PT1163019E - Dispositivos médicos e aplicações de polímeros de poli-hidroxialcanoato - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "Dispositivos médicos e aplicações de polímeros de poli- hidroxialcanoato"

Campo do invento 0 presente invento refere-se em geral a implantes médicos compreendendo biopolimeros de poli-hidroxialcanoato ("PHA") e a utilizações médicas e a métodos para preparação dos mesmos.

Antecedentes do invento

Na área médica, têm sido desenvolvidos vários polímeros degradáveis que se quebram in vivo nos seus monómeros respectivos em semanas ou nalguns meses. Apesar da disponibilidade destes polímeros degradáveis sintéticos, existe ainda uma necessidade de desenvolver polímeros degradáveis que possam alargar ainda mais a gama de propriedades disponíveis, particularmente propriedades mecânicas.

Os poli-hidroxialcanoatos são poliésteres termoplásticos naturais e podem ser processados por técnicas tradicionais de processamento de polímeros para utilização numa enorme variedade de aplicações, incluindo embalagens de consumo, forros de fraldas descartáveis e sacos para lixo, produtos alimentares e produtos médicos. Os esforços iniciais concentraram-se em aplicações de moldagem, em particular para artigos de embalagens de consumo tais como garrafas, recipientes para cosméticos, canetas e tees para golfe. As Patentes U.S. N.os 4826493 e 4880592 descrevem a fabricação de películas de poli-(R)-3-hidroxibutirato ("PHB") e de poli-(R)-3-hidroxibutirato-co-(R)-3-hidroxivalerato ("PHBV") e a sua utilização como folha exterior de fraldas. A Patente U.S. N.° 5292860 descreve a fabricação do copolímero de PHA poli(3-hidroxibutirato-co-3-hidroxihexanoato) e a utilização destes polímeros para fabricação de película para folha exterior de fraldas e doutros artigos descartáveis. Materiais para a folha exterior de fraldas e outros materiais para fabricação de artigos de higiene pessoal, biodegradáveis ou susceptíveis de compostagem, a partir de outros copolímeros de PHB que não PHBV, são descritos em PCT WO 95/20614, 2 ΕΡ 1 163 019/ΡΤ WO 95/20621, WO 95/23250, WO 95/20615, WO 95/33874, WO 96/08535, e nas Patentes U.S. N.os 5502116; 5536564; e 5489470 .

Uma das propriedades mais úteis de PHA que facilmente os distingue de polímeros obtidos por via petroquímica é a sua biodegradabilidade. Produzidos naturalmente por bactérias do solo, os PHA são degradados por exposição subsequente a estas mesmas bactérias em solo, composto ou sedimento marinho. A biodegradação de PHA está dependente de um certo número de factores, tais como a actividade microbiana do ambiente e a área superficial do item. Temperatura, pH, peso molecular e cristalinidade são também factores importantes. A biodegradação inicia-se quando os microrganismos começam a crescer sobre a superfície do plástico e segregam enzimas que quebram o polímero em unidades monoméricas de hidroxiácido, que são depois assimiladas pelos microrganismos e utilizadas como fontes de carbono para crescimento. Em ambientes aeróbios, os polímeros são degradados em dióxido de carbono e água, enquanto que em ambientes anaeróbios os produtos de degradação são dióxido de carbono e metano (Williams & Peoples, CHEMTECH, 26_: 38-44 (1996)). Embora se considere amplamente que o mecanismo para degradação de PHA no ambiente ocorre via ataque enzimático e possa ser relativamente rápido, entende-se geralmente que o mecanismo de degradação in vivo envolve um simples ataque hidrolítico às ligações éster dos polímeros, que pode ser ou não mediado por proteína. Ao contrário de polímeros compreendendo 2-hidroxi-ácidos, tais como poli(ácido glicólico) e poli(ácido láctico), os poli-hidroxialcanoatos são normalmente constituídos por 3-hidroxiácidos e, em certos casos, por 4-, 5- e 6-hidroxi-ácidos. Elementos de ligação éster derivados destes hidroxiácidos são geralmente menos susceptíveis a hidrólise do que elementos de ligação éster derivados de 2-hidroxi-ácidos.

Investigadores têm desenvolvido processos para a produção de uma grande variedade de PHA, e cerca de 100 monómeros diferentes têm sido incorporados em polímeros sob condições de fermentação controladas (Steinbuchel & Valentin, FEMS Microbiol. Lett., 128: 219-28 (1995)). Actualmente, existem apenas duas composições de PHA disponíveis comercialmente: PHB e PHBV. Por causa da sua grande diversidade em termos de composição, podem ser produzidos PHA 3 ΕΡ 1 163 019/ΡΤ com uma gama de propriedades físicas (Williams & Peoples, CHEMTECH, 26: 38-44 (1996)). Os PHA disponíveis comercialmente, PHB e PHBV, representam apenas uma pequena parte dos conjuntos de propriedades disponíveis nos PHA. Por exemplo, a extensão de degradação de PHB e PHBV está na gama de cerca de 4 a 42%, enquanto que a mesma propriedade para poli-4-hidroxibutirato ("P4HB") é de cerca de 1000% (Saito & Doi, Int. J. Biol. Macromol. 1_6: 99-104 (1994)). De modo similar, os valores de módulo de Young e de resistência à tracção para PHB e PHBV são 3,5 a 0,5 GPa e 40 a 16 MPa, respectivamente (para um teor em HV crescente até 25% molar), em comparação com 149 MPa e 104 MPa, respectivamente para P4HB (Saito & Doi, Int. J. Biol. Macromol. 16_: 99-104 (1994)) . PHB e PHBV têm sido extensivamente estudados para utilização em aplicações biomédicas, para além da sua utilização comercial como um substituto biodegradável para matérias-primas de resinas sintéticas. Estes estudos vão desde utilizações potenciais em libertação controlada (ver, e.g.f Koosha, et al., Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 6_: 117-30 (1989) e Pouton & Akhtar, Adv. Drug Delivery Rev., 18: 133-62 (1996)), até à utilização na formulação de comprimidos, suturas cirúrgicas, coberturas para feridas para feridas, pós lubrificantes, vasos sanguíneos, armações para tecido, implantes cirúrgicos para juntar partes tubulares do corpo, placas de fixação de fracturas ósseas, e outras utilizações ortopédicas, como descrito em PCT WO 98/51812. Coberturas para feridas fabricadas de PHB são reveladas em GB 2166354 A de Webb, et al.. Um desenvolvimento médico recente é a utilização de PHB e PHBV para preparação de uma folha flexível porosa, bioabsorvível, para separação de tecido e estimulação da regeneração de tecido em tecido mole lesionado, descrita em EP 75446 7 Al de Bowald et al. e em EP 349505 A2. Relatos têm também descrito a utilização de PHBV para retardar o crescimento celular (Rivard, et al., J. Appl. Biomat., 65-68 (1995)).

Para além da biocompatibilidade, é frequentemente desejado que um dispositivo médico implantado se deva degradar após a sua função principal ter sido conseguida. PHB e PHBV, os únicos PHA testados como implantes médicos até à data, têm mostrado períodos de degradação in vivo muito longos, superiores a um ano para PHB (Duvernoy, et al. 4

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Thorac. Cardiovasc. Surgeon _43: 271-74 (1995); Malm, et al., J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 104: 600-07 (1992)). Para muitas aplicações, este tempo de degradação muito longo é indesejável uma vez que a persistência de um polímero num local de cicatrização de ferida pode conduzir a uma resposta inflamatória crónica no paciente. Foi constatado que pensos de PHB de degradação lenta, utilizados para regenerar tecido arterial, induzem uma resposta de macrófago a longo prazo (superior a dois anos) (Malm, et ai., Eur. Surg. Res. 26: 298-308 (1994)). Foram identificados macrófagos envolvidos na degradação dos implantes de PHB e esta resposta de macrófago a longo prazo parece indicar a presença de material particulado, de degradação lenta, persistente, com origem no implante. Ainda que um penso de PHB utilizado para reparar o pericárdio não tenha sido observado ao microscópio óptico vulgar 12 meses após implantação, por microscopia de luz polarizada observou-se material particulado residual de pequena dimensão (Malm, et al., Scand. J. Thor. Cardiovasc. Surg. 26_: 9-14 (1992)). Não é claro se este material particulado permanece ou não localizado no local de implante ou se migra através do corpo, causando possivelmente complicações não previstas. O destino biológico, ou impacto médico, deste material particulado não pode ser previsto sem um estudo de longo prazo. De modo a minimizar problemas potenciais associados aos PHA de degradação lenta, é vantajoso utilizar materiais absorvíveis com velocidades de degradação in vivo mais rápidas.

Existe apenas um relato descrevendo a biocompatibilidade ou a degradação in vivo de um qualquer outro polímero de PHA em aplicações biomédicas (PCT WO 98/51812). A Patente U.S. N.0 5334698 de Witholt et al. revela artigos médicos fabricados com um poliéster opticamente activo isolado a partir de células de Pseudomonas oleovorans; contudo, não são apresentados quaisquer exemplos ou discussão sobre a fabricação ou ensaios de biocompatibilidade, e não são fornecidos quaisquer métodos para obter o polímero numa forma adequadamente pura para utilização médica in vivo. Uma vez que as bactérias adequadas para produção destes polímeros podem também produzir uma endotoxina, bem como outros mediadores inflamatórios, é importante que o polímero seja processado para remover estes contaminantes.

Para muitas aplicações, a velocidade de degradação de 5

ΕΡ 1 163 019/PT ΡΗΑ está bem adaptada ao tempo de vida requerido para o produto. Contudo, em certos casos, seria desejável ser possivel exercer mais controlo sobre velocidade à qual os polímeros de decompõem no ambiente. Este controlo alargaria a gama de aplicações para esta classe de polímeros. Por exemplo, uma pelicula de PHA pode ter propriedades mecânicas adequadas para ser utilizada como uma pelicula de cobertura, mas ainda assim não ter velocidade de degradação óptima para a aplicação. A capacidade de ser possível controlar a velocidade de degradação do polímero no ambiente seria assim uma vantagem nitida. A Patente U.S. N.° 5935506 revela um extensor de PHB. A construção do extensor, referido como de bioabsorção rápida, contém uma grande quantidade de plastificante. Porém, a abordagem de PHB plastificado não consegue funcionar, uma vez que se verificou uma estenose do extensor superior a 90% às quatro semanas (ver Behrend, American J. Cardiol. pp. 45, TCT Abstracts (Outubro de 1998); Unverdorben, et al., American J. Cardiol. pp. 46, TCT Abstracts (Outubro de 1998)). Seria vantajoso um extensor bioabsorvível com propriedades mecânicas melhoradas e sem plastificante.

Assim, embora os poli-hidroxialcanoatos ofereçam uma vasta gama de propriedades mecânicas que são potencialmente úteis em aplicações médicas, a sua utilização particularmente in vivo como polímeros absorvíveis tem sido limitada pela sua hidrólise lenta. Seria assim desejável desenvolver métodos para controlo das velocidades de degradação de poli-hidroxialcanoatos .

Em PCT WO 98/51812 revelam-se métodos de preparação de uma ampla variedade de materiais de poliéster biocompativeis, biodegradáveis, conhecidos como poli-hidroxialcanoatos. Estes materiais são preparados com pureza elevada, e são adequados para utilização em aplicações médicas in vivo.

Deste modo, é um objectivo deste invento proporcionar novos dispositivos e utilizações para composições compreendendo ou derivadas de poli-hidroxialcanoatos que se degradam mais rapidamente no ambiente e/ou in vivo. É outro objectivo deste invento proporcionar métodos para fabricação dos artigos e dispositivos a partir destas composições. 6 ΕΡ 1 163 019/ΡΤ

Sumário do invento

De acordo com o presente invento, é proporcionado um implante médico biocompativel para a ligação, fixação, suporte, reparação ou reforço de tecido mole, o implante compreendendo uma composição de homopolimero de poli (4-hidroxibutirato), onde a composição de homopolimero de poli(4-hidroxi-butirato) compreende opcionalmente aditivos que alteram a estabilidade química do polímero, onde o homopolimero de poli(4-hidroxibutirato) tem um peso molecular ponderai médio na gama entre 10000 a 10000000 Dalton, onde o implante é seleccionado entre o grupo consistindo de agrafos de sutura; dispositivos para reparação de menisco; rebites; tachas; parafusos de interferência; redes cirúrgicas para implantes de tecido mole para reforço de tecido mole, para a união de defeitos fasciais, para um penso de traqueia ou doutro órgão, para recuperação de órgãos, para material de enxerto durai, para cobertura de feridas ou queimaduras, ou para um tamponamento hemostático; bandas; cavilhas ortopédicas; barreiras de aderência; extensores cardiovasculares, de gastrenterologia ou uretéricos; dispositivos para reparação de cartilagem articular; guias para nervo; dispositivos para reparação de tendão; dispositivos para reparação de defeitos do septo atrial; pensos cardiovasculares para enxerto de penso vascular, penso intracardíaco ou para oclusão por penso após endarterectomia; e pensos de reparação para a reparação de defeitos na parede torácica e abdominal, hérnias inguinais, paracolostomicas, ventrais, paraumbilicais, escrotais ou femorais, para reforço de retalho de músculo, para reforço de linhas de agrafos e incisões longas, para reconstrução da zona pélvica, para reparação de prolapso rectal ou vaginal, para almofadas de sutura e agrafos, para reparação urinária ou da bexiga, ou para compressas. É também proporcionado um método de preparação de um implante médico biocompativel para a ligação, fixação, suporte, reparação ou reforço de tecido mole, o implante compreendendo uma composição de homopolimero de poli(4-hidroxibutirato), onde a composição de homopolimero de poli(4-hidroxibutirato) compreende opcionalmente aditivos que alteram a 7 ΕΡ 1 163 019/ΡΤ estabilidade química do polímero, onde o homopolímero de poli(4-hidroxibutirato) tem um peso molecular ponderai médio na gama entre 10000 a 10000000 Dalton, compreendendo proporcionar uma composição de homopolímero de poli(4-hidroxibutirato), onde a composição de homopolímero de poli(4-hidroxibutirato) compreende opcionalmente aditivos que alteram a estabilidade química do polímero, onde o homopolímero de poli(4-hidroxibutirato) tem um peso molecular ponderai médio na gama entre 10000 a 10000000 Dalton; e formar ou incorporar a composição de homopolímero de poli(4-hidroxibutirato) num implante seleccionado entre o grupo consistindo de agrafos de sutura; dispositivos para reparação de menisco; rebites; tachas; parafusos de interferência; redes cirúrgicas para implantes de tecido mole para reforço de tecido mole, para a união de defeitos fasciais, para um penso de traqueia ou doutro órgão, para recuperação de órgãos, para material de enxerto durai, para cobertura de feridas ou queimaduras, ou para um tamponamento hemostático; bandas; cavilhas ortopédicas; dispositivos para reparação de cartilagem articular; guias para nervo; dispositivos para reparação de tendão; dispositivos para reparação de defeitos do septo atrial; pensos cardiovasculares para enxerto de penso vascular, penso intracardíaco ou para oclusão por penso após endarterectomia; e pensos de reparação para a reparação de defeitos na parede torácica e abdominal, hérnias inguinais, paracolostomicas, ventrais, paraumbilicais, escrotais ou femorais, para reforço de retalho de músculo, para reforço de linhas de agrafos e incisões longas, para reconstrução da zona pélvica, para reparação de prolapso rectal ou vaginal, para almofadas de sutura e agrafos, para reparação urinária ou da bexiga, ou para compressas.

