DE69836439T2

DE69836439T2 - Polyhydroxyalkanoatzusammensetzungen mit kontrollierten abbaugeschwindigkeiten

Info

Publication number: DE69836439T2
Application number: DE69836439T
Authority: DE
Inventors: P. David Arlington MARTIN; A. Frank SKRALY; F. Simon Sherborn WILLIAMS
Original assignee: Metabolix Inc
Current assignee: Yield10 Bioscience Inc
Priority date: 1997-12-22
Filing date: 1998-12-22
Publication date: 2007-05-24
Anticipated expiration: 2018-12-23
Also published as: CA2314151C; CA2314151A1; CY1106007T1; ES2281147T3; EP2196484A1; AU1942999A; EP1042388B1; WO1999032536A1; EP1659142A1; JP4376455B2; EP2196484B1; EP1042388A1; EP1659142B1; EP2258742A1; ES2356350T3; DE69836439D1; DK1042388T3; ES2394953T3; PT1042388E; AU751610B2

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft generell Polyhydroxyalkanoatpolymere und Verfahren zur Veränderung der Geschwindigkeiten ihres Abbaus, insbesondere Verfahren, die diesen Prozess beschleunigen, sowie neuartige biologisch abbaubare Polyhydroxyalkanoate, die besonders für medizinische Anwendungen geeignet sind.
Hintergrund der Erfindung
Auf dem Gebiet der Medizin sind verschiedene abbaubare Polymere, die sich in vivo innerhalb von Wochen oder wenigen Monate in ihre jeweiligen Monomere zersetzen, entwickelt worden. Trotz der Verfügbarkeit dieser synthetischen abbaubaren Polymere besteht immer noch ein Bedarf an der Entwicklung abbaubarer Polymere, die den Bereich der verfügbaren Optionen weiter erweitern können. Insbesondere besteht ein Bedarf an der Entwicklung abbaubarer Polymere, die einen breiteren Bereich an mechanischen Eigenschaften aufweisen.
Polyhydroxyalkanoate sind natürliche, thermoplastische Polyester, die mittels herkömmlicher Polymertechniken für den Einsatz in einer enormen Vielzahl von Anwendungen, einschließlich von Verpackungen von Konsumgütern, Auskleidungen von Wegwerfwindeln und Abfalltüten, Nahrungsmitteln und Medizinprodukten, verarbeitet werden können. Zunächst konzentrierten sich die Bemühungen auf Anwendungen unter Einsatz eines Formens, insbesondere auf Konsumgüterverpackungen wie Flaschen, Kosmetikbehälter, Schreibstifte, Golftees und dergleichen. Die US-Patente Nr. 4 826 493 und 4 880 592 beschreiben die Herstellung von PHB- und PHBV-Folien und ihre Verwendung als Stützfolien für Windeln. Das US-Patent Nr. 5 292 860 beschreibt die Herstellung des PHA-Copolymers Poly(3-hydroxybutyrat-co-3-hydroxyhexanoat) und die Verwendung dieser Polymere zur Herstellung von Stützfolien für Windeln und anderer Wegwerfartikel. Materialien für Stützfolien von Windeln und andere Materialien für die Herstellung biologisch abbaubarer oder kompostierbarer Körperpflegeartikel aus PHB-Copolymeren, bei denen es sich nicht um PHBV handelt, werden in PCT WO 95/20614, WO 95/20621, WO 95/23250 WO 95/20615, WO 95/33874, US 5 502 116 , US 5 536 564 , US 5 489 470 und WO 96/08535 beschrieben.
Eine der nützlichsten Eigenschaften von PHAs, die diese deutlich von petrochemisch erzeugten Polymeren unterscheidet, ist ihre biologische Abbaubarkeit. Auf natürliche Weise von Bodenbakterien erzeugt werden die PHAs bei der nachfolgenden Exposition gegen die gleichen Bakterien entweder im Boden, im Kompost oder im Meeressediment abgebaut. Der biologische Abbau von PHAs hängt von mehreren Faktoren ab, wie der mikrobiologischen Aktivität der Umwelt und der Oberfläche des Gegenstands. Außerdem sind die Temperatur, der pH, das Molekulargewicht und die Kristallinität wichtige Faktoren. Der biologische Abbau beginnt, wenn Mikroorganismen anfangen, auf der Oberfläche des Kunststoffs zu wachsen und Enzyme zu sezernieren, die das Polymer zur monomeren Hydroxysäureeinheit abbauen. Die Hydroxysäuren werden dann von den Mikroorganismen aufgenommen und als Kohlenstoffquellen für das Wachstum verwendet. In aeroben Umgebungen werden die Polymere zu Kohlendioxid und Wasser abgebaut, während die Abbauprodukte in anaeroben Umgebungen Kohlendioxid und Methan sind (Williams, S.F. und Peoples, O.P., CHEMTECH 26: 38–44 (1996)). Während man generell davon ausgeht, dass der Mechanismus des Abbaus von PHAs in der Umwelt über einen enzymatischen Angriff erfolgt und relativ schnell sein kann, weiß man, dass der Mechanismus des Abbaus in vivo einen simplen hydrolytischen Angriff auf die Polymeresterbindungen beinhaltet. Er kann durch Proteine vermittelt sein, muss es aber nicht. Im Gegensatz zu Polymeren, die 2-Hydroxysäuren, wie Polyglycol- und Polymilchsäure, umfassen, bestehen Polyhydroxyalkanoate normalerweise aus 3-Hydroxysäuren und, in bestimmten Fällen, sogar aus 4-, 5- und 6-Hydroxysäuren. Von diesen Hydroxysäuren ausgehende Esterbindungen sind im Allgemeinen weniger hydrolyseempfindlich als von 2-Hydroxysäuren ausgehende Esterbindungen.
Forscher haben Verfahren zur Produktion einer Vielzahl von PHAs entwickelt, und um die 100 unterschiedliche Monomere sind unter kontrollierten Fermentationsbedingungen in Polymere inkorporiert worden (Steinbüchel, A. und Valentin, H.E., FEMS Microbiol. Lett. 128: 219–228 (1995)). Es gibt derzeit nur zwei kommerziell erhältliche PHA-Zusammensetzungen, Poly-(R)-3-hydroxybutyrat (PHB) und Poly-(R)-3-hydroxybutyrat-co-(R)-3-hydroxyvalerat (PHBV). Wegen der großen Vielfalt ihrer Zusammensetzungen können PHAs mit verschiedenen physikalischen Eigenschaften erzeugt werden (Williams, S.F. und Peoples, O.P., CHEMTECH 26: 38–44 (1996)). Die kommerziell erhältlichen PHAs, PHB und PHBV, repräsentieren nur einen kleinen Teil der Sets von Eigenschaften, die mit PHAs erhalten werden können. Zum Beispiel liegt die Dehnung beim Reißen für PHB und PHBV in der Gegend um 4 bis 42 %, während die gleiche Eigenschaft für Poly-4-hydroxybutyrat (P4HB) bei ungefähr 1000 % liegt (Saito, Y. und Doi, Y., Int. J. Biol. Macromol. (1994) 16: 9–104). Ähnlich liegen die Werte für den Elastizitätsmodul und die Zugfestigkeit für PHB und PHBV bei 3,5 bis 0,5 GPa bzw. 40 bis 16 MPa (für einen auf 25 Mol-% ansteigenden HV-Gehalt) im Vergleich zu 149 MPa bzw. 104 MPa für P4HB (Saito, Y. und Doi, Y., Int. J. Biol. Macromol. (1994) 16: 99–104).
Zusätzlich zu einer kommerziellen Verwendung als biologisch abbaubarer Ersatz für synthetische Harze für Gebrauchsgüter sind PHB und PHBV extensiv bezüglich eines Einsatzes in biomedizinischen Anwendungen untersucht worden. Diese Studien reichen von potenziellen Verwendungen bei der verzögerten Freisetzung, die von Koosha, F. et al., Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 6: 117–130 (1989) und Pouton, C.W. und Akhtar, S., Adv. Drug Delivery Rev. 18: 133–162 (1996) in Übersichtsarbeiten dargestellt wurden, bis zu Anwendungen bei der Formulierung von Tabletten, chirurgischen Nähten, Wundverbänden, Schmierpulvern, Blutgefäßen, Gewebestützen, chirurgischen Implantaten zur Verbindung röhrenförmiger Körperteile, Platten zur Fixierung gebrochener Knochen und anderen orthopädischen Anwendungen, wie sie in WO 98/51812 von Metabolix beschrieben werden. Die vielleicht am weitesten fortgeschrittene medizinische Entwicklung ist der Einsatz von PHB und PHBV zur Herstellung eines porösen, bioresorbierbaren, flexiblen Bogens zur Trennung von Geweben und zur Stimulation der Geweberegeneration in verletztem weichem Gewebe, der in der Europäischen Patentanmeldung 754 467 A1 an Bowald, S. und Johansson-Ruden, G., eingereicht am 26. Juni 1988, und EP 0349505 A2 beschrieben wird. Jüngere Berichte haben auch den Einsatz von PHBV für die Aufrechterhaltung des Zellwachstums beschrieben (Rivard, C.H. et al., J. Appl. Biomat. 6: 65–68 (1995)).
Neben der Biokompatibilität ist es oft erwünscht, dass sich eine implantierte medizinische Vorrichtung zersetzt, nachdem sie ihre primäre Funktion ausgeübt hat. PHB und PHBV, die einzigen PHAs, die bis jetzt als medizinische Implantate getestet wurden, weisen in vivo sehr lange Abbauzeiten, für PHB von mehr als einem Jahr, auf (Duvernoy, O., Malm et al., Thorac. Cardiovasc. Surgeon (1995) 43: 271–74, Malm et al., C., J. Thorac. Cardiovasc. Surg. (1992) 104: 600–607). Für viele Anwendungen ist diese sehr lange Abbauzeit unerwünscht, da die Persistenz eines Polymers am Ort einer Heilung zu einer chronischen Entzündungsreaktion beim Patienten führen kann. Für sich langsam abbauende PHB-Patche, die zur Regenerierung von Arteriengewebe eingesetzt werden, hat sich gezeigt, dass sie eine langfristige (länger als zwei Jahre) Makrophagenreaktion hervorrufen (Malm et al., Eur. Surg. Res. 1994, 26: 298–308). Für Makrophagen wurde gefunden, dass sie am Abbau der PHB-Implantate beteiligt sind, und diese langfristige Makrophagenreaktion zeigt offenbar das Vorliegen eines persistenten, sich langsam abbauenden teilchenförmigen Materials an, das aus dem Implantat stammt. Tatsächlich wurde, obwohl ein PHB-Patch, der für die Reparatur des Perikards eingesetzt worden war, nach 12-monatiger Implantation mittels normaler Lichtmikroskopie nicht gesehen wurde, kleines restliches teilchenförmiges Material mittels Polarisationslichtmikroskopie gefunden (Malm et al., C., Scand. J. Thor. Cardiovasc. Surg. 1992, 26: 9–14). Es ist nicht klar, ob dieses teilchenförmige Material am Ort des Implantats verbleibt, oder ob es durch den ganzen Körper wandern und unvorhergesehene Komplikationen verursachen könnte. Das biologische Schicksal oder die medizinischen Auswirkungen dieses teilchenförmigen Materials können ohne eine Langzeitstudie nicht vorhergesagt werden. Zur Minimierung von potenziellen, mit sich langsam abbauenden PHAs assoziierten Problemen ist es vorteilhaft, resorbierbare Materialien mit schnelleren In-vivo-Abbaugeschwindigkeiten zu verwenden.
DE-A-3 937 649 offenbart Poly(4-hydroxybutyrat) und andere PHAs und aus PHAs hergestellte chirurgische Abdeckungen.
EP-A-0 754 469 offenbart einen porösen, biologisch resorbierbaren Bogen aus PHB oder PHBV.
Es gibt bisher nur einen Bericht, der die Biokompatibilität oder den In-vivo-Abbau irgendeines anderen PHA-Polymers in biomedizinischen Anwendungen beschreibt (WO 98/51812). Das US-Patent Nr. 5 334 698 an Witholt, B. und Lageveen, R.G. erwähnt medizinische, aus einem optisch aktiven, aus Zellen von Pseudomonas oleovorans isolierten Polyester hergestellte Gegenstände, aber es werden keine Beispiele für die Herstellung oder die Testung auf Biokompatibilität zitiert, und es werden keine Verfahren zur Gewinnung des Polymers in einer für eine medizinische Verwendung in vivo zweckmäßigen reinen Form bereitgestellt. Da Bakterien zur Herstellung eingesetzt werden, können diese Polymere auch ein Endotoxin sowie andere Entzündungsmediatoren erzeugen, und es ist wichtig, dass das Polymer zur Entfernung dieser Verunreinigungen bearbeitet wird.
Bei vielen Anwendungen ist die Geschwindigkeit des biologischen Abbaus von PHA gut für die erforderliche Lebensdauer des Produkts geeignet. In bestimmten Fällen wäre es jedoch erwünscht, eine bessere Kontrolle über die Geschwindigkeit, mit der sich Polymere in der Umwelt zersetzen, ausüben zu können. Eine derartige Kontrolle würde den Anwendungsbereich für diese Polymerklasse erweitern. Zum Beispiel kann es sein, dass eine PHA-Folie mechanische Eigenschaften hat, die sie für eine Anwendung als Mulchfolie geeignet machen, aber keine für die Anwendung optimale Abbaugeschwindigkeit. Die Fähigkeit zur Steuerung der Abbaugeschwindigkeit des Polymers in der Umwelt wäre somit ein ausgesprochener Vorteil.
Somit ist der Einsatz von Polyhydroxyalkanoaten, obwohl sie einen breiten Bereich mechanischer Eigenschaften, die potenziell für medizinische Anwendungen nützlich sind, bieten, insbesondere als resorbierbare Polymere in vivo bisher durch ihre langsame Hydrolyse eingeschränkt gewesen. Es wäre deshalb erwünscht, Verfahren zur Steuerung der Abbaugeschwindigkeiten von Polyhydroxyalkanoaten bereitzustellen.
