CZ360396A3 - Micro-organisms enabling intracellular polyhydroxyalkanoate synthesis with simultaneous extracellular polysaccharide synthesis and process for preparing thereof - Google Patents

Micro-organisms enabling intracellular polyhydroxyalkanoate synthesis with simultaneous extracellular polysaccharide synthesis and process for preparing thereof Download PDF

Info

Publication number
CZ360396A3
CZ360396A3 CZ963603A CZ360396A CZ360396A3 CZ 360396 A3 CZ360396 A3 CZ 360396A3 CZ 963603 A CZ963603 A CZ 963603A CZ 360396 A CZ360396 A CZ 360396A CZ 360396 A3 CZ360396 A3 CZ 360396A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
microorganism
leu
ala
arg
hexosyltransferase
Prior art date
Application number
CZ963603A
Other languages
English (en)
Inventor
Jens Kossmann
Volker Buttcher
Thomas Welsh
Original Assignee
Inst Genbiologische Forschung
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Inst Genbiologische Forschung filed Critical Inst Genbiologische Forschung
Publication of CZ360396A3 publication Critical patent/CZ360396A3/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/62—Carboxylic acid esters
    • C12P7/625—Polyesters of hydroxy carboxylic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
    • C12N15/8245—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine involving modified carbohydrate or sugar alcohol metabolism, e.g. starch biosynthesis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
    • C12N15/8245—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine involving modified carbohydrate or sugar alcohol metabolism, e.g. starch biosynthesis
    • C12N15/8246—Non-starch polysaccharides, e.g. cellulose, fructans, levans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12N9/1051—Hexosyltransferases (2.4.1)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Description

