CN108602944A - 液体生物聚合物、其用途和制备方法 - Google Patents

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Abstract

提供了在室温下以液相存在的生物聚合物，其用途及其制备方法。

Description

液体生物聚合物、其用途和制备方法
技术领域
相关申请的交叉引用
本申请要求于2016年3月28日提交的韩国专利申请号10-2016-0037218的优先权的权益，其全部公开内容通过引用并入本文。
本发明提供了在室温下以液相存在的聚羟基链烷酸酯(polyhydroxyalkanoate：PHA)生物聚合物，其用途及其制备方法。
背景技术
生物聚合物是通过使用生物质作为原料生产的聚合物塑料。生物聚合物不仅为仅由基于生物质的组分构成的塑料的统称，而且也为包含基于石油化学品的塑料的混合物的统称。生物聚合物是其主要组分是由植物和微生物制成的塑料的环境友好材料，其可以容易地分解并转变成可以被活的生物体吸收的形式。
聚羟基链烷酸酯(PHA)(一种典型的生物聚合物)，是当微生物的碳源丰富时在不存在生长所需元素例如氮、氧、磷、镁等的情况下为了储存能量和还原能力而积累在生物体中的天然聚酯物质。由于PHA在具有与源自石油的合成聚合物相似的特性的同时表现出生物降解性和生物相容性，所以其被认为是常规合成塑料的替代品。
已知约150种类型的PHA单体，并且这些单体的大多数是3-、4-、5-或6-羟基链烷酸酯(hydroxyalkanoate：HA)。被积极研究的代表性PHA单体是在3位和4位碳处具有羟基的单体，例如3-羟基丁酸酯(3HB)、4-羟基丁酸酯(4HB)、3-羟基丙酸酯(3HP)和具有6至12个碳原子的中链长度(MCL)的3-羟基链烷酸酯。
在微生物的PHA合成中发挥关键作用的酶是PHA合酶，其使用多种羟基酰基辅酶A作为底物合成包含对应单体的聚酯。此外，由于PHA合酶对多种羟基酰基辅酶A具有底物特异性，所以聚合物的单体组成受PHA合酶控制。因此，为了合成PHA，需要用于合成和提供可以用作PHA合酶底物的多种羟基酰基辅酶A的代谢途径以及使用所述底物和PHA合酶来进行聚合物合成的代谢途径。
发明内容
技术问题
常规的PHA生物聚合物在室温下以固态存在。本发明提供了在室温下以液相存在的生物聚合物，并且进一步提供了不仅在室温下以液相存在而且表现出生物降解性和黏附特性并因此可以用于多个领域的生物聚合物。
发明内容
技术问题
一个实施方案提供了在室温下以液相存在的聚羟基链烷酸酯(PHA)生物聚合物。
另一个实施方案提供了包含所述生物聚合物的PHA生物聚合物组合物，所述PHA生物聚合物组合物是可生物降解的或疏水的，或者同时具有生物降解性和疏水性二者。
又一个实施方案提供了用于制备包含4-羟基丁酸酯和2-羟基丁酸酯作为重复单元的共聚物的方法，其包括培养微生物的步骤，所述微生物具有减弱或缺陷的乳酸脱氢酶活性，并且包含编码使2-羟基链烷酸酯转变成2-羟基烷酰基辅酶A并使4-羟基链烷酸酯转变成4-羟基烷酰基辅酶A的酶的基因以及编码使用2-羟基烷酰基辅酶A和4-羟基烷酰基辅酶A作为底物的聚羟基链烷酸酯合酶的基因。
再一个实施方案提供了微生物，所述微生物具有减弱或缺陷的乳酸脱氢酶活性，其包含编码使2-羟基链烷酸酯转变成2-羟基烷酰基辅酶A并使4-羟基链烷酸酯转变成4-羟基烷酰基辅酶A的酶的基因以及编码使用2-羟基烷酰基辅酶A和4-羟基烷酰基辅酶A作为底物的PHA合酶的基因，并且生产包含4-羟基丁酸酯和2-羟基丁酸酯作为重复单元的共聚物。
另一个实施方案提供了用于制备生产包含4-羟基丁酸酯和2-羟基丁酸酯作为重复单元的共聚物的微生物的方法，其包括以下步骤：使编码乳酸脱氢酶的基因缺失；以及将编码使2-羟基链烷酸酯转变成2-羟基烷酰基辅酶A并使4-羟基链烷酸酯转变成4-羟基烷酰基辅酶A的酶的基因以及编码使用2-羟基烷酰基辅酶A和4-羟基烷酰基辅酶A作为底物的PHA合酶的基因引入细胞中。
有益效果
本发明提供了在室温下以液相存在的PHA生物聚合物，并且所述生物聚合物可以在电子、汽车、食品、农业和医学领域中被广泛地用作可生物降解的，可生物相容的且疏水的生物塑料的原料。特别地，本文提供的液体PHA聚合物表现出优异的黏附特性，并因此可以应用于整个化学工业，例如漆、有色漆、涂料、聚合物、纤维和黏合剂。此外，由于其不溶于水并且即使在湿态下也保留黏附特性，所以其可以应用于医用生物黏合剂。例如，可以是多种医学应用，例如组织黏合剂、止血剂、组织工程用支持物、药物递送载体、组织填料、创伤愈合、或者防止组织间黏连。
附图说明
图1示出了pPs619C1310-CpPCT540载体的制造过程和切割图谱。
图2示出了pPs619C1249.18H-CPPCT540载体的切割图谱。
图3示出了由重组细胞生产的4-羟基丁酸酯-2-羟基丁酸酯共聚物的气相色谱法分析的结果。
图4示出了包含不同摩尔比的4-羟基丁酸酯和2-羟基丁酸酯的聚合物的照片。
图5示出了包含不同摩尔比的4-羟基丁酸酯和2-羟基丁酸酯之聚合物的差示扫描量热法(DSC)分析的结果。endo表示吸热反应，而exo表示放热反应。
具体实施方式
在一个实施方案中，本发明涉及在室温下以液相存在的聚羟基链烷酸酯(PHA)生物聚合物。
一个具体实施方案涉及在室温下以液相存在并且具有生物降解性或疏水性，或者同时具有生物降解性和疏水性二者的PHA生物聚合物。
另一个具体实施方案涉及包含4-羟基丁酸酯和2-羟基丁酸酯作为重复单元的在室温下以液相存在的PHA生物聚合物。
另一个具体实施方案涉及在室温下以液相存在的生物聚合物，其中所述聚合物包含4-羟基丁酸酯和2-羟基丁酸酯作为重复单元，以及4-羟基丁酸酯和2-羟基丁酸酯以30％或更大的摩尔比分别包含在所述聚合物中。
另一个具体实施方案涉及在室温下以液相存在的生物聚合物，其中所述聚合物包含4-羟基丁酸酯和2-羟基丁酸酯作为重复单元，以及4-羟基丁酸酯和2-羟基丁酸酯以40％或更大的摩尔比分别包含在所述聚合物中。
另一个具体实施方案涉及在室温下以液相存在的生物聚合物，其中所述聚合物包含4-羟基丁酸酯和2-羟基丁酸酯作为重复单元，以及4-羟基丁酸酯和2-羟基丁酸酯以1∶1的摩尔比包含在所述聚合物中。
另一个实施方案涉及同时具有生物降解性和疏水性的生物聚合物组合物，其包含所述生物聚合物。
一个具体实施方案涉及这样的生物聚合物组合物：其可以黏附至选自以下的基材：玻璃、金属、聚合物材料、水凝胶、木材、陶瓷、细胞、组织、器官和生物分子。
另一个具体实施方案涉及这样的生物聚合物组合物：其可以用作组织黏合剂、组织缝合剂、黏连抑制剂、止血剂、组织工程用支持物、创伤敷料、药物递送载体、组织填料、环境友好涂料、环境友好油彩、脱发遮瑕剂添加剂或化妆品添加剂。
另一个实施方案涉及用于制备包含4-羟基丁酸酯和2-羟基丁酸酯作为重复单元的共聚物的方法。
