ES2394953T3 - Composiciones de polihidroxialcanoato con velocidades de degradación controladas - Google Patents

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Frank A Skraly
Simon F Williams
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Abstract

Un implante médico biocompatible que comprende un homopolímero de poli (4-hidroxi-butirato) en donde elimplante es seleccionado de dispositivos de regeneración tisular guiada, dispositivos de ingeniería de tejidos,soportes de ingeniería de tejidos, espumas, recubrimientos, mallas, micropartículas, materiales de cierre de heridareabsorbibles como materiales de sutura y grapado, dispositivos de liberación controlada, dispositivos deadministración de fármacos, dispositivos de encapsulación celular, dispositivos de administración dirigida,dispositivos con revestimientos biocompatibles, dispositivos ortopédicos, prótesis, cementos óseos (incluyendoadhesivos y/o rellenos estructurales), dispositivos de diagnosis, varillas, tornillos óseos, pernos, suturas quirúrgicas,stents, parches (como parches para hernias o parches pericárdicos), dispositivos con aplicaciones vasculares ytubos adecuados para el paso de fluidos corporales.

Description

Composiciones de polihidroxialcanoato con velocidades de degradación controladas
Campo de la invención
[0001] La presente invención se refiere generalmente a polímeros de polihidroxialcanoato y a métodos para alterar sus velocidades de degradación, particularmente a métodos que aceleran este proceso y a novedosos polihidroxialcanoatos biodegradables particularmente apropiados para aplicaciones médicas.
Antecedentes de la invención
[0002] En el área médica se ha desarrollado un número de polímeros degradables que se descomponen in vivo en sus monómeros respectivos en semanas o en unos pocos meses. A pesar de la disponibilidad de estos polímeros sintéticos degradables persiste la necesidad de desarrollar polímeros degradables que ofrezcan una gama más amplia de propiedades mecánicas.
[0003] Los polihidroxialcanoatos son poliésteres naturales, termoplásticos y pueden ser procesados mediante técnicas tradicionales poliméricas para su uso en una gran diversidad de aplicaciones, incluyendo el empaque de bienes de consumo, acolchado de pañales desechables y bolsas de basura, alimentos y productos médicos. Los esfuerzos iniciales se centraron en aplicaciones mediante moldes, en particular para elementos de empaque para el consumo tales como botellas, contenedores de cosméticos, plumas, montículos de golf y similares. Las Patentes
U.S.
4 826 493 y 4 880 592 describen la manufactura de películas de PHB y PHBV y su uso como entretela protectora del acolchado de pañales. La Patente U.S. No. 5 292 860 describe la manufactura del copolímero PHA poly_(3-hidroxibutirato-co-3-hidroxihexanoato) y el uso de estos polímeros para producir la entretela protectora del acolchado de pañales, así como otros elementos desechables. Los materiales de la entretela protectora de los pañales y de otros materiales para la producción de artículos biodegradables de higiene personal a partir de copolímeros PHB y no PHBV, se describen en la PCT WO 95/20 621, WO 95/23 250, WO 95/20 615, WO 95/33 874,
U.S.
5 502 116, U.S. 5 536 564, U.S. 5 489 470 y WO 96/08535.
[0004] Una de las propiedades de mayor utilidad de los PHA que los distingue rápidamente de los polímeros derivados de petroquímicos es su biodegradabilidad. Producidos naturalmente mediante bacterias de la tierra, los PHA se degradan mediante exposición subsiguiente a estas mismas bacterias ya sea en tierra, abono o sedimento marino. La biodegradación de los PHA depende de un número de factores tales como la actividad microbiana del entorno y el área de la superficie del elemento. Adicionalmente, la temperatura, el pH, el peso molecular y la cristalinidad, son aspectos importantes. La biodegradación comienza cuando los microorganismos comienzan a crecer en la superficie del plástico y segregan enzimas que descomponen el polímero en unidades monoméricas ácidas hidroxiladas. Los ácidos hidroxilados entonces son tomados por los microorganismos y utilizados como fuentes de carbono para el crecimiento. En ambientes aerobios los polímeros se degradan a dióxido de carbono y agua, mientras que en ambientes anaerobios los productos de la degradación sonel dióxido decarbonoyel metano (Williams, S.F. and Peoples, O.P. CHEMTECH, 26, 38-44 (1996). Mientras que el mecanismo para la degradación de los PHA en el ambiente es ampliamente considerado como por vía del ataque enzimático y puede ser relativamente rápido, el mecanismo de degradación in vivo generalmente se entiende que implica un ataque hidrolítico simple en los enlaces de éster de los polímeros. Puede o no ser mediante proteínas. A diferencia de los polímeros que comprenden 2-hidroxiácidos como el ácido poliglicólico y poliláctico, los polihidroxialcanoatos normalmente se componen de 3-hidroxiácidos y en ciertos casos hasta de 4, 5 y 6-hidroxiácidos. Los enlaces de ésteres derivados de estos hidroxiácidos generalmente son menos susceptibles a hidrólisis que los enlaces de ésteres derivados de 2-hidroxiácidos.
[0005] Los investigadores han desarrollado procesos para la producción de una gran variedad de PHA y se han incorporado a polímeros alrededor de 100 monómeros diferentes bajo condiciones controladas de fermentación (Steinbuchel A and Valentín, H.E., FEMS Microbiol, Lett, 128:219-225 (1995)). Actualmente hay solo dos compuestos de PHA disponibles comercialmente, poli-(R)-3-hidroxibutirato (PHB) y poli-(R)-3-hidroxibutirato-co-(R)3-hidroxivalerato (PHBV). Debido a la gran diversidad de su composición, pueden producirse los PHA con un rango de propiedades físicas (Williams, S.F. and Peoples, O.P., CHEMTECH, 26:38-44 (1996)). Los PHA, PHB y PHBV comercialmente disponibles, representansolo un pequeño componente de los conjuntos de propiedades disponibles a los PHA. Por ejemplo, la extensión para descomponer el PHB y el PHBV fluctúa del 4 al 42%, mientras que la misma propiedad para el poli-4-hidroxibutirato (P4HB) es de alrededor del 1 000% (Saito, Y. and Doi, Y. Int. J. Biol. Macromol. (1994) 16: 99-104). De manerasimilar los valoresde losmódulos de Young y de resistencia a la tensión para el PHB y el PHBV son de 3,5 a 0,5 GPa y de 40 a 16 MPa, respectivamente (para un contenido HV en aumento a 25 mol %), comparado con 140 MPa y 104 MPa, respectivamente para el P4HB (Saito, Y. and Doi, Y. Int. J. Biol. Macromol. (1994) 16: 99-104).
[0006] En adición a encontrar uso comercial como reemplazo biodegradable para resinas de artículos sintéticos, el PHB y el PHBV se han utilizado extensamente para su uso en aplicaciones biomédicas. Estos estudios abarcan desde usos potenciales en liberación controlada que han sido revisados por Koosha, F. et al., Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 6:117-130 (1989) y Pouton C.W. and Akhtar, S. Adv. Drug Delivery Rev., 18:133-162 (1996), hasta el uso en formulación de tabletas, suturas quirúrgicas, vendajes, polvos lubricantes, vasos sanguíneos, reconstrucción de tejido, implantes quirúrgicos para unir partes tubulares del cuerpo, placas de fijación de fracturas óseas y otros usos ortopédicos, tal como se describe en la WO 98/51 812 por Metabolix. Quizás el desarrollo médico más avanzado es el uso de PHB y PHBV para preparar una lámina porosa, flexible, bio-reabsorbible para la separación de tejido y la estimulación de la regeneración de tejido en casos de tejido blando dañado, descrito en la Solicitud Europea de Patente 754 467 A1 a Bowald, S. and Johansson_Ruden, G. solicitada el 26 de junio de 1988 y en la EP 0 349 595 A2. Informes recientes también han descrito el uso de PHBV para mantener el crecimiento celular (Rivard,
C.H. et al., J. Appl. Biomat., 6:_65-68 (1995)).
[0007] JP 04 326932 por Nippon Zeon KK revela la preparación de una película de un copolímero de ácido 3hidroxibutírico (3HB) y ácido 4-hidroxibutírico (4HB). JP 05 023189 de Mitsubishi Kasei Corp. revela un método para la producción continua de un copolímero que contiene 3HB y 4HB. El poliéstersedice que esútil para la fabricación de materiales tales como sistemas de liberación sostenida y suturas. DE 3937649 revela P4HB y microorganismos que son capaces de acumular P4HB y el uso potencial de P4HB en compresa para su uso como apósitos para heridas. Kishida, et al., Chem. Pharm. Bull., 37 (7):1954-1956 (1989) revela un método para controlar las tasas de degradación de poliésteres biodegradables como poli (ácido láctico) y poli �-hidroxibutirato (PHB). JP 07 275344 por Nippon Zeon KK revela un material médico de tejido blando de un copolímero de poliéster con unidad 3HB y 4HB, y un vaso sanguíneo artificial o un elemento de remedio de vaso sanguíneo hecho del copolímero. WO 93/20134 revela la regulación de la tasa de degradación de polímeros bio erosionables utilizados en la entrega de fármacos de liberación sostenida. Los polímeros bio erosionables descritos para su uso incluyen poli �
-
hidroxibutirato (es decir, P3HB), poli �-hydroxivalerato y poli �-hidroxibutirato-�-hidroxivalerato. Lee, et al., Macromol. Chem Phys, 198 (4): 1109-1120 (1997) revela la copolimerización química de �-butirolactona y y-butirolactona para obtener poly(3HB-co4HB). EP 0 601 885 revela polímeros preparados sometiendo a �-butirolactona y lactonas deseis osiete elementos a polimerización de abertura de anillo en presencia de un catalizador. Ejemplos de lactonas con seis o siete elementos que se puedan utilizar contienen glicólido y L-lactida. Fukuzaki, et al., Die Makromolekulare Chemie, 190 (7): 1553-1559 (1989) revela copolimerización directa del ácido 1-láctico con y -butirolactona para producir copolímeros de bajo peso molecular de ácido láctico y ácido 4-hidroxibutírico. No hay ninguna mención de aplicaciones del copolímero producido. La patente U.S. nº 3.982.543 revela polímeros de glicólido y lactida así como copolímeros de glicólido preparados utilizando varios co-monómeros cíclicos, incluyendo y-butirolactona. EP 0 423 484 revela mezclas de ácido poliláctico y homo y copolímeros de 3-hidroxibutirato, y para la liberación sostenida de compuestos activos. WO 94/06866 generalmente revela un material desechable que incluye un polímero que contiene ácido hidroxicarboxílico, que se degrada hidrolíticamente durante las etapas de eliminación y operativa de una manera controlada. Proporciona un listado de ácidos hidroxicarboxilicos que pueden componer los polímeros contemplados. Los ácidos hidrocarboxilicos preferidos son los ácidos a -hidroxicarboxilicos pero otros ácidos hidroxicarboxilicos en los que el grupo hidroxilo está unido a un carbono diferente como el carbono beta-, gamma-, delta, épsilon y/o omega, también pueden ser utilizados.
