KR101630003B1

KR101630003B1 - 2-하이드록시알카노에이트 중합체의 제조방법

Info

Publication number: KR101630003B1
Application number: KR1020120136571A
Authority: KR
Inventors: 강동균; 강혜옥
Original assignee: 주식회사 엘지화학
Priority date: 2011-11-28
Filing date: 2012-11-28
Publication date: 2016-06-13
Also published as: KR20130059308A

Abstract

2-하이드록시알카노에이트(2-hydroxyalkanoate: 2HA)를 2-하이드록시알카노일-CoA(2-하이드록시알카노일-CoA)로 전환하는 효소의 유전자 및 폴리하이드록시알카노에이트(polyhydroxyalkanoate: PHA) 합성효소 유전자를 동시에 가지는 세포를 이용하여 2-하이드록시알카노에이트들의 모노머로 이루어진 2-하이드록시알카노에이트 중합체를 제조하는 방법에 관한 것이다.

Description

2-하이드록시알카노에이트 중합체의 제조방법{Method of preparing for 2-hydroxyalkanoate polymer}

본 발명은 2-하이드록시알카노에이트를 2-하이드록시알카노일-CoA로 전환하는 효소의 유전자 및 2-하이드록시알카노일-CoA를 기질로 사용할 수 있는 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소 유전자를 동시에 가지는 미생물을 배양 배지에서 배양하는 것을 포함하는 2-하이드록시알카노에이트 중합체의 제조방법에 관한 것이다.

폴리하이드록시알카노에이트(PHA)는 과도한 탄소원이 존재하며 인, 질소, 마그네슘, 산소 등의 다른 영양분이 부족할 때 미생물이 에너지나 탄소원 저장물질로 그 내부에 축적하는 폴리에스터(polyester)이다. PHA는 기존의 석유로부터 유래된 합성고분자와 비슷한 물성을 가지면서 완전한 생분해성을 보이기 때문에 기존의 합성 플라스틱을 대체할 물질로 인식되고 있다. 미생물에서 PHA를 생산하기 위해서는 미생물의 대사산물을 PHA 모노머로 전환해 주는 효소와 PHA 모노머를 이용하여 PHA 고분자를 합성하는 PHA 합성효소(PHA synthase)가 필수적이다. PHA 합성효소는 하이드록시아실-CoA를 기질로 사용하여 PHA를 합성하며, PHA의 기질인 하이드록시아실-CoA를 제공할 수 있는 효소로는 랄스토니아 유트로파 등으로부터 클로닝된 β-케토티올라제 (PhaA), 아세토아세틸-CoA 리덕타아제 (PhaB), 슈도모나스로부터 클로닝된 3-하이드록시데카노일-ACP:CoA 트랜스퍼라아제 (PhaG), 에어로모나스 카비애와 슈도모나스 에어루지노사로부터 유래된 (R)-specific enoyl-CoA hydratase (PhaJ) (Fukui et al., J. Bacteriol., 180:667, 1998; Tsuge et al., FEMS Microbiol. Lett., 184:193, 2000), 대장균과 슈도모나스 에어루지노사 등으로부터 유래된 3-케토아실-ACP 리덕타아제 (FabG) 등이 알려져 있다 (Taguchi et al., FEMS Microbiol. Lett., 176:183, 1999; Ren et al., J. Bacteriol., 182:2978, 2000; Park et al., FEMS Microbiol. Lett., 214:217, 2002). 이러한 효소들을 이용하여 다양한 탄소위치가 하이드록실화된 하이드록시알카노에이트를 이용하여 다양한 종류의 PHA를 합성해 왔다.

하지만 2번 위치가 하이드록실화된 하이드록시알카노에이트에 대한 PHA 합성효소의 반응성은 거의 없는 것으로 보고되어 있다 (Zhang et al., Appl.Microbiol. Biotechnol., 56:131, 2001; Valentin and Steinbuchel, Appl.Microbiol. Biotechnol., 40:699, 1994). In vitro에서 PHA 합성효소의 글라이콜릴-CoA에 대해 반응성을 분석한 보고는 있었지만, 글라이콜릴-CoA에 대한 PHA 합성효소의 반응성은 매우 미약하였다 (Zhang et al., Appl. Microbiol. Biotechnol.,56:131, 2001; Valentin and Steinbuchel, Appl. Microbiol. Biotechnol., 40:699,1994). 즉, 2번-탄소위치가 하이드록실화된 글라이콜레이트와 같은 하이드록시알카노에이트는 PHA 합성효소의 기질특이성에 적합하지 않아, 자연적으로 혹은 재조합 세포나 식물을 이용하여 PHA 및 그 공중합체를 제조한 예는 없다.

이에, 본 발명자들은 2-하이드록시알카노에이트를 2-하이드록시알카노일-CoA로 전환하는 효소의 유전자 및 2-하이드록시알카노일-CoA를 기질로 사용할 수 있는 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소 유전자를 동시에 가지는 미생물을 배양 배지에서 배양하는 경우 2-하이드록시알카노에이트 중합체가 생성되는 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 2-하이드록시알카노에이트 중합체를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 2-하이드록시알카노에이트를 2-하이드록시알카노일-CoA로 전환하는 효소의 유전자 및 2-하이드록시알카노일-CoA를 기질로 사용할 수 있는 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소 유전자를 동시에 가지는 미생물을 배양 배지에서 배양하는 것을 포함하는 2-하이드록시알카노에이트 중합체의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 한 구체예에서, 배양 배지는 개시제로서 3-하이드록시알카노에이트를 포함하지 않을 수 있다.