另一个实施方案涉及用于制备包含4-羟基丁酸酯和2-羟基丁酸酯作为重复单元的共聚物的方法，其包括培养细胞的步骤，所述细胞具有减弱或缺陷的乳酸脱氢酶活性，并且包含编码使2-羟基链烷酸酯转变成2-羟基烷酰基辅酶A并使4-羟基链烷酸酯转变成4-羟基烷酰基辅酶A的酶的基因以及编码使用2-羟基烷酰基辅酶A和4-羟基烷酰基辅酶A作为底物的聚羟基链烷酸酯合酶的基因。
在另一个实施方案中，本发明涉及生产包含4-羟基丁酸酯和2-羟基丁酸酯作为重复单元的共聚物的微生物及其制备方法。
一个具体实施方案涉及微生物，其具有减弱或缺陷的乳酸脱氢酶活性，其包含编码使2-羟基链烷酸酯转变成2-羟基烷酰基辅酶A并使4-羟基链烷酸酯转变成4-羟基烷酰基辅酶A的酶的基因以及编码使用2-羟基烷酰基辅酶A和4-羟基烷酰基辅酶A作为底物的PHA合酶的基因，并且生产包含4-羟基丁酸酯和2-羟基丁酸酯作为重复单元的共聚物。
另一个实施方案涉及用于制备生产4-羟基丁酸酯-2-羟基丁酸酯共聚物的微生物的方法，其包括以下步骤：使编码乳酸脱氢酶的基因缺失；以及将编码使2-羟基链烷酸酯转变成2-羟基烷酰基辅酶A并使4-羟基链烷酸酯转变成4-羟基烷酰基辅酶A的酶的基因以及编码使用2-羟基烷酰基辅酶A和4-羟基烷酰基辅酶A作为底物的PHA合酶的基因引入细胞中。
下文中，将更详细地描述本发明。
本发明提供了在室温下以液相存在的PHA生物聚合物。优选地，本发明提供了在室温和常压下以液相存在PHA生物聚合物。
室温是指没有特别加热或控制的常温，并且通常可以在15℃至30℃或20℃至25℃的温度范围内。常压是指没有特别加压或控制的正常大气压，并且通常可以在约900至1,100hPa的压力范围内。
在一个实施方案中，生物聚合物具有生物降解性。生物降解性是指可以在体内降解的特性。
在另一个实施方案中，生物聚合物具有疏水性。疏水性是指难以与水分子结合的特性。
在另一个实施方案中，生物聚合物同时具有生物降解性和疏水性二者。
PHA聚合物没有限制地包括由多种羟基链烷酸酯单体构成的聚合物，只要该聚合物在室温和常压下以液相存在即可。例如，羟基链烷酸酯单体可以为2-、3-、4-、5-或6-羟基链烷酸酯。
在一个实施方案中，术语“包含4-羟基丁酸酯和2-羟基丁酸酯作为重复单元的共聚物”是指这样的PHA聚合物：其是包含通过使单体4-羟基丁酸酯和2-羟基丁酸通过酯键聚合而获得的重复单元的线性聚酯。此时，各单体的聚合顺序没有特别限制，并且其可以随机重复。其实例包括4-羟基丁酸酯-2-羟基丁酸酯共聚物或2-羟基丁酸酯-4-羟基丁酸酯共聚物。
在本发明的一个实施方案中，制备包含多种摩尔比的4-羟基丁酸酯和2-羟基丁酸酯的聚链烷酸酯共聚物大分子并分析物理特性。在差示扫描量热法(DSC)分析中，虽然在4-羟基丁酸酯或2-羟基丁酸酯的均聚物中观察到结晶，但确定4-羟基丁酸酯和2-羟基丁酸酯的共聚物是没有观察到结晶和熔解温度(Tm)的无定形聚合物。还首次确定了4-羟基丁酸酯和2-羟基丁酸酯的共聚物表现出黏附特性。特别地，确定当4-羟基丁酸酯和2-羟基丁酸酯单体的摩尔比分别为30％或更大时，共聚物表现出对于黏合剂适当的液相特性、疏水性和黏附特性。此外，当4-羟基丁酸酯和2-羟基丁酸酯单体的摩尔比为40％或更大时，共聚物可以表现出对于黏合剂适当的液相特性、疏水性和黏附特性。此外，当4-羟基丁酸酯和2-羟基丁酸酯单体的摩尔比为1∶1时，共聚物可以表现出对于黏合剂适当的液相特性、疏水性和黏附特性。
因此，共聚物中的4-羟基丁酸酯和2-羟基丁酸酯可以以30∶70至70∶30、或40∶60至60∶40、或50∶50的摩尔比来提供，并且共聚物在室温和常压下可以以液相存在。此外，在上述范围内，本发明的共聚物可以表现出黏附特性。此外，在上述范围内，由于本发明的共聚物表现出生物相容性、疏水性和黏附性并且以液相存在，所以其可以被用作用于黏附或固定玻璃、金属、聚合物材料、水凝胶、木材、陶瓷或生物材料的黏合剂。此外，由于本发明的聚合物不溶于水并且即使在湿态下也保留其黏附特性，所以其可以被用作医用生物黏合剂。
因此，本发明还提供了同时具有生物降解性和疏水性二者的生物聚合物组合物，其包含在室温下以液相存在的生物聚合物。
例如，生物聚合物组合物可以为溶剂型、水溶型或非溶剂型，并且基于基材可以以0.01至100μg/cm2的量使用，但不限于此。此外，使用所述组合物的方法与使用生物聚合物的常规方法一致，典型的方法可以为涂覆法。
本发明的生物聚合物组合物可以黏附至多种基材，例如无生命表面或生物样品。例如，所述组合物可以黏附至但不限于选自以下的基材：玻璃、金属、聚合物材料、水凝胶、木材、陶瓷、细胞、组织、器官和生物分子。生物分子的实例可以包括但不限于核酸、氨基酸、肽、蛋白质、脂质、碳水化合物、酶、激素、生长因子或配体。
因此，本发明的生物聚合物组合物不仅可以用于诸如漆、有色漆、涂料、聚合物、膜、黏附片和纤维的化学工业，而且可以用于诸如汽车工业、电子和电气工业、化妆品、医药的多种应用。
例如，生物聚合物组合物可以用作组织黏合剂、组织缝合剂、黏连抑制剂、止血剂、组织工程用支持物、创伤敷料、药物递送载体、组织填料、环境友好涂料、环境友好油彩、脱发遮瑕剂添加剂或化妆品添加剂。
作为具体实例，生物聚合物组合物可以代替目前市场上使用的氰基丙烯酸类黏合剂或基于纤维蛋白的黏合剂以用于多个领域，例如皮肤、血管、消化系统、颅神经、整形外科、矫形外科等。例如，生物聚合物组合物可以代替外科缝合线，可以用于堵塞不需要的血管以及用于软组织(例如，面部组织和软骨)和硬组织(例如，骨和牙齿)的止血和缝合，并且可以应用于家用医药。
更具体地，生物聚合物组合物可以作为生物黏合剂应用于人体的内表面和外表面，并且可以局部应用于例如人体的外表面(例如皮肤)或者在手术过程期间暴露的内部器官的表面。此外，本发明的生物聚合物组合物可以用于黏附组织的受损部分、密封组织中的空气/流体渗漏、将医用装置黏附至组织或者填充组织的缺陷部分。术语“生物组织”没有特别限制，并且包括例如皮肤、骨、神经、轴突、软骨、血管、角膜、肌肉、肌筋膜、脑、前列腺、乳腺、子宫内膜、肺、脾、小肠、肝、睾丸、卵巢、子宫颈、直肠、胃、淋巴结、骨髓和肾。
此外，生物聚合物组合物可以用于创伤愈合。例如，其可以用作应用于创伤的敷料。
此外，生物聚合物组合物可以用于皮肤缝合。也就是说，其可以代替缝合线局部地用于缝合创伤。此外，本发明的生物聚合物组合物可以应用于疝修补，例如，可以用于涂覆疝修补用网的表面。
生物聚合物组合物还可以用于缝合和防止管状结构如血管的渗漏。此外，本发明的生物聚合物组合物还可以用于止血。