[0008] Además de la biocompatibilidad, también a menudo se desea que el dispositivo médico implantado se degrade después de haber cumplido su misión principal. El PHB y el PHBV, los únicos PHA probados como implantes médicos hasta la fecha, han mostrado períodos de degradación in vivo muy prolongados, de más de un año para el PHB (Duvernoy, O., Malm, et al. Thorac. Cardiovasc. Surgeon (1995) 43: 271-74. Malm, et al., C. J. Thorac. Cardiovasc. Surg. (1992) 104: 600-607.). Para muchas aplicaciones, este período de degradación tan extenso es indeseado ya que la persistencia del polímero en el sitio de curación de una herida puede conllevar un respuesta inflamatoria crónica en el paciente. Se ha constatado que los parches de PHB de degradación lenta utilizados para regenerar tejido arterial educen una respuesta macrófaga a largo plazo (mayor de dos años) (Malm, et al, Eur. Surg. Res. 1994, 26: 298-308). Se identificó a los macrófagos como implicados en la degradación de los implantes de PHB y esta respuesta macrófaga a largo plazo parece indicar la presencia de material persistente de baja degradación en forma de partículas que se origina a parte del implante. Es más, aunque el parche de PHB utilizado para la reparación del pericardio no podía ser visto mediante microscopía de luz ordinaria luego de 12 meses de implantación, se observó material residual de pequeñas partículas mediante microscopía bajo luz polarizada. (Malm, et al., C. Sand J Thor. Cardiovasc. Surg. 1992, 26; 9-14). No está claro si este material en forma de partículas se mantiene localizado en el sitio del implante o si puede emigrar a lo largo del cuerpo, causando complicaciones no previstas. El destino biológico o el impacto médico de este material en forma de partículas no puede predecirse sin un estudio a largo plazo. Para minimizar los problemas potenciales asociados con PHA de degradación lenta resulta ventajoso utilizar materiales re-absorbibles con tasas más rápidas de degradación in vivo.
[0009] Hay un solo informe que describe la biocompatibilidad o degradación in vivo de cualquier otro polímero PHA en aplicaciones médicas (WO 98/51 812). La Patente U.S. No. 5 334 698 a Witholt, B. y Lageveen, RG., menciona artículos médicos producidos con un poliéster óptimamente activo aislado a partir de células Pseudomonas oleovorans, sin embargo, no se citan ejemplos o discusión de la fabricación o de pruebas de biocompatibilidad y no sebrindanmétodos para obtenerel polímeroen una forma adecuadamente pura para usomédicoin vivo. Debido a que las bacterias apropiadas para la producción de estos polímeros pueden producir también una endotoxina así como otros mediados inflamatorios, es importante que el polímero pueda ser procesado para eliminar estos contaminantes.
[0010] Para muchas aplicaciones, la tasa de biodegradación del PHA se adapta satisfactoriamente a la vida útil requerida del producto. Sin embargo, en ciertos casos sería aconsejable ser capaz de ejercer más control sobre la tasa a la que los polímeros se descomponen en el ambiente. Tal control ampliaría el rango de aplicaciones para esta clase de polímeros. Por ejemplo, una película de PHA puede tener propiedades mecánicas deseadas para ser utilizada como una película de estiércol y paja, y sin embargo no tener la tasa óptima de degradación para la aplicación. La capacidad de ser capaz de controlar la tasa de degradación del polímero en el ambiente sería por tanto una ventaja específica.
[0011] Por tanto, mientras los polihidroxialcanoatos ofrecen una amplia gama de propiedades mecánicas que son potencialmente útiles en aplicaciones médicas, su uso particularmente in vivo como polímeros re-absorbibles se limita debido a su lenta hidrólisis. Por tanto sería apropiado el desarrollo de métodos para controlar las tasas de degradación de los polihidroxialcanoatos.
[0012] Es por tanto un objetivo de esta invención, el brindar métodos para controlar las tasas de degradación de los polihidroxialcanoatos.
[0013] Es también objetivo de esta invención brindar nuevos compuestos que incluyan o se deriven de polihidroxialcalnoatos que se degradan más rápidamente en el ambiente y/o in vivo.
[0014] Es otro objetivo de esta invención el brindar métodos para fabricar artículos y dispositivos a partir de estos compuestos.
Resumen de la invención
[0015] En un primer aspecto, la presente invención proporciona un implante médico biocompatible que comprende el homopolímero poli (4-hidroxi-butirato) en donde el implante es seleccionado de dispositivos guiados de regeneración tisular, dispositivos de ingeniería de tejidos, soportes de ingeniería de tejidos, espumas, recubrimientos, mallas, micropartículas, materiales de cierre de herida reabsorbibles como materiales de sutura y grapado, dispositivos de liberación controlada, dispositivos de administración de fármacos, dispositivos de encapsulación celular, dispositivos con revestimientos biocompatibles, aparatos ortopédicos, prótesis, cementos óseos (incluyendo adhesivos y/o rellenos estructurales), dispositivos de diagnosis, varillas, tornillos óseos, pasadores, suturas quirúrgicas, stents, parches (como parches para hernias o parches para pericardio), dispositivos con aplicaciones vasculares y tubos adecuados para el paso de fluidos corporales.. El implante puede ser estéril.
[0016] En una realización más del primer aspecto, el implante puede ser para uso en ingeniería de tejidos, opcionalmente en donde el implante estásembrado con células antes o después de la implantación.
[0017] Enuna realizaciónmás del primer aspecto, el implante puedecomprender unagente terapéutico parauso en la administración controlada de fármacos.
[0018] En una realización más del primer aspecto, el implante puede constar de un agente de tratamiento de imagen seleccionado del grupo de agentes detectables por un método que consiste en ultrasonidos, MRI, CAT, rayos x y fluorescencia.
[0019] En una realización más del primer aspecto, el implante puede ser para uso en aplicaciones ortopédicas.
[0020] En una realización más del primer aspecto, el implante puede ser en forma de micropartículas.
[0021] En una realización más del primer aspecto, el homopolímero de poli(4-hidroxibutirato) puede ser no poroso.
[0022] En una realización más del primer aspecto, el implante puede comprender el homopolímero de poli(4hidroxibutirato) como un revestimiento.
[0023] En una realización más del primer aspecto, el implante puede comprender además una proteína, péptido, factor de crecimiento, enzima, anticuerpo, antígeno y/o factor de unión celular.
[0024] En una realización más del primer aspecto, el homopolímero de poli(4-hidroxibutirato) puede comprender una capa hidrofóbica y/o un surfactante.
[0025] Como aquí se describe, se han desarrollado composiciones de polihidroxialcanoatos biocompatibles con tasas de degradación controladas. En una realización, los polihidroxialcanoatos contienen aditivosparamodificarlas tasas de degradación. En otra realización, los polihidroxialcanoatos están formados por mezclas de monómeros o incluyen grupos colgantes o modificaciones en sus esqueletos para alterar sus tasas de degradación. En otra realización, los polihidroxialcanoatos son modificados químicamente. Pueden usarse métodos para producir los dispositivos que aumentan la porosidad o área superficial expuesta, para alterar la degradabilidad. Por ejemplo, como se demuestra en los ejemplos, el poli(4HB) poroso puede producirse utilizando métodos que crean poros, vacíos o espacios intersticiales, tales como una emulsión o técnica de secado mediante rociado o que incorporan partículas liofilizables o lixiviables dentro del polímero. Los ejemplos describen composiciones del poli (4HB) que incluyen espumas, recubrimientos, mallas y micropartículas. Como demuestran los ejemplos, estos compuestos polihidroxialcanoatos tienen propiedades mecánicas extremadamente favorables, así como el hecho de que son compatibles y se degradan dentro de marcos de tiempos apropiados bajo condiciones fisiológicas. Estos materiales de polihidroxialcanoatos brindan una gama mayor de tasas de degradación de polihidroxialcanoatos que los que están disponibles en la actualidad.
[0026] También se describen los métodos para procesar estos materiales, particularmente en caso de aplicaciones terapéuticas, profilácticas o con fines de diagnóstico, o en dispositivos que pueden ser implantados o inyectados.
Breve descripción de los dibujos [0027]
La figura 1 es un esquema de biopolímeros PHA ampliamente divididos en grupos de acuerdo con la longitud de sus grupos colgantes y sus respectivas rutas biosintéticas.
La Figura 2a es un esquema de las rutas mediante las que se derivan PHAs de grupo colgante corto. La Figura 2b es un esquema de las rutas mediante las que se derivan PHAs de grupo colgante largo.
La Figura 3 es un gráfico de degradación de P4HB in vivo con el tiempo (semanas)
Descripción detallada de la invención
I. Composiciones PHA
Composiciones de polímeros
[0028] Tal comoseutiliza aquí, los “materialesde PHA” contienen una omás unidades, por ejemplo entre unas 10 y 10 000 y preferiblemente entre 100 y 30 000 unidades de la siguiente fórmula I:
-
OCR1R2(CR3R4)nCO-; donde n es un entero, por ejemplo entre 1 y 15 y en una realización preferente, entre 1 y 4; y donde R1, R2, R3 y R4 independientemente, pueden ser radicales hidrocarburo que incluyen radicales hidrocarburo
de cadena larga; halo y radicales hidroxi-sustituidos, radicales hidroxi; radicales halógenos, radicales nitrógenosustituidos; radicales oxígeno-sustituidos y/o átomos de hidrógeno. [0029] Comose usa aquí, la fórmula -(CR3R4)n-se define como incluyente de las siguientes fórmulas:
-
CR3R4- (donde n=1);
-
CR3R4CR3’R4’- (donde n=2); y
-
CR3R4CR3’R4’CR3"R4"- (donde n=3);
donde R3, R4, R3’, R4’, R3", and R4" pueden ser independientemente radicales hidrocarburo que incluyen radicales hidrocarburo de cadena larga; radicales halo-e hidroxi-sustituidos; radicales hidroxi; radicales halógenos; radicales nitrógeno-sustituidos; radicales oxígeno-sustituidos y/o átomos de hidrógeno. Por lo tanto, la fórmula incluye unidades derivadas de 3-hidroxiácidos (n=1), 4-hidroxiácidos (n=2) y 5-hidroxiácidos (n=3).