본 발명의 다른 구체예에서, 2-하이드록시알카노에이트는 2-하이드록시부티레이트, 글라이콜레이트 및 락테이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 2-하이드록시알카노에이트일 수 있다.

본 발명의 한 구체예에서, 2-하이드록시알카노에이트를 2-하이드록시알카노일-CoA로 전환하는 효소의 유전자는 프로피오닐-CoA 트랜스퍼라아제 유전자(pct)일 수 있다.

본 발명의 한 구체예에서, 2-하이드록시알카노에이트를 2-하이드록시알카노일-CoA로 전환하는 효소의 유전자는 클로스트리디움 프로피오니쿰(Clostridium propionicum) 유래의 pct 유전자일 수 있다.

본 발명의 한 구체예에서, 2-하이드록시알카노에이트를 2-하이드록시알카노일-CoA로 전환하는 효소의 유전자는,

(a) 서열번호 1의 염기서열;

(b) 서열번호 1의 염기서열에서 A1200G가 변이된 염기서열;

(c) 서열번호 1의 염기서열에서 T78C, T669C, A1125G 및 T1158C가 변이된 염기서열;

(d) 서열번호 1과 대응하는 아미노산 서열에서 Gly335Asp이 변이되고, 서열번호 1의 염기서열에서 A1200G가 변이된 염기서열;

(e) 서열번호 1과 대응하는 아미노산 서열에서 Ala243Thr이 변이되고, 서열번호 1의 염기서열에서 A1200G가 변이된 염기서열;

(f) 서열번호 1과 대응하는 아미노산 서열에서 Asp65Gly이 변이되고, 서열번호 1 의 염기서열에서 T669C, A1125G 및 T1158C가 변이된 염기서열;

(g) 서열번호 1과 대응하는 아미노산 서열에서 Asp257Asn이 변이되고, 서열번호1의 염기서열에서 A1200G가 변이된 염기서열;

(h) 서열번호 1과 대응하는 아미노산 서열에서 Asp65Asn이 변이되고, 서열번호 1의 염기서열에서 T669C, A1125G 및 T1158C가 변이된 염기서열;

(i) 서열번호 1과 대응하는 아미노산 서열에서 Thr199Ile이 변이되고, 서열번호1의 염기서열에서 T669C, A1125G 및 T1158C가 변이된 염기서열; 및

(j) 서열번호 1의 염기서열에서 T78C, T669C, A1125G 및 T1158C가 변이되고, 서열번호 1과 대응하는 아미노산 서열에서 Val193Ala이 변이된 염기서열로 이루어진 군으로부터 선택된 염기서열을 갖는 것일 수 있다.

본 발명의 한 구체예에서, 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소 유전자는 슈도모나스 속 6-19(pseudomonas sp . 6-19)의 PHA 합성효소 유전자일 수 있다.

본 발명의 한 구체예에서, 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소 유전자는

서열번호 2의 아미노산 서열; 또는

서열번호 2의 아미노산 서열에서 E130D, S325T, S477R, S477H, S477F, S477Y, S477G, Q481M, Q481K 및 Q481R로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 변이를 포함하는 아미노산 서열에 대응하는 염기 서열을 갖는 것일 수 있다.

본 발명의 한 구체예에서, 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소 유전자는 서열번호 2의 아미노산 서열에서,

(i) S325T 및 Q481M;

(ii) E130D, S325T 및 Q481M;

(iii) E130D, S325T, S477R 및 Q481M; 및

(iv) E130D, S477F 및 Q481K로 이루어진 군으로부터 선택되는 변이를 포함하는 아미노산 서열에 대응하는 염기서열을 갖는 것일 수 있다.

본 발명의 다른 구체예에서, 2-하이드록시알카노에이트를 2-하이드록시알카노일-CoA로 전환하는 효소의 유전자 및 2-하이드록시알카노일-CoA를 기질로 사용할 수 있는 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소 유전자를 동시에 가지는 미생물은 락테이트디하이드로게나아제를 코딩하는 유전자가 결실되어 있는 미생물일 수 있다.

본 발명은 2-하이드록시알카노에이트 중합체를 제조하는 방법을 제공하는 효과가 있다.

이하, 본 발명의 구성을 구체적으로 설명한다.

본 발명은 2-하이드록시알카노에이트를 2-하이드록시알카노일-CoA로 전환하는 효소의 유전자 및 2-하이드록시알카노일-CoA를 기질로 사용할 수 있는 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소 유전자를 동시에 가지는 미생물을 배양 배지에서 배양하는 것을 포함하는 2-하이드록시알카노에이트 중합체의 제조방법을 제공한다.