此外，生物聚合物组合物可以用作黏连抑制剂。黏连在所有手术部位发生，并且是手术部位周围的其他组织黏在创伤周围的现象。手术后约97％的情况中发生黏连，并且特别地，其中的5％至7％引起严重的问题。为了防止这样的黏连，在手术期间使创伤最小化或者可以使用抗炎药。此外，激活TPA(组织纤溶酶原激活物)以防止纤维蛋白形成，或者使用物理屏障，例如结晶溶液、聚合物溶液和固体膜。然而，这些方法在体内可能是有毒性的并且可能表现出其他副作用。本发明的生物聚合物组合物可以应用于手术后暴露的组织以防止在所述组织与周围组织之间发生的黏连。例如，其可以用作用于防止器官黏连的药剂，尤其是用作肠黏连抑制剂。
生物聚合物组合物还可以用作组织工程用支持物。组织工程技术是指在支持物上培养分离自患者组织的细胞以制备细胞-支持物复合物并将该复合物移植到体内的技术。组织工程技术应用于几乎所有人体器官的再生，包括人工皮肤、人工骨、人工软骨、人工角膜、人工血管、人工肌肉等。由于本发明的生物聚合物组合物可以黏附至多种生物分子，所以其可以用作组织工程用支持物。此外，生物聚合物组合物可以用作医用材料，例如化妆品材料、创伤覆盖材料和牙基质。
此外，生物聚合物组合物可以用于眼部黏连，例如穿孔、开裂或切口的治疗，角膜移植和人工角膜插入；牙黏连，例如保持器装置、牙桥、牙冠附着、摇动牙固定、断齿治疗和填充材料固定；手术治疗，例如血管接合、细胞组织接合、人工材料移植、创伤闭合；矫形治疗，例如骨、韧带、肌腱、半月板和肌肉的治疗以及人工材料移植；或者药物递送载体等。
术语“使2-羟基链烷酸酯转变成2-羟基烷酰基辅酶A并使4-羟基链烷酸酯转变成4-羟基烷酰基辅酶A的酶”是指能够通过从辅酶A供体中解离出辅酶A并将其分别转移至2-羟基链烷酸酯和4-羟基链烷酸酯而产生2-羟基烷酰基辅酶A和4-羟基烷酰基辅酶A的酶。辅酶A供体的实例包括乙酰辅酶A或酰基辅酶A(例如，丙酰辅酶A)。
在一个实施方案中，所述酶可以是丙酰辅酶A转移酶。此外，所述酶的基因可以源自丙酸梭菌(Clostridium propionicum)。
例如，编码使2-羟基链烷酸酯、3-羟基链烷酸酯和4-羟基链烷酸酯分别转变成2-羟基烷酰基辅酶A、3-羟基烷酰基辅酶A和4-羟基烷酰基辅酶A的酶的基因可以具有选自以下的核苷酸序列：
(a)SEQ ID NO：1的核苷酸序列；
(b)包含A1200G突变的SEQ ID NO：1的核苷酸序列；
(c)包含T78C、T669C、A1125G和T1158C突变的SEQ ID NO：1的核苷酸序列；
(d)包含A1200G突变和以下突变的SEQ ID NO：1的核苷酸序列：导致对应于SEQ IDNO：1的氨基酸序列中的Gly335Asp突变；
(e)包含A1200G突变和以下突变的SEQ ID NO：1的核苷酸序列：导致对应于SEQ IDNO：1的氨基酸序列中的Ala243Thr突变；
(f)包含T669C、A1125G和T1158C突变以及以下突变的SEQ ID NO：1的核苷酸序列：导致对应于SEQ ID NO：1的氨基酸序列中的Asp65Gly突变；
(g)包含A1200G突变和以下突变的SEQ ID NO：1的核苷酸序列：导致对应于SEQ IDNO：1的氨基酸序列中的Asp257Asn突变；
(h)包含T669C、A1125G和T1158C突变以及以下突变的SEQ ID NO：1的核苷酸序列：导致对应于SEQ ID NO：1的氨基酸序列中的Asp65Asn突变；
(i)包含T669C、A1125G和T1158C突变以及以下突变的SEQ ID NO：1的核苷酸序列：导致对应于SEQ ID NO：1的氨基酸序列中的Thr199Ile突变；以及
(j)包含T78C、T669C、A1125G和T1158C突变以及以下突变的SEQ ID NO：1的核苷酸序列：导致对应于SEQ ID NO：1的氨基酸序列中的Val93Ala突变。
术语“使用2-羟基烷酰基辅酶A和4-羟基烷酰基辅酶A作为底物的PHA合酶”是指能够使用2-羟基烷酰基辅酶A和4-羟基烷酰基辅酶A作为底物合成包含4-羟基丁酸酯和2-羟基丁酸酯作为重复单元的共聚物的酶。
例如，所述酶可以是源自假单胞菌属(Pseudomonas sp.)6-19的PHA合酶(phaC)。
例如，PHA合酶可以由对应于以下氨基酸序列的核苷酸序列组成：SEQ ID NO：4的氨基酸序列；或者包含选自L18H、V24A、K91R、M128V、E130D、N246S、S325T、S477R、S477H、S477F、S477Y、S477G、Q481M、Q481K、Q481R和A527S中至少一个突变的SEQ ID NO：4的氨基酸序列。
在另一个具体实施方案中，PHA合酶可以由对应于包含选自以下突变的SEQ IDNO：4的氨基酸序列的核苷酸序列组成：
(i)S325T和Q481M；
(ii)E130D、S325T和Q481M；
(iii)E130D、S325T、S477R和Q481M；
(iv)E130D、S477F和Q481K；以及
(v)L18H、V24A、K91R、M128V、E130D、N246S、S325T、S477G、Q481K和A527S。
这样的酶可以包含在不完全改变分子活性的范围内的另外的突变。例如，蛋白质和肽中通常不改变分子活性的氨基酸交换是本领域已知的。例如，通常发生的交换是氨基酸残基交换，例如Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Thr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly，但不限于此。在一些情况下，蛋白质可以通过磷酸化、硫酸化、丙烯酸化、糖基化、甲基化、法尼基化等修饰。此外，可以包括由于氨基酸序列的突变或修饰而对热、pH等具有提高的结构稳定性或者具有提高的蛋白质活性的酶蛋白质。
此外，编码所述酶的基因可以包括这样的核酸分子：其包含功能等同的密码子——编码同一氨基酸的密码子(通过密码子简并)，或者编码生物学等同的氨基酸的密码子。所述核酸分子可以使用标准分子生物学技术例如化学合成法或重组法来分离或制备，或者可以使用市售核酸分子。
术语“乳酸脱氢酶”是指催化丙酮酸与乳酸之间的可逆转变的酶，并且该酶在乳酸合成途径中发挥着必不可少的作用。在一个实施方案中，编码乳酸脱氢酶的基因可以为ldhA。
本发明的特征在于，为了生产不含乳酸的共聚物，在宿主细胞的代谢期间参与乳酸产生的乳酸脱氢酶与固有调节活性相比是减弱或缺陷的。固有调节活性意指宿主细胞在其天然状态下具有的酶的活性状态，并且可以意指例如大肠杆菌(Escherichia coli)中天然存在的乳酸合成活性。
乳酸脱氢酶活性的缺失可以通过遗传操作来进行，所述遗传操作使编码所述酶的基因的一部分或全部缺失或者将其替换，或者向所述基因的核苷酸序列中插入特定的突变序列。此外，乳酸脱氢酶的活性可以通过以下过程来减弱：修饰所述基因的表达调控序列(例如，所述基因的启动子区或5’-UTR区)的核苷酸序列以使所述酶的表达减弱；或者在开放阅读框区域处引入突变以使酶的活性减弱。这样的突变的引入可以通过本领域已知的任意方法来完成，例如同源重组或λred重组系统。