[0030] Estas unidades pueden ser las mismas en un homopolímero o pueden ser unidades diferentes, como por ejemplo en un copolímero o terpopolímero. Los polímeros típicamente tienen un peso molecular sobre 300, por ejemplo entre 300 y 107 y en una realización preferente 10 000 a 10 000 000 Daltons.
[0031] Los materiales PHA pueden contener o modificarse para incluir otras moléculas, tales como compuestos bioactivos y detectables, agentes tensioactivos, otros polímeros degradables o no degradables, así como materiales utilizados para modificar las propiedades mecánicas de los PHA tales como plastificantes, rellenos, agentes nucleantes, colorantes, estabilizadores, modificadores y vinculantes.
[0032] Los PHB y P4HB poseen propiedades físicas muy diferentes. Una gama de copolímeros PHA que contienen 4-hidroxibutirato o son conocidos o pueden prepararse con un rango de propiedades intermedias entre las del PHB y el P4HB (Saito, Y. and Doi, Y. Int. J. Biol. Macromol. (1994) 16: 99-104), sin embargo, las aplicaciones biomédicas, no se ha informado de pruebas de biocompatibilidad y degradación in vivo del P4HB y sus copolímeros.
Copolímeros PHA de 4HB y 3HB que varían en composición de 0 a 100% 4HB, se han producido en Alcaligenes eutrophus (Nakamura, S., Doi, Y. and Scandola, M. Macromol. (1992) 25;4 37-4231) y a partir de 64 a 100% 4HB en Comamonas acidovorans (Saito, Y. and Doi, Y Int. J. Biol. Macromol (1994) 16:99-104), sin embargo, estos polímeros fueron de masa molecular modesta (1x105 a 5x105 g/mol, por GPC), en comparación con la masa molecular producida en E. coli recombinante (mayor que 5 x 105 g/mol, GPC).
[0033] Los biopolímeros PHA pueden ser divididos ampliamente en tres grupos de acuerdo a la longitud de sus grupos colgantes y a sus respectivas rutas biosintéticas (Figura 1). Aquellos con grupos colgantes cortos; tales como el polidroxibutirato (PHB), un homopolímero de R-3 unidades de ácido hidroxibutírico (R-3HB), son materiales altamente cristalinos termoplásticos y se han conocido como los más largos (Lemoigne, M. and Roukhelman, N., Annales des fermentations, 5:527-536 (1925)). Un segundo grupo de PHA que contienen las unidades cortas R-3HB polimerizadas de manera aleatoria con unidades ácidas hidroxiladas de grupos colgantes mucho más largos, se informó primeramente a principios de los setenta (Wallen, L.L. and Rohwedder, W.K., Environ. Sci. Technol., 8:576579 (1974)). También se conoce un número de microorganismos que producen específicamente copolímeros de R3HB con estas unidades ácidas hidroxiladas de grupos colgantes más largos y pertenecen a este segundo grupo (Steinbüchel, A. and Wiese, S., Appl. Microbiol. Biotechnol., 37:691-697 (1992)). A principios de los ochenta, un grupo de investigación en los Países Bajos identificó un tercer grupo de PHA que contenía predominantemente ácidos hidroxilados de grupos colgantes más largos (De Smet, M.J. et al., J. Bacteriol., 154: 870-878 (1983)).
[0034] Los polímeros PHA pueden constituir hasta el 90% del peso celular seco de las bacterias y se encuentran como gránulos discretos dentro de las células bacterianas. Estos gránulos PHA se acumulan en respuesta a la limitación de nutrientes y sirven como materiales de reserva de carbono y de energía. Se utilizan por los microorganismos rutas distintas para producir cada grupo de estos polímeros. Una de estas rutas que lleva a los polihidroxialcanoatos de grupo colgante corto (SPGPHA) implica a tres enzimas, a saber tiolasa, reductasa y sintasa PHB (ldenominada a veces polimerasa). Utilizando esta ruta, el homopolímero PHB es sintetizado por condensación de dos moléculas de la acetil-Coenzima A para dar acetoacetil-Coenzima A, seguido de la reducción de este intermedio a R-3-hidroxubitirilo-Coenzima A y la subsiguiente polimerización (Figura 2a). La última enzima en esta ruta, la sintasa, tiene una especificidad de sustrato que puede acomodar unidades monoméricas C3-C5 incluyendo unidades ácidas hidroxiladas R-4 e hidroxi R-5. Esta ruta biosintética se encuentra por ejemplo, en las bacterias Zoogloea ramigera y Alaligenes eutrophus. La ruta biosintética que se utiliza para formar el tercer grupo de PHA, los polihidroxialcanoatos de grupo colgante largo (LPGPHA) es todavía parcialmente desconocido, sin embargo, en la actualidad se piensa que las unidades de hidroxiacilo monomérico que llevan a los LPGPHA se derivan mediante la 1-oxidación de ácidos grasos y la ruta del ácido graso (Figura 2b). Los sustratos de hidroxiacilo-Coenzima R-3 resultantes de estas rutas son entonces polimerizados por las sintasas PHA (a veces denominadas polimerasas) que tienen especificidades de sustrato que favorecen las unidades monoméricas mayores en el intervalo C6-C14. Los PHA de grupos colgantes largosse producen por ejemplo por Pseudomonads.
[0035] Presumiblemente, el segundo grupo de PHAs que contienen tanto unidades cortas R-3HB como unidades de monómeros de grupos colgantes más largos, utilizan ambas rutas mostradas en las Figuras 2a y 2b para proporcionar monómeros hidroxiácidas. Los últimos son entonces polimerizados por sintasas PHA capaces de aceptar estas unidades.
[0036] En total, alrededor de 100 tipos diferentes de ácidos hidroxilados han sido incorporados a los PHA mediante métodos de fermentación (Steinbüchel, A. and Valentin, H.E., FEMS Microbiol., Lett., 128:219-228 (1995)). Notablemente, estos incluyen PHA que contienen grupos colgantes funcionalizados tales como ésteres, enlaces dobles, y grupos alquoxi, aromáticos, halógenos e hidroxi.
[0037] Según la presente invención, el polihidroxialcanoato utilizado para aplicaciones médicas es P4HB. P4HB es biocompatible, reabsorbible, procesable, fuerte y dúctil. El mantenimiento de la potencia de ruptura es otro parámetro muyimportante respectoa los materialesde suturaygrapado, especialmente los reabsorbibles. Debidoa que los materiales reabsorbibles son degradados in vivo, sus propiedades físicas y mecánicas cambian como resultado de estadegradación. Por ejemplo, unasutura reabsorbible perderá gran parte desu potencia de ruptura y como tal su capacidad para recomponer el tejido, más rápidamente que el tiempo necesario para su total reabsorción. Lassuturas PGA por ejemplo, perderán lamayoría de su potencia dentrode tressemanas in vivo (Vet Surg 21; 192: 355-61), pero no se reabsorberán completamente antes de las seis semanas. Esta pérdida de potencia mecánica es el resultado de la disminución de la masa molecular del polímero. Es importante resaltar que un número de parámetros afectará las tasas de reabsorción y de potencial de ruptura de la sutura in vivo, tales como el tipo de tejido, los estrés mecánicos, la presencia de infección, etc.
[0038] Los ejemplos demuestran que la tasa de degradación del P4HB in vivo es rápida en relación a otros PHA, sin embargo su tasa de reabsorción es más lenta que la de muchos de los materiales utilizados como suturas reabsorbibles. Adicionalmente, como se muestra en la Tabla 7, los implantes de P4HB mantienen su masa molecular durante el proceso de reabsorción. Se espera que este mantenimiento de la masa molecular sea un beneficio para el mantenimiento de propiedades mecánicas y por ello de la resistencia a la rotura de los PHA utilizados como materiales de cierre de heridas. Debido a sus excelentes propiedades mecánicas, el mantenimiento de una alta masa molecular, su procesabilidad, biocompatiblidad y capacidad de reabsorción, el P4HB debería ser útil como material reabsorbible para el cierre de heridas tal como material para suturas y grapado, particularmente como aquísemodifica para incrementar sus tasas de degradación.
Fuentes de PHAs
[0039] A mediados de los años ochenta, diversos grupos de investigación identificaban activamente y aislaban genes y productos de genes responsables de la síntesis del PHA. Estos esfuerzos llevan al desarrollo de sistemas transgénicos para la producción de PHA tanto en plantas como en microorganismos, así como métodos enzimáticos para la síntesis del PHA. Tales rutas pudieran incrementar aún más los tipos de PHA disponibles. Estos avances han sido revisados en Williams, S.F. and Peoples, O.P., CHEMTECH, 26, 38-44 (1996), and Williams S.F. and Peoples, O.P., Chem. Br. 33, 29-32 (1997).
[0040] La identificación, clonación y expresión de los genes implicados en la biosíntesis de los PHA a partir de diversos microorganismos dentro de organismos recombinantes, permite la producción de PHA dentro de organismos que no son productores nativos de PHA. Tales organismos recombinantes aportan a los investigadores un mayor grado de control del proceso de producción de PHA debido a que están libres de actividades enzimáticas de fondo para la biosíntesis de precursores no deseados de PHA o degradación de PHA. Adicionalmente, la elección adecuada de un organismo recombinante puede facilitar la purificación de, o permitir la biocompatibilidad incrementada de, los PHA producidos.
[0041] Los requerimientos mínimos para la síntesis de PHA en un organismo recombinante son una fuente de hidroxialcanoilo-CoA y una sintasa apropiada de PHA (Gemgross, T.U. and Martin, D.P. Proc.Nat. Acad. Sci. (1995)
92: 6279-6283). Los productores recombinantes de PHA por tanto, requieren una ruta biosintética para un monómero hidroxialcanoilo-CoA y una sintasa PHA adecuada. La producción de un homopolímero requiere que el organismo produzca sólo un sustrato apropiado para la sintasa PHA, ya que la producción de sustratos múltiples resulta en la formación de un copolímero PHA. Los organismos recombinantes que contienen un transgen que codifica una sintasa de PHA son suficientes para la producción de P4HB.
[0042] En ausencia de rutas de degradación del PHA, la masa molecular del PHA acumulado en los organismos recombinantes puede ser muy alta. Se ha informado que PHB producido en E. coli recombinante tiene una masa molecular de 4 x 106 g/mol (Sim, S.J. Snell, K.D. Hogan, S.A. Stubbe, J., Rha, C. and Sinskey. A Nature Biotech. (1997) 15:63-67). La masa molecular es importante para el control de las propiedades físicas de un PHA dado, debido a que la masa molecular incrementada de los PHA producidos en organismos recombinantes puede llevar a propiedades materiales mejoradas, tales como una mayor resistencia a tracción y elongación de rotura (Kusaka, S., Iwata, T. and Doi, Y. J.M.S. Pure Appl. Chem. (1998) A35:319-335).