Podem-se manipular as velocidades de degradação de polímeros através da adição de vários componentes a composições poliméricas, bem como por selecção de composição química, peso molecular, condições de processamento e forma do produto polimérico final. Pode-se alterar a composição química através de selecção de monómeros que podem ser incorporados no polímero, por alteração de elementos de ligação, esqueleto químico ou grupos pendentes, e/ou por 8 ΕΡ 1 163 019/ΡΤ manipulação de peso molecular. A composição de poli-hidroxialcanoato no implante do presente invento pode conter aditivos para alterar a velocidade de degradação. Podem-se aumentar porosidade, substâncias hidrófilas incluídas e/ou área superficial exposta a água, que aumentarão todas a velocidade de degradação. Revestimentos hidrófobos ou incorporação ou mistura com substância hidrófobas com os polímeros diminuirão a velocidade de degradação.

Implantes preferidos incluem agrafos de sutura, dispositivos para reparação de menisco, rebites, tachas, parafusos de interferência, rede cirúrgica para as utilizações acima descritas, pensos de reparação para as utilizações acima descritas, bandas, pensos cardiovasculares para as utilizações acima descritas, cavilhas ortopédicas (incluindo material de adição para enchimento ósseo), barreiras de aderência, os extensores acima descritos, dispositivos para reparação de cartilagem articular, guias para nervo, dispositivos para reparação de tendão e dispositivos para reparação de defeitos do septo atrial.

Podem-se utilizar composições de poli-hidroxialcanoato em aplicações médicas tanto novas como existentes, incluindo entrega de droga e libertação controlada de drogas e doutros materiais bioactivos. Podem-se também utilizar composições de poli-hidroxialcanoato para preparar ou formar revestimentos sobre uma ampla variedade de dispositivos, incluindo extensores, cateteres e sensores. As suas vantagens em aplicações novas e existentes podem ser a utilização de um material substituto biodegradável na aplicação, ou a adição de alguma outra característica ou atributo desejáveis associados à aplicação ou utilização, tal como uma propriedade mecânica ou superficial, propriedade física ou química, técnica de esterilização, biocompatibilidade, mecanismo de degradação, preferência de embalagem, e/ou uma questão de estabilidade.

Como demonstrado pelos exemplos, composições de poli-hidroxialcanoato compreendendo poli(4HB) têm propriedades mecânicas extremamente favoráveis, bem como são biocompatíveis e degradam-se dentro de intervalos de tempo desejáveis sob condições fisiológicas. Estes materiais de poli-hidroxialcanoato proporcionam uma gama mais larga de velocidades de degradação de poli-hidroxialcanoato do que as actualmente disponíveis. 9 ΕΡ 1 163 019/ΡΤ São também descritos métodos para processamento destes materiais em dispositivos que podem ser implantados ou injectados.

Breve descrição dos desenhos A Figura 1 é um esquema de biopolimeros de PHA divididos genericamente em grupos de acordo com o comprimento dos seus grupos pendentes e seus percursos biossintéticos respectivos. A Figura 2a é um esquema dos percursos pelos quais se obtêm PHA de grupos pendentes curtos. A Figura 2b é um esquema dos percursos pelos quais se obtêm PHA de grupos pendentes longos. A Figura 3 é um gráfico da degradação de P4HB in vivo ao longo do tempo (semanas).

Descrição detalhada do invento

Foram desenvolvidos implantes médicos compreendendo uma composição de poli-hidroxialcanoato biocompativel conforme definida na reivindicação 1 apensa. I. Definições

Um "polímero bioerodível" é um polímero insolúvel em água que é convertido sob condições fisiológicas em materiais solúveis em água independentemente do mecanismo específico envolvido no processo de erosão. "Bioerosão" inclui tanto processos físicos (tais como dissolução) como processos químicos (tais como clivagem do esqueleto). 0 prefixo "bio" indica que a erosão ocorre sob condições fisiológicas, em oposição a outros processos de erosão causados, por exemplo, por temperatura elevada, bases ou ácidos fortes, luz UV ou condições climatéricas. Os termos "bio-ressorção" e "bioabsorção" são utilizados intermutavelmente e implicam frequentemente que o polímero ou os seus produtos de degradação são removidos por actividade celular (e.g., fagocitose) num ambiente biológico.

Como aqui utilizado por referência a polímeros, o termo "degradar" refere-se à clivagem da cadeia de polímero, tal que o peso molecular permanece aproximadamente constante ao 10 ΕΡ 1 163 019/ΡΤ nível de oligómeros e subsistem partículas de polímero após degradação. O termo "degradar completamente" refere-se à clivagem do polímero ao nível molecular tal que existe uma perda de massa essencialmente completa. O termo "degradar" conforme aqui utilizado inclui "degradar completamente" a não ser que indicado o contrário.

Biocompatível refere-se a materiais que não induzem uma resposta imunológica tóxica ou severa após implantação ou ingestão. II. Composições de poli-hidroxialcanoato ("PHA") (1) Composições de polímero "Materiais de PHA" contêm uma ou mais unidades, por exemplo entre 10 e 100000, e preferivelmente entre 100 e 30000 unidades da fórmula I seguinte: -OCRV (CR3R4) nCO-; onde n é um inteiro, por exemplo entre 1 e 15, e numa concretização preferida, entre 1 e 4; e onde R1, R2, R3 e R4 independentemente podem ser radicais hidrocarboneto incluindo radicais hidrocarboneto de cadeia longa; radicais substituídos com halo e com hidroxi; radicais hidroxi; radicais halogéneo; radicais substituídos com azoto; radicais substituídos com oxigénio; e/ou átomos de hidrogénio. A fórmula -(CR3R4)n- inclui as fórmulas seguintes: —CR3R4- (onde n = 1); -CR3R4CR3,R4’- (onde n=2); e -CR3R4CR3'R4'CR3"R4"- (onde n=3); onde R3, R4, R3<, R4<, R3” e R4” podem ser

independentemente radicais hidrocarboneto incluindo radicais hidrocarboneto de cadeia longa; radicais substituídos com halo e com hidroxi; radicais hidroxi; radicais halogéneo; radicais substituídos com azoto; radicais substituídos com oxigénio; e/ou átomos de hidrogénio. Assim, a fórmula I inclui unidades derivadas de 3-hidroxiácidos (n=l), 4- hidroxiácidos (n=2) e 5-hidroxiácidos (n=3). 11 ΕΡ 1 163 019/ΡΤ

Estas unidades podem ser a mesma num homopolímero, ou podem ser mais unidades diferentes, tal como por exemplo num copolimero ou terpolimero. Os polímeros têm tipicamente um peso molecular acima de 300, por exemplo entre 300 e 107, ou, tal como para os homopolímeros de poli(4-hidroxibutirato) utilizados no presente invento, 10000 a 10000000 Dalton.

Materiais de PHA podem conter ou ser modificados para incluírem outras moléculas, tais como compostos bioactivos e detectáveis, agentes tensioactivos, outros polímeros degradáveis ou não degradáveis, bem como materiais utilizados para modificar as propriedades mecânicas de PHA tais como plastificantes, cargas, agentes de nucleação, corantes, estabilizantes, modificadores e ligantes. PHA representativos são descritos em Steinbuchel & Valentin, FEMS Microbiol. Lett., 128: 219-28 (1995). PHB e P4HB possuem propriedades físicas muito diferentes. Vários copolímeros de PHA contendo 4-hidroxibutirato ou são conhecidos ou podem ser preparados com uma gama de propriedades intermédias entre as de PHB e de P4HB (Saito & Doi, Int. J. Biol. Macromol. 16_: 99-104 (1994)). Contudo, não têm sido relatadas aplicações biomédicas, ensaios de biocompatibilidade e degradação in vivo de P4HB e dos seus copolímeros. Copolímeros PHA de 4HB e 3HB, com uma composição variando de 0 a 100% de 4HB, foram produzidos em Alcaligenes eutrophus (Nakamura, et al. Macromol. 25: 4237-31 (1992)) e de 64 a 100% de 4HB em Comamonas acidovorans (Saito & Doi, Int. J. Biol. Macromol. 16: 99-104 (1994)). No entanto, estes polímeros tinham uma massa molecular modesta (lxlO5 a 5xl05 g/mol, por GPC) em comparação com a massa molecular produzida em E. coli recombinante (superior a 5xl05 g/mol, GPC).

Biopolímeros de PHA podem ser genericamente divididos em três grupos, de acordo com o comprimento dos seus grupos pendentes e seus percursos biossintéticos respectivos (Figura 1) . Aqueles com grupos pendentes curtos, tais como poli-hidroxibutirato (PHB), um homopolímero de unidades ácido R-3-hidroxibutírico (R-3HB), são materiais termoplásticos altamente cristalinos, e são conhecidos desde há muito (Lemoigne & Roukhelman, Annales des fermentaiions, _5: 527-36 (1925)). Um segundo grupo de PHA, contendo as unidades R-3HB 12 ΕΡ 1 163 019/ΡΤ curtas polimerizadas aleatoriamente com unidades de hidroxiácido de grupo pendente muito mais longo, foi primeiro relatado no inicio dos anos setenta (Wallen & Rohwedder, Environ. Sei. Technol., 8: 576-79 (1974)). São também conhecidos vários microrganismos que produzem especificamente copolimeros de R-3HB com estas unidades de hidroxiácido de grupo pendente mais longo e que pertencem a este segundo grupo (Steinbchel & Wiese, Appl. Microbiol. Biotechnol., 37: 691-97 (1992)). No inicio dos anos oitenta, um grupo de investigação nos Países Baixos identificou um terceiro grupo de PHA, que continha hidroxiácidos de grupo pendente predominantemente mais longo (De Smet, et al., J. Bacteriol., 154: 870-78 (1983)).

Polímeros de PHA podem constituir até 90% do peso seco de células de bactérias, e são encontrados como grânulos discretos no interior de células bacterianas. Estes grânulos de PHA acumulam-se em resposta a uma limitação de nutrientes e servem como materiais de reserva de carbono e de energia. São utilizados percursos distintos pelos microrganismos para produzir cada grupo destes polímeros. Um destes percursos, que conduz aos poli-hidroxialcanoatos de grupo pendente curto (SPGPHA) envolve três enzimas, nomeadamente tiolase, redutase e PHB-sintase (por vezes denominada polimerase). Utilizando este percurso, o homopolímero de PHB é sintetizado por condensação de duas moléculas de acetil-Coenzima A para dar acetoacetil-Coenzima A, seguindo-se redução deste intermediário em R-3-hidroxibutiril-Coenzima A, e polimerização subsequente (Figura 2a) . A última enzima neste percurso, a sintase, tem uma especificidade de substrato que pode acomodar unidades monoméricas C3-C5, incluindo unidades R-4-hidroxiácido e R-5-hidroxiácido. Este percurso biossintético é encontrado, por exemplo, nas bactérias Zoogloea ramigera e Alcaligenes eutrophus. O percurso biossintético, que é utilizado para produzir o terceiro grupo de PHA, os poli-hidroxialcanoatos de grupo pendente longo (LPGPHA), é ainda parcialmente desconhecido; contudo, pensa-se actualmente que as unidades de hidroxiacilo monomérico que conduzem aos LPGPHA são obtidas pela β-oxidação de ácidos gordos e pelo percurso dos ácidos gordos (Figura 2b) . Os substratos de R-3-hidroxiacilo-Coenzima resultantes destas vias são depois polimerizados por PHA-sintases (por vezes denominadas polimerases) que têm especificidades de substrato favorecendo as unidades monoméricas maiores na gama de C6- 13 ΕΡ 1 163 019/ΡΤ C14. ΡΗΑ de grupo pendente longo são produzidos, por exemplo, por Pseudomonads.

Presumivelmente, o segundo grupo de PHA contendo tanto unidades R-3HB curtas como monómeros de grupo pendente mais longo utilizam ambos os percursos que se mostram nas Figuras 2a e 2b para proporcionar os monómeros de hidroxiácido. Estes últimos são depois polimerizados por PHA-sintases capazes de aceitar estas unidades.

Ao todo, cerca de 100 tipos diferentes de hidroxiácidos têm sido incorporados em PHA por métodos de fermentação (Steinbuchel & Valentin, FEMS Microbiol. Lett., 128: 219-28 (1995)). Particularmente, estes incluem PHA contendo grupos pendentes funcionalizados tais como ésteres, ligações duplas, grupos alcoxi, aromáticos, halogéneos e hidroxi.

Um poli-hidroxialcanoato preferido para aplicações médicas é o poli-4-hidroxibutirato (P4HB). Ο P4HB é biocompatível, absorvível, processável, resistente e dúctil. A manutenção da resistência à ruptura é outro parâmetro muito importante para materiais de sutura e agrafamento, especialmente os absorvíveis. À medida que os materiais absorvíveis se degradam in vivo, as suas propriedades fisicas e mecânicas alteram-se como resultado desta degradação. Por exemplo, uma sutura absorvível perderá a maior parte da sua resistência à ruptura, e como tal a sua capacidade para fixar o tecido, mais rapidamente do que o tempo para a sua completa ressorção. Suturas de poli(ácido glicólico) (PGA), por exemplo, perderão a maior parte da sua resistência em três semanas in vivo {Vet. Surg. 2_1; 192: 355-61), mas não serão completamente absorvidas antes das seis semanas. Esta perda de resistência mecânica é o resultado da diminuição de massa molecular do polímero. É importante notar que vários parâmetros afectarão as velocidades de ressorção e a carga de ruptura da sutura in vivo, tal como o tipo de tecido, tensões mecânicas e a presença de infecção.