Mikroorganismy, umožňující intracelulární polyhydroxyalkanoátovou syntézu se současnou extracelulární polysacharidovou syntézou a způsoby jejich produkce
Oblast techniky
Předložený vynález se týká mikroorganismů, které jsou schopné intracelulárně syntetizovat polyhydroxyalkanoáty a exprimovat extracelulárně enzymy, které katalyzuji syntézu různých polysacharidů, čímž jsou štěpeny di-, oligo- a polysacharidy, které jsou přítomny v kultivační mediu. Tyto enzymy jsou zejména hexosyltransferásy. Navíc se předložený vynález týká způsobů přípravy takových mikroorganismů.
Dosavadní stav techniky
V současné době se mikroorganismy používají ve velkém měřítku pro syntézu různých substancí v biotechnologických výrobních procesech. Syntéza komplexu biopolymerů jako jsou například polyhydroxybutyráty (PHB) nebo polyhydroxyalkanoáty (PHA), inter alia, je velmi důležitá. Tyto biopolymery jsou komerčně zvláště zajímavé, protože vykazují termoplastické vlastnosti, které jsou srovnatelné s vlastnostmi synteticky připravených plastů jako je polypropylen.
Biopolymery PHA a PHB mohou částečně nahradit běžné, průmyslově vyráběné polymery. Jsou zvláště zajímavé pro obalový průmysl, protože vykazují některé výhody ve srovnání s běžnými plasty jako je například 100% biodegradabilita a vynikající kompatibilita se životním prostředím a výhoda využití obnovitelných zdrojů jako výchozích materiálů pro výrobu. Mohou tak přispívat ke snížení plastových odpadů, které je obtížné recyklovat.
Dosud nebylo možno komercionalizovat tyto biopolymery ve velkém měřítku pro jejich vysoké výrobní náklady, vznikající inter alia z vysoké komplexnosti výrobní technologie, vysokých nákladů na výrobní zařízení, nákladného zpracování produktů a vysokých cen surovin. Výroba syntetických petrochemických plastů jako je například polypropylen, je méně nákladná, což vede k tomu, že tyto produkty jsou obvykle nenákladné a připravené ve velkých množstvích.
PHB je polyester kyseliny D(-)-3-hydroxymáselné. Výraz polyhydroxyalkanoát (PHA) jak je zde dále používán, zahrnuje polymery kyseliny 3-hydroxymáselné, polymery příbuzných hydroxyalkanoátů jako je 3-hydroxyvalerát, 3-hydroxyhexanoát a 3-hydroxydekanoát a navíc kopolymery a směsi těchto hydroxyalkanoátů.
Dosud PHB a PHA byly pouze nalezeny v prokaryotech a jsou využívány mnoha bakteriálními druhy jako substance pro intracelulární ukládání uhlíku a energie. Jsou ukládány v buňkách v granulích a mohou činit do 90 % suché hmotnosti buněk.
V současnosti se kopoiymer PHB a polyhydroxyvalerátu připravuje v průmyslovém měřítku u Imperiál Chemical Industries PLC a na trhu je dostupný pod jménem BIOPOL. V romto výrobním procesu se používá mikroorganismus Alcaligenes eutrophus (Byrom, 1992, FEMS Mícrobiol. Rev. 103:247-250). Uvedený mikroorganismus se kultivuje v glukozovém solném mediu ve vsázkovém reaktoru za živných podmínek, umožňujících buněčný růst pouze během prvních 60 hodin a PHB syntézu během fáze následujících 48 hodin. Toto vede k vysoké PHB akumulaci v buňkách. Za účelem izolace PHB z buněk, jsou tyto odděleny z kultivačního media a PHB je, jako obvykle, extrahován z buněk pomocí rozpouštědla (methanol; chloroform/methylenchlorid) a následně vysrážen a sušen ve vakuu.
Nadměrné náklady dosahované při produkci PHA pomocí Alcaligenes eutrophus jsou přiřaditelné částečně malému uhlovodíkovému substrátovému spektru těchto mikroorganismů. Původní typ kmenu pouze využívá fruktozu jako cukr a glukonát cukrové kyseliny (Vilde, 1962, Arch. Mikrobiol. 43:109-137; Gottschalk a spol., 1964, Arch.Mikrobiol. 48:95-108). Mutanti získaní z původního typu kmene mohou také růst na glukóze (Schlegel a Gottschalk, 1965, Biochem. Z. 341:249-259). Tyto kmeny se výhodně používají pro technickou fermentaci, protože glukóza je méně nákladná než fruktoza. Vhodné glukozové zdroje zahrnují disacharidy, jako je sacharoza (glukoza-fruktoza), maltoza (glukoza-glukoza) nebo oligosacharidy jako je dextran nebo dextrin, z nichž některé se tvoří během zpracování zemědělských produktů jako sekundární nebo odpadní produkty.
Nevýhodou použití těchto méně nákladných substrátů je, že mikroorganismy použité pro PHA produkci, zahrnující Alcaligenes eutrophus, nejsou schopné importovat uvedené dinebo oligosacharidy, pro nepřítomnost odpovídajících transportních systémů pro import do buněk. Proto tyto substráty musí být hydrolyzovány před použitím a musí být konvertovány na odpovídající hexozové monomery. Opět jsou taková zpracování časově náročná a nákladná.
Za účelem dosažení redukce v PHA výrobních nákladech zvětšením substrátového spektra Alcaligenes eutrophus, byly vyvíjeny snahy jednak o produkci kmenů, které jsou schopny využít jiné méně nákladné substráty než původní typ, mutagenezí, a jednak o zavedení heterologních genů do mikroorganismu Alcaligenes eutrophus, které umožní aletrnativním substrátům, jako je sacharóza, být transportovány do buněk. Nicméně obě cesty selhaly. Mutageneze vyžaduje screening velmi velkého počtu klonů pro získání vhodného klonu. Zavedení heterologních genů, kódujících transportní systémy alternativních substrátů často zahrnují nesnáze že některé geny tvoří takové transportní systémy.
Proto všechny podstatné geny musí být transferovány a opatřeny promotory, které jsou rozpoznávány v hostiteli pro využití. Obtížnost zde často vyvstávající je, že koordinovaná exprese těchto genů v novém hostiteli neprobíhá správně a proto nedochází k účinné expresi transportního systému, proto za účelem transferu transportačních systémů pro alternativní substráty k dalším mikroorganismů, je, jak je obvyklé, nezbytné znát přesnou kontrolu exprese genů.
Přes mnoho vynaložených snah dosud nebylo možné do širokého spektra substrátů pro PHA produkční mikroorganismy zahrnout nenákladné substráty podílející se na snížení PHA výrobních nákladů. Je zde tedy nutná potřeba vývoje ekonomických PHB a PHA produkčních metod, umožňujících komercionalizaci těchto biopolymerů ve velkém měřítku.
Proto je předložený vynález zaměřen na problém poskytnutí mikroorganismů a procesů, umožňujících méně nákladnou produkci PHA v mikroorganismech.
Tohoto objektu je dosaženo provedeními charakterizovanými v patentových nárocích.
Podstata vvnálezu
Předložený vynález se tak týká mikroorganismů intracelulárně produkujících PHB nebo PHA a umožňujících extracelulární syntézu alespoň jednoho polysacharidu následkem exprese alespoň jednoho extracelulárního proteinu, majícího enzymatickou aktivitu hexosyltransferásy.
Mikroorganismy podle vynálezu jsou výhodně mikroorganismy, patřící do rodu Alcaligenes, zejména Alcaligenes eutrophus nebo mikroorganismu E.coli, který je schopen intracelulární syntézy PHA následkem zavedení genů, kódujících enzyma pro PHA syntézu.
Navíc se vynález týká způsobů přípravy takových mikroorganismů, kde DNA sekvence, kódující alespoň jeden extracelulární protein, mající enzymatickou aktivitu hexosyltransferás, jsou zavedeny do mikroorganismu, který syntetizuje PHB nebo PHA intracelulárně. Uvedené DNA sekvence jsou napojeny k regulátorovým DNA sekvencím pro kontrolu transkripce a obsahují signální sekvenci zajišťující sekreci syntetizovaných proteinů.
Vynález se týká zejména takových procesů, které zahrnují následující stupně:
(a) konstrukci expresní kazety, umožňující expresi extracelulárního proteinu, vykazujícího aktivitu hexosyltransferásy;
(b) transformaci mikroorganismu expresní kazetou konstruovanou ve stupni (a) a (c) kultivaci transformovaného mikroorganismu za podmínek, umožňujících expresi uvedeného proteinu.
V zásadě může být použit jako výše uvedený mikroorganismus jakýkoliv mikroorganismus schopný syntetizovat PHB nebo PHA intracelulárně; bakterie patřící do rodu
Alcaligenes a bakterie druhu E.coli, inkorporující DNA sekvence, kódující enzymy pro syntézu PHA jsou preferovány, i
Expresní kazeta jak je uvedena ve stupni (a) způsobu, která umožňuje expresi extracelulárního proteinu, vykazujícího aktivitu hexosyltransferasy obvykle obsahuje následující DNA sekvence:
(i) promotor sekvenci, umožňující expresi DNA sekvence po směru exprese v hostitelském organismu, který je pak selektován;
(ii) DNA sekvenci, kódující alespoň jeden protein, vykazující aktivitu hexosyltransferasy a připojený k promotoru v sense orientaci; a (iii) DNA sekvenci na 3’ konci DNA sekvence uvedené v (ii) , která slouží jako terminační signál pro transkripci.