[0043] La biosíntesis del P3HB-co-4HB que contiene un nivel bajo de 4HB (1,5%) ha sido descrita en E. coli recombinante (Valentin, H. E., Dennis, D. J. Biotech 1997, 58; 33-38). Es de destacar que la masa molecular de estos PHA era muy alta (superior a 1 x 106 g/mol). Adicionalmente, han sido descritos la biosíntesis del P3HB-co4HB y el homopolímero P4HB en E. coli recombinante (Hein, et al.. FEMS Microbiol. Lett. 1997, 153; 411-418).
[0044] La producción biológica de P4HB tiene ciertas ventajas con respecto a métodos químicos sintéticos tradicionales. La síntesis químicade PHB de una altamasamolecular (mayor de 1 x 105g/mol) esdifícil debido a la tendencia del ácido libre a lactonizarse para formar el anillo de cinco elementos relativamente no tensionado y cinéticamente favorecido. Por tanto la policondensación de ácido 4-hidroxibutírico es difícil de lograr, mientras que el
material resultante de las reacciones de polimerización de apertura de anillo a alta presión de y-butirolactona es de muy baja masa molecular (Korte, F. and Gelt, W. Polymer Left. 1966, 4, 685) y tendría propiedades mecánicas pobres. Una estrategiasintética alternativa para el P4HB, la polimerización de apertura en anillo del radical libre del dioxolane 2-metileno, resulta en un copolímero que contiene unidades de anillo abierto y no abierto (Bailey, et al. J. Polym. Sci. Polym. Chem. (1982) 20: 3021-30. Bailey, W. J. Polym. Preprints (1984) 25:210-11.). El 4HB ha sido copolimerizado con éxito con 3HB vía polimerización de apertura de anillo (Hori, Y., Yamaguchi, A. and Hagiwara, T. Polymer 1996, 36, 4703-4705.), sin embargo, el peso molecular de los copolímeros fue modesto (menos de 1 x 105 g/mol), especialmente para compuestos con más de 80% de 4HB (menos de 2 x 104 g/mol). Adicionalmente, muchos de los catalizadores utilizados para la síntesis química de poliésteres, contienen metales tóxicos. Estos contaminantes tóxicos pueden evitarse utilizando un proceso biológico para producir los PHA.
II. Formulaciones de PHA con tasas de degradación alteradas
[0045] Las tasas de degradación del p4HB pueden ser manipuladas mediante adición de varios componentes a la composición polimérica, así como la selección de la composición química, peso molecular, condiciones de procesamiento y forma del producto polimérico final. Una porosidad incrementada, la inclusión de sustancias hidrofílicas, y/o el incremento del área superficial expuesta al agua, incrementarán la tasa de degradación. Los recubrimientoshidrófobos o la incorporación a o lamezcla desustanciashidrófobas con los polímeros, disminuirála tasa de degradación.
Aditivos que alteran las tasas de degradación.
[0046] La hidrólisis de polihidroxialcanoatos se acelera con pHs ácidos o básicos y por tanto, puede utilizarse la inclusión de aditivos ácidos o básicos o excipientes, para modular la tasa de degradación de los PHA. Los excipientes pueden añadirse como partículas, pueden mezclarse con cualquier otro aditivo o agente incorporado o a incorporar, o puede disolverse dentro del polímero.
[0047] Los aditivos que enriquecen la tasa de degradación pueden incluir ácidos inorgánicos tales como sulfato de amonio y cloruro de amonio, ácidos orgánicos tales como ácido cítrico, ácidos benzoicos, los péptidos, ácido ascórbico, bases inorgánicas tales como carbonato de sodio, carbonato de potasio, carbonato de calcio, carbonato de zinc e hidróxido de zinc, y bases orgánicas tales como sulfato de protamina, espermina, colina, etanolamina, dietanolamina y trietanolamina y surfactantes como Tween™ and Pluronic™. Tales aditivos se utilizan preferiblemente en concentraciones entre 0,1 y 30% en peso.
[0048] La tasa de degradación también puede mejorarse mediante aditivos que forman poros o aumentan de otra forma el área superficial en el polímero o aumentan el contenido amorfo del polímero. Los agentes formadores de poros se añaden generalmente como partículas e incluyen compuestos solubles en agua tales como sales inorgánicas y azúcares que se retiran mediante lixiviación. Las partículas apropiadas incluyen cristales de sales, proteínas tales como gelatina y agarosa, almidones, polisacáridos tales como alginato y otros polímeros. Los diámetros de las partículas pueden estar entre nanómetros a 500 micras. También pueden ser liofilizables. Los agentes formadores de poros pueden incluirse en una cantidad entre 0,01% y 90% de peso a volumen, preferiblemente a un nivel entre 1 y 30% (p/p, polímero), para incrementar la formación de poros. Por ejemplo, en atomización o evaporación de disolvente, un agente formador de poros tal como una sal volátil, por ejemplo, bicarbonato de amonio, acetato de amonio, cloruro de amonio o benzoato de amonio u otra sal liofilizable, se disuelve primero en agua. La solución que contiene el agente formador de poros se emulsifica entonces con la solución de polímero para crear gotas del agente formador de poros en el polímero. Esta emulsión se atomiza entonces o se somete a un proceso de extracción/evaporación de disolvente. Después el polímero se precipita, se congelan y liofilizan las micropartículas endurecidas para retirar los agentes formadores de poros. Los plastificantes, tales como los ésteres de citrato y otros polímeros como los polihidroxialcanoatos atácticos pueden añadirse para aumentar el carácter amorfo del polímero.
[0049] Los recubrimientos hidrófobos que pueden incorporarse para aumentar las tasas de degradación incluyen compuestos hidrófobos tales como fosfolípidos, colesterol y otros polímeros, así como surfactantes. Estos materiales y métodos para formación de recubrimientos o incorporación a los materiales se describen en WO 96/18420 por Bracco Research SA, WO 92/18164 por Delta Biotechnology, Ltd., WO 95/03356 por Massachusetts Institute of Technology, PCT/US97/03007 por Acusphere, Patente U.S. No. 5,271,961 a Mathiowitz, et al., Patente U.S. No. 5,711,933 a Bichon, et al., y Patente U.S. No. 5,705,187 a Unger. Ejemplos específicos presentan a los ácidos grasos y a los fosfolípidos como emulsionantes para estabilizar la fase grasa en la fase acuosa durante el proceso de emulsión/encapsulado, con el resultado de que las microesferas se recubren con una capa exterior del surfactante. El uso de aditivos tales como grasas, ceras e hidrocarburos de alto peso molecular también se divulgan para hidrofobizar las paredes del polímero y para ralentizar la penetración de agua.
III. Métodos para la producción de dispositivos médicos
[0050] P4HB es útil en la preparación de una diversidad de dispositivos médicos porosos biodegradables.
[0051] Cuando se implantan los PHA depirogenados en el cuerpo, estos materiales muestran muy poca reacción inflamatoria aguada o reacción adversa en los tejidos. No hay respuesta inflamatoria significativa o formación de tejido en forma de escaras. El reclutamiento de células inflamatorias es mínimo. El examen histológico de los dispositivos extraídos demuestra que los materiales son esencialmente inertes. En correspondencia, los dispositivos fabricados a partir de los PHA pueden implantarse conmínimosefectosadversos al tejido circundante. La liberación de los productos de degradación del ácido hidroxi a partir de los materiales implantados es típicamente lenta y bien tolerada por el cuerpo. Por tanto se espera que los PHA mantengan sus propiedades materiales durante meses y finalmente se degradarán a materiales no tóxicos.
[0052] Los dispositivos preparados a partir de P4HB pueden utilizarse en un amplio rango de diversas aplicaciones médicas. Ejemplos de tales aplicaciones incluyen liberación controlada, administración de medicamentos, soportes de ingeniería de tejidos, encapsulado celular; recubrimientos biocompatibles, administración dirigida; implantes biocompatibles; regeneración guiada de tejidos, vendajes, dispositivos ortopédicos, prostéticos y cementos óseos (incluyendo adhesivos y/o rellenos estructurales) y diagnósticos.
[0053] Los P4HB pueden encapsularse, mezclarse con, o acoplarse iónica o covalentemente a cualquiera de una variedad de agentes terapéuticos, profilácticos o diagnósticos. Puede encapsularse o incorporarse una amplia variedad de materiales biológicamente activos, ya sea para su administración a un sitio por parte del P4HB, o para impartir propiedades al P4HB, tales como bioadherencia, unión celular, mejora del crecimiento celular, inhibición de crecimiento bacteriano y prevención de formación de coágulos.
[0054] Ejemplos de agentes terapéuticos y profilácticos apropiados incluyen compuestos sintéticos inorgánicos y orgánicos, proteínas y péptidos, polisacáridos y otros azúcares, lípidos y secuencias de ácido nucleico del ADN y ARN que tengan actividad terapéutca, profiláctica o diagnóstica. Las secuencias de ácidos nucleicos incluyen genes, moléculas antisentido que se vinculan al ADN complementario para inhibir la transcripción y ribozimas. Compuestos con una amplia gama de pesos moleculares pueden ser encapsulados, por ejemplo, entre 100 y 500 000 gramos o más por mol. Los ejemplos de materiales apropiados incluyen proteínas, tales como anticuerpos, ligantes de receptor y enzimas, péptidos tales como péptidos de adherencia, sacáridos y polisacáridos, medicamentos sintéticos inorgánicos y orgánicos y ácidos nucleicos. Los ejemplos de materiales que pueden ser encapsulados incluyen enzimas, factores de coagulación sanguínea, inhibidores o agentes disolventes de coágulos, tales como la estreptoquinasa y activadores plasminógenos del tejido, antígenos para la inmunización; hormonas y factores de crecimiento; polisacáridos tales como la heparina; oligonucleótidos tales como oligonucleótidos antisentido y ribozimas y vectores retrovirales para uso en terapia de genes. El polímero también puede utilizarse para encapsular células y tejidos. Los agentes de diagnóstico representativos son agentes detectables mediante fluorescencia de rayos X, imágenes de resonancia magnética, radioactividad, ultrasonidos, tomografía computerizada y tomografía por emisión de positrones. Los agentes de diagnóstico ultrasónicoson típicamente un gas tal como el aire, oxígeno o perfluorocarbonos.