Os exemplos demonstram que a velocidade de degradação de P4HB in vivo é rápida em relação a outros PHA, contudo, a sua velocidade de ressorção é mais lenta do que a de muitos materiais utilizados como suturas absorvíveis. Além disso, como se mostra na Tabela 7, os implantes de P4HB mantêm a sua massa molecular durante o processo de ressorção. É de esperar 14 ΕΡ 1 163 019/ΡΤ que esta manutenção de massa molecular seja um benefício para a manutenção de propriedades mecânicas, e como tal da resistência à ruptura de PHA utilizados como materiais de fecho de feridas. Por causa das suas propriedades mecânicas excelentes, manutenção de massa molecular elevada, características de processamento, biocompatibilidade e características de ressorção, P4HB e P4HB-co-HA são úteis numa variedade de dispositivos médicos, incluindo, por exemplo, materiais de fecho de feridas absorvíveis tais como materiais de suturação e agrafamento.

(2) Fontes de PHA

Materiais de PHA, que podem ser modificados para alterar as suas velocidades de degradação, podem ser obtidos a partir de uma fonte biológica, uma fonte enzimática ou uma fonte química. A fonte biológica pode ser um microrganismo ou um organismo superior tal como uma planta, e pode ser modificada por engenharia genética.

Em meados dos anos oitenta, vários grupos de investigação estavam activamente a identificar e isolar os genes e produto génicos responsáveis pela síntese de PHA. Estes esforços conduziram ao desenvolvimento de sistemas transgénicos para produção de PHA tanto em microrganismos como em plantas, bem como a métodos enzimáticos para síntese de PHA. Estas vias conseguiram aumentar adicionalmente os tipos de PHA disponíveis. Estes avanços foram revistos em Williams & Peoples, CHEMTECH, 26: 38-44 (1996) e Williams & Peoples, Chem. Br. 33_: 29-32 (1997) . Métodos que podem ser utilizados para produzir polímeros de PHA adequados para modificação subsequente para alterar as suas velocidades de degradação são descritos, por exemplo, na Patente U.S. N.° 4910145 de Holmes, et ai.; Byrom, "Miscellaneous Biomaterials" em Biomaterials (Byrom, Ed.), págs. 333-59 (MacMillan Publishers, London 1991); Hocking & Marchessault, "Biopolyesthers" em Chemistry and Technology of Biodegradable Polymers (Griffin, Ed.), pp. 48-96 (Chapman and Hall, London 1994); Holmes, "Biologically Produced (R)—3— hydroxyalkanoate Polymers and Co-polymers" em Developments In Crystalline Polymers (Bassett Ed.), vol. 2, pp. 1-65 (Elsevier, London 1988); Lafferty et ai., "Microbial Production of Poly-b-hydroxybutyric acid" em Biotechnology 15 ΕΡ 1 163 019/ΡΤ (Rehm & Reed, Eds.) vol. 66, pp. 135-76 (Verlagsgesellschaft, Weinheim 1988); Millier & Seebach, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 32: 477-502 (1993); Steinbuchel, "Polyhydroxyalkanoic Acids" em Biomaterials (Byrom, Ed.), pp. 123-213 (MacMillan Publishers, London 1991); Williams & Peoples, CHEMTECH, 26: 38-44, (1996); Steinbuchel & Wiese, Appl. Microbiol. Biotechnol., 3_7: 691-697 (1992); Patentes U.S. N.os 5245023; 5250430; 5480794; 5512669; e 5534432; Agostini, et ai., Polym. Sei., Part A-l, 9_: 2775-87 (1971); Gross, et ai., Macromolecules, 21: 2657-68 (1988); Dubois, et ai., Macromolecules, 26_: 4407-12 (1993); Le Borgne & Spassky, Polymer, 30_: 2312-19 (1989); Tanahashi & Doi, Macromolecules, 24: 5732-33 (1991); Hori, et ai., Macromolecules, 26_: 4388-90 (1993); Kemnitzer, et ai., Macromolecules, 26_: 1221-29(1993); Hori, et ai., Macromolecules, 26_: 5533-34 (1993); Hocking, et ai., Polym. Buli., 3_0: 163-70 (1993); Xie, et ai., Macromolecules, 3£: 6997-98 (1997); Patente U.S. N.° 5563239 de Hubbs; Patentes U.S. N.os 5489470 e 5520116 de Noda, et ai. Os PHA obtidos a partir destes métodos podem estar em qualquer forma, incluindo uma forma de látex ou sólida. A identificação, clonagem e expressão dos genes envolvidos na biossintese de PHA a partir de vários microrganismos em organismos recombinantes permitem a produção de PHA em organismos que não são produtores nativos de PHA. Um exemplo preferido é o E. coli que é um hospedeiro bem reconhecido para produção de biofármacos e de PHA para aplicações médicas. Estes organismos recombinantes proporcionam aos investigadores um maior grau de controlo do processo de produção de PHA porque estão isentos de actividades enzimáticas residuais para a biossintese de precursores de PHA indesejados ou para degradação do PHA. Adicionalmente, a selecção apropriada de um organismo recombinante pode facilitar a purificação, ou permitir a biocompatibilidade aumentada, do PHA produzido.

Os requisitos mínimos para a síntese de PHA num organismo recombinante são uma fonte de hidroxialcanol-CoA e de uma PHA-sintase apropriada (Gerngross & Martin, Proc. Natl. Acad. Sei. _92_: 6279-83 (1995). Os produtores de PHA recombinantes requerem assim um percurso biossintético para um monómero hidroxialcanol-CoA e uma PHA-sintase adequada. A produção de um homopolimero requer que o organismo produza apenas um substrato adequado para a PHA sintase, uma vez que 16 ΕΡ 1 163 019/ΡΤ a produção de múltiplos substratos resulta na formação de um co-polímero de PHA. Organismos recombinantes contendo um transgene codificando uma PHA-sintase são suficientes para produção de P4HB.

Na ausência de percursos de degradação de PHA, a massa molecular do PHA acumulado em organismos recombinantes pode ser muito elevada. Foi noticiado que PHB produzido em E. coli recombinante tem uma massa molecular de 4xl06 g/mol (Sim, et al., Nature Biotech. 15_: 63-67 (1997)). A massa molecular é importante para controlar as propriedades fisicas de um dado PHA, porque a massa molecular aumentada de PHA produzidos em organismos recombinantes pode conduzir a propriedades de material melhoradas, tais como uma resistência à tracção e um alongamento na ruptura melhorados (Kusaka, et al., J. M. S. Pure Appl. Chem. A35: 319-35 (1998)). A biossíntese de P3HB-CO-4HB contendo um baixo nivel de 4HB (1,5%) foi descrita em E. coli recombinante (Valentin, et al., J. Biotech. 5_8: 33-38 (1997)). É digno de nota que as massas moleculares destes PHA eram muito elevadas (superiores a lxlO6 g/mol). Adicionalmente, foram descritas as biossinteses do P3HB-co-4HB e do homopolimero de P4HB em E. coli recombinante (Hein, et al., FEMS Microbiol. Lett., 153: 411-18 (1997)) .

Para além da utilização de vias biológicas para síntese de PHA, também se podem obter polímeros de PHA por síntese química. Uma abordagem amplamente utilizada envolve a polimerização de abertura de anel de monómeros de β-lactona utilizando vários catalisadores ou iniciadores tais como aluminoxanos, diestanoxanos ou compostos de alcoxi-zinco e alcoxi-alumínio (ver Agostini, et al., Polym. Sei., Part A-l, 9_: 2775-87 (1971); Gross, et al., Macromolecules, 2\_: 2657-68 (1988); Dubois, et al., Macromolecules, 26_: 4407-12 (1993); Le Borgne & Spassky, Polymer, 3£: 2312-19 (1989); Tanahashi & Doi, Macromolecules, 2A_: 5732-33 (1991); Hori, et al., Macromolecules, 26_: 4388-90 (1993); Kemnitzer, et al., Macromolecules, 26_: 1221-29 (1993); Hori, et al., Macromolecules, 26_: 5533-34 (1993); Hocking & Marchessault, Polym. Buli. 3_0: 163-70 (1993). Uma segunda abordagem envolve polimerização de condensação de ésteres e é descrita na Patente U.S. N.° 5563239 de Hubbs, et al.. Investigadores têm também desenvolvido métodos quimoenzimáticos para preparar 17 ΕΡ 1 163 019/ΡΤ ΡΗΑ. Por exemplo, Xie et al., Macromolecules, 3_0: 6997-98 (1997) revelam uma polimerização de abertura de anel de beta-butirolactona por lipases termófilas para produzir PHB. A produção biológica de P4HB ou P4HB-co-HA tem certas vantagens em relação aos métodos de síntese química tradicionais. A síntese química de P4HB de massa molecular elevada (superior a lxlO5 g/mol) é difícil devido à tendência do ácido livre para lactonizar para formar o anel de cinco membros relativamente sem tensões e cineticamente favorecido. Assim, a policondensação de ácido 4-hidroxibutírico é difícil de conseguir, enquanto que o material que resulta de reacções de polimerização de abertura de anel a alta pressão de γ-butirolactona é de massa molecular muito baixa (Korte & Gelt, Polymer Lett., _4: 685 (1966)) e teria propriedades mecânicas pobres. Uma estratégia de síntese alternativa para P4HB, a polimerização de abertura de anel de radical livre de 2-metilenodioxolano, resulta num co-polímero contendo unidades de anel aberto e não aberto (Bailey, et al. J. Polym. Sei. Polym. Chem. 20_: 3021-30 (1982); Bailey, J. Polym. Preprints 25: 210-11 (1984)). Ο 4HB tem sido copolimerizado com sucesso com 3HB por polimerização de abertura de anel (Hori, et al., Polymer 36_: 4703-05 (1996)). Contudo, o peso molecular dos copolímeros era modesto (inferior a lxlO5 g/mol), especialmente para composições com mais do que 80% de 4HB (inferior a 2xl04 g/mol). Adicionalmente, muitos dos catalisadores utilizados para a síntese química de poliésteres contêm metais tóxicos. Estes contaminantes tóxicos podem ser evitados utilizando um processo biológico para produzir PHA. (3) Formulações de PHA com velocidades de degradação alteradas a. Aditivos de alteraçao de velocidades de degradação A hidrólise de poli-hidroxialcanoatos é acelerada a pH ácido ou básico e assim a inclusão de aditivos ou excipientes ácidos ou básicos pode ser utilizada para modular a velocidade de degradação de PHA. Os excipientes podem ser adicionados como particulados, podem ser misturados com qualquer outro aditivo ou agente incorporado ou a ser incorporado, ou podem ser dissolvidos no polímero. Aditivos que melhoram a velocidade de degradação incluem ácidos 18

ΕΡ 1 163 019/PT inorgânicos tais como sulfato de amónio e cloreto de amónio, ácidos orgânicos tais como ácido cítrico, ácidos benzóicos, péptidos, ácido ascórbico, bases inorgânicas tais como carbonato de sódio, carbonato de potássio, carbonato de cálcio, carbonato de zinco e hidróxido de zinco, e bases orgânicas tais como sulfato de protamina, espermina, colina, etanolamina, dietanolamina e trietanolamina, e tensioactivos tais como TWEEN™ e PLURONIC™. Estes aditivos podem ser utilizados em concentrações entre 0,1 e 30% em peso. A velocidade de degradação pode também ser melhorada por aditivos que formam poros ou que de outro modo aumentam a área superficial no polímero ou que aumentam o teor amorfo do polímero. Os agentes formadores de poros são geralmente adicionados como particulados e incluem compostos solúveis em água tais como sais inorgânicos e açúcares que são removidos por lixiviação. Partículas adequadas incluem cristais de sais, proteínas tais como gelatina e agarose, amidos, polissacáridos tais como alginato e outros polímeros. Os diâmetros das partículas podem estar adequadamente entre os nanómetros e 500 mícron. Podem também ser liofilizáveis. Podem-se incluir agentes formadores de poros numa quantidade entre 0,01% e 90% em peso para volume, tal como um nível entre um e trinta por cento (p/p, polímero), para aumentar a formação de poros. Por exemplo, em secagem por pulverização ou evaporação de solvente, um agente formador de poros tal como um sal volátil, por exemplo, bicarbonato de amónio, acetato de amónio, cloreto de amónio ou benzoato de amónio ou outro sal liofilizável, é primeiro dissolvido em água. A solução contendo o agente formador de poros é depois emulsionada com a solução de polímero para criar gotículas do agente formador de poros no polímero. Esta emulsão é depois seca por pulverização ou submetida a um processo de evaporação/extracção de solvente. Após o polímero estar precipitado, as micropartículas endurecidas são congeladas e liofilizadas para remover os agentes formadores de poros. Podem-se adicionar plastificantes, tais como os ésteres de citrato, e outros polímeros tais como poli-hidroxialcanoatos atácticos, para aumentar o carácter amorfo do polímero.