용어 "2-하이드록시알카노에이트 중합체"란 특정 2-하이드록시알카노에이트 모노머를 반복단위로 함유하거나 2종 이상의 2-하이드록시알카노에이트 모노머를 반복단위로 함유하는 것을 말한다. 예를 들어, 2-하이드록시알카노에이트 중합체에는 2-하이드록시부티레이트 중합체, 폴리락테이트, 폴리글라이콜레이트, 2-하이드록시부티레이트-co-락테이트, 2-하이드록시부티레이트-co-글라이콜레이트, 2-하이드록시부티레이트-co-글라이콜레이트-co-락테이트 등을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 미생물은 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소 유전자 및 2-하이드록시알카노에이트를 2-하이드록시알카노일-CoA로 전환하는 효소의 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환되거나 상기 유전자가 염색체상에 삽입된 것일 수 있다.

또한, 본 발명에 있어서, 상기 미생물은 2-하이드록시알카노에이트를 2-하이드록시알카노일-CoA로 전환하는 효소의 유전자 및 2-하이드록시알카노일-CoA를 기질로 사용할 수 있는 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환되거나, 상기 유전자가 염색체상에 삽입된 것일 수 있다.

용어 "벡터"는 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 본 발명에서, 상기 벡터로는 플라스미드 벡터, 박테리오파지 벡터, 코스미드 벡터, YAC(Yeast Artificial Chromosome) 벡터 등이 사용될 수 있다. 본 발명의 목적상 플라스미드 벡터를 이용하는 것이 바람직하다. 그러한 목적에 사용될 수 있는 전형적인 플라스미드 벡터는 (a) 숙주세포당 수백 개의 플라스미드 벡터를 포함하도록 복제가 효율적으로 이루어지도록 하는 복제 개시점, (b) 플라스미드 벡터로 형질전환된 숙주세포가 선발될 수 있도록 하는 항생제 내성 유전자 및 (c) 외래 DNA 절편이 삽입될 수 있는 제한효소 절단부위를 포함하는 구조를 지니고 있다. 적절한 제한효소 절단부위가 존재하지 않을지라도, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터(adaptor) 또는 링커(linker)를 사용하면 벡터와 외래 DNA를 용이하게 라이게이션(ligation)할 수 있다.

라이게이션 후에, 벡터는 적절한 숙주세포로 형질전환되어야 한다. 본 발명에 바람직한 숙주세포는 원핵 또는 진핵생물 세포일 수 있다. 선호되는 숙주세포는 원핵세포이다. 적합한 원핵세포는 전술한 세 가지 유전자들 중 어느 하나의 유전자를 가지는 미생물뿐만 아니라, 대장균과 같이 상기 유전자 모두를 가지지 않는 미생물 또한 사용 가능하다. 바람직한 대장균은 E.coli DH5a, E.coli JM101, E.coli K12, E.coli W3110, E.coli X1776, E.coli XL1-Blue(Stratagene), E.coli B 등을 포함한다. 그러나 FMB101, NM522, NM538 및 NM539와 같은 E. coli 균주 및 다른 원핵생물의 종(speices) 및 속(genera)도 또한 사용될 수 있다. 전술한 E. coli 및 PHA 합성효소의 유전자를 가지는 미생물에 덧붙여, 아그로박테리움 A4와 같은 아그로박테리움 속 균주, 바실루스 섭틸리스(Bacillus subtilis)와 같은 바실리(bacilli), 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella typhimurium) 또는 세라티아 마르게센스(Serratia marcescens)와 같은 또 다른 장내세균 등이 숙주세포로서 이용될 수 있다. 효모와 곰팡이 같은 주지의 진핵숙주세포, 스포도프테라 프루기페르다(SF9)와 같은 곤충세포, CHO 및 생쥐 세포와 같은 동물세포, 조직배양된 인간세포 및 식물세포도 사용될 수 있다. 적당한 숙주로 형질전환되면 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다.

당업계에 주지된 바와 같이, 숙주세포에서 형질전환 유전자의 발현 수준을 높이기 위해서는 해당 유전자가 선택된 발현숙주 내에서 기능을 발휘하는 전사 및 해독 발현 조절 서열에 작동가능하도록 연결되어야만 한다. 바람직하게는 발현 조절 서열 및 해당 유전자는 세균 선택 마커 및 복제 개시점 (replication origin)을 같이 포함하고 있는 하나의 발현 벡터 내에 포함되게 된다. 발현 숙주가 진핵세포인 경우에는, 발현 벡터는 진핵 발현 숙주 내에서 유용한 발현 마커를 더 포함하여야만 한다.

상기 "발현 조절 서열(expression control sequence)"이라는 표현은 특정한 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열의 발현에 필수적인 DNA 서열을 의미한다. 그러한 조절 서열은 전사를 실시하기 위한 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다. 예를 들면, 원핵생물에 적합한 조절 서열은 프로모터, 임의로 오퍼레이터 서열 및 리보좀 결합 부위를 포함한다.　진핵세포는 프로모터, 폴리아데닐화 시그날 및 인핸서가 이에 포함된다.　플라스미드에서 유전자의 발현 양에 가장 영향을 미치는 인자는 프로모터이다. 고 발현용의 프로모터로서 SRα 프로모터와 사이토메가로바이러스 (cytomegalovirus) 유래 프로모터 등이 바람직하게 사용된다.