本文提供的微生物包含编码使2-羟基链烷酸酯转变成2-羟基烷酰基辅酶A并使4-羟基链烷酸酯转变成4-羟基烷酰基辅酶A的酶的基因以及编码使用2-羟基烷酰基辅酶A和4-羟基烷酰基辅酶A作为底物的PHA合酶的基因，并且这些基因可以通过遗传重组方法引入微生物中。
例如，微生物可以为通过以下过程获得的微生物：用重组载体转化微生物，所述重组载体包含编码使2-羟基链烷酸酯转变成2-羟基烷酰基辅酶A并使4-羟基链烷酸酯转变成4-羟基烷酰基辅酶A的酶的基因以及编码使用2-羟基烷酰基辅酶A和4-羟基烷酰基辅酶A作为底物的PHA合酶的基因；或者对微生物进行遗传工程改造以在其染色体上插入所述基因。
此外，所述细胞可以为已经具有以下基因中的一种基因的细胞：编码使2-羟基链烷酸酯转变成2-羟基烷酰基辅酶A并使4-羟基链烷酸酯转变成4-羟基烷酰基辅酶A的酶的基因，以及编码使用2-羟基烷酰基辅酶A和4-羟基烷酰基辅酶A作为底物的PHA合酶的基因。在这种情况下，另一基因可以通过重组载体转化到细胞中或者通过遗传操作插入细胞的染色体中。
例如，微生物可以为通过以下获得的微生物：用编码使2-羟基链烷酸酯转变成2-羟基烷酰基辅酶A并使4-羟基链烷酸酯转变成4-羟基烷酰基辅酶A的酶的基因转化包含编码使用2-羟基烷酰基辅酶A和4-羟基烷酰基辅酶A作为底物的PHA合酶之基因的细胞。
在另一个实例中，微生物可以为通过以下获得的微生物：通过用编码使用2-羟基烷酰基辅酶A和4-羟基烷酰基辅酶A作为底物的PHA合酶的基因转化包含编码使2-羟基链烷酸酯转变成2-羟基烷酰基辅酶A并使4-羟基链烷酸酯转变成4-羟基烷酰基辅酶A的酶之基因的细胞。
通过遗传重组方法制备生产4-羟基丁酸酯-2-羟基丁酸酯共聚物的微生物的方法或者使用所述微生物生产4-羟基丁酸酯-2-羟基丁酸酯共聚物的方法可以包括以下步骤。
首先，将编码使2-羟基链烷酸酯转变成2-羟基烷酰基辅酶A并使4-羟基链烷酸酯转变成4-羟基烷酰基辅酶A的酶的基因以及编码使用2-羟基烷酰基辅酶A和4-羟基烷酰基辅酶A作为底物的PHA合酶的基因中的至少一个插入载体中以产生重组载体。可以将两个基因插入单独的载体中或者插入单个载体中。
术语“载体”是指包含可操作地连接以能够在个体细胞中表达编码期望蛋白质的基因插入物之必需调控元件的基因构建体，并且可以是向宿主细胞中引入编码期望蛋白质的核酸序列的手段。可以使用多种类型的载体，例如质粒、病毒载体、噬菌体载体、黏粒载体和YAC(酵母人工染色体)载体。重组载体包括克隆载体和表达载体。克隆载体是包含复制起点(例如，质粒、噬菌体或黏粒的复制起点)和连接的另一DNA片段的复制子，并且所连接的DNA片段可以被复制。表达载体已被开发用于合成蛋白质。
在本发明中，载体没有特别限制，只要其功能是在多种宿主细胞如原核细胞或真核细胞中表达并产生期望酶基因即可。然而，优选这样的载体：其允许引入载体中的基因转移和不可逆地融合至宿主细胞的基因组中，并且使基因表达在细胞中稳定地维持长时间段。
这样的载体包含允许基因在选择的宿主中表达的转录和翻译表达调控序列。表达调控序列可以包括用于进行转录的启动子、用于调控这种转录的任意操纵子序列、编码合适的mRNA核糖体结合位点的序列、和/或调控转录和翻译的终止的序列。例如，适于原核生物的调控序列可以包括启动子、任选的操纵子序列和/或核糖体结合位点。适于真核细胞的调控序列可以包括启动子、终止子和/或多腺苷酸化信号。起始密码子和终止密码子通常被认为是编码期望蛋白质的核酸序列的一部分，并且应当在施用基因构建体时在个体中起作用并且应当在编码序列的框内。载体的启动子可以是组成型或诱导型的。其还可以包含可复制表达载体的复制起点。此外，其可以适当地包含增强子、目的基因5’端和3’端的非翻译区、选择标记(例如，抗生素抗性标记)或可复制单元。载体可以进行自我复制或者可以整合到宿主基因组DNA中。
可用的表达调控序列的实例包括腺病毒的早期启动子和晚期启动子、猿猴病毒40(SV40)、鼠乳腺瘤病毒(MMTV)启动子、HIV的长末端重复序列(LTR)启动子、莫洛尼病毒、巨细胞病毒(CMV)启动子、EB病毒(EBV)启动子、劳氏肉瘤病毒(RSV)启动子、RNA聚合酶II启动子、β-肌动蛋白启动子、人血红蛋白启动子和人肌肉肌酸启动子、lac系统、trp系统、TAC或TRC系统、T3和T7启动子、噬菌体λ的主操纵子和启动子区、fd编码蛋白的调控区、磷酸甘油酸激酶(PGK)或其他糖酵解酶的启动子、磷酸酶启动子如Pho5、酵母α-交配系统的启动子、和已知调控原核或真核细胞或其病毒的基因表达的其他组成型或诱导型序列、及其组合。
为了提高转基因在细胞中的表达水平，期望基因与转录和翻译表达调控序列应当彼此可操作地连接。通常，“可操作地连接”意指连接的DNA序列是接触的，并且在分泌性前导序列的情况下是接触的并且存在于阅读框中。例如，如果前序列或分泌性前导序列的DNA表达为参与蛋白质分泌的前蛋白，则其可以是与多肽的DNA可操作地连接的；如果启动子或增强子影响序列的转录，则其可以是与编码序列可操作地连接的；如果核糖体结合位点影响序列的转录，则其可以是与编码序列可操作地连接的；或者如果核糖体结合位点被布置成促进翻译，则其可以是与编码序列可操作地连接的。这些序列的连接可以通过在方便的限制性位点连接来进行，并且在不存在这样的位点的情况下，连接可以根据常规方法使用合成寡核苷酸衔接子或接头来进行。
考虑到宿主细胞的性质、载体的拷贝数、控制拷贝数的能力和由载体编码的其他蛋白质(例如，抗生素标记的表达)，本领域技术人员可以选择适于本发明的多种载体、表达调控序列、宿主等。
然后，使用重组载体转化微生物。
术语“转化”意指将DNA引入宿主中并且使DNA作为染色体外因子或者通过染色体整合完成来复制。
可以用根据本发明的重组载体转化的微生物包括原核细胞和真核细胞二者，并且通常可以使用具有高的DNA引入效率和高的所引入DNA表达效率的宿主。具体实例包括但不限于已知的真核宿主细胞和原核宿主细胞，例如埃希氏菌(Escherichia)属，包括大肠杆菌(例如，大肠杆菌DH5a、大肠杆菌JM101、大肠杆菌K12、大肠杆菌W3110、大肠杆菌X1776、大肠杆菌B和大肠杆菌XL1-Blue)；假单胞菌(Pseudomonas)属；杆菌(Bacillus)属；链霉菌(Streptomyces)属；欧文式菌(Erwinia)属；沙雷氏菌(Serratia)属；普罗威登斯菌(Providencia)属；棒状杆菌(Corynebacterium)属；钩端螺旋体(Leptospira)属；沙门氏菌(Salmonella)属；短杆菌(Brevibacterium)属；Hypomonas属；色杆菌(Chromobacterium)属；诺卡氏菌(Nocardia)属；真菌；或者酵母。一旦转化到合适的宿主中，载体就可以独立于宿主基因组复制并且发挥作用，或者在一些情况下整合到基因组自身中。
