법이 이용될 수 있으며, 구체적으로, Ni-NTA His-결합 레진(Novagen)을 사용하는 크로마토그래피 방법을 이용하여 분리할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 재조합벡터는 pET-SLTI66인 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 숙주세포는 대장균 또는 아그로박테리움인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에서 "발현 조절 서열 (expression control sequence)"이라는 표현은 특정한 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열의 발현에 필수적인 DNA 서열을 의미한다. 이러한 조절 서열은 전사를 실시하기 위한 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다. 예를 들면, 원핵생물에 적합한 조절 서열은 프로모터, 임의로 오퍼레이터 서열 및 리보좀 결합 부위를 포함한다. 진핵세포는 프로모터, 폴리아데닐화 시그날 및 인핸서가 이에 포함된다. 플라스미드에서 유전자의 발현 양에 가장 영향을 미치는 인자는 프로모터이다. 고 발현용의 프로모터로서 SRα 프로모터와 사이토메가로바이러스 (cytomegalovirus) 유래 프로모터 등이 바람직하게 사용된다. 본 발명의 DNA 서열을 발현시키기 위하여, 매우 다양한 발현 조절 서열중 어느 것이라도 벡터에 사용될 수 있다. 유용한 발현 조절서열에는, 예를 들어, SV40 또는 아데노바이러스의 초기 및 후기 프로모터들, lac 시스템, trp 시스템, TAC 또는 TRC 시스템, T3 및 T7 프로모터들, 파지 람다의 주요 오퍼레이터 및 프로모터 영역, fd 코드 단백질의 조절 영역, 3-포스포글리세레이트 키나제 또는 다른 글리콜분해 효소에 대한 프로모터, 상기 포스파타제의 프로모터들, 예를 들어, Pho5, 효모 알파-교배 시스템의 프로모터 및 원핵세포 또는 진핵 세포 또는 바이러스의 유전자 발현을 조절하는 것으로 알려진 기타 다른 서열 및 이들의 여러 조합이 포함된다. T7 프로모터는 대장균에서 본 발명의 단백질을 발현시키는데 유용하게 사용될 수 있다.
핵산은 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 배치될 때 "작동가능하게 연결 (operably linked)"된다. 이것은 적절한 분자 (예를 들면, 전사 활성화 단백질)은 조절 서열(들)에 결합될 때 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결된 유전자 및 조절 서열(들)일 수 있다. 예를 들면, 전서열(pre-sequence) 또는 분비 리더 (leader)에 대한 DNA는 폴리펩타이드의 분비에 참여하는 전단백질로서 발현되는 경우 폴리펩타이드에 대한 DNA에 작동가능하게 연결되고; 프로모터 또는 인핸서는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 번역을 용이하게 하도록 배치되는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로, "작동가능하게 연결된"은 연결된 DNA 서열이 접촉하고, 또한 분비 리더의 경우 접촉하고 리딩 프레임 내에 존재하는것을 의미한다. 그러나, 인핸서 (enhancer)는 접촉할 필요가 없다. 이들 서열의 연결은 편리한 제한 효소 부위에서 라이게이션(연결)에 의해 수행된다. 그러한 부위가 존재하지 않는 경우, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 (oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용한다.
본원 명세서에 사용된 용어 "발현 벡터"는 통상 이종의 DNA의 단편이 삽입된 재조합 캐리어 (recombinant carrier)로서 일반적으로 이중 가닥의 DNA의 단편을 의미한다. 여기서, 이종 DNA는 숙주 세포에서 천연적으로 발견되지 않는 DNA인 이형 DNA를 의미한다. 발현 벡터는 일단 숙주 세포내에 있으면 숙주 염색체 DNA와 무관하게 복제할 수 있으며 벡터의 수 개의 카피 및 그의 삽입된(이종) DNA가 생성될 수 있다.
당업계에 주지된 바와 같이, 숙주세포에서 형질감염 유전자의 발현 수준을 높이기 위해서는, 해당 유전자가, 선택된 발현 숙주 내에서 기능을 발휘하는 전사 및 해독 발현 조절 서열에 작동가능하도록 연결되어야만 한다. 바람직하게는 발현 조절서열 및 해당 유전자는 세균 선택 마커 및 복제 개시점(replication origin)을 같이 포함하고 있는 하나의 발현 벡터 내에 포함되게 된다. 숙주세포가 진핵세포인 경우에는, 발현 벡터는 진핵 발현 숙주 내에서 유용한 발현 마커를 더 포함하여야만 한다.
상술한 발현 벡터에 의해 형질전환 또는 형질감염된 숙주 세포는 본 발명의 또 다른 측면을 구성한다. 본원 명세서에 사용된 용어 "형질전환"은 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체외 인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 복제 가능하게 되는 것을 의미한다. 본원 명세서에 사용된 용어 "형질감염"은 임의의 코딩 서열이 실제로 발현되든 아니든 발현 벡터가 숙주 세포에 의해 수용되는 것을 의미한다.
물론 모든 벡터와 발현 조절 서열이 본 발명의 DNA 서열을 발현하는데 모두 동등하게 기능을 발휘하지는 않는다는 것을 이해하여야만 한다. 마찬가지로 모든 숙주가 동일한 발현 시스템에 대해 동일하게 기능을 발휘하지는 않는다. 그러나, 당업자라면 과도한 실험적 부담없이 본 발명의 범위를 벗어나지 않는 채로 여러 벡터, 발현 조절 서열 및 숙주 중에서 적절한 선택을 할 수 있다. 예를 들어, 벡터를 선택함에 있어서는 숙주를 고려하여야 하는데, 이는 벡터가 그 안에서 복제되어야만 하기 때문이다. 벡터의 복제 수, 복제 수를 조절할 수 있는 능력 및 당해 벡터에 의해 코딩되는 다른 단백질, 예를 들어 항생제 마커의 발현도 또한 고려되어야만 한다. 발현 조절 서열을 선정함에 있어서도, 여러 가지 인자들을 고려하여야만 한다. 예를 들어, 서열의 상대적 강도, 조절가능성 및 본 발명의 DNA 서열과의 상용성 등, 특히 가능성있는 이차 구조와 관련하여 고려하여야 한다. 단세포 숙주는 선정된 벡터, 본 발명의 DNA 서열에 의해 코딩되는 산물의 독성, 분비 특성, 단백질을 정확하게 폴딩시킬 수 있는 능력, 배양 및 발효 요건들, 본 발명 DNA 서열에 의해 코딩되는 산물을 숙주로부터 정제하는 것의 용이성 등의 인자를 고려하여 선정되어야만 한다. 이들 변수의 범위내에서, 당업자는 본 발명의 DNA 서열을 발효 또는 대규모 동물 배양에서 발현시킬 수 있는 각종 벡터/발현 조절 서열/숙주 조합을 선정할 수 있다. 발현 클로닝에 의해 본 발명에 따른 단백질의 cDNA를 클로닝하려고 할 때의 스크리닝법으로서 바인딩법(binding법), 페닝법(panning법), 필름에멀션법(film emulsion 법)등이 적용될 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
하기 실시예에서는 재조합 미생물로 대장균을 사용하였으나, 탄소원으로 부터 아세틸-CoA를 생성하는 미생물이라면 제한없이 사용할 수 있으며, 알칼리제네스(Alcaligenes)속, 슈도모나스(Pseudomonas)속, 에스케리치아(Escherichia)속, 랄스토니아(Ralstonia)속, 바실러스(Bacillus)속, 코리네박테리움(Corynebacterium) 등을 사용할 수 있다.
본 발명에서 사용 또는 제작된 재조합 균주, 플라스미드 및 프라이머를 표 1~3에 나타내었다.
균주명 특징 입수처
XL1-Blue recA1 endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44 relA1 lac [F′ proAB lacI q ZΔM15 Tn10 (TetR)] Stratagenea
BL21(DE3) BL21(DE3) F - ompT hsdSB ( rB - mB -) gal dcm (DE3) Invitrogenb
XBT XL1-Blue ΔtyrR 본 발명
XB201T XL1-Blue ΔtyrR △poxB △pflB △adhE △frdB 본 발명
XB201TB XL1-Blue ΔtyrR △poxB △pflB △adhE △frdBΔtyrB 본 발명
XB201TBA XL1-Blue ΔtyrR △poxB △pflB △adhE △frdB ΔtyrB ΔaspC 본 발명
XB201TBAL XL1-Blue ΔtyrR △poxB △pflB △adhE △frdB ΔtyrB ΔaspCΔldhA 본 발명
XB201TBAF XL1-Blue ΔtyrR△poxB△pflB△adhE△frdBΔtyrBΔaspCΔldhA::Ptrc-fldH-rrnBT 본 발명
플라스미드 특징
Abbreviations: Ap, ampicillin; Km, kanamycin; Cm, chloramphenicol; R,resistance.		 입수처
pKD46 λ-Red recombinase under arabinose inducible araBAD promoter, temperature sensitive origin; ApR 1
pJW168 lox66-cat-lox71 cassette; CmRApR 2
pMloxC Cre-recombinase under IPTG inducible lacUV5 promoter, temperature sensitive origin; ApR 3
pMtrc9 pMloxC derivative; trc promoter downstream of lox66-cat-lox71 cassette; ApR
pKM212-MCS pBBR1MCS2 derivative; promoter, PHA biosynthesis genes transcription terminator; KmR 4
pET-22b(+) Expression vector, T7 promoter; ApR Novagenc
pPs619C1437Pct540 pBluescript II KS(+) derivative; Ralstonia eutropha PHA biosynthesis operon
promoter, Pseudomonas sp. MBEL 6-19 phaCP s6-19 variant (phaC1437; E130D, S325T, S477G, Q481K), Clostridium propionicum pctCp variant (pct540; V193A, silent mutations: T78C, T669C, A1125G, T1158C), transcriptional terminator of theR. eutropha PHA biosynthesis operon; ApR 		5
pPs619C1wtPct540 pPs619C1437Pct540 derivative; phaC1437 was replaced by phaC1Ps 6-19wild type;
ApR 		6
pPs619C1202Pct540 pPs619C1437Pct540 derivative; phaC1437 was replaced by phaC1202 (E130D,Q481K); ApR 5
pPs619C1301Pct540 pPs619C1437Pct540 derivative; phaC1437 was replaced by phaC1301 (E130D,S325T, Q481K); ApR 5
pPs619C1310Pct540 pPs619C1437Pct540 derivative; phaC1437 was replaced by phaC1310 (E130D, S477F, Q481K); ApR 5
pPs619C1439Pct540 pPs619C1437Pct540 derivative; phaC1437 was replaced by phaC1439 (E130D, S325T, S477F, Q481K); ApR 5
pCnCAB pBluescript II KS(+) derivative; R. eutropha PHA biosynthesis operon
promoter, R. eutropha phaCAB genes, transcriptional terminator of the R. eutropha
PHA biosynthesis operon, ApR 		5
pCnAB pCnCAB derivative; R. eutropha PHA biosynthesis operon promoter, R. eutropha
phaAB; ApR 		7
pPs619C1437-HadA pBluescript II KS(+) derivative; R. eutropha PHA biosynthesis operon promoter, Pseudomonas sp. MBEL 6-19 phaCP s6-19variant (phaC1437; E130D, S325T, S477G, Q481K), Clostridium difficile hadA gene, transcriptional terminator of the R. eutropha PHA biosynthesis operon; ApR 본 발명