본 발명의 DNA 서열을 발현시키기 위하여, 매우 다양한 발현 조절 서열 중 어느 것이라도 벡터에 사용될 수 있다. 유용한 발현 조절 서열의 예로는, 예를 들어, SV40 또는 아데노바이러스의 초기 및 후기 프로모터들, lac 시스템, trp 시스템, TAC 또는 TRC 시스템, T3 및 T7 프로모터들, 파지 람다의 주요 오퍼레이터 및 프로모터 영역, fd 코드 단백질의 조절 영역, 3-포스포글리세레이트 키나제 또는 다른 글리콜분해 효소에 대한 프로모터, 상기 포스파타제의 프로모터들, 예를 들어 Pho5, 효모 알파-교배 시스템의 프로모터 및 원핵세포 또는 진핵 세포 또는 이들의 바이러스의 유전자의 발현을 조절하는 것으로 알려진 구성과 유도의 기타 다른 서열 및 이들의 여러 조합이 포함된다.

핵산은 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 배치될 때 "작동가능하게 연결(operably linked)"된다. 이것은 적절한 분자(예를 들면, 전사 활성화 단백질)가 조절 서열(들)에 결합될 때 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결된 유전자 및 조절 서열(들)일 수 있다.　예를 들면, 전서열(pre-sequence) 또는 분비 리더 (leader)에 대한 DNA는 폴리펩타이드의 분비에 참여하는 전단백질로서 발현되는 경우 폴리펩타이드에 대한 DNA에 작동가능하게 연결되고; 프로모터 또는 인핸서는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 번역을 용이하게 하도록 배치되는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로, "작동가능하게 연결된"은 연결된 DNA 서열이 접촉하고, 또한 분비 리더의 경우 접촉하고 리딩 프레임 내에 존재하는 것을 의미한다. 그러나, 인핸서(enhancer)는 접촉할 필요가 없다. 이들 서열의 연결은 편리한 제한 효소 부위에서 라이게이션(연결)에 의해 수행된다.　그러한 부위가 존재하지 않는 경우, 전술한 바와 같이 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 (oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용한다.

물론 모든 벡터와 발현 조절 서열이 본 발명의 DNA 서열을 발현하는데 모두 동등하게 기능을 발휘하지는 않는다는 것을 이해하여야만 한다. 마찬가지로 모든 숙주가 동일한 발현 시스템에 대해 동일하게 기능을 발휘하지는 않는다. 그러나, 당업자라면 과도한 실험적 부담없이 본 발명의 범위를 벗어나지 않는 채로 여러 벡터, 발현 조절 서열 및 숙주 중에서 적절한 선택을 할 수 있다. 예를 들어, 벡터를 선택함에 있어서는 숙주를 고려하여야 하는데, 이는 벡터가 그 안에서 복제되어야만 하기 때문이다. 벡터의 복제 수, 복제 수를 조절할 수 있는 능력 및 당해 벡터에 의해 코딩되는 다른 단백질, 예를 들어 항생제 마커의 발현도 또한 고려되어야만 한다. 이들 변수의 범위 내에서, 당업자는 본 발명에 적합한 각종 벡터/발현 조절 서열/숙주 조합을 선정할 수 있다.

또한, 원핵세포의 형질전환은 Sambrook et al., supra의 1.82 섹션에 기술된 칼슘 클로라이드 방법을 사용해서 용이하게 달성될 수 있다.　선택적으로, 전기천공법(electroporation)(Neumann et al., EMBO J., 1: 841(1982))이 또한 이러한 세포들을 형질전환하는데 사용될 수 있다.

지금까지 미생물에서 PHA를 생산할 때 3-하이드록시부티레이트와 같은 3번 탄소위치에 하이드록실화된 기질 또는 3번 이상의 탄소위치에 하이드록실화된 기질들만 사용할 수 있다고 알려져 있었다. 그러나, 이전 발명에서 2번 탄소 위치에 하이드록실화된 락테이트를 기질로 이용하여 락테이트 중합체(polylactic acid: PLA)를 생산 할 수 있도록 락틸-CoA를 기질로 효율적으로 이용할 수 있는 슈도모나스 속 6-19(슈도모나스 sp. 6-19) 유래 PHA합성효소 변이체를 개발하여 성공적으로 PLA 및 PLA 공중합체를 합성할 수 있었고(WO 08/062999), 클로스트리디움 프로피오니쿰(Clostridium propionicum) 유래 프로피오닐-CoA 트랜스퍼라아제의 변이체를 사용하여 프로피오닐-CoA 트랜스퍼라아제의 세포 성장 저해 및 대장균에서의 비효율적인 발현 문제를 해결함으로써 PLA 및 PLA공중합체를 고효율로 제조할 수 있다는 것을 확인한 바 있다. 다만, 락테이트와 같은 2-하이드록시알카노에이트들의 중합체 및 공중합체들은 생산할 때 PHA로 전환이 안되거나 생산성이 매우 낮기 때문에 PHA합성의 개시제 역할을 한다고 알려진 3-하이드록시부틸-CoA(3-hydroxybutyl-CoA: 3HB-CoA)와 같은 단량체가 있어야만 2-하이드록시알카노에이트가 단량체로 들어간 PHA가 생성된다고 보고되어 왔다. (Jung et al,. 2010; Taguchi et al,. 2008; Ymada et al., 2009; Yang et al., 2010).