[0055] En el caso de liberación controlada, puede incorporarse una amplia gama de diferentes compuestos bioactivos a un dispositivo de liberación controlada. El compuesto bioactivo puede incorporarse al P4HB en un porcentaje de carga entre 0,1% y 70% en peso, preferiblemente entre 5% y 50% en peso. El P4HB puede estar en casi cualquier forma física, tal como polvo, película, artículo moldeado, partículas, esferas, látex y materiales cristalinos o amorfos. Puede combinarse con materiales adicionales no-PHA, por ejemplo, otros polímeros. Es apropiado para uso en aplicaciones que requieran materiales moldeables, biocompatibles y de degradación lenta, por ejemplo, dispositivos médicos. Ejemplos de dispositivos médicos que pueden prepararse a partir de polímeros P4HB incluyen varillas, tornillos óseos, pernos, suturas quirúrgicas, stents, dispositivos de ingeniería de tejidos, dispositivos de administración de medicamentos y parches tales como parches para hernias y parches pericárdicos.
[0056] Los implantes degradables fabricados con P4HB pueden utilizarse en una amplia gama de aplicaciones ortopédicas y vasculares, en ingeniería de tejidos, regeneración guiada de tejidos y aplicaciones en las que actualmente se utilizan otros elastómetros termoplásticos (McMillin, Rubber Chem. Technol., 67:417-46 (1994)). Los implantes pueden incluir otros factores para estimular la reparación y la curación. Los dispositivos preferidos son tubos apropiados para el paso de fluidos corporales. Estos dispositivos pueden ser modificados con factores de unión celular, factores de crecimiento, péptidos y anticuerpos y sus fragmentos.
[0057] Los métodos preferidos para la fabricación de dispositivos médicos incluyen dispersión en disolventes, procesamiento mediante fusión, extrusión, , moldeo por inyección y compresión y atomización. Las partículas se preparan preferiblemente directamente a partir de un procesobasado en lafermentación,o medianteuna técnica de evaporación de disolvente, técnica de emulsión doble o mediante microfluidización, utilizando métodos disponibles en la técnica. Koosha, F. Ph.D. Dissertation, 1989, Univ. Nottingham, UK., Diss. Abstr. Int. B 51:1206 (1990); Bruhn,
B.W. and Müeller, B.W. Proceed Intern. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 18:668-69 (1991); Conti, B. et al., J. Microencapsulation, 9:153-166 (1992); Ogawa, Y. et al., Chem. Pharm. Bull., 36:1095-103 (1988); Mathiowitz, E. and Langer, R. "Polyanhydride microspheres as drug delivery systems," M. Donbrow Ed., en "Microcapsules Nanopart. Med Pharm." CRC, Boca Raton, Florida, 1992, Ch. 5, pp. 99-123).
[0058] El P4HB puede fabricarse en forma de dispositivos apropiados para curación de heridas. Por ejemplo, pueden prepararse materiales de fibras no tejidas con este propósito a partir de polímeros produciendo primero fibras de polímeros, presionando los polímeros a través de una salida perforada, utilizando procedimientos conocidos por los expertos en la técnica. Las fibras pueden fabricarse luego en forma de una membrana porosa (tela) dispersándolas sobre un soporte sólido y sometiéndolas a moldeo por compresión. El espesor del dispositivo es preferiblemente menor que 500 μm. El dispositivo de curación de heridas también puede prepararse perforando una película o membrana utilizando un láser para lograr la porosidad, o utilizando una técnica de lixiviación para preparar un material poroso. El tamaño de los poros debe idealmente ser suficientemente pequeño para aislar células y otros tejidos. Los dispositivos de curación de heridas pueden colocarse in vivo para separar los tejidos y estimular su regeneración.
[0059] Los P4HB pueden utilizarse para encapsular células. Utilizando procedimientos conocidos por los expertos en la técnica, las células pueden primeramente ser pre-revestidas. Maysinger, Reviews in the Neurosciences, 6:15-33 (1995). Utilizando un procedimiento de encapsulado de partículas tal como la técnica de doble emulsión, las células pueden entonces ser encapsuladas por los PHA: Ogawa, et.al. Chem Pharm. Bull, 36:1095103 (1998). Las células encapsuladas pueden entonces implantarse in vivo.
[0060] Los P4HB pueden fabricarse en soportes de ingeniería de tejidos utilizando una amplia gama de técnicas de procesamiento de polímeros. Métodos preferidos de fabricación de soportes de ingeniería de tejidos de P4HB incluyen dispersión en disolventes, procesado en fusión, procesamiento/tejido/hilado de fibras, extrusión, moldeo por inyección y compresión, laminación y dispersión en disolvente/lixiviación de disolvente. Esosmétodosson conocidos por los expertos en la técnica.
[0061] Un método preferido de fabricación de soportes de ingeniería de tejidos de P4HB implica el uso de un extrusor, tal como un extrusor Brabender. Por ejemplo, esta técnica puede utilizarse para preparar tubos por extrusión apropiados para la implantación en una gama de longitudes y tamaños.
[0062] Otro método preferente implica la preparación de un soporte de P4HB no tejido a partir de fibras. Las fibras pueden ser producidas a partir de la fusión o solución y procesadas en forma de no tejidos utilizando métodos conocidos por los expertos en la técnica. Las propiedades del no tejido pueden ser personalizadas variando por ejemplo el material P4HB, las dimensiones de la fibra, densidad de la fibra, espesor del material, orientación de la fibra y método de procesamiento de la fibra. Las membranas porosas pueden, si se desea, ser procesadas posteriormente. Por ejemplo, estas membranas pueden conformarse en forma de tubos huecos.
[0063] Otro método preferente implica el procesamiento por fusión o disolvente del P4HB en un molde apropiado y la perforación del material utilizando un láser u otromedio para alcanzar la porosidad deseada. También se prefieren métodos que incluyen enrollar una lámina de P4HB moldeada por compresión en forma de un bucle sellándolo al calor. La lámina de P4HB puede ser enrollada opcionalmente con otro material, como un segundo polímero biodegradable. Por ejemplo, el último material pudiera ser un no tejido de ácido poliglicólico, ácido poliláctico o un copolímero de ácidos glicólico y láctico. Tal procedimiento debe aportar un tubo laminado apropiado para uso en la ingeniería de nuevos vasos, conductos y tubos. El P4HB puede también utilizarse para revestir otros soportes de ingeniería de tejidos. Tales materiales pudieran derivarse a partir de otros polímeros degradables. El recubrimiento puede realizarse por ejemplo, con una solución basada en disolvente, o mediante técnicas de fusión o utilizando un látex P4HB.
[0064] Los dispositivos de ingeniería de tejidos aquí descritos pueden ser sembrados con células antes de la implantación o después de la implantación.Las célulaspuedenser cultivadasa partir de una secciónsana del tejido del donante, expandidas in vitro utilizando técnicas de cultivo celular y luego sembradas en un soporte (o matriz) antes o después de la implantación. Alternativamente, las células pueden obtenerse de tejido de otros donantes o de líneas celulares existentes.
[0065] Los P4HB pueden utilizarse para recubrir otros dispositivos y materiales. Tales recubrimientos pueden mejorar sus propiedades con fines médicos, por ejemplo, mejorar su biocompatibilidad, propiedades mecánicas y adaptar su nivel de degradación y de liberación controlada. Los P4HB pueden ser recubiertos sobre otros dispositivos utilizando procedimientos de fabricación como los antes descritos. El espesor del recubrimiento puede ajustarse a las necesidades de la aplicación específica cambiando el peso del recubrimiento o la concentración aplicada y/o por sobre-recubrimiento.
[0066] Los P4HB pueden fabricarse en stents, utilizando una amplia gama de técnicas de procesamiento de polímeros. Los métodos preferentes de fabricación de stents de P4HB incluyen dispersión en disolventes, procesamiento en fusión, procesado/hilado de fibras, extrusión, moldeo por inyección y por compresión. Tales métodos son conocidos por los expertos en la técnica.
[0067] Antes de la implantación, puede esterilizarse un artículo polimérico reabsorbible para evitar enfermedad e infección al receptor. La esterilización se lleva a cabo antes de sembrar un dispositivo polimérico con células. La esterilización térmica de artículos que contienen P4HB no es práctica ya que el tratamiento térmico puede deformar el artículo, especialmente si el P4HB tiene una temperatura de fusión por debajo de la requerida para el tratamiento de esterilización. Este problema se resuelve utilizando gas de óxido de etileno frío como agente esterilizador. La exposición de un artículo que contenga un P4HB a vapores de óxido de etileno antes de la implantación esteriliza el artículo haciéndolo apropiado para el implante. Durante la esterilización con este gas en frío el artículo que contiene P4HB mantiene su forma. Este tipo de tratamiento es ideal para la esterilización de artículos moldeados o preconformados donde la forma del artículo juega un papel importante en su funcionamiento adecuado.
[0068] Los dispositivos aquí descritos pueden administrarse sistémicamente o localmente. Los métodos preferentes de administración sistémica son la inyección y la implantación.
[0069] Los compuestos y métodos descritos aquí serán entendidos con mayor claridad mediante los ejemplos siguientes, que no son limitantes.
Ejemplo 1: Producción de P4HB en Escherichia coli recombinante
[0070] Cepa MBX1177de E. coli, una derivada de la cepa DH5a elegida por su capacidad para crecer con un ácido 4-hidroxibutírico (4HB) como única fuente de carbono, se transformó con pFS30, un plásmido que contiene genes codificares de la sintasa de PHA a partir de Ralstonia eutropha, transferasa CoA-4-hidroxibutirilo a partir de Clostridium kluweri y 1-lactamasa que confiere resistencia a la ampicilina. La sintasa y transferasa están bajo el control del promotor trc, que es inducible mediante isopropilo-1-D-tiogalactopiranosida (IPTG) en pFS30. Estas células crecieron primeramente en 100 ml LB (Luria Broth, Disco, Detroit, Mich; 25 g/L). más 100 μg/ml de ampicilina durante la noche en unmatraz Erlenmeyer de 250ml a 37º C removiendo a 200 rpm. Este cultivo fue utilizado ensu totalidad como un inóculo para fermentación producida en un recipiente de 7L. La primera etapa de la fermentación consistió en el crecimiento de una biomasa en 5L de LB-ampicilina a 37ºC removiendo a 800 rpm y aireación a 1 volumen volumétrico de aire/min (vvm). Después de 17 horas, el volumen se ajustó a 6L añadiendo un litro de medio, de manera que el volumen total contuviera por litro: 2,5 g de polvo LG, 5 g. de 4HB como sal de sodio, 2 g. de glucosa, 50 mmol de fosfato de potasio (pH7), 7 g. de ácido fosfórico, 100 μg de ampicilina y 0,1 mmol de IPTG. En este momento, la temperatura se ajustó a 33ºC y la velocidad de agitación se redujo a 400 rpm. Se realizaron adicionesperiódicas de glucosa y 4HB desodio cuando el pH estuvosignificativamente pordebajo o por encimade 7, respectivamente, debido a que la adición de glucosa causa una lenta disminución del pH y la adición del 4HB provoca un lento ascenso del pH. El pH no se controló automáticamente. La fermentación continuó en esta forma durante otras 70 horas, en cuyo momento se había alimentado un total de 34 g/L de glucosas y 15 g/L de 4HB. Las células se asentaron a 4ºC durante 2 días, después de cuyo tiempo la fase líquida se extrajo por bombeo y la pasta de células se fluidizó en un Microfluidizador M110-EH (Microfluidics Corporation, Nepon, Mass) at 18 000 psi. El material resultante se liofilizó y extrajo con tetrahidrofurano (THF, 3% p/v P4HB) con calentamiento (60ºC) y agitación mecánica. El extracto resultante de THF se filtró a presión a través de filtros de profundidad de micro-fibra de vidrio (2,3 μm) y Teflón (2μm). El polímero se precipitó en un volumen equivalente de agua y se liofilizó. El polímero se re-disolvió en THF (3% p/v P4HB) con calentamiento (60ºC) y la solución se filtró a través de filtros de profundidad de micro-fibra (2,3 μM) y Teflón (2μm) y se precipitó en agua/THF (1:1). El precipitado se lavó con agua/THF (1.1) y se liofilizó para dar una espuma de color blanco (20 g). Este material se identificó como poli-4hidroxibutirato y se mostró no-citotóxico mediante ensayo de difusión de agar (ISO 10 993 Toxicon Corp.. Bedford, MA). Análisis elemental (C 55,63%, H 7,41%, O 37,28%, N 41 ppm). El análisis GC muestra muy bajo nivel de lípidos en el polímero purificado. El análisis NMR muestra picos esperados y ausencia de lípidos.