pET22b-hisPCT540 pET22b(+) derivative; T7 promoter, the C. propionicum pct540 gene; ApR 본 발명
pET22b-his4CL pET22b(+) derivative; promoter,the S. coelicolor gene; ApR 본 발명
pET22b-his4CL(A294G) pET22b(+) derivative; promoter,the S. coelicolor (A294G) gene; ApR 본 발명
pET22b-hisFldA pET22b(+) derivative; promoter,the C. botulinum A str. ATCC 3502 fldA gene; ApR 본 발명
pKM212-AroGfbr pKM212-MCS derivative; tac promoter, the E. coli feedback resistant aroG(D146N) gene; KmR 본 발명
pKM212-AroGfbrPAL pKM212-MCSderivative; tac promoter, the E. coli feedback resistant aroG(D146N) and Streptomyces maritimus PALgenes; KmR 본 발명
pKM212-AroGfbrPheAfbr pKM212-MCS derivative; tac promoter, the E. coli feedback resistant aroG(D146N) and pheA(T326P) genes; KmR 본 발명
pKM212-GPE-PhaAB pKM212-MCS derivative; tac promoter, the E. coli feedback resistant aroG(D146N), pheA(T326P), R. eutropha PHA biosynthesis operon promoter, R. eutropha phaA and phaB genes; KmR 본 발명
pKM212-GPE-100PhaAB pKM212-MCS derivative; tac promoter, the E. coli feedback resistant aroG(D146N), pheA(T326P), BBa_J23100 promoter, R. eutropha phaA and phaB genes; KmR 본 발명
pKM212-GPE-105PhaAB pKM212-MCS derivative; tac promoter, the E. coli feedback resistant aroG(D146N), pheA(T326P), BBa_J23105 promoter, R. eutropha phaA and phaB genes; KmR 본 발명
pKM212-GPE-114PhaAB pKM212-MCS derivative; tac promoter, the E. coli feedback resistant aroG(D146N), pheA(T326P), BBa_J23114 promoter, R. eutropha phaA and phaB genes; KmR 본 발명
pKM212-GPE-109PhaAB pKM212-MCS derivative; tac promoter, the E. coli feedback resistant aroG(D146N), pheA(T326P), BBa_J23109 promoter, R. eutropha phaA and phaB genes; KmR 본 발명
pKM212-GPE-103PhaAB pKM212-MCS derivative; tac promoter, the E. coli feedback resistant aroG(D146N), pheA(T326P), BBa_J23103 promoter, R. eutropha phaA and phaB genes; KmR 본 발명
pTrc-FldH pTrc99A derivative; trc promoter, the C. botulinum A str. ATCC 3502 fldH gene; ApR 본 발명
pACYC184KS pACYC184 derivative; MCS of pBluescript II KS in XbaI and NaeI site of pACYC184; CmR 특허
pACYC-FldH pACYC184KS derivative; trc promoter, the C. botulinum A str. ATCC 3502 fldH gene; CmR 본 발명
pACYC-4CL(A294G) pACYC184KS derivative; trc promoter, the S. coelicolor (A294G) gene; CmR 본 발명
pACYC-4CL(A294G)FldA pACYC184KS derivative; trc promoter, the S. coelicolor (A294G) and the C. botulinum A str. ATCC 3502 fldA genes; CmR 본 발명
pACYC-4CL(A294G)FldAH pACYC184KS derivative; trc promoter, the S. coelicolor (A294G), and the C. botulinum A str. ATCC 3502 fldA and fldH genes; CmR 본 발명
pET22b-hisHadA pET22b(+) derivative; promoter, the C. difficile A str. ATCC hadA genes; ApR 본 발명
pKM212-HmaS pKM212-MCS derivative; tac promoter, the Amycolatopsis orientalis hmaS gene; KmR 본 발명
pKM212-HmaSHmo pKM212-MCS derivative; tac promoter, the A. orientalis hmaS and S. coelicolor hmo genes; KmR 본 발명
pKM212-HmaSHmoDmd pKM212-MCS derivative; tac promoter, the A. orientalis hmaS and S. coelicolor hmo and Rhodotorula graminis dmd genes; KmR 본 발명
pKA312-MCS pKA32-MCS derivative; tac promoter, R. eutropha PHA biosynthesis genes
transcription terminator; CmR 		7
pKA312-PanE pKA312-MCS derivative; tac promoter, Lactococcus lactis subsp. lactis Il1403
panE gene; CmR 		7
pKA312-AroGfbrPheAfbr pKA312-MCS derivative; tac promoter, the E. coli feedback resistant aroG(D146N) and pheA(T326P) genes; CmR 본 발명
pMtrcFldH pMtrc9 derivative; trc promoter, the C. botulinum A str. ATCC 3502 fldH gene; ApR 본 발명
1 Datsenko, K. A. & Wanner, B. P Natl Acad Sci USA 97:6640, 2000.
2 Lee, K. H. et al., Molecular Systems Biology 3, doi:ARTN 149 10.1038/msb4100196, 2007.
3 Palmeros, B. et al. Gene 247:255, 2000.
4 Park, S. J. et al., Metab Eng 20, 20, 2013.
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7 Choi, S. Y. et al., Nat Biotechnol 34:435, 2016.
8 Knobloch, K. H. & Hahlbrock, K., Archives of Biochemistry and Biophysics 184: 237, 1977.
9 Kaneko, M. et al., J Bacteriol 185:20, 2003.
프라이머 서열 서열번호
Pcthis-F CGCGCATATGAGAAAGGTTCCCATTATTAC 14
Pcthis-R CGCGGGATCCTTAGTGATGGTGATGGTGGTGGGACTTCATTTCCTTCAGAC 15
4CLhis-F TACAGAATTCATGTTCCGCAGCGAGTACGC 16
4CLhis-R TATTCCTGCAGGTTAGTGATGGTGATGGTGGTGTCGCGGCTCCCTGAGCTGTC 17
4CLmut-F TACATCGTCAGCGGCGCC 18
4CLmut-R GGCGCCGCTGACGATGTA 19
FldAhis-F CGCGCATATGGAAAACAATGCAAACATGTT 20
FldAhis-R CGCGAAGCTTTTAGTGATGGTGATGGTGGTGTTTTTCTTTGCGAACCATGATA 21
AroG-F CGCGGAATTCATGAATTATCAGAACGACGA 22
AroG-R TATTAAGCTTTTACCCGCGACGCGCTTTTA 23
PheA-F TATCAAGCTTACACAGGAAACAGAAATGACATCGGAAAACCCGTT 24
PheA-R CGCGAAGCTTTCAGGTTGGATCAACAGGCA 25
PheAmut-F ACAATCTGATTATGCCCCGTCTGGAATCAC 26
PheAmut-R GTGATTCCAGACGGGGCATAATCAGATTGT 27
PAL-Kp-F TATAGGTACCACACAGGAAACAGAAATGGGGACCTTCGTTATTGA 28
PAL-Sal-R CGCTGTCGACTTATCACTTGTCATCGTCAT 29
FldH-F TATAGGATCCATGAAAATCCTGGCGTATTGCG 30
FldH-R CGCGAAGCTTTTATTTACAAACGCGCTGGT 31
Trc-F CGCGCTCGAGGCTGTTGACAATTAATCATC 32
Ter-R CGCGGAGCTCTGTAGAAACGCAAAAAGGCC 33
FldA-F TATACCTGCAGGACACAGGAAACAGAAATGGAAAACAATGCAAACAT 34
FldA-R TATGCCTGCAGGTTAGTGATGGTGATGGTGGT 35
FldH-sbF TATACCTGCAGGACACAGGAAACAGAAATGAAAATCCTGGCGTATTGCG 36
FldH-hiR CGCGAAGCTTTTATTTACAAACGCGCTGGT 37
HadA-hisF CGGCCATATGCTTTTAGAAGGAGTTAAAGT 38
HadA-hisR TATTGCGGCCGCTTAGTGATGGTGATGGTGGTGATATCTTACAACTTTACTAT 39
HadA-sbF TATTCCTGCAGGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGAATTCATGCTTTTAGAAGGAGTTAA 40
HadA-ndR CGCGCATATGTTAATATCTTACAACTTTAC 41
HadA-sbmR TATTCCTGCAGGACACAGGAAACAGAAATGCTTTTAGAAGGAGTTAA 42
HadA-sbmR TATACCTGCAGGTTAATATCTTACAACTTTAC 43
Hmo-F TATAGGTACCACACAGGAAACAGAAATGCGGGAACCACTCACGCT 44
Hmo-R TATAGGATCCTTATCCATGGCTCCTATCTCGGT 45
Dmd-F TATAGGATCCACACAGGAAACAGAAATGCCTCGTCCGCGCGTCCT 46
Dmd-R TATGCCTGCAGGTTATGCAGCAGATGACGGCGCAAA 47
PanE-F TATAGGATCCACACAGGAAACAGAAATGAGAATTACAATTGCCGG 48
PanE-R CGCGCCTGCAGGTTATTTTGCTTTTAATAACTCTTC 59
PheA-kpR TATTGGTACCTCAGGTTGGATCAACAGGCA 50
tyrRKO-F ATAGTGTCATATCATCATATTAATTGTTCTTTTTTCAGGTGAAGGTTCCCTAGGTGACACTATAGAACGCG 51
tyrRKO-R CGGCTGGTGATTTCGTCCAGCGAACCTTCCATCGCATCTTCGCCCACGGCTAGTGGATCTGATGGGTACC 52
tyrRKO-EXF TTTCCGTCTTTGTGTCAATGATTGTTGACAGAAACCTTCCTGCTATCCAAATAGTGTCATATCATCATAT 53
tyrRKO-EXR GCGTGCTGGGATAATTGCGATAAAGCTGGGTTAATACCGAGCGTTCAAAACGGCTGGTGATTTCGTCCAG 54
poxBKO-F TTTCTCTCCCATCCCTTCCCCCTCCGTCAGATGAACTAAACTTGTTACCGGACACTATAGAACGCGGCCG 55
poxBKO-R GCGCAGCATATACAGGCTGAAACCTTTGGCCTGTTCGAGTTTGATCTGCGCCGCATAGGCCACTAGTGGA 56
poxBKO-EXF TATGCCCGATGATATTCCTTTCATCGGGCTATTTAACCGTTAGTGCCTCCTTTCTCTCCCATCCCTTCCC 57