그러나, 본 발명에서는 개시제로서 3-하이드록시부티레이트 없이도 2-하이드록시알카노에이트 중합체를 제조할 수 있다.

본 발명의 다른 구체예에서, 2-하이드록시알카노에이트는 2-하이드록시부티레이트, 글라이콜레이트 및 락테이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 하이드록시알카노에이트일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 예를 들어,본 발명에 의해 생산되는 중합체는 2-하이드록시부티레이트 중합체, 폴리락테이트, 폴리글라이콜레이트, 2-하이드록시부티레이트-co-글라이콜레이트, 2-하이드록시부티레이트-co-락테이트, 락테이트-co-글라이콜레이트, 2-하이드록시부티레이트-co-락테이트-co-글라이콜레이트 등일 수 있다.

(a) 서열번호 1의 염기서열;

(b) 서열번호 1의 염기서열에서 A1200G가 변이된 염기서열;

서열번호 2의 아미노산 서열; 또는

(i) S325T 및 Q481M;

(ii) E130D, S325T 및 Q481M;

(iii) E130D, S325T, S477R 및 Q481M; 및

이하, 본 발명을 실시예를 통해 상세히 설명한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

하기 실시예에서는 PHA 합성효소의 기질인 2-하이드록시알카노일-CoA를 제공하기 위하여, 2-하이드록시알카노에이트를 2-하이드록시알카노일-CoA로 전환하는 효소의 유전자로 클로스트리듐 프로피오니쿰 유래 프로피오닐-CoA 트랜스퍼라아제(pct)를 사용하였지만, 상기 전환 효소는 2-하이드록시알카노에이트를 2-하이드록시알카노일-CoA로 전환하는 역할을 하는 것으로서 다른 미생물 유래의 트랜스퍼라아제 유전자를 사용하여도 동일한 결과를 얻을 수 있다.

또한, 하기 실시예에서는 2-하이드록시알카노일-CoA를 기질로 사용할 수 있는 PHA 합성효소의 유전자로 pPs619C1249.18H 만을 예시하였지만, PHA 합성효소는 2-하이드록시알카노일-CoA를 기질로 사용하여 2-하이드록시알카노에이트 중합체를 생성하는 역할을 하는 것으로서 워터시아 유트로파, 알칼리게네스 라투스, 시노리조비움 멜리로티, 바실러스 메가테리움, 크로마티움 비노섬 등 다양한 종류의 미생물로부터 유래된 PHA 합성효소 등을 사용하여도 동일한 결과를 얻을 수 있다.

실시예 1: 2-하이드록시부티레이트 중합체 및 2-하이드록시부티레이트-co-글라이콜레이트 제조용 재조합 벡터의 제작

1-1. pPs619C1310-CPPCT540 재조합 벡터의 제작

슈도모나스 속 MBEL 6-19 (슈도모나스 sp. MBEL 6-19)의 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소의 변이체를 사용하여, 2-하이드록시알카노에이트 중합체를 제조할 수 있는 시스템을 완성하였다.

phaC1Ps6-19 합성효소 변이체(phaC1Ps6-19300)를 기초로 하여 서열번호 3 및 4의 프라이머를 사용한 SDM 방법을 이용하여 E130D, S477F 및 Q481K 이 변이된 아미노산 서열을 가진 슈도모나스 속 MBEL 6-19 유래 PHA 합성효소 변이체(phaC1Ps6-19310)를 제작하였다(한국공개특허 2008-0047279).

서열번호 3:5'-gaa ttc gtg ctg tcg agc cgc ggg cat atc- 3'

서열번호 4: 5'-gat atg ccc gcg gct cga cag cac gaa ttc- 3

이로부터 얻은 재조합 벡터(pPs619C1310-CPPCT540)를 E. coli JM109에 형질전환시키고, 이를 3HB가 포함된 중합체 검출배지(LB agar, glucose 20g/L, 3HB 2g/L, Nile red 0.5μg/ml)에서 생육시킨 결과, 중합체 생성을 확인할 수 있었다.

1-2 pPs619C1249.18H-CPPCT540 재조합 벡터의 제작

상기 1-1에서 제작한 pPs619C1310-CPPCT540 벡터를 주형으로 하여 서열번호 5 및 6의 프라이머를 사용하여 error-prone PCR을 수행하였다.

서열번호 5: 5'-ATGCCCGGAGCCGGTTCGAA-3'

서열번호 6: 5'-GAAATTGTTATCCGCCTGCAGG-3'

error-prone PCR을 수행한 후 돌연변이가 포함된 PCR 단편을 증폭하기 위해 서열번호 5및 6의 프라이머를 이용하여 다시 PCR 한 후 증폭된 돌연변이들을 pPs619C1310-CPPCT540 벡터의 BstBI/SbfI 위치에 삽입하여 변이체들에 대한 라이브러리를 제작하였다. 제작된 변이체 라이브러리를 E.coli XL-1Blue에 형질전환 시키고, 이를 PHB 검출배지(LB agar, glucose 20g/L, Nile red 0.5μg/ml)에서 3일 동안 배양했다. 배양 후 스크리닝 과정을 통해 최종 선별된 변이체는 L18H, V24A, K91R, M128V, E130D, N246S, S325T, S477G, Q481K 및 A527S이 변이된 아미노산 서열을 가진 pPs619C1249.18H이었다.