Es ist deshalb ein Ziel dieser Erfindung, Verfahren zur Steuerung der Abbaugeschwindigkeiten von Polyhydroxyalkanoaten bereitzustellen.
Es ist ein weiteres Ziel dieser Erfindung, neue Zusammensetzungen bereitzustellen, die Polyhydroxyalkanoate umfassen oder sich von diesen ableiten und sich in der Umwelt und/oder in vivo leichter zersetzen.
Es ist noch ein weiteres Ziel dieser Erfindung, Verfahren zur Fabrikation von Gegenständen und Vorrichtungen aus diesen Zusammensetzungen bereitzustellen.
Zusammenfassung der Erfindung
Es sind biokompatible, poröse medizinische Implantate, die ein Poly(4-hydroxybutyrat)-Homopolymer umfassen, entwickelt worden. Verfahren zur Herstellung der Vorrichtungen, die die Porosität oder die exponierte Oberfläche erhöhen, können zur Veränderung der Abbaubarkeit eingesetzt werden. Zum Beispiel kann, wie durch die Beispiele gezeigt wird, poröses Poly(4HB) mittels Verfahren hergestellt werden, die Poren, Hohlräume oder Zwischenräume erzeugen, wie eine Emulsions- oder Sprühtrocknungstechnik, oder die auslaugbare oder lyophilisierbare Teilchen in das Polymer inkorporieren. Beispiele beschreiben Poly(4HB)-Zusammensetzungen einschließlich von Schaumstoffen, Beschichtungen, Netzen und Mikroteilchen. Wie durch die Beispiele gezeigt wird, haben diese Polyhydroxyalkanoatzusammensetzungen extrem günstige mechanische Eigenschaften, und sie sind biokompatibel und zersetzen sich unter physiologischen Bedingungen innerhalb des gewünschten Zeitraums. Diese Polyhydroxyalkanoatmaterialien stellen einen breiteren Bereich an Polyhydroxyalkanoat-Abbaugeschwindigkeiten bereit, als sie derzeit verfügbar sind.
Verfahren zur Verarbeitung dieser Materialien, insbesondere für therapeutische, prophylaktische oder diagnostische Anwendungen oder zu Vorrichtungen, die implantiert oder injiziert werden können, werden ebenfalls beschrieben.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 ist eine schematische Darstellung von PHA-Biopolymeren, die in Abhängigkeit von der Länge der anhängenden Gruppen und ihrer jeweiligen Biosynthesewege grob in Gruppen eingeteilt sind.
2a ist eine schematische Darstellung der Wege, über die PHAs mit kurzen anhängenden Gruppen erhalten werden.
2b ist eine schematische Darstellung der Wege, über die PHAs mit langen anhängenden Gruppen erhalten werden.
3 ist eine graphische Darstellung des Abbaus von P4HB in vivo in Abhängigkeit von der Zeit (Wochen).
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
I. PHA-Zusammensetzungen
Polymerzusammensetzungen
So, wie der Begriff hier verwendet wird, enthalten „PHA-Materialien" eine oder mehrere Einheit(en), zum Beispiel zwischen 10 und 100 000, und vorzugsweise zwischen 100 und 30 000 Einheiten mit der Formel I: -OCR¹R²(CR³R⁴)_nCO-, wobei n eine ganze Zahl ist, zum Beispiel zwischen 1 und 15, und bei einer bevorzugten Ausführungsform zwischen 1 und 4, und
wobei R¹, R², R³ und R⁴ unabhängig voneinander Kohlenwasserstoffgruppen, einschließlich langkettiger Kohlenwasserstoffgruppen, halogen- und hydroxysubstituierte Gruppen, Hydroxygruppen, Halogengruppen, stickstoffsubstituierte Gruppen, sauerstoffsubstituierte Gruppen und/oder Wasserstoffatome sein können.
So, wie sie hier verwendet wird, ist die Formel -(CR³R⁴)_n- so definiert, dass sie die folgenden Formeln einschließt: -CR³R⁴- (wobei n = 1); -CR³R⁴CR^3'R^4'- (wobei n = 2) und -CR³R⁴CR^3'R^4'CR^3''R^4''- (wobei n = 3),wobei R³, R⁴, R^3', R^4', R^3'' und R^4'' unabhängig voneinander Kohlenwasserstoffgruppen, einschließlich langkettiger Kohlenwasserstoffgruppen, halogen- und hydroxysubstituierte Gruppen, Hydroxygruppen, Halogengruppen, stickstoffsubstituierte Gruppen, sauerstoffsubstituierte Gruppen und/oder Wasserstoffatome sein können. Somit schließt die Formel I Einheiten ein, die von 3-Hydroxysäuren (n = 1), 4-Hydroxysäuren (n = 2) und 5-Hydroxysäuren (n = 3) abgeleitet sind.
Diese Einheiten können in einem Homopolymer die gleichen sein, oder sie können unterschiedliche Einheiten sein, wie in einem Copolymer oder Terpolymer. Die Polymere haben typischerweise ein Molekulargewicht von über 300, zum Beispiel zwischen 300 und 10⁷, und bei einer bevorzugten Ausführungsform von 10 000 bis 10 000 000 Dalton.
PHA-Materialien können andere Moleküle enthalten oder so modifiziert sein, dass sie andere Moleküle enthalten, wie biologisch aktive und nachweisbare Verbindungen, oberflächenaktive Mittel, andere abbaubare oder nicht abbaubare Polymere sowie Materialien, die zur Modifizierung der mechanischen Eigenschaften von PHAs eingesetzt werden, wie Weichmacher, Füllstoffe, Nukleierungsmittel, Farbstoffe, Stabilisatoren, Modifikatoren und Bindemittel.
PHB und P4HB besitzen sehr unterschiedliche physikalische Eigenschaften. Verschiedene 4-Hydroxybutyrat-haltige PHA-Copolymere sind entweder bekannt oder können mit unterschiedlichen Eigenschaften, die zwischen denen von PHB und P4HB liegen, hergestellt werden (Saito, Y. und Doi, Y., Int. J. Biol. Macromol. (1994) 16: 99–104), aber über biomedizinische Anwendungen, eine Testung auf Biokompatibilität und auf einen Abbau von P4HB und seinen Copolymeren in vivo ist nicht berichtet worden. PHA-Copolymere aus 4HB und 3HB, deren Zusammensetzung von 0 bis 100 % 4HB variiert, sind in Alcaligenes eutrophus erzeugt worden (Nakamura, S., Doi, Y. und Scandola, M., Macromolecules (1992) 25: 4237–4231), und solche, die von 64 bis 100 % 4HB variieren, in Comamonas acidovorans (Saito, Y. und Doi, Y., Int. J. Biol. Macromol. (1994) 16: 99–104), aber diese Polymere hatten im Vergleich zu der in rekombinanten E. coli erzeugten Molekülmasse (über 5 × 105 g/mol, bestimmt mittels GPC) eine bescheidene Molekülmasse (1 × 10⁵ bis 5 × 10⁵ g/mol, GPC).
Die PHA-Biopolymere können in Abhängigkeit von der Länge ihrer anhängenden Gruppen und der jeweiligen Biosynthesewege grob in drei Gruppen eingeteilt werden (1). Diejenigen mit kurzen anhängenden Gruppen, wie Polyhydroxybutyrat (PHB), ein Homopolymer von R-3-Hydroxybuttersäure (R-3HB)-Einheiten, sind hochkristalline, thermoplastische Materialien und schon am längsten bekannt (Lemoigne, M. und Roukhelman, N., Annales des fermentations 5: 527–536 (1925)). Von einer zweiten Gruppe von PHAs, die die kurzen R-3HB-Einheiten zufällig polymerisiert mit viel längeren anhängenden Gruppen aus Hydroxysäureeinheiten enthalten, wurde erstmals in den frühen 1970er Jahren berichtet (Wallen, L.L und Rohwedder, W.K., Environ. Sci. Technol. 8: 576–579 (1974)). Verschiedene Mikroorganismen, die spezifisch Copolymere von R-3HB mit diesen längeren anhängenden Gruppen aus Hydroxysäureeinheiten produzieren, sind ebenfalls bekannt und gehören zu dieser zweiten Gruppe (Steinbüchel, A. und Wiese, S., Appl. Microbiol. Biotechnol. 37: 691–697 (1992)). In den frühen 80er Jahren identifizierte eine Forschergruppe in den Niederlanden eine dritte Gruppe von PHAs, die vorwiegend längere anhängende Gruppen aus Hydroxysäuren enthalten (De Smet, M.J. et al., J. Bacteriol. 154: 870–878 (1983)).
Die PHA-Polymere können bis zu 90 % des Zelltrockengewichts von Bakterien ausmachen, und sie finden sich als einzelne Körnchen im Inneren der Bakterienzellen. Diese PHA-Körnchen akkumulieren als Reaktion auf einen Nährstoffmangel und dienen als Reservematerialien für Kohlenstoff und Energie. Von Mikroorganismen werden unterschiedliche Wege zur Erzeugung jeder dieser Polymergruppen eingesetzt. Einer dieser Wege, der zu den Polyhydroxyalkanoaten mit kurzen anhängenden Gruppen („short pendant group polyhydroxyalkanoates", SPGPHAs) führt, umfasst drei Enzyme, nämlich die Thiolase, die Reduktase und die PHB-Synthase (manchmal als Polymerase bezeichnet). Über diesen Weg wird das Homopolymer PHB durch die Kondensation von zwei Molekülen Acetyl-Coenzym-A unter Bildung von Acetoacetyl-Coenzym-A, gefolgt von der Reduktion dieses Zwischenprodukts zu R-3-Hydroxybutyryl-Coenzym-A und der nachfolgenden Polymerisation, synthetisiert (2a). Das letzte Enzym in diesem Weg, die Synthase, hat eine Substratspezifität, die monomere C3-C5-Einheiten, einschließlich von R-4-Hydroxysäure- und R-5-Hydroxysäureeinheiten, umsetzen kann. Dieser Biosyntheseweg findet sich zum Beispiel in den Bakterien Zoogloea ramigera und Alcaligenes eutrophus. Der Biosyntheseweg, der zur Bildung der dritten Gruppe der PHAs, der Polyhydroxyalkanoate mit langen anhängenden Gruppen („long pendant group PHAs", LPGPHAs) eingesetzt wird, ist zum Teil noch unbekannt, aber es wird derzeit angenommen, dass die monomeren Hydroxyacyleinheiten, die zu den LPGPHAs führen, aus der β-Oxidation von Fettsäuren und dem Fettsäureweg stammen (2b). Die R-3-Hydroxyacyl-Coenzym-Substrate, die aus diesen Wegen hervorgehen, werden dann durch PHA-Synthasen (manchmal als Polymerasen bezeichnet), die Substratspezifitäten haben, die die größeren monomeren Einheiten im C6-C14-Bereich bevorzugen, polymerisiert. PHAs mit langen anhängenden Gruppen werden zum Beispiel von Pseudomonaden erzeugt.
Vermutlich setzt die zweite Gruppe von PHAs, die Monomere sowohl aus kurzen R-3HB-Einheiten als auch solchen mit längeren anhängenden Gruppen enthalten, beide der in den 2a und 2b beschriebenen Wege zur Bereitstellung der Hydroxysäuremonomere ein. Die letzteren werden dann von PHA-Synthasen, die imstande sind, diese Einheiten zu akzeptieren, polymerisiert.
Insgesamt sind bis jetzt ungefähr 100 unterschiedliche Typen von Hydroxysäuren durch Fermentierungsverfahren in PHAs inkorporiert worden (Steinbüchel, A. und Valentin, H.E., FEMS Microbiol. Lett. 128:219–228 (1995)). Insbesondere gehören dazu PHAs, die funktionalisierte anhängende Gruppen, wie Ester, Doppelbindungen, Alkoxygruppen, aromatische Gruppen, Halogene und Hydroxygruppen, enthalten.
P4HB ist biokompatibel, resorbierbar, verarbeitbar, stabil und geschmeidig. Die Beibehaltung der Reißfestigkeit ist ein weiterer sehr wichtiger Parameter für Naht- und Klammermaterialien, insbesondere von resorbierbaren. Da resorbierbare Materialien in vivo abgebaut werden, ändern sich ihre physikalischen und mechanischen Eigenschaften als Folge dieses Abbaus. Zum Beispiel wird eine resorbierbare Naht den größten Teil ihrer Reißfestigkeit, und somit ihrer Fähigkeit zur Fixierung von Gewebe, innerhalb eines Zeitraums verlieren, der kürzer als die für ihre vollständige Resorption erforderliche Zeit ist. PGA-Nähte, zum Beispiel, verlieren ihre Stabilität in vivo zum großen Teil innerhalb von drei Wochen (Vet. Surg. 21, 192: 355–61), sind aber nicht vor sechs Wochen vollständig resorbiert. Dieser Verlust der mechanischen Stabilität resultiert aus der Abnahme der Molekülmasse des Polymers. Es ist wichtig festzuhalten, dass verschiedene Parameter die Resorptionsgeschwindigkeiten und Reißfestigkeiten von Nähten in vivo beeinflussen, wie der Gewebetyp, mechanische Beanspruchungen, das Vorliegen von Infektionen etc.
Die Beispiele zeigen, dass die Geschwindigkeit des Abbaus von P4HB in vivo im Vergleich zu der anderer PHAs hoch ist, aber seine Resorptionsgeschwindigkeit ist langsamer als die von vielen der Materialien, die als resorbierbare Nähte verwendet werden. Außerdem behalten, wie in der Tabelle 7 gezeigt ist, P4HB-Implantate ihre Molekülmasse während des Resorptionsprozesses bei. Für diese Beibehaltung der Molekülmasse wird erwartet, dass sie sich vorteilhaft auf die Aufrechterhaltung der mechanischen Eigenschaften und die Reißfestigkeit der als Materialien zur Schließung von Wunden verwendeten PHAs auswirkt. Aufgrund ihrer ausgezeichneten mechanischen Eigenschaften, der Beibehaltung einer großen Molekülmasse, der Verarbeitbarkeit, der Biokompatibilität und der Resorbierbarkeit sollte P4HB als resorbierbares Material für das Verschließen von Wunden, wie Naht- und Klammermaterialien, nützlich sein, insbesondere, wenn es wie hier zur Erhöhung seiner Abbaugeschwindigkeiten modifiziert ist.