Taková expresní kazeta je výhodně umístěna na vektorové molekule, která nehledě na expresní kazetu, obsahuje následující DNA sekvence:
(v) jeden nebo více selekční markerových genů; a (ví) DNA sekvence, umožňující replikaci vektorové DNA ve vybraném mikroorganismu, jestliže vektorová DNA není integrována do genomu mikroorganismu.
Není vždy absolutně nutné, aby jednotlivé sekvence byly přítomny, v závislosti na systému použitém pro expresi. Například DNA sekvence uvedená pod (iii) výše a selekční markerový gen uvedený pod (v) nejsou ve všech případech nezbytné. Dále DNA sekvence, umožňující expresi proteinu, vykazujícího aktivitu hexosyltransferasy nebyl na vektoru umístěny v každém případě, ale mohou být integrovány do genomu hostitelského organismu pomocí homologní nebo nehomologní rekombinace v jedné nebo více kopiích na jedno nebo více míst.
V tomto případě DNA sekvence uvedená v (ví) nebyla přítomna. Navíc je možné, že nejen jedna ale několik DNA sekvencí, kódujících hexosyltransferasy různých typů, je exprimováno v organismu.
Konstrukce takových expresních kazet a vektorů a manipulace použitých DNA sekvencí může být provedena běžnými technikami známými odborníkům. Takové techniky jsou podrobně popsány například v díle Sambrooka a spol., 1989, druhé vydání, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York; Methods in Enzymology, 1979, 1983, 1986 a 1987, Academie Press, New York, sv. 68, 100, 101, 118 a 142-155; a DNA-Cloning, 1985 a 1987, sv. I, II, III, Glover editors, IRL Press, Oxford.
DNA sekvence přirozeně kontrolující transkripci vybraného hexosyltransferasového genu může být použita jako promotorova sekvence, je-li tato aktivní ve vybraném organismu. Nicméně tato sekvence může být také zaměněna za jiné promotorové sekvence. Je možné použít promotory, které působí konstitutivní expresi genu jakož i indukovatelné promotory, umožňující, aby DNA sekvence ve směru exprese byla kontrolována vnějšími faktory. Bakteriální a virální promotorové skvence, vykazující tyto vlastnosti byly popsány podrobně v literatuře. Promotory, umožňující zvláště silnou expresi sekvencí DNA ve směru jsou například T7 promotor (Studier a spol., 1990, v Methods in Enzymology 185:60-89), lacuv5, trp-lacUV5 (DeBoer a spol., v Rodriguez R.L. a Chamberlin M.J.(Eds.), Promoters, Structure and Function; Praeger, New York, 1982, str. 462-481;DeBoer a spol, 1983, Proč. Nati. Acad. Sci . USA 80:21-25), lp-^ , rac (Boros a spol, 1986, Gene 42:97-100) nebo ompF-promotor. Známé promotory zahrnují ty, které jsouindukovatelné sacharozou, například z
Bacillus amyloliquefaciens.
i
DNA sekvence uvedené pod (ii) kódující protein s enzymatickou aktivitou hexosyltransferas, mohou mít různý původ. Takové enzymy a DNA sekvence je kódující jsou například známy z různých mikroorganismů. Enzymy nebo DNA sekvence, které je kódují a jsou popsány dále, se používají v preferovaném provedení vynálezu.
V předloženém vynálezu výraz hexosyltransferasy. označuje enzymy, katalyzující reakce, jejichž mechanismus se liší skutečností, že hexosa je přímo transferována z di-, oligonebo polysacharidů k akceptorú, kterým je pravidelně rostoucí polysacharidový řetězec. V tomto případě katalýza nevyžaduje ani aktivované glukozové deriváty, jaké se vykytují v polysacharidové syntéze v rostlinách a zvířatech, ani kofaktory. Energie nezbytná pro polymerizaci hexosových zbytků je přímo získána štěpením glykosidické vazby v odpovídajícím di-, oligo- nebo polysacharidů.
Hexosyltransferasy využívající sacharozu jako substrát jsou rozlišeny podle toho, zda transferují glukosový zbytek , (glukosyltransferasy) nebo fruktosový zbytek (fruktosyltransferasy) ze sacharozové molekuly k rostoucímu polysacharidovému řetězci. Vzniklé reakční produkty jsou fruktoza a glukany v prvním případě a glukóza a fruktany ve druhém případě.
Glukosyltransferasy využívající sacharozu jako substrát obecně katalyzují reakce následujícího typu:
sacharóza + (glukan)n -----> fruktoza + (glukan)n+1
V závislosti na způsobu, jakým jsou glukozové molekuly vzájemně spojeny ve *glukanu a na výskytu rozvětvení mohou jako reakční produkty vznikat různé glukany.
Extracelulární glukosyltransferasy z druhů Streptococcus, které katalyzují syntézu glukanů, vakazujících rozdílné vlastnosti, jsou známé. Tyto enzymy jsou rozděleny do tří skupin:
(a) glukosyltransferasy, které syntetizují ve vodě rozpustné glukany, z nichž většina je a-1,6 spojena, takzvané dextrany (GTF S-typ) (b) glukosyltransferasy, které syntetizují ve vodě nerozpustné glukany, z nichž většina je a-1,3 spojena, takzvané mutany (GTF I-typ (c) glukosyltransferasy, které syntetizují kmbinaci ve vodě rozpustných a ve vodě nerozpustných glukanů (GTF-SI typ) .
Geny, kódující glukosyltransferasy S-typu, I-typu a SI-typu již byly izolovány ze čtyř různých druhů Streptococcus (přehled viz Giffard a spol., 1993, J.Gen.Microbiol.
139:1511-1522).
Navíc byl popsán gen kódující dextransacharozu (sacharoza: 1,6-a-D-glukan 6-a-D-glukosyltransferasa, E.C.
2.4.1.5.) z Leuconostoc mesendroides (VO 89/12386), Tato transferasa je také glukosyltransferasa, která využívá sacharozu jako substrát. Výsledný glukan, tj, dextran, obsahuje převážně a-1,6 navázané glukosové molekuly, s paralelními řetězci, které jsou mezi sebou vzájemně zesítěný.
Mohou být také použity DNA sekvence, kódující dextranmaltasy nebo dextrandextrinasy.
Další glykosyltransferasa, která využívá sacharozu jako substrát je amylosachárasa (také označena: sacharóza: 1,4-a-D-glukan 4-a-glukosyltransferasa, E.C. 2.4.1.4.). Tento enzym katalyzuje reakci:
sacharóza + (α-1,4-D-glukan) ---> fruktoza + (α-1,4-D-glukan)n+1
Dosud byla amylosacharasa nalezena pouze v málo bakteriálních druzích, zahrnujících hlavně druhy Neisseria (MacKenzie a spol., 1978, Can.J.Microbíol. 24:357-362). DNA sekvence, obsahující region, kódující amylosacharasovou aktivitu, byla izolována z genomické DNA knihovny Neisseria polysaccharea. Uvedená DNA sekvence je obsažena v plasmidu pNB2 (DSM 9196).
Byly také popsány fruktosyltransferasy, využívající sacharozu jako substrát. Tyto katalyzují reakce následujícího typu:
sacharóza + (fruktoza)n---> glukóza + (fruktoza)n+Produkty produkované v této reakci jsou fruktany, nemluvě o glukóze. Obsahují jednu sacharozovou molekulu, ke které jsou adovány fruktozové polymery a která působí jako starterová molekula polymerizační reakce. V závislosti na typu navázání fruktozových molekul, mohou být syntetizované fruktany rozděleny do dvou skupin:
(a) (2 >1) navázané β-D-fruktany (inulinový typ) (b) (2 >6) navázané β-D-fruktany (phleinového nebo levanového typu).
Ve shodě se dvěma různými typy fruktanů, které se mohou objevovat jako syntézhí produkty, jsou fruktosyltransferasy podobně rozděleny do dvou typů, které jsou známé pod běžnými názvy levansacharasa (sacharoza:β-D-fruktosyltransferasa, E.C. 2.4.1.10.) a inulosacharasa (E.C. 2.4.1.9.).
DNA sekvence, kóduj ící levansacharasu a inulosacharasy , byly dosud izolovány z různých mikroorganismů. Tyto zahrnují DNA sekvence z Bacillus amyloliquefaciens (Tang a spol. , 1990, Gene 96:89-93), Bacillus subtilis (Steimetz a spol.,. 1985,
Mol.Gen.Genetics 200: 220-228 a Erwinia amylovora (Geier a Geider, 1993, Phys.Mol.Plant Pathology 42:387-404; DE 4227061.8 a VO 94/04692). Tyto kódují levansacharasy, které katalyzují syntézu polyfruktanů levanového typu. Navíc byla popsána DNA sekvence, kódující fruktosyltransferasu ze Streptococcus mutans (Shiroza a spol., 1988, J.Bacteriology 170:810-816; Sáto a Kuramitsu, 1986, Infect.Immun.
52:166-170). Tento enzym syntetizuje fruktan inulinového typu.
Navíc k hexosyltransferásám, které využívají sacharozu jako substrát, jsou známy hexosyltransferasy, využívající maltozu jako substrát. Například byla popsána amylomaltasa (také nazvaná: α-1,4-glukan:D-glukoza 4-glukosyltransferasa, E.C.2.4.1.3.) z Escherichia coli, pro kterou byl navržen následující reakční mechanismus:
maltoza + (1,4-a-glukan)n ---> D-glukoza + (1,4-a-gůukan)n+1 (Palmer a spol., 1976, Eur.J.Biochem. 69:105-115; Haselbarth a spol. 1971, Biochim.Biophys.Acta 227:2996-3012). Gen, kódující tento cytosolický enzym, podílející se na maltozovém metabolismu E.coli, byl podobně popsán (Pugsley a Dubreuil,
1988, Mol.Microbiol. 2:473-479).