poxBKO-EXR TTTGTTTTCGCCAGTTCGATCACTTCATCACCGCGTCCGCTGATGATTGCGCGCAGCATATACAGGCTGA 58
pflBKO-F TACCAAAGGTGACTGGCAGAATGAAGTAAACGTCCGTGACTTCATTCAGAGACACTATAGAACGCGGCCG 59
pflBKO-R GCGAGTTGAAACGTACTGCGTAGCCAGATACACGGATGGTCAGCTGCGGACCGCATAGGCCACTAGTGGA 60
pflBKO-EXF TGTTACATGTCCGAGCTTAATGAAAAGTTAGCCACAGCCTGGGAAGGTTTTACCAAAGGTGACTGGCAGA 61
pflBKO-EXR AGATTGAGTGAAGGTACGAGTAATAACGTCCTGCTGCTGTTCTTTAGTCAGCGAGTTGAAACGTACTGCG 62
adhEKO-F TGAACTTAACGCACTCGTAGAGCGTGTAAAAAAAGCCCAGCGTGAATATGGACACTATAGAACGCGGCCG 63
adhEKO-R GCTTTTTTCTCAGCTTTAGCCGGAGCAGCTTCTTTCTTCGCTGCAGTTTCCCGCATAGGCCACTAGTGGA 64
adhEKO-EXF AAAAAAGTTTAACATTATCAGGAGAGCATTATGGCTGTTACTAATGTCGCTGAACTTAACGCACTCGTAGAG 65
adhEKO-EXR AGGGGCCGTTTATGTTGCCAGACAGCGCTACTGATTAAGCGGATTTTTTCGCTTTTTTCTCAGCTTTAGCCG 66
frdBKO-F GCGGAAGCAGCCAATAAGAAGGAGAAGGCGAATGGCTGAGATGAAAAACCGACACTATAGAACGCGGCCG 67
tyrBKO-F GTGTTTCAAAAAGTTGACGCCTACGCTGGCGACCCGATTCTTACGCTTATTAGGTGACACTATAGAACGCG 68
tyrBKO-R TGGCAATGGCGCGAATAGCGTAGGCATCCTCTTCCATACCGGCACCAAATTAGTGGATCTGATGGGTACC 69
tyrBKO-EXF CCGGTTTATTGTGTTTTAACCACCTGCCCGTAAACCTGGAGAACCATCGCGTGTTTCAAAAAGTTGACGC 70
tyrBKO-EXR GGAGAAAATTTTCGAGAACGAATTGCTCACCAGAGCGGGTAATCCAGCGCTGGCAATGGCGCGAATAGCG 71
aspCKO-F ATGTTTGAGAACATTACCGCCGCTCCTGCCGACCCGATTCTGGGCCTGGCTAGGTGACACTATAGAACGCG 72
aspCKO-R TAGCCGCGAAAGCGCGCAGTCCTTCAGCATCTTCTTCCAGACCACGGGCATAGTGGATCTGATGGGTACC 73
aspCKO-EXF CGTTACCCTGATAGCGGACTTCCCTTCTGTAACCATAATGGAACCTCGTCATGTTTGAGAACATTACCGC 74
aspCKO-EXR CAGGCCAAAGTTTTTAGAGTAGGAACTGGCAACAATCAGCTCTTTATGCATAGCCGCGAAAGCGCGCAGT 75
PhaAB-BamF TATAGGATCCCGGGCAAGTACCTTGCCGAC 76
PhaAB-sbR TATCAAGCTTTCAGCCCATATGCAGGCCGC 77
100-Kpn-F TATTGGTACCTTGACGGCTAGCTCAGTCCTAGGTACAGTGCTAGCGAATTCACAGGAAACAGACCATGACTGACGTTGTCATCGT 78
PhaB-Bam-R TATTGGATCCTCAGCCCATATGCAGGCCGC 79
105-Kpn-F TATTGGTACCTTTACGGCTAGCTCAGTCCTAGGTACTATGCTAGCGAATTCACAGGAAACAGACCATGACTGACGTTGTCATCGT 80
114-Kpn-F TATTGGTACCTTTATGGCTAGCTCAGTCCTAGGTACAATGCTAGCGAATTCACAGGAAACAGACCATGACTGACGTTGTCATCGT 81
109-Kpn-F TATTGGTACCTTTACAGCTAGCTCAGTCCTAGGGACTGTGCTAGCGAATTCACAGGAAACAGACCATGACTGACGTTGTCATCGT 82
103-Kpn-F TATTGGTACCCTGATAGCTAGCTCAGTCCTAGGGATTATGCTAGCGAATTCACAGGAAACAGACCATGACTGACGTTGTCATCGT 83
ldhAKO-F ACAGGTGAACGAGTCCTTTGGCTTTGAGCTGGAATTTTTTGACTTTCTGCGACACTATAGAACGCGGCCG 84
ldhAKO-R TTGCTTAAGTTTTGCAGCGTAGTCTGAGAAATACTGGTCAGAGCTTCTGCCCGCATAGGCCACTAGTGGA 85
ldhAKO-EXF ATGAAACTCGCCGTTTATAGCACAAAACAGTACGACAAGAAGTACCTGCAACAGGTGAACGAGTCCTTTG 86
ldhAKO-EXR AGCGGCAAGATTAAACCAGTTCGTTCGGGCAGGTTTCGCCTTTTTCCAGATTGCTTAAGTTTTGCAGCGT 87
ldhArep-R TTGCTTAAGTTTTGCAGCGTAGTCTGAGAAATACTGGTCAGAGCTTCTGCTGAGCGGATACATATTTGAATGTATTT 88
실시예 1: 재조합 2-하이드록시이소카프로네이트 CoA-전이효소의 제작
CoA 공여체로서 아세틸-CoA를 사용하여 방향족 기질의 스펙트럼이 넓은 효소를 찾아내었다. FldA 대한 상동 효소를 식별하기 위해 배열 유사성 분석을 실시하였으며, 다른 기원의 다양한 FldA 중 FldA와 48% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 Clostridium difficile의 2-이소카프레노일-CoA:2-하이드록시이소카프로에이트 CoA-전이효소(HadA, 서열번호 1)를 스크리닝하였다(도 2).
HadA를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제작하기 위하여, 클로스트리듐 Clostridium difficile 630 균주의 염색체 DNA를 주형으로 하고, HadA-hisF, HadA-hisR 프라이머로 PCR을 수행하여, C 말단(C terminus)에 his-tag이 달린 2-하이드록시이소카프로에이트-CoA 전이효소를 코딩하는 his_HadA 유전자 절편을 제작하였다.
다음으로, 상기 제조된 his_HadA 절편을 T7 프로모터의 강한 유전자 발현을 진행하는 pET22b 플라스미드에 제한효소(NdeI 및 NotI)를 처리한 후, T4 DNA 라이게이즈를 처리하여, 제한효소로 절단된 his_HadA절편 및 pET22b 플라스미드를 접합시킴으로써, 재조합 플라스미드인 pET22b_hisHadA 를 제작하였다 (도 2).
상기 pET22b_hisHadA를 대장균 XL1-Blue(Stratagene Cloning Systems, USA)에 도입시킨 후, 배양하고, IPTG를 첨가하여, HadA 발현을 유도한 후, His-tag을 이용하여 Ni-NTA 스핀 키트(Quiagen, Germany)에서 배양액으로 부터 HadA를 정제하였다(도 3 a).
실시예 2: 2-하이드록시이소카프로에이트 CoA-전이효소의 기질 다양성 확인
HadA가 아세틸-CoA를 공여체로 사용할 수 있는지 확인하기 위하여, 실시예 1에서 제조한 HadA를 사용하여, in vitro 어세이를 수행하였다.
10μg의 HadA를 0.1mM 아세틸-CoA 및 10mM 기질을 포함하는 50mM 인산 완충액(pH7.5)에 첨가하고, 30℃에서 10분간 반응을 수행하였다. 반응 후, 0.1mM의 옥살아세트산, 5μg citrate synthase 및 0.5mM의 5.5'-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid)(DTNB)을 첨가하였다. 그 후, 유리된 CoA의 양을 412nm에서의 흡광도를 측정하여 분석하였다(도 3b).
생성되는 지방족 및 방향족 아실-CoA의 분석은 Eclipse XDB-C18 컬럼 (5μm, 4.6 ㅧ 150mm, Agilent)를 갖춘 LC-MS (Agilent 1100 시리즈 및 LC / MSD VL, Agilent)에서 수행하였다.
그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, HadA가 아세틸-CoA를 CoA 공여체로 사용하여 만델레이트, 4-하이드록시만델레이트, 페닐락테이트, 4-하이드록시페닐락테이트, 2-하이드록시-4-페닐부티레이트, 3-하이드록시-3-페닐프로피오네이트 및 4-하이드록시 벤조산을 기질로 사용하여, 상기 기질을 해당 CoA 유도체로 전환할 수 있는 것을 확인하였다.
도 5에는 HadA가 전환할 수 있는 다양한 기질들의 CoA 전환 반응을 분자식으로 나타내었다.
실시예 3: 방향족 단량체 생성이 증가된 재조합 균주의 제작
in vivo에서 글루코오스로부터 D-페닐락테이트를 생성하도록 대장균을 조작하였다. 방향족 화합물의 생합성은 3-데옥시-D-아라비노-헵툴로소네이트-7-인산(DAHP)의 합성에서 시작되며, 상기 DAHP는 DAHP 합성효소에 의한 포스포에놀피루베이트(PEP)와 에리쓰로즈-4-인산(E4P)의 축합으로 생성된다. 생성된 DAHP는 페닐피루베이트(PPA)로 전환된 후, D-락테이트 디하이드로게네이즈(FldH)에 의해 D-페닐락테이트로 전환된다(도 1). 방향족 화합물 생합성을 위한 대사경로는 다양한 저해기구에 의해 복잡하게 제어되는 것으로 알려져 있다. aroG에 의해 코딩되는 DAHP 합성효소와 pheA에 의하여 코딩되는 코리스메이트 뮤타아제/프레페네이트 디하이드로게네이즈의 발현은 L-페닐알라닌에 의하여 저해된다(ribe, D. E. et al., J. Bacteriol. 127:1085, 1976).
본 발명에서는 L-페닐알라닌에 의한 피드백 저해를 해제하기 위해 피드백 저해 내성 돌연변이 AroGfbr [AroG (D146N)] 및 PheAfbr [PheA (T326P)]를 구축하였다(Zhou, H. Y. et al., Bioresour. Technol. 101:4151, 2010; Kikuchi, Y. et al., Appl. Environ. Microbiol. 63:761, 1997). AroGfbr, PheAfbr 및 C. botulinum A str. ATCC 3502의 FldH를 발현하는 대장균 XL1-Blue를 제작하였다.
pKM212-AroGfbr를 구축하기 위해 피드백 저해 내성 돌연변이인 3-데옥시-D-아라비노-헵툴로소네이트(heptulosonate)-7-인산 합성효소 유전자(aroG)를 프라이머 AroG-F 및 AroG-R을 이용하여 플라스미드 pTyr-a(Na, D. et al., Nature Biotechnol. 31:170, 2013)를 주형으로하여, PCR 산물을 제조하고, 상기 PCR 산물을 제한효소(EcoRI/HidIII)를 이용하여, pKM212-MCS(Park, S. J. et al., Metab. Eng. 20:20, 2013)와 연결하여, pKM212-AroGfbr를 제작하였다.
pKM212-AroGfbrPheAfbr 플라스미드를 다음과 같이 구축하였다. 첫째, 단일변이된 염기(T976G)의 프라이머 PheA-F 및 PheAmut-R을 이용하여 대장균의 게놈 DNA로부터 991bp의 DNA 단편을 PCR로 증폭했다. 둘째, 단일변이된 염기 (A976C) 및 PheA-R의 프라이머 PheAmut-F를 이용하여 대장균의 게놈 DNA로부터 200bp의 DNA 단편을 증폭하였다.
이어, 혼합한 2개의 단편을 주형으로 사용하여 1161bp의 DNA조각을 오버랩 PCR로 프라이머 PheA-F 및 PheA-R로 증폭했다. PCR 산물을 제한효소(HindIII)를 사용하여, 상기 제작된 pKM212-AroGfbr와 연결하였다.
pACYC-FldH 구축을 위해 C. botulinum A str. ATCC 3502의 D-락테이트 디하이드로게네이즈(fldH)를 사용 하였다. fldH 유전자의 코돈 사용 빈도는 대장균 에 최적화 대장균 코돈 최적화 fldH 유전자를 프라이머 FldH- F 및 FldH-R를 사용하고, 주형으로 pUC57-FldHopt(GenScript, Piscataway, NJ, USA)를 이용하여 실시하였다.
PCR 산물을 제한효소(BamHI/HindIII)를 사용하여, pTrc99A ( Pharmacia, Biotech, Sweden ) 와 연결하여 pTrc-FldH를 제작하였다. 다음은 trc 프로모터 및 rrnB 터미네이터 결합한 fldH 유전자를 pTrc-FldH를 주형으로 프라이머 Trc-F 및 Ter-R을 이용한 PCR로 증폭했다. 증폭된 PCR 산물을 제한효소(XhoI/SacI)를 사용하여 pACYC184KS(한국특허공개 2015-0142304)와 연결하고 pACYC-FldH을 얻었다.
상기 제작된 pKM212-AroGfbrPheAfbr, pACYC-FldH를 대장균 XL1-Blue에 도입하여, AroGfbr, PheAfbr 및 FldH를 발현하는 재조합 대장균을 제작하였다.
상기 대장균은 15.2g/L의 글루코오스를 포함하는 MR 배지에서 배양하였을 때, 0.372g/L의 D-페닐락테이트를 생산하였다.