Revestimentos ou materiais hidrófobos que podem ser incorporados para aumentar as velocidades de degradação incluem compostos hidrófobos tais como fosfolípidos, colesterol e outros polímeros, bem como tensioactivos. Estes 19 ΕΡ 1 163 019/ΡΤ materiais e métodos para formação de revestimentos ou incorporação nos materiais são descritos em WO 96/18420 pela Bracco Research SA, WO 92/18164 pela Delta Biotechnology, Ltd., WO 95/03356 pelo Massachusetts Institute of Technology, PCT/US97/03007 pela Acusphere, Patente U.S. N.° 5271961 de Mathiowitz, et al., Patente U.S. N.° 5711933 de Bichon, et al. e Patente U.S. N.° 5705187 de Unger. Exemplos específicos revelam ácidos gordos e fosfolípidos como emulsionantes para estabilizar a fase oleosa na fase aquosa durante o processo de emulsão/encapsulação, com o resultado de as microsferas ficarem revestidas com uma camada exterior do tensioactivo. É também revelada a utilização de aditivos tais como gorduras, ceras e hidrocarbonetos de peso molecular elevado para tornar hidrófobas as paredes do polímero e retardar a penetração de água.

b. Modificação de grupos pendentes de PHA

Um método alternativo para alterar a velocidade de degradação de polímeros de PHA envolve a modificação dos grupos pendentes de poli-hidroxialcanoato. Os grupos pendentes podem ser modificados em todo ou em parte. Por exemplo, podem-se converter grupos pendentes em grupos ácidos e básicos, tais como ácidos carboxílicos e aminas. Estes tipos de grupos podem melhorar a degradação alterando os valores de pH local. Alternativamente, os grupos pendentes podem ser convertidos em grupos reactivos, tais como álcoois e aminas, que podem clivar o esqueleto de polímero por uma reacção quer intramolecular quer intermolecular. Para além destas conversões, os grupos pendentes podem também ser convertidos em grupos hidrófilos para aumentar a absorção de agentes hidrolíticos tais como água, ou podem ser convertidos em grupos que aumentarão a natureza amorfa dos polímeros. Os procedimentos requeridos para realizar a conversão de grupo funcional dos grupos pendentes são bem conhecidos dos peritos na especialidade. Um método adequado que pode ser utilizado para preparar um PHA, incorporando uma unidade que altera a velocidade de degradação do polímero, é revelado em WO 98/39453 por Hein, et al. Grupos pendentes adequados em polímeros de PHA que alterarão a velocidade de degradação podem também ser obtidos directamente por fermentação. 20

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c. Modificação química de PHA A velocidade de hidrólise de um poli-hidroxialcanoato depende de um certo número de factores. Um factor chave é a natureza quimica ou reactividade dos elementos de ligação éster entre os monómeros. A velocidade de degradação do esqueleto de PHA pode ser assim alterada incorporando no esqueleto de polímero elementos de ligação químicos que são mais susceptíveis de hidrólise, ou ataque enzimático. Exemplos de monómeros que podem ser incorporados em esqueletos de poli-hidroxialcanoato para alterar a velocidade de degradação do polímero são os 2-hidroxiácidos, tais como ácido glicólico e ácido láctico, e outros hidroxiácidos que modulam a reactividade do elemento de ligação éster, tais como ácido 2-hidroxietoxiacético. Para além da incorporação doutros hidroxiácidos que proporcionam ésteres que são mais susceptíveis a ataque hidrolítico ou enzimático, podem-se incorporar outros tipos de funcionalidades no esqueleto de polímero. Por exemplo, um ou mais dos elementos de ligação éster podem ser substituídos por grupos tais como amida, anidrido, carbonato ou carbamato. Exemplos de monómeros que podem ser incorporados no esqueleto de poli-hidroxialcanoato são aminoácidos e aminoálcoois. Para além disso, podem-se incorporar monómeros multifuncionais nos esqueletos de poli-hidroxialcanoato, por exemplo, trióis ou tetraóis. Estes tipos de unidades monoméricas podem também ser utilizados para aumentar ou manter o peso molecular do polímero por reticulação intercadeias, ou para modificar a cristalinidade dos polímeros.

Pode-se utilizar uma variedade de métodos para incorporar elementos de ligação químicos susceptíveis nos esqueletos de poli-hidroxialcanoato. Por exemplo, podem-se adicionar co-alimentações durante a fermentação de PHA que resultam na incorporação de monómeros desejados. Co-alimentações adequadas incluem ácidos hidroxialcoxiacéticos. Estes tipos de monómeros podem também ser incorporados durante a síntese química a partir de monómeros de hidroxiácido utilizando catalisadores, e via derivados de Coenzima A utilizando catalisadores enzimáticos tais como as PHA-sintases.

Podem-se também incorporar elementos de ligação químicos susceptíveis em esqueletos de poli-hidroxialcanoato após a 21 ΕΡ 1 163 019/ΡΤ sua síntese inicial. Métodos para conseguir isto incluem transformações químicas tais como reacções de inserção, irradiação, esterificação, trans-esterificação (ver, e.g., Otera, et al., Tetrahedron Lett., 2J_: 2383-86 (1986); Otera J. et al., Org. Chem., 56_: 530 11 (1991), Otera, et al., J. Org. Chem., 5_4: 4013-14 (1989); e Otera, et al., J. Chem.

Soc. Chem. Commun. 1742-43 (1991)), reacções de metátese de éster (ver, e.g., Stanton & Gagne, J. Am. Chem. Soc., 119: 5075-76 (1997)), e mistura reactiva. No último caso, podem ser realizadas reacções químicas na massa fundida com a presença de um catalisador. Por exemplo, ésteres ou poliésteres podem ser fundidos com poli-hidroxialcanoatos na presença de catalisadores adequados de modo a modificar quimicamente o poli-hidroxialcanoato. d. Processamento de PHA incluindo elementos de ligação susceptlveis

Podem-se manipular adicionalmente poli-hidroxialcanoatos utilizando uma ampla variedade de técnicas de processamento de polímeros. Métodos para processamento destes materiais incluem vazamento a partir solvente, processamento da massa fundida, processamento/fiação/tecelagem, extrusão, injecção e moldagem por compressão, e laminagem. III, Dispositivos e métodos para a sua fabricação

As composições de poli(4-hidroxibutirato) são úteis para preparar uma variedade de dispositivos médicos (implantes) biodegradáveis e/ou bioabsorvíveis, ou revestimentos sobre estes. As composições de polímeros biodegradáveis exibem preferivelmente uma biodegradação relativamente lenta, por exemplo, possuindo uma meia-vida in vivo entre três e seis meses ou menos. O polímero tem preferivelmente um ponto de fusão/temperatura de transição vítrea relativamente baixo, por exemplo, inferior a 136°C, e/ou é solúvel num solvente não tóxico, não halogenado, para facilidade de processamento.

Descrevem-se a seguir aplicações e dispositivos representativos. Materiais do estado da especialidade nestes dispositivos e aplicações podem ser substituídos totalmente ou parcialmente pelas composições de poli(4-hidroxibutirato) biocompativeis aqui descritas para proporcionar as especificações de dispositivo, tais como velocidade de degradação e propriedades mecânicas. 22 ΕΡ 1 163 019/ΡΤ (1) Dispositivos de agrafo de sutura

Estes dispositivos são tipicamente utilizados para prender de novo tecido ao osso. Muitas vezes os procedimentos envolvem a ligação de tendão, de ligamento ou doutro tecido mole a ossos no ombro, joelho, cotovelo, pulso, mão e anca. Numa abordagem, ancoragens de osso são inseridas no osso e depois tecido mole, tal como ligamento ou tendão, pode ser suturado ao ponto de ancoragem. 0 procedimento pode ser realizado de um modo aberto ou preferivelmente utilizando uma técnica minimamente invasiva através da qual o dispositivo é colocado por um dispositivo de entrega adequado. Exemplos de dispositivos de agrafo de sutura correntemente utilizados, que são representativos do estado da especialidade, incluem a Bionx Biodegradable Anchor (Bionx Implants, Bluebell, PA),

i TM

BioROC EZ Suture Bone Fastener (Innovasive Devices, Marlborough, MA), Resorbable Soft Tissue Attachment Device (Zimmer, Warsaw, IN) e as Acufex TAG Bioabsorbable Anchors (Smith & Nephew Endoscopy, Mansfield, MA) . Dispositivos de agrafo de sutura de poli-hidroxialcanoato podem ser fabricados de acordo com os métodos e procedimentos descritos nas Patentes U.S. N.os 5814071; 5797963; 5735875; 5725529; 5649963; 5643321; 5593425; 5423821; 5269809; 5268001; 5163960; e 5041129. (2) Dispositivos para reparação de menisco

Existem vários dispositivos para a reparação de lesões de menisco. Num procedimento, estes dispositivos de fixação ortopédicos são utilizados para a fixação segura de lesões de menisco longitudinais verticais (lesões "bucket-handle") localizadas na área vascularizada do menisco em combinação com imobilização adequada. Os dispositivos são frequentemente utilizados em cirurgia minimamente invasiva. Exemplos de dispositivos de reparação actualmente em utilização, que são representativos do estado da especialidade, incluem o BIOFIX™ Meniscus Arrow (Bioscience, Inc., Malvern, PA), T-Fix Suture Bar (Acufex Microsurgical, Inc.), e o Meniscal Dart (Innovasive Devices, Marlborough, MA) . Dispositivos de poli-hidroxialcanoato para reparação de menisco podem ser fabricados de acordo com os métodos e procedimentos descritos por de Goot, Biomaterials, _18:613-22 (1997), e nas Patentes U.S. N.os 5855619; 5853746; 5725556; 5645589; 5059206; 5035713; 4976715; 4924865; 4895148; e 4884572. 23 ΕΡ 1 163 019/ΡΤ (3) Rebites e tachas

Podem-se utilizar rebites e tachas na religação de tecido mole. Utilizações particulares incluem a religação de tecido mole no ombro, incluindo reparações de instabilidade no ombro (procedimentos de Bankart), reparação de lesão SLAP, reparações de separação acromio-clavicular, reparações de rotador de pulso, reconstruções de deslocamento capsular ou capsulolabral, tenodese de bíceps, e reparação de deltoide. Um exemplo de dispositivo de rebite do estado da especialidade é o LactoSorb Pop Rivet (Biomet, Inc., Warsaw, IN). Dispositivos de rebite e tachas de poli-hidroxialcanoato podem ser fabricados de acordo com os métodos e procedimentos descritos por Speer, et al., Clin. Orthop. 291: 67-74 (1993), e Patentes U.S. N.os 5840078; 4895148; 5868747; 5843084; 5840078; 5827298; 5807292; 5785713; 5730744. (4) Parafusos de interferência

Podem-se utilizar parafusos de interferência biodegradáveis na fixação de tecido mole. Estes parafusos podem ser utilizados, por exemplo, para fixar enxertos de tecido mole ao osso durante cirurgias de reconstrução de ligamentos cruzados do joelho. Exemplos de parafusos do estado da especialidade incluem o parafuso RCI (Smith & Nephew, Carlsbad, CA) e o parafuso Arthrex BIO-INTERFERENCE (Arthrex, Naples, FL). Parafusos de poli-hidroxialcanoato podem ser fabricados de acordo com os métodos e procedimentos descritos nas Patentes U.S. N.os 5275601; 5584836; 5364400; 5348026; 5876455; 5632748; 5496326; 5718706; 5690222; 5383878; 5425733; 5417692; 4927421; 5211647; 5116337; e 4927421. (5) Rede cirúrgica

Pode-se utilizar rede cirúrgica biodegradável em cirurgia geral. Por exemplo, utilizam-se redes cirúrgicas no tratamento de hérnias onde o tecido conjuntivo foi rompido ou como um material de banda para suportar o reposicionamento e suporte do colo da bexiga para incontinência urinária feminina. No presente invento, estas redes (tampões) são utilizadas como implantes de tecido mole para reforço de tecido mole, por exemplo, na reparação de aponeuroses abdominais e da parede abdominal, de defeitos fasciais e 24 ΕΡ 1 163 019/ΡΤ capsulares, e de tendões patelares e de aquiles, e na substituição de tendões infraspinatus e de ligamentos cruciformes cranianos. Outras utilizações destas redes no presente invento incluem a união de defeitos fasciais, como um penso para a traqueia ou para outros órgãos, recuperação de órgãos, bandas (incluindo uma banda intestinal), material de enxerto durai, cobertura de feridas ou queimaduras, e como um tamponamento hemostático. Exemplos de redes do estado da especialidade incluem a Brennen Biosynthetic Surgical Mesh Matrix (Brennan Medicai, St. Paul, MN), Pensos GORE-TEX™ (Gore, Flagstaff, AZ), e a SEPRAMESH™ (Genzyme Corporation, MA) . Redes cirúrgicas de poli-hidroxialcanoato podem ser fabricadas de acordo com os métodos e procedimentos descritos por Bupta, "Medicai textile structures: an overview" Medicai Plastics and Biomaterials, pp. 16-30 (Jan./Fev. 1998) e pelos métodos descritos nas Patentes U.S. N.os 5843084; 5836961; 5817123; 5747390; 5736372; 5679723; 5626611; 5578046; 5397332; 5393594; 5368602; 5252701; 4838884; 4655221; 4633873; 4441496; 4052988; 3875937; 3797499; e 3739773. (6) Penso de reparação

Podem-se utilizar pensos de reparação biodegradáveis em cirurgia geral. No presente invento, estes pensos são utilizados para a reparação de defeitos na parede torácica e abdominal, hérnias inguinais, paracolostomicas, ventrais, paraumbilicais, escrotais, femorais e outras hérnias, para reforço de retalho de músculo, para reforço de linhas de agrafos e incisões longas, para reconstrução da zona pélvica, para reparação de prolapso rectal e vaginal, para almofadas de sutura e agrafos, para reparação urinária e da bexiga, ou para compressas. Exemplos de pensos do estado da arte incluem o produto TISSUEGUARD™ (Bio-Vascular Inc., St. Paul, MN). Patches de reparação de poli-hidroxialcanoato podem ser fabricados de acordo com os métodos e procedimentos descritos nas Patentes U.S. N.os 5858505; 5795584; 5614284; 5702409; 5690675; 5433996; 5326355; 4052988; 3875937. (7) Bandas

Podem-se utilizar bandas biodegradáveis como implantes para reforçar tecido mole onde existem fraquezas. Exemplos destes procedimentos incluem suporte pubouretral e suporte da bexiga, reparação de prolapso uretral e vaginal, reconstrução 25 ΕΡ 1 163 019/ΡΤ da zona pélvica, e sacro-colposuspensão. O dispositivo pode ser utilizado para tratar incontinência urinária feminina resultante de hipermobilidade uretral ou de deficiência intrínseca do esfíncter. Exemplos de dispositivos do estado da especialidade incluem o Mentor SUSPEND Slmg (Mentor

Corporation, Minneapolis, MN). Dispositivos de banda de poli-hidroxialcanoato podem ser fabricados de acordo com os métodos e procedimentos descritos nas Patentes U.S. N.os 5700479; 5860425; 5836315; 5836314; 5813408; 5690655; 5611515; 4217890. (8) Penso cardiovascular

No presente invento, utilizam-se pensos cardiovasculares biodegradáveis para enxerto de penso vascular, (acrescento da artéria pulmonar), para penso intracardíaco, e para oclusão por penso após endarterectomia. Exemplos de materiais de penso similares do estado da arte (não degradáveis) incluem pensos e tecidos Sulzer Vascutek FLUOROPASSIC™ (Sulzer Carbomedics Inc., Austin, TX) . Pensos cardiovasculares de poli-hidroxialcanoato podem ser fabricados de acordo com os métodos e procedimentos descritos nas Patentes U.S. N.os 5716395; 5100422; 5104400; e 5700287; e por Malm, et ai.,

Eur. Surg. Res., 2_6_:298—308 (1994). (9) Cavilhas ortopédicas

No presente invento, utilizam-se cavilhas biodegradáveis para fixação de tecido mole. Estes dispositivos têm sido utilizados, por exemplo, para estabilizar fracturas de pulso, pé, anca, mão, cotovelo, ombro e joelho. Exemplos de dispositivos do estado da especialidade incluem o RESOR-PIN™ Resorbable Membrane Pin (Geistlich-Pharma, Washington, DC). Cavilhas ortopédicas de poli-hidroxialcanoato podem ser fabricadas por técnicas de processamento convencionais tais como técnicas de processamento de massa fundida como injecção e moldagem por compressão, formação de fibras, bem como técnicas baseadas em solvente. (10) Barreiras de aderência

Utilizam-se barreiras de aderência biodegradáveis em cirurgia geral para prevenir aderências indesejáveis, particularmente após cirurgia. Exemplos de dispositivos do ΕΡ 1 163 019/ΡΤ 2β estado da especialidade utilizados para estes propósitos incluem a Endopath INTERCEED Absorbable Adhesion Barrier (Ethicon, Inc.), e SEPRAFILM™ (Genzyme, Cambridge, MA). Barreiras de aderência de poli-hidroxialcanoato podem ser fabricadas de acordo com os métodos e procedimentos descritos nas Patentes U.S. N.os 5824658; 5795584; 5791352; 5711958; 5639468; 5626863; 5626622; 5607686; 5580923; 5137875, e 4840626. (11) Extensores (stents)

Utilizam-se actualmente extensores numa gama de aplicações, médicas normalmente para impedir a reoclusão de um vaso. No presente invento, os extensores são extensores cardiovasculares, de gastrenterologia e uretéricos. Geralmente, estes extensores são não degradáveis. Utilizam-se extensores uretéricos e uretrais para aliviar a obstrução numa variedade de condições benignas, malignas e pós-traumáticas, tais como a presença de pedras e/ou fragmentos de pedra, ou outras obstruções ureterais tais como as associadas a estritura ureteral, carcinoma de órgãos abdominais, fibrose retroperitoneal ou trauma ureteral, ou em associação com litotripsia extracorporal por ondas de choque. O extensor pode ser colocado utilizando técnicas cirúrgicas endoscópicas ou percutaneamente. Exemplos de extensores do estado da especialidade incluem o extensor ureteral em rabo de porco duplo (C.R. Bard, Inc., Covington, GA), o SpiraStent (Urosurge, Coralville, IA), e os Cook Urological Ureteral and Urethral Stents (Cook Urological, Spencer, IN).