Quellen für PHAs
In der Mitte der 1980er Jahre waren mehrere Forschergruppen intensiv damit beschäftigt, die für die PHA-Synthese verantwortlichen Gene und Genprodukte zu identifizieren und isolieren. Diese Anstrengungen haben zur Entwicklung von transgenen Systemen zur Erzeugung von PHAs sowohl in Mikroorganismen als auch Pflanzen sowie zu enzymatischen Verfahren der PHA-Synthese geführt. Solche Wege könnten die Zahl der verfügbaren PHA-Typen weiter erhöhen. Diese Fortschritte wurden in Reviews beschrieben (Williams & Peoples, CHEMTECH 26: 38–44 (1996) und Williams & Peoples, Chem. Br. 33: 29–32 (1997)).
Die Identifizierung, Klonierung und Expression der an der Biosynthese von PHAs beteiligten Gene verschiedener Mikroorganismen in rekombinanten Organismen ermöglichen die Herstellung von PHAs in Organismen, die von Haus aus kein PHA erzeugen. Solche rekombinanten Organismen ermöglichen den Forschern eine bessere Kontrolle über den Prozess der PHA-Produktion, da sie frei von Hintergrund-Enzymaktivitäten für die Biosynthese unerwünschter PHA-Vorläufer oder für den Abbau des PHA sind. Außerdem kann die geeignete Wahl eines rekombinanten Organismus die Reinigung des erzeugten PHA erleichtern oder eine verbesserte Biokompatibilität von diesem ermöglichen.
Die Minimalanforderungen an die Synthese von PHA in einem rekombinanten Organismus sind eine Quelle für Hydroxyalkanoyl-CoA und eine geeignete PHA-Synthase (Gerngross, T.U. und Martin, D.P., Proc. Natl. Acad. Sci. (1995) 92: 6279–6283). Rekombinante PHA-Produzenten benötigen somit einen Biosyntheseweg für ein Hydroxyalkanoyl-CoA-Monomer und eine geeignete PHA-Synthase. Die Erzeugung eines Homopolymers erfordert, dass der Organismus nur ein geeignetes Substrat für die PHA-Synthase bildet, da die Bildung multipler Substrate zur Bildung eines PHA-Copolymers führt. Rekombinante Organismen, die ein für eine PHA-Synthase codierendes Transgen enthalten, reichen für die Herstellung von P4HB aus.
In Abwesenheit von Abbauwegen für PHAs kann die Molekülmasse des in rekombinanten Organismen akkumulierten PHA sehr hoch sein. Für in rekombinanten E. coli erzeugtes PHB wurde berichtet, dass es eine Molekülmasse von 4 × 10⁶ g/mol hat (Sim, S.J., Snell, K.D., Hogan, S.A., Stubbe, J., Rha, C. und Sinskey, A., Nature Biotech. (1997) 15: 63–67). Die Molekülmasse ist für die Steuerung der physikalischen Eigenschaften des jeweiligen PHA wichtig, da die erhöhte Molekülmasse in rekombinanten Organismen erzeugter PHAs zu verbesserten Materialeigenschaften führen kann, wie einer erhöhten Zugfestigkeit und Dehnung beim Reißen (Kusaka, S., Iwata, T. und Doi, Y., J.M.S. Pure Appl. Chem. (1998) A35: 319–335).
Die Biosynthese von P3HB-co-4HB mit einem niedrigen 4HB-Gehalt (1,5 %) ist für rekombinante E. coli beschrieben worden (Valentin, H.E., Dennis, D., J. Biotech. 1997, 58: 33–38). Es ist bemerkenswert, dass die Molekülmassen dieser PHAs sehr hoch waren (über 1 × 10⁶ g/mol). Außerdem ist die Biosynthese des P3HB-co-4HB und des Homopolymers P4HB in rekombinanten E. coli beschrieben worden (Hein et al., FEMS Microbiol. Lett. 1997, 153: 411–418).
Die biologische Produktion von P4HB hat gegenüber herkömmlichen Verfahren einer chemischen Synthese gewisse Vorteile. Die chemische Synthese von P4HB mit hoher Molekülmasse (über 1 × 105 g/mol) ist aufgrund der Neigung der freien Säure, unter Bildung des relativ spannungsarmen und kinetisch begünstigten fünfgliedrigen Rings zu lactonisieren, schwierig. Somit ist eine Polykondensation von 4-Hydroxybuttersäure schwer zu erreichen, während das Material, dass aus den Reaktionen der Ringöffnungspolymerisation von γ-Butyrolacton bei hohem Druck resultiert, eine sehr niedrige Molekülmasse hat (Korte, F. und Gelt, W., Polymer Lett. 1966, 4, 685) und schlechte mechanische Eigenschaften aufweisen würde. Eine alternative Strategie für die Synthese von P4HB, die über freie Radikale verlaufende Ringöffnungspolymerisation von 2-Methylendioxolan, führt zu einem Copolymer, das ringgeöffnete und nicht geöffnete Einheiten enthält (Bailey et al., J. Polym. Sci. Polym. Chem. (1982) 20: 3021–30, Bailey, W., J. Polym. Preprints 25: 210–11). 4HB wurde erfolgreich mit 3HB über eine Ringöffnungspolymerisation copolymerisiert (Hori, Y., Yamaguchi, A. und Hagiwara, T., Polymer 1996, 36: 4703–4705), aber das Molekulargewicht der Copolymere war bescheiden (unter 1 × 10⁵ g/mol), insbesondere für Zusammensetzungen mit mehr als 80 4HB (unter 2 × 10⁴ g/mol). Außerdem enthalten viele der für die chemische Synthese von Polyestern eingesetzten Katalysatoren toxische Metalle. Diese toxischen Verunreinigungen können bei Verwendung eines biologischen Verfahrens zur Herstellung von PHAs vermieden werden.
II. PHA-Formulierungen mit veränderten Abbaugeschwindigkeiten
Die Abbaugeschwindigkeiten des P4HB können über die Zugabe verschiedener Komponenten zur Polymerzusammensetzung sowie die Wahl der chemischen Zusammensetzung, des Molekulargewichts, der Verarbeitungsbedingungen und der Form des fertigen Polymerprodukts manipuliert werden. Das Erhöhen der Porosität, die Einarbeitung hydrophiler Substanzen und/oder das Vergrößern der gegen Wasser exponierten Oberfläche erhöhen alle die Abbaugeschwindigkeit. Hydrophobe Beschichtungen oder die Inkorporation oder Beimischung hydrophober Substanzen in das bzw. zu dem Polymer erniedrigen die Abbaugeschwindigkeit.
Additive, die die Abbaugeschwindigkeiten verändern
Die Hydrolyse von Polyhydroxyalkanoaten ist bei sauren oder basischen pH-Werten beschleunigt, und somit kann die Einarbeitung eines sauren oder basischen Additivs oder Hilfsstoffs dazu eingesetzt werden, die Abbaugeschwindigkeit von PHAs zu modulieren. Die Hilfsstoffe können in Form von Teilchen zugegeben werden, sie können mit einem beliebigen zugesetzten oder zuzusetzenden Additiv oder Mittel gemischt werden, oder sie können im Polymer gelöst werden.
Zu Additiven, die die Abbaugeschwindigkeit erhöhen, gehören anorganische Säuren wie Ammoniumsulfat und Ammoniumchlorid, organische Säuren wie Citronensäure, Benzoesäuren, Peptide, Ascorbinsäure, anorganische Basen wie Natriumcarbonat, Kaliumcarbonat, Calciumcarbonat, Zinkcarbonat und Zinkhydroxid, und organische Basen wie Protaminsulfat, Spermin, Cholin, Ethanolamin, Diethanolamin und Triethanolamin sowie Tenside wie Tween^TM und Pluronic^TM. Solche Additive werden vorzugsweise in Konzentrationen zwischen 0,1 und 30 Gew.-% eingesetzt.
Die Abbaugeschwindigkeit kann auch durch Additive erhöht werden, die Poren bilden oder auf andere Art die Oberfläche des Polymers erhöhen oder den amorphen Anteil des Polymers erhöhen. Porenbildende Mittel werden generell in Form von Teilchen zugesetzt, und zu ihnen gehören wasserlösliche Verbindungen wie anorganische Salze und Zucker, die durch Auslaugen entfernt werden. Zu geeigneten teilchenförmigen Materialien gehören Salzkristalle, Proteine wie Gelatine und Agarose, Stärken, Polysaccharide wie Alginat und andere Polymere. Die Durchmesser der Teilchen können zweckmäßigerweise von Nanometern bis zu 500 Mikrometern reichen. Sie können auch lyophilisierbar sein. Porenbildende Mittel können in einer Menge zwischen 0,01 und 90 % (Gew./Vol.), vorzugsweise in einem Anteil zwischen einem und dreißig Prozent (Gew./Gew., Polymer) zur Erhöhung der Porenbildung eingearbeitet werden.
Zum Beispiel wird beim Sprühtrocknen oder der Lösemittelverdampfung zuerst ein porenbildendes Mittel wie ein flüchtiges Salz, zum Beispiel Ammoniumbicarbonat, Ammoniumacetat, Ammoniumchlorid oder Ammoniumbenzoat oder ein anderes lyophilisierbares Salz, in Wasser gelöst. Die das porenbildende Mittel enthaltende Lösung wird dann mit der Polymerlösung emulgiert, um Tröpfchen des porenbildenden Mittels im Polymer zu erzeugen. Diese Emulsion wird dann sprühgetrocknet oder einem Prozess einer Lösemittelverdampfung/Extraktion unterzogen. Nach dem Ausfällen des Polymers werden die gehärteten Mikroteilchen eingefroren und zur Entfernung des porenbildenden Mittels lyophilisiert. Weichmacher, wie die Citratester, und andere Polymere, wie ataktische Polyhydroxyalkanoate, können zur Erhöhung amorphen Charakters des Polymers zugesetzt werden.
Zu hydrophoben Beschichtungen oder Materialien, die zur Erhöhung der Abbaugeschwindigkeiten inkorporiert werden können, gehören hydrophobe Verbindungen wie Phospholipide, Cholesterol und andere Polymere sowie Tenside. Diese Materialien und Verfahren zur Bildung von Beschichtungen oder die Inkorporation in die Materialien werden beschrieben in WO 96/18420 von Bracco Research SA, WO 92/18164 von Delta Biotechnology Ltd., WO 95/03356 des Massachusetts Institute of Technology, PCT/US97/03007 von Acusphere, im US-Patent Nr. 5 271 961 an Mathiowitz et al., im US-Patent Nr. 5 711 933 an Bichon et al. und im US-Patent Nr. 5 705 187 an Unger. Spezifische Beispiele offenbaren Fettsäuren und Phospholipide als Emulgatoren zur Stabilisierung der Ölphase in der wässrigen Phase während des Vorgangs der Emulgierung/Verkapselung mit dem Ergebnis, dass die Mikrokügelchen mit einer Tensidschicht überzogen werden. Die Verwendung von Additiven wie Fetten, Wachsen und hochmolekularen Kohlenwasserstoffen zur Hydrophobisierung der Polymerwände und für eine langsame Wasserpenetration wird ebenfalls offenbart.
III. Verfahren zur Herstellung medizinischer Vorrichtungen
4HB ist für die Herstellung einer Vielzahl poröser, biologisch abbaubarer medizinischer Vorrichtungen nützlich. Wenn von Pyrogenen befreite PHAs in den Körper implantiert werden, bewirken diese Materialien eine sehr geringe, oder gar keine, akute Entzündungsreaktion oder sonstige schädliche Gewebsreaktion. Es gibt keine signifikante Entzündungsreaktion oder Bildung von Narbengewebe. Die Rekrutierung von Entzündungszellen ist minimal. Die histologische Untersuchung der explantierten Vorrichtungen zeigt, dass die Materialien im Wesentlichen inert sind. Demgemäß können aus PHAs konstruierte Vorrichtungen mit minimalen schädlichen Nebenwirkungen auf das umgebende Gewebe implantiert werden. Die Freisetzung der Hydroxysäureabbauprodukte aus den implantierten Materialien ist typischerweise langsam und wird vom Körper gut vertragen. Somit wird für PHAs erwartet, dass sie ihre Materialeigenschaften über Monate beibehalten und sich schließlich zu untoxischen Materialien zersetzen.
Aus PHA hergestellte Vorrichtungen können für eine Vielzahl unterschiedlicher medizinischer Anwendungen eingesetzt werden. Beispiele für derartige Anwendungen sind die verzögerte Freisetzung, die Arzneimittelzufuhr, Gerüste für ein Gewebeengineering, die Zellverkapselung, die gezielte Zuführung, biokompatible Beschichtungen, biokompatible Implantate, die gelenkte Gewebsregeneration, Wundverbände, orthopädische Vorrichtungen, Prothesen und Knochenzemente (einschließlich von Klebstoffen und/oder strukturellen Füllstoffen) sowie Diagnostika.