상기 MR 배지는 1L 당 6.67g KH2PO4,4g (NH4)2HPO4,0.8g MgSO4·7H2O, 0.8g citrate 및 5ml의 미량금속 용액을 포함하며, 상기 미량금속 용액은 0.5M HCl:10g FeSO4·7H2 O, 2g CaCl2, 2.2g ZnSO4·7H2O, 0.5g MnSO4·4H2O, 1g CuSO4·5H2O, 0.1g(NH4)6 Mo7O24·4H2O 및 0.02 g Na2B4O7·10H2O를 포함한다.
대사공학에 의해 방향족 단량체의 생성량을 증가시키기 위하여, 글루코오스로부터 D-페닐락테이트를 소량 생산(0.372g/L) 생산하는 상기 AroGfbr, PheAfbr 및 FldH를 발현하는 대장균 XL1-Blue 균주를 대사공학적 조작을 통하여 수율을 상승시켰다. 방향족 아미노산 생합성을 억제하도록 조절하는 이중 전사조절 인자인 TyrR을 결실시킨 AroGfbr, PheAfbr 및 FldH를 발현하는 대장균 XBT 균주를 제작하였다.
상기 AroGfbr, PheAfbr 및 FldH를 발현하는 대장균에서 tyrR 유전자의 결실은 원 스텝 불활성화 방법을 사용하여 수행하였다(Datsenko, K. A. et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 97:6640, 2000).
상기 대장균 XBT 균주는 16.4g/L의 글루코오스를 포함하는 MR 배지에서 배양한 결과, 0.5g/L의 D-페닐락테이트를 생산하여, tyrR을 결실시키지 않은 상기 대장균 XL1-Blue 균주보다 30% 높은 생산성을 나타내었다.
D-페닐락테이트 생합성과 충돌하는 경로를 제거하기 위하여, 대장균 XBT에서 poxB(피루브산 산화효소를 코딩하는 유전자), pflB(피루브산 포메이트 리아제를 코딩하는 유전자), adhE(아세트알데히드탈수소효소/ 알코올탈수소효소를 코딩하는 유전자) 및 frdB(푸마레이트 리덕테이즈를 코딩하는 유전자)를 결실시킨 대장균 XB201T를 제작하였다.
대장균 XB201T 균주는 15.7g/L의 글루코오스로부터 0.55g/L의 D-페닐락테이트를 생산하였고, 이는 대장균 XBT보다 10% 높은 수율을 나타내는 것이다.
추가적으로, in silico 게놈 규모 대사 플럭스 분석에 따른 대사공학 분석을 실시하여, D-페닐락테이트 생산을 더욱 증가시키고자 하였다.
in silico 플럭스 응답 분석을 위해서는 2251개 대사 반응과 1135개 대사산물로 구성되는 대장균 iJO1366 게놈 스케일 모델을 사용하였으며, D-페닐락테이트 생산에 미치는 중심 및 방향족 아미노산 생합성 반응의 영향을 조사하였다. 본 발명의 XB201T 균주에 반영하기 위하여, D-페닐락테이트 생합성의 이종 대사 반응(fldH 유전자)을 모델에 더 부가하고 해당 플럭스를 제로로 설정함으로써 유전자 녹아웃을 모델에 반영시켰다. D-페닐락테이트 생성 속도는 목적 함수로 극대화시킨 반면, 중심 아미노산 및 방향족 아미노산 생합성 반응 플럭스 값은 최소값에서 최대값까지 서서히 증가시켰다. 시뮬레이션 중 글루코오스 반응속도는 시간당 건조세포 무게 1g 당 10mmol로 설정하였다. 모든 시뮬레이션은 Gurobi Optimizer 6.0 및 GurobiPy 패키지(Gurobi Optimization, Inc. Houston, TX)를 사용하여 Python 환경에서 실행하였다. COBRApy32를 사용하여, COBRA 호환 SBML 파일의 읽기, 쓰기 및 작업을 수행하였다.
그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, 티로신 아미노전이효소를 코딩하는 tyrB 유전자 및 아스파라긴산 아미노전이효소를 코딩하는 aspC 유전자를 상기 대장균 XB201T 균주에 제거하고, L-페닐알라닌 생합성을 감소시켜 D-페닐락테이트로의 탄소 흐름을 강화하였다.
상기 in silico 플럭스 응답 분석 결과로 제작된 대장균 XB201TBA 균주는 18.5g/L의 글루코오스로부터 1.62g/L의 D-페닐락테이트를 생산하여 수율이 크게 높아졌으며, 이는 AroGfbr, PheAfbr 및 FldH를 발현하는 대장균 XL1-Blue 균주의 D-페닐락테이트 생산량보다 4.35 배 높아진 것이다.
실시예 4: 재조합 균주를 이용한 방향족 단량체를 함유하는 폴리하이드록시알카노에이트의 제조
XB201TBA에서 D-락테이트 형성을 방지하기 위해 ldhA 유전자를 추가로 결실하여 XB201TBAL 균주를 제작하였다. 방향족 단량체를 함유하는 폴리하이드록시알카노에이트를 제조하기 위하여, 대장균 XB201TBAL 균주에서 PhaC1437 및 HadA를 발현시켰다.
PhaC1437과 HadA를 코딩하는 유전자들을 포함하는 재조합 벡터를 제작하기 위하여, 클로스트리듐 Clostridium difficile 630 균주의 염색체 DNA를 주형으로 하고, HadA-sbF, HadA-ndR 프라이머로 PCR을 수행하여, 2-하이드록시이소카프로에이트-CoA 전이효소를 코딩하는 hadA 유전자 절편을 제작하였다. 증폭된 PCR 산물을 제한효소(SbfI/NdeI)를 사용하여 p619C1437-pct540(Yang, T. H. et al. Biotechnol Bioeng 105: 150, 2010)과 연결하고 p619C1437-HadA를 얻었다. 상기 제작된 p619C1437-HadA를 대장균 XB201TBAL에 도입하여, AroGfbr, PheAfbr, FldH, PhaC1437 및 HadA를 발현하는 재조합 대장균을 제작하였다. 상기 대장균을 20g/L 글루코오스 및 1g/L 소듐 3HB를 함유하는 MR 배지에서 배양하여, 폴리(52.1 mol% 3HB-co-47.9 mol% D-페닐락테이트)를 건조 세포 무게의 15.8 중량% 함량으로 생산하였다(도 7). 또한, 유가식 발효(fed-batch)를 통해 폴리(52.3mol % 3HB-co-47.7mol % D-페닐락테이트)를 건조 세포 무게의 24.3 중량% 함량으로 생산하였다(도 10a, b).
실시예 5: 재조합 균주를 이용한 다양한 방향족 단량체를 함유하는 폴리하이드록시알카노에이트의 제조
대장균 XB201TBAL을 이용한 시스템이 다양한 방향족 공중합체의 제조에 사용할 수 있는지를 확인하기 위하여, 만델레이트를 모노머로 사용하여 시험하였다.
AroGfbr, PheAfbr, FldH, PhaC1437 및 HadA를 발현하는 대장균 XB201TBAL을 1g/L의 소듐 3HB 및 0.5g/L D-만델레이트을 함유하는 MR 배지에서 배양한 결과, 폴리(55.2 mol% 3HB-co-43.0 mol% D-페닐락테이트-co-1.8 mol% D-만델레이트)를 건조세포 무게의 11.6 중량% 함량으로 제조하여(도 8a, b), D-만델레이트를 기질로 하여 D-만델레이트를 포함하는 방향족 중합체를 성공적으로 제조하였다.
다음으로, 대사공학에 의해 D-만델레이트를 in vivo에서 생산하고자 하였다. 글루코오스로부터 D-만델레이트를 생산하기 위해 AroGfbr, PheAfbr, FldH, PhaC1437 및 HadA를 발현하는 대장균 XB201TBAL에서 Amycolatopsis orientalis 유래 하이드록시만델레이트 합성효소(HmaS), S. coelicolor의 하이드록시만델레이트 산화효소(Hmo) 및 Rhodotorula graminis의 D-만델레이트 탈수소효소(Dmd)를 발현시켰다.
pKM212-HmaS의 구축을 위해, A. orientalis의 하이드록시만델산 합성효소 유전자(hmaS)를 사용하고 그 코돈을 대장균에서 합성 벡터에 클로닝하여 플라스미드 pUC57-HmaSopt를 제작하였다(GenScript, Piscataway, NJ, USA).
상기 pUC57-HmaSopt를 제한효소(EcoRI/KpnI)를 사용하여, pKM212-MCS에 연결하였다. pKM212-HmaSHmo을 제작하기 위해 S. coelicolor의 하이드록시만델레이트 산화효소 유전자(hmo)를 코돈 최적화 hmo 유전자를 합성하고(GenScript, Piscataway, NJ, USA), 프라이머 Hmo-F 및 Hmo-R을 이용한 PCR에 의해 증폭했다. PCR 산물을 제한효소(KpnI/BamHI)를 이용하여, pKM212-HmaS와 연결하여, pKM212-HmaSHmo를 제작하였다.
pKM212-HmaSHmoDmd를 구축하기 위해 대장균 코돈 최적화 dmd 유전자를 함유하는 pUC57-Dmd를 합성하고(GenScript, Piscataway, NJ, USA), 프라이머 Dmd-F 및 Dmd-R을 이용한 PCR에 의해 대장균 코돈 최적화 R. graminis D-만델레이트 디하이드로게네이즈 유전자(dmd)를 증폭하였다. PCR 산물을 제한효소(BamHI/SbfI)를 사용하여, pKM212-HmaSHmo와 연결하여, pKM212-HmaSHmoDmd를 제작하였다.
상기 제작된 pKM212-HmaSHmoDmd를 AroGfbr, PheAfbr, FldH, PhaC1437 및 HadA를 발현하는 대장균 XB201TBAL에 도입하여, 만델레이트 생산능을 가지는 재조합 균주를 제작하였다.
상기 제작된 만델리에트 생산능을 가지는 재조합 균주를 20g/L의 글루코오스와 1g/L의 소듐 3HB를 함유하는 배지에서 배양한 결과, 건조 세포 무게의 16.4 중량%의 폴리(92.9 mol%의 3HB-co-6.3 mol% D-페닐락테이트-co-0.8 mol% D-만델레이트)를 생산하였다.
다른 가능한 방향족 단량체로서 3-하이드록시-3-페닐프로피오네이트(3HPh)를 사용하여 방향족 폴리머 생산을 확인하였다. 대장균 XB201TBAL 균주를 20g/L 글루코오스, 0.5g/L 3-하이드록시-3-페닐프로피온산 및 1g/L 소듐 3HB를 함유하는 배지에서 배양하면 폴리(33.3 mol% 3HB-co-18.0 mol% D-페닐락테이트-co-48.7 mol% 3HPh)를 건조 세포 무게의 14.7 중량%로 생산하는 것을 확인하였다 (도 8c, d). 이러한 결과는 본 발명에서 개발된 2-하이드록시이소카프로에이트-CoA 전이효소를 이용한 시스템이 다양한 방향족 폴리에스테르의 제조에 널리 사용할 수 있음을 시사한다.
실시예 6: 재조합 균주를 이용한 다양한 장사슬 2-HA를 함유하는 폴리하이드록시알카노에이트의 제조
본 발명의 2-하이드록시이소카프로에이트-CoA 전이효소를 이용한 시스템이 다양한 장사슬 2-HA를 함유하는 폴리하이드록시알카노에이트의 제조에 사용할 수 있는지를 확인하기 위하여, 다양한 장사슬 2-HA 모노머[2-하이드록시이소카프로에이트(2HIC), 2-하이드록시헥사노에이트(2HH) 및 2-하이드록시옥타노에이트(2HO)]를 단량체로 사용하여, 폴리머 생산능을 확인하였다. PhaC1437 및 HadA를 발현하는 대장균 XL1-Blue를 1g/L의 3HB, 20g/L의 글루코오스 및 농도별(0.25, 0.5 및 1g/L) 장사슬 2-HA를 함유하는 MR 배지에서 배양한 결과, 2-하이드록시이소카프로에이트, 2-하이드록시헥사노에이트 혹은 2-하이드록시옥타노에이트를 함유하는 공중합체를 생성하였다. 또한, 배지 내에 함유된 2-HA의 농도가 증가할수록 공중합체 내에 함유하는 단량체의 몰분율이 증가하는 것을 확인할 수 있었다 (표 4, 표 5 및 표 6).