Uma vantagem de extensores de poli-hidroxialcanoato é a sua capacidade de bioabsorção, o que é particularmente desejável em aplicações tais como aplicações urológicas, uma vez que não é requerido um segundo procedimento para remover o extensor. Para além disso, um dos principais problemas na utilização de extensores metálicos em aplicações cardiovasculares é a restenose subsequente causada por crescimento excessivo da parede endotelial, que se crê ser devida, pelo menos em parte, a irritação causada pelo extensor metálico sobre a parede do vaso (ver Behrend, American J. Cardiol. pp. 45, TCT Abstracts (Out. 1998); Unverdorben, et al., American J. Cardiol. pág. 46, TCT Abstracts (Out. 1998)). Um extensor bioabsorvivel constituído de, ou revestido com, um poli-hidroxialcanoato deverá produzir apenas uma pequena irritação ou mesmo nenhuma. 27 ΕΡ 1 163 019/ΡΤ

Os extensores de poli-hidroxialcanoato podem ser fabricadas de acordo com os métodos e procedimentos descritos nas Patentes U.S. N.os 5792106; 5769883; 5766710; 5670161; 5629077; 5551954; 5500013; 5464450; 5306286; e 5085629. Ver também Tanquay, Cardiology Clinics, 23: 699-713 (1994), e

Talja, J. Endourology, 11: 391-97(1997). (12) Reparação de cartilagem articular Têm sido utilizadas matrizes de polímero biodegradável, sozinho ou incorporando células e/ou factores de crescimento moleculares bioactivos, para reparar defeitos de cartilagem articular. Um exemplo de um material utilizado num tal procedimento é o poli(ácido láctico) (Schroder, et al., J. Biomed. Mat. Res., 25:329-39 (1991)). Dispositivos de poli- hidroxialcanoato para reparação de cartilagem articular podem ser fabricados de acordo com os métodos e procedimentos descritos nas Patentes U.S. N.os 5876452; 5736372; 5716981; 5700774; 5655546; e 5041138. (17) Guias para nervo e reparação de tendão

Podem-se utilizar dispositivos biodegradáveis como guias para facilitar o recrescimento e religação de nervos e tendões cortados ou danificados. Estes dispositivos são geralmente fabricados como tubos. Um exemplo de um guia de nervo e o produto Neurotube . Dispositivos de poli-hidroxi-alcanoato para reparação de tendão podem ser preparados de acordo com procedimentos descritos na Patente U.S. N.° 4792336. Guias de nervo de poli-hidroxialcanoato podem ser fabricadas de acordo com os métodos e procedimentos descritos nas Patentes U.S. N.os 5800544; 5735863; 5584885; 5514181; 5026381; 5019087; e 4955893. (14) Reparação de defeitos do septo atrial

Grandes defeitos do septo atrial que não podem ser fechados directamente com suturas podem ser reparados com pensos pericárdicos ou com materiais sintéticos não absorvíveis. Pensos e dispositivos de poli-hidroxialcanoato para reparação de defeitos do septo atrial podem ser fabricados de acordo com os métodos e procedimentos descritos nas Patentes U.S. N.os 5853422; 5634936; 5861003; 5855614; e por Malm, T. et ai., Scand. J. Thor. Cardiovasc. Surg., 26:9-14 (1992). 28

ΕΡ 1 163 019/PT IV. Métodos de fabricação dos dispositivos (implantes) Métodos de fabricação de dispositivos médicos incluem vazamento a partir de solvente, processamento de massa fundida, extrusão, injecção e moldagem por compressão, formação de fibras e secagem por pulverização. Preferivelmente, preparam-se partículas directamente a partir de um processo baseado em fermentação, ou por uma técnica de evaporação de solvente, uma técnica de dupla emulsão ou por microfluidização, utilizando métodos disponíveis na especialidade. (Koosha, Ph. D. Dissertation, 1989, Univ. Nottingham, UK, Diss. Abstr. Int. B _51:1206 (1990); Bruhn & Mueller, Proceed. Intern. Symp. Control. Rei. Bioact. Mater. _18:668-69 (1991); Conti, et al., J. Microencapsulation, _9:153—66 (1992); Ogawa, et al.r Chem. Pharm. Buli., 36:1095-103 (1988); Mathiowitz & Langer, "Polyanhydride microspheres as drug delivery Systems", em Mícrocapsules Nanopart. Med. Pharm. (Donbrow, Ed.) cap. 5, pp. 99-123 (CRC, Boca Raton, Florida 1992)) .

Podem-se utilizar PHA para produzir dispositivos adequados para cicatrização de feridas. Por exemplo, para este fim, materiais fibrosos não tecidos podem ser preparados a partir destes polímeros produzindo primeiro fibras de polímero, por prensagem dos polímeros através de uma saída perfurada, utilizando procedimentos conhecidos dos peritos na especialidade. As fibras são depois utilizadas para fabricar uma membrana porosa (tecido) espalhando estas sobre um suporte sólido e submetendo-as a moldagem por compressão. A espessura do dispositivo pode ser inferior a 500 pm. Um dispositivo para cicatrização de feridas pode também ser preparado por perfuração de uma película ou membrana utilizando um laser para conseguir porosidade, ou por uma técnica de lixiviação para preparar um material poroso. Idealmente, os tamanhos de poro deverão ser suficientemente pequenos para conter as células e outras matérias de tecido. Os dispositivos de cicatrização de feridas podem ser posicionados in vivo para separar tecidos e estimular a regeneração do tecido.

Podem-se utilizar pha para encapsular células. Utilizando procedimentos conhecidos dos peritos na especialidade, as células podem ser primeiro pré-revestidas (ver, Maysinger, Reviews in the Neurosclences, 6:15-33 29 ΕΡ 1 163 019/ΡΤ (1995)). Utilizando um procedimento de encapsulação de partículas tais como a técnica da dupla emulsão, as células podem depois ser encapsuladas por PHA. Ogawa, et al., Chem. Pharm. Buli., 3_6_: 1095 — 103 (1988). As células encapsuladas podem depois ser implantadas in vivo.

Os PHA podem ser fabricados em armações de engenharia de tecidos utilizando uma ampla variedade de técnicas de processamento de polímeros. Métodos de fabricação de armações de engenharia de tecidos de PHA incluem vazamento a partir de solvente, processamento de massa fundida, processamento/fiação/tecelagem de fibras, ou outros meios de formação de fibras, extrusão, injecção e moldagem por compressão, laminagem e lixiviação de solvente/vazamento de solvente. Estes métodos são conhecidos dos peritos na especialidade.

Um método de fabricação de uma armação de engenharia de tecidos de PHA envolve a utilização de uma extrusora, tal como uma extrusora Brabender. Por exemplo, esta técnica pode ser utilizada para preparar tubos extrudidos adequados para implantação numa gama de comprimentos e tamanhos.

Outro método envolve a preparação de uma armação de PHA não tecida a partir das fibras. As fibras podem ser produzidas a partir de massa fundida ou a partir de solução, e processadas em não tecidos utilizando métodos conhecidos dos peritos na especialidade. As propriedades do não tecido podem ser configuradas fazendo variar, por exemplo, o material de PHA, as dimensões de fibra, a densidade de fibra, a espessura de material, a orientação das fibras e o método de processamento das fibras. Se desejado as membranas porosas podem ser adicionalmente processadas. Por exemplo, estas membranas podem ser formadas em tubos ocos.

Outro método envolve o processamento de massa fundida ou a partir de solvente de um PHA adequado num molde apropriado e a perfuração do material utilizando um laser ou outros meios para conseguir a porosidade desejada. Outros métodos envolvem o enrolamento de uma folha de PHA moldada por compressão numa volta e a selagem por calor. Opcionalmente, a folha de PHA pode ser enrolada com outro material, tal como um segundo polimero biodegradável. Por exemplo, este último material pode ser um não tecido de poli(ácido glicólico), 30 ΕΡ 1 163 019/ΡΤ poli(ácido láctico), ou um co-polimero de ácidos glicólico e láctico, proporcionando, por exemplo, um tubo laminado adequado para utilização na engenharia de novos vasos, duetos e tubos. Os PHA podem também ser utilizados para revestir outras armações de engenharia de tecidos. Estes materiais podem ser obtidos a partir doutros polímeros degradáveis. O revestimento pode ser realizado, por exemplo, com uma solução baseada em solvente, ou por técnicas de fusão, ou utilizando um látex de PHA.

Dispositivos de engenharia de tecidos aqui descritos podem ser semeados com células antes da implantação ou após implantação. As células podem ser colhidas a partir de uma secção saudável do tecido do dador, expandidas in vitro utilizando técnicas de cultura de células, e depois semeadas numa armação (ou matriz) quer antes quer após implantação. Alternativamente, as células podem ser obtidas a partir de tecido doutro dador ou a partir de linhas de células existentes.

Podem-se utilizar PHA para revestir outros dispositivos e materiais. Estes revestimentos podem melhorar as suas propriedades para aplicação médica, por exemplo, melhorando a sua biocompatibilidade, propriedades mecânicas, e configurando as suas propriedades de degradação e perfis de libertação controlada. Podem-se revestir PHA sobre outros dispositivos utilizando os procedimentos de fabricação acima descritos. A espessura do revestimento pode ser ajustada às necessidades da aplicação específica, alterando o peso ou a concentração do revestimento aplicado, e/ou com aplicação de várias camadas.

Podem-se utilizar PHA para fabricar extensores utilizando uma ampla variedade de técnicas de processamento de polímeros. Métodos de fabricação de extensores de PHA incluem vazamento a partir de solvente, processamento de massa fundida, processamento da fibra/fiação, extrusão, ablação a laser, moldagem por injecção e moldagem por compressão. Estes métodos são conhecidos dos peritos na especialidade.

Podem-se utilizar métodos para fabricação de dispositivos que aumentam a porosidade ou a área superficial exposta para alterar a características de degradação. Por 31 ΕΡ 1 163 019/ΡΤ exemplo, como demonstrado pelos exemplos, pode-se preparar poli(4-hidroxibutirato) poroso utilizando métodos que criam poros, vazios ou espaçamento intersticial, tal como uma técnica de emulsão ou de secagem por pulverização, ou que incorporam partículas lixiviáveis ou liofilizáveis no polímero. Métodos adicionais para fabricação de dispositivos de poli-hidroxialcanoato estão descritos em Biomaterials Science (Ratner, et al., Eds.) Academic Press, San Diego, Califórnia 1996; Biomedical Applications of Polymeric Materials (Tsuruta, et al., Eds.) CRC Press, Boca Raton, Florida, 1993; Synthetíc Biodegradable Polymer Scaffolds (Atala, et al., Eds.) Birhauser, Boston, 1997; Wound Closure Biomaterials and Devices, (Chu, J. et al., Eds.) CRC Press, Boca Raton, Florida, 1997; Polyurethanes in Biomedical Applications (Lamba, et al., Eds.) CRC Press, Boca Raton, Florida, 1998; Handbook of Biodegradable Polymers (Domb, et al., Eds.) Harwood Academic Publishers, Amsterdão, Países Baixos, 1997. V. Utilização dos dispositivos

Os implantes de poli-hidroxialcanoato (incluindo revestimentos) podem ser entregues por quaisquer meios incluindo cirurgia aberta ou por um método minimamente invasivo, tal como ingestão ou injecção ou inserção. Adicionalmente, dependendo da aplicação, a composição pode ser adicionalmente modificada para incluir outros materiais, tais como agentes bioactivos tais como factores de crescimento, fármacos, agentes antimicrobianos, factores de angiogénese, ou materiais que modificam as propriedades do dispositivo tais como outros polímeros, plastificantes, nucleantes e cargas.

Quando se implantam PHA sem pirogénios no corpo, estes materiais apresentam muito pequenas, ou nenhumas, reacções inflamatórias agudas ou nenhumas reacções adversas de tecido. Não existe qualquer resposta inflamatória significativa ou formação de tecido de cicatriz. 0 recrutamento de células inflamatórias é mínimo. 0 exame histológico dos dispositivos explantados demonstra que os materiais são essencialmente inertes. Deste modo, dispositivos construídos de PHA podem ser implantados com efeitos adversos mínimos no tecido circundante. A libertação dos produtos de degradação do 32

ΕΡ 1 163 019/PT hidroxiácido a partir dos materiais implantados é tipicamente lenta e bem tolerada pelo corpo. Assim, é de esperar que os PHA mantenham as suas propriedades de material durante meses e que eventualmente se degradem em materiais não tóxicos.