Das PHA kann ein beliebiges aus einer Vielzahl therapeutischer, prophylaktischer oder diagnostischer Mittel verkapseln, mit ihm gemischt oder ionisch oder kovalent an es gekoppelt werden. Es kann eine große Vielzahl biologisch aktiver Materialien verkapselt oder inkorporiert werden, entweder für die Zufuhr zu einer bestimmten Stelle durch das Polyhydroxyalkanoat, oder um ihm die Eigenschaften des Polymers, wie Bioadhäsivität, Zellanheftung, Verstärkung des Zellwachstums, Hemmung des Wachstums von Bakterien und Verhinderung der Bildung von Gerinnseln, zu verleihen.
Beispiele für geeignete therapeutische und prophylaktische Mittel sind synthetische anorganische und organische Verbindungen, Proteine und Peptide, Polysaccharide und andere Zucker, Lipide und DNA- und RNA-Nukleinsäuresequenzen mit therapeutischen, prophylaktischen oder diagnostischen Aktivitäten. Zu Nukleinsäuresequenzen gehören Gene, Antisense-Moleküle, die an komplementäre DNA binden, zur Hemmung der Transkription sowie Ribozyme. Es können Verbindungen mit einem breiten Bereich an Molekulargewichten, zum Beispiel zwischen 100 und 500 000 Gramm oder mehr pro Mol, verkapselt werden. Beispiele für geeignete Materialien sind Proteine, wie Antikörper, Rezeptorliganden und Enzyme, Peptide, wie Adhäsionspeptide, Saccharide und Polysaccharide, synthetische organische oder anorganische Arzneimittel und Nukleinsäuren. Beispiele für Materialien, die verkapselt werden können, sind Enzyme, Gerinnungsfaktoren, Inhibitoren oder Mittel zur Auflösung von Gerinnseln, wie die Streptokinase und der Gewebe-Plasminogenaktivator, Antigene für eine Immunisierung, Hormone und Wachstumsfaktoren, Polysaccharide wie Heparin, Oligonukleotide, wie Antisense-Oligonukleotide, und Ribozyme und retrovirale Vektoren für den Einsatz in der Gentherapie. Das Polymer kann auch zur Verkapselung von Zellen und Geweben verwendet werden. Repräsentative diagnostische Mittel sind Mittel, die durch Röntgen, Fluoreszenz, Magnetresonanz-Imaging, Radioaktivität, Ultraschall, Computertomographie (CT) und Positronenemissionstomographie (PET) nachweisbar sind. Diagnostische Ultraschallmittel sind typischerweise Gase wie Luft und Sauerstoff oder Perfluorkohlenstoffe.
Im Falle einer verzögerten Freisetzung können viele verschiedene biologisch aktive Verbindungen in eine Vorrichtung für eine verzögerte Freisetzung inkorporiert werden. Zu ihnen gehören hydrophobe und hydrophile Verbindungen sowie Makromoleküle mit hohem Molekulargewicht, wie Proteine. Die biologisch aktive Verbindung kann in einer prozentualen Beladung zwischen 0,1 und 70 Gew.-%, bevorzugter zwischen 5 und 50 Gew.-%, in das PHA inkorporiert werden. Das PHA kann in fast jeder beliebigen physikalischen Form vorliegen, wie als Pulver, Folie, geformter Gegenstand, Teilchen, Kügelchen, Latex und kristallines oder amorphes Material. Es kann mit weiteren Materialen, die nicht aus PHA bestehen, kombiniert werden, zum Beispiel mit anderen Polymeren. Es ist für den Einsatz in Anwendungen geeignet, die sich langsam abbauende, biokompatible, formbare Materialien erfordern, zum Beispiel in medizinischen Vorrichtungen. Beispiele für medizinische Vorrichtungen, die aus den Polymeren hergestellt werden können, sind Stäbe, Knochenschrauben, Zapfen, chirurgische Nähte, Stents, Vorrichtungen für ein Gewebeengineering, Vorrichtungen für eine Arzneimittelzufuhr, Patche wie Hernia-Patche und Perikard-Patche.
Aus PHA hergestellte abbaubare Implantate können in einer Vielzahl orthopädischer und gefäßbezogener Anwendungen, beim Gewebeengineering, bei der gelenkten Geweberegeneration und in Anwendungen, für die derzeit andere thermoplastische Elastomere eingesetzt werden, verwendet werden (McMillin, Rubber Chem. Technol. 67: 417–46 (1994)). Die Implantate können andere Faktoren zur Stimulierung der Reparatur und der Heilung einschließen. Bevorzugte Vorrichtungen sind Röhren, die für die Passage von Körperflüssigkeiten geeignet sind. Diese Vorrichtungen können mit Faktoren für eine Zellanheftung, Wachstumsfaktoren, Peptiden und Antikörpern und ihren Fragmenten modifiziert werden.
Zu bevorzugten Verfahren für die Herstellung medizinischer Vorrichtungen gehören das Lösemittelgießen, die Schmelzverarbeitung, das Extrudieren, Spritzformen und Formpressen und das Sprühtrocknen. Die Teilchen werden vorzugsweise direkt aus einem auf einer Fermentation basierenden Prozess präpariert oder über eine Technik der Lösemittelverdampfung, eine Doppelemulsionstechnik oder eine Mikrofluidisierung unter Einsatz von Verfahren, die in diesem Gebiet zur Verfügung stehen (Koosha, F., Dissertation, 1989, Univ. Nottingham, GB, Diss. Abstr. Int. 8 51: 1206 (1990), Bruhn, B.W. und Müller, B.W., Proceed. Intern. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 18: 668–69 (1991), Conti, B. et al., J. Microencapsulation 5: 153–166 (1992), Ogawa, Y. et al., Chem. Pharm. Bull. 36: 1095–103 (1988), Mathiowitz, E. und Langer, R. „Polyanhydride microspheres as drug delivery systems", M. Donbrow, Hrsg., in „Microcapsules Nanopart. Med. Pharm.", CRC, Boca Raton, Florida, 1992, Kapitel 5, S. 99–123).
Das PHA kann zu Vorrichtungen verarbeitet werden, die für eine Wundheilung geeignet sind. Zum Beispiel können faserförmige Vliesmaterialien für diesen Zweck aus den Polymeren hergestellt werden, wobei zuerst Polymerfasern erzeugt werden, indem die Polymere unter Einsatz von Verfahren, die Fachleuten auf diesem Gebiet bekannt sind, durch einen perforierten Auslass gepresst werden. Die Fasern können dann zu einer porösen Membran (einem Tuch) verarbeitet werden, indem man sie auf einem festen Träger ausbreitet und sie einem Druckformen unterzieht. Die Dicke der Vorrichtung liegt vorzugsweise unter 500 μm. Die Wundheilungsvorrichtung kann auch hergestellt werden, indem eine Folie oder Membran zur Erzielung einer Porosität mit einem Laser perforiert wird, oder durch den Einsatz einer Auslaugtechnik zur Erzeugung eines porösen Materials. Die Porengrößen sollten idealerweise so klein sein, dass Zellen und anderes Gewebematerial ausgeschlossen werden. Die Wundheilungsvorrichtungen können in vivo zur Trennung von Geweben und zur Stimulierung der Gewebsregeneration eingesetzt werden.
Das PHA kann zur Verkapselung von Zellen eingesetzt werden. Über den Einsatz von Verfahren, die Fachleuten auf diesem Gebiet bekannt sind, können die Zellen zunächst vorbeschichtet werden (Maysinger, Reviews in the Neurosciences 6: 15–33 (1995)). Mittels eines Verfahrens zur Teilchenverkapselung, wie der Doppelemulsionstechnik, können die Zellen dann mit dem PHA verkapselt werden (Ogawa et al., Chem. Pharm. Bull. 36: 1095–103 (1988)). Die verkapselten Zellen können dann in vivo implantiert werden.
Das PHA kann mittels einer Vielzahl von Techniken zur Polymerverarbeitung zu Gerüsten für ein Gewebeengineering verarbeitet werden. Zu bevorzugten Verfahren zur Herstellung von Gerüsten aus PHA für ein Gewebeengineering gehören das Lösemittelgießen, das Schmelzverarbeiten, das Verarbeiten/Spinnen/Weben von Fasern, das Extrudieren, Injizieren und Druckformen, das Laminieren und das Lösemittellaugen/Lösemittelgießen. Diese Verfahren sind Fachleuten auf diesem Gebiet bekannt.
Ein bevorzugtes Verfahren zur Herstellung eines PHA-Gerüsts für ein Gewebeengineering beinhaltet die Verwendung eines Extruders, wie eines Brabender-Extruders. Zum Beispiel kann diese Technik dazu eingesetzt werden, extrudierte Röhren in unterschiedlichen Längen und Größen, die für eine Implantation geeignet sind, herzustellen.
Ein weiteres bevorzugtes Verfahren beinhaltet das Herstellen eines PHA-Gerüsts aus Fasern in Form eines Vlieses. Die Fasern können aus der Schmelze oder der Lösung erzeugt und mittels Verfahren, die Fachleuten auf diesem Gebiet bekannt sind, zu Vliesen verarbeitet werden. Die Eigenschaften des Vlieses können durch das Variieren zum Beispiel des PHA-Materials, der Faserabmessungen, der Faserdichte, der Materialdicke, der Faserorientierung und des Verfahrens der Faserverarbeitung maßgeschneidert werden. Die porösen Membranen können, wenn es erwünscht ist, weiterverarbeitet werden. Zum Beispiel können diese Membranen zu hohlen Röhren geformt werden.
Ein weiteres bevorzugtes Verfahren beinhaltet die Schmelz- oder Lösemittelverarbeitung des PHA in einer geeigneten Form und das Perforieren des Materials mittels eines Lasers oder eines anderen Hilfsmittel zur Erzielung der gewünschten Porosität. Ebenfalls bevorzugt werden Verfahren, zu denen das Walzen eines druckgeformten PHA-Bogens zu einer seitlich offenen Röhre und das Verschließen mittels Wärme gehören. Der PHA-Bogen kann gegebenenfalls mit einem anderen Material, wie einem zweiten biologisch abbaubaren Polymer, gewalzt werden. Zum Beispiel könnte das letztere Material ein Vlies aus Polyglycolsäure, Polymilchsäure oder einem Copolymer von Glycol- und Milchsäuren sein. Ein derartiges Verfahren sollte eine laminierte Röhre bereitstellen, die für den Einsatz im Engineering neuer Blutgefäße, von Gängen und Röhren geeignet ist. Das PHA kann auch zur Beschichtung anderer Gerüste für ein Gewebeengineering eingesetzt werden. Derartige Materialien könnten sich von anderen abbaubaren Polymeren ableiten. Die Beschichtung kann, zum Beispiel, mit einer lösemittelbasierten Lösung oder mittels Schmelztechniken oder unter Verwendung eines PHA-Latex durchgeführt werden.
Die hier beschriebenen Vorrichtungen für ein Gewebeengineering können vor der Implantation oder nach der Implantation mit Zellen besät werden. Die Zellen können aus einem gesunden Teil des Spendergewebes gewonnen werden, in vitro mittels Zellkulturtechniken vermehrt und dann entweder vor oder nach der Implantation in ein Gerüst (oder eine Matrix) ausgesät werden. Alternativ können die Zellen aus dem Gewebe eines anderen Spenders oder aus existierenden Zelllinien erhalten werden.
Das PHA kann zur Beschichtung anderer Vorrichtungen und Materialien eingesetzt werden. Solche Beschichtungen können ihre Eigenschaften für medizinische Anwendungen verbessern, indem sie zum Beispiel die Biokompatibilität und die mechanischen Eigenschaften verbessern und indem sie ihr Abbauprofil und das Profil der verzögerten Freisetzung maßschneidern. Das PHA kann mittels der beschriebenen Herstellungsverfahren auf andere Vorrichtungen aufgetragen werden. Die Dicke der Beschichtung kann durch das Verändern des Gewichts oder der Konzentration der aufgetragenen Beschichtung und/oder durch einen Überzug auf die Erfordernisse der jeweiligen Anwendung eingestellt werden.
Das PHA kann mittels einer Vielzahl von Polymerverarbeitungstechniken in Form von Stents hergestellt werden. Zu bevorzugten Verfahren für die Herstellung von PHA-Stents gehören das Lösemittelgießen, die Schmelzverarbeitung, das Verarbeiten/Spinnen von Fasern, das Extrudieren, das Spritzformen und das Druckformen. Derartige Verfahren sind Fachleuten auf diesem Gebiet bekannt.
Vor der Implantation muss ein bioresorbierbarer polymerer Gegenstand zur Vermeidung einer Erkrankung und Infektion des Empfängers sterilisiert werden. Die Sterilisation wird vor dem Besäen einer polymeren Vorrichtung mit Zellen durchgeführt. Eine Hitzesterilisation von PHA-haltigen Gegenständen kann oft nicht durchgeführt werden, da die Wärmebehandlung den Gegenstand deformieren könnte, insbesondere wenn das PHA eine Schmelztemperatur hat, die unter derjenigen liegt, die für die Sterilisationsbehandlung erforderlich ist. Dieses Problem kann durch die Verwendung von kaltem Ethylenoxidgas als Sterilisationsmittel vermieden werden. Die Exposition eines PHA-haltigen Gegenstands gegen Ethylenoxiddämpfe vor der Implantation sterilisiert den Gegenstand und macht ihn für die Implantation geeignet. Während der Sterilisation mit kaltem Ethylenoxidgas behält der PHA-haltige Gegenstand seine Form bei. Dieser Behandlungstyp ist ideal für die Sterilisation geformter oder vorgeformter Gegenstände, bei denen die Form des Gegenstands eine wichtige Rolle für sein richtiges Funktionieren spielt.