Ejemplo 2: Producción de poli (4HB-co-2HB) en Escherichia coli recombinante. (Ejemplo de referencia)
[0071] Cepas de E. coli MBX1177/pFS30 y MBX184 (CGSC6966)_/pFS30 se precultivaron en 300 ml de ampicilina-LB en unmatraz Erlenmeyer de un litroa 30ºC durante la noche removiendo a 200 rpm. Dos alícuotasde 100mlde cada precultivo se centrifugaron (2 000 x g., 10 minutos) y las células obtenidas de cada alícuota se re-suspendieron en 100 mlde unmedio que contenía,por litro: 6,25 g. de polvo LB, 2 g. glucosa, 50mmol de fosfato de potasio (ph 7), 100 μg ampicilina y 100 μmol IPTG. El medio también contenía 2-ácido hidroxibutírico (2HB) y 4HB; en un frasco las concentraciones fueron de 8 g/L 2HB y 2 g/L 4HB y en el otro las concentraciones de los dos ácidos eran de 5 g/L cada una. Ambos ácidos se añadieron a las probetas como sales de sodio; las masas dadas para los ácidos no incluían la masa de sodio. Estas cuatro probetas (dos probetas para cada cepa) se incubaron a 30ºC durante otras 48 horas con agitación a 200 rpm. Las células se retiraron del medio mediante centrifugación (2 000 x g., 10 minutos), se lavaron una vez en agua, se centrifugaron nuevamente y liofilizaron. El análisis mediante cromatografía gaseosa se llevó a cabo en la masa de células liofilizada para analizar el contenido y composición del polímero, ver Tabla 2. Los contenidos y composiciones celulares de los PHA producidos se muestran en la Tabla 2. Cuando la relación de 2HB a 4HB era de 4:1, el contenido de 2HB del polímero era superior al 19% para ambas cepas, mediante análisis GC, mientras que a una relación de 1:1 de 2HB a 4HB, el contenido de 2HB del polímero era de aproximadamente 1%. El 4HB se incorporaba con mayor rapidez al polímero que el 2HB; por tanto, cuando el 4HB estaba presente en 2g/L, el contenido total del polímero de las células era menor que cuando estaba presente en 5 g/L. Los polímeros producidos por el MBX184/pFS30 se extrajeron de las células y se analizaron. La masa de células liofilizada se incubó en 5 ml de cloroformo a 37ºC durante 2 horas. El desecho celular se retiró mediante centrifugación (2 000 x g., 5 minutos) y la solución de polímero resultante se añadió por goteo a 50 ml de etanol para precipitarla. El polímero precipitado se centrifugó del etanol como antes. En el caso de la relación 4:1 2HB:4HB el polímero fue difícil de centrifugar del etanol; formaba una bruma cuando se añadía al etanol pero no todo se podía recolectarmediante centrifugación, probablemente debido a que el peso molecular de este polímero era algo bajo. El polímero aislado de la probeta con 1:1 2HB:4HB se precipitó fácilmente del etanol, y fue recuperado casi totalmente. El análisis GC de estas muestras extraídas (Tabla 2), muestra que el contenido de 2HB era ligeramente menor que cuando el análisis se hacía en células completas. Es posible que los residuos de 2HB en la cadena de polímeros se hidrolicen durante la extracción, disminuyendo por tanto el contenido aparente de 2HB en las muestras extraídas. El hecho de que el peso molecular del polímero extraído sea aparentemente menor cuando el contenido de 2HB era superior, es coherente con esta explicación.
[0072] Se llevó a cabo un segundo experimento con MBX184/pFS30. Estas células se pre-cultivaron en 400 ml de ampicilina LB en un matraz Erlenmeyer de un litro a 30ºC durante la noche con agitación a 200 rpm. Se añadieron 20 ml demedio a cada frasco demaneraque el volumen total contuviera, porlitro: 2,5 g. adicionalesde polvo LG, 2
g. de 4HB como sal de sodio, 2 g. de glucosa, 50 mmol de fosfato de potasio (ph 7), 100 μg de ampicilina, 50 μmol de IPTG y 2, 4, 6 u 8 g. de 2HB como sal de sodio. Los frascos se incubaron durante otras 48 horas a 30ºC y a 200 rpm. Las células se retiraron del medio mediante centrifugación (2 000 x g., 10 minutos) se lavaron una vez con agua, se centrifugaron nuevamente y se liofilizaron. La masa seca de células se sometió a análisis GC como arriba. La Tabla 3 muestra el contenido celular y composición de los polímeros así obtenidos. A relaciones bajas de 2HB:4HB, se incorporó poco o ningún 2HB al polímero, sin embargo cuando esta relación era de 3:1 o 4:1, la incorporación de 2HB al polímero fue significativa. El contenido total de polímero de todas las células fue relativamente bajo, probablemente debido a que los ácidos no están presentes en concentraciones suficientemente altas para permitir la asimilación y/o incorporación para proceder con una relación alta.
Ejemplo 3: Producción de poli-(4HB-co-3HB) en E. coli recombinante. (Ejemplo de referencia)
[0073] La cepa MBX1177/pFS30 se pre-cultivó en 100 ml de ampicilina LB en cuatro matraces Erlenmeyer de 250 mol por separado a 30ºC durante la noche con agitación a 200 rpm. Se realizó una adición de 200 ml de medio en cada probeta de manera que el volumen total contenido por litro fuera: 2,5 g adicionales de polvo LG, 4 g. de 4HB como sal de sodio, 4 g. de glucosa, 50 mmol de fosfato de potasio (pH 7), 100 μg de ampicilina, 50 μmol IPTG; y 0,25, 0,75 o 1 g. de 3-butirato (3HB) comosal desodio. Losmatracesseincubaron durante otras48 horasa 30ºC y 200 rpm. Las células se retiraron delmedio por centrifugación (2000 x g., 10 minutos),se lavaron una vez con agua, se centrifugaron nuevamente y se liofilizaron. Se llevó a cabo el análisis por cromatografía gaseosa en la masa liofilizada de células para analizar el contenido y composición del polímero. El estándar utilizado para probar las unidades de 3-hidroxibutirato en el polímero fue poli(3-hidroxibutirato). Los contenidos celulares y composiciones del PHA producido semuestran en la Tabla 4. A medida que la relación 4HB/3HB en el medio disminuía, el contenido de 3HB del polímero aumentó en forma monotónica, mientras que el contenido total de las células era similar en todas las pruebas. Esto implica que la composición del medio puede utilizarse como predicción para controlar la composición del copolímerosin afectarsignificativamente la producción total del polímero. El polímerose extrajo del resto de la masa celular liofilizada. Para todas las muestras, la masa liofilizada se mezcló con unas tres veces su volumen de 1, 2-dicloroetano y se incubó con una agitación suave en una probeta cerrada a 37ºC durante 6 horas. La materia en partículasseseparó de lasolución de polímeropor centrifugación (2000 x g., 10minutos). Lasolución resultante se añadió por goteo a 10 veces su propio volumen de etanol y al polímero precipitado se le permitió separarse de la solución. El sobrenadante se extrajo y el polímero húmedo restante se asentó hasta que pareció estarseco,entoncesseliofilizó para completar elsecado. Las propiedades térmicas de estas composiciones P4HBco-3HBsemuestran en la Tabla 5.
Ejemplo 4: Degradación de P4HB in vitro e in vivo.
[0074] La degradación del P4HB se estudió in vitro e in vivo. Se examinaron tres configuraciones diferentes de variación de la porosidad (0%, 50% y 80% de porosidad). Se perforaron pequeños discos (5 mm. de diámetro) a partir de películas de P4HB moldeadas por compresión y de espesor uniforme. Las muestras porosas de P4HB se produjeron utilizando la técnica de lixiviación de sal antes descrita. El comportamiento de degradación in vitro se estudió incubando los discos en un buffer de fosfato estéril (8 mM de fosfato de sodio, 2 mM de fosfato de potasio, 140 mM de NaCl, 10 mM de KCl, pH 7,4, conteniendo NaN3 como conservante) a 37ºC. El comportamiento de la degradación in vivo se estudió después de la implantación en bolsones subcutáneos en ratas.
[0075] Preparación del P4HB poroso
Se mezclaron cristales clasificados de cloruro de sodio (80-100 μm) con P4HB fundido. La relación de sal a polímero puede ajustarse para producir la porosidad deseada, mientras que el tamaño de la partícula puede ajustarse para producir poros de diverso tamaño. La mezcla sal polímero se presionó hasta lograr una película fina. Después de permitir que el material se solidificara, la película se retiró del soporte de mylar. La película se extrajo exhaustivamente con agua para retirar la sal, dejando una película porosa de P4HB.