Jestliže DNA sekvence, kódující protein, vykazující aktivitu hexosyltransfferásy, který byl vybrán pro použití, nevykazuje ve svém 5’ regionu DNA sekvenci, kódující signální peptidovou sekvenci, umožňující sekreci hexosyltransferasy, pak DNA sekvence, kódující takovou signální peptidovou sekvenci, může být inzertována mezi promotor a kódující DNA sekvenci. Použitá sekvence musí v každém případě být ve stejném čtecím rámečku jako DNA sekvence, kódující enzym. Takové signální peptidové sekvence se nacházejí například v genu, kódujícím levansacharasu z bakterie rodu Bacillus (Borchert a Nagarajan, 1991, J.Bacteriol. 173:276-282).
Na jedné straně způsob podle předloženého vynálezu umožňuje mikroorganismům, které jsou používány pro PHA produkci fermentačními způsoby, být kultivovány za použití nenákladných substrátů. Hexosyltransferasy secernované do media vedou ke štěpení vhodných di-, oligo- nebo polysacharidů přítomných v mediu. Toto štěpení vede k uvolnění hexos, které jsou importovány mikroorganismy a mohou být využity pro buněčný růst nebo syntézu intracelulárních produktů.
Preferovaná provedení mikroorganismů a způsob podle vynálezu jsou ta provedení, ve kterých hexosyltransferasy využívají disacharidy, zejména sacharozu nebo maltozu jako substráty. Využití sacharozy jako substrátu v kultivačním mediu a exprese secernované glukosyltransferasy působí fruktozu, která může být importována mikroorganismy pro uvolnění do media. Jak je popsáno Linko-em a spol. (1993,
Appl.Microbiol.Biotech. 39:11-15), je fruktoza zvláště vhodný substrát pro intracelulární PHA syntézu a v porovnání s jinými uhlíkovými zdroji vede ke zvláště vysokého PHA podílu v suché hmotnosti buněk. Způsob podle vynálezu tak také poskytuje možnost produkce výhodného, i když relativně nákladného substrátu fruktosy z výrazně méně nákladného substrátu sacharozy a ke sníženi nákladů.
Navíc secernované hexosyltransferasy umožňují extracelulární syntézu různých polysacharidů jak bylo popsáno výše. většina těchto polysacharidů jsou žádoucí komerční produkty.
Je mnoho možných použití dextranu, například v potravinovém sektoru, farmaceutickém sektoru, např. jako náhrady krevní plasmy nebo pro zvýšení viskozity vodných roztoků a v chemickém průmyslu, např. jako báze pro dextranové gelya-1,4 Glukany vytvořené amylosacharasou jsou zvláště komerčně zajímavé, protože jejich chemická struktura odpovídá amylosové čisti rostlinného škrobu. Amylosa se rozsáhle používá inter alia v potravinářském průmyslu, v průmyslu papíru a textilu a při produkci cyklodextrinů. Samotné škroby, které až dosud byly jediným zdrojem pro získání a-1,4 glukanů obsahují nicméně dvě složky. Bez ohledu na amylosu, která je nerozvětveným řetězcem a-1,4 navázaných glukozových jednotek, obsahuje škrob další složku, amylopektin. Toto je vysoce rozvětvený polymer glukozových jednotek, které bez ohledu na a-1,4 vazby, představují rozvětvené glukozové řetězce přes a-1,6 vazby. Kvůli různým strukturám těchto dvou složek a fyzikálně-chemickým vlastnostem z nich vznikajícím, dvě složky také poskytují zcela odlišné možnosti použití. Za účelem přímého zlepšení jednotlivých jednotlivých složek je nezbytné získat je v čisté formě. Obě sloky mohou být získány ze škrobu, což však vyžaduje několik stupňů čištění a je časově náročné a vyžaduje určité náklady.
Přes vynaložené snahy nebylo dosud možné připravit čistou amylosu pomocí mikroorganismů nebo v rostlinách. Produkce čisté amylázy pomocí biotechnolockých procesů pro poskytnutí chemicky jednotné základní substance pro různé průmyslové využití je proto zvláště zajímavá.
Navíc je polyfruktoza nenákladným fruktozovým zdrojem, protože je stabilní, nehygroskopická a proto vykazuje dobré skladovací vlastnosti. Pro své viskozitní vlastnosti se polyfruktoza také jeví být vhodným zahušfovacím činidlem.
V této souvislosti je také důležité, že fruktoza může pouze nedostatečně (tj. mikroorganismy) být využívána a proto je polyfruktoza ideálně vhodná jako aditivum k nízkokalorickým potravinám. Navíc je polyfruktoza vhodná pro enkapsulaci příchutí, barviv a jiných aditiv, protože nemůže absorbovat vodu a proto umožňuje skladování za atmosférických podmínek. Dále je fruktoza také zajímavá jako náhrada chemicky produkovaných lineárních polymerů, které nejsou biologicky degradabilní.
a-1,4 glukany, které jsou syntetizovány amylomaltasou a které za vhodných podmínek mohou dosahovat délek řetězce podobných délkám amylosy, se používaj i pro odpovídaj ící účely jak již bylo popsáno výše pro glukany syntetizované amylosacharasou.
Extracelulárně syntetizované polysacharidy mohou být izolovány přímo z kultivačního media. Intracelulárně vytvořené polyhydroxyalkanoáty mohou být izolovány z buněk po oddělení buněk z kultivačního media. Proto současná extracelulární syntéza těchto polysacharidů ve spojení s intracelulární PHA syntézou může způsobit další redukci výrobních nákladů a může tak přispívat ke zvýšení rentability celého PHA výrobního procesu. 4
Na jedné straně může být konstrukce vektoru, obsahujícího expresní kazetu pro expresi extracelulární hexosyltransferasy provedena takovým způsobem, že expresní kazeta, která je složena z následujících prvků (i) kontrolní prvky pro iniciaci transkripce (promotor) (ii) DNA sekvence, kódující protein s hexosyltransferasovou aktivitou a navázaná k promotoru v sense orientaci a (iii) DNA sekvence na 3’ konci DNA sekvence specifikované v (ii) výše, sloužící jako terminační signál pro transkripci a umožňuje expresi translatovatelné mRNA, je konstruována ve vektoru vhodném pro hostitele zvoleného pro použití.
Na druhé straně může být expresní kazeta konstruována v běžném klonovacím vektoru, izolovaném z klonovacího vektoru s použitím vhodných restrikčních enzymů a inzertovaná do vektoru vhodného pro transformaci hostitele vybraného pro použití.
Navíc může být expresní vektor připraven inzertováním DNA sekvence, kódující protein, vykazující aktivitu hexosyltransferasy, do vektoru již obsahujícího kontrolní prvky pro iniciaci transkripce a DNA sekvenci, sloužící jako terminační signál pro transkripci. V tomto případě mohou být jediné restrikční místo nebo polylinker, do kterého má být DNA sekvence exprimována, inzertovány tak, aby ležely mezi kontrolními prvky pro iniciaci transkripce a terminačním signálem .
i
Existuje velký počet klonovacích vektorů, které jsou vhodné pro přípravu DNA sekvencí uvedených ve výrobních stupních a které obsahují replikační signál pro E.coli a markér gen pro selekci transformovaných bakteriálních buněk. Příklady takových vektorů jsou pBlueskript plasmidy, pBR322, pUC-serie, M13mp-serie, pACYC184 atd. Požadované sekvence mohou být inzertovány do vektoru ve vhodném restrikčním místě. Výsledný plasmid se použije pro transformaci v E.coli buňkách. Obvykle může být transformace provedena podle standardních metod popsaných Sambrookem a spol. (Molecular Cloning,
A Laboratory Manual, 1989, druhé vydání, Cold Spring Harbor Laboratory Press N. Y.). Transformované E.coli buňky jsou kultivovány ve vhodném mediu, sklizena a podrobeny lýzi. Plasmid se pak izoluje. Obecně jsou metody pro charakterizaci výsledné plasmidové DNA restrikční analýza, gelová elektroforéza, sekvenační reakce a jiné metody používané v biochemii a molekulární biologiii. Po každé operaci může být plasmidová DNA štěpena restrikčními endonukleasami a DNA fragmenty, které jsou izolovány mohou být navázány k jiným DNA sekvencím.
Tam, kde se použije Alcaligenes eutrophus pro expresi extracelulární hexosyltransferasy jsou k dispozici tak zvané vektory širokého hostitelského rozmezí, s jejichž pomocí může být transformováno mnoho gramnegativních bakterií. Tyto obsahují DNA sekvence, které umožňují replikaci plasmidové DNA jak v bakteriích jako je E.coli tak v Alcaligenes eutrophus. Tyto vektory zahrnují například plasmidy pLAFR3 a pLARFó (Staskawicz a spol., 1987, J. Bacteriol. 169:5789-5794; Bonas a spol., 1989, M01. Gen. Genet. 218:127-136).
Zavedení vektorů širokého hostitelského rozmezí do Alcaligenes eutrophus4se provádí konjugací s kmenem E.coli, obsahujícím odpovídající plasmid a konjugací s pomocným kmenem prostřednictvím triparentálního sdružování (triparental mating - Figurski a Helinski, 1979, Proč.Nati.Acad.Sci. USA 76:1648-1652; Ditta a spol., 1980, Proč.Nati.Acad.Sci. USA 77:7347-7351).
Transformovaný mikroorganismus se kultivuje v mediu, které musí splňovat požadavky konkrétního hostitele, zejména pokud jde o hodnotu pH, teplotu, ventilaci atd.