Die hier beschrieben Vorrichtungen können systemisch oder lokal verabreicht werden. Das bevorzugte Verfahren zur systemischen Verabreichung der Vorrichtungen ist eine Injektion. Die hier beschriebenen Zusammensetzungen und Verfahren werden anhand der folgenden, nicht einschränkenden Beispiele noch klarer werden.
Beispiel 1: Erzeugung von P4HB in rekombinanten Escherichia coli
Der E.-coli-Stamm MBX1177, ein Abkömmling des Stammes DH5α, der bezüglich seiner Fähigkeit, mit 4-Hydroxybuttersäure (4HB) als einziger Kohlenstoffquelle zu wachsen, selektiert worden war, wurde mit pFS30 transformiert, einem Plasmid, dass die Gene enthält, die für die PHA-Synthase von Ralstonia eutropha, die 4-Hydroxybutyryl-CoA-Transferase von Clostridium kluyveri und die β-Lactamase, die eine Resistenz gegen Ampicillin bewirkt, codieren. Die Synthase und die Transferase sind unter der Kontrolle des trc-Promotors, der in pFS30 durch Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) induzierbar ist. Diese Zellen ließ man zunächst in 100 mL LB (Luria Bouillon, Difco, Detroit, Michigan, 25 g/L) plus 100 μg/mL Ampicillin über Nacht in einem 250-mL-Erienmeyerkolben bei 37°C unter Schütteln mit 200 Upm wachsen. Die gesamte Kultur wurde als Inokulum für die in einem 7-L-Gefäß durchgeführte Fermentation eingesetzt. Die erste Stufe der Fermentation bestand aus dem Wachsenlassen von Biomasse in 5 L LB/Ampicillin bei 37°C unter Rühren mit 800 Upm und einer Begasung mit 1 volumetrischen Volumen Luft/min (vvm). Nach 17 Stunden wurde das Volumen durch die Zugabe von einem Liter Medium auf 6 L eingestellt, so dass das Gesamtvolumen pro Liter enthielt: 2,5 g LB-Pulver, 5 g 4HB als Natriumsalz, 2 g Glucose, 50 mmol Kaliumphosphat (pH 7), 7 g Phosphorsäure, 100 μg Ampicillin und 0,1 mmol IPTG. Zu diesem Zeitpunkt wurde die Temperatur auf 33°C eingestellt, und die Rührgeschwindigkeit wurde auf 400 Upm vermindert. In bestimmten Abständen wurden Glucose und Natrium-4HB zugegeben, wenn der pH deutlich unter bzw. über 7 lag, da die Zugabe von Glucose dazu führte, dass der pH langsam abnahm und die Zugabe von 4HB bewirkte, dass der pH langsam anstieg. Der pH wurde nicht automatisch gesteuert. Die Fermentation lief auf diese Weise weitere 70 Stunden ab, und danach waren insgesamt 34 g/L Glucose und 15 g/L 4HB verfüttert worden. Man ließ die Zellen sich 2 Tage bei 4°C absetzen, und danach wurde die flüssige Phase abgepumpt, und die Zellaufschlämmung wurde in einem Microfluidizer M110-EH von Microfluidics Corporation (Newton, Massachusetts) bei 18 000 psi fluidisiert. Das resultierende Material wurde lyophilisiert und in Tetrahydrofuran (THF, 3 % Gew./Vol. P4HB) unter Erwärmen (60°C) und mechanischem Rühren extrahiert. Der resultierende THF-Extrakt wurde unter Druck durch Glas-Mikrofaserfilter (2,3 μm) und Teflonfilter (2 μm) filtriert. Das Polymer wurde mit dem gleichen Volumen Wasser ausgefällt und lyophilisiert. Das Polymer wurde unter Erwärmen (60°C) wieder in THF gelöst (3 % Gew./Vol. P4HB), und die Lösung wurde durch Glas-Mikrofaserfilter (2,3 μm) und Teflonfilter (2 μm) filtriert und mit Wasser/THF (1:1) ausgefällt. Das Präzipitat wurde mit Wasser/THF (1:1) gewaschen und lyophilisiert, wodurch ein weißer Schaum (20 g) erhalten wurde. Dieses Material wurde als Poly-4-hydroxybutyrat identifiziert, und es wurde in einem Agardiffusionsassay (ISO 10993, Toxicon Corp., Bedford, Massachusetts) gezeigt, dass es nicht zytotoxisch war. Elementaranalyse: C 55,63 %, H 7,41 %, O 37,28 %, N 41 ppm. Die GC-Analyse zeigt, dass nur sehr wenig Lipid im gereinigten Polymer vorhanden ist. Die NMR-Analyse zeigt die erwarteten Peaks und keine Lipide.
Beispiel 2: Erzeugung von Poly(4HB-co-2HB) in rekombinanten Escherichia coli (Referenzbeispiel)
sDie E.-coli-Stämme MBX1177/pFS30 und MBX184 (CGSC6966)/pFS30 wurden in 300 mL LB/Ampicillin in einem Ein-Liter-Erlenmeyerkolben bei 30°C über Nacht unter Schütteln mit 200 Upm vorkultiviert. Zwei 100-mL-Aliquots einer jeden Vorkultur wurden zentrifugiert (2000 × g, 10 Minuten), und die aus jedem dieser Aliquots erhaltenen Zellen wurden in 100 mL eines Mediums resuspendiert, das pro Liter enthielt: 6,25 g LB-Pulver, 2 g Glucose, 50 mmol Kaliumphosphat (pH 7), 100 μg Ampicillin und 100 μmol IPTG. Das Medium enthielt auch 2-Hydroxybuttersäure (2HB) und 4HB. In einem Kolben lagen die Konzentrationen bei 8 g/L 2HB und 2 g/L 4HB, und im anderen lag die Konzentration der beiden Säuren jeweils bei 5 g/L. Beide Säuren wurden den Kolben in Form des Natriumsalzes zugegeben. Die für die Säuren angegebenen Massen schließen nicht die Masse des Natriums ein. Diese vier Kolben (zwei Kolben für jeden Stamm) wurden weitere 48 Stunden unter Schütteln mit 200 Upm bei 30°C inkubiert. Die Zellen wurden durch Zentrifugieren (2000 × g, 10 Minuten) vom Medium abgetrennt, einmal mit Wasser gewaschen, erneut zentrifugiert und lyophilisiert. Es wurde eine gaschromatographische Analyse der lyophilisierten Zellmasse zur Bestimmung des Polymergehalts und der Polymerzusammensetzung durchgeführt, siehe Tabelle 2. Die Gehalte der Zellen und die Zusammensetzungen der erzeugten PHAs sind in der Tabelle 2 angegeben. Wenn das Verhältnis von 2HB zu 4HB 4:1 war, lag der 2HB-Gehalt des Polymers für beide Stämme, wie mittels GC-Analyse bestimmt wurde, bei über 19 Prozent, während bei einem 1:1-Verhältnis von 2HB zu 4HB der 2HB-Gehalt des Polymers in der Gegend um 1 Prozent lag. Das 4HB wurde leichter in das Polymer inkorporiert als das 2HB. Deshalb war, wenn 4HB in einer Konzentration von 2 g/L vorlag, der Gesamtpolymergehalt der Zellen geringer als wenn es in einer Konzentration von 5 g/L vorlag. Die durch MBX184/pFS30 erzeugten Polymere wurden aus den Zellen extrahiert und analysiert. Die lyophilisierte Zellmasse wurde für 2 Stunden bei 37°C in 5 mL Chloroform inkubiert. Die Zelltrümmer wurden durch Zentrifugieren (2000 × g, 5 Minuten) entfernt, und die resultierende Polymerlösung wurde zur Präzipitation tropfenweise zu 50 mL Ethanol gegeben. Das ausgefällte Polymer wurde wie oben durch Zentrifugieren vom Ethanol abgetrennt. Im Falle des 4:1-Verhältnisses von 2HB zu 4HB war es schwierig, das Polymer durch Zentrifugieren vom Ethanol abzutrennen. Es bildete bei der Zugabe zum Ethanol einen Schleier, aber es konnte auch nicht annäherungsweise vollständig durch das Zentrifugieren gewonnen werden, vermutlich weil das Molekulargewicht dieses Polymers ziemlich niedrig war. Das aus dem Kolben mit dem 1:1-Verhältnis von 2HB zu 4HB isolierte Polymer konnte leicht aus dem Ethanol ausgefällt werden, und es wurde nahezu vollständig gewonnen. Eine GC-Analyse dieser extrahierten Proben (Tabelle 2) zeigte, dass der 2HB-Gehalt etwas niedriger war, als wenn die Analyse mit ganzen Zellen durchgeführt wurde. Es ist möglich, dass 2HB-Reste in der Polymerkette während der Extraktion hydrolysiert werden, wodurch der apparente 2HB-Gehalt in den extrahierten Proben erniedrigt wird. Die Tatsache, dass das Molekulargewicht des extrahierten Polymers scheinbar niedriger war, wenn der 2HB-Gehalt höher war, passt zu dieser Erklärung.
Es wurde ein zweites Experiment mit MBX184/pFS30 durchgeführt. Diese Zellen wurden über Nacht in 400 mL LB/Ampicillin in einem Ein-Liter-Erlenmeyerkolben bei 30°C unter Schütteln mit 200 Upm vorkultiviert. Zu jedem Kolben wurden 20 mL Medium zugegeben, so dass das Gesamtvolumen pro Liter enthielt: 2,5 g zusätzliches LB-Pulver, 2 g 4HB als Natriumsalz, 2 g Glucose, 50 mmol Kaliumphosphat (pH 7), 100 μg Ampicillin, 50 μmol IPTG und 2, 4, 6, oder 8 g 2HB als Natriumsalz. Die Kolben wurden für weitere 48 Stunden bei 30°C und 200 Upm inkubiert. Die Zellen wurden durch Zentrifugieren (2000 × g, 10 Minuten) aus dem Medium entfernt, einmal mit Wasser gewaschen, erneut zentrifugiert und lyophilisiert. Die getrocknete Zellmasse wurde wie oben einer GC-Analyse unterzogen. Die Tabelle 3 zeigt den Gehalt der Zellen und die Zusammensetzung der so erhaltenen Polymere. Bei niedrigen 2HB:4HB-Verhältnissen wurde wenig oder kein 2HB in das Polymer inkorporiert, aber wenn dieses Verhältnis bei 3:1 oder 4:1 lag, war die Inkorporation von 2HB in das Polymer sehr signifikant. Der Gesamtpolymergehalt der Zellen war ziemlich niedrig, wahrscheinlich weil die Säuren nicht in Konzentrationen vorlagen, die hoch genug waren, eine schnelle Aufnahme und/oder Inkorporation zu ermöglichen.
Beispiel 3: Erzeugung von Poly(4HB-co-3HB) in rekombinanten E. coli (Referenzbeispiel)
Der Stamm MBX1177/pFS30 wurde in vier separaten 250-mL-Erlenmeyerkolben in 100 mL LB/Ampicillin über Nacht bei 30°C unter Schütteln mit 200 Upm vorkultiviert. Zu jedem Kolben wurden 20 mL Medium zugegeben, so dass das Gesamtvolumen pro Liter enthielt: 2,5 g zusätzliches LB-Pulver, 4 g 4HB als Natriumsalz, 4 g Glucose, 50 mmol Kaliumphosphat (pH 7), 100 μg Ampicillin, 50 μmol IPTG und 0,25, 0,5, 0,75, oder 1 g 3-Hydroxybutyrat (3HB) als Natriumsalz. Die Kolben wurden weitere 48 Stunden bei 30°C und 200 Upm inkubiert. Die Zellen wurden durch Zentrifugieren (2000 × g, 10 Minuten) aus dem Medium entfernt, einmal mit Wasser gewaschen, erneut zentrifugiert und lyophilisiert. Es wurde eine gaschromatographische Analyse mit der lyophilisierten Zellmasse durchgeführt, um den Polymergehalt und die Polymerzusammensetzung zu bestimmen. Der zur Bestimmung der 3-Hydroxybutyrateinheiten im Polymer eingesetzte Standard war Poly(3-hydroxybutyrat). Die Gehalte der Zellen und die Zusammensetzungen der erzeugten PHAs sind in der Tabelle 4 angegeben. Mit der Abnahme des 4HB:3HB-Verhältnis im Medium nahm der 3HB-Gehalt des Polymers auf monotone Weise zu, während der Gesamtpolymergehalt der Zellen in allen Ansätzen ähnlich war. Das bedeutet, dass die Zusammensetzung des Mediums dazu herangezogen werden kann, die Zusammensetzung des Copolymers auf vorhersagbare Weise zu steuern, ohne das die Gesamtausbeute an Polymer signifikant beeinflusst wird. Das Polymer wurde aus dem Rückstand der lyophilisierten Zellmasse extrahiert. Für alle Proben wurde die lyophilisierte Zellmasse mit ungefähr dem Dreifachen ihres Volumens an 1,2-Dichlorethan gemischt und unter sanftem Schütteln 6 Stunden bei 37°C in einem geschlossenen Röhrchen inkubiert. Der feste Anteil wurde durch Zentrifugieren (2000 × g, 10 Minuten) von der Polymerlösung abgetrennt. Die resultierende Lösung wurde tropfenweise zu dem ungefähr 10-fachen ihres Volumens an Ethanol gegeben, und man ließ das ausgefällte Polymer sich aus der Lösung absetzen. Der Überstand wurde abgegossen, und das verbliebene nasse Polymer ließ man stehen, bis es trocken zu sein schien, und dann wurde es durch Lyophilisieren vollständig getrocknet. Die thermischen Eigenschaften dieser P4HB-co-3HB-Zusammensetzungen sind in der Tabelle 5 gezeigt.
Beispiel 4: Abbau von P4HB in vitro und in vivo
Der Abbau von PHB wurde in vitro und in vivo untersucht. Es wurden drei verschiedene Konfigurationen mit unterschiedlicher Porosität (0, 50 und 80 % Porosität) untersucht. Kleine Scheiben (Durchmesser 5 mm) wurden aus druckgeformten P4HB-Folien einheitlicher Dicke gestanzt. Die porösen P4HB-Proben wurden mittels der unten beschriebenen Salzauslaugungstechnik hergestellt. Das Abbauverhalten in vitro wurde durch das Inkubieren der Scheiben in einem sterilen Phosphatpuffer (8 mM Natriumphosphat, 2 mM Kaliumphosphat, 140 mM NaCl, 10 mM KCl, pH 7,4, mit NaN₃ als Konservierungsmittel) bei 37°C untersucht.