2HIC 농도 (g/L) PHA content (wt%) 2HIC (mol%) 3HB (mol%) LA (mol%)
0.25 21.3 ± 0.3 12.4 ± 0.8 83.8 ± 2.3 3.8 ± 3.1
0.5 24.0 ± 0.7 25.8 ± 2.4 70.0 ± 2.4 4.2 ± 1.5
1 35.3 ± 0.3 74.0 ± 14.6 23.2 ± 13.8 2.8 ± 0.9
2HH 농도 (g/L) PHA content (wt%) 2HH (mol%) 3HB (mol%) LA (mol%)
0.25 15.9 ± 0.5 17.2 ± 1.2 63.5 ± 5.8 19.3 ± 4.6
0.5 21.3 ± 5.5 35.1 ± 1.5 39.5 ± 1.0 25.4 ± 1.7
1 23.7 ± 0.3 52.3 ± 2.5 29.4 ± 2.5 18.3 ± 1.8
2HO 농도 (g/L) PHA content (wt%) 2HO (mol%) 3HB (mol%) LA (mol%)
0.25 16.8 ± 1.6 20.3 ± 3.8 72.4 ± 3.8 7.3 ± 0.1
0.5 13.7 ± 0.7 39.3 ± 1.6 54.4 ± 2.5 6.3 ± 1.0
1 16.4 ± 0.4 44.3 ± 1.0 47.1 ± 0.3 8.6 ± 0.8
실시예 7: 합성 프로모터 기반 플럭스 조절을 통한 다양한 몰분율의 방향족 단량체를 함유하는 폴리하이드록시알카노에이트의 제조
외부로부터 3HB를 첨가하지 않고도, 방향족 PHA를 생산하는 균주를 제작하기 위하여, XB201TBAL 균주에서 R. eutropha β-ketothiolase (PhaA)와 acetoacetyl-CoA reductase (PhaB)를 추가로 발현시키고, 3HB 보충없이 글루코오스에서 방향족 PHA를 생산하는지 확인하였다.
그 결과, 예상대로, AroGfbr, PheAfbr, FldH, PhaC1437 및 HadA를 발현하는 XB201TBAL 균주는 MR 배지에서 폴리 (86.2 mol% 3HB-co-13.8 mol% D-페닐락테이트)를 건조세포 무게의 18.0 중량%로 20g/L의 글루코오스로부터 생산하였다. 또한, 산업적 응용에 중요한 다양한 단량체 몰분율을 갖는 방향족 PHA의 생산을 합성 Anderson 프로모터(http://parts.igem.org/)를 사용하여 PhaAB의 대사 플럭스를 조절하여 시도하였다. 상이한 강도의 5 가지 프로모터(서열번호 89~93) 하에서 PhaAB를 발현하는 5 개의 상이한 플라스미드를 제작하고 AroGfbr, PheAfbr, FldH, PhaC1437 및 HadA를 발현하는 XB201TBAL 균주에 도입 하였다.
PhaAB 발현이 감소함에 따라 D-페닐락테이트 단량체 몰분율은 증가하였다; 각각 11.0 mol%, 15.8 mol%, 20.0 mol%, 70.8 mol% 및 84.5 mol%의 D-페닐락테이트를 갖는 공중합체를 제조할 수 있었다(도 9a, b 및 표 7); BBa_J23103 프로모터 하에서 PhaAB를 발현시킴으로써, 폴리(15.5 mol% 3HB-co-84.5 mol% D-페닐락테이트)를 건조세포 무게의 4.3 중량%로 생산하였다(도 9b). 이러한 결과는 대사 플럭스를 조절함으로써 다양한 방향족 단량체 몰분율을 갖는 방향족 폴리에스테르가 생성될 수 있음을 시사한다.
Synthetic promoters Mole fraction (mol% ± s.d.) Molecular weight (Da) T g (ㅊC)
3HB PhLA M n M w M w /M n
BBa_J23100 89.0 ± 0.8 11.0 ± 0.5 24920 50120 2.01 9.41
BBa_J23105 84.2 ± 2.7 15.8 ± 0.4 22470 45460 2.02 10.05
BBa_J23114 80.0 ± 1.8 20.0 ± 1.3 15760 25850 1.64 15.64
BBa_J23109 29.2 ± 1.1 70.8 ± 1.2 2665 4184 1.57 29.04
BBa_J23103 15.5 ± 0.6 84.5 ± 3.3 3569 4588 1.29 33.47
실시예 8: 유가식 발효를 통한 방향족 폴리하이드록시알카노에이트의 제조
본 실시예에서는 AroGfbr, PheAfbr, FldH, HadA, PhaC1437 및 BBa_J23114 프로모터 하에서 PhaAB를 발현하는 대장균 XB201TBAL 균주의 pH-stat 배양을 3HB 공급없이 수행하였다. 배양 96시간 후 중합체 함량이 건조세포 무게의 43.8 중량%인 폴리 (67.6 mol% 3HB-co-32.4 mol % D-페닐락테이트)를 2.5g/L로 생산하였다(도 10c, d).
또한, 방향족 폴리하이드록시알카노에이트의 생산을 더욱 향상시키기 위해 대장균 XB201TBA 염색체의 ldhA 유전자를 fldH 유전자로 대체하여 유전자 발현 시스템을 최적화했다. 또한, ldhA 유전자의 천연 프로모터를 강한 trc 프로모터로 대체하여 fldH 유전자의 발현을 증가시켰다. 펄스 공급 방법을 사용하여서 글루코오스를 공급하는 유가식 발효를 진행하였다. AroGfbr, PheAfbr, FldH, HadA, PhaC1437 및 BBa_J23114 프로모터 하에서 PhaAB를 발현하는 대장균 XB201TBAF 균주는 중합체 함량이 건조세포 무게의 55.0 중량%인 폴리(69.1 mol% 3HB-co-38.1 mol % D-페닐락테이트)를 13.9g/L로 유가식 발효를 통해 생산하였으며(도 10e, f), 생산량은 13.9g/L로, AroGfbr, PheAfbr, FldH, HadA, PhaC1437 및 BBa_J23114 프로모터 하에서 PhaAB를 발현하는 대장균 XB201TBAL 균주에서의 생산량인 2.5g/L 보다 5.56배 높았으며 글루코오스 및 3HB가 첨가된 배지에서 AroGfbr, PheAfbr, FldH, HadA 및 PhaC1437를 발현하는 대장균 XB201TBAL 균주의 유가식 배양으로 수득된 것 보다 훨씬 높았다. 이러한 결과는 방향족 폴리하이드록시알카노에이트가 조작된 균주 (AroGfbr, PheAfbr, FldH, HadA, PhaC1437 및 BBa_J23114 프로모터 하에서 PhaAB를 발현하는 대장균 XB201TBAF 균주)의 유가식 배양을 통해 고농도로 성공적으로 생산될 수 있음을 보여준다.
실시예 9: 방향족 단량체를 함유하는 폴리하이드록시알카노에이트의 물성 분석
마지막으로, 대사적으로 조작된 대장균에 의해 생산되는 방향족 PHA의 물질 특성을 조사하였다.
폴리하이드록시알카노에이트(PHA) 함량 및 모노머 조성은 GC 또는 GC-MS에 의해 결정하였다. 채취 한 세포를 증류수로 3 회 세척 한 다음, 24시간 동결 건조하고, 동결 건조 세포의 PHA는 산 촉매된 메타노라이시스(methanolysis) 의해 대응하는 하이드록시메틸에스테르로 전환하였다. 얻어진 메틸에스테르는 Agilent 7683 자동 주입기, 프레임 이온화 검출기 및 용융 실리카 모세관 컬럼(ATTM-Wax, 30m, ID 0.53mm, 두께 1.20μm, Alltech, 미국)를 갖춘 GC (Agilent 6890N, Agilent, 미국) 을 이용하여 분석하였다. 폴리머는 클로로포름 추출법에 의해 추출하였고, 용매 추출법을 이용하여, 세포에서 정제하였다. 폴리머의 구조, 분자량 및 열적 성질은 각각 핵자기 공명법(NMR), 겔 퍼미에이션 크로마토그래피(GPC) 및 시차 주사 열량계 (DSC)를 이용하여 측정하였다.
그 결과, 도 7은 대장균 XB201TBAL에 의하여 생산된 폴리 (3HB-co-D-페닐락테이트)를 분석한 결과를 나타내었으며, 도 8은에는 대장균 XB201TBAL에 의하여 생산된 폴리(3HB-co-D-페닐락테이트-co-D-만델레이트)를 분석한 결과를 나타내었다.