Jestliže se použije kultivační medium, které obsahuje sacharozu nebo maltozu, jsou polysachar idy odpovídajícího Typu syntetizovány v mediu se současným uvolňováním hexoz. Hexozy mohou být importovány mikroorganismem, který se kultivuje. Syntetizované polysacharidy mohou být izolovány z kultivačního media po ukončení fermentačního procesu. Izolace intracelulárně syntetizovaného PHB z buněk po jejich odstranění se provede metodami, které jsou známé z literatury.
Vynález se také týká mikroorganismů, produkovaných způsobem podle vynálezu.
Další provedení předloženého vynálezu se týká použití DNA sekvencí, kódujících protein, vykazující enzymatickou aktivitu hexosyltransferas, pro příravu mikroorganismů, které syntetizují PHB nebo PHA intracelulárně a kkteré, díky expresi alespoň jednoho proteinu, vakazujícího enzymatickou aktivitu hexosyltransferásy umožňují extracelulární syntézu alespoň jednoho polysacharidu do kultivačního media.
Navíc se vynález týká použití mikroorganismů připravených podle jednoho ze způsobů podle předloženého vynálezu, pro kombinaci intracelulátní PHB nebo PHA syntézou se současnou extracelulární syntézou polysacharidu díky sekreci proteinu, majícího enzymatickou aktivitu hexosyltransferasy.
Další provedení vynáezu se týká způsobů přípravy PHB, PHA nebo polysacharidu za použití mkroorganismu podle vynálezu.
Použité zkratky:
GTF glukosyltransferasa
PHB polyhydroxybutyrát
Popis obrázků na připojených výkresech:
Obrázek 1 představuje kolonie A.eutrophus, které obsahují plasmid pGE9 a byly kultivovány na FN-mediu, obsahujícím 0,2 % sacharózu při 20 °C po 2 dny. Po vystavení parám jodu na asi 5 min byly kolonie obklopeny modře zbarveným kolem.
Obrázek 2A představuje mikroskopický obraz tepelně fixovaného preparátu A.eutrophus transkonjugantů, obsahujících pGE9 plasmid a vybarvených 1% (hmotn./obj.) roztokem Nile Blue A (1000 násobné zvětšení)
Obrázek 2B představuje mikroskopický obraz jak je popsán na obrázku 2A, připravený za použití světla s vlnovou délkou 460 nm. Při této vlnové délce vykazuje Nile Blue
A barvivo, které se váže k PHB grana fluorescenci (lOOOnásobné zvětšení).
Vynález je ilustrován příklady, které žádným způsobem nijak neomezují rozsah vynálezu.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Konstrukce vektoru širokého hostitele pGE9 pro expresi extracelulární amylosacharasy
Konstrukce vektoru širokého hostitele, umožňujícího expresi extracelulární amylosacharasy v Alcaligenes eutrophus, byla provedena za použití fragmentu genomické DNA z Neisseria polysaccharea, obsahujícího kódující region pro amylosacharasu. Takový fragment byl izolován jako Pstl fragment z vetoru pNB2 (DSM 9196). Uvedený fragment obsahuje DNA sekvenci znázorněnou v SeqlD N0.1. Fragment byl ligován do vektoru pGE151 linearizovaného Pstl (derivát vektoru pKM-6, Kortlůcke a spol., J.Bacteriol. 174 (1992), 6277-6289). Výsledný vektor pGE9 byl transformován do Escherichia coli kmen S17-1 (Simon a spol., Bio/Technology 1 (1983), 784-791) a pěstován v selekčním mediu (YT-medium, obsahující 15 gg/ml tetracyklinu).
Příklad 2
Konjugativní plasmidový transfer mezi E.coli a Alcaligenes eutrophus H16 (Friedrich a spol., J.Bacteriol. 147 (1981) 198-205)
Donorový kmen (E.coli S17-1 s pGE9) připravený podle přííkladu 1 byl inkubován ve 4 ml YT-media při 37 “C přes noc. Příjemce (A.eutrophus H16; Vilde, Arch.Mikrobiol. 43 (1962),
109-13) byl podobně inkubován ve 4 ml YT-media při 28 C přes noc. 4
Kultury pěstované přes noc byly peletovány, promyty jednou YT-mediem a pak opět peletovány. Pelety byly umístěny v lOnásobné koncentraci do fyziologického salinického roztoku (0,9% NaCl roztok). 0,2 ml každého donorového a recipientového koncentrátu byly smíseny a umístěny na pevné YT-medium. Tato vsázka byla inkubována po asi 6 hodin při 28 °C bez rušení.
Plotna pak byla promyta 2 ml fyziologického salinického roztoku. Byla připravena ředění 10 , 10“ a 10” bunecne suspenze. 200 μΐ každého ředění bylo umístěno na selekční medium (FN-medium, obsahující 15 gg/ml tetracyklinu) a inkubováno při 28 °C do růstu kolonií (přibližně 2 dny) . Negativní kontroly byly získány umístěním kultur rostlých přes noc na FN-medium s tetracyklinem a jejich inkubováním také při 28 °C.
Příklad 3
Hodnocení transkonjugantů ne amylosacharasovou aktivitu a současnou produkci poly-3-hydroxybutyrátu (PHB)
Některé kolonie připravené podle příkladu 2 a rostlé na selekční mediu byly transferovány na FN-medium, obsahující tetracyklin a navíc 0,2 % sacharozy po 2 dny. Transkonjuganty byly vystaveny parám jodu za účelem demonstrování glukanů vytvořených amylosacharasou. V případě kolonií secernovanou amylosacharasou vede vystavení parám jodu ke tvorbě modře zbarvených kruhů v souvislosti se tvorbou a-1,4 glukanů (viz obr. 1) .
Pro produkci PHB byly transkonjuganty umístěny do definovaného minimálriího media (MM), které navíc obsahuje 1 % sacharozy a byly inkubovány při 28 °C čtyři dny (Peoples a spol., J.Biol.Chem. 264 (1989), 15298-15303).
Z těchto kultur byly připraveny tepelně fixované preparáty pro hodnocení pod mikroskopem. Preparáty byly vybarveny s 1% (hmotn./obj.) Nile blue A roztokem podle metody Ostle-ho a spol. (Appl.Environ.Microbiol. 44 (1982),
238-241) (viz obr. 2A) . Toto barvivo se váže k PHB grana a fluoreskuje oranžové světlo při stimulaci vlnové délky 460 nm (viz obr. 2B).
Přítomnost a-1,4 glukanů byla prokázána vybarvením supernatantu prostého buněk s roztokem Lugolu.
Použité roztoky a media:
roztok Lugolu 13,1 mM I2
39,6 mM KI rozpuštěný v H2O (dvakrát destilovaná)
YT-medium:
0,8 % bacto-trypton
0,5 % kvasnicového extraktu
0,5 % NaCl
FN-medium: 0,02 % MgS04 . 7H2O 1 0,001 % CaCl2-2H20
0,5.10-3% FeCl3.6H2O (zásobní roztok rozpuštěný v 0, IN
HC1)
0,2 % NH4C1 0,2 % fruktozy + 1 ml SL6-roztoku + 100 ml 10 x H16 pufru ad 1000 ml H20 (dvakrát destilovaná)
ΙΟχ H16 pufr 59,2 g/1 Na2HP04 g/1
SL6-roztok 0,1 g/1 ZnS04.7H20
0,03 g/1 MnS04.4H20 0,3 g/1 H3BO3 0,2 g/1 CoCl2.6H20 0,01 g/1 CuSO4.2H2O 0,02 g/1 NÍC12.6H2O 0,03 g/1 Na2Mo04.2H20 mg/1 CuS04.5H20 100 mg/1 ZnS04.6H20 100 mg/1 MnSO4.4H2O 2,6 g/1 CaCl2.2H20
Roztok stopových prvků
MM: 0,39 g/l MgSO4 * 0,45 g/l K2SO4 ml/1 1,1M H3PO4 15 mg/1 FeSO4.7H2O 24 ml/1 roztoku stopových prvků hodnota pH se upraví pomocí NaOH na 6,8 po sterilizaci se přidá NH4C1 až do konečné koncentrace 0,05 % a fruktoza až do konečné koncentrace 1 % (hmotn./obj.)
Seznam sekvencí (1) Obecná informace:
(i) Přihlašovatel:
(A) Jméno: Institut fůr Genbiologosche Forschung
Berlin GmbH (B) Ulice: Ihnenstrasse 63 (C) Město: Berlín (D) Země: DE (F) Poštovní kod (ZIP): 14195 (G) Telefon: +49 30 8300070 (H) Telefax: +49 30 83000736 (ii) Název vynálezu: Mikroorganismy, umožňující intracelulární polyhydroxyalkanoátovou syntézu se současnou extracelulární polysacharidovou syntézou a způsoby jejich produkce (iii) Počet sekvencí: 2 (iv) Počítačově čtecí forma:
(A) Typ media: Floppy disk (B) Počítač: IBM PC kompatibilní (C) Operační systém: PC-DOS/MS-DOS (D) Software: PatentIn Release #1.0, Version #1.30 (EPO) (ví) Prioritní údaje o přihlášce:
(A) Číslo přihlášky: DE P 44 20 223.7 (B) Datum podání: 06.červen 1994 (2) Informace o SEQ ID NO: 1:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 2883 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: neznámý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (genomická) (iii) Hypotetická: ne (iv) Anti-sense: ne (ví) Původní zdroj:
(A) Organismus: Neisseria polysaccharea (vii) Bezprostřední zdroj:
(A) Knihovna: genomická knihovna v pBluescript11 SK (B) Klon: pNB2 (ix) Rysy:
(A) Jméno/klíč: CDS (B) Lokace: 939..2780 (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 1:
CSAGTTTTGCG TTCCCGAACC GAACGTGATG CTTGAGCCGA ACACCTGTCG GCAAGCGCTG 60
ACCGCCTTTT GCCCCATCGA CATCGTAACA ATCGGTTTGG TGGCAAGCTC TTTCGCTTTG 120
AGCGTGGCAG AAAGCAAAGT CAGCACGTCT TCCGGCCTTT CGGCATCACC GCAATTTTGC 180
AGATGTCCGC GCCGCAGTCC TCCATCTGTT TCAGACGGCA TACGATTTCT TCTTGCGGCG 240
GCGTGCGGTG AAACTCATGA TTGCAGAGCA GGGCGATGCC GTTTTTTTGA GCATGCCACG 300
GCGCCGGAGC GGTTTCGCCG GAAAAAAGCT CGATATCGAT AATGTCGGGC AGGCGGCTTT 360
CAATCAGCGA GTCGAGCAGT TCAAAATAAT AATCGTCCGA ACACGGGAAC GAGCCGCCTT 420
CGCCATGCCG TCTGAACGTA AACAGCAGCG GCTTGTCGGG CAGCGCGTCG CGGACGGTCT 480
GCGTGTGGCG CAATACTTCG CCGATGCTGC CCGCGCATTC CAAAAAATCG GCGCGGAACT 540
CGACGATATC GAAGGGCAGG TTTTTGATTT GGTCAAGTAC GGCGGAAAGT ACGGCGGCAT 600