실시예 2: LdhA 유전자가 knock-out된 대장균 XL1-Blue 변이체 제작

락테이트가 포함되지 않는 2-하이드록시알카노에이트 중합체를 생산하기 위하여 대장균의 대사과정 중 락테이트 생산에 관여하는 D-락테이트디하이드로게나제(LdhA)를 genomic DNA에서 knouk-out 시켰다. 유전자의 결실은 업계에 잘 알려져 있는 red-recombination 방법을 이용하였다. LdhA를 결실시키기 위해 사용된 올리고머는 서열번호 7 및 서열번호 8의 염기서열로 합성하였다.

서열번호 7: 5'-atcagcgtacccgtgatgctaacttctctctggaaggtctgaccggctttaattaaccctcactaaagggcg-3'

서열번호 8: 5'-atcagcgtacccgtgatgctaacttctctctggaaggtctgaccggctttaattaaccctcactaaagggcg-3'

실시예 3: 재조합 대장균의 제작 및 이를 이용한 2-하이드록시부티레이알카노에이트 중합체의 제조

실시예 1에서 제작된 pPs619C1249.18H-CpPCT540을 대장균 XL1-Blue 및 대장균 XB(△LdhA)에 도입하여 재조합 대장균 XL1-Blue(pPs619C1249.18H-CpPCT540) 및 XB(pPs619C1249.18H-CpPCT540)를 제작한 다음, 플라스크 배양을 수행하였다. 먼저 재조합 대장균 XL1-Blue(pPs619C1310-CpPCT540)및 XB(pPs619C1249.18H-CpPCT540)를 2 g/L의 2-하이드록시부티레이트 또는 2g/L의 2-글라이콜레이트가 함유된 MR 배지에서 4일 동안 배양하였다. MR 배지의 조성은 다음과 같다: KH2PO4 6.67g, (NH4)2HPO4 4g, MgSO4·7H2O 0.8g, citric acid 0.8g, 및 trace metal solution 5mL. Trace metal solution(per liter): 5M HCl 5mL, FeSO4·7H2O 10g, CaCl2 2g, ZnSO4·7H2O 2.2g, MnSO4·4H2O 0.5g, CuSO4·5H2O 1g, (NH4)6Mo7O2·4H2O 0.1g, 및 Na2B4O2·10H2O 0.02g.

상기 배양액을 원심 분리하여 균체를 회수하고, 동결 건조시킨 다음, 클로로포름을 이용하여 균체에 축적된 고분자 물질을 회수하였다. 고분자의 모노머 조성을 가스크로마토그래피로 분석한 결과, 2-하이드록시알카노에이트 중합체임을 확인하였다. 생성된 고분자는 표 1과 같다.