폴리(52.1 mol% 3HB-co-47.9 mol% D-페닐락테이트)는 무정형이었으며, 공중합체 중의 D-페닐락테이트의 몰 분율이 증가함에 따라 분자량의 감소에도 불구하고 Tg는 23.86℃까지 크게 증가하였다. 또한, 폴리머 중에 방향족을 포함하는 공중합체는 결정화도가 감소하였다. 폴리머의 방향족 고리가 P(3HB) (입체 화학에 의해 유도된)의 결정화를 방해하는 것으로 추측된다. P(3HB)의 경우 강한 결정성으로 인해 높은 취성(brittleness)을 나타내는 것에 비해, 생성된 공중합체의 경우 결정화도의 저하 및 Tg의 향상으로 인해 기계적 인성의 향상을 초래하였다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> Korea Advanced Institute of Science and Technology <120> Method for Preparing Polyhydroxyalkanoates Using 2-Hydroxyisocaproate-CoA Transferase <130> P17-B221 <150> 2017/0026266 <151> 2017-02-28 <160> 93 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 399 <212> PRT <213> HadA-Clostridium difficile <400> 1 Met Leu Leu Glu Gly Val Lys Val Val Glu Leu Ser Ser Phe Ile Ala 1 5 10 15 Ala Pro Cys Cys Ala Lys Met Leu Gly Asp Trp Gly Ala Glu Val Ile 20 25 30 Lys Ile Glu Pro Ile Glu Gly Asp Gly Ile Arg Val Met Gly Gly Thr 35 40 45 Phe Lys Ser Pro Ala Ser Asp Asp Glu Asn Pro Met Phe Glu Leu Glu 50 55 60 Asn Gly Asn Lys Lys Gly Val Ser Ile Asn Val Lys Ser Lys Glu Gly 65 70 75 80 Val Glu Ile Leu His Lys Leu Leu Ser Glu Ala Asp Ile Phe Val Thr 85 90 95 Asn Val Arg Val Gln Ala Leu Glu Lys Met Gly Ile Ala Tyr Asp Gln 100 105 110 Ile Lys Asp Lys Tyr Pro Gly Leu Ile Phe Ser Gln Ile Leu Gly Tyr 115 120 125 Gly Glu Lys Gly Pro Leu Lys Asp Lys Pro Gly Phe Asp Tyr Thr Ala 130 135 140 Tyr Phe Ala Arg Gly Gly Val Ser Gln Ser Val Met Glu Lys Gly Thr 145 150 155 160 Ser Pro Ala Asn Thr Ala Ala Gly Phe Gly Asp His Tyr Ala Gly Leu 165 170 175 Ala Leu Ala Ala Gly Ser Leu Ala Ala Leu His Lys Lys Ala Gln Thr 180 185 190 Gly Lys Gly Glu Arg Val Thr Val Ser Leu Phe His Thr Ala Ile Tyr 195 200 205 Gly Met Gly Thr Met Ile Thr Thr Ala Gln Tyr Gly Asn Glu Met Pro 210 215 220 Leu Ser Arg Glu Asn Pro Asn Ser Pro Leu Met Thr Thr Tyr Lys Cys 225 230 235 240 Lys Asp Gly Arg Trp Ile Gln Leu Ala Leu Ile Gln Tyr Asn Lys Trp 245 250 255 Leu Gly Lys Phe Cys Lys Val Ile Asn Arg Glu Tyr Ile Leu Glu Asp 260 265 270 Asp Arg Tyr Asn Asn Ile Asp Ser Met Val Asn His Val Glu Asp Leu 275 280 285 Val Lys Ile Val Gly Glu Ala Met Leu Glu Lys Thr Leu Asp Glu Trp 290 295 300 Ser Ala Leu Leu Glu Glu Ala Asp Leu Pro Phe Glu Lys Ile Gln Ser 305 310 315 320 Cys Glu Asp Leu Leu Asp Asp Glu Gln Ala Trp Ala Asn Asp Phe Leu 325 330 335 Phe Lys Lys Thr Tyr Asp Ser Gly Asn Thr Gly Val Leu Val Asn Thr 340 345 350 Pro Val Met Phe Arg Asn Glu Gly Ile Lys Glu Tyr Thr Pro Ala Pro 355 360 365 Lys Val Gly Gln His Thr Val Glu Val Leu Lys Ser Leu Gly Tyr Asp 370 375 380 Glu Glu Lys Ile Asn Asn Phe Lys Asp Ser Lys Val Val Arg Tyr 385 390 395 <210> 2 <211> 559 <212> PRT <213> PHA synthase-Pseudomanas sp. 6-19 <400> 2 Met Ser Asn Lys Ser Asn Asp Glu Leu Lys Tyr Gln Ala Ser Glu Asn 1 5 10 15 Thr Leu Gly Leu Asn Pro Val Val Gly Leu Arg Gly Lys Asp Leu Leu 20 25 30 Ala Ser Ala Arg Met Val Leu Arg Gln Ala Ile Lys Gln Pro Val His 35 40 45 Ser Val Lys His Val Ala His Phe Gly Leu Glu Leu Lys Asn Val Leu 50 55 60 Leu Gly Lys Ser Gly Leu Gln Pro Thr Ser Asp Asp Arg Arg Phe Ala 65 70 75 80 Asp Pro Ala Trp Ser Gln Asn Pro Leu Tyr Lys Arg Tyr Leu Gln Thr 85 90 95 Tyr Leu Ala Trp Arg Lys Glu Leu His Asp Trp Ile Asp Glu Ser Asn 100 105 110 Leu Ala Pro Lys Asp Val Ala Arg Gly His Phe Val Ile Asn Leu Met 115 120 125 Thr Glu Ala Met Ala Pro Thr Asn Thr Ala Ala Asn Pro Ala Ala Val 130 135 140 Lys Arg Phe Phe Glu Thr Gly Gly Lys Ser Leu Leu Asp Gly Leu Ser 145 150 155 160 His Leu Ala Lys Asp Leu Val His Asn Gly Gly Met Pro Ser Gln Val 165 170 175 Asn Met Gly Ala Phe Glu Val Gly Lys Ser Leu Gly Val Thr Glu Gly 180 185 190 Ala Val Val Phe Arg Asn Asp Val Leu Glu Leu Ile Gln Tyr Lys Pro 195 200 205 Thr Thr Glu Gln Val Tyr Glu Arg Pro Leu Leu Val Val Pro Pro Gln 210 215 220 Ile Asn Lys Phe Tyr Val Phe Asp Leu Ser Pro Asp Lys Ser Leu Ala 225 230 235 240 Arg Phe Cys Leu Arg Asn Asn Val Gln Thr Phe Ile Val Ser Trp Arg 245 250 255 Asn Pro Thr Lys Glu Gln Arg Glu Trp Gly Leu Ser Thr Tyr Ile Glu 260 265 270 Ala Leu Lys Glu Ala Val Asp Val Val Thr Ala Ile Thr Gly Ser Lys 275 280 285 Asp Val Asn Met Leu Gly Ala Cys Ser Gly Gly Ile Thr Cys Thr Ala 290 295 300 Leu Leu Gly His Tyr Ala Ala Ile Gly Glu Asn Lys Val Asn Ala Leu 305 310 315 320 Thr Leu Leu Val Ser Val Leu Asp Thr Thr Leu Asp Ser Asp Val Ala 325 330 335 Leu Phe Val Asn Glu Gln Thr Leu Glu Ala Ala Lys Arg His Ser Tyr 340 345 350 Gln Ala Gly Val Leu Glu Gly Arg Asp Met Ala Lys Val Phe Ala Trp 355 360 365 Met Arg Pro Asn Asp Leu Ile Trp Asn Tyr Trp Val Asn Asn Tyr Leu 370 375 380 Leu Gly Asn Glu Pro Pro Val Phe Asp Ile Leu Phe Trp Asn Asn Asp 385 390 395 400 Thr Thr Arg Leu Pro Ala Ala Phe His Gly Asp Leu Ile Glu Leu Phe 405 410 415 Lys Asn Asn Pro Leu Ile Arg Pro Asn Ala Leu Glu Val Cys Gly Thr 420 425 430 Pro Ile Asp Leu Lys Gln Val Thr Ala Asp Ile Phe Ser Leu Ala Gly 435 440 445 Thr Asn Asp His Ile Thr Pro Trp Lys Ser Cys Tyr Lys Ser Ala Gln 450 455 460 Leu Phe Gly Gly Asn Val Glu Phe Val Leu Ser Ser Ser Gly His Ile 465 470 475 480 Gln Ser Ile Leu Asn Pro Pro Gly Asn Pro Lys Ser Arg Tyr Met Thr 485 490 495 Ser Thr Glu Val Ala Glu Asn Ala Asp Glu Trp Gln Ala Asn Ala Thr 500 505 510 Lys His Thr Asp Ser Trp Trp Leu His Trp Gln Ala Trp Gln Ala Gln 515 520 525 Arg Ser Gly Glu Leu Lys Lys Ser Pro Thr Lys Leu Gly Ser Lys Ala 530 535 540 Tyr Pro Ala Gly Glu Ala Ala Pro Gly Thr Tyr Val His Glu Arg 545 550 555 <210> 3 <211> 1065 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AroGfbr <400> 3 atgaattatc agaacgacga tttacgcatc aaagaaatca aagagttact tcctcctgtc 60 gcattgctgg aaaaattccc cgctactgaa aatgccgcga atacggttgc ccatgcccga 120 aaagcgatcc ataagatcct gaaaggtaat gatgatcgcc tgttggttgt gattggccca 180 tgctcaattc atgatcctgt cgcggcaaaa gagtatgcca ctcgcttgct ggcgctgcgt 240 gaagagctga aagatgagct ggaaatcgta atgcgcgtct attttgaaaa gccgcgtacc 300 acggtgggct ggaaagggct gattaacgat ccgcatatgg ataatagctt ccagatcaac 360 gacggtctgc gtatagcccg taaattgctg cttgatatta acgacagcgg tctgccagcg 420 gcaggtgagt ttctcaatat gatcacccca caatatctcg ctgacctgat gagctggggc 480 gcaattggcg cacgtaccac cgaatcgcag gtgcaccgcg aactggcatc agggctttct 540 tgtccggtcg gcttcaaaaa tggcaccgac ggtacgatta aagtggctat cgatgccatt 600 aatgccgccg gtgcgccgca ctgcttcctg tccgtaacga aatgggggca ttcggcgatt 660 gtgaatacca gcggtaacgg cgattgccat atcattctgc gcggcggtaa agagcctaac 720 tacagcgcga agcacgttgc tgaagtgaaa gaagggctga acaaagcagg cctgccagca 780 caggtgatga tcgatttcag ccatgctaac tcgtccaaac aattcaaaaa gcagatggat 840 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Phe Gln Gln Lys Phe Glu Val Ile Pro Ala 20 25 30 Asn Leu Thr Thr His Asp Gly Phe Lys Gln Ala Leu Arg Glu Lys Arg 35 40 45 Tyr Gly Asp Phe Glu Ala Ile Ile Lys Leu Ala Val Glu Asn Gly Thr 50 55 60 Glu Ser Tyr Pro Trp Asn Ala Asp Leu Ile Ser His Leu Pro Ser Ser 65 70 75 80 Leu Lys Val Phe Ala Ala Ala Gly Ala Gly Phe Asp Trp Leu Asp Leu 85 90 95 Asp Ala Leu Asn Glu Arg Gly Val Ala Phe Ala Asn Ser Arg Gly Ala 100 105 110 Gly Asp Thr Ala Thr Ser Asp Leu Ala Leu Tyr Leu Ile Leu Ser Val 115 120 125 Phe Arg Leu Ala Ser Tyr Ser Glu Arg Ala Ala Arg Thr Gly Asp Pro 130 135 140 Glu Thr Phe Asn Arg Val His Leu Glu Ile Gly Lys Ser Ala His Asn 145 150 155 160 Pro Arg Gly His Val Leu Gly Ala Val Gly Leu Gly Ala Ile Gln Lys 165 170 175 Glu Ile Ala Arg Lys Ala Val His Gly Leu Gly Met Lys Leu Val Tyr 180 185 190 Tyr Asp Val Ala Pro Ala Asp Ala Glu Thr Glu Lys Ala Leu Gly Ala 195 200 205 Glu Arg Val Asp Ser Leu Glu Glu Leu Ala Arg Arg Ser Asp Cys Val 210 215 220 Ser Val Ser Val Pro Tyr Met Lys Leu Thr His His Leu Ile Asp Glu 225 230 235 240 Ala Phe Phe Ala Ala Met Lys Pro Gly Ser Arg Ile Val Asn Thr Ala 245 250 255 Arg Gly Pro Val Ile Ser Gln Asp Ala Leu Ile Ala Ala Leu Lys Ser 260 265 270 Gly Lys Leu Leu Ser Ala Gly Leu Asp Val His Glu Phe Glu Pro Gln 275 280 285 Val Ser Lys Glu Leu Ile Glu Met Lys His Val Thr Leu Thr Thr His 290 295 300 Ile Gly Gly Val Ala Ile Glu Thr Phe His Glu Phe Glu Arg Leu Thr 305 310 315 320 Met Thr Asn Ile Asp Arg Phe Leu Leu Gln Gly Lys Pro Leu Leu Thr 325 330 335 Pro Ala Gly Lys Val Phe Ala Pro Ser Ser Ala Ala 340 345 <210> 14 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 cgcgcatatg agaaaggttc ccattattac 30 <210> 15 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 15 cgcgggatcc ttagtgatgg tgatggtggt gggacttcat ttccttcaga c 51 <210> 16 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 16 tacagaattc atgttccgca gcgagtacgc 30 <210> 17 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 17 tattcctgca ggttagtgat ggtgatggtg gtgtcgcggc tccctgagct gtc 53 <210> 18 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 18 tacatcgtca gcggcgcc 18 <210> 19 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 19 ggcgccgctg acgatgta 18 <210> 20 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 20 cgcgcatatg gaaaacaatg caaacatgtt 30 <210> 21 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 21 cgcgaagctt ttagtgatgg tgatggtggt gtttttcttt gcgaaccatg ata 53 <210> 22 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 22 cgcggaattc atgaattatc agaacgacga 30 <210> 23 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 23 tattaagctt ttacccgcga cgcgctttta 30 <210> 24 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 24 tatcaagctt acacaggaaa cagaaatgac atcggaaaac ccgtt 45 <210> 25 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 25 cgcgaagctt tcaggttgga tcaacaggca 30 <210> 26 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 26 acaatctgat tatgccccgt ctggaatcac 30 <210> 27 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 27 gtgattccag acggggcata atcagattgt 30 <210> 28 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 28 tataggtacc acacaggaaa cagaaatggg gaccttcgtt attga 45 <210> 29 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 29 cgctgtcgac ttatcacttg tcatcgtcat 30 <210> 30 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 30 tataggatcc atgaaaatcc tggcgtattg cg 32 <210> 31 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 31 cgcgaagctt ttatttacaa acgcgctggt 30 <210> 32 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 32 cgcgctcgag gctgttgaca attaatcatc 30 <210> 33 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 33 cgcggagctc tgtagaaacg