出于本发明的目的，宿主细胞可以为具有由碳源生物合成羟基酰基辅酶A之途径的微生物。
转化方法包括但不限于使用本领域已知的合适的标准技术，例如电穿孔、电注射、显微注射、磷酸钙共沉淀、氯化钙/氯化铷法、逆转录病毒感染、DEAE-葡聚糖、阳离子脂质体法、聚乙二醇介导的摄取、基因枪等。此时，环状载体可以用合适的限制酶进行切割并以线性形式引入。
然后，培养上述转化的微生物以生产4-羟基丁酸酯-2-羟基丁酸酯共聚物。
可以在培养基中培养表达重组载体的转化体以生产和分离大量的4-羟基丁酸酯-2-羟基丁酸酯共聚物。培养基和培养条件可以根据转化细胞的种类适当地选择。在培养期间可以适当地调节条件例如温度、培养基pH和培养时间以适于细胞生长和共聚物的大规模生产。这样的培养方法的实例包括但不限于分批培养、连续培养和补料分批培养。
在一个实施方案中，培养可以在包含2-羟基丁酸酯和/或4-羟基丁酸酯的培养基中进行。此外，如果微生物能够由碳源(如葡萄糖)生物合成2-羟基丁酸酯和4-羟基丁酸酯，则可以在不添加2-羟基丁酸酯和/或4-羟基丁酸酯的情况下制备共聚物。
此外，培养基应当适当地满足特定菌株的需求。培养基可以包含多种碳源、氮源、磷和微量元素组分。培养基中的碳源包括：糖和碳水化合物，例如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、淀粉和纤维素；油和脂肪，例如大豆油、葵花油、蓖麻油和椰子油；脂肪酸，例如棕榈酸、硬脂酸和亚油酸；醇，例如甘油和乙醇；以及有机酸，例如乙酸，但不限于此。这些材料可以单独使用或作为混合物使用。培养基中的氮源的实例包括蛋白胨，酵母提取物，肉提取物，麦芽提取物，玉米浆，大豆粉和尿素，或者无机化合物如硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵，但不限于此。氮源也可以单独使用或作为混合物使用。培养基中的磷源的实例包括但不限于磷酸二氢钾或磷酸氢二钾、或者相应的含钠盐。此外，培养基可以包含生长所需的金属盐，例如硫酸镁或硫酸铁，或者可以包含但不限于必需生长物质，例如氨基酸和维生素。上述原料可以通过合适的方法以分批或连续的方式添加到培养物。
此外，如果需要，可以以合适的方式使用碱性化合物(例如，氢氧化钠、氢氧化钾或氨水)或酸性化合物(例如，磷酸或硫酸)以调节培养物的pH。此外，通过使用消泡剂诸如脂肪酸聚乙二醇酯可以抑制气泡形成。可以向培养物中注入氧气或含氧气体(例如，空气)以保持有氧条件，并且培养物的温度通常可以在20℃至45℃，优选25℃至40℃的范围内。可以继续培养直至获得期望共聚物的期望产量。
然后，回收所生产的4-羟基丁酸酯-2-羟基丁酸酯共聚物。
由重组微生物生产的4-羟基丁酸酯-2-羟基丁酸酯共聚物可以通过本领域公知的方法从细胞或培养基中分离。用于回收4-羟基丁酸酯-2-羟基丁酸酯共聚物的方法的实例包括但不限于离心法、超声破碎、过滤、离子交换色谱法、高效液相色谱法(HPLC)和气相色谱法(GC)。
具体实施方式
下文中，将通过实施例更详细地描述本发明。然而，以下实施例仅用于举例说明的目的，并且不旨在将本发明限于此。
实施例1.用于制备4-羟基丁酸酯-2-羟基丁酸酯共聚物的重组载体的制备
1-1.pPs619C1310-CPPCT540重组载体的制备
使用源自丙酸梭菌的丙酰辅酶A转移酶(CP-PCT)基因的突变体作为丙酰辅酶A转移酶基因(pct)，并且使用源自假单胞菌属MBEL 6-19(KCTC 11027BP)的PHA合酶基因的突变体作为PHA合酶基因。所使用的载体为pBluescript I(Stratagene Co.，USA)。
首先，提取假单胞菌属MBEL 6-19(KCTC 11027BP)的全部DNA以分离PHA合酶(phaC1Ps6-19)基因。基于phaC1Ps6-19基因序列(SEQ ID NO：3)，制备引物[5′-GAG AGA CAATCA AAT CAT GAG TAA CAA GAG TAA CG-3＇(SEQ ID NO：5)、5′-CAC TCA TGC AAG CGT CACCGT TCG TGC ACG TAC-3＇(SEQ ID NO：6)]。使用所提取的整个DNA作为模板来进行PCR。对获得的PCR产物进行电泳以确定对应于phaC1Ps6-19基因的大小为1.7kb的基因片段并获得phaC1Ps6-19基因。
为了表达phaC1Ps6-19合酶，用BamHI/EcoRI从pSYL105载体上消化包含源自罗尔斯通氏菌(Ralstonia eutropha)H16的PHB生产操纵子的DNA片段(Lee等，Biotech.Bioeng.，1994，44：1337-1347)，并将其插入pBluescript II(Stratagene Co.，USA)的BamHI/EcoRI识别位点中以制备pReCAB重组载体。在pReCAB载体中，PHA合酶(phaCRE)和单体供应酶(phaARE和phaBRE)通过PHB操纵子启动子不断地表达。为了制备在每端包含一个BstBI/SbfI识别位点的phaC1Ps6-19合酶基因片段，首先在没有氨基酸转变的情况下通过SDM(定点诱变)法除去内源性BstBI位点。然后，为了添加BstBI/SbfI识别位点，使用以下引物进行重叠PCR：[5′-atg ccc gga gcc ggt tcg aa-3＇(SEQ ID NO：7)、5＇-CGT TAC TCT TGT TAC TCATGA TTT GAT TGT CTC TC-3＇(SEQ ID NO：8)、5′-GAG AGA CAA TCA AAT CAT GAG TAA CAAGAG TAA CG-3＇(SEQ ID NO：9)、5-CAC TCA TGC AAG CGT CAC CGT TCG TGC ACG TAC 3＇(SEQ ID NO：10)、5′-GTA CGT GCA CGA ACG GTG ACG CTT GCA TGA GTG 3＇(SEQ ID NO：11)、5′-aac ggg agg gaa cct gca gg-3＇(SEQ ID NO：12)]。如下制备重组载体pPs619C1-ReAB：用BstBI/SbfI切割pReCAB载体以除去罗尔斯通氏菌H16PHA合酶(phaCRE)，然后将以上获得的phaC1Ps6-19基因插入BstBI/Sbfl识别位点中。