<110> LG CHEM, LTD. <120> Method of preparing for 2-hydroxyalkanoate polymer or 2-hydroxyalkanoate copolymer <130> P120102 <150> 2011/0125165 <151> 2011-11-28 <160> 8 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1575 <212> DNA <213> clostridium propionicum popionyl-CoA transferase <400> 1 atgagaaagg ttcccattat taccgcagat gaggctgcaa agcttattaa agacggtgat 60 acagttacaa caagtggttt cgttggaaat gcaatccctg aggctcttga tagagctgta 120 gaaaaaagat tcttagaaac aggcgaaccc aaaaacatta cctatgttta ttgtggttct 180 caaggtaaca gagacggaag aggtgctgag cactttgctc atgaaggcct tttaaaacgt 240 tacatcgctg gtcactgggc tacagttcct gctttgggta aaatggctat ggaaaataaa 300 atggaagcat ataatgtatc tcagggtgca ttgtgtcatt tgttccgtga tatagcttct 360 cataagccag gcgtatttac aaaggtaggt atcggtactt tcattgaccc cagaaatggc 420 ggcggtaaag taaatgatat taccaaagaa gatattgttg aattggtaga gattaagggt 480 caggaatatt tattctaccc tgcttttcct attcatgtag ctcttattcg tggtacttac 540 gctgatgaaa gcggaaatat cacatttgag aaagaagttg ctcctctgga aggaacttca 600 gtatgccagg ctgttaaaaa cagtggcggt atcgttgtag ttcaggttga aagagtagta 660 aaagctggta ctcttgaccc tcgtcatgta aaagttccag gaatttatgt tgactatgtt 720 gttgttgctg acccagaaga tcatcagcaa tctttagatt gtgaatatga tcctgcatta 780 tcaggcgagc atagaagacc tgaagttgtt ggagaaccac ttcctttgag tgcaaagaaa 840 gttattggtc gtcgtggtgc cattgaatta gaaaaagatg ttgctgtaaa tttaggtgtt 900 ggtgcgcctg aatatgtagc aagtgttgct gatgaagaag gtatcgttga ttttatgact 960 ttaactgctg aaagtggtgc tattggtggt gttcctgctg gtggcgttcg ctttggtgct 1020 tcttataatg cggatgcatt gatcgatcaa ggttatcaat tcgattacta tgatggcggc 1080 ggcttagacc tttgctattt aggcttagct gaatgcgatg aaaaaggcaa tatcaacgtt 1140 tcaagatttg gccctcgtat cgctggttgt ggtggtttca tcaacattac acagaataca 1200 cctaaggtat tcttctgtgg tactttcaca gcaggtggct taaaggttaa aattgaagat 1260 ggcaaggtta ttattgttca agaaggcaag cagaaaaaat tcttgaaagc tgttgagcag 1320 attacattca atggtgacgt tgcacttgct aataagcaac aagtaactta tattacagaa 1380 agatgcgtat tccttttgaa ggaagatggt ttgcacttat ctgaaattgc acctggtatt 1440 gatttgcaga cacagattct tgacgttatg gattttgcac ctattattga cagagatgca 1500 aacggccaaa tcaaattgat ggacgctgct ttgtttgcag aaggcttaat gggtctgaag 1560 gaaatgaagt cctaa 1575 <210> 2 <211> 559 <212> PRT <213> PHA synthase <400> 2 Met Ser Asn Lys Ser Asn Asp Glu Leu Lys Tyr Gln Ala Ser Glu Asn 1 5 10 15 Thr Leu Gly Leu Asn Pro Val Val Gly Leu Arg Gly Lys Asp Leu Leu 20 25 30 Ala Ser Ala Arg Met Val Leu Arg Gln Ala Ile Lys Gln Pro Val His 35 40 45 Ser Val Lys His Val Ala His Phe Gly Leu Glu Leu Lys Asn Val Leu 50 55 60 Leu Gly Lys Ser Gly Leu Gln Pro Thr Ser Asp Asp Arg Arg Phe Ala 65 70 75 80 Asp Pro Ala Trp Ser Gln Asn Pro Leu Tyr Lys Arg Tyr Leu Gln Thr 85 90 95 Tyr Leu Ala Trp Arg Lys Glu Leu His Asp Trp Ile Asp Glu Ser Asn 100 105 110 Leu Ala Pro Lys Asp Val Ala Arg Gly His Phe Val Ile Asn Leu Met 115 120 125 Thr Glu Ala Met Ala Pro Thr Asn Thr Ala Ala Asn Pro Ala Ala Val 130 135 140 Lys Arg Phe Phe Glu Thr Gly Gly Lys Ser Leu Leu Asp Gly Leu Ser 145 150 155 160 His Leu Ala Lys Asp Leu Val His Asn Gly Gly Met Pro Ser Gln Val 165 170 175 Asn Met Gly Ala Phe Glu Val Gly Lys Ser Leu Gly Val Thr Glu Gly 180 185 190 Ala Val Val Phe Arg Asn Asp Val Leu Glu Leu Ile Gln Tyr Lys Pro 195 200 205 Thr Thr Glu Gln Val Tyr Glu Arg Pro Leu Leu Val Val Pro Pro Gln 210 215 220 Ile Asn Lys Phe Tyr Val Phe Asp Leu Ser Pro Asp Lys Ser Leu Ala 225 230 235 240 Arg Phe Cys Leu Arg Asn Asn Val Gln Thr Phe Ile Val Ser Trp Arg 245 250 255 Asn Pro Thr Lys Glu Gln Arg Glu Trp Gly Leu Ser Thr Tyr Ile Glu 260 265 270 Ala Leu Lys Glu Ala Val Asp Val Val Thr Ala Ile Thr Gly Ser Lys 275 280 285 Asp Val Asn Met Leu Gly Ala Cys Ser Gly Gly Ile Thr Cys Thr Ala 290 295 300 Leu Leu Gly His Tyr Ala Ala Ile Gly Glu Asn Lys Val Asn Ala Leu 305 310 315 320 Thr Leu Leu Val Ser Val Leu Asp Thr Thr Leu Asp Ser Asp Val Ala 325 330 335 Leu Phe Val Asn Glu Gln Thr Leu Glu Ala Ala Lys Arg His Ser Tyr 340 345 350 Gln Ala Gly Val Leu Glu Gly Arg Asp Met Ala Lys Val Phe Ala Trp 355 360 365 Met Arg Pro Asn Asp Leu Ile Trp Asn Tyr Trp Val Asn Asn Tyr Leu 370 375 380 Leu Gly Asn Glu Pro Pro Val Phe Asp Ile Leu Phe Trp Asn Asn Asp 385 390 395 400 Thr Thr Arg Leu Pro Ala Ala Phe His Gly Asp Leu Ile Glu Leu Phe 405 410 415 Lys Asn Asn Pro Leu Ile Arg Pro Asn Ala Leu Glu Val Cys Gly Thr 420 425 430 Pro Ile Asp Leu Lys Gln Val Thr Ala Asp Ile Phe Ser Leu Ala Gly 435 440 445 Thr Asn Asp His Ile Thr Pro Trp Lys Ser Cys Tyr Lys Ser Ala Gln 450 455 460 Leu Phe Gly Gly Asn Val Glu Phe Val Leu Ser Ser Ser Gly His Ile 465 470 475 480 Gln Ser Ile Leu Asn Pro Pro Gly Asn Pro Lys Ser Arg Tyr Met Thr 485 490 495 Ser Thr Glu Val Ala Glu Asn Ala Asp Glu Trp Gln Ala Asn Ala Thr 500 505 510 Lys His Thr Asp Ser Trp Trp Leu His Trp Gln Ala Trp Gln Ala Gln 515 520 525 Arg Ser Gly Glu Leu Lys Lys Ser Pro Thr Lys Leu Gly Ser Lys Ala 530 535 540 Tyr Pro Ala Gly Glu Ala Ala Pro Gly Thr Tyr Val His Glu Arg 545 550 555 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 gaattcgtgc tgtcgagccg cgggcatatc 30 <210> 4 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 gatatgcccg cggctcgaca gcacgaattc 30 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 atgcccggag ccggttcgaa 20 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 gaaattgtta tccgcctgca gg 22 <210> 7 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 atcagcgtac ccgtgatgct aacttctctc tggaaggtct gaccggcttt aattaaccct 60 cactaaaggg cg 72 <210> 8 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 atcagcgtac ccgtgatgct aacttctctc tggaaggtct gaccggcttt aattaaccct 60 cactaaaggg cg 72