Dispositivos preparados a partir de PHA podem ser utilizados para uma vasta gama de aplicações médicas diferentes.

Os PHA utilizados no presente invento (composições de homopolímero de poli(4-hidroxibutirato)) podem encapsular, ser misturados com, ou ser ionicamente ou covalentemente acoplados a qualquer um de uma variedade de agentes terapêuticos, profilácticos ou de diagnóstico. Podem-se encapsular ou incorporar uma vasta variedade de materiais biologicamente activos, quer para entrega a um local pelo poli-hidroxialcanoato, quer para conferir propriedades ao polimero, tais como bioadesão, ligação a células, melhoria do crescimento celular, inibição de crescimento bacteriano, e prevenção de formação de coágulos.

Exemplos de agentes terapêuticos e profilácticos adequados incluem compostos inorgânicos e orgânicos sintéticos, proteínas e péptidos, polissacáridos e outros açúcares, lípidos e sequências de ácido nucleico ADN e ARN com actividades terapêutica, profiláctica ou de diagnóstico. Sequências de ácido nucleico incluem genes, moléculas anti-sentido que se ligam a ADN complementar para inibir a transcrição, e ribozimas. Podem ser encapsulados compostos com um grande intervalo de pesos moleculares, por exemplo, entre 100 e 500000 gramas ou mais por mole. Exemplos de materiais adequados incluem proteínas tais como anticorpos, ligandos de receptor e enzimas, péptidos tais como péptidos de adesão, sacáridos e polissacáridos, fármacos sintéticos orgânicos ou inorgânicos, e ácidos nucleicos. Exemplos de materiais que podem ser encapsulados incluem enzimas, factores de coagulação de sangue, agentes inibidores ou de dissolução de coágulos tais como estreptoquinase e activador de plasminogénio de tecido; antigénios para imunização; hormonas e factores de crescimento; polissacáridos tais como heparina; oligonucleótidos tais como oligonucleótidos anti-sentido e ribozimas e vectores retrovirais para utilização em terapia génica. O polímero pode também ser utilizado para encapsular células e tecidos. Agentes de diagnóstico 33 ΕΡ 1 163 019/ΡΤ representativos são agentes detectáveis por raios x, fluorescência, imagiologia de ressonância magnética, radioactividade, ultra-sons, tomografia computorizada (CT) tomografia de emissão de positrões (PET). Agentes de diagnóstico por ultra-sons são tipicamente um gás tal como ar, oxigénio ou perfluorocarbonetos.

No caso de libertação controlada, uma vasta gama de compostos bioactivos diferentes podem ser incorporados num dispositivo de libertação controlada. Estes incluem macromoléculas hidrófobas, hidrófilas e de peso molecular elevado tais como proteínas. 0 composto bioactivo pode ser incorporado no P4HB numa carga percentual entre 0,1% e 70% em peso, mais preferivelmente entre 5% e 50% em peso. As composições de homopolímero de poli(4-hidroxibutirato) podem ser utilizadas em quase todas as formas físicas, tais como pó, película, artigo moldado, partículas, esferas, látexes, e materiais cristalinos ou amorfos. Podem ser combinados com materiais não PHA adicionais, por exemplo, outros polímeros.

Antes da implantação, um artigo polimérico bioabsorvível tem de ser esterilizado para prevenir doenças e infecções do receptor. A esterilização é realizada antes de se semear um dispositivo polimérico com células. A esterilização térmica de artigos contendo PHA é frequentemente pouco prática uma vez que o tratamento térmico pode deformar o artigo, especialmente se o PHA tiver uma temperatura de fusão abaixo da requerida para o tratamento térmico de esterilização. Este problema pode ser ultrapassado utilizando óxido de etileno gasoso frio como agente de esterilização. A exposição de um artigo contendo PHA a vapores de óxido de etileno antes da implantação esteriliza o artigo tornando este adequado para implantação. Durante a esterilização com óxido de etileno gasoso frio, irradiação gama, o artigo contendo PHA mantém a sua forma. Este tipo de tratamento está idealmente adaptado para esterilização de artigos moldados ou pré-formados onde a forma do artigo desempenha um papel importante no seu funcionamento adequado.

Os dispositivos aqui descritos podem ser administrados sistemicamente ou localmente. Métodos de administrar sistemicamente os dispositivos incluem injecção, inalação, administração oral e implantação. 34 ΕΡ 1 163 019/ΡΤ

Os implantes e métodos aqui descritos serão melhor compreendidos por referência aos exemplos seguintes.

Exemplo 1: Produção de P4HB em E. coli recombinante E. coli da estirpe MBX1177, um derivado da estirpe DH5a seleccionado quanto à sua capacidade para crescer com ácido 4-hidroxibutírico (4HB) como a única fonte de carbono, foi transformado com pFS30, um plasmideo contendo os genes codificando PHA-sintase de Ralstonia eutropha, 4-hidroxi-butiril-CoA-transferase de Clostridium kluyveri, e β-lactamase, que confere resistência a ampicilina. A sintase e a transferase estão sob o controlo do promotor trc, que é induzivel por isopropil-p-D-tiogalactopiranósido (IPTG) em pFS30. Estas células foram primeiro cultivadas em 100 ml de LB (Luria Broth, Difco, Detroit, Mich.; 25 g/L) mais 100 pg/ml de ampicilina, de um dia para o outro, num balão Erlenmeyer de 250 ml a 37°C, com agitação a 200 rpm. Utilizou-se toda esta cultura como inoculo para a fermentação realizada num vaso de 7 L. A primeira etapa da fermentação consistiu no crescimento de biomassa em 5 L de LB-ampicilina, a 37°C com agitação a 800 rpm e arejamento com 1 volume volumétrico de ar/minuto (vvm). Após 17 horas, ajustou-se o volume a 6 L por adição de um litro de meio, tal que o volume total continha, por litro: 2,5 g de pó LB, 5 g de 4HB como sal de sódio, 2 g de glucose, 50 mmol de fosfato de potássio (pH 7), 7 g de ácido fosfórico, 100 pg de ampicilina e 0,1 mmol de IPTG. Neste instante, ajustou-se a temperatura a 33°C, e reduziu-se a velocidade de agitação para 400 rpm. Efectuaram-se adições periódicas de glucose e 4HB sódico quando o pH estava significativamente abaixo ou acima de 7, respectivamente, porque a adição de glucose fazia com que o pH diminuísse lentamente e a adição de 4HB fazia com que o pH aumentasse lentamente. O pH não foi controlado automaticamente. A fermentação prosseguiu desta forma durante 70 h adicionais, período após o qual tinham sido alimentados um total de 34 g/L de glucose e 15 g/L de 4HB. Deixaram-se as células sedimentar a 4°C durante 2 dias, período após o qual se removeu a fase liquida por bombagem, e fluidificou-se a massa de células num Microfluidizer M110-EH da Microfluidics Corporation (Newton, Mass.) a 18 000 psi. Liofilizou-se o material resultante e extraiu-se para tetra-hidrofurano (THF, 3% p/v de P4HB) com aquecimento (60°C) e agitação mecânica. O extracto de THF resultante foi filtrado sob pressão através 35 ΕΡ 1 163 019/ΡΤ de filtros espessos de microfibras de vidro (2,3 pm) e Teflon (2 pm) . Precipitou-se o polímero num volume igual de água e liofilizou-se. Redissolveu-se o polimero em THF (3% p/v de P4HB) com aquecimento (60°C) e filtrou-se a solução através de filtros espessos de microfibras de vidro (2,3 pm) e Teflon (2 pm), e precipitou-se em água/THF (1:1). Lavou-se o precipitado com água/THF (1:1) e liofilizou-se para dar uma espuma de cor branca (20 g) . Este material foi identificado como poli-4-hidroxibutirato e mostrou ser não citotóxico num ensaio de difusão em ágar (ISO 10993, Toxicon Corp., Bedford, MA). A análise elementar deu C 55,63%, H 7,41%, O 37,28%, N 41 ppm. A análise por GC mostra muito poucos lípidos no polímero purificado. A análise por RMN mostra os picos esperados e nenhuns lipidos.

Exemplo de Referência 2: Produção de poli(4HB-co-2HB) em E. coli recombinante E. coli das estirpes MBX1177/pFS30 e MBX184 (CGSC6966)/pFS30 foram pré-cultivados em 300 mL de LB-ampicilina num balão Erlenmeyer de um litro, a 30°C de um dia para o outro, com agitação a 200 rpm. Duas alíquotas de 100 mL de cada pré-cultura foram centrifugadas (2000xg, 10 minutos), e as células obtidas a partir de cada uma destas alíquotas foram de novo suspensas em 100 mL de um meio contendo, por litro: 6,25 g de pó LB; 2 g de glucose; 50 mmol de fosfato de potássio (pH 7); 100 pg de ampicilina; e 100 pmol de IPTG. O meio continha também ácido 2-hidroxibutírico (2HB) e 4HB; num balão as concentrações eram 8 g/L de 2HB e 2 g/L de 4HB, e no outro as concentrações dos dois ácidos eram cada uma 5 g/L. Ambos os ácidos foram adicionados aos balões como o sal de sódio; as massas indicadas para os ácidos não incluem a massa de sódio. Incubaram-se estes quatro balões (dois balões para cada estirpe) a 30°C durante 48 horas adicionais, com agitação a 200 rpm. As células foram removidas do meio por centrifugação (2000xg, 10 minutos), lavadas uma vez com água, centrifugadas outra vez, e liofilizadas. Realizou-se a análise de cromatografia gasosa na massa celular liofilizada para analisar o teor e a composição de polímero. Na Tabela 2 mostram-se os teores celulares e composições dos PHA produzidos. Quando a razão de 2HB para 4HB era 4:1, o teor em 2HB do polímero foi superior a 19 por cento para ambas as estirpes por análise de GC, enquanto que para uma razão de 1:1 de 2HB para 4HB, o teor em 36 ΕΡ 1 163 019/ΡΤ 2ΗΒ do polímero era à volta de 1 por cento. 0 4HB foi mais facilmente incorporado no polímero do que ο 2HB; deste modo, quando ο 4HB estava presente a 2 g/L o teor global em polímero das células foi menor do que quando este estava presente a 5 g/L. Os polímeros produzidos por MBXl84/pFS30 foram extraídos das células e analisados. Incubou-se a massa de células liofilizadas em 5 mL de clorofórmio, a 37°C durante 2 horas. Removeram-se os resíduos celulares por centrifugação (2000xg, 5 minutos), e adicionou-se gota a gota a solução de polímero resultante a 50 mL de etanol para o precipitar. Centrifugou-se o polímero precipitado a partir do etanol como acima descrito. No caso da razão 2HB:4HB 4:1, o polímero era difícil de centrifugar a partir do etanol; formou uma névoa quando adicionado ao etanol, mas não pôde ser quase completamente recolhido por centrifugação, provavelmente porque o peso molecular deste polímero era bastante baixo. O polímero isolado a partir do balão de 2HB:4HB 1:1 foi facilmente precipitado a partir do etanol, e foi recuperado quase completamente. A análise por GC destas amostras extraídas (Tabela 2) mostra que o teor em 2HB era ligeiramente menor do que quando a análise foi efectuada em células inteiras. É possível que resíduos de 2HB na cadeia de polímero sejam hidrolisados durante a extracção, diminuindo assim o teor aparente em 2HB nas amostras extraídas. O facto de o peso molecular do polímero extraído ser aparentemente menor quando o teor em 2HB era mais elevado é consistente com esta explicação.

Foi realizada uma segunda experiência com MBXl84/pFS30. Estas células foram pré-cultivadas em 400 mL de LB-ampicilina num balão Erlenmeyer de um litro, a 30°C de um dia para o outro, com agitação a 200 rpm. Efectuou-se uma adição de 20 ml de meio a cada balão tal que o volume total continha, por litro: 2,5 g de pó LB adicional; 2 g de 4HB como sal de sódio; 2 g de glucose; 50 mmol de fosfato de potássio (pH 7); 100 pg de ampicilina; 50 pmol de IPTG; e 2, 4, 6 ou 8 g de 2HB como sal de sódio. Incubaram-se os balões durante 48 horas adicionais a 30°C e 200 rpm. As células foram removidas do meio por centrifugação (2000xg, 10 minutos), lavadas uma vez com água, centrifugadas outra vez, e liofilizadas. A massa celular seca foi submetida a análise de GC como acima descrito. A Tabela 3 mostra o teor celular e a composição dos polímeros assim obtidos. Para razões 2HB:4HB baixas, pouco ou nenhum 2HB foi incorporado no polímero; contudo, quando esta 37 ΕΡ 1 163 019/ΡΤ razão foi 3:1 ou 4:1, a incorporação de 2HB no polímero foi muito significativa. 0 teor global em polímero da totalidade das células era bastante baixo, provavelmente porque os ácidos não estão presentes em concentrações suficientemente elevadas para permitir que a absorção e/ou incorporação prossigam a uma velocidade elevada.

Tabela 2:

Análise por GC de poli(4HB-CO-2HB) a partir de MBX1177/pFS30 e MBX184/pFS30

Estirpe 4HB, g/L 2HB, g/L PHA total, % de dcwa P4HB, % de PHAb P2HB, % de PHAb 184/30 2 8 18, 3 70,8 19,2 (14,2)c 184/30 5 5 47, 1 98,8 1,2 (0,9 ) c 1177/30 2 8 13, 0 62,3 27, 7 1177/30 5 5 40, 1 98,9 1,1 a dcw: peso seco de células. b Determinado por análise de GC. Submeteram-se cerca de 20 mg de massa de células liofilizadas a butanólise, a 110°C durante 3 horas, em 2 mL de uma mistura contendo (em volume) 90% de 1-butanol e 10% de ácido clorídrico concentrado, com adição de 2 mg/mL de ácido benzóico como padrão interno. Os componentes solúveis em água da mistura resultante foram removidos por extracção com 3 mL de água. Analisou-se a fase orgânica (1 pL com uma razão de "split" de 1:50 para um caudal global de 2 mL/min.) numa coluna de GC capilar de sílica fundida SPB-1 (30 m; 0,32 mm ID; película de 0,25 pm; Supelco; Bellefonte, Pa.) com o perfil de temperatura seguinte: 80°C, 2 min.; 10°C por min. até 250°C; 250°C, 2 min. O padrão utilizado para testar a presença de unidades de 4-hidroxibutirato no polímero foi a γ-butirolactona. O padrão utilizado para testar as unidades de 2-hidroxibutirato no polímero foi o (2-hidroxibutirato) sódico. c As percentagens entre parêntesis foram determinadas por análise de GC como acima, mas após extracção do polímero para clorofórmio e precipitação subsequente em etanol.