通过对氨基酸序列进行测序发现影响短链长度(SCL)活性的三个氨基酸位置。使用SDM法用以下引物制备包含phaC1Ps6-19300(其为包含E130D、S325T和Q481M的phaC1Ps6-19合酶突变体)的pPs619C1300-ReAB：[5＇CTG ACC TTG CTG GTG ACC GTG CTT GAT ACC ACC-3＇(SEQ ID NO：13)、5-GGT GGT ATC AAG CAC GGT CAC CAG CAA GGT CAG-3′(SEQ ID NO：14)、5＇CGA GCA GCG GGC ATA TC A TGA GCA TCC TGA ACC CGC-3＇(SEQ ID NO：15)、5＇GCGGGT TCA GGA TGC TCA TGA TAT GCC CGC TGC TCG-3＇(SEQ ID NO：16)、5′-atc aac ctcatg acc gat gcg atg gcg ccg acc-3＇(SEQ ID NO：17)、5＇-ggt cgg cgc cat cgc atcggt cat gag gtt gat-3＇(SEQ ID NO：18)]。
在此，为了构建其中共表达丙酰辅酶A转移酶的操纵子形式的组成型表达系统，使用源自丙酸梭菌的丙基辅酶A转移酶(CP-PCT)。使用通过使用丙酸梭菌的染色体DNA和引物[5′-GGAATTCATGAGAAAGGTTCCCATTATTACCGCAGATGA-3＇(SEQ ID NO：19)、5＇-gc tctaga ttagga ctt cat ttc ctt cag acc cat taa gcc ttc tg-3＇(SEQ ID NO：20)]的PCR获得的片段作为CP-PCT。此时，使用SDM法除去存在于野生型CP-PCT中的NdeI位点以易于克隆。此外，为了添加SbfI/NdeI识别位点，使用以下引物进行重叠PCR：[5′-agg cct gca ggc gga taacaa ttt cac aca gg-3＇(SEQ ID NO：21)、5′-gcc cat atg tct aga tta gga ctt catttc c-3′(SEQ ID NO：22)]。如下制备pPs619C1300-CPPCT载体：用SbfI/NdeI切割pPs619C1300-ReAB载体以除去源自罗尔斯通氏菌H16的单体供应酶(phaARE和phaBRE)，然后将经PCR克隆的CP-PCT基因插入SbfI/NdeI识别位点中。
然后，在添加Mn2+并且dNTP以不同浓度存在的条件下，使用以上制备的pPs619C1300-CPPCT作为模板以及引物[5′-CGCCGGCAGGCCTGCAGG-3＇(SEQ ID NO：23)、5＇-GGCAGGTCAGCCCATATGTC-3＇(SEQ ID NO：24)]，进行易错PCR，以向CP-PCT基因中引入随机突变。然后，在正常条件下使用以上引物进行PCR以扩增包含随机突变的PCR片段。用SbfI/NdeI消化pPs619C1300-CPPCT载体以除去野生型CP-PCT，然后制备其中将扩增的突变PCR片段插入SbfI/NdeI识别位点中的连接混合物，并将该混合物引入大肠杆菌JM109以获得105大小的CP-PCT文库。使制备的CP-PCT文库在聚合物检测培养基(LB琼脂、葡萄糖20g/L、3HB1g/L、尼罗红0.5μg/ml)中生长3天，然后进行筛选以确定聚合物生产，并且首先选择约80个候选物。将这些候选物在聚合物生产条件下进行液体培养(LB琼脂、葡萄糖20g/L、3HB 1g/L、氨苄青霉素100mg/L，37℃)4天，并且通过FACS(荧光激活细胞分选)分析来选择2个变体——CP-PCT变体512(包含核酸替换A1200G)和CP-PCT变体522(包含核酸替换T78C、T669C、A1125G和T1158C)。基于以上选择的初级突变体(CP-PCT变体512和CP-PCT变体522)，使用上述易错PCR法通过随机诱变获得多种CP-PCT变体。从其中二次选择CP-PCT变体540(包含Val193Ala以及沉默突变T78C、T669C、A1125G和T1158C)以制备pPs619C1300-CPPCT540载体。
此外，基于以上制备的phaC1Ps6-19合酶突变体(phaC1Ps6-19300)，使用引物[5＇-gaattc gtg ctg tcg agc cgc ggg cat atc-3＇(SEQ ID NO：25)、5＇-gat atg ccc gcg gctcga cag cac gaa ttc-3＇(SEQ ID NO：26)、5＇-ggg cat atc aag agc atc ctg aac ccgc-3＇(SEQ ID NO：27)、5＇g cgg gtt cag gat gct ctt gat atg ccc-3＇(SEQ ID NO：28)]，使用SDM法制备包含具有带有突变E130D、S477F和Q481K的氨基酸序列之源自假单胞菌属MBEL 6-19的PHA合酶变体(phaC1Ps6-19310)的pPs619C1310-CPPCT540载体(图1)。
1.2pPs619C1249.18H-CPPCT540重组载体的制备
使用引物[5′-ATGCCCGGAGCCGGTTCGAA-3＇(SEQ ID NO：29)和5′-GAAATTGTTATCCGCCTGCAGG-3＇(SEQ ID NO：30)]，并且使用以上1-1中制备的pPs619C1310-CPPCT540载体作为模板，进行易错PCR。在进行易错PCR之后，使用以上引物再次进行PCR以扩增包含突变的PCR片段，并且将扩增的突变体插入pPs619C1310-CPPCT540载体的BstBI/SbfI位点中以构建突变体的文库。将制备的突变体文库转化到大肠杆菌XL-1Blue中，并且将转化体在PHB检测培养基(LB琼脂、葡萄糖20g/L、尼罗红0.5μg/ml)中培养3天。在培养之后通过筛选最终选择的变体为具有氨基酸突变L18H、V24A、K91R、M128V、E130D、N246S、S325T、S477G、Q481K和A527S的pPs619C1249.18H。由此制备了pPs619C1249.18H-CPPCT540载体(图2)。
实施例2.具有ldhA基因敲除的大肠杆菌XL1-Blue变体的制备
为了基于大肠杆菌XL1-Blue(Stratagene，USA)生产不含乳酸的聚合物，将在大肠杆菌的代谢期间参与乳酸生产的D-乳酸脱氢酶(LdhA)从基因组DNA中敲除。使用公知的red重组法进行遗传缺失。合成用于使ldhA缺失的寡聚物以具有SEQ ID NO：31(5′-atcagcgtacccgtgatgctaacttctctctggaaggtctgaccggctttaattaaccctcactaaagggcg-3＇)和SEQ ID NO：32(5＇-atcagcgtacccgtgatgctaacttctctctggaaggtctgaccggctttaattaaccctcactaa agggcg-3＇)的序列。
实施例3.4-羟基丁酸酯-2-羟基丁酸酯共聚物的制备