caaaaaggcc 30 <210> 34 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 34 tatacctgca ggacacagga aacagaaatg gaaaacaatg caaacat 47 <210> 35 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 35 tatgcctgca ggttagtgat ggtgatggtg gt 32 <210> 36 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 36 tatacctgca ggacacagga aacagaaatg aaaatcctgg cgtattgcg 49 <210> 37 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 37 cgcgaagctt ttatttacaa acgcgctggt 30 <210> 38 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 38 cggccatatg cttttagaag gagttaaagt 30 <210> 39 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 39 tattgcggcc gcttagtgat ggtgatggtg gtgatatctt acaactttac tat 53 <210> 40 <211> 64 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 40 tattcctgca ggcggataac aatttcacac aggaaacaga attcatgctt ttagaaggag 60 ttaa 64 <210> 41 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 41 cgcgcatatg ttaatatctt acaactttac 30 <210> 42 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 42 tattcctgca ggacacagga aacagaaatg cttttagaag gagttaa 47 <210> 43 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 43 tatacctgca ggttaatatc ttacaacttt ac 32 <210> 44 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 44 tataggtacc acacaggaaa cagaaatgcg ggaaccactc acgct 45 <210> 45 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 45 tataggatcc ttatccatgg ctcctatctc ggt 33 <210> 46 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 46 tataggatcc acacaggaaa cagaaatgcc tcgtccgcgc gtcct 45 <210> 47 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 47 tatgcctgca ggttatgcag cagatgacgg cgcaaa 36 <210> 48 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 48 tataggatcc acacaggaaa cagaaatgag aattacaatt gccgg 45 <210> 49 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 49 cgcgcctgca ggttattttg cttttaataa ctcttc 36 <210> 50 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 50 tattggtacc tcaggttgga tcaacaggca 30 <210> 51 <211> 71 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 51 atagtgtcat atcatcatat taattgttct tttttcaggt gaaggttccc taggtgacac 60 tatagaacgc g 71 <210> 52 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 52 cggctggtga tttcgtccag cgaaccttcc atcgcatctt cgcccacggc tagtggatct 60 gatgggtacc 70 <210> 53 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 53 tttccgtctt tgtgtcaatg attgttgaca gaaaccttcc tgctatccaa atagtgtcat 60 atcatcatat 70 <210> 54 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 54 gcgtgctggg ataattgcga taaagctggg ttaataccga gcgttcaaaa cggctggtga 60 tttcgtccag 70 <210> 55 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 55 tttctctccc atcccttccc cctccgtcag atgaactaaa cttgttaccg gacactatag 60 aacgcggccg 70 <210> 56 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 56 gcgcagcata tacaggctga aacctttggc ctgttcgagt ttgatctgcg ccgcataggc 60 cactagtgga 70 <210> 57 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 57 tatgcccgat gatattcctt tcatcgggct atttaaccgt tagtgcctcc tttctctccc 60 atcccttccc 70 <210> 58 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 58 tttgttttcg ccagttcgat cacttcatca ccgcgtccgc tgatgattgc gcgcagcata 60 tacaggctga 70 <210> 59 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 59 taccaaaggt gactggcaga atgaagtaaa cgtccgtgac ttcattcaga gacactatag 60 aacgcggccg 70 <210> 60 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 60 gcgagttgaa acgtactgcg tagccagata cacggatggt cagctgcgga ccgcataggc 60 cactagtgga 70 <210> 61 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 61 tgttacatgt ccgagcttaa tgaaaagtta gccacagcct gggaaggttt taccaaaggt 60 gactggcaga 70 <210> 62 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 62 agattgagtg aaggtacgag taataacgtc ctgctgctgt tctttagtca gcgagttgaa 60 acgtactgcg 70 <210> 63 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 63 tgaacttaac gcactcgtag agcgtgtaaa aaaagcccag cgtgaatatg gacactatag 60 aacgcggccg 70 <210> 64 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 64 gcttttttct cagctttagc cggagcagct tctttcttcg ctgcagtttc ccgcataggc 60 cactagtgga 70 <210> 65 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 65 aaaaaagttt aacattatca ggagagcatt atggctgtta ctaatgtcgc tgaacttaac 60 gcactcgtag ag 72 <210> 66 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 66 aggggccgtt tatgttgcca gacagcgcta ctgattaagc ggattttttc gcttttttct 60 cagctttagc cg 72 <210> 67 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 67 gcggaagcag ccaataagaa ggagaaggcg aatggctgag atgaaaaacc gacactatag 60 aacgcggccg 70 <210> 68 <211> 71 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 68 gtgtttcaaa aagttgacgc ctacgctggc gacccgattc ttacgcttat taggtgacac 60 tatagaacgc g 71 <210> 69 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 69 tggcaatggc gcgaatagcg taggcatcct cttccatacc ggcaccaaat tagtggatct 60 gatgggtacc 70 <210> 70 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 70 ccggtttatt gtgttttaac cacctgcccg taaacctgga gaaccatcgc gtgtttcaaa 60 aagttgacgc 70 <210> 71 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 71 ggagaaaatt ttcgagaacg aattgctcac cagagcgggt aatccagcgc tggcaatggc 60 gcgaatagcg 70 <210> 72 <211> 71 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 72 atgtttgaga acattaccgc cgctcctgcc gacccgattc tgggcctggc taggtgacac 60 tatagaacgc g 71 <210> 73 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 73 tagccgcgaa agcgcgcagt ccttcagcat cttcttccag accacgggca tagtggatct 60 gatgggtacc 70 <210> 74 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 74 cgttaccctg atagcggact tcccttctgt aaccataatg gaacctcgtc atgtttgaga 60 acattaccgc 70 <210> 75 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 75 caggccaaag tttttagagt aggaactggc aacaatcagc tctttatgca tagccgcgaa 60 agcgcgcagt 70 <210> 76 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 76 tataggatcc cgggcaagta ccttgccgac 30 <210> 77 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 77 tatcaagctt tcagcccata tgcaggccgc 30 <210> 78 <211> 85 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 78 tattggtacc ttgacggcta gctcagtcct aggtacagtg ctagcgaatt cacaggaaac 60 agaccatgac tgacgttgtc atcgt 85 <210> 79 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 79 tattggatcc tcagcccata tgcaggccgc 30 <210> 80 <211> 85 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 80 tattggtacc tttacggcta gctcagtcct aggtactatg ctagcgaatt cacaggaaac 60 agaccatgac tgacgttgtc atcgt 85 <210> 81 <211> 85 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 81 tattggtacc tttatggcta gctcagtcct aggtacaatg ctagcgaatt cacaggaaac 60 agaccatgac tgacgttgtc atcgt 85 <210> 82 <211> 85 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 82 tattggtacc tttacagcta gctcagtcct agggactgtg ctagcgaatt cacaggaaac 60 agaccatgac tgacgttgtc atcgt 85 <210> 83 <211> 85 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 83 tattggtacc ctgatagcta gctcagtcct agggattatg ctagcgaatt cacaggaaac 60 agaccatgac tgacgttgtc atcgt 85 <210> 84 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 84 acaggtgaac gagtcctttg gctttgagct ggaatttttt gactttctgc gacactatag 60 aacgcggccg 70 <210> 85 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 85 ttgcttaagt tttgcagcgt agtctgagaa atactggtca gagcttctgc ccgcataggc 60 cactagtgga 70 <210> 86 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 86 atgaaactcg ccgtttatag cacaaaacag tacgacaaga agtacctgca acaggtgaac 60 gagtcctttg 70 <210> 87 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 87 agcggcaaga ttaaaccagt tcgttcgggc aggtttcgcc tttttccaga ttgcttaagt 60 tttgcagcgt 70 <210> 88 <211> 77 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 88 ttgcttaagt tttgcagcgt agtctgagaa atactggtca gagcttctgc tgagcggata 60 catatttgaa tgtattt 77 <210> 89 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pJ23100 promoter <400> 89 ttgacggcta gctcagtcct aggtacagtg ctagc 35 <210> 90 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pJ23105 promoter <400> 90 tttacggcta gctcagtcct aggtactatg ctagc 35 <210> 91 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pJ23114 promoter <400> 91 tttatggcta gctcagtcct aggtacaatg ctagc 35 <210> 92 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pJ23109 promoter <400> 92 tttacagcta gctcagtcct agggactgtg ctagc 35 <210> 93 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pJ23103 promoter <400> 93 ctgatagcta gctcagtcct agggattatg ctagc 35

Claims (32)

  1. 탄소원으로부터 아세틸-CoA 생성능을 가지는 알칼리제네스(Alcaligenes)속, 슈도모나스(Pseudomonas)속, 에스케리치아(Escherichia)속, 랄스토니아(Ralstonia)속, 바실러스(Bacillus)속, 코리네박테리움(Corynebacterium)속으로 구성된 군에서 선택되는 미생물에서, 2-하이드록시이소카프로에이트-CoA 전이효소를 코딩하는 유전자인 hadA 및 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소를 코딩하는 유전자가 도입되어 있으며, 2-하이드록시이소카프로에이트, 2-하이드록시헥사노에이트, 2-하이드록시옥타노에이트, 페닐락테이트, 2-하이드록시-4-페닐부티레이트, 3-하이드록시-3-페닐프로피오네이트, 4-하이드록시벤조산 및 만델레이트로 구성된 군에서 선택되는 방향족 단량체 또는 장사슬 2-HA를 단량체로 함유하는 폴리하이드록시알카노에이트 생성능을 가지는 재조합 미생물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소는 Ralstonia eutropha, Pseudomonas, Bacillus 및 Pseudomonas sp. 6-19으로 구성된 군에서 선택되는 균주 유래의 PHA synthase 또는 하기에서 선택되는 아미노산 서열을 가지는 PHA synthase의 변이효소인 것을 특징으로 하는 재조합 미생물:
    서열번호 2의 아미노산 서열에서 E130D, S325T, L412M, S477R, S477H, S477F, S477Y, S477G, Q481M, Q481K 및 Q481R로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 변이를 포함하는 아미노산 서열;
    서열번호 2의 아미노산 서열에서 E130D, S325T, L412M, S477G 및 Q481M이 변이된 아미노산 서열(C1335);
    서열번호 2의 아미노산 서열에서 E130D, S477F 및 Q481K가 변이된 아미노산 서열(C1310); 및
    서열번호 2의 아미노산 서열에서 E130D, S477F 및 Q481R이 변이된 아미노산 서열(C1312).
  3. 제1항에 있어서, 상기 2-하이드록시이소카프로에이트-CoA 전이효소는 Clostridium difficile 630 유래인 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 2-하이드록시이소카프로에이트-CoA 전이효소는 아세틸-CoA를 CoA 공여체로 사용하는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  5. 삭제
  6. 제1항에 있어서, β-케토티올레이즈를 코딩하는 유전자와 아세토아세틸-CoA 리덕테이즈를 코딩하는 유전자가 추가로 도입되어 있는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  7. 다음 단계를 포함하는 방향족 단량체 또는 장사슬 2-HA를 단량체로 함유하는 폴리하이드록시알카노에이트의 제조방법:
    (a) 제1항 내지 제4항 및 제6항 중 어느 한 항의 재조합 미생물을 배양하는 단계; 및
    (b) 2-하이드록시이소카프로에이트, 2-하이드록시헥사노에이트, 2-하이드록시옥타노에이트, 페닐락테이트, 2-하이드록시-4-페닐부티레이트, 3-하이드록시-3-페닐프로피오네이트, 4-하이드록시벤조산 및 만델레이트로 구성된 군에서 선택되는 방향족 단량체 또는 장사슬 2-HA를 단량체로 함유하는 폴리하이드록시알카노에이트를 수득하는 단계.