Das Abbauverhalten in vivo wurde an Ratten nach der Implantation in subkutane Taschen untersucht.
Präparation von porösem P4HB Natriumchloridkristalle definierter Größe (80–180 μm) wurden mit schmelzflüssigem P4HB gemischt. Das Verhältnis Polymer zu Salz kann zur Erzielung der gewünschten Porosität eingestellt werden, und die Teilchengröße kann zur Erzeugung von Poren unterschiedlicher Größe eingestellt werden. Die Mischung aus Polymer und Salz wurde zu einem dünnen Film gepresst. Nachdem das Material fest geworden war wurde der Film vom Mylar-Träger entfernt. Der Film wurde zur Entfernung des Salzes erschöpfend mit Wasser extrahiert, wobei ein poröser Film aus P4HB zurückblieb.
Beschleunigfer Abbau von P4HB Der Abbau von PHB wurde in vivo untersucht. Drei unterschiedliche Konfigurationen mit unterschiedlicher Porosität (0, 50 und 80 % Porosität) wurden untersucht. Kleine Scheiben (Durchmesser 5 mm) wurden aus druckgeformten P4HB-Folien einheitlicher Dicke gestanzt. Die porösen P4HB-Proben wurden mittels einer Salzauslaugungstechnik hergestellt. Das Abbauverhalten in vivo wurde an Ratten nach Implantation in subkutane Taschen untersucht. Zu unterschiedlichen Zeiten wurden Proben entnommen. Die Molekülmasse wurde mittels GPC bestimmt, und der Massenverlust wurde über eine Quantifizierung der verbliebenen 4HB über eine GC-Analyse bestimmt. Die Ergebnisse sind in der 3 gezeigt. Wie in der 3 gezeigt ist, hing der Massenverlust von der Porosität ab. Die Folie und Proben mit einer Porosität von 50 % und 80 % zeigten einen Massenverlust von 5 %, 20 % bzw. 75 % über den Zeitraum von sechs Wochen, und die durchschnittliche Abnahme der Molekülmasse dieser Proben nahm ebenfalls signifikant ab (20 bis 50 %). Diese Daten zeigen, dass die Geschwindigkeit des Abbaus von PHAs über das Verändern der Porosität und das Vergrößern der Oberfläche modifiziert und verzögert werden kann.
Ergebnisse
Die P4HB-Implantate führten zu einer äußerst geringen Entzündungsreaktion, die viel geringer als bei einem Vlies aus PGA war. Das ist ein sehr guter Hinweis auf die Biokompatibilität dieser Materialien. Proben wurden zu unterschiedlichen Zeiten entnommen und histologisch sowohl bezüglich des Implantats als auch des umgebenden Gewebe bewertet. Die Molekülmasse wurde mittels GPC bestimmt, und der Massenverlust wurde über eine Quantifizierung des verbliebenen 4HB mittels GC-Analyse bestimmt. Die Ergebnisse sind in den Tabellen 6 und 7 gezeigt. Wie in der Tabelle 6 gezeigt ist, wird P4HB in vitro über einen Zeitraum von zehn Wochen nicht signifikant abgebaut. Alle Proben behielten ihr Ausgangsgewicht bei, und es kam zu einer Abnahme der mittleren Molekülmasse von ungefähr 20 bis 40 %. Die in vivo inkubierten Proben zeigten einen viel ausgeprägteren Abbau. Der Massenverlust hing von der Porosität ab. Die Folie und Proben mit einer Porosität von 50 und 80 % zeigten einen Massenverlust von 20 %, 50 % bzw. 100 % über den Zeitraum von zehn Wochen, und die durchschnittliche Abnahme der Molekülmasse dieser Proben nahm ebenfalls signifikant ab (20 bis 50 %).
Eine Untersuchung der Proben mittels Lichtmikroskopische und Environmental Scanning Elektronenmikroskopie (ESEM) zeigt fast keine erkennbare Veränderung der In-vitro-Proben über den Inkubationszeitraum von zehn Wochen. Andererseits zeigen die In-vivo-Implantate deutliche Anzeichen eines Abbaus. Die Oberfläche dieser Materialien wird über den Implantationszeitraum von zehn Wochen immer mehr abgebaut. Nach einer Woche zeigen die Folienproben einige Anzeichen für ein Reißen und eine Haarrissbildung, die während der folgenden neun Wochen zu einer Oberflächenerosion und Grübchenbildung voranschreiten.
Die Daten zum In-vitro-Abbau legen nahe, dass P4HB ziemlich stabil gegenüber einer einfachen Hydrolyse ist, im Gegensatz zu anderen Polyestern, die in bioresorbierbaren Anwendungen eingesetzt werden, wie PGA, PLA und deren Copolymere. Allerdings zeigt der Abbau der Implantate an, dass P4HB in vivo abgebaut werden kann, was einen biologisch vermittelten Abbau nahelegt. Die Daten zeigen einen mit zunehmender Porosität zunehmenden Abbau, was zeigt, dass die Oberfläche des Polymerimplantats eine Rolle bei seinem Abbau in vivo spielt. Das legt nahe, dass der Abbau von P4HB-Polymeren in vivo an der Oberfläche des Implantats erfolgt, im Gegensatz zu Materialien aus PGA oder PLA, bei denen der Abbau durch eine Hydrolyse im gesamten Implantat erfolgt, mit einer damit verbundenen Abnahme der Molekülmasse und einem Verlust der mechanischen Eigenschaften. Diese Daten legen nahe, dass die Geschwindigkeit des Abbaus von P4HB durch die Veränderung seiner Oberfläche modifiziert und verzögert werden kann. Auch wird erwartet, dass dieser Typ des Oberflächenabbaus zu einer relativ langsamen Geschwindigkeit des Molekülmassenverlustes führt, was eine längere Aufrechterhaltung der Materialeigenschaften des Polymers als bei existierenden resorbierbaren, medizinischen Polyestern ermöglicht. Die P4HB-Implantate wurden sehr gut toleriert und führten nur zu einer äußerst geringen Fremdkörperreaktion. Diese Befunde zeigen, dass diese Materialien gegenüber existierenden medizinischen Polyestern signifikante Vorteile aufweisen.
Beispiel 5: Druckformen
P4HB wurde mittels einer hydraulischen Carver-Presse zu einem dünnen Film gepresst. Die Drucktiegel wurden auf 115°C erhitzt. Das P4HB wurde unter Einsatz von Metallspacern zwischen zwei Mylar-Bögen gepresst. Die Dicke der Spacer und der Druck der Presse können zur Steuerung der Filmdicke eingestellt werden. Der Film wurde aus der Presse genommen, und dann ließ man ihn sich auf Raumtemperatur abkühlen. Nach dem Festwerden (innerhalb einiger Sekunden) ließ sich der Film leicht von der Mylar-Verstärkung abschälen. Die Daten bezüglich der mechanischen Eigenschaften sind in der Tabelle 1 gezeigt. Die schnelle Verfestigung von P4HB zeigt seine schnelle Kristallisation.
Beispiel 6: Druckformen von porösem P4HB
Natriumchloridkristalle definierter Größe (80–180 μm) wurden mit schmelzflüssigem P4HB wie in den Beispielen 4 und 5 beschrieben gemischt. Das Verhältnis von Polymer zu Salz kann so eingestellt werden, dass die gewünschte Porosität erzeugt wird, und die Teilchengröße kann so eingestellt werden, dass Poren unterschiedlicher Größe gebildet werden. Die Mischung aus Polymer und Salz wurde unter Einsatz der im Beispiel 6 beschriebenen Bedingungen zu einem dünnen Film gepresst. Man ließ das Material 10 min fest werden, und dann wurde der Film von der Mylar-Verstärkung entfernt. Der Film wurde zur Entfernung des Salzes erschöpfend mit Wasser extrahiert, wobei ein poröser Film aus P4HB zurückblieb. Die Entfernung des Salzes wurde über die Analyse des Chlorids im Überstand verfolgt und durch eine Elementaranalyse des ausgelaugten Films bestätigt (weniger als 0,5 % Chlorid). Die Daten bezüglich der mechanischen Eigenschaften für zu 50 % und zu 80 % poröses P4HB (pP4HB50 bzw. pP4HB80) sind in der Tabelle 1 gezeigt,
Beispiel 7: Säen von Zellen auf P4HB-Gerüste
Poröses P4HB (wie im Beispiel 6 beschrieben) wurde durch Behandlung mit kaltem Ethylenoxid sterilisiert. Es wurde zusammen mit Gefäßzellen des Schafs ausgesät und in vitro kultiviert. Vorläufige Daten zeigten eine sehr gute Anheftung dieser Zellen an das Material. Das ist eine weitere Demonstration der Biokompatibilität dieses Materials. Die Zahl der an diesem Material anhaftenden Zellen kann über eine DNA-Bestimmung ermittelt und mit denen für PGA-Vlies, der Standard für Gerüste für ein Gewebeengineering, verglichen werden.
Beispiel 8: Faserorientierung
Druckgeformte Streifen aus P4HB wurden uniaxial gedehnt. Die Probe wurde schmaler und klar und zeigte Anzeichen einer Querschnittsverminderung. Nach diesem Dehnvorgang erschien das Polymer stabiler und etwas flexibler, was eine uniaxiale Orientierung der Probe anzeigte.
Beispiel 9: Thermisches Phasentrennverfahren zur Erzeugung von P4HB-Schaumstoff
P4HB wurde in Dioxan in einer Konzentration von 1 bis 5 % (Gew./Vol.) gelöst. Diese Polymerlösung wurde als eine dicke Folie gegossen und durch Abkühlen auf Eis unter den Schmelzpunkt von Dioxan verfestigt. Das Lösemittel wurde bei vermindertem Druck von diesem festen Material abgezogen, wodurch ein poröser Schaumstoff mit den ungefähren Abmessungen des dicken Ausgangsfilms erhalten wurde. Eine ESEM-Analyse dieses Materials zeigte eine hochporöse, schwammartige Struktur. Die Polymerkonzentration und der Abkühlungsprozess können zur Veränderung der Porosität des Schaumstoffs variiert werden. Vor dem Einfrieren kann die Polymerlösung in unterschiedliche Formen gebracht, zu teilchenförmigem Material zerkleinert oder als Beschichtung eingesetzt werden. Somit kann diese thermische Phasentrenntechnik zur Erzeugung einer Vielzahl hochporöser, dreidimensionaler Formen aus P4HB verwendet werden.
Beispiel 10: Beschichtung eines Vliesmaterials aus PGA mit P4HB
P4HB wurde in Tetrahydrofuran in einer Konzentration von 1 % (Gew./Vol.) gelöst. Ein 1 mm dickes Vliesmaterial aus PGA (Albany International, Schüttdichte 52 mg/cm³) wurde so in diese Lösung getaucht, dass die Lufthohlräume eliminiert wurden. Man ließ das beschichtete Vlies lufttrocknen, und die Beschichtungsprozedur wurde wiederholt. Lichtmikroskopische und ESEM-Analysen des beschichteten Vlieses zeigten, dass das Polymer während des Trocknungsprozesses zu den Schnittpunkten der Fasern wanderte und eine Verbindung der Fasern miteinander bewirkte. Es zeigte sich, dass diese Technik der Faserverbindung die Stabilität und die Handhabbarkeit des PGA-Vlieses dramatisch verbesserte. Die Zugprüfung gemäß ASTM D638 zeigte, dass die Zugfestigkeit, der Elastizitätsmodul und die Dehnung beim Reißen dieses Materials bei 130 psi, 240 psi und 171 psi lagen. Das stellte eine dramatische Verbesserung gegenüber dem unbeschichteten Material dar, das für die Testung dieser Parameter zu fragil war.
Beispiel 11: Beschichtung eines Vliesmaterials aus PGA mit P4HB-Schaumstoff
P4HB wurde in Dioxan in einer Konzentration von 2,5 % (Gew./Vol.) gelöst. Ein 1 mm dickes Vliesmaterial aus PGA (Albany International, Schüttdichte 52 mg/cm³) wurde so in diese Lösung getaucht, dass die Lufthohlräume eliminiert wurden. Das beschichtete Vlies wurde in Eis abgekühlt, so dass die Beschichtungslösung fest wurde. Das Vlies wurde zur Entfernung des Dioxans gefriergetrocknet. Die lichtmikroskopische Analyse des beschichteten Vlieses zeigte, dass das Polymer während des Gefriertrocknungsprozesses einen netzartigen Schaumstoff im gesamten PGA-Vlies bildete. Dieses geschäumte Material hat eine gute Handhabbarkeit. Die große Oberfläche und die verbesserten mechanischen Eigenschaften sind für verschiedene Anwendungen attraktiv.
Beispiel 12: Bildung von P4HB-Mikrokügelchen
P4HB wurde in Dichlormethan in einer Konzentration von 1 % (Gew./Vol.) gelöst. Ein Volumen dieser Lösung von 1 mL wurde mit 5 mL einer 0,5 %-igen (Gew./Vol.) Lösung von Natriumdodecylsulfat (SDS) gemischt. Die zweiphasige Mischung wurde zur Gewinnung einer Suspension mechanisch gemischt. Ein Stickstoffstrom wurde 1 Stunde unter schnellem Rühren durch die Mischung geblubbert, um die Entfernung des Dichlormethans zu erleichtern. Die Mischung wurde über Nacht offen an der Luft gerührt, um die vollständige Entfernung des Dichlormethans zu ermöglichen. Die resultierende Suspension enthielt P4HB-Mikrokügelchen von ungefähr 1–10 μm, wie mittels eines Lichtmikroskops mit Phasenkontrast bestimmt wurde. Tabelle 1 Thermische und mechanische Eigenschaften ausgewählter medizinischer Polymere