使用电穿孔将实施例1中制备的重组载体转化到实施例2中制备的具有ldhA基因敲除的大肠杆菌XL1-BlueΔldhA中，从而获得重组大肠杆菌XL1-BlueΔldhA。进行培养瓶培养以使用该重组大肠杆菌制备上述三元共聚物。首先，对于种子培养，将重组大肠杆菌在包含100mg/L氨苄青霉素和20mg/L卡那霉素的3mL LB培养基[BactoTM Triptone(BD)10g/L、BactoTM酵母提取物(BD)5g/L、NaCL(amresco)10g/L]中培养12小时。对于主培养，将1ml种子培养物接种到补充有1g/L 4-羟基丁酸酯(4-HB)、1g/L 2-羟基丁酸酯(2-HB)、100mg/L氨苄青霉素、20mg/L卡那霉素和10mg/L硫胺的100ml MR培养基(葡萄糖10g、KH2PO46.67g、(NH4)2HPO44g、MgSO4·7H2O0.8g、柠檬酸0.8g和微量金属溶液5mL/1L；在此，微量金属溶液包含5MHCl 5mL、FeSO4·7H2O 10g、CaCl2 2g、ZnSO4·7H2O 2.2g、MnSO4·4H2O 0.5g、CuSO4·5H2O1g、(NH4)6Mo7O2·4H2O 0.1g和Na2B4O2·10H2O 0.02g/1L)中，并且在30℃下在以250rpm搅拌下培养3天。
将培养溶液在4℃下以4,000rpm离心10分钟从而回收细胞。回收的细胞用蒸馏水洗涤两次并在80℃下干燥12小时。在细胞定量之后，在100℃下在硫酸催化剂下使用氯仿作为溶剂使细胞与甲醇反应。在室温下向其中添加体积相当于氯仿一半的蒸馏水，并将混合物静置直至其分成两层。在这两层中，收集其中溶解有甲基化聚合物的单体的氯仿层，并且通过气相色谱法(GC)来分析聚合物的组分。使用苯甲酸酯作为内标物质。所使用的GC分析条件示于下表1中。
如表2和图3所示，GC分析的结果表明通过重组大肠杆菌生产出4-羟基丁酸酯-2-羟基丁酸酯共聚物。
[表1]
GC分析条件
项目 特性
型号 Hewlett Packard 6890N
检测器 火焰离子化检测器(FID)
柱 Alltech Capillary ATTM-WAX，30m，0.53mm
液相 100％聚乙二醇
注入口温度/检测口温度 250℃/250℃
载气 He
总流量 3ml/分钟
隔膜净化流量 1ml/分钟
柱头压力 29kPa
注入口模式 无分流
注入体积/溶剂 1μl/氯仿
初始温度/时间 80℃/5分钟
最终温度/时间 230℃/5分钟
温度坡度 7.5℃/分钟
表2
实施例4.根据4-羟基丁酸酯-2-羟基丁酸酯共聚物中各单体的摩尔比进行的物理 特件分析
在实施例3中描述的方法中，在用于生产4-羟基丁酸酯-2-羟基丁酸酯共聚物的培养期间，主培养基中4-羟基丁酸酯和2-羟基丁酸酯的浓度在0至3g/L之间变化。在培养之后，通过离心从培养溶液中仅回收细胞以进行聚合物纯化，并用蒸馏水洗涤两次，然后冷冻干燥。接着，基于聚合物浓度向冻干的细胞添加氯仿至约30g/L的浓度，并在室温下使用磁力搅拌器搅拌来提取聚合物24小时。然后，以2∶1∶1的比添加氯仿、蒸馏水和甲醇，并在室温下使所得混合物进行层分离。然后，使用分液漏斗分离底层的聚合物提取溶液。然后，使用滤纸分离和除去细胞残留物。接着，通过蒸发从过滤后的聚合物溶液中除去几乎所有的氯仿，然后添加甲醇以使聚合物沉淀。通过离心收集沉淀的聚合物，最后在干燥箱(75℃)中干燥。
通过实施例3中描述的GC分析确定聚合物中单体的摩尔比(表3)。在下表3中，聚合物含量(wt％)是相对于干细胞重量的PHA聚合物含量。
[表3]
作为一些样品的物理特性的分析结果，发现当2HB单体和4HB单体的摩尔比分别为30％或更大时，共聚物具有足以被用作生物黏合剂的黏附特性并且在室温下作为液体存在(图4)。
还进行了差示扫描量热法(DSC)分析以研究根据单体的摩尔比的聚合物的热特性。在DSC测量期间进行两次加热，并且在第二次加热时测量玻璃化转变温度(Tg)和熔解温度(Tm)。加热时的初始温度为-60℃，升温速率为10℃/分钟，最终温度为200℃。使用氮气作为DSC分析的载气。作为DSC分析的结果，2HB和4HB的均聚物观察到结晶，但2HB和4HB的共聚物没有观察到结晶，表明该共聚物是无定形共聚物。此外，在2HB和4HB的共聚物中没有观察到熔解温度(Tm)，并且确定随着2HB摩尔比提高，玻璃化转变温度(Tg)提高。

Claims (22)

1.在室温下以液相存在的聚羟基链烷酸酯(PHA)生物聚合物。
2.根据权利要求1所述的生物聚合物，其具有生物降解性或疏水性，或者同时具有生物降解性和疏水性二者。
3.根据权利要求1所述的生物聚合物，其中
所述生物聚合物包含4-羟基丁酸酯和2-羟基丁酸酯作为重复单元，以及
4-羟基丁酸酯和2-羟基丁酸酯以30％或更大的摩尔比分别包含在所述生物聚合物中。
4.根据权利要求1所述的生物聚合物，其中
所述生物聚合物包含4-羟基丁酸酯和2-羟基丁酸酯作为重复单元，以及
4-羟基丁酸酯和2-羟基丁酸酯以40％或更大的摩尔比分别包含在所述生物聚合物中，以及所述生物聚合物在室温下以液相存在。
5.根据权利要求1所述的生物聚合物，其中所述生物聚合物包含4-羟基丁酸酯和2-羟基丁酸酯作为重复单元，以及
4-羟基丁酸酯和2-羟基丁酸酯以1∶1的摩尔比包含在所述聚合物中，以及所述生物聚合物在室温下以液相存在。
6.具有生物降解性和疏水性二者的生物聚合物组合物，其包含根据权利要求1至5中任一项所述的生物聚合物。
7.根据权利要求6所述的组合物，其中所述组合物黏附至选自以下的基材：玻璃、金属、聚合物材料、水凝胶、木材、陶瓷、细胞、组织、器官和生物分子。
8.根据权利要求6所述的组合物，其中所述组合物用作组织黏合剂、组织缝合剂、黏连抑制剂、止血剂、组织工程用支持物、创伤敷料、药物递送载体、组织填料、环境友好涂料、环境友好油彩、脱发遮瑕剂添加剂或化妆品添加剂。
9.用于制备包含4-羟基丁酸酯和2-羟基丁酸酯作为重复单元的共聚物的方法，其包括：
培养微生物，所述微生物具有减弱或缺陷的乳酸脱氢酶活性，并且包含编码使2-羟基链烷酸酯转变成2-羟基烷酰基辅酶A并使4-羟基链烷酸酯转变成4-羟基烷酰基辅酶A的酶的基因以及编码使用2-羟基烷酰基辅酶A和4-羟基烷酰基辅酶A作为底物的聚羟基链烷酸酯合酶的基因。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述微生物通过用以下基因转化微生物来获得：编码使2-羟基链烷酸酯转变成2-羟基烷酰基辅酶A并使4-羟基链烷酸酯转变成4-羟基烷酰基辅酶A的酶的基因，以及编码使用2-羟基烷酰基辅酶A和4-羟基烷酰基辅酶A作为底物的PHA合酶的基因。
11.根据权利要求9所述的方法，其中所述使2-羟基链烷酸酯转变成2-羟基烷酰基辅酶A并使4-羟基链烷酸酯转变成4-羟基烷酰基辅酶A的酶是丙酰辅酶A转移酶。