Claims

2-하이드록시알카노에이트를 2-하이드록시알카노일-CoA로 전환하는 효소의 유전자 및 2-하이드록시알카노일-CoA를 기질로 사용할 수 있는 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소 유전자를 동시에 가지는 미생물을 3-하이드록시알카노에이트를 포함하지 않는 배양 배지에서 배양하는 것을 포함하고,
상기 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소 유전자는 서열번호 2의 아미노산 서열에서 L18H, V24A, K91R, M128V, N246S, S477R, S477H, S477F, S477Y, Q481M 및 Q481R로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 변이를 포함하는 아미노산 서열에 대응하는 염기서열을 갖는 2-하이드록시알카노에이트 중합체의 제조방법.
삭제
제1항에 있어서,
상기 2-하이드록시알카노에이트는 2-하이드록시부티레이트, 글라이콜레이트 및 락테이트로 이루어진 그룹으로부터 하나 이상 선택되는 것인 방법.
제1항에 있어서,
2-하이드록시알카노에이트를 2-하이드록시알카노일-CoA로 전환하는 효소의 유전자는 프로피오닐-CoA 트랜스퍼라아제 유전자(pct)인 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 2-하이드록시알카노에이트를 2-하이드록시알카노일-CoA로 전환하는 효소의 유전자는 클로스트리디움 프로피오니쿰(Clostridium propionicum) 유래의 pct 유전자인 것인 방법.
제1항에 있어서,
상기 2-하이드록시알카노에이트를 2-하이드록시알카노일-CoA로 전환하는 효소의 유전자는,
(a) 서열번호 1의 염기서열;
(b) 서열번호 1의 염기서열에서 A1200G가 변이된 염기서열;
(c) 서열번호 1의 염기서열에서 T78C, T669C, A1125G 및 T1158C가 변이된 염기서열;
(d) 서열번호 1과 대응하는 아미노산 서열에서 Gly335Asp이 변이되고, 서열번호 1의 염기서열에서 A1200G가 변이된 염기서열;
(e) 서열번호 1과 대응하는 아미노산 서열에서 Ala243Thr이 변이되고, 서열번호 1의 염기서열에서 A1200G가 변이된 염기서열;
(f) 서열번호 1과 대응하는 아미노산 서열에서 Asp65Gly이 변이되고, 서열번호 1 의 염기서열에서 T669C, A1125G 및 T1158C가 변이된 염기서열;
(g) 서열번호 1과 대응하는 아미노산 서열에서 Asp257Asn이 변이되고, 서열번호1의 염기서열에서 A1200G가 변이된 염기서열;
(h) 서열번호 1과 대응하는 아미노산 서열에서 Asp65Asn이 변이되고, 서열번호 1의 염기서열에서 T669C, A1125G 및 T1158C가 변이된 염기서열;
(i) 서열번호 1과 대응하는 아미노산 서열에서 Thr199Ile이 변이되고, 서열번호1의 염기서열에서 T669C, A1125G 및 T1158C가 변이된 염기서열; 및
(j) 서열번호 1의 염기서열에서 T78C, T669C, A1125G 및 T1158C가 변이되고, 서열번호 1과 대응하는 아미노산 서열에서 Val193Ala이 변이된 염기서열로 이루어진 군으로부터 선택된 염기서열을 갖는 것인 방법.
삭제
제1항에 있어서,
폴리하이드록시알카노에이트 합성효소 유전자는 서열번호 2의 아미노산 서열에서 E130D, S325T, S477G 및 Q481K로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 변이를 더 포함하는 아미노산 서열에 대응하는 염기 서열을 갖는 것인 방법.
제8항에 있어서,
폴리하이드록시알카노에이트 합성효소 유전자는 서열번호 2의 아미노산 서열에서
(i) S325T 및 Q481M;
(ii) E130D, S325T 및 Q481M;
(iii) E130D, S325T, S477R 및 Q481M; 및
(iv) E130D, S477F 및 Q481K로 이루어진 군으로부터 선택되는 변이를 포함하는 아미노산 서열에 대응하는 염기서열을 갖는 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 미생물은 락테이트디하이드로게나아제를 코딩하는 유전자가 결실되어 있는 미생물인 것인 방법.