^apP4HB50, 50 % poröses P4HB, siehe Beispiel 7
^apP4HB80, 80 % poröses P4HB, siehe Beispiel 7
Lit.: 1. aus dieser Arbeit, bestimmt gemäß ASTM D638 bei Umgebungstemperatur und einer Dehngeschwindigkeit von 0,05 oder 0,1 inch/min 2. Hutmacher et al., Int. J. Oral. Max. Imp. 1996, 11, 667–678 3. Nobles et al., eingereicht 4. Mark, Physical Properties of Polymers Handbook, American Inst. of Physics, Woodbury, New York, 1996 5. Schwartz, S.S. und Goodman, S.H., Plastic Materials and Processes, Van Nostrand Reinhold Company, New York, 1982 6. Saito, Y, und Doi, Y., Int. J. Biol. Macromol. (1994) 16: 99–104

^a TGZ : Trockengewicht der Zellen
^b bestimmt mittels GC-Analyse. Ungefähr 20 mg lyophilisierte Zellmasse wurden einer dreistündigen Butanolyse bei 110°C in 2 mL einer Mischung unterzogen, die (in Volumeneinheiten) 90 % 1-Butanol und 10 % konzentrierte Salzsäure enthielt, wobei 2 mg/mL Benzoesäure als interner Standard zugegeben wurden. Die wasserlöslichen Komponenten der resultierenden Mischung wurden durch Extraktion mit 3 mL Wasser entfernt. Die organische Phase (1 μL in einem Splitverhältnis von 1:50 bei einer Gesamtflussgeschwindigkeit von 2 mL/min) wurde auf einer SPB-1-Kapillar-GC-Säule aus verschmolzenem Siliciumdioxid (30 m, 0,32 mm ID, 0,25 μm Film, Supelco, Bellefonte, Pennsylvania) mit dem folgenden Temperaturprofil analysiert: 2 min bei 80°C, mit 10°C pro min auf 250°C, 2 min bei 250°C. Der zur Testung auf das Vorliegen von 4-Hydroxybutyrateinheiten im Polymer eingesetzte Standard war Natrium(2-hydroxybutyrat).
^c Prozentuale Gehalte in Klammern wurden wie oben bestimmt, jedoch nach der Extraktion des Polymers mit Chloroform und nachfolgender Ausfällung in Ethanol.