Tabela 3:

Análise por GC de poli(4HB-CO-2HB) a partir de MBXl84/pFS30

Amostra 4HB, g/L 2HB, g/L PHA total, % de dcwa P4HB, % de PHAb P2HB, % de PHAb 1 2 2 8,2 100 0 2 2 4 5,6 100 0 3 2 6 5,7 84,1 15, 9 4 2 8 4,1 54, 3 45, 7 dcw: peso seco de células. b Determinado por análise de GC. Ver Tabela 2 para detalhes.

Exemplo de Referência 3: Produção de poli(4HB-co-3HB) em E. coli recombinante A estirpe MBXll77/pFS30 foi pré-cultivada em 100 ml de 38 ΕΡ 1 163 019/ΡΤ LB-ampicilina em quatro balões Erlenmeyer de 250 ml, a 30°C de um dia para o outro, com agitação a 200 rpm. Efectuou-se uma adição de 20 ml de meio a cada balão tal que o volume total continha, por litro: 2,5 g de pó LB adicional; 4 g de 4HB como sal de sódio; 4 g de glucose; 50 mmol de fosfato de potássio (pH 7); 100 pg de ampicilina; 50 pmol de IPTG; e 0,25, 0,5, 0,75 ou 1 g de 3-hidroxibutirato (3HB) como sal de sódio. Incubaram-se os balões durante 48 horas adicionais a 30 °C e 200 rpm. As células foram removidas do meio por centrifugação (2000*g, 10 minutos), lavadas uma vez com água, centrifugadas outra vez, e liofilizadas. Realizou-se a análise de cromatografia gasosa na massa celular liofilizada para analisar o teor e a composição de polímero. O padrão utilizado para testar as unidades de 3-hidroxibutirato no polímero foi poli(3-hidroxibutirato). Na Tabela 4 apresentam-se os teores celulares e composições dos PHA produzidos. À medida que a razão 4HB/3HB no meio diminuiu, o teor em 3HB do polímero aumentou de um modo monotónico, embora o teor global de polímero das células fosse similar em todos os ensaios, o que significa que a composição do meio pode ser utilizada, como era de esperar, para controlar a composição de co-polímero sem afectar significativamente o rendimento global do polímero. O polímero foi extraído do restante da massa celular liofilizada. Para todas as amostras, misturou-se a massa celular liofilizada com cerca de três vezes o seu próprio volume de 1,2-dicloroetano e incubou-se com agitação moderada num tubo fechado, a 37°C durante 6 horas. A matéria particulada foi separada da solução de polímero por centrifugação (2000xg, 10 minutos). A solução resultante foi adicionada gota a gota a cerca de 10 vezes o seu próprio volume de etanol, e deixou-se o polímero precipitado sedimentar a partir da solução. Descartou-se o sobrenadante, e deixou-se o polímero húmido restante em repouso até parecer estar seco. Liofilizou-se depois o polímero até à secura total. Na Tabela 5 mostram-se as propriedades térmicas destas composições de P4HB-CO-3HB. 39 ΕΡ 1 163 019/ΡΤ

Tabela 4 :

Análise por GC de poli(4HB-CO-3HB) a partir de MBXll77/pFS30

Amostra 4HB, g/L 3HB, g/L PHA total, % de dcwa P4HB, % de PHAb P3HB, % de PHAb 3a 4 0,25 49, 3 98, 0 2, 0 3b 4 0, 5 46, 7 94,2 5, 8 3c 4 0,75 56, 6 91, 7 8,3 3d 4 1 51, 8 89, 4 10,6 a dcw: peso de células secas. b Determinado por análise de GC. Ver Tabela 2 para detalhes. 0 padrão utilizado para testar a presença de unidades 4-hidroxibutirato no polímero foi a γ-butirolactona. 0 padrão utilizado para testar as unidades 3-hidroxibutirato no polímero foi poli(3-hidroxibutirato).

Tabela 5:

Propriedades de P4HB e P4HB-CO-3HB a partir de MBX1177/pFS30

Amostra 9- a o % a Tmb dH Tml b Tg b Tx b Tm2 b Mw c 4HB 3HB (°C) (J/g) (°C) (°C) (°C) P4HB 100 0 60 45 -51 -16 X 1 000 000 3b 94,2 5,8 47 36 -52 -4 44 1 500 000 3c 91,7 8,3 40 20 -53 nd 39 1 900 000 3d 89,4 10, 6 39 17 -53 nd nd 1 100 000 nd = não detectado. a Determinado por análise de GC, ver Tabela 2 para detalhes. b Determinada por análise de DSC. Utilizou-se um calorimetro de varrimento diferencial Perkin Elmer Pyris 1. As massas das amostras eram aproximadamente 4-8 mg. 0 programa térmico utilizado foi como se segue: 25°C, 2 min.; aquecimento até 195°C a 10°C por min.; manutenção a 195°C por 2 min.; arrefecimento até -80°C a 300°C por min.; manutenção a -80°C durante 2 min.; aquecimento até 195°C a 10°C por min. A temperatura de fusão (Tm) e a entalpia de fusão deste pico de fusão (dHTml) foram determinadas no primeiro ciclo de aquecimento. A temperatura de transição vítrea (Tg), a temperatura de cristalização (Tx) e a temperatura de fusão (Tm2) foram determinados durante o segundo ciclo de aquecimento. c Determinados por análise de GPC. Dissolveram-se os polímeros isolados em clorofórmio a aproximadamente 1 mg/ml e cromatografaram-se as amostras (50 pL) numa coluna Waters Stryagel HT6E com um caudal de 1 ml de clorofórmio por minuto à temperatura ambiente, utilizando um detector de índice de refracção. As massas moleculares foram determinadas em relação a padrões de poliestireno de polidispersividade estreita.

Exemplo 4: Degradação in vitro e in vivo de P4HB A degradação de P4HB foi estudada in vitro e in vivo. Examinaram-se três configurações diferentes de porosidade variável (0%, 50% e 80% de porosidade). Puncionaram-se pequenos discos (5 mm de diâmetro) a partir de películas de P4HB moldadas por compressão, de espessura uniforme. 40

ΕΡ 1 163 019/PT

Produziram-se amostras porosas de P4HB utilizando a técnica de lixiviação abaixo descrita. O comportamento de degradação in vítro foi estudado por incubação dos discos num tampão estéril de fosfato (fosfato de sódio 8 mM, fosfato de potássio 2 mM, NaCl 140 mM, KC1 10 mM, pH 7,4, contendo NaN3 como conservante) a 37°C. O comportamento de degradação in vivo foi estudado após implantação em bolsos subcutâneos em ratos.

Preparação de P4HB poroso

Misturaram-se cristais de cloreto de sódio classificados (80-180 pm) com P4HB fundido. (Note-se que a razão polimero sal pode ser ajustada para produzir a porosidade desejada, enquanto que o tamanho de partícula pode ser ajustado para produzir poros de tamanho variável.) A mistura de polímero sal foi prensada numa pelicula fina. Após deixar o material solidificar, removeu-se a pelicula do suporte de Mylar. Extraiu-se a pelicula exaustivamente com água para remover o sal, deixando uma pelicula porosa de P4HB.

Degradação acelerada de P4HB A degradação de P4HB foi estudada in vivo. Examinaram-se três configurações diferentes de porosidade variável (0%, 50% e 80% de porosidade). Puncionaram-se pequenos discos (5 mm de diâmetro) a partir de películas de P4HB moldadas por compressão de espessura uniforme. Produziram-se amostras porosas de P4HB utilizando uma técnica de lixiviação de sal. O comportamento de degradação in vivo foi estudado após implantação em bolsos subcutâneos em ratos. Retiraram-se amostras em vários instantes. Mediu-se a massa molecular por GPC e mediu-se a perda de massa por quantificação do 4HB restante por análise de GC. Os resultados são apresentados na Figura 3. Como se mostra na Figura 3, a perda de massa da amostra variou com a porosidade. As amostras de película, de 50% e de 80% de porosidade exibiram uma perda de massa de 5%, 20% e 75%, respectivamente, durante o período de seis semanas, enquanto a perda de massa molecular média destas amostras diminuiu também significativamente (20 a 50%) . Estes resultados demonstram que a velocidade de degradação de PHA pode ser modificada e controlada alterando a porosidade e aumentando a área superficial. 41 ΕΡ 1 163 019/ΡΤ

Resultados

Os implantes de P4HB mostraram uma resposta inflamatória muito pequena, muito menor do que para uma rede não tecida de PGA. Esta é uma indicação muito boa da biocompatibilidade destes materiais. Retiraram-se amostras em vários instantes e avaliaram-se histoloqicamente, tanto nos implantes como no tecido circundante. Mediu-se a massa molecular por GPC e mediu-se a perda de massa por quantificação do 4HB restante por análise de GC. Os resultados são apresentados nas Tabelas 6 e 7. Como se mostra na Tabela 6, ο P4HB não se deqrada significativamente durante um período de dez semanas in vitro. Todas as amostras mantiveram o seu peso de partida, e ocorreu uma diminuição de 20 a 40% em massa molecular média. As amostras incubadas in vivo mostraram uma degradação muito menos pronunciada. A perda de massa variou com a porosidade. As amostras de película, de 50% e de 80% de porosidade exibiram uma perda de massa de 20%, 50% e 100%, respectivamente, durante o período de dez semanas, enquanto a perda de massa molecular média destas amostras diminuiu também significativamente (20 a 50%). O exame por microscopia óptica e por microscopia electrónica de varrimento ambiental (ESEM) das amostras não mostrou quase qualquer alteração discernível para as amostras in vitro durante o período de incubação de dez semanas. Em contraste, os implantes in vivo mostram sinais distintos de degradação. As superfícies destes materiais degradaram-se progressivamente durante o período de implantação de dez semanas. Após uma semana, as amostras de película exibiram alguns sinais de fractura e fissuração, que evoluíram para erosão superficial e corrosão durante as nove semanas seguintes.

Os dados de degradação in vitro sugerem que ο P4HB é razoavelmente estável a hidrólise simples, contrariamente a outros poliésteres utilizados em aplicações bioabsorvíveis, tais como PGA, PLA e seus co-polímeros. Contudo, a degradação dos implantes mostrou que ο P4HB pode ser degradado in vivo, sugerindo um modo de degradação mediado biologicamente. Os resultados mostram uma degradação crescente com uma porosidade crescente, o que indica que a área superficial do implante de polímero desempenha um papel na sua degradação in vivo. Isto sugere que a degradação de polímeros de P4HB in 42 ΕΡ 1 163 019/ΡΤ vivo ocorre na superfície do implante, contrariamente a materiais de PGA ou PLA que se degradam através do implante por hidrólise, com diminuição associada de massa molecular e perda de propriedades mecânicas. Estes resultados sugerem que a velocidade de degradação de P4HB pode ser modificada e controlada por alteração da sua área superficial. É também de esperar que este tipo de degradação superficial resulte numa velocidade relativamente lenta de perda de massa molecular, permitindo a manutenção de propriedades do material polimérico durante mais tempo do que os poliésteres médicos absorvíveis existentes. Os implantes de P4HB foram muito bem tolerados e mostraram apenas uma reacção de corpo estranho muito pequena. Estas constatações mostram que estes materiais têm vantagens significativas em relação aos poliésteres biomédicos existentes.

Tabela 6:

Degradação de P4HB in vitro: Percentagem de massa original restante e massa molecular

Implantação (semanas) Película % em peso restante3 Película Massa Molec.b 50% Por. % em peso restante3 50%Por. Massa Molec.b 80%Por. % em peso restante3 80%Por. Massa Molec.b 0 108 1144592 96 963145 123 1291117 1 97 1160707 93 1103860 99 968245 2 101 1008496 98 1055614 106 1072328 4 100 887005 96 725089 116 987665 6 109 896521 97 764260 95 1049079 10 92 772485 90 605608 100 727543 a Determinada por análise de GPC. Ver Tabela 3 para detalhes. b Determinada por análise quantitativa de GC. Ver Tabela 2 para detalhes. 43 ΕΡ 1 163 019/ΡΤ

Tabela 7 :

Degradação de P4HB in vivo: Percentagem da massa original restante e massa molecular

Implantação (semanas) Película % em peso restante3 Película Massa Molec.b 50% Por. % em peso restante3 50%Por. Massa Molec.b 80%Por. % em peso restante3 80%Por. Massa Molec .b 0 108 1144592 96 963145 123 1291117 1 103 1091107 109 1026821 88 1132492 2 95 1054873 94 973830 35 943960 4 92 1007736 73 989629 39 881919 6 90 797170 74 901330 28 689157 10 80 716296 48 647175 0 nd a Determinada por análise de GPC. Ver Tabela 3 para detalhes. b Determinado por análise de GC. Ver Tabela 2 para detalhes. Os explantes pesavam muitas vezes mais do que o implante original devido à presença de tecido aderente ou sangue coagulado. Deste modo, a massa de P4HB no explante foi determinada por análise quantitativa de GC. A percentagem em peso restante de P4HB foi considerada como esta massa dividida pela massa do implante original.

Exemplo 5: Moldagem por compressão 0 P4HB foi prensado numa película fina utilizando uma prensa hidráulica Carver. Os pratos da prensa estavam aquecidos a 115°C. 0 P4HB foi prensado entre duas folhas de Mylar utilizando espaçadores de metal. A espessura dos espaçadores e a pressão da prensa foram ajustadas para controlar a espessura da película. Removeu-se a película da prensa e deixou-se arrefecer à temperatura ambiente. Após solidificar (numa questão de segundos), a película foi facilmente despegada do material de suporte de Mylar. Na Tabela 1 mostram-se os dados das propriedades mecânicas para este material. A rápida solidificação de P4HB demonstra a sua rápida cristalização. 44 ΕΡ 1 163 019/ΡΤ

Tabela 1:

Propriedades térmicas e mecânicas de polímeros médicos seleccionados

Polímero Tm rc) Tg (°C) Resis. tracção (psi) Módulo (psi) Alonga-mento (%) Degradação 1P4HB 60 -51 7 500 9400 1000 depende da config. ^ΡίΗΒδΟ3 60 -51 895 2155 164 depende da config. 1pP4HB80b 60 -51 180 257 100 depende da config. 6P4HB-3HB 10% 50 -42 9 000 14 500 1080 Não reportado 1PHB 175 0 4 000 110 000 4 >52 semanas 2PGA 230 35 10000 1000000 17 8 semanas 3pdlla Am 53 5000 300000 5 <8 semanas 3plla 175 55 10000 500000 8 >8 semanas 2dlplg 50/50 Am 48 7000 300000 5 3-8 semanas 5ldpe 2000 400-700 Não degradável 5hdpe 4000 100-1000 Não degradável 5uhmwpe 7250 450 Não degradável PP 4000 20000 200-700 Não degradável ΡΕΤ 8500 50 Não degradável PTFE 3000 na cedência 50000 300 Não degradável apP4HB50, P4HB 50% de porosidade, ver exemplo 7. b pP4HB80, P4HB 80% de porosidade, ver exemplo 7. Tabela de referências: 1. A partir deste trabalho medido de acordo com o ASTM D638 à temperatura ambiente e a uma velocidade de tracção de 0,05 ou 0,1 in./min.. 2. Hutmacher et al. Int. J. Oral Max. Imp. 1996, 11: 667-78. 3. Nobes et al. submetido para publicação. 4. Mark, Physical Properties of Polymers Handbook, American Inst. of Physics, Woodbury, New York, 1996. 5. Schwartz, S.S. e Goodman, S. H. Plastic Materials and Processes, Van Nostrand Reinhold Company, New York, 1982. 6. Saito, Y. e Doi, Y. Int. J. Biol. Macromol. (1994) 16: 99-104.