[0076] Degradación acelerada del P4HB. La degradación del P4HB se estudió in vivo. Se examinaron tres configuraciones diferentes de diversa porosidad (0%, 50% y 80% de porosidad). Se perforaron pequeños discos (5mm diám.) a partir de películas de P4HB moldeadas por compresión de espesor uniforme. Las muestras porosas de P4HB se produjeron utilizando una técnica de lixiviación salina. El comportamiento de la degradación in vivo se estudió luego de la implantación en bolsones subcutáneos en ratas. Las muestras se retiraron en diversos momentos. La masa molecular se midió mediante GPC y la pérdida de masa se midió mediante cuantificación del 4HB restante mediante análisis CG. Los resultados semuestran en la Figura 3. Comomuestra la Figura 3, la pérdida de masa en la muestra varía con la porosidad. Las muestras de películas porosas al 50% y 80% mostraron una pérdida de masa del 5%, 20% y 75%, respectivamente, en el período de seis semanas, mientras que la pérdida promedio de masa molecular de estas muestras también disminuyó significativamente (20 al 50%). Estos datos demuestran que la velocidad de degradación de las PHA puede modificarse y controlarse alterando la porosidad e incrementando el área superficial.
Resultados
[0077] Los implantes de P4HB mostraron una respuesta inflamatoria mínima, mucho menor que la de una malla PGA no tejida. Esta es una buena indicación de la biocompatabilidad de estos materiales. Las muestras fueron retiradas en diversos momentos y evaluadas histológicamente tanto con respecto a los implantes como al tejido circundante.La masa molecular se midió porGPC ylapérdida de masa se midióporcuantificacióndel 4HBrestante mediante análisis GC. Los resultados se muestran en las Tablas 6 y 7. Como muestra la Tabla 6, el P4HB no se degrada significativamente in vitro en un período de 10 semanas. Todas estas muestras mantuvieron su peso inicial y se produjo una disminución del 20 al 40% en la masa molecular promedio. Las muestras incubadas in vivo mostraron una degradaciónmás pronunciada. La pérdida de masa varió con la porosidad. Las muestras porosas de película y al 50% y 80% mostraron una pérdida de masa del 20%, 50% y 100% respectivamente en un período de 10 semanas, mientras que la pérdida promedio de masa molecular de estas muestras se redujo significativamente (20 al 50%).
[0078] El examen de las muestras mediante microscopia óptica y microscopia de exploración electrónica ambiental (ESEM) no demuestra cambio discernible en las muestras in vitro durante el período de 10semanas de incubación. Por otra parte, los implantes in vivo muestran signos distintivos de degradación.La superficie de estosmaterialesse degrada progresivamente durante el período de implantación de 10 semanas. Luego de una semana, las muestras de película muestran algunos signos de ruptura y cuarteado, que progresan a erosión y picadura superficial en las nueve semanas siguientes.
[0079] Los datos de degradación in vitro sugieren que el P4HB es relativamente estable a hidrólisis simple, a diferencia de otros poliésteres utilizados en aplicaciones bioreabsorbibles, tales como el PGA, PLA y sus copolímeros. Sin embargo, la degradación de los implantes indica que el P4HB puede ser degradado in vivo, sugiriendo un modo de degradación mediado biológicamente. Los datos muestran degradación creciente con porosidad creciente, lo que indica que el área superficial del implante del polímero juega un papel en su degradación in vivo. Esto sugiere que la degradación de los polímeros P4HB in vivo ocurre en la superficie del implante, a diferencia de los materiales de PGA o PLA que degradan a través del implante por hidrólisis, con disminución asociada de masa molecular y pérdida de propiedades mecánicas. Estos datos sugieren que la velocidad de degradación del P4HB puede modificarse y controlarse alterando su área superficial. También, se espera que este tipo de degradación superficial resultará en una velocidad relativamente lenta de pérdida de la masa molecular permitiendo el mantenimiento de propiedades materiales del polímero más tiempo que los poliésteres médicos absorbibles existentes. Los implantes de P4HB se toleraron muy bien y mostraron solo una mínima reacción a cuerpos extraños. Estos resultados muestran que estos materiales tienen ventajas significativas sobre los poliésteres biomédicos existentes.
Ejemplo 5: Moldeo por compresión
[0080] El P4HB fue comprimido hasta lograr una película fina utilizando una prensa hidráulica Carver. Los rodillos se calentaron hasta 115ºC y el P4HB se comprimió entre dos láminas de mylar utilizando espaciadores metálicos. El espesor del espaciador y la presión de la prensa pueden ajustarse para controlar el espesor de la película. La película se retiró de la prensa y se dejó enfriar a temperatura ambiente. Después de solidificar (en cuestión de segundos), la película pudo ser pelada del material de soporte de mylar. Los datos mecánicos de este material se muestran en la tabla 1. La rápida solidificación del P4HB demuestra su rápida cristalización.
Ejemplo 6: Moldeo por compresión de P4HBporoso.
[0081] Los cristales clasificados de cloruro desodio (80-180 Pm)semezclaron con P4HBfundido comosedescribe en los ejemplos 4 y 5. La relación sal polímero puede ajustarse para producir la porosidad deseada, mientras que el tamaño de partícula puede ajustarse para producir poros de diversos tamaños. La mezcla sal polímero se presionó hasta una película fina utilizando las condiciones descritas en el Ejemplo 6. Después de permitir que el material se solidificara, la películase retiró del soporte de mylar. La películase extrajo exhaustivamente con agua para eliminar la sal, dejando una película porosa de P4HB. La eliminación de sal se supervisó mediante análisis de cloruro en el supernadante y se confirmó mediante análisis elemental de la película lixiviada (menos de 0,5% de cloruro). Los datos mecánicos para el P4HB poroso al 50%, y 80% (pP4HB50 y pP4Hb80, respectivamente), se muestran en la Tabla 1.
Ejemplo 7: Siembra celular de soportes de P4HB
[0082] El P4HB poroso (tal comose describe en el ejemplo 6) se esterilizó mediante tratamiento con óxido de etileno frío. Se sembró con células vasculares ovinas y se cultivó in vitro. Los datos preliminares indicaron muy buena adherencia del material a estas células. Esta es una demostración más de la biocompatibilidad de este material. El número de células adheridasalmaterial puede ser cuantificado utilizando un contraste de ADN y compararlo con las soportes de ingeniería de tejjdos estándares, malla PGA.
Ejemplo 8: Orientación de la fibra.
[0083] Tiras del P4HB moldeadas por compresión se estiraron uniaxialmente. La muestra se encogió y se aclaró, mostrando signos de estricción. Después de este proceso de estirado, el polímero pareció más fuerte y algo más flexible, demostrando una orientación uniaxial de la muestra.
Ejemplo 9: Método de separación térmica de fase para producción de espuma de P4HB.
[0084] El P4HB se disolvió en dioxano a 1 a 5% p/vol. Esta solución de polímero se dispersó como una película gruesa y se solidificó mediante enfriamiento en hielo por debajo del punto de fusión del dioxano. El disolvente se evaporó de este material sólido a baja presión para dar una espuma porosa con dimensiones aproximadas a las de la película gruesa de partida. El análisis por ESEM de este material mostró una estructura altamente porosa de tipo esponja. La concentración de polímero y el proceso de enfriamiento pueden variarse para alterar la porosidad de la espuma. Antes de congelarla, la solución del polímero puede conformarse en una diversidad de formas, descomponerse en partículas de material o utilizarse como recubrimiento. Por tanto, esa técnica de separación térmica de fase puede utilizarse para producir una gran variedad de formas tridimensionales de P4HB altamente porosas.
Ejemplo 10: Recubrimiento de P4HB de una malla PGA no tejida.
[0085] El P4HB se disolvió en tetrahidrofurano a 1% p/vol. Se introdujo una malla PGA no tejida de 1 mm de espesor (Albany International, densidad bruta de 52mg/cc)en estasolución de manera que los vacíos de airese eliminaran. La malla recubierta sesecó al aire y el procedimiento de recubrimiento se repitió. Los análisis pormicroscopia óptica y ESEM de la malla recubierta mostraron que durante el proceso de secado el polímero emigraba a las intersecciones de la fibra, y funcionaba para atar las fibras entre sí. Esta técnica de enlace de fibras se vio que aumentaba dramáticamente la resistencia y facilidad demanipulación de la malla PGA. El ensayo de tracciónsegún ASTM D638, mostró que la tensión de rotura, el módulo de Young y la elongación final de este material fue de 130 psi, 240 psi y 171%. Esto constituye una mejora importante sobre el material no recubierto que era demasiado frágil para ensayar estos parámetros.
Ejemplo 11: Recubrimiento de espuma de P4HB de una malla PGAno tejida.
[0086] El P4HB se disolvió en dioxano a 2,5% p/vol. Se introdujo una malla PGA no tejida de 1 mm. de espesor (AlbanyInternational, densidad aparente 52 mg/cc) en esta solución de manera que los vacíos de airese eliminaran. La malla recubierta se enfrió sobre hielo de manera que la solución de recubrimiento se solidificara. La malla se liofilizó para retirar el dioxano. El análisis por microscopio óptico de la malla recubierta mostró que durante el proceso de liofilización el polímero formó una espuma en forma de red a lo largo de la malla PGA. Este material espumosotiene buena manejabilidad.Elalta área superficial ylas propiedades mecánicas mejoradas son atractivas para una diversidad de aplicaciones.
Ejemplo 12: Formación de microesferas de P4HB.
[0087] El P4HB se disolvió en diclorometano a 1% p/vol. Un volumen de 1 ml de esta solución se mezcló con 5 ml de unasolución de 0,5% p/vol. de dodecilsulfato desodio (SDS).La mezcla de dos fases semezclómecánicamente para dar una emulsión. Un chorro de nitrógeno se pasó en forma de burbujas a través de la mezcla durante 1 hora con agitación rápida para facilitar la eliminación del diclorometano. La suspensión resultante contenía microesferas de P4HB de alrededor de 1-10 μm, determinadas bajo un microscopio óptico de contraste de fase.
Resumen
[0088] El homopolímero P4HB tiene propiedades físicas y características de degradación que lo hacen muy atractivo en implantes para uso en aplicaciones médicas. Este polímero puede fabricarse en implantes tales como fibras, láminas, espumas, recubrimientos, estructuras, filamentos y similares para uso de estos materiales médicos implantables.
Tabla 1: Propiedades térmicas y mecánicas de polímeros médicos seleccionados
Polímero
Tm Tg Resist. a Tracción Módulo Elongación Degradación
(ºC)
(ºC)º (psi) (psi) %
1P4HB
60 -51 7 500 9 400 1 000 Depende config.
1pP4HB50a
60 -51 895 2 155 164 Depende config.
1pP4HB80b
60 -51 180 257 100 Depende config.