CGCGGGCGAC AAGCGGCACG GCGATTTTGG TGCGTCCGCT TCCGATAACG GTGTTTTTGA 660
CGGTCAGGGC TGGTGTGCAT GGCGGTTGTT GCGGCTGAAA GGAACGGTAA AGACGCAATT 720
ATAGCAAAGG CACAGGCAAT GTTTCAGACG GCATTTCTGT GCGGCCGGCT TGATATGAAT 780
CAAGCAGCAT CCGCATATCG GAATGCAGAC TTGGCACAAG CCTGTCTTTT CTAGTCAGTC 840
CGCAGTTCTT GCAGTATGAT TGCACGACAC GCCCTACACG GCATTTGCAG ·> GATACGGCGG 900
CAGACCGCGT CGGAAACTTC AGAATCGGAG CAGGCATC ATG TTG ACC CCC ACG 953
Met Leu Thr Pro Thr 1 5
CAG Gin CAA GTC GGT TTG ATT TTA CAG TAC CTC AAA ACA CGC ATC TTG Ile Leu 20 GAC Asp 1001
Gin Val Gly Leu 10 Ile Leu Gin Tyr Leu 15 Lys Thr Arg
ATC TAC ACG CCC GAA CAG CGC GCC GGC ATC GAA AAA TCC GAA GAC TGG 1049
Ile Tyr Thr Pro Glu Gin Arg Ala Gly Ile Glu Lys Ser Glu Asp Trp
25 30 35
CGG CAG TTT TCG CGC CGC ATG GAT ACG CAT TTC CCC AAA CTG ATG AAC 1097
Arg Gin Phe Ser Arg Arg Met Asp Thr His Phe Pro Lys Leu Met Asn
40 45 50
GAA CTC GAC AGC GTG TAC GGC AAC AAC GAA GCC CTG CTG CCT ATG CTG 1145
Glu Leu Asp Ser Val Tyr Gly Asn Asn Glu Ala Leu Leu Pro Met Leu
55 60 65
GAA ATG CTG CTG GCG CAG GCA TGG CAA AGC TAT TCC CAA CGC AAC TCA 1193
Glu Met Leu Leu Ala Gin Ala Trp Gin Ser Tyr Ser Gin Arg Asn Ser
70 75 80 85
TCC TTA AAA GAT ATC GAT ATC GCG CGC
Ser Leu Lys Asp Ile 90 Asp Ile Ala Arg
TTG TCC AAC AAA CAA GTC ‘GGC GGC GTG
Leu Ser Asn Lys 105 Gin Val Gly Gly Val 110
GGC GAT TTG AAG GGC TTG AAA GAT AAA
Gly Asp Leu 120 Lys Gly Leu Lys Asp 125 Lys
GGT TTG ACT TAT CTG CAC CTG ATG CCG
Gly Leu 135 Thr Tyr Leu His Leu 140 Met Pro
AAA AGC GAC GGC GGC TAT GCG GTC AGC
Lys 150 Ser Asp Gly Gly Tyr 155 Ala Val Ser
GCA CTG GGC ACA ATA GGC GAC TTG CGC
Ala Leu Gly Thr Ile 170 Gly Asp Leu Arg
GAA TCG CAT TTC CGC CGT CGT CGA TTT
Glu Ser Eis Phe 185 Arg Arg Arg Arg Phe 190
CGA ACA CGA ATG GCG CAA CGC TGC GCC
Arg Thr Arg 200 Met Ala Gin Arg Cys 205 Ala
TTC TAC TAT ATT TTC CCC GAC CGC CGG
Phe Tyr 215 Tyr Ile Phe Pro Asp 220 Arg Arg
ACC CTG CGC GAA ATC TTC CCC GAC CAG
Thr 230 Leu Arg Glu Ile Phe 235 Pro Asp Gin
CTG GAA GAC GGA CGC TGG GTG TGG ACG
Leu Glu Asp Gly Arg 250 Trp Val Trp Thr
GAC TTG AAT TAC AGC AAC CCG TGG GTA
Asp Leu Asn Tyr 265 Ser Asn Pro Trp Val 270
TGC TGT TCC TTG CCA ACT TGG GCG TTG
Cys Cys Ser 280 Leu Pro Thr Trp Ala 285 Leu
TTG CCT TTA TTT GGA AAC AAA TGG GGA
Leu Pro 295 Leu Phe Gly Asn Lys 300 Trp Gly
GAA AAC AAC CCC GAT TGG ATT 1241
Glu 95 Asn Asn Pro Asp Trp 100 Ile
TGC TAC GTT GAT TTG TTT GCC 1289
Cys Tyr Val Asp Leu 115 Phe Ala
ATT CCT TAT TTT CAA GAG CTT 1337
Ile Pro Tyr Phe 130 Gin Glu Leu
CTG TTT AAA TGC CCT GAA GGC 1385
Leu Phe Lys 145 Cys Pro Glu Gly
ACG TAC CGC GAT GTC AAT CCG 1433
Thr Tyr 160 Arg Asp Val Asn Pro 165
GAA GTC ATT GCT GCG CTG CAC 1481
Glu 175 Val Ile Ala Ala Leu 180 His
TAT CTT CAA CCA CAC CTC CAA 1529
Tyr Leu Gin Pro His 195 Leu Gin
GGC GAC CCG CTT TTC GAC AAT 1577
Gly Asp Pro Leu 210 Phe Asp Asn
ATG CCC GAC CAA TAC GAC CGC 1625
Met Pro Asp 225 Gin Tyr Asp Arg
CAC CCG GGC GGC TTC TCG CAA 1673
His Pro 240 Gly Gly Phe Ser Gin 245
ACC TTC AAT TCC TTC CAA TGG 1721
Thr 255 Phe Asn Ser Phe Gin 260 Trp
TTC GCG CAA TGG CGG GCG AAA 1769
Phe Ala Gin Trp Arg 275 Ala Lys
ACA TCC TGC GTA TGG ATG CGG 1817
Thr Ser Cys Val 290 Trp Met Arg
CAA GCT GCG AAA ACC TGC GCA 1865
Gin Ala Ala Lys Thr Cys Ala
305
7
GCG Ala 310 CAC GCC CTC Leu ATC Ile CGC Arg 315 GCG TTC AAT GCC GTT ATG CGT ATT GCC GCG 1913
His Ala Ala 4 Phe Asn Ala Val 320 Met Arg Ile Ala Ala 325
CCC GCC GTG TTC TTC AAA TCC GAA GCC ATC GTC CAC CCC GAC CAA GTC 1961
Pro Ala Val Phe Phe Lys Ser Glu Ala Ile Val His Pro Asp Gin Val
330 335 340
GTC CAA TAC ATC GGG CAG GAC GAA TGC CAA ATC GGT TAC AAC CCC CTG 2009
Val Gin Tyr Ile Gly Gin Asp Glu Cys Gin Ile Gly Tyr Asn Pro Leu
345 350 355
CAA ATG GCA TTG TTG TGG AAC ACC CTT GCC ACG CGC GAA GTC AAC CTG 2057
Gin Met Ala Leu Leu Trp Asn Thr Leu Ala Thr Arg Glu Val Asn Leu
360 365 370
CTC CAT CAG GCG CTG ACC TAC CGC CAC AAC CTG CCC GAG CAT ACC GCC 2105
Leu His Gin Ala Leu Thr Tyr Arg His Asn Leu Pro Glu His Thr Ala
375 380 385
TGG GTC AAC TAC GTC CGC AGC CAC GAC GAC ATC GGC TGG ACG TTT GCC 2153
Trp Val Asn Tyr Val Arg Ser His Asp Asp Ile Gly Trp Thr Phe Ala
390 395 400 405
GAT GAA GAC GCG GCA TAT CTG GGC ATA AGC GGC TAC GAC CAC CGC CAA 2201
Asp Glu Asp Ala Ala Tyr Leu Gly Ile Ser Gly Tyr Asp His Arg Gin
410 415 420
TTC CTC AAC CGC TTC TTC GTC AAC CGT TTC GAC GGC ACG TTC GCT CGT 2249
Phe Leu Asn Arg Phe Phe Val Asn Arg Phe Asp Gly Thr Phe Ala Arg
425 430 1 435
GGC GTA CCG TTC CAA TAC AAC CCA AGC ACA GGC GAC TGC CGT GTC AGT 2297
Gly Val Pro Phe Gin Tyr Asn Pro Ser Thr Gly Asp Cys Arg Val Ser
440 445 450
GGT ACA GCC GCG GCA TTG GTC GGC TTG GCG CAA GAC GAT CCC CAC GCC 2345
Gly Thr Ala Ala Ala Leu Val Gly Leu Ala Gin Asp Asp Pro His Ala
455 460 465
GTT GAC CGC ATC AAA CTC TTG TAC AGC ATT GCT TTG AGT ACC GGC GGT . 2393
Val Asp Arg Ile Lys Leu Leu Tyr Ser Ile Ala Leu Ser Thr Gly Gly
470 475 480 485
CTG CCG CTG ATT TAC CTA GGC GAC GAA GTG GGT ACG CTC AAT GAC GAC 2441
Leu Pro Leu Ile Tyr Leu Gly Asp Glu Val Gly Thr Leu Asn Asp Asp
490 495 500
GAC TGG TGC CAA GCA GCA ATA AGA GCG ACG ACA GCC GTT GGG CCA CCG 2489
Asp Trp Cys Gin Ala Ala Ile Arg Ala Thr Thr Ala Val Gly Pro Pro
505 510 515
TCC GCG CTA CAA CGA AGC CCT GTA CGC GCA ACC GAA CGA TCC GTC GAC 2537
Ser Ala Leu Gin Arg Ser Pro Val Arg Ala Thr Glu Arg Ser Val Asp
520 525 530 δ
CGC Arg AGC Ser 535 CGG Arg CAA ATC TAT CAG GGC Gly TTG CGC CAT ATG ATT GCC GTC CGC Val Arg 2585
Gin Xle Tyr Gin 540 Leu Arg His Met 545 Ile Ala
CAA AGC AAT CCG CGC TTC GAC GGC GGC AGG CTG GTT ACA TTC AAC ACC 2633
Gin Ser Asn Pro Arg Phe Asp Gly Gly Arg Leu Val Thr Phe Asn Thr
550 555 t 560 565
AAC AAC AAG CAC ATC ATC GGC TAC ATC GCA ACA ATG CGC TTT TGG CAT 2681
Asn Asn Lys His Ile Ile Gly Tyr Ile Ala Thr Met Arg Phe Trp His
570 575 580
TCG GTA ACT TCA GCG AAT ATC CGC AAA CCG TTA CCG CGC ATA CCC TGC 2729
Ser Val Thr Ser Ala Asn Ile Arg Lys Pro Leu Pro Arg Ile Pro Cys
585 590 595
AAG CCA TGC CCT TCA AGG CGC ACG ACC TCA TCG GTG GCA AAA CTG TCA 2777
Lys Pro Cys Pro Ser Arg Arg Thr Thr Ser Ser Val Ala Lys Leu Ser
600 605 610
GCC TGAATCAGGA TTTGACGCTT CAGCCCTATC AGGTCATGTG GCTCGAAATC 283 0
Ala
GCCTGACGCA CGCTTCCCAA ATGCCGTCTG AACCGTTTCA GACGGCATTT GCG 2883 (2) Informace o SEQ ID NO: 2:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 614 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence: SEQ ID N0:2:
Met Leu Thr Pro Thr Gin Gin Val Gly Leu Ile Leu Gin Tyr Leu Lys
1 5 10 15
Thr Arg Ile Leu 20 Asp Ile Tyr Thr Pro 25 Glu Gin Arg Ala Gly 30 Ile Glu
Lys Ser Glu 35 Asp Trp Arg Gin Phe 40 Ser Arg Arg Met Asp 45 Thr His Phe
Pro Lys 50 Leu Met Asn Glu Leu 55 Asp Ser Val Tyr Gly 60 Asn Asn Glu Ala
Leu 65 Leu Pro Met Leu Glu 70 Met Leu Leu Ala Gin 75 Ala Trp Gin Ser Tyr 80
Ser Gin Arg Asn Ser 85 Ser Leu Lys Asp Ile 90 Asp Ile Ala Arg Glu 95 Asn
Asn Pro Asp Trp 100 Ile Leu Ser Asn Lys 105 Gin Val Gly Gly Val 110 Cys Tyr
Val Asp Leu 115 Phe Ala Gly Asp Leu 120 Lys Gly Leu Lys Asp 125 Lys Ile Pro
Tyr Phe 130 Gin Glu Leu Gly i Leu 135 Thr Tyr Leu His Leu 140 Met Pro Leu Phe
Lys 145 Cys Pro Glu Gly Lys 150 Ser Asp Gly Gly Tyr 155 Ala Val Ser Thr Tyr 160
Arg Asp Val Asn Pro 16S Ala Leu Gly Thr Ile 170 Gly Asp Leu Arg Glu 175 Val
Ile Ala Ala Leu 180 His Glu Ser His Phe Arg 185 Arg Arg Arg Phe 190 Tyr Leu
Gin Pro His 195 Leu Gin Arg Thr Arg 200 Met Ala Gin Arg Cys 205 Ala Gly Asp
Pro Leu 210 Phe Asp Asn Phe Tyr 215 Tyr Ile Phe Pro Asp 220 Arg Arg Met Pro
Asp 225 Gin Tyr Asp Arg Thr 230 Leu Arg Glu Ile Phe 235 Pro Asp Gin His Pro 240
Gly Gly Phe Ser Gin 245 Leu Glu Asp Gly Arg 250 Trp Val Trp Thr Thr 255 Phe
Asn Ser Phe Gin 260 Trp Asp Leu Asn Tyr Ser 265 Asn Pro Trp Val 270 Phe Ala
Gin Trp Arg 275 Ala Lys Cys Cys Ser 280 Leu Pro Thr Trp $la 285 Leu Thr Ser
Cys Val 290 Trp Met Arg Leu Pro 295 Leu Phe Gly Asn Lys 300 Trp Gly Gin Ala
Ala 305 Lys Thr Cys Ala Ala 310 His Ala Leu Ile Arg 315 Ala Phe Asn Ala Val 320
Met Arg Ile Ala Ala 325 Pro Ala Val Phe Phe 330 Lys Ser Glu Ala Ile 335 Val
His Pro Asp Gin 340 Val Val Gin Tyr Ile Gly 345 Gin Asp Glu Cys 350 Gin Ile
Gly Tyr Asn 355 Pro Leu Gin Met Ala 360 Leu Leu Trp Asn Thr 365 Leu Ala Thr
Arg Glu 370 Val Asn Leu Leu His 375 Gin Ala Leu Thr Tyr 380 Arg His Asn Leu
Pro 385 Glu His Thr Ala Trp 390 Val Asn Tyr Val Arg 395 Ser His Asp Asp Ile 400
Gly Trp Thr Phe Ala Asp Glu Asp Ala Ala Tyr Leu . Gly Ile Ser Gly
405 410 415
Nýv '~*3 ί-^ί’Ά Λ. rti/z<-·«\ >
- 31 -Ό
33;
< T3 1
£ 1 O
3 0*3
82 s c j
c?
>< o
o <= σ i — co* r-* ; oc
-1 £ <£> O
χ I o cn
Ο< S