12.根据权利要求9所述的方法，其中所述编码使2-羟基链烷酸酯转变成2-羟基烷酰基辅酶A并使4-羟基链烷酸酯转变成4-羟基烷酰基辅酶A的酶的基因由选自以下的核苷酸序列组成：
(a)SEQ ID NO：1的核苷酸序列；
(b)包含A1200G突变的SEQ ID NO：1的核苷酸序列；
(c)包含T78C、T669C、A1125G和T1158C突变的SEQ ID NO：1的核苷酸序列；
(d)包含A1200G突变和以下突变的SEQ ID NO：1的核苷酸序列：导致对应于SEQ ID NO：1的氨基酸序列中的Gly335Asp突变；
(e)包含A1200G突变和以下突变的SEQ ID NO：1的核苷酸序列：导致对应于SEQ ID NO：1的氨基酸序列中的Ala243Thr突变；
(f)包含T669C、A1125G和T1158C突变以及以下突变的SEQ ID NO：1的核苷酸序列：导致对应于SEQ ID NO：1的氨基酸序列中的Asp65Gly突变；
(g)包含A1200G突变和以下突变的SEQ ID NO：1的核苷酸序列：导致对应于SEQ ID NO：1的氨基酸序列中的Asp257Asn突变；
(h)包含T669C、A1125G和T1158C突变以及以下突变的SEQ ID NO：1的核苷酸序列：导致对应于SEQ ID NO：1的氨基酸序列中的Asp65Asn突变；
(i)包含T669C、A1125G和T1158C突变以及以下突变的SEQ ID NO：1的核苷酸序列：导致对应于SEQ ID NO：1的氨基酸序列中的Thrl99Ile突变；以及
(j)包含T78C、T669C、A1125G和T1158C突变以及以下突变的SEQ ID NO：1的核苷酸序列：导致对应于SEQ ID NO：1的氨基酸序列中的Val93Ala突变。
13.根据权利要求9所述的方法，其中所述聚羟基链烷酸酯合酶是源自假单胞菌属(Pseudomonas sp.)6-19的聚羟基链烷酸酯合酶。
14.根据权利要求9所述的方法，其中所述编码聚羟基链烷酸酯合酶的基因由对应于以下氨基酸序列的核苷酸序列组成：
SEQ ID NO：4的氨基酸序列；或者
包含选自L18H、V24A、K91R、M128V、E130D、N246S、S325T、S477R、S477H、S477F、S477Y、S477G、Q481M、Q481K、Q481R和A527S中至少一个突变的SEQ ID NO：4的氨基酸序列。
15.根据权利要求9所述的方法，其中所述编码聚羟基链烷酸酯合酶的基因由对应于包含选自以下突变的SEQ ID NO：4的氨基酸序列的核苷酸序列组成：
(i)S325T和Q481M；
(ii)E130D、S325T和Q481M；
(iii)E130D、S325T、S477R和Q481M；
(iv)E130D、S477F和Q481K；以及
(v)L18H、V24A、K91R、M128V、E130D、N246S、S325T、S477G、Q481K和A527S。
16.根据权利要求9所述的方法，其中所述培养在包含2-羟基丁酸酯和4-羟基丁酸酯的培养基中进行。
17.生产包含2-羟基丁酸酯和4-羟基丁酸酯作为重复单元的共聚物的微生物，其中所述微生物具有减弱或缺陷的乳酸脱氢酶活性，并且包含编码使2-羟基链烷酸酯转变成2-羟基烷酰基辅酶A并使4-羟基链烷酸酯转变成4-羟基烷酰基辅酶A的酶的基因以及编码使用2-羟基烷酰基辅酶A和4-羟基烷酰基辅酶A作为底物的PHA合酶的基因。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述使2-羟基链烷酸酯转变成2-羟基烷酰基辅酶A并使4-羟基链烷酸酯转变成4-羟基烷酰基辅酶A的酶是丙酰辅酶A转移酶。
19.根据权利要求17所述的方法，其中所述编码使2-羟基链烷酸酯转变成2-羟基烷酰基辅酶A、并使4-羟基链烷酸酯转变成4-羟基烷酰基辅酶A的酶的基因由选自以下的核苷酸序列组成：
(a)SEQ ID NO：1的核苷酸序列；
(b)包含A1200G突变的SEQ ID NO：1的核苷酸序列；
(c)包含T78C、T669C、A1125G和T1158C突变的SEQ ID NO：1的核苷酸序列；
(d)包含A1200G突变和以下突变的SEQ ID NO：1的核苷酸序列：导致对应于SEQ ID NO：1的氨基酸序列中的Gly335Asp突变；
(e)包含A1200G突变和以下突变的SEQ ID NO：1的核苷酸序列：导致对应于SEQ ID NO：1的氨基酸序列中的Ala243Thr突变；
(f)包含T669C、A1125G和T1158C突变以及以下突变的SEQ ID NO：1的核苷酸序列：导致对应于SEQ ID NO：1的氨基酸序列中的Asp65Gly突变；
(g)包含A1200G突变和以下突变的SEQ ID NO：1的核苷酸序列：导致对应于SEQ ID NO：1的氨基酸序列中的Asp257Asn突变；
(h)包含T669C、A1125G和T1158C突变以及以下突变的SEQ ID NO：1的核苷酸序列：导致对应于SEQ ID NO：1的氨基酸序列中的Asp65Asn突变；
(i)包含T669C、A1125G和T1158C突变以及以下突变的SEQ ID NO：1的核苷酸序列：导致对应于SEQ ID NO：1的氨基酸序列中的Thr199Ile突变；以及
(j)包含T78C、T669C、A1125G和T1158C突变以及以下突变的SEQ ID NO：1的核苷酸序列：导致对应于SEQ ID NO：1的氨基酸序列中的Val93Ala突变。
20.根据权利要求17所述的微生物，其中所述聚羟基链烷酸酯合酶是源自假单胞菌属6-19的聚羟基链烷酸酯合酶。
21.根据权利要求17所述的微生物，其中所述编码聚羟基链烷酸酯合酶的基因由对应于以下氨基酸序列的核苷酸序列组成：
SEQ ID NO：4的氨基酸序列；或者
包含选自L18H、V24A、K91R、M128V、E130D、N246S、S325T、S477R、S477H、S477F、S477Y、S477G、Q481M、Q481K、Q481R和A527S中至少一个突变的SEQ ID NO：4的氨基酸序列。
22.根据权利要求17所述的微生物，其中所述编码聚羟基链烷酸酯合酶的基因由对应于包含选自以下突变的SEQ ID NO：4的氨基酸序列的核苷酸序列组成：
(i)S325T和Q481M；
(ii)E130D、S325T和Q481M；
(iii)E130D、S325T、S477R和Q481M；
(iv)E130D、S477F和Q481K；以及
(v)L18H、V24A、K91R、M128V、E130D、N246S、S325T、S477G、Q481K和A527S。
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