6P4HB-3HB 10%
50 -42 9 000 14 500 1 080 No informado
1PHB
175 0 4 000 110 000 4 más de 52 semanas
2PGA
230 35 10 000 1 000 000 17 8 semanas
3PDLLA
Am 53 5 000 300 000 5 Menos de 8 semanas
3PLLA
175 55 10 000 500 000 8 Más de 8 semanas
2DLPLG 50/50
Am 48 7 000 300 000 5 3-8 semanas
5LDPE
2 000 400-700 No degradable
5HDPE
4 000 100-1 000 No degradable
5UHMWPE
7 250 450 No degradable
PP
4 000 20 000 200-700 No degradable
PET
8 500 50 No degradable
PTFE
3,000 @ fluencia 50 000 300 No degradable
Resultados apP4HB50, P4HB 50% poroso, ver ejemplo 7. bpP4HB80, P4HB 80% poroso, ver ejemplo 7. Referencias
1. De este trabajo medido de acuerdo a ASTMD638 a temperatura ambiente y una velocidad de deformación de 0,05
o 0,1 plgd/min. 2. Hutmacher et al. Int. J. Oral Max. Imp. 1996, 11, 667-678. 3. Nobes et aL presentado. 4. Mark, Physical Properties of Polymers Handbook, American Inst. of Physics, Woodbury, New York, 1996. 5. Schwartz, S.S.
and Goodman, S. H. Plastic Materials and Processes, Van Nostrand Reinhold Company, New York, 1982. 6. Saito,
Y. and Doi, Y. Int. J. Biol. Macromol. (1994) 16: 99-104
Tabla 2. Análisis GC de poli(4HB-co-2HB) de MBX1177/pFS30 y MBX184/pFS30
Cepa
4HB, g/L 2HB, g/L PHA total, % de dcwa P4HB, % de PHAb P2HB, % de PHAb
184/30
2 8 18,3 70,8 19,2
(14.2)c
184/30
5 5 47,1 98,8 1,2
(0,9)c
1177/30
2 8 13,0 62,3 27,7
1177/30
5 5 40,1 98,9 1,1
adcw: peso de célula seca
bdeterminado por análisis GC. Alrededor de 20 mg. de masa celular liofilizada se sometió a butanolisis a 110ºC durante 3 horas en 2 ml de una mezcla que contenía (en volumen) 90% 1-butanol y 10% ácido hidroclorhídrico concentrado, con 2mg/ml de ácido benzoicoañadido como un estándar interno. Los componentessolublesen agua 10 de la mezcla resultante se eliminaron por extracción con 3 ml de agua. La fase orgánica (1 μL a una tasa de separación de 1:50 a una tasa de flujo total de 2 ml/min) se analizó en una columna capilar GC de sílice fundida SPB-1 (30 m; 0,32 mm ID; película de O,25 μm; Supelco; Bellefonte, Pa) con el siguiente perfil de temperatura: 80ºC, 2 min; 10ºC porminuto a 250ºC; 250ºC, 2 min. Elestándar utilizado paraensayar para presencia de unidades
de 4-hidroxibutarato en el polímero fue y-butirolactona. El estándar utilizado para ensayar para unidades de 215 hidroxibutirato en el polímero fue sodio (2-hidroxibutirato).
clos porcentajes en paréntesis sedeterminaron medianteanálisisGCcomo antes,pero después de la extracción del polímero en cloroformo y subsiguiente precipitado en etanol.
Tabla 3. Análisis GC de poli(4HB-co-2HB) de MBX184/pFS30.
Muestra
4HB, g/L 2HB, g/L PHA total, % de dcwa P4HB, % de PHAb P2HB, % de PHAb
1
2 2 8,2 100 0
2
2
4 5,6 100 0
3
2 6 5,7 84,1 15,9
4
2 8 4,1 54,3 45,7
adcw: peso célula seca bdeterminado por análisis GC. Ver tabla 2 para detalles
Tabla 4: Análisis GC de poli (4HB-co-3HB) de MBX1177/pFS30
Muestra
4HH, g/L, 3HB, g/L PHA total, % de dcwa P4HB, % de PHAb P3HB, % de PHAb
3a
4 0,25 49,3 98,0 2,0
3b
4 0,5 46,7 94,2 5,8
3c
4 0,75 56,6 91,7 8,3
3d
4 1 51,8 89,4 10,6
adcw: peso célula seca
bdeterminado mediante análisis GC. Ver Tabla 2 para detalles. El estándar utilizado para probar la presencia de 10 unidades de 4-hidroxibutirato en el polímero fue y-butyrolactona. El estándar utilizado para ensayar para unidades de 3-hidroxibutirato en el polímero fue poli(3-hidroxibutirato).
Tabla 5. Propiedades del P4HB y P4HB-co-3HB de MBX1177/pFS30
Muestra
%a 4HB %a 3HB Tmb (ºC) dH Tmlb (J/G) Tgb (ºC) Txb (ºC) Tm2b (ºC) Mwc
P4HB
100 0 60 45 -51 -16 X 1,000,000
3b
94,2 5,8 47 36 -52 -4 44 1,500,000
3c
91,7 8,3 40 20 -53 Nd 39 1,900,000
3d
89,4 10,6 39 17 -53 Nd Nd 1,100,000
nd - no detectado
a Determinado mediante análisis GC, ver Tabla 2 para detalles._
b Determinado por análisis DSC. Se utilizó un calorímetro de scanning diferencial Perkin Elmer Pyris. Las masas de muestra fueron de aproximadamente 4-8 mg. Elprograma térmico utilizado fue comosigue: 25ºC, 2 min; calentar a
5 195ºC a10ºC por min; mantener a 195ºC 2 min; enfriar a -80ºC a 300Cº por min; mantener a -80ºC por 2 min; calentar a 195ºC a 10ºC por min. La temperatura de fusión (Tm) y la entalpía de fusión de este pico de fusión (dHTml) se determinaron en el primer ciclo de calentamiento. La temperatura de transición vítrea (Tg), la temperatura de cristalización (Tx) y la temperatura de fusión (Tm2) se determinaron durante el segundo ciclo de calentamiento.
10 c Determinado por análisis GPC. Los polímerosaisladosse disolvieron en cloroformoa aproximadamente 1mg/ml y lasmuestras (50 PL)se cromatografiaron en una columna Waters Stryagel HT6E a un caudal de 1 ml de cloroformo por minuto a temperatura ambiente, utilizando un detector de índice refractario. Las masas moleculares se determinaron con relación a los estándares de poliestireno de polidispersión estrecha.
Tabla 6: Degradación de P4HB in vitro. Porcentaje de la masa original restante y masa molecular de la
15 película, muestras de P4HB incubadas en buffer fosfato, porosas 50%y 80% (8mM de fosfato de sodio, 2 mM fosfato de potasio, 140 mM de NaCl, 10 mM de KCL, pH 7,4, conteniendo NaN3 como conservante) a 37ºC.
Implantación (semanas)
Peso de la película % restantea Masa molecular de la películab 50% Por. Peso % restanteb 50% Por. Masa molecularb 80% Por. Peso % restantea 80% Por. Masa molecularb
0
108 1 144 592 96 963 145 123 1 291 117
1
97 1 160 707 93 1 103 860 99 968 245
2
101 1 008 496 98 1 055 614 106 1 072 328
4
100 887 005 96 725 089 116 987 665
6
109 896 521 97 764 260 95 1 049 079
10
92 772 485 90 605 608 100 727 543
a Determinado mediante análisis GPC. Ver Tabla 3 para detalles. b Determinado por análisis cuantitativo GC. Ver Tabla 2 para detalles
Tabla 7: Degradación de P4HB in vitro. Porcentaje de masa original restante y masa molecular de la película, muestras de P4HB 50% y 80%porosas implantadas subcutáneamente en ratas
Implantación (semanas)
Peso de la película % restantea Masa molecular de la películab 50% Por. Peso % restanteb 50% Por. Masa molecularb 80% Por. Peso % restantea 80% Por. Masa molecularb
0
108 1 144 592 96 963 145 123 1 291 117
1
103 1 091 107 109 1 026 821 88 1 132 492
2
95 1 054 873 94 973 830 35 943 960
4
92 1 007 736 73 989 629 39 881 919
6
90 797 170 74 901 330 28 689 157
10
80 716 296 48 647 175 0 n/D
N/D No determinado
a Determinado mediante análisis GPC. Ver Tabla 3 para detalles.
b Determinado por análisis cuantitativo GC. Ver Tabla 2 para detalles. A menudo los explantes pesaban más que el implante original debido a la presencia de tejido adherente o sangre coagulada. En consecuencia: lamasade P4HB 10 en el explante se determinó por análisis cuantitativo GC. El porcentaje en peso de P4HB restante se calculó como estamasa dividida por el implante original.

Claims (11)

  1. REIVINDICACIONES
    1.
    Un implante médico biocompatible que comprende un homopolímero de poli (4-hidroxi-butirato) en donde el implante es seleccionado de dispositivos de regeneración tisular guiada, dispositivos de ingeniería de tejidos, soportes de ingeniería de tejidos, espumas, recubrimientos, mallas, micropartículas, materiales de cierre de herida reabsorbibles como materiales de sutura y grapado, dispositivos de liberación controlada, dispositivos de administración de fármacos, dispositivos de encapsulación celular, dispositivos de administración dirigida, dispositivos con revestimientos biocompatibles, dispositivos ortopédicos, prótesis, cementos óseos (incluyendo adhesivos y/o rellenos estructurales), dispositivos de diagnosis, varillas, tornillos óseos, pernos, suturas quirúrgicas, stents, parches (como parches para hernias o parches pericárdicos), dispositivos con aplicaciones vasculares y tubos adecuados para el paso de fluidos corporales.
  2. 2.
    El implante de la reivindicación 1 que es estéril.
  3. 3.
    El implante de cualquier reivindicación anterior para su uso en ingeniería de tejidos, opcionalmente en donde el implante está sembrado con células antes de la implantación o después de la implantación.
  4. 4.
    El implante de la reivindicación 1 o 2 que comprende un agente terapéutico para su uso en administración controlada de fármacos.
  5. 5.
    El implante de la reivindicación 1 o 2 que comprende un agente de tratamiento de imagen seleccionado del grupo de agentes detectablesmediante un método que consiste en ultrasonidos, MRI, CAT, rayos xyfluorescencia.
  6. 6.
    El implante de la reivindicación 1 o 2 para su uso en aplicaciones ortopédicas.
  7. 7.
    El implante de la reivindicación 1 o 2 en forma de micropartículas.
  8. 8.
    El implante de cualquier reivindicación anterior en donde el homopolímero de poli(4-hidroxibutirato) es no poroso.
  9. 9.
    El implante de cualquier reivindicación anterior en donde el implante comprende el homopolímero de poli(4hidroxibutirato) como un recubrimiento.
  10. 10.
    El implante de cualquier reivindicación anterior que además comprende una proteína, péptido, factor de crecimiento, enzima, anticuerpo, antígeno y/o factor celular de unión.
  11. 11.
    El implante de cualquier reivindicación anterior en donde el homopolímero de poli(4-hidroxibutirato) comprende una capa hidrofóbica y/o un surfactante.
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