Claims (14)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Mikroorganismus, který syntetizuje PHB nebo PHA intracelulárně a umožňuje extracelulární syntézu alespoň jednoho polysacharidu, následkem exprese alespoň jednoho proteinu, majícího enzymatickou aktivitu hexosyltransferasy.
  2. 2. Mikroorganismus podle nároku 1, kde proteinem s enzymatickou aktivitou hexosyltransferasy je glukosyltransferasa nebo fruktosyltransferasa.
  3. 3. Mikroorganismus podle nároku 2, kde glukosyltransferasa je amylosacharasa (EC 2.4.1.4), amylomaltasa (EC 2.4.1.3), dextrasacharasa (EC 2.4.1.5), glukosyltransferasa S, I nebo SI typu z druhů. Streptococcus, nebo dextran dextrinasa.
  4. 4. Mikroorganismus podle nároku 2, kde fruktosyltransferasa je levansacharasa (EC 2.4.1.10) nebo inulosacharasa (EC 2.4.1.9).
  5. 5. Mikroorganismus podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4, mikroorganismus patřící do rodu Alcaligenes nebo druhů Escherichia coli.
  6. 6. Způsob přípravy mikroorganismu, který syntetizuje PHB nebo PHA intracelulárně a umožňuje extracelulární syntézu alespoň jednoho polysacharidu, přičemž DNA sekvence, kódující alespoň jeden extracelulární protein, mající enzymatickou aktivitu hexosyltransferasy jsou zavedeny do mikroorganismu, který itracelulárně syntetizuje PHB nebo PHA.
  7. 7. Způsob podle nároku 6, vyznačuj ící se tím, že zahrnuje následující stupně:
    (a) konstrukci expresní kazety, umožňující expresi extracelulárního proteinu, vykazujícího aktivitu hexosyltransferasy;
    (b) transformaci mikroorganismu expresní kazetou konstruovanou ve stupni (a) a (c) kultivaci transformovaného mikroorganismu za podmínek, umožňujících expresi uvedeného proteinu.
  8. 8. Způsob podle nároku 6 nebo 7, vyznačující se tím, že proteinem s enzymatickou aktivitou hexosy ltransf erasy je glukosyltransf erasa nebo fruktosyltransferasa.
  9. 9. Způsob podle nároku 8, vyznačující se t í m, že glukosyltransferasa je amylosacharasa (EC 2.4.1.4), amylomaltasa (EC 2.4.1.3), dextrasacharasa (EC 2.4.1.5), glukosyltransferasa S, I nebo SI typu z druhů Streptococcus, nebo dextran dextrinasa.
  10. 10. Způsob podle nároku 8,vyznačující se tím, že fruktosyltransferasa je levansacharasa (EC 2.4.1.10) nebo inulosacharasa (EC 2.4.1.9).
  11. 11. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 6 až 10, vyznačuj ícíse tím, že mikroorganismus patří do rodu Alcaligenes nebo druhů
    Escherichia coli.
  12. 12. Použití DNA sekvencí, kódujících protein, mající enzymatickou aktivitu hexosyltransferasy, pro přípravu mikroorganismů, které syntetizují PHB nebo
    PHA intracelulárně a umožňují extracelulární syntézu alespoň jednoho polysachariduí na základ exprese alespoň jedné extracelulární hexosyltransferasy.
  13. 13. Použití mikroorganismu podle kteréhokoliv z nároků 1 až 5 pro přípravu PHB, PHA nebo pólysacharidu.
  14. 14. Způsobu přípravy PHB, PHA nebo póly sacharidu, při kterém se použije mikroorganismus podle kteréhokoliv z nároků 1 až 5.
CZ963603A 1994-06-06 1995-06-06 Micro-organisms enabling intracellular polyhydroxyalkanoate synthesis with simultaneous extracellular polysaccharide synthesis and process for preparing thereof CZ360396A3 (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE4420223A DE4420223C1 (de) 1994-06-06 1994-06-06 Verfahren zur Kombination der intrazellulären Polyhydroxyalkanoat-Synthese in Mikroorganismen mit einer extrazellulären Polysaccharid-Synthese