  8. 제7항에 있어서, 상기 재조합 미생물을 방향족 단량체 또는 장사슬 2-HA를 단량체로 함유하는 배지에서 배양하는 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트의 제조방법.
  9. 삭제
  10. 탄소원으로부터 아세틸-CoA 생성능을 가지는 알칼리제네스(Alcaligenes)속, 슈도모나스(Pseudomonas)속, 에스케리치아(Escherichia)속, 랄스토니아(Ralstonia)속, 바실러스(Bacillus)속, 코리네박테리움(Corynebacterium)속으로 구성된 군에서 선택되는 미생물에서, 2-하이드록시이소카프로에이트-CoA 전이효소를 코딩하는 유전자인 hadA, 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소를 코딩하는 유전자, DAHP(3-데옥시-D-아라비노-헵툴로소네이트-7-인산) 합성효소를 코딩하는 유전자, 코리스메이트 뮤타아제/프레페네이트 디하이드로게네이즈를 코딩하는 유전자 및 D-락테이트 디하이드로게네이즈를 코딩하는 유전자가 도입되어 있고, 페닐락테이트를 단량체로 함유하는 폴리하이드록시알카노에이트 생성능을 가지는 재조합 미생물.
  11. 제10항에 있어서, 상기 2-하이드록시이소카프로에이트-CoA 전이효소는 Clostridium difficile 630 유래인 것을 특징으로 하는 페닐락테이트를 단량체로 함유하는 폴리하이드록시알카노에이트 생성능을 가지는 재조합 미생물.
  12. 제10항에 있어서, 상기 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소는 Ralstonia eutropha, Pseudomonas, Bacillus 및 Pseudomonas sp. 6-19으로 구성된 군에서 선택되는 균주 유래의 PHA synthase 또는 하기에서 선택되는 아미노산 서열을 가지는 PHA synthase의 변이효소인 것을 특징으로 하는 페닐락테이트를 단량체로 함유하는 폴리하이드록시알카노에이트 생성능을 가지는 재조합 미생물:
    서열번호 2의 아미노산 서열에서 E130D, S325T, L412M, S477R, S477H, S477F, S477Y, S477G, Q481M, Q481K 및 Q481R로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 변이를 포함하는 아미노산 서열;
    서열번호 2의 아미노산 서열에서 E130D, S325T, L412M, S477G 및 Q481M이 변이된 아미노산 서열(C1335);
    서열번호 2의 아미노산 서열에서 E130D, S477F 및 Q481K가 변이된 아미노산 서열(C1310); 및
    서열번호 2의 아미노산 서열에서 E130D, S477F 및 Q481R이 변이된 아미노산 서열(C1312).
  13. 제10항에 있어서, 상기 DAHP(3-데옥시-D-아라비노-헵툴로소네이트-7-인산) 합성효소를 코딩하는 유전자는 서열번호 8으로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하는 유전자인 것을 특징으로 하는 페닐락테이트를 단량체로 함유하는 폴리하이드록시알카노에이트 생성능을 가지는 재조합 미생물.
  14. 제10항에 있어서, 상기 코리스메이트 뮤타아제/프레페네이트 디하이드로게네이즈를 코딩하는 유전자는 서열번호 9으로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하는 유전자인 것을 특징으로 하는 페닐락테이트를 단량체로 함유하는 폴리하이드록시알카노에이트 생성능을 가지는 재조합 미생물.
  15. 제10항에 있어서, 상기 D-락테이트 디하이드로게네이즈를 코딩하는 유전자는 서열번호 10으로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하는 유전자인 것을 특징으로 하는 페닐락테이트를 단량체로 함유하는 폴리하이드록시알카노에이트 생성능을 가지는 재조합 미생물.
  16. 제10항에 있어서, 상기 D-락테이트 디하이드로게네이즈를 코딩하는 유전자는 fldH 유전자인 것을 특징으로 하는 페닐락테이트를 단량체로 폴리하이드록시알카노에이트 생성능을 가지는 재조합 미생물.
  17. 제10항에 있어서, β-케토티올레이즈를 코딩하는 유전자와 아세토아세틸-CoA 리덕테이즈를 코딩하는 유전자가 추가로 도입되어 있는 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트 생성능을 가지는 재조합 미생물.
  18. 제10항에 있어서, tyrR 유전자, 피루브산 산화효소를 코딩하는 유전자, 피루브산 포메이트 리아제를 코딩하는 유전자, 아세트알데히드 탈수소효소를 코딩하는 유전자, 푸마레이트 리덕테이즈를 코딩하는 유전자, 티로신 아미노전이효소를 코딩하는 유전자, 및 아스파라긴산 아미노전이효소를 코딩하는 유전자로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자가 결실되어 있는 것을 특징으로 하는 페닐락테이트를 단량체로 함유하는 폴리하이드록시알카노에이트 생성능을 가지는 재조합 미생물.
  19. 다음 단계를 포함하는 페닐락테이트를 단량체로 함유하는 폴리하이드록시알카노에이트의 제조방법;
    (a) 제10항 내지 제18항 중 어느 한 항의 재조합 미생물을 배양하는 단계; 및
    (b) 페닐락테이트를 단량체로 함유하는 폴리하이드록시알카노에이트를 수득하는 단계.
  20. 탄소원으로부터 아세틸-CoA 생성능을 가지는 알칼리제네스(Alcaligenes)속, 슈도모나스(Pseudomonas)속, 에스케리치아(Escherichia)속, 랄스토니아(Ralstonia)속, 바실러스(Bacillus)속, 코리네박테리움(Corynebacterium)속으로 구성된 군에서 선택되는 미생물에서, 2-하이드록시이소카프로에이트-CoA 전이효소인 hadA 를 코딩하는 유전자, 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소를 코딩하는 유전자, DAHP(3-데옥시-D-아라비노-헵툴로소네이트-7-인산) 합성효소를 코딩하는 유전자, 코리스메이트 뮤타아제/프레페네이트 디하이드로게네이즈를 코딩하는 유전자 및 D-락테이트 디하이드로게네이즈를 코딩하는 유전자, 하이드록시만델레이트합성효소를 코딩하는 유전자, 하이드록시만델레이트 산화효소를 코딩하는 유전자 및 D-만델레이트 탈수소효소를 코딩하는 유전자가 도입되어 있고, 만델레이트를 단량체로 함유하는 폴리하이드록시알카노에이트 생성능을 가지는 재조합 미생물.
  21. 제20항에 있어서, 상기 2-하이드록시이소카프로에이트-CoA 전이효소는 Clostridium difficile 630 유래인 것을 특징으로 하는 만델레이트를 단량체로 함유하는 폴리하이드록시알카노에이트 생성능을 가지는 재조합 미생물.
  22. 제20항에 있어서, 상기 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소는 Ralstonia eutropha, Pseudomonas, Bacillus 및 Pseudomonas sp. 6-19으로 구성된 군에서 선택되는 균주 유래의 PHA synthase 또는 하기에서 선택되는 아미노산 서열을 가지는 PHA synthase의 변이효소인 것을 특징으로 하는 만델레이트를 단량체로 함유하는 폴리하이드록시알카노에이트 생성능을 가지는 재조합 미생물:
    서열번호 2의 아미노산 서열에서 E130D, S325T, L412M, S477R, S477H, S477F, S477Y, S477G, Q481M, Q481K 및 Q481R로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 변이를 포함하는 아미노산 서열;
    서열번호 2의 아미노산 서열에서 E130D, S325T, L412M, S477G 및 Q481M이 변이된 아미노산 서열(C1335);
    서열번호 2의 아미노산 서열에서 E130D, S477F 및 Q481K가 변이된 아미노산 서열(C1310); 및
    서열번호 2의 아미노산 서열에서 E130D, S477F 및 Q481R이 변이된 아미노산 서열(C1312).
  23. 제20항에 있어서, 상기 DAHP(3-데옥시-D-아라비노-헵툴로소네이트-7-인산) 합성효소를 코딩하는 유전자는 서열번호 8로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하는 유전자인 것을 특징으로 하는 만델레이트를 단량체로 함유하는 폴리하이드록시알카노에이트 생성능을 가지는 재조합 미생물.
  24. 제20항에 있어서, 상기 코리스메이트 뮤타아제/프레페네이트 디하이드로게네이즈를 코딩하는 유전자는 서열번호 9로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하는 유전자인 것을 특징으로 하는 만델레이트를 단량체로 함유하는 폴리하이드록시알카노에이트 생성능을 가지는 재조합 미생물.
  25. 제20항에 있어서, 상기 D-락테이트 디하이드로게네이즈를 코딩하는 유전자는 서열번호 10로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하는 유전자인 것을 특징으로 하는 만델레이트를 단량체로 함유하는 폴리하이드록시알카노에이트 생성능을 가지는 재조합 미생물.
  26. 제20항에 있어서, 상기 하이드록시만델레이트합성효소를 코딩하는 유전자는 서열번호 11로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하는 유전자인 것을 특징으로 하는 만델레이트를 단량체로 함유하는 폴리하이드록시알카노에이트 생성능을 가지는 재조합 미생물.
  27. 제20항에 있어서, 상기 하이드록시만델레이트 산화효소를 코딩하는 유전자는 서열번호 12로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하는 유전자인 것을 특징으로 하는 만델레이트를 단량체로 함유하는 폴리하이드록시알카노에이트 생성능을 가지는 재조합 미생물.
  28. 제20항에 있어서, 상기 D-만델레이트 탈수소효소를 코딩하는 유전자는 서열번호 13으로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하는 유전자인 것을 특징으로 하는 만델레이트를 단량체로 함유하는 폴리하이드록시알카노에이트 생성능을 가지는 재조합 미생물.
  29. 제20항에 있어서, 상기 D-락테이트 디하이드로게네이즈를 코딩하는 유전자는 fldH 유전자인 것을 특징으로 하는 만델레이트를 단량체로 함유하는 폴리하이드록시알카노에이트 생성능을 가지는 재조합 미생물.
  30. 제20항에 있어서, β-케토티올레이즈를 코딩하는 유전자와 아세토아세틸-CoA 리덕테이즈를 코딩하는 유전자가 추가로 도입되어 있는 것을 특징으로 하는 만델레이트를 단량체로 함유하는 폴리하이드록시알카노에이트 생성능을 가지는 재조합 미생물.
  31. 다음 단계를 포함하는 만델레이트를 단량체로 함유하는 폴리하이드록시알카노에이트의 제조방법;
    (a) 제20항 내지 제30항 중 어느 한 항의 재조합 미생물을 배양하는 단계; 및
    (b) 만델레이트를 단량체로 함유하는 폴리하이드록시알카노에이트를 수득하는 단계.
  32. 다음 단계를 포함하는 2-하이드록시이소카프로에이트, 2-하이드록시헥사노에이트 및 2-하이드록시옥타노에이트로 구성되는 군에서 선택되는 화합물을 단량체로 함유하는 폴리하이드록시알카노에이트의 제조방법;
    (a) 제1항 내지 제4항 및 제6항 중 어느 한 항의 재조합 미생물을 2-하이드록시이소카프로에이트, 2-하이드록시헥사노에이트 및 2-하이드록시옥타노에이트로 구성되는 군에서 선택되는 화합물을 함유하는 배지에서 배양하는 단계; 및
    (b) 2-하이드록시이소카프로에이트, 2-하이드록시헥사노에이트 및 2-하이드록시옥타노에이트로 구성되는 군에서 선택되는 화합물을 단량체로 함유하는 폴리하이드록시알카노에이트를 수득하는 단계.
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