^a TGZ : Trockengewicht der Zellen
^b bestimmt mittels GC-Analyse; siehe Tabelle 2 bezüglich Details.

^a TGZ: Trockengewicht der Zellen
^b bestimmt mittels GC-Analyse; siehe Tabelle 2 bezüglich Details. Der zur Testung auf das Vorliegen von 4-Hydroxybutyrateinheiten im Polymer eingesetzte Standard war γ-Butyrolacton. Der zur Testung auf das Vorliegen von 3-Hydroxybutyrateinheiten im Polymer eingesetzte Standard war Poly(3-hydroxybutyrat).

Tabelle 5 Eigenschaften von P4HB und P4HB-co-3HB aus MBX1177/pFS30

n.n. = nicht nachgewiesen
^a bestimmt mittels GC-Analyse; siehe Tabelle 2 bezüglich Details.
^b bestimmt mittels DSC-Analyse; Es wurde ein Differential Scanning Calorimeter Pyris 1 von Perkin Elmer eingesetzt. Die Probenmassen lagen bei ungefähr 4–8 mg. Das eingesetzte Heizprogramm sah folgendermaßen aus : 2 min bei 25°C, Aufheizen auf 195°C mit 10°C pro min, 2 min bei 195°C, Abkühlen auf –80°C mit 300°C pro min, 2 min bei –80°C, Aufheizen auf 195°C mit 10°C pro min. Die Schmelztemperatur (Tm) und die Fusionsenthalpie für diesen Schmelzpeak (dH Tm1) wurden beim ersten Heizzyklus bestimmt. Die Glasübergangstemperatur (Tg), die Kristallisationstemperatur (Tx) und die Schmelztemperatur (Tm2) wurden während des zweiten Heizzyklus bestimmt.
^c bestimmt mittels GPC-Analyse; Die isolierten Polymere wurden in einer Konzentration von ungefähr 1 mg/mL in Chloroform gelöst, und Proben (50 μL) wurden auf einer HT6E-Styragel-Säule von Waters bei einer Flussgeschwindigkeit von 1 mL Chloroform pro Minute bei Raumtemperatur unter Verwendung eines Brechungsindexdetektors chromatographiert. Die Molekülmassen wurden relativ zu Polystyrolstandards enger Polydispersität bestimmt.

₃

^a bestimmt mittels GC-Analyse; siehe Tabelle 3 bezüglich Details.
^b bestimmt mittels quantitativer GC-Analyse; siehe Tabelle 2 bezüglich Details.

n.b. = nicht bestimmt
a bestimmt mittels GPC-Analyse; siehe Tabelle 3 bezüglich Details.
b bestimmt mittels GC-Analyse; siehe Tabelle 2 bezüglich Details. Explantate wogen häufig aufgrund von anhaftendem Gewebe oder koaguliertem Blut mehr als das ursprüngliche Implantat. Deshalb wurde die Masse des P4HB im Explantat mittels quantitativer GC-Analyse bestimmt. Die Gewichtsprozente des verbliebenen P4HB wurden als diese Masse geteilt durch die des ursprünglichen Implantats berechnet.

Claims

Biokompatibles, poröses medizinisches Implantat, das ein Poly(4-hydroxybutyrat)-Homopolymer umfasst.
Implantat, wie es im Anspruch 1 beansprucht wird, wobei das Implantat aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Stäben, Knochenschrauben, Zapfen, chirurgischen Nähten, Stents, Vorrichtungen für ein Gewebeengineering, Vorrichtungen für eine Arzneimittelzufuhr und Patchen besteht.
Implantat nach Anspruch 1 oder Anspruch 2 für die Verwendung im Gewebeengineering.
Implantat, wie es im Anspruch 2 beansprucht wird, wobei der Patch ein Hernia-Patch oder ein Perikard-Patch ist.
Implantat, wie es im Anspruch 1 beansprucht wird, wobei das Implantat eine poröse Vorrichtung für die Wundheilung ist.
Verwendung des Poly(4-hydroxybutyrat)-Homopolymers zur Herstellung eines porösen medizinischen Implantats.