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CZ360396A3 true CZ360396A3 (en) 1997-04-16

Family

ID=6520214

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ963603A CZ360396A3 (en) 1994-06-06 1995-06-06 Micro-organisms enabling intracellular polyhydroxyalkanoate synthesis with simultaneous extracellular polysaccharide synthesis and process for preparing thereof

Country Status (8)

Country Link
EP (1) EP0760856A1 (cs)
JP (1) JPH10504182A (cs)
AU (1) AU696978B2 (cs)
CZ (1) CZ360396A3 (cs)
DE (1) DE4420223C1 (cs)
HU (1) HUT76348A (cs)
IL (1) IL114020A0 (cs)
WO (1) WO1995033838A1 (cs)

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2287935T3 (es) 1994-05-18 2007-12-16 Bayer Bioscience Gmbh Secuencias de adn codificantes de enzimas capaces de facilitar la sintesis de a-1,4 glucanos lineales en plantas, hongos y microorganismos.
NL1000064C1 (nl) 1994-07-08 1996-01-08 Stichting Scheikundig Onderzoe Produktie van oligosacchariden in transgene planten.
NL1002275C2 (nl) * 1996-02-07 1997-08-08 Have D J Van Der Bv Modificatie van polysacchariden.
US6833491B2 (en) 1996-02-07 2004-12-21 D. J. Van Der Have B.V. Modification of polysaccharides
DE19729273C2 (de) * 1997-07-09 2000-08-17 Aventis Res & Tech Gmbh & Co Thermoplastische Mischung auf 1,4-alpha-D-Polyglucanbasis, Verfahren zu deren Herstellung und Verwendung
JP2002524080A (ja) * 1998-09-02 2002-08-06 プランテック バイオテクノロジー ゲーエムベーハー アミロスクラーゼをコードする核酸分子
DE10225380B4 (de) * 2002-06-07 2006-07-06 Technische Universität Braunschweig Produktion und Sekretion von Glucosyltransferasen
CZ2012571A3 (cs) 2012-08-27 2013-12-11 Vysoké ucení technické v Brne Zpusob produkce polyhydroxyalkanoátu (PHA) na olejovém substrátu
JP5882415B2 (ja) * 2013-12-27 2016-03-09 物産フードサイエンス株式会社 フルクトースが付加された糖質の製造方法

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5371002A (en) * 1989-06-07 1994-12-06 James Madison University Method of production of poly-beta-hydroxyalkanoate copolymers
KR100189468B1 (ko) * 1991-04-09 1999-06-01 양갑석 폴리-베타-하이드록시알카노에이트(pha)공중합체및그제조방법,이를생산하는미생물과pha공중합체의고분자블렌드

Also Published As

Publication number Publication date
EP0760856A1 (en) 1997-03-12
WO1995033838A1 (en) 1995-12-14
DE4420223C1 (de) 1995-05-04
AU696978B2 (en) 1998-09-24
HUT76348A (en) 1997-08-28
JPH10504182A (ja) 1998-04-28
HU9603363D0 (en) 1997-02-28
AU2787895A (en) 1996-01-04
IL114020A0 (en) 1995-10-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU699552B2 (en) DNA sequences coding for enzymes capable of facilitating the synthesis of linear alpha-1,4 glucans in plants, fungi and microorganisms
JP4554083B2 (ja) オルタナンスクラーゼをコードする核酸分子
US20070087426A1 (en) Novel transferase and amylase, process for producing the enzymes, use thereof, and gene coding for the same
CA2342124A1 (en) Nucleic acid molecules encoding an amylosucrase
FR2897069A1 (fr) Construction de nouveaux variants de l&#39;enzyme dextrane-saccharase dsr-s par ingienerie moleculaire.
CZ360396A3 (en) Micro-organisms enabling intracellular polyhydroxyalkanoate synthesis with simultaneous extracellular polysaccharide synthesis and process for preparing thereof
Ortiz-Soto et al. Biochemical properties of inulosucrase from Leuconostoc citreum CW28 used for inulin synthesis
Nakapong et al. Heterologous expression of 4α-glucanotransferase: Overproduction and properties for industrial applications
JP4659983B2 (ja) フルクトース転移酵素活性を有する酵素をコードする核酸分子、およびその使用
CN1809636B (zh) 耐热化α-葡聚糖磷酸化酶(GP)的方法
Swistowska et al. Heterologous hyper-expression of a glucansucrase-type glycosyltransferase gene
US20040175814A1 (en) Novel transferase and amylase, process for producing the enzymes, use thereof, and gene coding for the same
Kimura et al. Synthesis of polysaccharides III: Sucrase as catalyst
JP4230498B2 (ja) 新規トランスフェラーゼ及びアミラーゼ、それらの製造法及び利用、並びに該新規酵素類の遺伝子
US20040235120A1 (en) Method for producing vitamin b12
US20040086902A1 (en) Method for the production of polyfructans
JP4335272B2 (ja) 新規トランスフェラーゼ及びアミラーゼ、それらの製造法及び利用、並びに該新規酵素類の遺伝子
JPH10150986A (ja) 超耐熱性４−α−グルカノトランスフェラーゼ
Kido et al. Hydrolysis-transglycosylation of sucrose and production of β-(2→ 1)-fructan by inulosucrase from Neobacillus drentensis 57N
Yoo et al. Expression of orf7 (oxi III) as dTDP-Glucose 4, 6-Dehydratase Gene Cloned from Streptomyces antibioticus Tu99 and Biochemical Characteristics of Expressed Protein
JPH07183A (ja) コリネバクテリウムの生産するサイクロデキストリン・グルカノトランスフェラーゼの製造法及び該酵素の利用
Rimphanitchayakit et al. Mutagenesis of cyclodextrin glucanotransferase gene that affects themostability of the enzyme

Legal Events

Date Code Title Description
PD00 Pending as of 2000-06-30 in czech republic