Exemplo 6: Moldagem por compressão de P4HB poroso

Cristais de cloreto de sódio classificados (80-180 pm) foram misturados com P4HB fundido como descrito nos Exemplos 4 e 5. (A razão polímero sal pode ser ajustada para produzir a porosidade desejada, enquanto o tamanho de partícula pode ser ajustado para produzir poros de tamanho variável.) A 45 ΕΡ 1 163 019/ΡΤ mistura de polímero sal foi prensada numa película fina utilizando as condições descritas no Exemplo 6. Após deixar o material solidificar, removeu-se a película do suporte de Mylar. A película foi extraída exaustivamente com água para remover o sal, deixando uma película porosa de P4HB. A remoção de sal foi monitorada por análise do cloreto no sobrenadante e confirmada por análise elementar da película lixiviada (menos do que 0,5% de cloreto). Na Tabela 1 apresentam-se os dados mecânicos para P4HB 50% e 80% de porosidade (pP4HB50 e pP4HB80, respectivamente).

Exemplo 7: Sementeira de células de armações de P4HB P4HB poroso, como descrito no Exemplo 6, foi esterilizado por tratamento com óxido de etileno frio. Semeou-se com células vasculares de ovino e cultivou-se in vitro. Os resultados preliminares mostraram uma muito boa ligação destas células ao material. Isto é uma demonstração adicional da biocompatibilidade deste material. O número de células ligadas ao material pode ser quantificado, utilizando um ensaio da determinação de ADN, e comparado com o padrão para armações de engenharia de tecidos, rede de PGA.

Exemplo 8: Orientação das fibras de P4HB

Estiraram-se uniaxialmente tiras de P4HB moldadas por compressão. A amostra estreitou e tornou-se transparente, mostrando sinais de estrangulamento. Após este processo de estiramento, o polímero pareceu mais forte e algo mais flexível, demonstrando a orientação uniaxial da amostra.

Exemplo 9: Produção de espuma de P4HB

Utilizou-se um método térmico de separação de fase para produzir espuma de P4HB. Em primeiro lugar, dissolveu-se P4HB em dioxano a 1 a 5% p/v. Esta solução de polímero foi vazada como uma película espessa e solidificou por arrefecimento sobre gelo abaixo do ponto de fusão do dioxano. Evaporou-se o solvente deste material sólido a baixa pressão para dar uma espuma porosa com as dimensões aproximadas da película espessa de partida. A análise por ESEM deste material mostrou uma estrutura espongiforme altamente porosa. Podem-se fazer variar a concentração de polímero e o processo de arrefecimento para alterar a porosidade da espuma. Antes da ΕΡ 1 163 019/ΡΤ 4β congelação, a solução de polímero pode ser enformada numa variedade de formas, quebrada em material particulado ou utilizada como revestimento. Deste modo, esta técnica térmica de separação de fase pode ser utilizada para produzir uma grande variedade de formas tridimensionais altamente porosas de P4HB.

Exemplo 10: Revestimento de P4HB de uma rede não tecida

de PGA

Dissolveu-se P4HB em tetra-hidrofurano a 1% p/v. Uma rede de PGA não tecida com 1 mm de espessura (Albany International, peso especifico 52 mg/cm3) foi mergulhada nesta solução tal que os vazios de ar fossem eliminados. Deixou-se a rede revestida secar ao ar, e repetiu-se o procedimento de revestimento. As análises por microscopia óptica e ESEM da rede revestida mostraram que, durante o processo de secagem, o polímero migrou para as intersecções da fibra, e funcionou para ligar as fibras umas às outras. Constatou-se que esta técnica de ligação de fibras melhorava dramaticamente a resistência e as características de manipulação da rede de PGA. Os ensaios de tracção de acordo com o ASTM D638 mostraram que a resistência à tracção, o módulo de Young e o alongamento na ruptura deste material eram 130 psi, 240 psi e 171%, respectivamente. Isto foi uma melhoria dramática em relação ao material não revestido que era demasiado frágil para testar estes parâmetros.

Exemplo 11: Revestimento com espuma de P4HB de uma rede

não tecida de PGA

Dissolveu-se P4HB em dioxano a 2,5% p/v. Uma rede de PGA não tecida com 1 mm de espessura (Albany International, peso específico 52 mg/cm3) foi mergulhada nesta solução tal que os vazios de ar fossem eliminados. A malha revestida foi arrefecida ao ar de modo que a solução de revestimento solidificou. A malha foi liofilizada para remover o dioxano. A análise por microscopia óptica da rede revestida mostrou que, durante o processo de liofilização, o polímero formou uma espuma do tipo teia através da rede de PGA. Este material espumoso tinha boas características de manipulação. A área superficial elevada e as propriedades mecânicas melhoradas são atractivas para uma variedade de aplicações. 47

ΕΡ 1 163 019/PT

Exemplo 12: Formação de microsferas de P4HB

Dissolveu-se P4HB em diclorometano a 1% p/v. Misturou-se um volume de 1 ml desta solução com 5 ml de uma solução a 0,5% p/v de dodecilsulfato de sódio (SDS). A mistura de duas fases foi mexida mecanicamente para dar uma emulsão. Fez-se borbulhar uma corrente de azoto através da mistura durante 1 hora, com agitação rápida, para facilitar a remoção do diclorometano. Agitou-se a mistura aberta ao ar de um dia para o outro para permitir a remoção completa de diclorometano. A suspensão resultante continha microsferas de P4HB de cerca de 1-10 pm, conforme determinado com um microscópio óptico de contraste de fase.

Conclusões dos Exemplos O homopolimero de P4HB têm propriedades físicas e características de degradação que o tornam muito atractivo como implantes para utilização em aplicações médicas. Este polímero pode ser fabricado em fibras, folhas, espumas, revestimentos, estruturas, filamentos e outros, para utilização destes como materiais médicos implantáveis.

Lisboa

Claims (15)

1. ΕΡ 1 163 019/ΡΤ 1/4 REIVINDICAÇÕES 1. Implante médico biocompatível para a ligação, fixação, suporte, reparação ou reforço de tecido mole, em que o implante compreende uma composição de homopolímero de poli(4-hidroxibutirato), onde a composição de homopolímero de poli(4-hidroxi-butirato) compreende opcionalmente aditivos que alteram a estabilidade química do polímero, onde o homopolímero de poli(4-hidroxibutirato) tem um peso molecular ponderai médio na gama entre 10000 a 10000000 Dalton, onde o implante é seleccionado entre o grupo consistindo de agrafos de sutura; dispositivos para reparação de menisco; rebites; tachas; parafusos de interferência; redes cirúrgicas para implantes de tecido mole para reforço de tecido mole, para a união de defeitos fasciais, para um penso de traqueia ou doutro órgão, para recuperação de órgãos, para material de enxerto durai, para cobertura de feridas ou queimaduras, ou para um tamponamento hemostático; bandas; cavilhas ortopédicas; barreiras de aderência; extensores cardiovasculares, de gastrenterologia ou uretéricos; dispositivos para reparação de cartilagem articular; guias para nervo; dispositivos para reparação de tendão; dispositivos para reparação de defeitos do septo atrial; pensos cardiovasculares para enxerto de penso vascular, penso intracardíaco ou para oclusão por penso após endarterectomia; e pensos de reparação para a reparação de defeitos na parede torácica e abdominal, hérnias inguinais, paracolostomicas, ventrais, paraumbilicais, escrotais ou femorais, para reforço de retalho de músculo, para reforço de linhas de agrafos e incisões longas, para reconstrução da zona pélvica, para reparação de prolapso rectal ou vaginal, para almofadas de sutura e agrafos, para reparação urinária ou da bexiga, ou para compressas.
2. 2. implante de acordo com a reivindicação 1, onde a velocidade de degradação da composição de homopolímero de poli(4-hidroxibutirato) é controlada por aumento da porosidade da composição de poli(4-hidroxibutirato).
3. 3. Implante de acordo com a reivindicação 1, onde a composição de homopolímero de poli(4-hidroxibutirato) compreende aditivos seleccionados entre o grupo consistindo ΕΡ 1 163 019/ΡΤ 2/4 de substâncias hidrófilas, substâncias hidrófobas, e revestimentos que alteram a incorporação de água pela composição.
4. 4. Implante de acordo com a reivindicação 1, que compreende aditivos que alteram a estabilidade química do polímero.
5. 5. Implante de acordo com a reivindicação 4, onde os aditivos promovem a cisão da cadeia.
6. 6. Implante de acordo com a reivindicação 4, onde os aditivos são seleccionados entre o grupo que consiste em ácidos, bases, electrófilos, nucleófilos, plastificantes, polímeros, agentes formadores de poros e agentes concebidos para reduzir a cristalinidade do polímero.
7. 7. Implante de acordo com a reivindicação 1, que compreende agentes formadores de poros.
8. 8. Implante de acordo com a reivindicação 7, onde os agentes formadores de poros são partículas liofilizáveis.
9. 9. Implante de acordo com a reivindicação 7, onde os agentes de formação de poros absorvem água.
10. 10. Método de preparação de um implante médico biocompatível para a ligação, fixação, suporte, reparação ou reforço de tecido mole, o implante compreendendo uma composição de homopolímero de poli(4-hidroxibutirato), onde a composição de homopolímero de poli(4-hidroxibutirato) compreende opcionalmente aditivos que alteram a estabilidade química do polímero, onde o homopolímero de poli(4-hidroxibutirato) tem um peso molecular ponderai médio na gama entre 10000 a 10000000 Dalton, que compreende proporcionar uma composição de homopolímero de poli(4-hidroxibutirato), onde a composição de homopolímero de poli(4-hidroxibutirato) compreende opcionalmente aditivos que alteram a estabilidade química do polímero, onde o homopolímero de poli(4-hidroxibutirato) tem um peso molecular ponderai médio na gama entre 10000 a 10000000 ΕΡ 1 163 019/ΡΤ 3/4 Dalton; e formar ou incorporar a composição de homopolimero de poli(4-hidroxibutirato) num implante seleccionado entre o grupo consistindo de agrafos de sutura; dispositivos para reparação de menisco; rebites; tachas; parafusos de interferência; redes cirúrgicas para implantes de tecido mole para reforço de tecido mole, para a união de defeitos fasciais, para um penso de traqueia ou doutro órgão, para recuperação de órgãos, para material de enxerto durai, para cobertura de feridas ou queimaduras, ou para um tamponamento hemostático; bandas; cavilhas ortopédicas; barreiras de aderência; extensores cardiovasculares, de gastrenterologia ou uretéricos; dispositivos para reparação de cartilagem articular; guias para nervo; dispositivos para reparação de tendão; dispositivos para reparação de defeitos do septo atrial; pensos cardiovasculares para enxerto de penso vascular, penso intracardiaco ou para oclusão por penso após endarterectomia; e pensos de reparação para a reparação de defeitos na parede torácica e abdominal, hérnias inguinais, paracolostomicas, ventrais, paraumbilicais, escrotais ou femorais, para reforço de retalho de músculo, para reforço de linhas de agrafos e incisões longas, para reconstrução da zona pélvica, para reparação de prolapso rectal ou vaginal, para almofadas de sutura e agrafos, para reparação urinária ou da bexiga, ou para compressas.
11. 11. Implante de acordo com a reivindicação 1 ou o método de acordo com a reivindicação 10, onde: o rebite ou tacha é um dispositivo para reparação de lesão SLAP, reparações de separação acromio-clavicular, reparações de rotador do pulso, reconstruções de desvio capsular ou capsulolabral, tenodese de biceps e reparação de deltoide; a rede cirúrgica se destina a reparação de aponeuroses abdominais, da parede abdominal, de defeitos fasciais ou capsulares, de tendões patelares ou de aquiles, ou para substituição de tendões infraspinatus ou de ligamentos cruzados cranianos.
12. 12. Implante de acordo com a reivindicação 1, onde o implante compreende adicionalmente um agente terapêutico, profiláctico ou de diagnóstico.
13. 13. Implante de acordo com a reivindicação 12, onde o ΕΡ 1 163 019/ΡΤ 4/4 agente terapêutico, profiláctico ou de diagnóstico é seleccionado entre o grupo que compreende genes, oligonucleótidos, ácidos nucleicos, moléculas anti-sentido, ribozimas, vectores retrovirais para utilização em terapia génica, anticorpos e seus fragmentos, factores de ligação celular, ligandos de receptor, enzimas, péptidos de adesão, sacáridos, polissacáridos, fármacos sintéticos orgânicos ou inorgânicos, factores de coagulação de sangue; inibidores de coagulação de sangue, agentes de dissolução de coágulos, antigénios para imunização, hormonas, factores de crescimento e agentes de diagnóstico detectáveis por raios x, fluorescência, imagiologia de ressonância magnética, radioactividade, ultra-sons, tomografia computorizada (CT) ou tomografia de emissão de positrões (PET).
14. 14. implante de acordo com a reivindicação 13, onde: o agente de dissolução de coágulo é seleccionado entre estreptoquinase e activador de plasminogénio de tecido; o polissacárido é heparina; o oligonucleótido é um oligonucleótido anti-sentido; o agente de diagnóstico detectável por ultra-sons é um gás seleccionado entre ar, oxigénio e perfluorocarbonetos.
15. 15. Implante de acordo com a reivindicação 1, onde o polímero encapsula células ou tecido. Lisboa